CN106399351B - 一种分子改造手段提高酿酒酵母的乙醇耐受性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种分子改造手段提高酿酒酵母乙醇耐受性的方法，该方法为：建立RHO1基因的突变序列文库，导入酿酒酵母，通过添加乙醇的平板筛选方法获得耐受性提高的菌株。本发明利用小GTP水解酶从调节细胞形态入手进而提高细胞乙醇胁迫耐受响应，采用类似全局转录调控的方法对小GTP水解酶进行随机突变，通过主动干预细胞形态来达到调节细胞乙醇耐受性的目的。通过本发明方法可有效筛选到乙醇耐受性提高的菌株，构建的载体有普遍适用性，可适用于实验室酵母、工业酵母。

Description

一种分子改造手段提高酿酒酵母的乙醇耐受性的方法
技术领域
本发明涉及工业微生物胁迫耐受性领域和分子生物学领域，特别是涉及一种分子改造手段提高酿酒酵母乙醇耐受性的方法。
背景技术
自近几十年爆发的资源危机以来，能源枯竭以及日趋恶化的环境问题，使燃料乙醇作为新型可再生清洁能源备受关注。燃料乙醇是一种代表性的可再生清洁能源，可以缓解我国能源紧张的现状、降低原油进口依赖度，并能大大缓解化石燃料炼制与消费过程中带来的严重环境污染问题，目前燃料乙醇已经实现了大规模工业化生产和应用。人们希望利用廉价的木质纤维素原料最终实现超高浓度(Very High Gravity，VHG)乙醇发酵，通过超过25％(v/v)的高终点乙醇浓度来大大降低了乙醇精馏能耗和废槽液总量、提高生产效率。
但在发酵过程中，随着终产物乙醇浓度的提高，乙醇在一众环境胁迫因子(温度、渗透压、低pH、纤维素原料降解产生的有毒副产物等)中成为最主要的胁迫因素，酵母细胞活性被高浓度乙醇严重抑制甚至出现生长停滞和死亡的现象。从过程工程控制角度进行的工艺优化只能部分缓解这种胁迫因素，不能完全弥补酵母菌本身性能下降引发的发酵效率的降低问题。因此，揭示酵母细胞复杂的乙醇胁迫响应机制、有效的筛选或构建具有高耐受性高发酵性能的菌株一直是发酵工业追求的目标。
组学的深入分析揭示应对乙醇胁迫细胞在整体的转录/翻译水平发生了调整，表达水平发生变化的基因数量依据不同的乙醇作用方式可达上百甚至上千，因此分子水平上的耐性改造策略已采用全局性、非靶向性的方法来代替传统单基因操作，如基因组改组、全局转录调控等；生理生化水平的研究集中在乙醇胁迫响应下酵母细胞膜和细胞壁的组分改变、防止蛋白变性的大分子物质的积累、更活跃的氧化-还原酶系统等，但对细胞形态和乙醇耐受性关系研究及机理探讨还很鲜见，酵母细胞在乙醇胁迫下出现的"伸长"、"单极出芽"等现象仅被认为是细胞被动承受乙醇胁迫的附属结果，并且认为这种"伸长"使细胞的处境更为不利，活性进一步降低。
但是，已有很多实例表明酵母细胞受到环境的刺激、伴随极化状态改变而出现的细胞形态变化其目的是更快更好的适应环境，如假丝酵母只有在假丝型生长状态下才具有致病性，酿酒酵母在限氮固体培养基上出现的丝状生长现象使其扩展生存空间获取营养。因此猜测酿酒酵母乙醇胁迫下形态的改变可能与细胞主动的乙醇响应存在关系，解决这一问题的关键是找到细胞形态与胁迫耐受性之间的媒介与桥梁，小分子量GTP水解酶家族引起了我们的关注。
小分子量GTP酶的功能为结合并水解鸟苷酸，当其活性部位被GTP占据后发生构象变化，特定部位可介导自身与下游靶点相互作用。在酿酒酵母的研究中已证明小GTP酶的活性与多种胁迫响应有关，如细胞壁损伤修复、多效药物响应(pleiotropic drug response，PDR)、离子胁迫响应、饥饿及耐热性、渗透压胁迫、活性氧(ROS)产生与消除途径等，直接或间接影响众多基因的转录表达，如与多效胁迫响应相关的雷帕霉素靶TOR复合物I(TORC1)依赖的信号级联过程、HOG MAP kinase途径、Pkc1依赖的细胞壁完整CWI途径等。但小GTP酶与乙醇耐受性直接或间接相关的报导还较少见。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明提供了一种以RhoGTPase为中心靶点改造菌种的方法用于提高酿酒酵母乙醇胁迫耐受性。
本发明的技术方案如下：一种分子改造手段提高酿酒酵母乙醇耐受性的方法，建立RHO1基因的突变序列文库，导入酿酒酵母，通过添加乙醇的平板筛选方法获得耐受性提高的菌株。
优选地，所述RHO1基因的突变序列文库由易错PCR获得。
优选地，突变序列文库靶基因为RhoGTPase中的RHO1基因。
优选地，用于酿酒酵母转化的载体以pRS316为骨架、由对应宿主的PGK1启动子调节插入片段表达。
优选地，以PGK-F/R为引物PCR扩增启动子片段pRS316载体。
更为具体地，一种提高酿酒酵母乙醇耐受性的方法，包括以下步骤：
S1.基因组选取；取酿酒酵母种子接种于YPD培养基30℃过夜培养后，以标准方法提取酵母基因组。
S2.以PGK-F/R为引物PCR扩增对应宿主PGK1启动子片段，以BamHI和EcoRI双酶切、回收后，连入经BamHI和EcoRI双酶切线性化的pRS316载体，转化E.coli DH5α，挑选阳性克隆并提取质粒，同样双切验证片段正确后，命名该载体为pRS316-PGK01；
S3.以基因组为模板，用引物对RHO-F/R利用易错PCR扩增RHO1基因，克隆得到的片段纯化后与载体pRS316-PGK01分别进行EcoRI、KpnI双酶切，随后进行连接反应，进行转化大肠杆菌E.coli DH5α，挑选阳性克隆制成混菌，提取质粒，即为突变序列的载体文库。
S4.将突变序列的载体文库的突变载体转入酿酒酵母，以G418(终浓度100ug/mL)为筛选药物，涂布于含5-12％(v/v)乙醇的平板上，筛选得到耐受性高的菌株。
优选的，所述步骤S4中，乙醇平板培养条件具体为：30℃培养48h，挑选可以正常生长的菌落，进行耐受性评价，筛选得耐受性高的菌株。
上述方法可适用于工业酿酒酵母或实验室模式菌株。
本发明利用小GTP水解酶从调节细胞形态入手进而提高细胞乙醇胁迫耐受响应，采用类似全局转录调控的方法对小GTP水解酶进行随机突变，通过主动干预细胞形态来达到调节细胞乙醇耐受性的目的。这一新的耐受性调节方式的引入对乙醇耐性机理研究与提高燃料乙醇生产效率都有重要的意义，并可以为适应性进化研究提供参考。通过本发明方法可有效筛选到乙醇耐受性提高的菌株，构建的载体有普遍适用性，可适用于实验室酵母、工业酵母。
附图说明
图1为本发明实施例1启动子电泳图；
图2为本发明实施例1测序发现的套峰；
图3为本发明实施例1的pRS315-PGK-RHO01双酶切验证电泳图；
图4为本发明实施例1乙醇耐受性考察结果图；其中，A为YPD平板；B为含5％(v/v)无水乙醇的YPD平板；
图5为本发明实施例2突变株乙醇耐受性验证结果图；其中，A为YPD平板，B为含12％(v/v)乙醇的YPD平板。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；如无特殊说明，所述试剂和生物材料，均可从商业途径获得。
(1)菌株：实验室模式酿酒酵母Sc288c、工业酿酒酵母Sc4126；大肠杆菌E.coliDH5α。
(2)载体骨架：pRS316。
(3)培养基：
YPD培养基：葡萄糖2.5wt％，蛋白胨0.5wt％，酵母浸粉0.5wt％，自来水溶解，固体培养基加琼脂2wt％
LB液体培养基：蛋白胨1wt％，酵母浸出粉0.5wt％，NaCl 1wt％，去离子水配置，pH7.0-7.2，固体培养基加2wt％的琼脂。
(4)引物：
实施例1
提高实验室模式菌株S288c乙醇胁迫耐受性：
(1)基因组提取：取处于对数生长期后期到稳定期前期的实验室酵母Sc288c过夜培养物，3000r/min离心5min，弃上清，用3ml无菌水洗细胞，3000r/min离心5min，用500ul裂解缓冲液(0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，50mmol/L EDTA，1％SDS)再次悬浮，加入干净酸洗玻璃珠(约1.5mi离心管2/3体积)和25ul的5mmol/L NaCl，以最高速震荡2min，10000r/min离心2min，转移上清液至新离心管；加入500ul苯酚，震荡，离心1min。吸取水相至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，在—20℃下沉淀至少1h，最高转速离心5min沉淀DNA，弃上清，用70％乙醇清洗，最后悬浮在50ul缓冲液中(2.5mM Tris-HCl(pH8.0))，获得酵母基因组。
(2)含启动子片段的载体构建：以PGK-F/R为引物PCR扩增启动子片段。
PCR体系：
PCR程序：
如图1所示为启动子电泳图，其中，M：DL2000Marker；P1：PGK1启动子克隆片段。扩增产物用Takara回收试剂盒回收后，以BamHI和EcoRI双酶切，37℃酶切2h。
酶切体系：
同上进行片段回收。同时pRS316质粒也进行同样的酶切反应，反应体系：
随后进行连接反应。反应体系：
该反应体系于16℃水浴，过夜连接。连接产物随后进行感受态细胞制备与转化实验。
从-80℃取出冻存的E.coli DH5α，接种于50ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜。将该菌种悬液以1:100的比例接种，取250ul菌液转接到50ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h至OD600＝0.4-0.5左右。将菌液转入50mL离心管中，冰上放置10min。在4℃下，4000r/min离心10min。弃去上清，将管倒置1min以便培养液流尽。用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置30min，4℃4000r/min离心10min，弃去上清，加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置。加入质粒DNA溶液，轻轻摇匀，冰上放置30分钟后，42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却5分钟。向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp和Kan)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。将上述菌液摇匀后取100ul涂布于含Amp及Kan双抗的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。以Takara质粒小提试剂盒提取质粒，以上述酶切验证是否连接正确。验证片段正确后，命名该载体为pRS316-PGK01
(3)突变文库载体构建：以上述基因组为模板，利用易错PCR扩增RHO1基因，突变率保持在5％以下。
扩增体系如下：
扩增产物为含碱基突变的混合物。测序检测到一定信号强度的套峰(图2)，表明引入了突变位点。
同上用Takara纯化试剂盒纯化PCR片段，与pRS316-PGK01分别进行EcoRI、KpnI的双酶切，随后进行连接反应，同上进行转化大肠杆菌，挑选阳性克隆制成混菌，提取质粒，即获得突变序列的载体文库。载体命名为pRS315-PGK-RHO01,用EcoRI、KpnI双酶切验证结果如图3所示，其中，M：DL2000Marker；R：表达载体酶切验证。
(4)耐受性提高的突变体筛选
将含不同突变序列的混合载体pRS315-PGK-RHO01电转化入酿酒酵母S288c。在含5ml YPD的50ml离心管中，培养酵母，30℃过夜，取0.1-0.5ml过夜培养物，接种含100ml新鲜培养基的500ml摇瓶，30℃生长至OD600大约1.3-1.5左右；在4℃，3000r/min离心5min收集细胞，用50ml预冷的灭菌水悬浮细胞；在4℃，3000r/min离心5min收集细胞，用25ml预冷的灭菌水悬浮细胞；在4℃，3000r/min离心5min收集细胞，用2ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞；在4℃，5000r/min离心5min收集细胞，用200ul预冷的1M山梨醇悬浮细胞；分装细胞用以电转。每40uL细胞加入约5～10ug的线性化的DNA 2ul，枪吹匀，置0.2cm电转杯冰浴5min；使用预设程序Sc2(1500V，BioRad)，立即加入1ml 1M山梨醇，静置培养1h以上。将菌体悬液涂布于YPD(含有100ug/mL的G418)和5％(v/v)乙醇的平板上，浓缩涂布筛选平板，培养48h。
可以正常生长的细胞即可能为乙醇耐受性提高菌株，选菌落直径最大的进行复筛。将其作十倍梯度稀释，2ul点滴含5％(v/v)乙醇平板和正常的YPD平板，观察菌落生长情况。图4为含突变序列的菌体乙醇耐受性考察结果，其中，Control：出发菌株为实验室酵母S288c；1：筛选得到的一株突变体。从图4可知，突变体耐受性要较出发菌株提高了一个数量级。
实施例2
提高工业酿酒酵母菌株Sc4126乙醇胁迫耐受性：
实验基本步骤同实施例1，将基因组换为Sc4126基因组；电转的宿主酵母为Sc4126。结果如图5所示为突变株乙醇耐受性验证结果图，出发菌株为工业酵母Sc4126，Sc4126-12与Sc4126-19为两株突变体，其中图5A为YPD平板，图5B为含12％(v/v)乙醇的YPD平板，从图5A和图5B可知，突变体较出发菌株Sc4126乙醇耐受性有不同程度的提高。说明此方法可以适用于工业酿酒酵母和实验室酵母。
<110> 大连大学
<120> 一种分子改造手段提高酿酒酵母的乙醇耐受性的方法
<160> 2
<210> 1
<211> 630
<212>S288c的RHO1基因序列
<400> 1
1 ATGTCACAAC AAGTTGGTAA CAGTATCAGA AGAAAGCTGG TAATCGTTGG TGATGGTGCC
61 TGTGGTAAGA CATGTTTATT AATCGTCTTT TCCAAGGGCC AATTTCCAGA AGTCTACGTA
121 CCAACTGTCT TTGAAAACTA TGTAGCAGAT GTTGAAGTTG ATGGGCGTCG TGTAGAGCTA
181 GCGCTATGGG ATACCGCTGG TCAAGAAGAT TATGATAGAC TAAGACCATT GTCATCCCA
241 GACTCCAATG TCGTATTAAT TTGTTTCTCT ATCGATCTTC CAGATTCTTT AGAGAATGTA
301 CAAGAAAAAT GGATTGCCGA AGTATTACAT TTCTGTCAAG GTGTGCCAAT TATTCTTGTT
361 GGTTGTAAAG TGGATTTGAG AAACGACCCA CAAACCATTG AACAATTAAG ACAAGAAGGT
421 CAACAACCCG TTACATCACA GGAGGGACAA TCTGTAGCAG ACCAGATTGG CGCAACCGGA
481 TACTACGAAT GTTCGGCCAA GACTGGTTAT GGTGTCAGAG AAGTGTTTGA GGCCGCCACT
541 AGAGCTTCAT TGATGGGTAA ATCTAAAACG AATGGTAAAG CTAAGAAGAA CACTACTGAA
601AAGAAGAAGA AGAAGTGTGT CTTGTTATAG
<210> 2
<211>872
<212>S288c的PGK1基因序列
<400> 2
1 ACTGTAATTG CTTTTAGTTG TGTATTTTTA GTGTGCAAGT TTCTGTAAAT CGATTAATTT
61 TTTTTTCTTT CCTCTTTTTA TTAACCTTAA TTTTTATTTT AGATTCCTGA CTTCAACTCA
121 AGACGCACAG ATATTATAAC ATCTGCATAA TAGGCATTTG CAAGAATTAC TCGTGAGTAA
181 GGAAAGAGTG AGGAACTATC GCATACCTGC ATTTAAAGAT GCCGATTTGG GCGCGAATCC
241 TTTATTTTGG CTTCACCCTC ATACTATTAT CAGGGCCAGA AAAAGGAAGT GTTTCCCTCC
301 TTCTTGAATT GATGTTACCC TCATAAAGCA CGTGGCCTCT TATCGAGAAA GAAATTACCG
361 TCGCTCGTGA TTTGTTTGCA AAAAGAACAA AACTGAAAAA ACCCAGACAC GCTCGACTTC
421 CTGTCTTCCT ATTGATTGCA GCTTCCAATT TCGTCACACA ACAAGGTCCT AGCGACGGCT
481 CACAGGTTTT GTAACAAGCA ATCGAAGGTT CTGGAATGGC GGGAAAGGGT TTAGTACCAC
541 ATGCTATGAT GCCCACTGTG ATCTCCAGAG CAAAGTTCGT TCGATCGTAC TGTTACTCTC
601 TCTCTTTCAA ACAGAATTGT CCGAATCGTG TGACAACAAC AGCCTGTTCT CACACACTCT
661 TTTCTTCTAA CCAAGGGGGT GGTTTAGTTT AGTAGAACCT CGTGAAACTT ACATTTACAT
721 ATATATAAAC TTGCATAAAT TGGTCAATGC AAGAAATACA TATTTGGTCT TTTCTAATTC
781 GTAGTTTTTC AAGTTCTTAG ATGCTTTCTT TTTCTCTTTT TTACAGATCA TCAAGGAAGT
841 AATTATCTAC TTTTTACAAC AAATATAAAA CA

Claims (1)

1.一种分子改造手段提高酿酒酵母乙醇耐受性的方法，其特征在于，适用于工业酿酒酵母或实验室模式菌株，具体包括以下步骤：
S1.基因组选取；
S2.以PGK-F/R为引物PCR扩增对应宿主PGK1启动子片段，以BamHI和EcoRI双酶切、回收后，连入经BamHI和EcoRI双酶切线性化的pRS316载体，转化E.coli DH5α构建载体pRS316-PGK01；
PGK-F：TTGGATCCACTGTAATTGCTTTTAGTTG
PGK-R：CCAGAATTCTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAG
S3.以基因组为模板，用引物对RHO-F/R利用易错PCR扩增RHO1基因，克隆得到的片段纯化后与载体pRS316-PGK01分别进行双酶切、进行连接反应，建立突变序列文库，得突变载体；
RHO-F：CGTGAATTCATGTCACAACAAGTTGGTAACAG
RHO-R：CTCGGTACCCTATAACAAGACACACTTCTTCT
S4.将突变载体转入酿酒酵母，涂布于5-12％(v/v)乙醇的平板上，筛选得到耐受性高的菌株；乙醇平板培养条件具体为：30℃培养48h，挑选可以正常生长的菌落，进行耐受性评价，筛选得耐受性高的菌株。
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