CN103140584A - 包含磷酸酮醇酶的重组宿主细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组宿主细胞，其包含：（i）编码多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变或替换，所述多肽将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA；和（ii）编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸。本发明也涉及重组宿主细胞，其还包含（iii）编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。

Description

包含磷酸酮醇酶的重组宿主细胞
相关申请的交叉引用
本专利申请涉及并要求2010年6月18日提交的美国临时专利申请61/356379的优先权，该专利全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明一般涉及工业微生物领域。本发明涉及重组宿主细胞，其包含（i）编码多肽的内源性基因中的修饰，所述多肽将丙酮酸转化为乙酰-CoA、乙醛或乙酰-磷酸，和（ii）编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸。本发明也涉及重组宿主细胞，其包含（i）编码具有丙酮酸脱羧酶（PDC）活性的多肽的内源性基因中的修饰或具有PDC活性的内源性多肽中的修饰，和（ii）编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸。本发明也涉及重组宿主细胞，其还包含（iii）编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。此外，本发明涉及制备和使用此类重组宿主细胞的方法，包括例如增加细胞生长的方法、降低或消除细胞生长对外源碳底物的需求的方法、增加葡萄糖消耗的方法、以及增加产生利用丙酮酸的途径的产物的方法。
背景技术
全球对液态运输燃料的需求预计将对实现某些环境方面驱动的目标的能力造成压力，例如石油储量的保持和温室气体排放的限制。此类需求驱动了科技的发展，其允许利用可再生资源以减少石油储量的消耗和并尽量减少温室气体的排放。
丁醇是一种重要的工业化学品，其可用作燃料添加剂、塑料工业中的化学原料以及食品和香料工业中的食品级提取剂。每年，通过石油化学手段生产100至120亿磅的丁醇，并且对该日用化学品的需求将来很可能还会增加。
化学合成的异丁醇方法是已知的，如羰基合成、一氧化碳的催化氢化（Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry，第6版，2003，Wiley-VCH Verlag GmbH and Co.，Weinheim，Germany，第5卷，第716-719页）和甲醇与正丙醇的格尔伯特缩合（Carlini等人，J.Molec.Catal.A:Chem.220:215-220，2004）。这些工艺利用衍生自石油化学产品的起始材料并通常昂贵，并且对环境不友好。用衍生自植物的原材料生产异丁醇将会使温室气体排放达到最低程度并将代表本领域的进步。
2-丁酮，也被称为甲基乙基酮（MEK），是被广泛使用的溶剂，并且是继丙酮之后最重要的商品化生产的酮。它被用作用于漆料、树脂和粘合剂的溶剂、以及选择性提取剂、氧化反应的活化剂，并且它可在催化剂的存在下通过与氢反应而化学地转化为2-丁醇（Nystrom，R.F.和Brown，W.G.（J.Am.Chem.Soc.（1947）69:1198）。2,3-丁二醇可被用于丁烯和丁二烯（二者是重要的化工原料，目前由裂化石油获得）的化学合成中，并且2,3-丁二醇的酯可被用作增塑剂（Voloch等人，“Fermentation Derived2,3-Butanediol，”Comprehensive Biotechnology，Pergamon Press Ltd.，England，第2卷，第3节:933-947（1986））。
微生物可被工程化以表达生物合成途径，其起始利用细胞的丙酮酸来产生，例如2,3-丁二醇、2-丁酮、2-丁醇和异丁醇。美国专利公开7,851,188公开了用于生产异丁醇的工程化重组微生物。美国专利申请公布US20070259410A1和US20070292927A1公开了用于产生2-丁酮或2-丁醇的重组微生物的工程化。公开了多个用于异丁醇和2-丁醇的生物合成的途径，它们全部从细胞的丙酮酸开始。丁二醇是美国专利申请公布US20070292927A1公开的2-丁醇途径中的中间体。
在工程化表达利用丙酮酸的生物合成途径的重组宿主细胞中，对丙酮酸脱羧酶（PDC）的破坏可用于提高丙酮酸的可用性，其用于经由生物合成途径的产物形成。例如，美国专利申请公布US20070031950A1公开了带有一种或多种丙酮酸脱羧酶基因的破坏（PDC敲出或PDC-KO）并且表达D-乳酸脱氢酶基因的酵母菌株，其被用于生产D-乳酸。美国专利申请公布US20050059136A1公开了没有丙酮酸脱水酶活性的葡萄糖耐受的不依赖二碳源（GCSI）的酵母菌株，其可以具有外源乳酸脱氢酶基因。Nevoigt和Stahl（Yeast12:1331-1337（1996））描述了在啤酒糖酵母中降低的丙酮酸脱羧酶和提高的NAD-依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶对甘油产量的影响。美国专利申请20090305363A1公开了通过工程化酵母以表达定位于胞质的乙酰乳酸合酶和基本除去丙酮酸脱羧酶活性而提高的丙酮酸至乙酰乳酸的转化。
尽管PDC-KO重组宿主细胞可用于生产利用丙酮酸生物合成途径的产物，PDC-KO重组宿主细胞需要外源的碳底物补充（例如，乙醇或乙酸）用于它们的生长（Flikweert等人，1999，FEMS Microbiol.Lett.174（1）:73-79“Growth requirements of pyruvate-decarboxylase-negativeSaccharomyces cerevisiae”）。在带有一个或多个编码丙酮酸脱氢酶基因突变的大肠杆菌菌株中观察到了类似的营养缺陷型（Langley和Guest，1977，J.Gen.Microbiol.99:263-276）。
在商业应用中，在转化为所需产物的底物中额外加入外源碳底物可能会导致成本增加。本领域仍存在对于重组宿主细胞的需求，其降低了或消除了对外源碳底物补充的需求。
发明内容
本发明的一个方面涉及重组宿主细胞，其包含（i）编码多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换，所述多肽将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA；和（ii）编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸。本发明的另一方面涉及此类重组宿主细胞，其还包含（iii）编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。在多个实施方案中，所述将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA的多肽是丙酮酸脱羧酶、丙酮酸-甲酸裂解酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶或丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶。
本发明的一个方面涉及重组宿主细胞，其包含（i）编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中或具有丙酮酸脱羧酶活性的内源性多肽中的修饰；和（ii）编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸。本发明的另一方面涉及此类重组宿主细胞，其还包含（iii）编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。
本发明的一个方面涉及重组宿主细胞，其包含（i）编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换；和（ii）编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸。本发明的另一方面涉及重组宿主细胞，其还包含：（iii）编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。本发明的另一方面涉及与包含（i）且不包含（ii）或（iii）的重组真核宿主细胞相比，所述宿主细胞在培养物中的生长对外源二碳底物具有降低或消除的需求。本发明的另一方面涉及在不补充外源二碳底物的培养基中此类宿主细胞的生长情况与在补充外源二碳底物的培养基中包含（i）且不包含（ii）或（iii）的宿主细胞的生长速率基本上相等的或更高。
本发明的一个方面，所述重组宿主细胞是下列属的成员：梭菌属（Clostridium）、发酵单胞菌属（Zymomonas）、埃希氏菌属（Escherichia）、沙门氏菌属（Salmonella）、沙雷氏菌属（Serratia）、欧文氏菌属（Erwinia）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、志贺氏菌属（Shigella）、红球菌属（Rhodococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、肠球菌属（Enterococcus）、产碱菌属（Alcaligenes）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、节杆菌属（Arthrobacter）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、短杆菌属（Brevibacterium）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、耶氏酵母属（Yarrowia）、毕赤酵母属（Pichia）、假丝酵母属（Candida）、汉逊酵母属（Hansenula）或糖酵母属（Saccharomyces）。在本发明的另一方面，所述重组宿主细胞是啤酒糖酵母（S.cerevisiae）。
在本发明的另一方面中，所述重组宿主细胞表达利用丙酮酸的生物合成途径，其包括例如用于生成如2,3-丁二醇、异丁醇、2-丁醇、2-丁酮、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、乳酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸或异戊醇产物的生物合成途径。本发明的另一方面涉及在所述重组宿主细胞中表达异丁醇生物合成途径，所述重组宿主细胞包含编码多肽的至少一种DNA分子，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：（i）丙酮酸至乙酰乳酸的转化；（ii）乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸的转化；（iii）2,3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸的转化；（iv）2-酮异戊酸至异丁醛的转化；以及（v）异丁醛至异丁醇的转化。本发明的另一方面涉及在所述重组宿主细胞中表达2-丁酮生物合成途径，所述重组宿主细胞包含编码多肽的至少一种DNA分子，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：（i）丙酮酸至乙酰乳酸的转化的转化；（ii）乙酰乳酸至乙偶姻的转化；（iii）乙偶姻至2,3-丁二醇的转化；以及（iv）2,3-丁二醇至2-丁酮的转化。
本发明的另一方面涉及在所述重组宿主细胞中表达2-丁醇生物合成途径，所述重组宿主细胞包含编码多肽的至少一种DNA分子，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：（i）丙酮酸至乙酰乳酸的转化；（ii）乙酰乳酸至乙偶姻的转化；（iii）乙偶姻至2,3-丁二醇的转化；（iv）2,3-丁二醇至2-丁酮的转化；以及（v）2-丁酮至2-丁醇的转化。
本发明的一个方面涉及生产产物的方法，所述产物选自2,3-丁二醇、异丁醇、2-丁醇、2-丁酮、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、乳酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸和异戊醇，所述方法包括使本文所述的重组宿主细胞在产生所述产物的条件下生长且任选地回收所述产物。本发明的另一方面涉及制备重组宿主细胞的方法，所述方法包括用（i）编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸；以及任选地（ii）编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化宿主细胞，所述宿主细胞包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换。
本发明的另一方面涉及改善重组宿主细胞的生长的方法，所述重组宿主细胞包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换，所述方法包括（i）用编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞；以及任选地（ii）用编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。在多个实施方案中，所述方法还包括使所述重组宿主细胞在包含限制的碳底物的培养基中生长。
本发明的另一方面涉及降低重组宿主细胞的生长对外源二碳底物的需求的方法，所述重组宿主细胞包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换，所述方法包括（i）用编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞；以及任选地（ii）用编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。
本发明的另一方面涉及消除重组宿主细胞的生长对外源二碳底物的需求的方法，所述重组宿主细胞包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换，所述方法包括（i）用编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞；以及任选地（ii）用编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述宿主细胞。
本发明的另一方面涉及增加所述重组宿主细胞中磷酸酮醇酶途径的活性的方法，所述方法包括（i）提供本发明的重组宿主细胞；以及（ii）使所述重组宿主细胞在增加所述重组宿主细胞中磷酸酮醇酶途径的活性的条件下生长。
在另一方面，所述重组宿主细胞包含磷酸酮醇酶，所述磷酸酮醇酶以小于7.5E-242的E值匹配表6中给出的序型HMM。在另一方面，所述磷酸酮醇酶与SEQ ID NO:355、379、381、388、481、486、468或504中的至少一个具有至少约40%的同一性。在另一方面，所述磷酸酮醇酶与SEQID NO:355、379、381、388、481、486、468或504中的至少一个具有至少约90%的同一性。在另一方面，所述磷酸酮醇酶以小于7.5E-242、1.1E-124、2.1E-49、7.8E-37的E值分别匹配表6、7、8和9中给出的序型HMM。在另一方面，所述重组宿主细胞还包含磷酸转乙酰酶，所述磷酸转乙酰酶以小于5E-34的E值匹配表14中给出的序型HMM。在另一方面，所述磷酸转乙酰酶与SEQ ID NO:1475、1472、1453、1422、1277、1275、1206、1200、1159或1129具有至少约40%的同一性。在另一方面，所述磷酸转乙酰酶与SEQ ID NO:1475、1472、1453、1422、1277、1275、1206、1200、1159或1129具有至少约90%的同一性。
附图说明以及提供的序列表和表格
本发明的各种实施方案可通过详细的描述、附图和并入的序列描述更充分的理解，这也是本专利申请的一部分。
图1描绘了磷酸酮醇酶途径的示意图，其包括磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶。
图2描绘了没有外源碳底物补充的表达磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶的PDC-KO酵母菌株的生长情况。
图3描绘了没有外源碳底物补充的表达磷酸酮醇酶和/或磷酸转乙酰酶的PDC-KO酵母菌株的生长情况。
图4描绘了磷酸乙酰转移酶（PTA）和磷酸丁酰转移酶（PTB）序列的系统发育树。采用默认参数用Clustal X进行多重序列比对。采用邻接法推导系统发育树并用Mega4软件绘制。标记的序列如下：（编号，菌种，GI号）1，肠道沙门氏菌（S.enterica），56412650；2，大肠杆菌（E.coli）K12，88192043；3，小韦荣菌（V.parvula），227371784；4，克鲁氏梭状芽孢杆菌（C.kluyveri），153954015；5，丙酮丁醇梭菌（C.Acetobutylicum），15895019；6，热纤梭菌（C.thermocellum），196254011；7，甲烷八叠球菌（M.thermophila），88192043；8，化脓性链球菌（S.pyogenes），48425286；9，枯草芽孢杆菌（B.subtilis），58176784；10，发酵乳酸杆菌（L.fermentum），227514417；11，植物乳杆菌（L.plantarum），28377658；12，旧金山乳杆菌（L.sanfranciscensis），11862872。
图5是本文所述的pRS426::GPD-xpk1+ADH-eutD质粒图谱。
图6描绘的是BP913整合了磷酸酮醇酶途径载体（本文所述）后的Δpdc1::ilvD（Sm）基因座。
图7A显示了在不存在乙醇和存在乙醇以及不存在和存在所述磷酸酮醇酶途径（xpk）条件下产异丁醇菌株的生长情况。ISO1、ISO2和ISO3是指平行测定。
图7B显示了来自图7A的菌株第二次传代培养的生长情况。
表6、7、8、9和14为本文所述序型HMM的表格。表6、7、8、9和14为随同文件电子提交的，并以引用方式并入本文。
根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和所附的序列描述形成了本申请的一部分。
随同文件提供的序列表以引用方式并入本文并符合37C.F.R.1.821-1.825（“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求—序列规则（Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequencesand/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules）”），并且与世界知识产权组织（WIPO）标准ST.25（2009）以及EPO和PCT的序列列表要求（规则5.2和49.5（a-bis），以及行政指导的208节和附录C）相一致。核苷酸的符号和格式以及氨基酸序列数据符合如37C.F.R.§1.822所示的规则。电子提交的序列表的内容名称：20110615_CL4871USNA_SeqList.txt；大小：6.67MB；和创建/修改日期：2011年6月9日/2011年6月15日全文以引用方式并入本文。
SEQ ID NO:1-20为PDC靶基因编码区和蛋白质的序列。
SEQ ID NO:21-638为磷酸酮醇酶靶基因编码区和蛋白质的序列。
SEQ ID NO:762-1885为磷酸转乙酰酶靶基因编码区和蛋白质的序列。
SEQ ID NO:1893-1897为杂合启动子序列。
SEQ ID NO:639-642、644-654、656-660、662-701-714、725-726、729-740、742-748和750-761为引物。
SEQ ID NO:643为载体pRS426::GPD-xpk1+ADH1-eutD。
SEQ ID NO:655为TEF1p-kan-TEF1t基因。
SEQ ID NO:661为载体pLA54。
SEQ ID NO:715为载体pRS423::pGAL1-cre。
SEQ ID NO:716为载体pLH468-sadB。
SEQ ID NO:717和718为来自木糖氧化无色杆菌（Achromobacterxylosoxidans）sadB的氨基酸和核酸序列。
SEQ ID NO:719为来自乳酸乳球菌（L.lactis）的kivD编码区。
SEQ ID NO:720为质粒pRS425::GPM-sadB。
SEQ ID NO:721为GPM启动子。
SEQ ID NO:722为ADH1终止子。
SEQ ID NO:723为GPM-sadB-ADHt片段。
SEQ ID NO:724为pUC19-URA3质粒。
SEQ ID NO:741为ilvD-FBA1t片段。
SEQ ID NO:749为URA3r2模板DNA。
SEQ ID NO:1886为来自变异链球菌（S.mutans）的ilvD编码区。
SEQ ID NO:1888为载体pLH468。
SEQ ID NO:1898为pUC19-URA3::pdc1::GPD-xpk1+ADH1-eutD。
SEQ ID NO:1899-1906为经修饰的啤酒糖酵母（S.cerevisiae）基因座的序列。
SEQ ID NO:1907是pLH702的序列。
SEQ ID NO:1908是pYZ067DkivDDhADH的序列。
SEQ ID NO:1909是ALD6的氨基酸序列。
SEQ ID NO:1910是K9D3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:1911是K9G9的氨基酸序列。
SEQ ID NO:1912是YMR226c的氨基酸序列。
SEQ ID NO:1913和1914是AFT1的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:1915和1916是AFT2的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:1917和1918是FRA2的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:1919和1920是GRX3的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:1921和1922是CCC1的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:1923是来自Beijerinkia indica的乙醇脱氢酶的氨基酸序列。
具体实施方式
申请人已通过降低或消除对于提供两种底物的需求解决了所述问题，两种底物中的一种底物被转化为所需的产物，另一种底物被重组宿主细胞全部或部分地转化为乙酰-CoA，所述重组宿主细胞需要此类用于生长的补充，在此类细胞中包含所述磷酸酮醇酶途径多个酶的表达。一种此类酶，磷酸酮醇酶（酶学委员会编号EC4.1.2.9），催化木酮糖-5-磷酸转化为甘油醛-3-磷酸和乙酰-磷酸（Heath等人，J.Biol.Chem.231:1009-29；1958）。另一种此类酶为磷酸转乙酰酶（酶学委员会编号EC2.3.1.8），其将乙酰-磷酸转化为乙酰-CoA。
申请人已提供了PDC-KO重组宿主细胞，其包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸和任选地编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。与PDC-KO细胞相比，对用于其生长的外源二碳底物此类细胞表现出降低的或消除了的需求。申请人还提供了制备和使用此类重组宿主细胞的方法，其包括例如增加细胞生长的方法、降低或消除细胞生长对外源碳底物的需求的方法、增加葡萄糖消耗的方法、以及增加产生利用丙酮酸的途径的产物的方法。
除非另行定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。如发生矛盾，以本专利申请（包括其定义）为准。除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。本文提及的所有公布、专利和其它参考文献出于各种目的全文以引用方式并入本文，如同每一单独的公布或专利申请均特定且个别地以引用方式并入一样，除非仅专利或专利申请的特定部分被提及以引用方式并入本文。
下文描述了合适的方法和材料，虽然在本发明的实施或试验过程中也可以使用与本文所述的那些类似或等同的方法和材料。材料、方法和实施例仅是例示性的并且不旨在进行限制。根据具体实施方式和权利要求，本发明的其它特点和优点将显而易见。
为了进一步明确本发明，提供下列术语、缩写和定义。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”，或其任何其它变型旨在是非排它的或可广泛解释的。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非另外特别说明，否则“或”是指包含性的或，而不是指排它性的或。例如，以下任何一个均表示满足条件A或B：A是真的（或存在的）且B是假的（或不存在的）、A是假的（或不存在的）且B是真的（或存在的）、以及A和B都是真的（或存在的）。
同样，涉及元素或组分实例（即次数）的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，术语“发明”或“本发明”为非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施方案，而是涵盖如专利申请所述的所有可能的实施方案。
如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于制备浓缩物或使用溶液的一般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异等等。术语“约”还包括由于产生自特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施方案中，术语“约”指在报告数值10%范围内，优选地在报告数值5%范围内。
本文所用术语“丁醇”是指2-丁醇、1-丁醇、异丁醇或它们的混合物。
术语“利用丙酮酸的生物合成途径”是指从丙酮酸产生生物合成产物的酶途径。
术语“异丁醇生物合成途径”是指从丙酮酸产生异丁醇的酶途径。
术语“2-丁醇生物合成途径”是指从丙酮酸产生2-丁醇的酶途径。
术语“2-丁酮生物合成途径”是指从丙酮酸产生2-丁酮的酶途径。
如本文所用，术语“pdc-”、“PDC敲除”或“PDC-KO”是指具有灭活或降低编码丙酮酸脱羧酶（PDC）的基因的表达的基因修饰，从而使该细胞基本上没有或完全没有丙酮酸脱羧酶酶活性。如果所述细胞具有多于一种的表达的（活性的）PDC基因，则每个活性PDC基因可以被灭活或具有最小的表达从而产生pdc-细胞。
术语“碳底物”是指可被本文所公开的重组宿主细胞代谢的碳源。本文提供了非限制性的碳底物的实例，包括但不限于单糖、寡糖、多糖、乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐、甘油、二氧化碳、甲醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、右旋糖或它们的混合物。
术语“外源二碳底物”是指提供的由缺乏将丙酮酸转化为乙酰-CoA的能力的宿主细胞代谢为乙酰-CoA的碳源。这个术语用于区分碳底物，其通过利用丙酮酸的生物合成途径转化为丙酮酸衍生的产物，本文也指“途径底物”，其包括例如葡萄糖。
术语“多核苷酸”旨在包括单数的核酸以及复数的核酸，并且是指核酸分子或构建体例如信使RNA（mRNA）或质粒DNA（pDNA）。多核苷酸可包含全长cDNA序列的核苷酸序列，或其片段，包括非翻译的5'和3'序列和编码序列。所述多核苷酸可由任何多核糖核酸或多脱氧核糖核酸组成，其可为非改性的RNA或DNA，或改性的RNA或DNA。例如，多核苷酸可由单链和双链DNA构成，其为单链和双链区域的混合物；单链和双链RNA，其为单链和双链区域的混合物；包含DNA和RNA的杂合分子，其可为单链或，更典型地双链或单链和双链区域的混合物。“多核苷酸”包含了化学地、酶学地或代谢地改性的形式。
多核苷酸序列可意为“分离的”，其中它从天然的环境中移除出来。例如，包含在载体中的编码具有二羟酸脱水酶活性多肽或多肽片段的异源性多核苷酸，出于本发明的目的可被认为是分离的。分离的多核苷酸的另一个实例包括异源宿主细胞拥有的重组多核苷酸或溶液中的纯化的（部分地或基本上）多核苷酸。根据本发明分离的多核苷酸或核酸还包括此类人工合成生产的分子。DNA聚合物形式的分离的多核苷酸片段可由一个或多个cDNA、基因组DNA或合成DNA片段构成。
术语“基因”指可被表达为特定蛋白质的核酸片段，其任选包括编码序列前的调节序列（5'非编码序列）和编码序列后的调节序列（3'非编码序列）。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的调控序列的基因。“内源性基因”指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。“异源性基因”是指非天然存在于宿主生物中的但通过基因转移导入所述宿主生物中的基因。“异源性基因”也包括原生的编码区或它们的一部分，即以不同于对应的原生基因的形式重新导入源生物体。例如，异源性基因可包括是被再引入至天然宿主的嵌合基因的一个部分的天然编码区，其中所述嵌合基因包括非天然的调控区。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因或嵌合基因。
如本文所用，术语“编码区”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指位于编码序列的上游（5'非编码序列）、中间或下游（3'非编码序列）的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并指由单体（氨基酸）通过酰胺键（也被称为肽键）线性连接组成的分子。术语“多肽”是指任何两个或更多个氨基酸的链，并且不涉及产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或其它任何用于指由两个或更多个氨基酸组成的一条链或多条链的术语，都包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可用于取代或与这些术语中任一项互换使用。多肽可来源于天然生物源或由重组技术产生，但不一定是由指定的核酸序列翻译的。它可由任何方式生成，包括通过化学合成。
以“分离的”多肽或片段形式的变体和其衍生物拟为不在其自然环境下的多肽。不需要特别的纯化水平。例如，分离的多肽可从它原生的或天然的环境中去除。在宿主细胞中重组产生的多种多肽和蛋白质考虑以所述发明目的进行分离，即为原生的或重组的多肽，其已通过任何适宜的技术分离、分馏或部分或大幅纯化。
如本文所用，术语“变体”是指利用例如重组DNA技术（例如诱变）产生的，通过氨基酸的插入、缺失、突变和取代而不同于特异性地列举的本发明的多肽的多肽。通过将特定多肽的序列与同源的多肽（例如酵母或细菌的）的序列进行比较，并使高度同源区域（保守区域）中进行的氨基酸序列改变的数量最小化，或通过用共有序列代替氨基酸，可发现用以确定哪些氨基酸残基可以被取代、添加或缺失而不会破坏所关注的活性的指导。
作为另外一种选择，编码这些相同或相似多肽的重组多核苷酸变体可以合成或通过利用遗传密码子的冗余而选出。各种密码子取代，如产生各种限制性位点的沉默变化，可引入以优化克隆到质粒表达载体或病毒表达载体。多核苷酸序列的多种突变可体现在所述多肽或添加到所述多肽的其它肽的结构域中以改变多肽中任意部分的性质。
氨基酸“取代”可以是用具有相似的结构和/或化学特性的另一种氨基酸取代一种氨基酸的结果，即保守的氨基酸取代，或它们可以是用具有不同的结构和/或化学特性的另一种氨基酸取代一种氨基酸的结果，即非保守的氨基酸取代。“保守的”氨基酸取代可在参与残基在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性或两亲性本质相似性的基础上进行。例如，非极性（疏水性）氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电的（碱性）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；并且带负电的（酸性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。作为另外一种选择，“非保守”氨基酸取代可通过选择这些氨基酸中任一项在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性或两亲性本质的差异而进行。“插入”或“缺失”可在重组蛋白质结构上或功能上耐受的变型范围之内。通过系统地利用重组DNA技术产生多肽分子中的氨基酸的插入、缺失或取代，并检测所得重组变体的活性，可以以实验方法确定所允许的变型。
术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3'端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或响应不同的环境条件或生理条件而指导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因表达的启动子称为“组成型启动子”。还应认识到因为在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，不同长度的DNA片段可可具有相同的启动子活性。例如，应当理解，“FBA1启动子”可用于指来源于FBA1基因启动子区的片段。
如本文所用的术语“终止子”是指位于编码序列下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3'端。3′区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。应认识到，因为在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，因此不同长度的DNA片段可可具有相同的终止子活性。例如，应当理解，“CYC1终止子”可用于指来源于CYC1基因终止子区的片段。
术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一种核酸序列的功能受到另一种核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达（即该编码序列受到该启动子的转录控制）时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。
如本文所用，术语“表达”指源于本发明核酸片段的有义RNA（mRNA）或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
如本文所用，术语“过表达”是指比相同的或相关的基因的内源性表达更高的表达。如果异源性基因的表达比可比较的内源性基因的表达更高，则所述异源性基因是过表达的。
如本文所用，术语“转化”指将核酸片段转移至宿主生物体内，导致基因稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。
如本文所用，术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列（线性或环状），其中多个核苷酸序列已连接或重组进入一种独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3'端非翻译序列一起引入细胞中。
如本文所用，术语“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
如它是指用于转化各种宿主的基因或编码区的核酸分子，术语“密码子优化的”是指在基因或编码区的核酸分子中的密码子改变，反映了在没有改变DNA编码的多肽情况下宿主生物典型的密码子使用情况。此类优化包括将至少一个或多于一个或显著的数目的密码子替换为在那种生物体中使用频率更高的一个或多个密码子。
包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的偏差，允许编码该基因的序列中的变型。由于每一密码子由三个核苷酸组成，而组成DNA的核苷酸限于四种特异性碱基，存在64种可能的核苷酸组合，其中的61种编码氨基酸（其余三种密码子编码结束翻译的信号）。本文将显示哪些密码子编码哪些氨基酸的“遗传密码”重制为表1。因此，许多氨基酸被分配了多于一种的密码子。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四种三联体编码，丝氨酸和精氨酸由六种，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。这种简并性允许DNA碱基组成在宽范围内变化而不会改变由该DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。
表1：标准遗传密码
Figure BDA00002836347400171
对于使用特定密码子来编码特定氨基酸向生长的肽链中的插入，许多生物表现出偏好。密码子偏好或密码子偏好性、生物体间密码子使用的差异是遗传密码子的简并性造成的，在很多生物体中有很详细的记录。密码子偏好性经常与信使RNA（mRNA）的翻译效率相关联，所述翻译效率反过来据信依赖于，特别是，被翻译的密码子的特性和特定转运RNA（tRNA）分子的可用性。选定的tRNA在细胞中的优势一般而言反映了在肽的合成中最经常使用的密码子。相应地，可基于密码子优化对基因进行加工，以使基因在给定生物中的表达最优化。
考虑到对于多种多样的动物、植物和微生物物种存在大量的基因序列，计算密码子使用的相对频率是可能的。密码子使用表是易得的，例如在http://www.kazusa.or.jp/codon/（2008年3月20日访问）提供的“密码子使用数据库”，并且这些表格可以在许多方面进行调整。参见Nakamura，Y.等人，Nucl.Acids Res.28:292（2000）。从GenBank Release128.0[2002年2月15日]计算的酵母的密码子使用表被重制为下文的表2。该表使用mRNA命名，因此，该表使用存在于RNA中的尿嘧啶（U），而不是存在于DNA中的胸腺嘧啶（T）。表2经过了调整，因此计算了每个氨基酸的频率，而非全部64个密码子。
表2：啤酒糖酵母基因的密码子使用表
Figure BDA00002836347400181
Figure BDA00002836347400191
Figure BDA00002836347400201
通过利用该表或类似的表，本领域的普通技术人员可将这些频率应用于任何给定的多肽序列，并产生密码子优化的编码所述多肽的编码区的核酸片段，但其使用针对给定的物种优化的密码子。
以优化的频率随机分配密码子来编码给定的多肽序列，可通过计算每种氨基酸的密码子频率，然后随机地为给多肽序列分配密码子而人工地实现。此外，多种算法和计算机软件程序是本领域的普通技术人员容易获得的。例如，可从DNAstar，Inc.，Madison，WI获得的Lasergene软件包中的“EditSeq”功能，可从InforMax，Inc.，Bethesda，MD获得的VectorNTI套件中的“backtranslation”功能，以及可从Accelrys，Inc.，SanDiego，CA获得的GCG-Wisconsin软件包中的“backtranslate”功能。此外，多种用于对编码区序列进行密码子优化的资源是可公开获得的，例如http://www.entelechon.com/bioinformatics/backtranslation.php?lang=eng（2008年4月15日访问）的“backtranslation”功能，和可在http://bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/EMBOSS/index.html（2002年7月9日访问）的“backtranseq”功能。构建基本的算法来基于给定的频率分配密码子也可由本领域的普通技术人员用基本的数学函数实现。
密码子优化的编码区也可通过本领域的技术人员已知的多个方法进行设计，包括软件包如“synthetic gene designer”（http://phenotype.biosci.umbc.edu/codon/sgd/index.php）。
当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时，多核苷酸或核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交和洗涤条件为人们所熟知，示例参见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory:Cold SpringHarbor，NY（1989），尤其是在该文献第11章和表11.1（全文以引用方式并入本文）中进行了例示。温度和离子强度条件确定了杂交的“严格性”。可以调节严格条件以筛选中度相似的片段（例如来自远缘生物的同源序列），到筛选高度相似的片段（例如从近缘生物复制功能性酶的基因）。杂交后的洗涤确定严格性条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6X SSC、0.5%SDS在室温下洗涤15分钟，然后用2X SSC、0.5%SDS在45℃下重复30分钟，再用0.2X SSC、0.5%SDS在50℃下重复洗涤两次，每次30分钟。更优选的一组严格性条件采用更高的温度，其中洗涤与上述洗涤相同，不同的是最后两次在0.2X SSC、0.5%SDS中洗涤30分钟时的温度被增加到60℃。另一组优选的高严格条件是最后两次洗涤是在65℃下用0.1X SSC、0.1%SDS进行。例如，另一组严格条件包括在0.1X SSC、0.1%SDS中于65℃下杂交并用2X SSC、0.1%SDS洗涤，随后用0.1X SSC、0.1%SDS洗涤。
杂交需要两种核酸含有互补序列，但是取决于杂交的严格度，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格度取决于核酸的长度和互补的程度，它们是本领域内熟知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性（对应较高的Tm）按下列顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经获得了计算Tm的方程式（参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51）。对于较短核酸（即寡核苷酸）的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性（参见Sambrook等人，同上，11.7-11.8）。在一个实施方案中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸；更优选至少约20个核苷酸；最优选长度为至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”是指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定而鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST（Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215:403-410（1993））。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有十个或更多邻接氨基酸或者三十个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定（如DNA杂交）和基因分离（如细菌菌落或噬斑的原位杂交）的方法中。此外，12至15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”包含的序列足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书教导了编码特定蛋白质的完整氨基酸和核苷酸序列。具有如本文报道序列的有益效果，技术人员现在可使用全部公布序列或它们的主要部分用于本领域技术人员已知的目的。因此，本发明包括如随附的序列表中所示的完整序列，以及如上文定义的这些序列的基本部分。
术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
术语“百分比同一性”如本领域已知是指通过比较多个序列测定的、两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。本领域中“同一性”也意为多肽或多核苷酸序列之间的序列关联度，视情况而定，如由此类序列字符串的匹配来测定。“同一性”和“相似性”可通过已知方法容易地计算出来，包括但不限于那些描述见下列：1.）Computational Molecular Biology（Lesk，A.M.编辑）Oxford University:NY（1988）；2.）Biocomputing:Informatics and GenomeProjects（Smith，D.W.编辑）Academic:NY（1993）；3.）Computer Analysis ofSequence Data，部分I（Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑）Humania:NJ（1994）；4.）Sequence Analysis in Molecular Biolog（von Heinje，G.编辑），Academic（1987）；以及5.）Sequence AnalysisPrimer（Gribskov，M.和Devereux，J.编辑）Stockton:NY（1991）。
设定确定同一性的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和百分比同一性计算可以用LASERGENE生物信息学计算软件包（LASERGENE bioinformatics computing suite（DNASTAR Inc.，Madison，WI））中的MegAlignTM程序进行。所述序列的多重比对用“Clustal比对方法”进行，其涵盖了多种算法，包括“CLUSTAL V比对方法”对应于标记为CLUSTAL V的比对方法（描述参见Higgins和Sharp，CABIOS.5:151-153（1989）；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8:189-191（1992））中，并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包（DNASTAR Inc.）中的MegAlignTM程序中找到的比对方法。对于多重比对，默认值对应于GAP PENALTY=10、以及GAP LENGTHPENALTY=10。用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE=1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5、以及DIAGONALS SAVED=5。对于核酸，这些参数为KTUPLE=2，GAPPENALTY=5，WINDOW=4、以及DIAGONALS SAVED=4。在使用Clustal V程序进行序列比对后，通过查看同一程序中的“序列距离”表格有可能获得“百分比同一性”。此外，也可以使用“Clustal W比对方法”，该方法对应于称为Clustal W的比对方法（描述于Higgins和Sharp，CABIOS.5:151-153（1989）；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8:189-191（1992）中）和可以在LASERGENE生物信息学计算软件包（DNASTAR Inc.）中的MegAlignTMv6.1程序中找到的比对方法。用于多重比对的默认参数（GAP PENALTY=10、GAP LENGTHPENALTY=0.2、Delay Divergen Seqs（%）=30、DNA TransitionWeight=0.5、Protein Weight Matrix=Gonnet系列、以及DNA WeightMatrix=IUB）。在使用Clustal W程序进行序列比对后，通过查看在同一程序中的“序列距离”表有可能获得“百分比同一性”。
本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于例如从其它物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。有用的一致性百分比实例包括但不限于：55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或55%至100%的任何正数百分比在描述本发明时可以是有用的，如55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。合适的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，更优选至少200个氨基酸，最优选至少250个氨基酸的多肽。
术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件包括但不限于：1.）GCG程序套件（Wisconsin Package版本9.0，Genetics Computer Group（GCG），Madison，WI）；2.）BLASTP，BLASTN，BLASTX（Altschul等人，J.Mol.Biol.，215:403-410（1990））；3.）DNASTAR（DNASTAR，Inc.Madison，WI）；4.）Sequencher（Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI）；以及5.）所述FASTA程序结合了Smith-Waterman算法（W.R.Pearson，Comput.MethodsGenome Res.，[Proc.Int.Symp.]（1994），会议日期1992，111-20，编辑：Suhai、Sandor，Plenum:New York，NY）。在本专利申请案的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，除非另外指明，否则分析结果将基于所参考程序的“默认值”。在此所用的“默认值”是指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY（1989）（下文称为“Maniatis”）；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY（1984）；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版（1987）。此处所用的附加的方法参见Methods in Enzymology，第194卷，Guide to YeastGenetics and Molecular and Cell Biology（部分A，2004，Christine Guthrie和Gerald R.Fink（编辑），Elsevier AcademicPress，San Diego，CA）。其它的分子工具是本领域已知的，包括通过重叠延伸聚合酶链反应（PCR）的拼接（Yu等人（2004）Fungal Genet.Biol.41:973-981），对于啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）URA3基因座突变的阳性选择（Boeke，J.D.等人（1984）Mol.Gen.Genet.197，345-346；M A Romanos等人，Nucleic Acids Res.1991年1月11日，19（1）:187），cre-lox位点特异性重组系统以及突变lox位点和FLP底物突变（Sauer，B.（1987）Mol Cell Biol7:2087-2096；Senecoff等人（1988）Journal of Molecular Biology，第201卷，第2期，第405-421页；Albert等人（1995）The Plant Journal.，第7卷，第4期，第649-659页），“无缝”基因缺失（Akada等人（2006）Yeast，23（5）:399-405），和空位修复方法（Ma等人，Genetics58:201-216，1981）。申请人已经发现，激活重组宿主细胞中磷酸酮醇酶途径降低或消除了此类细胞生长对外源碳底物的需求，所述重组宿主细胞包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的修饰，或包含具有丙酮酸脱羧酶活性的内源性多肽中的修饰。在多个实施方案中，所述重组宿主细胞包含（i）编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换；（ii）编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸；以及任选地（iii）编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。
对本文所公开的宿主细胞的遗传操纵可利用标准遗传学技术和筛选进行，并且可在任何适合遗传操纵的宿主细胞中完成（Methods in YeastGenetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页）。在多个实施方案中，本文所公开的重组宿主细胞可以是对遗传修饰和重组基因的表达有用的任何细菌、酵母或真菌宿主。在其它实施方案中，所述重组宿主细胞可以是下列属的成员：梭菌属（Clostridium）、发酵单胞菌属（Zymomonas）、埃希氏菌属（Escherichia）、沙门氏菌属（Salmonella）、沙雷氏菌属（Serratia）、欧文氏菌属（Erwinia）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、志贺氏菌属（Shigella）、红球菌属（Rhodococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、肠球菌属（Enterococcus）、产碱菌属（Alcaligenes）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、节杆菌属（Arthrobacter）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、短杆菌属（Brevibacterium）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、耶氏酵母属（Yarrowia）、毕赤酵母属（Pichia）、假丝酵母属（Candida）、汉逊酵母属（Hansenula）、伊萨酵母属（Issatchenkia）或糖酵母属（Saccharomyces）。在其它实施方案中，所述宿主细胞可为啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）、耐热克鲁维酵母（Kluyveromyces thermotolerans）、产乳糖酶酵母（Kluyveromyces marxianus）、光滑假丝酵母（Candida glabrata）、白假丝酵母（Candida albicans）、树干毕赤酵母（Pichia stipitis）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、大肠杆菌（E.coli）或植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。在另一实施方案中，所述宿主细胞是酵母宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是糖酵母属（Saccharomyces）的成员。在一些实施方案中，所述宿主细胞是乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、光滑假丝酵母（Candida glabrata）或粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）。在一些实施方案中，所述宿主细胞是啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）。啤酒糖酵母（Saccharomycescerevisiae）酵母为本领域所已知并可购自多种来源，包括但不限于美国典型培养物保藏中心（Rockville，MD）、Centraalbureau voorSchimmelcultures（CBS）真菌生物多样性中心、LeSaffre、Gert StrandAB、Ferm Solutions、North American Bioproducts、Martrex和Lallemand。啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）包括但不限于BY4741、CEN.PK113-7D、Ethanol酵母、Ferm ProTM酵母、XR酵母、GertStrand Prestige Batch Turbo alcohol酵母、Gert Strand Pot Distillers酵母、Gert Strand Distillers Turbo酵母、FerMaxTM Green酵母、FerMaxTM Gold酵母、
Figure BDA00002836347400263
酵母、BG-1、PE-2、CAT-1、CBS7959、CBS7960和CBS7961。
乙酰-CoA的来源
乙酰-CoA是主要的细胞性构成团块，其是脂肪酸、固醇和赖氨酸合成所需的。丙酮酸通常是乙酰-CoA的主要贡献者。丙酮酸脱氢酶催化丙酮酸直接转化为乙酰-CoA（E.C.1.2.4.1、E.C.1.2.1.51）或转化为乙酸（E.C.1.2.2.2），并且其是在自然界中广泛存在的。其它涉及将丙酮酸转化为乙酰-CoA、乙酰-磷酸或乙酸的酶包括丙酮酸-甲酸裂解酶（E.C.2.3.1.54）、丙酮酸氧化酶（E.C.1.2.3.3、E.C.1.2.3.6）、丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶（E.C.1.2.7.1）、以及丙酮酸脱羧酶（E.C.4.1.1.1）。为了保护用于感兴趣产物的丙酮酸而对宿主细胞所做的基因修饰，可包括那些限制转化为乙酰-CoA的基因修饰，其导致在缺乏外源二碳底物供应下减少生长，所述碳底物可容易地转化为乙酰-CoA而不依赖丙酮酸（例如乙醇或乙酸）。一个实例为文献记载的在丙酮酸脱羧酶缺陷的啤酒糖酵母（Saccharomycescerevisiae）中观察到的营养缺陷型（Flikweert等人1999，同上）。另一个实例为文献记载的在丙酮酸脱氢酶缺陷的大肠杆菌（Escherichia coli）中观察到的营养缺陷型（Langley和Guest，1977，J.Gen.Microbiol.99:2630276）。
丙酮酸脱羧酶的修饰
在多个实施方案中，本文所公开的重组宿主细胞包含编码具有丙酮酸脱羧酶（PDC）活性的多肽的内源性多核苷酸中的修饰，或包含具有PDC活性的内源性多肽中的修饰。在多个实施方案中，本文所公开的重组宿主细胞可在一个或多个编码PDC的多核苷酸、基因或多肽中有修饰或破坏。在多个实施方案中，所述重组宿主细胞包含编码具有PDC活性的多肽的一个或多个内源性多核苷酸或基因中或者具有PDC活性的一个或多个内源性多肽中的至少一个缺失、突变和/或替换。此类修饰、破坏、缺失、突变和/或替换可导致PDC活性降低或消除，产生PDC敲除（PDC-KO）的表型。
在多个实施方案中，本文所公开的重组宿主细胞的内源性丙酮酸脱羧酶活性将丙酮酸转化为乙醛，然后乙醛可转化为乙醇或经乙酸转化为乙酰-CoA。
在多个实施方案中，所述重组宿主细胞是包含编码丙酮酸脱羧酶的基因的乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、包含编码丙酮酸脱羧酶的基因的光滑假丝酵母（Candida glabrata）或包含编码丙酮酸脱羧酶的基因的粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）。
在其它实施方案中，所述重组宿主细胞是包含由pdc1、pdc5和pdc6基因编码的丙酮酸脱羧酶的三种同功酶以及丙酮酸脱羧酶调节基因pdc2的啤酒糖酵母。在啤酒糖酵母的一个非限制性实例中，pdc1和pdc5基因或所有三个基因被破坏。在啤酒糖酵母的另一个非限制性实例中，通过干扰pdc2调节基因可降低丙酮酸脱羧酶活性。在啤酒糖酵母的另一个非限制性实例中，编码丙酮酸脱羧酶蛋白质的多核苷酸或基因可被破坏，所述蛋白质为例如与pdc1或pdc5具有约70%至约75%、约75%至约80%、约80%至约85%、约85%至约90%、约90%至约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性的那些。
在多个实施方案中，具有PDC活性的多肽或编码具有PDC活性的多肽的多核苷酸或基因与酶学委员会编号EC4.1.1.1相关联。在其它实施方案中，本文所公开的重组宿主细胞的PDC基因在所使用的发酵条件下不是活性的，因此此类基因将不需要被修饰或灭活。
具有由于丙酮酸脱羧酶编码基因的破坏导致的降低的丙酮酸脱羧酶活性的重组宿主细胞的实例已被报道，例如Flikweert等人（Yeast（1996）12:247-257）报道的糖酵母属（Saccharomyces）、Bianchi等人（Mol.Microbiol.（1996）19（1）:27-36）报道的克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、以及Hohmann（Mol.Gen.Genet.（1993）241:657-666）中的调节基因的破坏。没有丙酮酸脱羧酶活性的糖酵母属（Saccharomyces）菌株可得自ATCC，具有登录号200027和200028。
可在本文所公开的重组宿主细胞中作为修饰或灭活的靶标的PDC多核苷酸、基因和多肽的实例包括但不限于下列的表的那些。
表3：丙酮酸脱羧酶（PDC）靶基因编码区和蛋白质的SEQ ID NO
Figure BDA00002836347400291
可在本文所公开的重组宿主细胞中作为修饰或灭活的靶标的PDC多核苷酸、基因和多肽的其它实例包括但不限于与表3的任何一个序列具有至少约70%至约75%、约75%至约80%、约80%至约85%、约85%至约90%、约90%至约95%、约96%、约97%、约98%或约99%序列同一性的PDC多核苷酸、基因和/或多肽。
在多个实施方案中，其它PDC多核苷酸、基因和/或多肽的序列可在文献中被鉴定，利用本文所公开的和本领域中可获得的序列可在技术人员熟知的生物信息学数据库中鉴定候选。例如，通过用已知的PDC编码多核苷酸或多肽序列对可公开获得的数据库的BLAST（如上所述）检索可鉴定此类序列。在此类方法中，同一性可基于Clustal W比对方法，采用GAPPENALTY=10，GAP LENGTH PENALTY=0.1和Gonnet250系列的蛋白质权重矩阵的默认参数。
此外，本文所述的或本领域已知的PDC多核苷酸或多肽序列可被用于鉴定天然的其它PDC同源物。例如本文所述的每一PDC编码核酸片段可被用于分离编码同源蛋白质的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性规程的实例包括但不限于：（1）核酸杂交方法；（2）DNA和RNA扩增方法，这可通过核酸扩增技术的多种用法来举例说明[如聚合酶链反应（PCR），Mullis等人，美国专利4,683,202；连接酶链反应（LCR），Tabor，S.等人，Proc.Acad.Sci.USA82:1074（1985）；或链置换扩增（SDA），Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.，89:392（1992）]；以及（3）文库构建和互补筛选方法。
在多个实施方案中，本文所述的与重组宿主蛋白质相关的PDC多核苷酸、基因和/或多肽可被修饰或破坏。对靶基因进行遗传学修饰和破坏以降低或除去其表达的许多方法是本领域的普通技术人员已知的，并且可被用于产生本文所述的重组宿主细胞。可被使用的修饰包括但不限于：编码PDC蛋白质的整个基因或所述基因的部分的缺失；向编码基因中（在启动子或编码区）插入DNA片段，从而使蛋白质不被表达或以较低水平表达；向编码区中导入突变，突变的导入导致终止密码子的加入或移框，从而使功能性蛋白质不被表达；以及向编码区中导入一个或多个突变以改变氨基酸，从而表达无功能的或活性较低的蛋白质。在其它实施方案中，靶基因的表达可被反义RNA或干扰RNA的表达阻止，并且构建体可被导入，导致共抑制。在其它实施方案中，转录物的合成或稳定性可通过突变降低。在实施方案中，从mRNA翻译为蛋白质的效率可通过突变受到调控。全部这些方法均可由本领域的技术人员使用已知的或鉴定的编码靶蛋白质的序列容易地实施。
在其它实施方案中，围绕靶PDC编码序列的DNA序列在一些修饰方法中也是有用的，并且对于例如酵母如啤酒糖酵母（Saccharomycescerevisiae），在由NCBI（美国国家生物技术信息中心）协调的基因组计划的以基因组计划ID9518协调的、具有标识GOPID#13838的完整基因组序列中是可用的。酵母基因组序列的附加的非限制性实例是白假丝酵母（Candida albicans）的基因组序列，其被包括于GPID#10771、#10701和#16373中。本领域的技术人员可容易地在可公开获得的数据库中找到其它的酵母基因组序列。
在其它实施方案中，围绕靶PDC编码序列的DNA序列对于利用同源重组的修饰方法可以是有用的。在这种方法的非限制性实例中，PDC基因的旁侧序列可被置于选择性标记基因的边界处以介导同源重组，所述标记基因从而替换该PDC基因。在另一个非限制性实例中，位于选择性标记基因边界的部分PDC基因序列和PDC基因旁侧序列可被用于介导同源重组，所述标记基因从而替换该靶PDC基因的至少一部分。在多个实施方案中，所述选择性标记可被位点特异性重组位点限定边界，如此在相应的位点特异性重组酶表达之后，抗性基因被从所述PDC基因处切除，而不会使后者再活化。在多个实施方案中，位点特异性重组留下了重组位点，所述重组位点破坏所述PDC蛋白质的表达。在其它实施方案中，所述同源重组载体可被构建为在选择性标记的切除之后同样留下所述PDC基因中的缺失，如本领域的技术人员所熟知的。
在其它实施方案中，可利用如Wach等人（Yeast，10:1793-1808，1994）所述的有丝分裂重组在PDC靶基因中生成缺失。此类方法可涉及制备包含介于基因组区域之间的选择性标记的DNA片段，其中所述基因组区域可短至20bp并且限定了靶DNA序列的边界。在其它实施方案中，这种DNA片段可通过对所述选择性标记基因的PCR扩增制备，扩增用与所述标记基因末端杂交的寡核苷酸作为引物并且包括可与酵母基因组重组的基因组区域。在多个实施方案中，所述线性DNA片段可被有效地转化到酵母中并重组至基因组中，导致包括了靶DNA序列的缺失的基因替换（如在例如Methods in Enzymology，第194卷，Guide to Yeast Genetics andMolecular and Cell Biology（部分A，2004，Christine Guthrie和GeraldR.Fink（编辑），Elsevier Academic Press，San Diego，CA）中所述）。
此外，启动子替换方法可被用于交换内源转录调控元件，所述方法允许了调控表达的其它途径，例如在Mnaimneh等人（（2004）Cell118（1）:31-44）中所述的。
在其它实施方案中，所述PDC靶基因编码活性能采用随机诱变而破坏，然后其可接着通过筛选以鉴定对于生长具有碳底物依赖的菌株。在这种类型的方法中，靶基因编码区或影响生长相关的碳底物依赖性的任何其它基因组区域的DNA序列不必是已知的。在多个实施方案中，对于具有降低的PDC活性和/或二碳底物依赖性的细胞的筛选或对于具有降低的PDC活性和降低的或消除对于生长的外源二碳底物依赖性的其它突变体的筛选，可被用作本发明的重组宿主细胞。
用于产生基因突变的方法是本领域中通用的和已知的，并可被用于制备突变体的应用中。常用的随机遗传修饰方法（综述于Methods in YeastGenetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY）包括自发突变、增变基因导致的突变、化学诱变、UV或X-射线照射或转座子诱变。
宿主细胞的化学诱变可涉及但不限于用下列DNA诱变剂中的一种处理：甲磺酸乙酯（EMS）、亚硝酸、硫酸二乙酯或N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基-胍（MNNG）。Spencer等人已综述了此类诱变方法（Mutagenesis inYeast，1996，Yeast Protocols:Methods in Cell and Molecular Biology.Humana Press，Totowa，NJ）。在实施方案中，使用EMS的化学诱变可如Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY中所述进行。用紫外（UV）光或X-射线辐照也可被用于在酵母细胞中产生随机突变生成。通过UV辐照的诱变的主要效应是会破坏DNA复制保真性的嘧啶二聚体的形成。酵母UV-诱变的规程可参见Spencer等人（Mutagenesis in Yeast，1996，Yeast Protocols:Methodsin Cell and Molecular Biology.Humana Press，Totowa，NJ）。在实施方案中，增变表型的导入也可被用于在宿主细胞中产生随机的染色体突变。在实施方案中，常用的增变表型可通过对下列基因中的一个或多个的破坏而获得：PMS1、MAG1、RAD18或RAD51。在其它实施方案中，非增变表型的恢复可通过插入野生型等位基因实现。在其它实施方案中，由任何的这些或其它已知的随机诱变方法制备的修饰的细胞的集合可以对降低的或除去的PDC活性进行筛选。
对于下列的酵母菌株，基因组已被完整测序和被注释，并且可公开地获得：棉阿舒囊霉（Ashbya gossypii）ATCC10895、光滑假丝酵母（Candida glabrata）CBS138、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）NRRL Y-1140、树干毕赤酵母（Pichia stipitis）CBS6054、啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）S288c、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）972h-和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）CLIB122。用已知的PDC多核苷酸或多肽序列（例如本文所提供的那些）对可公开获得的数据库进行的典型的BLAST（如上所述）检索，被用于鉴定其它宿主细胞的如酵母细胞的PDC编码序列。
因此，提供与本文所公开的任何PDC多肽或本文所公开的多肽（SEQID NO:1-20）具有至少约70%至约75%、约75%至约80%、约80%至约85%、约85%至约90%、约90%至约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性的丙酮酸脱羧酶多核苷酸、基因和多肽是本发明的范围之内。同一性基于Clustal W比对方法，所述方法采用GAPPENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=0.1和Gonnet250系列的蛋白质权重矩阵的默认参数。
在本文所公开的宿主细胞中用以降低或除去PDC活性的对PDC的修饰可使用本领域已知的方法来确认。例如，本领域熟知的聚合酶链反应方法可用于确认PDC的缺失。其它适宜的方法将为本领域那些技术人员所已知，并包括但不限于在酵母提取物蛋白质胨-右旋糖培养基（YPD）上没有生长。
磷酸酮醇酶的引入
申请人已经发现，表达与所述磷酸酮醇酶途径相关联的酶（例如，磷酸酮醇酶和/或磷酸转乙酰酶）导致降低或消除了PDC-KO细胞生长对外源二碳底物补充的需求。如本文所述确定的磷酸酮醇酶和/或磷酸转乙酰酶可采用本文所述的方法在此类细胞中表达。
所述磷酸酮醇酶途径的酶包括磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶（图1）。磷酸酮醇酶（酶学委员会编号EC4.1.2.9）催化木酮糖-5-磷酸转化为甘油醛-3-磷酸和乙酰-磷酸（Heath等人，J.Biol.Chem.231:1009-29，1958）。已经确定在多个以木糖为唯一碳源生长的酵母菌株中有磷酸酮醇酶活性，但在葡萄糖中生长的酵母菌株中没有（Evans和Ratledge，Arch.Microbiol.139:48-52，1984）。磷酸酮醇酶的抑制剂包括但不限于赤藓糖-4-磷酸和甘油醛-3-磷酸。磷酸转乙酰酶（酶学委员会编号EC2.3.1.8）将乙酰-磷酸转化为乙酰-CoA。
在多个实施方案中，在本文所公开的重组宿主细胞中通过工程化细胞以表达编码磷酸酮醇酶和任选地磷酸转乙酰酶的多核苷酸和/或多肽来激活磷酸酮醇酶途径。在多个实施方案中，本文所公开的重组宿主细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸。在其它实施方案中，本文所公开的重组宿主细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸和编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。在其它实施方案中，所述编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸是过表达的，或是以比相同的或相关的内源性基因（若有的话）的内源表达更高的水平表达的。在其它实施方案中，所述编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸是过表达的，或是以比相同的或相关的内源性基因（若有的话）的内源表达更高的水平表达的。
在多个实施方案中，具有磷酸酮醇酶活性的多肽催化木酮糖-5-磷酸转化为甘油醛-3-磷酸和乙酰-磷酸，和/或催化果糖-6-磷酸转化为赤藓糖-4-磷酸和乙酰-磷酸。在多个实施方案中，所述具有磷酸酮醇酶活性的多肽活性被赤藓糖-4-磷酸和/或甘油醛-3-磷酸抑制。在其它实施方案中，具有磷酸转乙酰酶活性的多肽催化乙酰-磷酸转化为乙酰-CoA。
许多编码磷酸酮醇酶活性的多核苷酸、基因和多肽的实例是本领域已知的，并可用于本文所公开的重组宿主细胞中。在多个实施方案中，此类多核苷酸、基因和/或多肽可为戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）MD363的木酮糖-5-磷酸酮醇酶（XpkA）（Posthuma等人，Appl.Environ.Microbiol.68:831-7，2002）。XpkA是乳酸菌中磷酸酮醇酶途径（PKP）的中心酶，并显示比活性为4.455μmol/min/mg（Posthuma等人，Appl.Environ.Microbiol.68:831-7，2002）。在其它实施方案中，此类多核苷酸、基因和/或多肽可为肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）的磷酸酮醇酶，其显示比活性为9.9μmol/min/mg并在pH高于4.5是稳定的（Goldberg等人，Method Enzymol.9:515-520，1966）。这个磷酸酮醇酶显示对于D-木酮糖-5-磷酸的米氏常数（Km）为4.7mM，而对于果糖-6-磷酸的米氏常数（Km）为29mM（Goldberg等人，Methods Enzymol.9:515-520，1966）。在其它实施方案中，此类多核苷酸、基因和/或多肽可为来自乳酸双歧杆菌（B.lactis）的D-木酮糖-5-磷酸/D-果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶基因xfp，如例如Sonderegger等人在代谢戊糖的啤酒糖酵母（S.cerevisiae）菌株中所述（Appl.Environ.Microbiol.70:2892-7，2004）。
在多个实施方案中，编码磷酸酮醇酶活性的多核苷酸、基因和/或多肽对应于酶学委员会编号EC4.1.2.9。
在多个实施方案中，宿主细胞包含多肽，其与表4的多肽或它们的活性片段或编码此类多肽的多核苷酸具有至少约80%、至少约85%、至少约90%或100%的同一性。在其它实施方案中，编码磷酸酮醇酶的多核苷酸、基因和/或多肽可包括但不限于在下列表4或表5中提供的序列。
表4：磷酸酮醇酶靶基因编码区和蛋白质的SEQ ID NO
Figure BDA00002836347400351
Figure BDA00002836347400371
在其它实施方案中，编码磷酸酮醇酶的多核苷酸、基因和/或多肽可与表4的任何一个序列具有至少约70%至约75%、约75%至约80%、约80%至约85%、约85%至约90%、约90%至约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的同一性，其中所述多核苷酸、基因和/或多肽编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽。
在其它实施方案中，编码磷酸酮醇酶的多核苷酸、基因和/或多肽可用于鉴定其它磷酸酮醇酶的多核苷酸、基因和/或多肽序列，或鉴定在其它细胞的，如上所述的PDC的，磷酸酮醇酶同源物。此类磷酸酮醇酶编码序列可在例如文献中和/或技术人员熟知的生物信息学数据库中进行鉴定。例如，利用生物信息学在其它的细胞类型中对磷酸酮醇酶编码序列的鉴定，可通过用已知的磷酸酮醇酶编码DNA和多肽序列（例如本文所提供的那些）对可公开获得的数据库进行BLAST（如上文所述）检索而实现。同一性基于Clustal W比对方法，所述方法采用GAP PENALTY=10、GAPLENGTH PENALTY=0.1和Gonnet250系列的蛋白质权重矩阵的默认参数。
使用多样性搜索、聚类、实验验证的木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶以及结构域架构，可鉴定附加的磷酸酮醇酶靶基因编码区。简而言之，用所述实验验证的序列、以0.01的E值结尾值（cut-off）进行的BLAST搜索产生了595个序列匹配。采用CD-HIT程序以95%的序列同一性和90%的长度重叠进行聚类，将这个数目降低至436。CD-HIT是一个用于在高序列同一性阈值聚类大型蛋白质数据库的程序。该程序删除冗余序列，并生成由其唯一代表组成的数据库。（Clustering of highly homologoussequences to reduce the size of large protein database，Weizhong Li，LukaszJaroszewski&Adam Godzik Bioinformatics，（2001）17:282-283）
木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶具有三个Pfam结构域：XFP_N；XFP；XFP_C。虽然这些结构域每一个可存在多个结构域架构，例如发现XFP_N存在八个架构。所述感兴趣的架构被确定为XFP_N；XFP；XFP_C。所述三个域的累计长度为760个氨基酸。
使用HMMER软件包进行所述磷酸酮醇酶的结构/功能鉴定。以下基于HMMER软件用户指南的信息给出了关于hmmbuild程序制备序型HMM的方式的一些描述。序型HMM能够建模带缺口的比对，例如包括插入和缺失，这使得软件可描述完整的保守域（而不是仅仅较小的不带缺口的基序）。采用插入（I）状态和缺失（D）状态对插入和缺失建模。包含多于特定部分x的空位字符的所有列将被指定为插入列。默认情况下，x被设置为0.5。每个匹配状态有一个I态和D态与之相关联。HMMER将比对中相同的共有位点的一组三种状态（M/D/I）称作“节点”。这些状态与称作状态转换概率的箭头互相关联。M和I状态是发射者，而D状态是静默的。转换被安排为使得在每一节点，M状态被使用（并且一个残基被对齐并评分）或者D状态被使用（并且没有残基被对齐，从而产生一个缺失-空位符号‘-’）。插入发生在节点之间，并且I状态具有自我转换，允许在共有列之间出现一个或多个插入的残基。
匹配状态的残基的评分（即匹配状态发射评分）或插入状态的残基的评分（即插入状态发射评分）与Log_2（p_x）/（null_x）成比例。其中p_x是根据序型HMM，在比对中的一个特定位点，一种氨基酸残基的概率，而null_x是根据空模型的概率。所述空模型为有预先算出的一组针对20种氨基酸中的每一种的发射概率的简单的单一状态概率模型，其中所述发射概率来源于氨基酸在SWISSPROT版本24中的分布。状态转换评分同样作为对数比值比参数被算出，并且与Log_2（t_x）成比例。其中t_x是转换为发射者或非发射者状态的概率。
采用实验验证序列的多重序列比对，所述序列包含感兴趣的架构XFP_N；XFP；XFP_C，创建了序型隐蔽马尔科夫模型（HMM）以代表所述木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶（XPK-XFP）的成员。如用户指南中所述，序型HMM是多重序列比对的统计模型。它们捕获关于比对中的每一列有多保守以及在每一位点哪种氨基酸残基最可能存在的位点特异性信息。因此，HMM具有正规的概率学基础。对于大量的蛋白质家族的序型HMMs在PFAM数据库（Janelia Farm Research Campus,Ashburn,VA）公开获得，见ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/databases/Pfam/releases/Pfam24.0/。
在BRENDA数据库中鉴定了八个具有实验验证的功能的木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶序列：
1.来自构巢曲霉（Aspergillus nidulans）FGSC A4的CBF76492.1（SEQ ID NO:355）
2.来自长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）的AAR98787.1（SEQID NO:379）
3.来自双歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）NCIMB41171的ZP_03646196.1（SEQ ID NO:381）
4.来自动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp.lactis）HN019的ZP_02962870.1（SEQ ID NO:388）
5.来自植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）WCFS1的NP_786060.1（SEQ ID NO:481）
6.来自短乳杆菌格雷夫斯亚种（Lactobacillus brevis subsp.gravesensis）ATCC27305的ZP_03940142.1（SEQ ID NO:486）
7.来自罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）100-23的ZP_03073172.1（SEQ ID NO468）
8.来自肠膜明串珠菌肠膜亚种（Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides）ATCC8293的YP_818922.1（SEQ ID NO:504）
所述BRENDA数据库是免费使用的信息系统，其包含所有分类的酶的生物化学和分子信息以及用于查询这个数据库和计算分子特性的软件工具。该数据库涵盖了分类与命名、反应和特异性、功能参数发生、酶的结构和稳定性、突变体和酶工程、制备和分离、酶的应用、以及配体相关数据的信息。（BRENDA，AMENDA and FRENDA the enzyme informationsystem:new content and tools in2009.Nucleic Acids Res.2009Jan；37（数据库期）:D588-92.Epub2008年11月4日，Chang A，Scheer M，Grote A，Schomburg I，Schomburg D。）所述八个序列用于构建如本文表6提供的序型HMM。
为进一步鉴定感兴趣的蛋白质，用四个序型HMM搜索所述436条序列：在表6中提供的序型HMM即生成的XPK_XFP_HMM以及对于所述三个结构域XFP_N的三个公布的序型；XFP；分别在表7、8和9中所述的XFP_C（PFAM数据库）。309蛋白质序列被保留下来，其长度在650个氨基酸至900个氨基酸之间，并包含这三个结构域。
所有309序列与实验验证的磷酸酮醇酶具有至少40%的同一性，除了12序列在35%的同一性距离之内。然而，所有309序列非常显著地匹配所有4个序型HMM。与XFP_XPK HMM、XFP_N、XFP和XFP_C序型HMM的最小显著匹配的E值分别为7.5E-242、1.1E-124、2.1E-49、7.8E-37。所述309序列提供在表5中，然而应当理解，任何通过所述方法鉴定的木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶可在如本文所述的宿主细胞中表达。在给出的登录信息如“互补序列（NN_NNNNN.N:X...Y）”的地方，应当理解为是指登录号NN_NNNNN.N的序列的反向互补序列，从核苷酸X至Y。当给出的登录信息为如“连接序列（NNNNNN.N:X..Y，NNNNNN.N:Z..Q）时，应当理解是指所得序列为将NNNNNN.N的核苷酸X至Y连接至NNNNNN.N的核苷酸Z至Q。
表5：木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶靶基因编码区和蛋白质 的SEQ IDNO
Figure BDA00002836347400411
Figure BDA00002836347400431
Figure BDA00002836347400441
Figure BDA00002836347400451
Figure BDA00002836347400461
Figure BDA00002836347400481
Figure BDA00002836347400501
Figure BDA00002836347400511
Figure BDA00002836347400521
Figure BDA00002836347400531
Figure BDA00002836347400541
Figure BDA00002836347400551
Figure BDA00002836347400561
Figure BDA00002836347400571
Figure BDA00002836347400591
Figure BDA00002836347400601
Figure BDA00002836347400611
Figure BDA00002836347400621
Figure BDA00002836347400631
许多编码磷酸酮醇酶的多核苷酸、基因和/或多肽的实例是本领域已知的，并可用于本文所公开的重组宿主细胞中。在多个实施方案中，所述磷酸转乙酰酶可为来自植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的EutD。在多个实施方案中，所述磷酸转乙酰酶可为来自枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的磷酸转乙酰酶。这个磷酸转乙酰酶对于乙酰-CoA具有的比活性为1371μmol/min/mg，并且米氏常数为0.06mM（Rado和Hoch，Biochim.Biophys.Acta.321：114-25，1973）。此外，根据下列公式得到这个反应的平衡常数（Keq）为154±14，有利于乙酰-CoA的形成：
Figure BDA00002836347400632
在多个实施方案中，宿主细胞包含多肽，其与表10的多肽或它们的活性片段或编码此类多肽的多核苷酸具有至少约80%、至少约85%、至少约90%或至少约99%的同一性。在多个实施方案中，所述磷酸转乙酰酶可为与SEQ ID NO:1472或其活性片段具有至少约80%、至少约85%、至少约90%或至少约99%的同一性的多肽。在其它实施方案中，编码磷酸转乙酰酶的多核苷酸、基因和/或多肽可包括但不限于在下列表10或表12中提供的序列。
表10：磷酸转乙酰酶靶基因编码区和蛋白质的SEQ ID NO
Figure BDA00002836347400641
附加的适宜的磷酸转乙酰酶靶基因编码区和蛋白质通过多样性搜索和聚类进行鉴定用所述植物乳杆菌（L.plantarum）的EutD蛋白质作为查询序列进行非冗余GenBank蛋白质数据库（NR）的blast搜索。采用了0.01的blast结尾值（E值）。这个搜索产生了2124个序列匹配。用CD-HIT程序聚类蛋白质，其参数设置为95%的序列同一性和90%的长度重叠，实现了冗余减少。最长的种子序列（代表每个簇）被保留用做进一步分析。聚类将蛋白质序列的数目减少至1336。通过移除序列<280氨基酸和序列>795氨基酸，对序列进一步清理产生了1231序列。
在Brenda数据库查询了实验验证的磷酸乙酰转移酶。在下列物种中发现了十三个：肠道沙门氏菌（S.enterica）、大肠杆菌（E.coli）K12、小韦荣菌（V.Parvula）、克鲁氏梭状芽孢杆菌（C.Kluyveri）、丙酮丁醇梭菌（C.Acetobutylicum）、热纤梭菌（C.Thermocellum）、甲烷八叠球菌（M.thermophila）、化脓性链球菌（S.pyogenes）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、发酵乳酸杆菌（L.fermentum）、植物乳杆菌（L.plantarum）、旧金山乳杆菌（L.sanfranciscensis）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、发酵乳酸杆菌（L.fermentum）、植物乳杆菌（L.plantarum）、旧金山乳杆菌（L.sanfranciscensis）、沼泽红假单胞菌（R.palustris）、大肠杆菌（E.coli）。
实验验证的磷酸乙酰转移酶（EC2.3.1.8）属于PTA_PTB pfam家族。然而，所述PTA_PTB结构域存在13种不同的架构（http://pfam.janelia.org/family/PF01515，Pfam数据库版本24）。调查所述结构域架构的机制是确定由BLAST搜索鉴定的蛋白质中哪些可能是磷酸乙酰转移酶。
从BRENDA数据库提取的实验验证的序列、以及在CD-HIT聚类和清理后保留下来的序列，对Pfam数据进行搜索以确定它们的结构域架构。Pfam是多重序列比对和序型隐蔽马尔科夫模型（HMM）的集合。每个Pfam HMM代表一个蛋白质家族或结构域。通过对Pfam HMM库搜索蛋白质序列，有可能确定其带有哪种结构域即它的结构域架构。（The Pfam蛋白质家族数据库：R.D.Finn，J.Tate，J.Mistry，P.C.Coggill，J.S.Sammut，H.R.Hotz，G.Ceric，K.Forslund，S.R.Eddy，E.L.Sonnhammer和A.Bateman Nucleic Acids Research（2008）数据库期36:D281-D288）
所述实验验证的蛋白质中的十二个只包含PTA_PTB结构域。两个序列，从沼泽红假单胞菌（R.palustris）至大肠杆菌（E.coli），包含两个结构域PTA_PTB和DRTGG、一个功能未知的结构域。因此，从CD-HIT聚类结果看，选中了仅包含PTA_PTB结构域（组1：549序列）或包含PTA_PTB+DRTGG结构域组合（组2：201序列）的蛋白质。
此外，所述PTA_PTB结构域，正如其名称所表明的，实际上不是磷酸乙酰转移酶所特异性的。该结构域也是磷酸丁酰转移酶（EC2.3.1.19）的标记。有两种方法区分这两个亚家族：使用乙酰转移酶和丁酰转移酶进行如下操作：
为进一步鉴定序列间的相互关系，进行了多重序列比对（MSA）、系统发育分析、序型HMM和GroupSim分析。对于这套分析，磷酸乙酰转移酶被分成两组。组1包含仅有PTA_PTB结构域的磷酸乙酰转移酶，而组2包含有PTA_PTB+DRTGG的磷酸乙酰转移酶。这里的动机是为了生产有相似长度的组。
用2.0版本的Clustal X，在默认参数下进行序列比对。（Thompson JD等人，The CLUSTAL_X windows interface:flexible strategies for multiplesequence alignment aided by quality analysis tools.Nucleic Acids Res.（1997）25:4876–4882.）
比对结果用于计算与参考序列的序列同一性%。如果将来自植物乳杆菌（L.plantarum）的序列作为参考，%ID的范围为从低至10.5%至最接近序列的75.6%。比对结果也为重建系统发育树提供基础。使用Jalview包版本2.3中可用的邻接法来生成树，并在MEGA4（Tamura、Dudley、Nei和Kumar2007）中将计算的树可视化。邻接法是一种用于重建系统发育树并且计算这个树的分支长度的方法。在每个阶段，所述树的两个最近的节点（术语“最近的节点”将在下一段中定义）被选出并定义为我们树中的邻居。递归地这样做直到所有的节点配对在一起。“The neighbor-joiningmethod:a new method for reconstructing phylogenetic trees.Mol Biol Evol.1987年7月；4（4）:406-25。Saitou N，Nei M.”Jalview版本2是一个用于交互式编辑、分析和注释多重序列比对的系统（Waterhouse，A.M.，Procter，J.B.，Martin，D.M.A，Clamp，M.和Barton，G.J.（2009）“Jalview Version2-a multiple sequence alignment editor and analysisworkbench”Bioinformatics25（9）1189-1191）。所述MEGA软件为从进化的角度进行探索、发现和分析DNA和蛋白质序列提供了工具。MEGA4实现了序列采集和进化分析的整合它包含了输入数据的阵列和用于可视化表示的多重结果浏览器；处理和编辑序列数据、序列比对、推断的系统发育树；以及估计的进化距离。所述结果浏览器允许使用者对他们的结果进行浏览、编辑、总结、输出和生成出版物质量的说明文字。MEGA4还包括距离矩阵和系统发育浏览器，以及用于输入数据和输出结果的可视化表示的高级图形模块（Tamura K，Dudley J，Nei M&Kumar S（2007）MEGA4:Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA）软件版本4.0.Molecular Biology and Evolution24:1596-1599）。
合在一起，%ID和生成的树（图4）显示潜在的磷酸乙酰转移酶（仅PTA_PTB结构域）分为两个主要亚家族。亚家族1从10.5%ID至~20%ID（176序列）和亚家族2从~20%ID至75.6%ID（361序列）。第三个亚家族，12序列，相对于植物乳杆菌（L.plantarum）序列具有%ID的范围从17%ID至25%ID。
基于包含在每个亚家族内的实验验证的序列计，亚家族1和亚家族2被确定分别代表磷酸丁酰转移酶（PTB）和磷酸乙酰转移酶（PTA）。
用GroupSim分析进行了亚家族1成员和亚家族2成员间的辨识（Capra和Singh（2008）Bioinformatics24:1473-1480）。GroupSim方法识别了确定蛋白质功能特异性的氨基酸残基。在对其序列被分成多个亚家族的蛋白质家族的多重序列比对中，可识别区分功能性亚家族间的序列的氨基酸残基。这个方法进行多重序列比对（MSA），在输入时进行已知特异性分组并在MSA中为每个氨基酸位点打分。高分表明氨基酸位点有较大可能是特异性决定位点（SDP）。
在537序列的MSA（通过以上的系统发育分析分成亚家族1和亚家族2）上进行的GroupSim分析识别出了高度辨识的位点。在表11中列出的为具有高于0.7分的位点（Pos），其中1.0的完美分值将表示在亚家族中的所有蛋白质在特异性位点都有列出的氨基酸，并且亚家族之间氨基酸总是不同的。所述“模式”列给出单字母代码的氨基酸。括号之间的数字表示在特定的位置上的每个氨基酸的出现频率。在列1中氨基酸位点的数字代表来自植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的PTA蛋白质序列，组2的代表蛋白质GI#28377658（SEQ ID NO:1472）。
表11：从GroupSim分析得到的对于亚家族1（PTB）和亚家族2 （PTA）的高度辨识的氨基酸位点。
Figure BDA00002836347400681
采用HMMER软件包对所述PTA和PTB亚家族的酶进行另一种结构/功能鉴定（序型HMM背后的理论描述参见R.Durbin、S.Eddy、A.Krogh和G.Mitchison，Biological sequence analysis:probabilistic models of proteinsand nucleic acids，Cambridge University Press，1998；Krogh等人，1994；J.Mol.Biol.235:1501–1531），按照购自HMMER的用户指南进行（JaneliaFarm Research Campus，Ashburn，VA）。
使用亚家族2中的实验验证序列（仅包含PTA_PTB结构域）的多重序列比对，生成代表亚家族2成员的序型隐蔽马尔科夫模型（HMM）。这些序列为：
1.来自旧金山乳杆菌（Lactobacillus sanfranciscensis）的BAB19267.1（SEQ ID NO:1475）
2.来自植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）WCFS1的NP_784550.1（SEQ ID NO:1472）
3.来自发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）ATCC14931的ZP_03944466.1（SEQ ID NO:1453）
4.来自枯草芽孢杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp.subtilis）菌株168的NP_391646.1（SEQ ID NO:1422）
5.来自嗜热甲烷八叠球菌（Methanosarcina thermophila）的AAA72041.1（SEQ ID NO:1277）
6.来自热纤梭菌（Clostridium thermocellum）DSM4150的ZP_03152606.1（SEQ ID NO:1275）
7.来自丙酮丁醇梭杆菌（Clostridium acetobutylicum）ATCC824的NP_348368.1（SEQ ID NO:1206）
8.来自克氏梭杆菌（Clostridium kluyveri）DSM555的YP_001394780.1（SEQ ID NO:1200）
9.来自小韦荣菌（Veillonella parvula）DSM2008的ZP_03855267.1（SEQ ID NO:1159）
10.来自肠道沙门氏菌沙门亚种副伤寒血清型A（Salmonella entericasubsp.enterica serovar Paratyphi A）菌株ATCC9150的YP_149725.1（SEQ ID NO:1129）
序型HMM的构建如下：在默认参数下使用Clustal X（接口至ClustalW）对亚家族2中的所述10种子序列（代表实验验证了功能的序列）进行比对。采用默认参数，对每个比对的序列的集合运行了hmmbuild程序。hmmbuild读取多重序列比对文件，构建新的序型HMM，并将所述序型HMM保存为文件。使用这一程序，从对上文所述的亚单元序列的每一集合的多重比对产生了未校正的序型。
用hmmcalibrate读取了序型HMM，hmmcalibrate以所述序型对大量合成的随机序列进行评分（所使用的合成序列的默认数量为5,000），将极值分布（EVD）拟合至这些评分的直方图，并重新存储已包括了EVD参数的HMM文件。当用序型搜索蛋白质序列数据库时，这些EVD参数（μ和λ）用于计算比对得分的E-值hmmcalibrate在标记为“EVD”的一行将两个参数写入HMM文件。这些参数为极值分布（EVD）的μ（位置）和λ（尺度）参数，所述EVD为在如SWISS-PROT的随机生成的大约相同的长度和残基组合物上计算得分的最适直方图。对所述序型HMM进行了一次校正。
表14提供了亚家族2集合的校准的序型HMM。所述序型HMM表给出了在所述氨基酸序列中出现在每个位点上的每种氨基酸的概率。氨基酸以单字母代码表示。每个位点的第一行报告了匹配发散得分：在那种状态的每种氨基酸的概率（最高分是高亮的）。第二行报告了插入状态发散得分，而第三行报告了状态过渡得分。M→M，M→I，M→D；I→M，I→I；D→M，D→D；B→M；M→E。表14显示在亚家族2序型HMM中，甲硫氨酸位于前两个位点的概率为3792和4481。
采用hmmsearch对所述亚家族2序型HMM进行评估，Z参数设置为十亿，其可将亚家族1成员同亚家族2的那些区别开来。hmmsearch程序用hmm文件代表亚家族2序型HMM和所有来自两个亚家族的全部序列，并将E-值得分赋给每条序列。这个E-值得分是对于序型HMM拟合性的量度；分值越低，拟合性就越好。所述序型HMM将亚家族2成员同亚家族1成员区别开，并且在最差得分的亚家族2成员（5e-34）和最优得分的亚家族1成员（4.3e-07）间存在大边际的E-值差异。这个分析显示为亚家族2磷酸乙酰转移酶（PTA）准备的序型HMM将PTA序列同来自磷酸丁酰转移酶PTB的蛋白质序列区分开来。
基于这些分析计，鉴定出361磷酸乙酰转移酶序列（仅PTA_PTB结构域）并提供在表12a中。
表12a：磷酸乙酰转移酶靶基因编码区和蛋白质的SEQ ID NO
Figure BDA00002836347400701
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Figure BDA00002836347400951
Figure BDA00002836347400961
此外，表12b中提供了特征在于两个结构域（DRTGG和PTA_PTB）的201磷酸乙酰转移酶序列。如上所述进行了MSA和系统发育分析。除了4个来源于植物生物体的序列外，相对于实验验证的（或人为策划的）序列的百分比同一性等于或大于40。此外，针对亚家族2（表14）的序型HMM进行的201序列的hmmer搜索，清楚地表明所有组2序列属于PTA亚家族（最小显著的E值为4.1e-93）。
表12b：磷酸乙酰转移酶靶基因编码区和蛋白质的SEQ ID NO
Figure BDA00002836347400962
Figure BDA00002836347400971
Figure BDA00002836347400981
Figure BDA00002836347400991
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Figure BDA00002836347401091
在其它实施方案中，编码磷酸转乙酰酶的多核苷酸、基因和/或多肽可与表10或12a或12b的任何一个序列具有至少约70%至约75%、约80%至约85%、约85%至约90%、约90%至约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的同一性，其中所述多核苷酸、基因和/或多肽编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽。
在多个实施方案中，编码磷酸转乙酰酶活性的多核苷酸、基因和/或多肽对应于酶学委员会编号EC2.3.1.8。
在其它实施方案中，本文所述或本领域记载的那些磷酸转乙酰酶多核苷酸、基因和/或多肽可用于鉴定在其它细胞中的磷酸转乙酰酶序列或磷酸转乙酰酶同源蛋白质，如上所述的PDC。
用于在包括但不限于酵母细胞的重组宿主细胞中表达基因的方法是本领域已知的（参见例如，Methods in Enzymology，第194卷，Guide toYeast Genetics and Molecular and Cell Biology（A部分，2004，ChristineGuthrie和Gerald R.Fink（编辑），Elsevier Academic Press，San Diego，CA）。在多个实施方案中，待表达的磷酸酮醇酶和/或磷酸转乙酰酶基因编码区可为针对靶宿主细胞密码子优化的，如本领域的技术人员所熟知。在包括但不限于酵母细胞的重组宿主细胞中的基因表达可需要可操作地连接至所关注的编码区的启动子和转录终止子。许多启动子可被用于构建基因的表达盒，包括但不限于下列的适合在酵母中使用的组成型启动子：FBA1、TDH3（GPD）、ADH1和GPM1；和下列的适合在酵母中使用的诱导型启动子：GAL1、GAL10和CUP1。其它酵母启动子包括杂合启动子UAS（PGK1）-FBA1p（SEQ ID NO:1893）、UAS（PGK1）-ENO2p（SEQ ID NO:1894）、UAS（FBA1）-PDC1p（SEQ ID NO:1895）、UAS（PGK1）-PDC1p（SEQ ID NO:1896）和UAS（PGK）-OLE1p（SEQ IDNO:1897）。可在嵌合基因构建体中用于表达的适用转录终止子包括但不限于FBA1t、TDH3t、GPM1t、ERG10t、GAL1t、CYC1t和ADH1t。
重组多核苷酸通常使用编码序列作为转化用嵌合基因的一部分进行克隆表达，所述嵌合基因包括可操作地连接至编码序列的启动子以及核糖体结合位点和终止控制区。所述编码区可来源于用于转化的宿主细胞，并与并非来源于编码磷酸酮醇酶和/或磷酸转乙酰酶的天然基因的原生调控序列结合。作为另外一种选择，所述编码区可来源于另一个宿主细胞。
用于转化多种宿主细胞的载体是常见的并在文献中有描述。载体通常包含选择性标记和在目标宿主中允许自主复制或染色体整合的序列。此外，适合的载体可包含允许实现转录起始控制的启动子区域和转录终止控制区，编码区DNA片段可被插入至二者之间，以提供所插入的编码区的表达。这两种控制区均可来源于与转化的宿主细胞同源的基因，但是应当理解，这种控制区也可来源于对被选择作生产宿主的特定物种来说是非天然的基因。
在多个实施方案中，适合的启动子、转录终止子和磷酸酮醇酶和/或磷酸转乙酰酶编码区可被克隆进大肠杆菌-酵母穿梭载体中，并被转化到酵母细胞。此类载体允许菌株在大肠杆菌和酵母菌株中繁殖，并且可包含选择性标记和允许在所期望的宿主中的自主复制或染色体整合的序列。在酵母中通常使用的质粒包括但不限于穿梭载体pRS423、pRS424、pRS425和pRS426（美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD），它们包含大肠杆菌复制起点（例如，pMB1）、酵母2-微米复制起点、以及用于营养选择的标记。这四种载体的选择标记是His3（载体pRS423）、Trp1（载体pRS424）、Leu2（载体pRS425）和Ura3（载体pRS426）。
在多个实施方案中，带有编码所述磷酸酮醇酶和/或磷酸转乙酰酶的嵌合基因的表达载体的构建，可在酵母中通过空位修复重组方法进行。在实施方案中，酵母载体DNA被消化（例如，在其多克隆位点），以在其序列中产生“空位”。制备所关注的多种插入DNA，所述插入DNA在其5'和3'端均包含约21bp的序列，所述序列依次彼此重叠和与载体DNA的5'和3'端重叠。例如，为构建“Gene X”的酵母表达载体，表达盒选择了酵母启动子和酵母终止子。所述启动子和终止子扩增自酵母基因组DNA，而基因X通过PCR扩增自其源生物，或者从包含基因X序列的克隆载体获得。至少21bp的重叠序列存在于在线性载体和启动子序列的5'之间、在启动子和基因X之间、基因X与终止子序列之间和在终止子与线性载体3'端之间。然后，所述“有间隙的”载体和所述插入DNA共转化到酵母菌株中并且接种到包含适宜化合物混合物的培养基上，将允许质粒上的营养选择标记互补。通过利用从选择的细胞制备的质粒DNA进行PCR作图，可验证正确的插入组合的存在。然后可将从酵母分离的质粒DNA（通常浓度较低）转入大肠杆菌菌株，例如TOP10，然后通过小量抽提和限制性作图进一步验证所述质粒构建体。最后，所述构建体可通过序列分析得到验证。
与缺口修复技术类似，向酵母基因组的整合也利用了酵母中的同源重组系统。在实施方案中，利用高保真DNA聚合酶和引物，包含编码区加上控制元件（启动子和终止子）和营养缺陷型标记的盒被PCR扩增，其中所述引物与所述盒杂交，并且包含与期望插入发生的基因组区域的5'和3’区同源的40-70碱基对的序列。然后将PCR产物转入酵母，并铺板于包含适当的化合物混合物的培养基上，所述混合物允许对所整合的营养缺陷型标记的选择。例如，为了将“基因X”整合至染色体位置“Y”中，从质粒DNA构建体PCR扩增启动子-编码区X-终止子构建体，并通过SOEPCR或普通的限制性消化和克隆将其与营养缺陷型标记（例如URA3）相连接。利用引物PCR扩增包含启动子-编码区X-终止子-URA3区域的完整的盒，其中所述引物包含与酵母染色体上“Y”位置的5'和3’区同源的40-70bp序列。上述PCR产物被转入酵母，并在缺乏尿嘧啶的生长培养基上进行选择。转化体可通过克隆PCR或通过对染色体DNA的直接测序得到验证。
本文所公开的在所述重组宿主细胞中存在的磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶活性可采用本领域已知的常规方法进行确认。在非限制性实例中，以及如本文实施例中所述，可用磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶基因的引物通过聚合酶链反应筛选转化子。在多个实施方案中，以及如本文实施例中所述，用引物N1039和N1040（SEQ ID NO:639和640）通过聚合酶链反应筛选转化子来确认xpk1基因的整合，而引物N1041和N1042（SEQ ID NO:641和642）可用于确认eutD基因的整合。在另一个非限制性实例中，以及如本文实施例中所述，在所述宿主细胞中通过筛选整合在Δpdc1::ilvD（Sm）基因座的磷酸酮醇酶和/或磷酸转乙酰酶构建体的ilvD（Sm）缺失来筛选转化子。
在另一个非限制性实例中，以及如本文实施例中所述，可通过在本文所公开的缺乏内源性磷酸酮醇酶活性的重组宿主细胞中表达磷酸酮醇酶（用本文所公开的方法进行鉴定）来测定磷酸酮醇酶的活性。如果存在磷酸酮醇酶活性，此类细胞表现出降低或消除了在培养物中生长对于外源二碳底物补充的需求。
在另一个非限制性实例中，以及如本文实施例中所述，可通过在本文所公开的缺乏内源性磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶活性的重组宿主细胞中表达磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶（用本文所公开的方法进行鉴定）来测定磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶的活性。如果存在磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶活性，此类细胞表现出降低或消除了在培养物中生长对于外源二碳底物补充的需求。
在另一个非限制性实例中，可通过更直接的方法确认磷酸酮醇酶和/或磷酸转乙酰酶的活性，如通过在需要磷酸酮醇酶活性的途径中测定下游产物的方法。例如，具有磷酸酮醇酶活性的多肽可催化木酮糖-5-磷酸转化为甘油醛-3-磷酸和乙酰-磷酸，和/或催化果糖-6-磷酸转化为赤藓糖-4-磷酸和乙酰-磷酸。还有，具有磷酸转乙酰酶活性的多肽可催化乙酰-磷酸转化为乙酰-CoA。
适宜的途径碳底物和外源二碳底物补充
PDC-KO不可在含葡萄糖的培养基（例如，2%的葡萄糖）上生长，但具有有功能的丁二醇生物合成途径的PDC-KO细胞已经表明可生长在补充了外源二碳底物（如乙醇）的葡萄糖上生长（参见例如，美国专利申请公布20090305363，以引用方式并入本文）。在多个实施方案中，本文所公开的宿主细胞可在发酵培养基中生长，所述发酵培养基包含适宜的途径碳底物和二碳底物补充，包括含有二碳底物补充的适宜的途径碳底物的组合。适宜的途径碳底物的非限制性实例包括但不限于：单糖，例如果糖；低聚糖，例如乳糖、麦芽糖、半乳糖或蔗糖；多糖，例如淀粉、纤维素或它们的混合物；以及来自可再生原料的未纯化混合物，例如干酪乳清渗透物、玉米浆、糖用甜菜糖蜜和大麦麦芽，包括它们的任何组合。在其它实施方案中，所述适宜的途径碳底物可包括乳酸盐、甘油或它们的组合。
在多个实施方案中，适宜的碳底物可为单碳底物如二氧化碳或甲醇，其代谢转化的关键生物化学中间体已经被阐明或它们的组合。在与甲基营养生物体相关的其它实施方案中，所述碳底物可为含碳化合物如甲胺、葡糖胺和多种代谢活性的氨基酸。在非限制性实例中，甲基营养酵母已知可利用来自甲胺的碳来形成海藻糖或甘油（Bellion等人，Microb.Growth ClCompd.，[Int.Symp.]，第7版（1993），415-32，编辑：Murrell，J.Collin；Kelly，Don P.Publisher:Intercept，Andover，UK）。在另一个非限制性实例中，不同种的假丝酵母菌（Candida）可代谢丙氨酸（Sulter等人，Arch.Microbiol.153:485-489（1990））。因此，预期本发明中所利用的碳源可涵盖各种含碳底物并且将仅受限于生物体的选择。
在其它实施方案中，对于被修饰以利用五碳（C5）糖的酵母细胞所述适宜的途径碳底物可为葡萄糖、果糖和蔗糖或这些与五碳（C5）糖如木糖和/或阿拉伯糖的混合物。在多个实施方案中，蔗糖可来源于可再生的糖源例如甘蔗、甜菜、木薯、甜高粱、以及它们的混合物。在其它实施方案中，葡萄糖和右旋糖可通过糖化淀粉基原料来源于可再生的谷物来源，包括谷物如玉米、小麦、裸麦、大麦、燕麦、以及它们的混合物。在多个实施方案中，所述途径碳底物可通过预处理和糖化过程来源于可再生的纤维素的或木质纤维素的生物质例如如美国专利申请公布US20070031918A1中所述，该专利以引用方式并入本文。
如本文所用，“生物质”是指任何纤维素的或木质纤维素的材料并包括但不限于包含纤维素，并且任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。在多个实施方案中，生物质也可包含附加组分如蛋白质和/或脂质。在其它实施方案中，生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物。例如，生物质可包括玉米棒和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的其它非限制性实例包括但不限于：玉米粒、玉米棒、作物残余如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、大豆、从谷物的研磨中获得的组分、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物。
本文所述的重组宿主细胞可使用本领域已知的标准实验室技术培养（参见例如，Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页）。在与含外源二碳底物的培养基补充相关的多个实施方案中，以及如实施例中所述，重组宿主细胞可生长在补充了一种或多种外源二碳底物的合成完全培养基中，如本文所述外源二碳底物的浓度是培养基的约0.01%、约0.05%、约0.1%、约0.5%、约1.0%、约1.5%、约1.5%或约2%（v/v）。在多个实施方案中，所述重组宿主细胞可生长在不含尿嘧啶或组氨酸、补充了0.5%（v/v）乙醇的合成完全培养物中。在与不补充外源二碳底物的培养基中生长相关的多个实施方案中，本文所述的重组宿主细胞可先在包含外源二碳底物的培养基中生长，然后稀释（例如，起始OD=0.1，125ml通风烧瓶中有20ml培养基）到未补充外源二碳底物的培养基中。
本文所述的重组宿主细胞的生长可使用本领域已知的方法测量（参见例如，Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页）。在非限制性实例中，本文所述的重组宿主细胞的生长情况可通过随着时间的推移测量细胞培养物的光密度（OD）来确定。例如，酵母培养物在600纳米的OD值与酵母细胞数量成正比。在另一个非限制性实例中，本文所述的重组宿主细胞的生长情况可通过随着时间的推移对样本中活细胞计数来确定。
申请人已经提供了细胞，所述细胞降低或消除了生长对于二碳底物补充的需求。在多个实施方案中，此类细胞包含（i）编码多肽的内源性基因中的缺失、突变和/或替换，所述多肽将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA，其导致对于最适生长需要外源二碳底物补充；（ii）编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸；以及任选地（iii）编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。在多个实施方案中，此类细胞包含（i）具有PDC活性的内源性多肽中的修饰，其导致降低或消除了PDC活性；（ii）编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸；以及任选地（iii）编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。因此，申请人还提供了改善重组宿主细胞的生长的方法，所述重组宿主细胞包含将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA的内源性多肽中的至少一个修饰，其导致对于最适生长需要外源二碳底物补充，所述方法包括用编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述宿主细胞。申请人还提供了改善重组宿主细胞的生长的方法，所述重组宿主细胞包含具有丙酮酸脱羧酶活性的内源性多肽中的至少一个修饰（例如，包含编码具有PDC活性的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换，其导致降低或消除PDC活性），所述方法包括用编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述宿主细胞。在其它实施方案中，所述方法还包括用具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化本文所述的重组宿主细胞。
申请人也提供了降低或消除重组宿主细胞的生长对外源二碳底物的需求的方法，所述重组宿主细胞包含将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA的内源性活性中的至少一个修饰，其导致对于最适生长需要外源二碳底物补充，所述方法包括用编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述宿主细胞，其包括用具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。在其它实施方案中，所述方法还包括用具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。
申请人也已经提供了降低重组宿主细胞的生长对外源二碳底物的需求的方法，所述重组宿主细胞包含具有丙酮酸脱羧酶活性的内源性多肽中的至少一个修饰（例如，编码具有PDC活性的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换），所述方法包括用编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。在其它实施方案中，所述方法还包括用具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。
此外，申请人已经提供了消除重组宿主细胞的生长对外源二碳底物的需求的方法，所述重组宿主细胞包含具有丙酮酸脱羧酶活性的内源性多肽中的至少一个修饰（例如，编码具有PDC活性的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换，其导致降低或消除PDC活性），所述方法包括用编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。在其它实施方案中，所述方法还包括用具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。
在多个实施方案中，降低对于外源二碳底物补充的需求可为本文所述的重组宿主细胞在不补充外源二碳底物的培养基中的生长速率，与包含将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA的内源性活性中的至少一个修饰的重组宿主细胞在补充外源二碳底物培养基中的生长速率相同或基本上相当。在多个实施方案中，此类生长速率可为包含将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA的内源性活性中的至少一个修饰的重组宿主细胞在补充了外源二碳底物的培养基中的生长速率的至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%。
在多个实施方案中，降低对于外源二碳底物补充的需求可为本文所述的重组宿主细胞在不补充外源二碳底物的培养基中的生长速率，与包含内源性PDC活性中的至少一个修饰的重组宿主细胞在补充外源二碳底物培养基中的生长速率相同或基本上相当。在多个实施方案中，此类生长速率可为包含内源性PDC活性中的至少一个修饰的重组宿主细胞在补充了外源二碳底物的培养基中的生长速率的至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%。
在其它实施方案中，本文所述的重组宿主细胞具有在不补充外源二碳底物的培养基中的生长速率，高于与包含将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA的内源性活性中的至少一个修饰的重组宿主细胞在不补充外源二碳底物培养基中的生长速率。
在其它实施方案中，本文所述的重组宿主细胞具有在不补充外源二碳底物的培养基中的生长速率，高于与包含内源性PDC活性中的至少一个修饰的重组宿主细胞在不补充外源二碳底物培养基中的生长速率。
在其它实施方案中，与包含将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA的内源性多肽中的修饰的重组宿主细胞相比，本文所述的重组宿主细胞可具有增加的葡萄糖消耗。
在其它实施方案中，与包含具有PDC活性的内源性多肽中的至少一个修饰（例如，编码具有PDC活性的多肽的异源性多核苷酸中的至少一个缺失、突变和/或替换，其导致降低或消除PDC活性）的重组宿主细胞相比，本文所述的重组宿主细胞可具有增加的葡萄糖消耗。
本文所述的重组宿主细胞的葡萄糖消耗可使用本领域已知的方法测量（参见例如，Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页）。在非限制性实例中，可通过用HPLC或用YSI Biochemistry Analyzer（YSI，Inc.，Yellow Springs，OH）对培养基中的葡萄糖量进行定量来测定葡萄糖消耗。
在其它实施方案中，提供了制备重组宿主细胞的方法，其包括用编码具磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含编码丙酮酸脱羧酶的内源性多核苷酸基因或多肽中的至少一个修饰（例如，编码具有丙酮酸脱羧酶活性的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换）。在其它实施方案中，所述方法还包括用具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。
在其它实施方案中，提供了将木酮糖-5-磷酸或果糖-6-磷酸转化为乙酰-磷酸的方法，其包括（i）提供如本文所述的重组宿主细胞或它们的组合；以及（ii）使所述重组宿主细胞在木酮糖-5-磷酸或果糖-6-磷酸转化为乙酰-磷酸的条件下生长。在其它实施方案中，提供了将木酮糖-5-磷酸或果糖-6-磷酸转化为乙酰-CoA的方法，其包括（i）提供如本文所述的重组宿主细胞或它们的组合；以及（ii）使所述重组宿主细胞在木酮糖-5-磷酸或果糖-6-磷酸转化为乙酰-CoA的条件下生长。
在其它实施方案中，提供了将乙酰-磷酸转化为乙酰-CoA的方法，其包括（i）提供如本文所述的重组宿主细胞或它们的组合；以及（ii）使所述重组宿主细胞在乙酰-磷酸转化为乙酰-CoA的条件下生长。在其它实施方案中，提供了在重组宿主细胞中增加具有磷酸酮醇酶活性的异源性多肽比活性的方法，其包括（i）提供如本文所述的重组宿主细胞或它们的组合；以及（ii）使所述重组宿主细胞在具有磷酸酮醇酶活性的异源性多肽以有功能的形式表达的条件下生长，其比活性以高于相同的缺乏具有磷酸酮醇酶活性的异源性多肽的重组宿主细胞。
在其它实施方案中，提供了在重组宿主细胞中增加具有磷酸转乙酰酶活性的异源性多肽比活性的方法，其包括（i）提供如本文所述的重组宿主细胞或它们的组合；以及（ii）使所述重组宿主细胞在具有磷酸转乙酰酶活性的异源性多肽以有功能的形式表达的条件下生长，其比活性以高于相同的缺乏具有磷酸转乙酰酶活性的异源性多肽的重组宿主细胞。
在其它实施方案中，提供了在重组宿主细胞中增加磷酸酮醇酶途径活性的方法，其包括（i）提供如本文所述的重组宿主细胞或它们的组合；以及（ii）使宿主细胞在宿主细胞中磷酸酮醇酶途径活性增加的条件下生长。
苏氨酸醛缩酶（E.C.号4.1.2.5）催化苏氨酸裂解以生成甘氨酸和乙醛。在啤酒糖酵母（S.cerevisiae）PDC-KO菌株中基于质粒的过表达编码这个酶的基因，显示消除了对于外源二碳补充的需求（van Maris等人，Appl Environ Microbiol.2003年4月，69（4）:2094-9）。在多个实施方案中，重组宿主细胞包含（i）编码多肽的内源性基因中的缺失、突变和/或替换，所述多肽将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA，其导致对于最适生长需要外源二碳底物补充；以及（ii）编码具有苏氨酸醛缩酶活性的多肽的异源性多核苷酸。
工程化的利用丙酮酸的生物合成途径
在多个实施方案中，本文所述的重组宿主细胞可工程化以具有生物合成途径以用于生成来源于丙酮酸的产物。来源于此类利用丙酮酸的生物合成途径的产物包括但不限于：2,3-丁二醇、异丁醇、2-异丁醇、2-丁酮、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、乳酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸和异戊醇。任何利用丙酮酸的生物合成途径的功能可以任何顺序在本文所述的重组宿主细胞中被工程化。与将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA（如丙酮酸脱羧酶、丙酮酸-甲酸裂解酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶或丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶）的内源性多肽中具有一个修饰的重组宿主细胞相比，在本文所公开的重组宿主细胞中，所述重组宿主细胞具有将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA的内源性多肽（如丙酮酸脱羧酶、丙酮酸-甲酸裂解酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶或丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶）中的修饰并具有异源性磷酸酮醇酶和/或磷酸转乙酰酶活性，可以更高的效率生成任何使用以丙酮酸作为初始底物的生物合成途径生成的产物。与具有PDC活性的内源性多肽中的修饰以降低或消除PDC活性的重组宿主细胞相比，在本文所公开的重组宿主细胞中，所述重组宿主细胞具有PDC活性的内源性多肽中的修饰并具有异源性磷酸酮醇酶和/或磷酸转乙酰酶活性，可更高效地生成任何使用以丙酮酸作为初始底物的生物合成途径生成的产物。
本文所述的重组宿主细胞的生物合成途径可为利用丙酮酸并产生所期望的产物的任何途径。所述途径的基因可包括内源性基因和/或异源性基因。在所述生物合成途径中通常有至少一个基因为异源性基因。用于生产丁醇的适当的生物合成途径是本领域中已知的，并且某些适当的途径描述于本文中。在一些实施方案中，所述丁醇生物合成途径包含至少一种对宿主细胞是异源的基因。在一些实施方案中，所述丁醇生物合成途径包含一种以上对宿主细胞是异源的基因。在一些实施方案中，所述丁醇生物合成途径包含异源性基因，所述异源性基因编码的多肽对应于生物合成途径的每一步骤。
本文和/或本领域已描述了可用于底物以生成如本文所述产物转化的基因和多肽，以及鉴别此类基因和多肽的方法例如对于异丁醇，参见实施例和美国专利公开7,851,188。酮醇酸还原异构酶（KARI）的描述参见美国专利申请公布20080261230A1、20090163376A1、20100197519A1和PCT申请公布WO/2011/041415。本文所述的KARI的实例为那些来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、霍乱弧菌（Vibrio cholera）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1和荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）PF5突变体。KARI包括Anaerostipes caccae的KARI变体“K9G9”和“K9D3”（分别为SEQ ID NO:1911和1910）。美国专利申请公布20100081154A1和美国专利公开7,851,188描述了二羟基丙酸脱水酶（DHAD），包括来源于变异链球菌（Streptococcus mutans）的DHAD。美国专利申请公布20090269823A1描述了SadB，来源于木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans）的乙醇脱氢酶（ADH）。乙醇脱氢酶也包括马肝ADH和Beijerinkia indica ADH（蛋白质SEQ ID NO:1923）。
用于生成2,3-丁二醇的生物合成途径的实施例可在本文所述的重组宿主细胞中工程化，如美国专利申请20090305363中所述，其以引用方式并入本文。所述2,3-丁二醇生物合成途径是2-丁醇生物合成途径的一部分，其公开于美国专利申请公开US20070292927A1，其以引用方式并入本文。此类途径的步骤包括但不限于：由乙酰乳酸合成酶将丙酮酸转化为乙酰乳酸；由乙酰乳酸脱羧酶将乙酰乳酸转化为乙偶姻；以及由丁二醇脱氢酶将乙偶姻转化为2,3-丁二醇。技术人员将会知道，具有此类途径的步骤的活性的多肽，可从多种来源分离并且可被用于本文所述的重组宿主细胞中。
此外，可在本文所述的重组宿主细胞中工程化的用于生成2-丁酮或2-丁醇的生物合成途径的实施例，公开于美国专利申请公布US20070292927A1和US20070259410A1，其以引用方式并入本文。美国专利申请公布US20070292927A1中的途径与就丁二醇的生产所公布的是相同的，不过增加了下列步骤：
-2,3-丁二醇至2-丁酮的转化，由例如二醇脱水酶或甘油脱水酶催化；以及
-2-丁酮至2-丁醇的转化，由例如丁醇脱氢酶催化。
美国专利申请公布US20090155870A1（其以引用方式并入本文）中描述了用于利用美国专利申请公布US20070292927A1公开的生物合成途径的2-丁醇生产的嵌合基因的构建和酵母的基因工程改造。对与这些途径相关的基因构建和表达的进一步描述可见于例如国际公布WO2009046370（例如，丁二醇脱水酶）；和美国专利申请公布US20090269823A1（例如，丁醇脱氢酶）和美国专利申请公布US20070259410A1，其以引用方式并入本文。技术人员将会知道，具有此类途径的步骤的活性的多肽，可从多种来源分离并且可被用于本文所述的重组宿主细胞中。
可被使用的用于生产异丁醇的生物合成途径包括那些描述于美国专利公开7,851,188和PCT公开WO2007050671中，上述专利以引用方式并入本文。异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
-丙酮酸至乙酰乳酸的转化，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
-乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸的转化，其可被例如乙酰羟酸催化；
-2,3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸的转化，其可被例如乙酰羟酸脱水酶催化；
-α-酮异戊酸至异丁醛的转化，其可被例如支链酮酸脱羧酶催化；
以及
异丁醛至异丁醇的转化，其可被例如支链醇脱氢酶催化。在一些实施方案中，所述异丁醇生物合成途径包含对所述酵母细胞是异源的至少一种基因、至少两种基因、至少三种基因或至少四种基因。在多个实施方案中，在重组宿主细胞中由异源性多肽催化异丁醇生物合成途径中每个底物至产物的转化。在多个实施方案中，所述催化乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸的底物至产物转化的多肽，和/或催化异丁醛至异丁醇的底物至产物转化的多肽，可利用NADH作为辅因子。
可被工程化至本文所述的重组宿主细胞中的用于生产缬氨酸的生物合成途径的实例包括下列步骤：乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸的转化，由乙酮醇酸还原异构酶（ILV5）催化；2,3-二羟基异戊酸至2-酮-异戊酸的转化，由二羟酸脱水酶（ILV3）催化；以及2-酮-异戊酸至缬氨酸的转化，由支链氨基酸转氨酶（BAT2）和支链氨基酸氨基转移酶（BAT1）催化。亮氨酸的生物合成包括直到2-酮-异戊酸的相同步骤，然后是2-酮-异戊酸通过α-异丙基苹果酸合酶（LEU9，LEU4）转化为α-异丙基苹果酸、α-异丙基苹果酸通过异丙基苹果酸异构酶（LEU1）转化为β-异丙基苹果酸、β-异丙基苹果酸通过β-IPM脱氢酶（LEU2）转化为α-酮异己酸、以及α-酮异己酸通过支链氨基酸转氨酶（BAT2）和支链氨基酸氨基转移酶（BAT1）转化为亮氨酸的步骤。对于缬氨酸或亮氨酸的生产，所述的这些途径中的至少一种酶的过表达是期望的。
可被工程化至本文所述的重组宿主细胞中的用于生产异戊醇的生物合成途径的实例包括下列步骤：亮氨酸至α-酮异己酸的转化，由支链氨基酸转氨酶（BAT2）和支链氨基酸氨基转移酶（BAT1）催化；α-酮异己酸至3-甲基丁醛的转化，由酮异己酸脱羧酶（THI3）或脱羧酶ARO10催化；以及最后的3-甲基丁醛至异戊醇的转化，由醇脱氢酶如ADH1或SFA1催化。异戊醇的生产受益于提高的亮氨酸或α-酮异己酸的生产，由这些化学品的生物合成途径中一种或多种酶的过表达介导。此外，用于最后两个步骤的一种或全部两种酶可以是过表达的。
可被工程化至本文所述的重组宿主细胞中的用于生产乳酸的生物合成途径的实例包括由乳酸脱氢酶催化的丙酮酸至乳酸的转化。工程化改造酵母用于用乳酸脱氢酶（被称为EC1.1.1.27）生产乳酸，是本领域中熟知的，例如在Ishida等人（Appl.Environ.Microbiol.71:1964-70（2005））。
可被工程化至本文所述的重组宿主细胞中的用于生产丙氨酸的生物合成途径的实例包括由氨基转移酶催化的丙酮酸至丙氨酸的转化。
本文所述可在所述重组宿主细胞中工程化的用于生成苹果酸酯的生物合成途径实施例，包括由丙酮酸羧化酶将丙酮酸转化为草酰乙酸，以及由苹果酸脱氢酶将草酰乙酸转化为苹果酸，如Zelle等人所述（Applied andEnvironmental Microbiology 74:2766-77（2008））。此外，苹果酸转移蛋白质可被表达。
本文所述可在所述重组宿主细胞中工程化的用于生成延胡索酸酯的生物合成途径实施例，包括由丙酮酸羧化酶将丙酮酸转化为草酰乙酸，以及由苹果酸脱氢酶将草酰乙酸转化为苹果酸，如Zelle等人所述（Applied andEnvironmental Microbiology 74:2766-77（2008））。此外，可表达延胡索酸酶和延胡索酸转运蛋白质。良好的生产条件和用于生产延胡索酸酯的工程化真菌是本领域所熟知的，其描述参见例如Goldberg等人（Journal ofChemical Technology and Biotechnology 81:1601-1611（2006））。
本文所述的可在重组宿主细胞中工程化的用于生成琥珀酸酯的生物合成途径实施例包括由丙酮酸羧化酶将丙酮酸转化为草酰乙酸，以及由苹果酸脱氢酶将草酰乙酸转化为苹果酸，如Zelle等人所述（Applied andEnvironmental Microbiology74:2766-77（2008））。此外，可表达延胡索酸酶、琥珀酸脱氢酶和琥珀酸转运蛋白质。
技术人员将会知道，具有上述生物合成途径的活性的多肽可从多种来源分离并且可被用于本文所述的重组宿主细胞中。
应当理解，包含丁醇生物合成途径，如本文提供的异丁醇生物合成途径的宿主细胞还可包含一个或多个附加的修饰。美国专利申请公布20090305363（以引用方式并入）公开了通过工程化酵母以表达定位于胞质的乙酰乳酸合酶和基本除去丙酮酸脱羧酶活性而提高丙酮酸至乙酰乳酸的转化。降低甘油-3-磷酸脱氢酶的活性的修饰，和/或干扰至少一个基因，其编码具有丙酮酸脱羧酶或的多肽，或干扰至少一个基因，其编码一个控制丙酮酸脱羧酶基因表达的调节元件，如美国专利申请公布20090305363所述（以引用方式并入本文），对宿主细胞的修改通过Entner-Doudoroff途径提供增加的碳流量或降低等价平衡，如美国专利申请公布20100120105所述（以引用方式并入本文）。其它的修饰包括整合至少一种多核苷酸，其编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中一个步骤的多肽。其它的修饰包括编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的内源性多核苷酸中的至少一个缺失、突变和/或替换。在多个实施方案中，所述具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽为啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisae）的YMR226C（SEQ ID NO:1912）或它们的同源物。附加的修饰包括编码具有醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性的多肽的内源性多核苷酸中的缺失、突变和/或替换。在多个实施方案中，所述具有醛脱氢酶活性的多肽为来自啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）的ALD6（SEQ ID NO:1909）或它们的同源物。在其中该酵母生产的宿主细胞是pdc-的具有降低葡萄糖抑制的基因修饰，其描述参见美国专利申请公开20110124060，其以引用方式并入本文。
重组宿主细胞可还包含（a）编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸；和（b）（i）编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一种缺失、突变和/或替换；和/或（ii）编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的至少一种异源性多核苷酸。在多个实施方案中，所述影响Fe-S簇生物合成的多肽由AFT1（核酸SEQ ID NO:1913，氨基酸SEQ ID NO:1914），AFT2（SEQ ID NO:1915和1916），FRA2（SEQ IDNO:1917和1918），GRX3（SEQ ID NO:1919和1920），或CCC1（SEQID NO:1921和1922）编码。在多个实施方案中，所述影响Fe-S簇生物合成的多肽为组成型突变体AFT1L99A、AFT1L102A、AFT1C291F或AFT1C293F。
发酵培养基
本文所公开的重组宿主细胞可在用于生产利用丙酮酸的产物的发酵培养基中生长。对于一些产物的最大生产，如2,3-丁二醇、异丁醇、2-丁酮或2-丁醇，本文所公开的作为产物宿主的重组宿主细胞优选地具有对生产的化学品的增强的耐受性，并且具有很高的碳水化合物利用速率。这些特征可通过诱变和选择、基因工程化赋予或可为天然存在的。
用于生产本文所公开的产物的发酵培养基可包含葡萄糖。用于产物生成途径的附加的碳底物可包括但不限于以上所述的那些。预期本发明中所利用的碳源可涵盖各种含碳底物并且将仅受限于生物体的选择。
除了合适的碳源外，发酵培养基还可含有本领域的技术人员已知的适合培养物生长和促进所期望的产物的生产所必需的酶途径的矿物质、盐、辅因子、缓冲剂及其它组分。
培养条件
通常，使细胞在约20℃至约37℃的温度范围下在合适的培养基中生长。对于本文所述的重组宿主细胞适宜的生长培养基是普通的商品化制备的培养基，例如包含了酵母氮源、硫酸铵和作为碳/能源的右旋糖的肉汤，或者YPD培养基，蛋白质胨、酵母提取物和右旋糖以大多数啤酒糖酵母菌株生长的最适比例的一种混合物。也可以使用其它确定的或合成的生长培养基，微生物学或发酵科学领域的技术人员将知道用于具体微生物生长的合适培养基。
适于发酵的pH范围在pH3.0至pH7.5之间，其中pH4.5至pH6.5优选作为起始条件。
发酵可在有氧或厌氧条件下进行，其中厌氧或微氧条件是优选的。
发酵培养基中产物的量可使用本领域已知的多种方法进行测定，例如高效液相色谱（HPLC）或气相色谱（GC）。
工业分批发酵和连续发酵
分批发酵方法可用于本文所述的重组宿主细胞。经典的分批发酵是封闭系统，其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不进行人工改变。因此在发酵开始时，用所需生物体对培养基进行接种，在不向系统添加任何物质的情况下进行发酵。然而，通常来说，“分批”发酵是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批发酵系统中，代谢产物和生物质组成持续改变直至发酵结束时。在分批培养物内，细胞发展通过静态延滞期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。通常，对数期中的细胞负责产生大部分终产物或中间产物。
补料-分批系统也可用于本文所述的重组宿主细胞。补料-分批系统与典型的分批系统相似，除了在发酵过程中增量添加碳源底物。在分解代谢阻遏往往抑制细胞的代谢作用（例如，葡萄糖抑制）以及在期望培养基中具有有限量的底物的情况下，补料分批式系统是有用的。补料分批式系统中的实际底物浓度难以测量并因而可根据可测量因素例如pH、溶解氧以及废气如CO2的分压进行评估。分批发酵和补料-分批发酵在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见于如下文献：Thomas D.Brock，Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiolog，第二版，1989，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.，或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36:227，1992，它们以引用方式并入本文。
虽然可采取成批模式，也预期也可对本文所述的重组宿主细胞采取连续发酵方法。连续发酵是一种开放式系统，其中将设定好的发酵培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续发酵一般使培养物维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高密度。
连续发酵允许调节一种因素或任意数目的因素，这些因素影响细胞生长或终产物浓度。例如，一种方法将维持限制性营养物质例如碳源或氮水平处于固定速率并允许所有其它参数变化。在其它系统中，影响生长的许多因素可以连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统力求维持稳态的生长条件，并因而在发酵过程中由于培养基被取出而导致的细胞损失必须与细胞的生长率保持平衡。用于调节连续发酵工艺中的营养物质和生长因子的方法以及使产物形成速率保持最高水平的方法是工业微生物领域众所周知的，并且多种方法已由Brock（同上）详细描述。
预期可采用分批发酵、补料分批发酵或采用连续发酵工艺来实施本发明，并且任何已知的发酵模式均将适用。另外，预期可将细胞固定在底物上而作为完整的细胞催化剂并让其经受发酵条件以生产。
从发酵培养基分离产物
产物可采用本领域技术人员已知的方法从发酵培养基分离。生物生产的异丁醇可使用本领域已知的方法用于ABE发酵（参见例如，Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.49:639-648（1998），Groot等人，Process.Biochem.27:61-75（1992），以及其中的参考文献）。例如，可通过离心、过滤、滗析等方法从发酵培养基中移除固体。然后，所述异丁醇可采用如蒸馏、共沸蒸馏、液-液提取、吸附、气体汽提、膜蒸发、全蒸发或真空闪发酵的方法从发酵培养基分离（参见例如美国专利公开20090171129A1和国际专利公开WO2010/151832A1，二者全文均以引用的方式并入本文）。
因为丁醇与水形成低沸点的共沸混合物，蒸馏可被用于分离混合物直至其共沸组成。蒸馏可与其它分离方法组合使用以分离共沸物。可与蒸馏组合使用以分离并纯化丁醇的方法包括但不限于滗析、液-液提取、吸附和基于膜的技术。此外，可使用共沸蒸馏用夹带剂（参见例如Doherty和Malone，Conceptual Design of Distillation Systems，McGraw Hill，NewYork，2001）分离丁醇。
丁醇-水混合物形成非均相共沸物，从而可组合使用蒸馏和滗析以分离并纯化异丁醇。在这种方法中，蒸馏包含异丁醇的发酵液使其接近共沸组成。然后冷凝共沸混合物，并且通过滗析从发酵培养基分离异丁醇。滗析后的含水相可作为回流返回第一蒸馏塔。富含异丁醇的滗析有机相可通过在第二蒸馏塔中蒸馏进一步被纯化。
也可从发酵培养基中组合使用液-液提取和蒸馏分离丁醇。在这种方法中，使用液-液提取用合适溶剂从发酵液中提取异丁醇。然后蒸馏包含异丁醇的有机相以从溶剂中分离丁醇。
蒸馏结合吸附也可用于从发酵培养基中分离异丁醇。在这种方法中，蒸馏包含异丁醇的发酵液使其接近共沸组成，然后使用吸附剂移除剩余的水，所述吸附剂例如分子筛（Aden等人，Lignocellulosic Biomass toEthanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute AcidPrehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover，Report NREL/TP-510-32438，National Renewable Energy Laboratory，2002年6月）。
此外，也可组合使用蒸馏和全蒸发以从发酵培养基中分离并纯化异丁醇。在这种方法中，蒸馏包含异丁醇的发酵液使其接近共沸组合物，然后用全蒸发通过亲水性膜移除剩余的水（Guo等人，J.Membr.Sci.，245，199-210（2004））。
原位产物移除（ISPR）（也被称为提取发酵）可用于从生产其的发酵容器中移除丁醇（或其它发酵性醇），从而使微生物高产率生产丁醇。本领域已描述的移除发酵性醇的一种ISPR方法为液-液提取。一般来讲，关于丁醇发酵例如所述包括微生物的发酵培养基，在丁醇浓度达到毒性水平之前与有机提取剂接触。所述有机提取剂和所述发酵培养基形成两相混合物。所述丁醇分配至有机提取剂相，降低了在包含微生物的水相中的浓度，从而限制了微生物在抑制性的丁醇中的暴露。
可进行液-液提取例如按照美国专利申请公布20090305370中所述的流程，其公开内容以全文形式并入本文。美国专利申请公布20090305370描述了采用液-液提取生产和从发酵液中移除丁醇的方法，所述方法包括了将发酵液同与水不混溶的提取剂接触、已形成包含水相和有机相的两相混合物的步骤。通常，所述提取剂可为选自饱和的、单不饱和的、多不饱和的（以及它们的混合物）C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它们的混合物。用于ISPR的所述提取剂可为非醇提取剂。所述ISPR提取剂可为外源有机提取剂，如油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、十四醇、硬脂醇、1-十一醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、十一醛、月桂醛、20-甲基十一醛、以及它们的混合物。
在一些实施方案中，所述醇可通过在发酵培养基中将醇与有机酸（例如，脂肪酸）和能够将醇与有机酸酯化的催化剂（例如，酶如脂肪酶）接触而酯化。在此类实施方案中，所述有机酸可作为ISPR提取剂，其中分配了醇酯。所述有机酸可供给至发酵容器和/或来源于添加至发酵容器中提供可发酵碳的生物质。原料中存在的脂类可被催化水解为有机酸，并且相同的催化剂（例如，酶）可将有机酸和醇酯化。所述催化剂可在发酵前供给制原料中，或在供给原料前或与其同时供给到发酵容器中。当所述催化剂供给至发酵容器中时，可通过所述脂类水解为有机酸并且基本上同时发生有机酸与发酵容器中存在的丁醇酯化，从而获得醇酯。有机酸和/或非来源于原料的天然油脂也可添加至发酵容器中，其中所述天然油脂被水解为有机酸。任何未与所述醇酯化的有机酸均可作为ISPR提取剂的一部分。所述包含醇酯的提取剂可从发酵培养基中分离，并且所述醇可从提取剂中回收。所述提取剂可在发酵容器中循环利用。因此，在丁醇生产的案例中例如将丁醇转化为酯降低了发酵培养基中游离丁醇浓度，屏蔽了来自增加的丁醇浓度对于微生物的毒性效应。此外，未磨碎谷物可用做原料而不用分离其中的脂类，由于这些脂类可被催化水解为有机酸，从而降低ISPR提取剂中脂类积累速率。
原位产物移除可以成批模式或连续模式进行。在连续模式的原位产物移除中，产物从反应器中持续地移除。在分批模式的原位产物移除中，一定体积的有机提取剂加入至发酵容器中，并且在这个过程中不移除所述提取剂。对于原位产物移除，有机提取剂可在形成两相发酵培养基的发酵开始时接触发酵培养基。作为另外一种选择，有机提取剂可在微生物达到期望的生长量之后与发酵培养基接触，其中所述生长量的达到可通过测定培养物的光密度确定。而且，所述有机提取剂可在发酵培养基中的产物醇水平到达预设水平时接触发酵培养基。在安装本发明的一些实施方案的丁醇生产案例中，所述有机酸提取剂可在发酵培养基中的丁醇水平到达毒性水平之前接触发酵培养基，以便将丁醇与有机酸酯化为丁醇酯，从而降低丁醇在发酵容器中的浓度。然后在丁醇酯达到期望的有效滴度后，所述含酯的有机相可从发酵容器中移除（并于与组成水相的发酵液分离）。在一些实施方案中，在发酵容器中的可利用发酵糖的发酵基本上完成后，所述含酯的有机相可与水相分离。
实施例
所用缩写的意义如下：“min”意为分钟，“h”意为小时，“sec”意为秒，“μl”意为微升，“ml”意为毫升，“L”意为升，“nm”意为纳米，“mm”意为毫米，“cm”意为厘米，“μm”意为微米，“mM”意为毫摩尔每升，“M”意为摩尔，“mmol”意为毫摩尔，“μmole”意为微摩尔，“g”意为克，“μg”意为微克，“mg”意为毫克，“rpm”意为每分钟转数，“w/v”意为重量/体积，“v/v”意为体积/体积，“OD”意为光密度，“bp”意为碱基对，并且“PCR”意为聚合酶链反应。
一般方法：
在实施例中使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning:A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；T.J.Silhay，M.L.Bennan和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1984；和Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.andWiley-Interscience，N.Y.，1987。HF Master Mix（NEB Cat.F-531）和Master Mix（Qiagen Cat.203443）分别用于基因克隆和克隆筛选的聚合酶链反应。
适合细菌培养物维持及生长的材料和方法在领域内也是众所周知的。适用于如下实施例的技术可在如下文献列出的内容中找到：Manual ofMethods for General Bacteriology,Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，RalphN.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.BriggsPhillips编辑，American Society for Microbiology，Washington，DC.1994；或Thomas D.Brock，Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，1989。除非另外指明，使用的用于细菌细胞生长和维持的所有试剂、限制性内切酶和材料均得自Aldrich Chemicals（Milwaukee，WI）、BD Diagnostic Systems（Sparks，MD）、Life Technologies（Rockville，MD）或Sigma ChemicalCompany（St.Louis，MO）。
HPLC
对发酵副产物组成的分析是本领域的技术人员所熟知的。例如，一种使用Shodex SH-1011柱和Shodex SH-G保护柱（二者均可购自WatersCorporation，Milford，MA）并联合折射率（RI）检测的高效液相色谱（HPLC）方法。用0.01M H2SO4作为流动相，以0.5mL/min流量和50℃的柱温实现色谱分离。异丁醇保留时间为47.6分钟。对于丁二醇，内消旋-丁二醇在26.0min洗脱，而2R,3R-丁二醇在27.7min洗脱。
实施例1
构建磷酸酮醇酶/磷酸转乙酰酶表达盒
所述xpk1和eutD基因（GenBank GI号分别为28379168（SEQ ID NO:172）和28377658（SEQ ID NO:1111））是采用引物N1039和N1040（用于xpkl）以及N1041和N1042（用于eutD）通过聚合酶链反应，从植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）（ATCC No.BAA-793）中得到的。所述N1039、N1040、N1041和N1042的引物序列分别对应于SEQ ID NO:639-642。
所述xpk1和eutD基因通过重叠聚合酶链反应方法，与包含相反的酵母终止子（CYC和ADH终止子，获得自PacI消化pRS423::CUP1-alsS+FBA-budA，其描述参见美国专利申请公开20090155870，以引用方式并入本文）的DNA片段融合（Yu等人，Fungal Genet.Biol.41:973-981，2003）。采用空位修复方法将所得的PCR产物克隆至大肠杆菌（E.coli）酵母穿梭载体（Ma等人，Genetics58:201-216;1981）。所述穿梭载体是基于pRS426（ATCC No.77107）的并包含GPD（也被称为TDH3）和ADH1启动子。所得包含xpk1的载体在GPD启动子的控制下，而在相反的方向eutD在ADH1启动子的控制下。所得载体（pRS426::GPD-xpk1+ADH1-eutD）的序列已提供如SEQ ID No:643（参见图5的这个载体图谱）。
实施例2
构建磷酸酮醇酶/磷酸转乙酰酶整合载体
通过EcoRI和SacI限制酶酶切制备所述pRS426::GPD-xpk1+ADH1-eutD载体的表达盒（GPD-xpk1+ADH1-eutD）。所得表达盒连接至酵母整合载体pUC19-URA3-MCS，其也是通过EcoRI和SacI限制酶酶切制备的。
载体pUC19-URA3MCS是基于pUC19的并包含来自啤酒糖酵母（Saccaromyces cerevisiae）URA3基因的序列，其位于多克隆位点（MCS）内。pUC19（美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA；ATCC#37254）包含pMB1复制子和用于在大肠杆菌中复制和选择的编码β-内酰胺酶的基因。除URA3的编码序列外，该基因的上游至下游序列都被包括用于在酵母中表达URA3。所述载体可用于克隆的目的，并且可用做酵母整合载体。
所述DNA涵盖了URA3编码区，连同URA3基因上游250bp和下游150bp，所述URA3编码区来自啤酒糖酵母（Saccaromyces cerevisiae）CEN.PK113-7D（CBS8340；Centraalbureau voor Schimmelcultures（CBS）Fungal Biodiversity Centre，Netherlands）基因组DNA扩增采用引物oBP438（SEQ ID NO:644），其包含BamHI、AscI、PmeI和FseI，以及oBP439（SEQ ID NO:645），其包含XbaI、PacI和NotI限制性酶切位点。基因组DNA使用Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）来制备。所述聚合酶链反应产物和pUC19经BamHI和XbaI消化后，用T4连接酶连接生成载体pUC19-URA3MCS。所述载体通过聚合酶链反应和测序来确认，所用引物为oBP264（SEQ ID NO:646）和oBP265（SEQ IDNO:647）。
所述连接反应转化至大肠杆菌（E.coli）Stbl3细胞，按照制造商的说明（Invitrogen，Carlsbad，CA，Cat.C7373）。转化子采用引物N1041和N1042用聚合酶链反应（PCR）筛选以检测eutD基因（序列分别为SEQID NO:641和642）。通过PCR检测到eutD基因表达的阳性克隆通过SacII限制性酶消化载体来进一步确认eutD基因的整合。
选出两个确认的克隆，并且如下所述将整合靶向序列添加至克隆中。用PCR扩增啤酒糖酵母（S.cerevisiae）菌株BY4700（ATCC No.200866）基因组的PDC1基因的5’和3’，使用的引物如下：N1049和N1050（5’）以及N1047和N1048（3’）（序列分别为SEQ ID NO:648-651）。引物N1049使得所述PDC1的3’端的161bp序列通过PCR与PDC1的5’端的237bp序列融合。这个pdc13’-5’-融合片段（长度为368bp）按照制造商的说明克隆至pCRII-Blunt TOPO载体（Invitrogen，Carlsbad，CA，Cat.K2800）。
采用引物N1047和N1050通过PCR检测pdc13’-5’-融合片段来筛选转化子。从阳性克隆中分离pdc13’-5’-融合片段，并用EcoRI酶消化释放，然后连接至pUC19-URA3::GPD-xpk1+ADH-eutD载体，其已经通过EcoRI限制酶消化而线性化以生成“磷酸酮醇酶途径”载体。此外，所述pdc13’-5’-融合片段连接至用EcoRI限制酶消化的pUC19-URA3-MCS上，以生成对照载体。按照制造商的说明将这两个连接反应转化至大肠杆菌（E.coli）Stbl3细胞（Invitrogen，Carlsbad，CA，Cat.C7373）。采用引物N1047和N1050通过PCR检测pdc13’-5’-融合片段来筛选所得转化子。鉴定包含pdc13’-5’-融合片段的阳性克隆，并且所述载体用NcoI限制酶（对照载体）或BsgK限制酶（磷酸酮醇酶途径载体）消化以确认克隆的方向。选取一个对照克隆（=pUC19-URA3::pdc1）和一个磷酸酮醇酶途径克隆（=pUC19-URA3::pdc1::GPD-xpk1+ADH1-eutD；SEQ ID NO:1898）进行整合。
实施例3
构建包含磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶基因的丙酮酸脱羧酶敲除（PDC- KO）酵母菌株
如实施例2中所述的对照物和磷酸酮醇酶途径载体用Aflll限制酶线性化，并转化至菌株BP913（CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvD（Sm）Δpdc5::sadB）以形成对照物和磷酸酮醇酶途径菌株。菌株BP913在实施例10中进一步描述。
转化的细胞涂布在合成弯曲培养基上，其不含尿嘧啶、包含乙醇作为单一碳源（1%v/v），并采用引物N238和oBP264（序列分别为SEQ IDNO:652和646）通过PCR进行筛选，以确认在pdc1基因座处的整合。在Δpdc1::ilvD（Sm）基因座处的整合导致ilvD（Sm）的丢失。
实施例4
导入磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶使PDC-KO细胞在没有外源二碳底物 补充条件下生长
如图所示丙酮酸脱羧酶敲除（PDC-KO）酵母菌株不可在包含2%葡萄糖作为单一碳源的培养基中生长，但转化了一个或多个编码丁二醇途径成员的质粒的菌株可在2%葡萄糖补充乙醇的培养基上生长（如美国专利申请公开20090305363中所述，其以引用方式并入本文）。为了测试磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶的导入是否能支持PDC-KO细胞的生长，用磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶基因（如实施例3所述）和编码丁二醇途径成员的载体pRS423::CUP1-alsS+FBA-budA（如美国专利申请公开20090155870中所述，其以引用方式并入本文）转化PDC-KO酵母。在包含补充了0.05%v/v乙醇的2%葡萄糖（合成完全减去组氨酸和尿嘧啶）的培养基上生长后，培养物被稀释至不含乙醇的相同培养基中（起始OD=0.1，125ml通风烧瓶中有20ml培养基）。为了对比，没有导入磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶的对照PDC-KO菌株也稀释至补充了乙醇（0.05%v/v）的培养基中。在生长过程中测量了600纳米的光密度（结果显示在图2和表13）。
表13
菌株/条件 0hOD 16hOD 22hOD 41.3hOD
xpkA 0.1 2.07 5.63 9.64
xpkB 0.1 2.44 5.93 9.78
xpkC 0.1 2.26 5.83 9.96
对照物A 0.1 0.47 0.5 0.822
对照物B 0.1 0.45 0.51 0.849
对照物C 0.1 0.5 0.52 0.879
对照物Aw/EtOH 0.1 2.01 5.49 11.44
对照物Bw/EtOH 0.1 2.16 5.7 11.5
对照物Cw/EtOH 0.1 2.12 5.76 11.76
转化了磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶的PDC-KO酵母在未补充乙醇（xpkA-xpkC，代表n=3结果）的培养基中的生长情况，与PDC-KO酵母菌株中包含2%葡萄糖、补充了乙醇（对照物A-对照物Cw/EtOH，代表n=3结果）的培养基中生长情况没有区别。在这些条件下，磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶转化的菌株的平均生长速率为0.19h-1。对于磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶转化的菌株观察到在具有更高透气量的相同条件下培养的生长速率为0.23h-1（数据为显示）。在包含2%葡萄糖、未补充乙醇的培养基中生长的PDC-KO酵母菌株，在最初的16小时显示有一些生长，但然后生长速率仅为0.01h-1（对照物A-对照物C，代表n=3结果）。
实施例5
构建包含磷酸酮醇酶或磷酸转乙酰酶的丙酮酸脱羧酶敲除（PDC- KO）酵母菌株
修饰如上所述整合载体（pUC19-URA3::pdc1::GPD-xpk1+ADH1-eutD）以消除xpk1磷酸酮醇酶基因或eutD磷酸转乙酰酶基因。具体地，为了移除eutD，所述整合载体用ClaI和SpeI限制酶消化以从eutD编码序列中移除0.6kb区域，形成载体pUC19-URA3::pdc1::GPD-xpk1。为了移除xpk1，所述整合载体用SpeI和KpnI限制酶消化以去除从SpeI至KpnI的3.4kb区域，形成载体pUC19-URA3::pdc1::ADH-eutD。所得的载体用AfIII限制酶消化以线性化，并转化至BP913/pRS423::CUP1-alsS+FBA-budA细胞（如实施例3所述）。如上所述，转化的细胞通过PCR筛选以确认在pdc1基因座的整合并进行培养。
实施例6
导入磷酸酮醇酶使PDC-KO细胞生长不要外源二碳底物补充
为了测试磷酸酮醇酶或磷酸转乙酰酶的导入是否能支持PDC-KO细胞的生长，用磷酸酮醇酶或磷酸转乙酰酶基因（如实施例5所述）和编码丁二醇途径成员的载体pRS423::CUP1-alsS+FBA-budA（如实施例4所述）转化PDC-KO酵母。在包含补充了0.05%v/v乙醇的2%葡萄糖（合成完全减去组氨酸和尿嘧啶）培养基上生长后，培养物被稀释至不含乙醇的相同培养基中（起始OD=0.1，125ml通风烧瓶中有20ml培养基）。为了对比，未导入磷酸酮醇酶或磷酸转乙酰酶基因的PDC-KO菌株在相同的条件下生长。在生长过程中测量了600纳米的光密度（结果显示在图3和表15）。
表15
菌株 0hOD 24hOD
xpk1+eutD 0.1 7.48
无（对照物） 0.1 0.575
仅eutD 0.1 0.338
仅eutD 0.1 0.28
仅xpk1 0.1 6.74
仅xpk1 0.1 7.26
转化了磷酸酮醇酶的PDC-KO酵母在未补充外源碳底物（xpk1，图3）的培养基中的生长情况，与PDC-KO酵母菌株中包含2%葡萄糖、补充了乙醇（xpk1+eutD，图3）的培养基中生长情况没有区别。转化了磷酸转乙酰酶的PDC-KO酵母（eutD，图3）的生长情况与在未补充外源二碳底物的培养基中的PDC-KO酵母菌株相比，没有明显的增加（无，图3）。
实施例7
在PDC-KO细胞导入磷酸酮醇酶增加了葡萄糖消化和丁二醇产量
为了测试在PDC-KO细胞导入磷酸酮醇酶对于葡萄糖消化和丁二醇产量的影响，PDC-KO酵母转化了（1）磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶（如实施例4所述）和编码丁二醇（BDO）途径成员的载体pRS423::CUP1-alsS+FBA-budA（如实施例4所述）（在下列表16中的“Xpk”）；或（2）编码丁二醇（BDO）途径成员的载体pRS423::CUP1-alsS+FBA-budA（在下列表6中的“对照物”）。
在包含补充了0.05%乙醇的2%葡萄糖（合成完全减去组氨酸和尿嘧啶）的培养基上生长后，Xpk和对照培养物被稀释至不含乙醇的培养基中（起始OD=0.1，125ml通风烧瓶中20ml培养基）。葡萄糖消化以及Xpk和对照培养物的丁二醇产量通过HPLC分析培养基来测定，葡萄糖和丁二醇的量如下列表所示。
表16：在PDC-KO细胞导入磷酸酮醇酶增加了葡萄糖消化和丁二醇 产量。
Xpk细胞（n=3）的葡萄糖消耗是对照菌株（n=3）葡萄糖消耗量的接近两倍。此外，Xpk细胞的丁二醇摩尔产量与对照细胞的丁二醇摩尔产量相比增加了。
实施例8
构建附加的磷酸酮醇酶途径整合载体
构建了与实施例2所述类似的磷酸酮醇酶/磷酸转乙酰酶整合载体。在这个实例中，克隆了xpk1和eutD基因构建体因此它们可立即整合至BP913的Δpdc1::ilvD（Sm）基因座下游。要做到这一点，使用引物N1110和N1111（SEQ ID No:653和654）从BP913基因组DNA中扩增了在ilvD（Sm）和TRX1之间的整合区。如下所述这被克隆至pUC19-URA3-MCS的PmeI位点。所述ilvD-TRX1PCR产物用多核苷酸激酶磷酸化（NEB Cat.M0201），通过PmeI消化和小牛肠碱性磷酸酶处理制备所述载体，两个片段连接过夜然后克隆至大肠杆菌（E.coli）Stbl3细胞中。克隆通过PCR筛选（使用引物N1110和N1111）然后用BsgI消化以确认ilvD-TRX1的插入方向。来自每个方向的一个克隆（pUC19-URA3::ilvD-TRX1A和B）被用于接下来的步骤：xpk1/eutD表达盒的添加。通过BgIII和EcoRV消化，得到来自pRS426::GPD-xpk1+ADH1-eutD的所述xpk1/eutD表达盒。5’伸出的DNA用Klenow片段进行填充。用AfIII线性化pUC19-URA3::ilvD-TRX1，然后5’伸出的DNA用Klenow片段进行填充。然后这个载体与制备的xpk1/eutD盒连接。连接反应转化至大肠杆菌（E.coli）Stbl3细胞中。用针对eutD的引物（N1041和N1042）筛选克隆，然后用BamHI消化以确定xpk1/eutD盒相对于ilvD-TRXI DNA序列的方向。
然后所述URA3标记基因用如下所述的遗传霉素抗性标记取代。构建了嵌合的遗传霉素抗性标记，其包含乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）的TEF1启动子和终止子（TEF1p-kan-TEF1t基因，如SEQ ID No:655所提供的）。这个基因被保留在pUC19载体中（克隆至SmaI位点）。所述kan基因的分离是通过首先用KpnI消化pUC19，用Klenow片段（NEB，Cat.M212）除去3'伸出的DNA，用HidcII消化，然后胶纯化1.8kb的基因片段（ZymocleanTMGel DNA Recovery Kit，Cat.D4001，ZymoResearch，Orange，CA）而得到的。用NsiI和NaeI（NsiI消化产生的3’伸出的DNA用Klenow片段去除）从pUC19-URA3::ilvD::GPD-xpk1+ADH1-eutD::TRX1（上面段落）中去除URA3标记。所述载体和kan基因连接过夜，并转化至大肠杆菌（E.coli）Stbl3细胞中。使用引物BK468和N1090或N1113（序列分别为SEQ ID No:656、657和658）通过PCR筛选克隆—阳性PCR结果表明了kan基因的存在和方向。两个方向的克隆用PmeI消化，并转化至BP913，在添加了1%（v/v）乙醇作为碳源和200μg/ml遗传霉素（G418）的酵母提取物-蛋白质胨培养基上选择转化子。获得了单个转化子，通过PCR进行了确认（引物N886和oBP264用于5’端，N1090和oBP512用于3’端，序列分别为SEQ ID No:659、646、657和660）。图6描绘了在所述质粒整合后的基因座。
实施例9
构建带有磷酸酮醇酶途径的产异丁醇的菌株
用2个包含异丁醇途径基因的质粒pYZ090和pYZ067转化实施例8中所述菌株（序列分别为SEQ ID NO:1892和1891）。
pYZ090被构建以包含一个嵌合基因，其具有来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）alsS基因（nt position457-2172）编码区，所述alsS基因表达起始于酵母CUP1启动子（nt2-449）并接CYC1终止子（nt2181-2430）；以及一个嵌合基因，其具有来自乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的ilvC基因（nt3634-4656），所述KARI的表达起始于酵母ILV5启动子（2433-3626）并接ILV5终止子（nt4682-5304）。
构建了pYZ067以包含下列嵌合基因：1）得自变异链球菌（S.mutans）UA159的ilvD基因编码区，其具有C-末端Lumio标记（nt位点2260-3972），该标记从酵母FBA1启动子（nt1661-2250）开始表达，后接FBA1终止子（nt40005-4317），用于表达二羟酸脱水酶；2）马肝ADH（nt4680-5807）的编码区，它从酵母GPM1启动子（nt5819-6575）开始表达，后接ADH1终止子（nt4356-4671），用于表达醇脱氢酶，和3）得自乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的kivD基因编码区（nt7175-8821），它从酵母TDH3启动子（nt8830-9493）开始表达，后接TDH3终止子（nt6582-7161），用于表达酮异戊酸脱羧酶。
在缺乏尿嘧啶和组氨酸、含1%（v/v）乙醇作为碳源和100μg/ml遗传霉素的合成完全培养基上获得转化子。也用对照菌株（BP913）转化相同的质粒，并没有涂布遗传霉素。然后在含有2%葡萄糖作为碳源并补充了0.05%（v/v）乙醇的相同培养基上出现了许多转化子的菌斑。36小时后，菌斑用于接种液体培养基（与平板组分相同）。48小时后，磷酸酮醇酶途径菌株和对照菌株的OD值类似（ca.4-5OD）然后所有菌株在不含乙醇（即无外源二碳底物源）的培养基中传代培养。所述磷酸酮醇酶培养物在无乙醇补充条件下生长，与补充了乙醇的对照菌株类似。结果显示在图7A（和表17A）。这些菌株再次传代培养以确认生长速率，其结果显示在图7B（和表17B）。与对照物相比，磷酸酮醇酶菌株出现降低的迟缓期，但其指数生长速率没有统计学上的差异（平均速率为0.16h-1）。
表17A
菌株/条件 0hOD 18.3hOD
xpkISO1 0.1 2.3
xpkISO2 0.1 22
xpkISO3 0.1 2.2
ISO（无乙醇）1 0.1 0.48
ISO（无乙醇）2 0.1 0.41
ISO（无乙醇）3 0.1 0.47
ISO（含乙醇）1 0.1 2.5
ISO（含乙醇）2 0.1 2.6
ISO（含乙醇）3 0.1 2.4
表17B
菌株/条件 0hOD 6.5hOD 23hOD 27hOD 48hOD
xpkISO1 0.1 0.18 2.91 4 4.4
xpkISO2 0.1 0.14 1.54 2.88 4.6
xpkISO3 0.1 0.16 2.15 3.54 4.3
ISO（含乙醇）1 0.1 0.14 2.21 3.46 4.4
ISO（含乙醇）2 0.1 0.11 1.13 2.18 4.2
ISO（含乙醇）3 0.1 0.1 0.84 1.6 4.4
实施例10
构建啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株BP913
这个实施例的目的是描述啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株BP913的构建。这个菌株来源于CEN.PK113-7D（CBS8340；Centraalbureau voor Schimmelcultures（CB S）Fungal Biodiversity Centre，Netherlands）并包含下列基因的缺失：URA3、HIS3、PDC1、PDC5和PDC6。
缺失，即完全去除整个编码序列，通过与聚合酶链反应片段同源性重组而创建，所述聚合酶链反应片段包含靶基因的上游和下游同源性区域以及用于选择转化子的G418抗性标记或URA3基因。其侧翼为的所述G418抗性标记，用Cre重组酶去除。通过同源重组去除URA3基因以产生无痕缺失。
一般来讲，每个无痕缺失的聚合酶链反应盒是通过重叠聚合酶链反应组合四个片段A-B-U-C得到的。PCR盒包含可选择的/可反向选择的标记URA3（片段U），其由天然CEN.PK113-7D URA3基因与启动子（URA3基因的250bp上游）和终止子（URA3基因的150bp下游）组成。片段A和C每个长500bp，它们对应于紧接靶基因上游的500bp（片段A）和靶基因3'的500bp（片段C）。片段A和C用于通过同源重组将盒整合到染色体中。片段B（500bp长）对应于紧接靶基因下游的500bp并用于通过同源性重组，从染色体上切除URA3标记和片段C，在盒整合到染色体时生成作为对应片段B的直接重复序列使用PCR产物ABUC盒，首先将URA3标记整合进基因组，然后通过同源重组从基因组中切除。初始整合删除了除3'的500bp之外的基因。在切除时，也删除了所述基因3'的500bp区域。对于使用这个方法的基因整合，将要整合的基因包含在聚合酶链反应和的片段A和B之间。
URA3缺失
为删除内源URA3编码区，ura3::loxP-kanMX-loxP盒通过聚合酶链反应扩增自pLA54模板DNA（SEQ ID NO:661）。pLA54包含乳酸克鲁维酵母（K.lactis）TEF1启动子和kanMX标记，并且侧翼序列为loxP位点，允许Cre重组酶参与重组并去除标记。聚合酶链反应使用PhusionDNA聚合酶和引物BK505与BK506（SEQ ID NO:662和663）。所述每个引物的URA3部分来源于URA3启动子上游5′区，和编码区下游3′区，使得loxP-kanMX-loxP标记的整合导致URA3编码区的替换。利用标准遗传学技术将所述聚合酶链反应产物转化到CEN.PK113-7D中（Methods inYeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，第201-202页）并且转化子在30℃包含G418（100μg/ml）的YPD上选择。采用聚合酶链反应验证筛选的转化子的正确整合，所用引物为LA468和LA492（SEQ ID NO:664和665）并指定CEN.PK113-7DΔura3::kanMX。
HIS3缺失
用于无痕HIS3缺失的聚合酶链反应盒的四个片段的扩增使用PhusionHigh Fidelity PCR Master Mix（New England BioLabs）并以CEN.PK113-7D基因组DNA为模板，用Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen;Valencia，CA）制备。HIS3片段A的扩增采用引物oBP452（SEQ ID NO:666）和引物oBP453（SEQ ID NO:667），其包含与HIS3片段B的5'端同源的5'尾。HIS3片段B的扩增采用引物oBP454（SEQ ID NO:668），其包含与HIS3片段A的3'端同源的5'尾，和引物oBP455（SEQ ID NO:669），其包含与HIS3片段U的5'端同源的5'尾。HIS3片段U的扩增采用引物oBP456（SEQ ID NO:670），其包含与HIS3片段B的3'端同源的5'尾，和引物oBP457（SEQ ID NO:671），其包含与HIS3片段C的5'端同源的5'尾。HIS3片段C的扩增采用引物oBP458（SEQ ID NO:672），其包含与HIS3片段U的3'端同源的5'尾，和引物oBP459（SEQ ID NO:673）。PCR产物用PCR Purification试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）纯化。HIS3片段AB通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合HIS3片段A和HIS3片段B并用引物oBP452（SEQ ID NO:666）和oBP455（SEQ ID NO:669）。HIS3片段UC通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合HIS3片段U和HIS3片段C并用引物oBP456（SEQ ID NO:670）和oBP459（SEQ IDNO:673）。所得聚合酶链反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过GelExtraction试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）纯化。HIS3ABUC盒通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合HIS3片段AB和HIS3片段UC并用引物oBP452（SEQ ID NO:666）和oBP459（SEQ ID NO:673）。PCR产物用PCR Purification试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）纯化。
制备CEN.PK113-7DΔura3::kanMX的感受态细胞，并用HIS3ABUC聚合酶链反应盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒（Zymo Research，Orange，CA）。转化混合物涂布在30℃的含2%的葡萄糖、不含尿嘧啶补充的合成完全培养基上。具有his3敲除的转化子用聚合酶链反应进行筛选，所用引物为oBP460（SEQ ID NO:674）和oBP461（SEQ ID NO:671），使用由Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备的基因组DNA。正确的转化子选择为菌株CEN.PK113-7DΔura3::kanMXΔhis3::URA3。
从Δura3位点移除KanMX标记以及从Δhis3位点移除URA3标记
所述KanMX标记通过用pRS423::PGAL1-cre（SEQ ID NO:715）转化CEN.PK113-7DΔura3::kanMXΔhis3::URA3而去除，采用Frozen-EZ YeastTransformation II试剂盒（Zymo Research，Orange，CA）并涂布在30℃的含2%的葡萄糖、不含组氨酸和尿嘧啶补充的合成完全培养基上。转化子在30℃的补充了1%的半乳糖的YP中生长~6小时以诱导Cre重组酶和KanMX标记剪切，然后涂布在30℃的YPD（2%葡萄糖）平板上复苏。分离物过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸（0.1%）的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。抗5-氟-乳清酸的分离物生长和接种到YPD中以去除pRS423::PGAL1-cre质粒。检测分离物中KanMX标记和URA3标记的丢失，并通过在YPD+G418平板、缺乏尿嘧啶的合成完全培养基平板和缺乏组氨酸的合成完全培养基平板的生长检测，检测pRS423::PGAL1-cre质粒的丢失。对G418敏感并为尿嘧啶和组氨酸营养缺陷性的正确的分离物被选为菌株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3并命名为BP857。所述缺失和标记移除通过聚合酶链反应和测序确认，所用引物为oBP450（SEQ ID NO:676）和oBP451（SEQID NO:677）用于Δura3，以及引物oBP460（SEQ ID NO:674）和oBP461（SEQ ID NO:675）用于Δhis3，所用的基因组DNA用Gentra PuregeneYeast/Bact试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）制备。
PDC6缺失
用于无痕PDC6缺失的聚合酶链反应盒的四个片段的扩增使用Phusion High Fidelity PCR Master Mix（New England BioLabs，Ipswich，MA）并以CEN.PK113-7D基因组DNA为模板，用Gentra PuregeneYeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备。PDC6片段A扩增采用引物oBP440（SEQ ID NO:670）和引物oBP441（SEQ ID NO:679），其包含与PDC6片段B的5'端同源的5'尾。PDC6片段B扩增采用引物oBP442（SEQ IDNO:680），其包含与PDC6片段A的3'端同源的5'尾，和引物oBP443（SEQ ID NO:681），其包含与PDC6片段U的5'端同源的5'尾。PDC6片段U扩增采用引物oBP444（SEQ ID NO:682），其包含与PDC6片段B的3'端同源的5'尾，和引物oBP445（SEQ ID NO:683），其包含与PDC6片段C的5'端同源的5'尾。PDC6片段C扩增采用引物oBP446（SEQ ID NO:684），其包含与PDC6片段U的3'端同源的5'尾，和引物oBP447（SEQID NO:685）。聚合酶链反应产物用PCR Purification试剂盒（Qiagen）纯化。PDC6片段AB通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合PDC6片段A和PDC6片段B并用引物oBP440（SEQ ID NO:678）和oBP443（SEQ IDNO:681）。PDC6片段UC通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合PDC6片段U和PDC6片段C并用引物oBP444（SEQ ID NO:682）和oBP447（SEQ ID NO:685）。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过GelExtraction试剂盒（Qiagen）纯化。所述PDC6ABUC盒通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合PDC6片段AB和PDC6片段UC并用引物oBP440（SEQ ID NO:678）和oBP447（SEQ ID NO:685）。PCR产物用PCRPurification试剂盒（Qiagen）纯化。
制备CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3的感受态细胞，并用PDC6ABUC聚合酶链反应盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒（Zymo Research）。转化混合物涂布在30℃的含2%的葡萄糖、不含尿嘧啶补充的合成完全培养基上。带有pdc6敲除的转化子通过聚合酶链反应进行筛选，所用引物为oBP448（SEQ ID NO:686）和oBP449（SEQ IDNO:687），使用由Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备的基因组DNA。正确的转化子被选为菌株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6::URA3。
CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6::URA3分离物过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸（0.1%）的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。所述缺失和标记移除通过聚合酶链反应和测序确认，所用引物为oBP448（SEQ ID NO:686）和oBP449（SEQ ID NO:687），使用由Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备的基因组DNA。来自分离物的PDC6基因的缺乏通过聚合酶链反应阴性结果来证明，所用PDC6的编码区的特异性引物为oBP554（SEQ ID NO:688）和oBP555（SEQ ID NO:689）。正确的分离物被选为菌株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6并被命名为BP891。
PDC1缺失ilvDSm整合
所述PDC1基因被删除并被ilvD替换，其编码区来自变异链球菌（Streptococcus mutans）ATCC#700610（SEQ ID NO:1886）。所述A片段接着ilvD编码区，其来自变异链球菌（Streptococcus mutans），对于用于PDC1缺失-ilvDSm整合的聚合酶链反应盒使用Phusion High FidelityPCR Master Mix（New England BioLabs）进行扩增并用NYLA83基因组DNA作为模板（构建菌株NYLA83的描述参见美国专利申请公开20110124060A1，以引用方式并入本文），用Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备。PDC1片段A扩增采用引物oBP513（SEQ ID NO:690）和引物oBP515（SEQ ID NO:691），其包含与PDC1片段B的5'端同源的5'尾。所述用于PDC1缺失-ilvDSm整合的聚合酶链反应盒的片段B、U和C使用Phusion HighFidelity PCR Master Mix（New EnglandBioLabs）进行扩增并用CEN.PK113-7D基因组DNA作为模板，用GentraPuregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备。PDC1片段B扩增采用引物oBP516（SEQ ID NO:692），其包含与PDC1片段A-ilvDSm的3'端同源的5'尾，和引物oBP517（SEQ ID NO:693），其包含与PDC1片段U的5'端同源的5'尾。PDC1片段U扩增采用引物oBP518（SEQ ID NO:694），其包含与PDC1片段B的3'端同源的5'尾，和引物oBP519（SEQ ID NO:695），其包含与PDC1片段C的5'端同源的5'尾。PDC1片段C扩增采用引物oBP520（SEQ ID NO:696），其包含与PDC1片段U的3'端同源的5'尾，和引物oBP521（SEQ ID NO:697）。聚合酶链反应产物用PCRPurification试剂盒（Qiagen）纯化。PDC1片段A-ilvDSm-B通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合PDC1片段A-ilvDSm和PDC1片段B并用引物oBP513（SEQ ID NO:690）和oBP517（SEQ ID NO:693）。PDC1片段UC通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合PDC1片段U和PDC1片段C并用引物oBP518（SEQ ID NO:694）和oBP521（SEQ ID NO:697）。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction试剂盒（Qiagen）纯化。PDC1A-ilvDSm-BUC盒通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合PDC1片段A-ilvDSm-B和PDC1片段UC并用引物oBP513（SEQID NO:690）和oBP521（SEQ ID NO:697）。PCR产物用PCR Purification试剂盒（Qiagen）纯化。
制备CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6的感受态细胞，并用PDC1A-ilvDSm-BUC聚合酶链反应盒转化，使用Frozen-EZ YeastTransformation II试剂盒（Zymo Research）。转化混合物涂布在30℃的含2%的葡萄糖、不含尿嘧啶补充的合成完全培养基上。具有PDC1敲除-ilvDSm整合的转化子用聚合酶链反应进行筛选，所用引物为oBP511（SEQ ID NO:698）和oBP512（SEQ ID NO:699），使用由GentraPuregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备的基因组DNA。来自分离物的PDC1基因的缺乏通过聚合酶链反应阴性结果来证明，使用PDC1编码区特异性的引物oBP550（SEQ ID NO:700）和oBP551（SEQ ID NO:701）。正确的转化子被选为菌株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSm-URA3。
CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSm-URA3过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸（0.1%）的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。所述PDC1的缺失、ilvDSm的整合以及标记的移除通过聚合酶链反应和测序来确认，所用引物为oBP511（SEQ ID NO:698）和oBP512（SEQ ID NO:699），使用由Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备的基因组DNA。正确的分离物被选为菌株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSm并命名为BP907。
PDC5缺失sadB整合
所述PDC5gene被删除并被sadB编码区替换，所述编码区来自木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans）。用于PDC5缺失-sadB整合的聚合酶链反应盒的片段首先克隆至质粒pUC19-URA3MCS（如实施例2中所述）。sadB的编码序列为（SEQ ID NO:718）并且PDC5片段B克隆至pUC19-URA3MCS中以生成PDC5A-sadB-BUC聚合酶链反应盒的sadB-BU部分。所述sadB编码序列扩增以pLH468-sadB（SEQ ID NO:716）作为模板，采用引物oBP530（SEQ ID NO:702），其包含AscI限制性位点，和引物oBP531（SEQ ID NO:703），其包含与PDC5片段B的5’端同源的5’尾。PDC5片段B扩增自CEN.PK113-7D基因组DNA，采用引物oBP532（SEQ ID NO:704），其包含与sadB的3'端同源的5'尾，和引物oBP533（SEQ ID NO:705），其包含Pmel限制性位点。聚合酶链反应产物用PCR Purification试剂盒（Qiagen）纯化。sadB-PDC5片段B通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合sadB片段U和PDC5片段B并用引物oBP530（SEQ ID NO:702）和oBP533（SEQ ID NO:705）。在用合适的酶消化后，所得聚合酶链反应产物经AscI和PmeI消化用T4DNA连接酶连接到pUC19-URA3MCS对应的位点上。所得质粒用作模板以扩增sadB-片段B-片段U，所用引物为oBP536（SEQ ID NO:706）和oBP546（SEQ IDNO:707），其包含与PDC5片段C的5’端同源的5’尾。PDC5片段C扩增自CEN.PK113-7D基因组DNA，采用引物oBP547（SEQ ID NO:708），其包含与PDC5sadB-片段B-片段U的3'端同源的5'尾，和引物oBP539（SEQ ID NO:709）。聚合酶链反应产物用PCR Purification试剂盒（Qiagen）纯化。PDC5sadB-片段B-片段U-片段C通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合PDC5sadB-片段B-片段U和PDC5片段C并用引物oBP536（SEQ ID NO:706）和oBP539（SEQ ID NO:709）。所得聚合酶链反应产物在琼脂糖凝胶上纯化接着使用Gel Extraction试剂盒（Qiagen）。通过扩增PDC5sadB-片段B-片段U-片段C以生成所述PDC5A-sadB-BUC盒，所用引物为oBP542（SEQ ID NO:710），其包含与原生PDC5编码序列上游50个核苷酸同源的5'尾和oBP539（SEQ ID NO:709）。PCR产物用PCR Purification试剂盒（Qiagen）纯化。
制备CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSm的感受态细胞，并用PDC5A-sadB-BUC聚合酶链反应盒转化，所述转化使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒（Zymo Research）。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶辅以1%的乙醇（无葡萄糖）的合成完全培养基上。具有pdc5敲除sadB整合的转化子通过聚合酶链反应进行筛选，所用引物为oBP540（SEQ ID NO:711）和oBP541（SEQ ID NO:712），使用由Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备的基因组DNA。来自分离物的PDC5基因的缺乏通过聚合酶链反应阴性结果来证明，使用PDC5编码区特异性的引物oBP552（SEQ ID NO:713）和oBP553（SEQID NO:714）。正确的转化子被选为菌株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadB-URA3。
CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadB-URA3过夜生长在YPD（0.1%乙醇）中并在30℃接种到合成完全培养基上，辅以乙醇（无葡萄糖）并包含包含5-氟-乳清酸（0.1%），以选择失去了URA3标记的分离物。所述PDC5缺失、sadB整合以及标记去除是通过聚合酶链反应确认的，所用引物为oBP540（SEQ ID NO:711）和BP541（SEQ ID NO:712），使用由Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备的基因组DNA。所述正确的分离物被选为菌株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadB并命名为BP913。
实施例11
构建菌株NYLA83
本实施例描述了啤酒糖酵母内源PDC1和PDC6基因的插入灭活。PDC1，PDC5和PDC6基因编码丙酮酸脱羧酶的三个同工酶。所得的菌株的使用如实施例10中所述。
构建pRS425::GPM-sadB
克隆了编码丁醇脱氢酶的DNA片段（SEQ ID NO:717），其来自木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans）（如美国专利申请公开US20090269823中所公开的）。被称为仲醇脱氢酶的这个基因的编码区（SEQ ID NO:718）采用标准条件扩增自木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans）基因组DNA，所述基因组DNA采用Gentra Puregene试剂盒（Gentra Systems，Inc.，Minneapolis，MN；catalognumber D-5500A）进行制备，按照对于革兰氏阴性菌的推荐规程，分别采用正向和反向引物N473和N469（SEQ ID NO:725和726）。将PCR产物TOPO-Blunt克隆至pCR4BLUNT（Invitrogen），从而得到pCR4Blunt::sadB，然后将该质粒转入大肠杆菌Mach-1细胞。随后从四个克隆中分离质粒并确认序列。
所述sadB编码区PCR扩增自pCR4Blunt::sadB。PCR引物包含附加的5’序列，其与酵母GPM1启动子和ADH1终止子重叠（N583和N584，如SEQ ID NO:727和728所提供）。然后所述PCR产物用间隙修复方法克隆至如下的啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）（Ma等人，ibid）。酵母-大肠杆菌（E.coli）穿梭载体pRS425::GPM::kivD::ADH，其包含GPM1启动子（SEQ ID NO:721）、来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）kivD编码区（SEQ D NO:719），和ADH1终止子（SEQ ID NO:722）（如美国专利7,851,188、实施例17所述），用BbvCI和PacI限制酶消化以释放kivD编码区。大约1μg的剩余载体片段与1μgsadB PCR产物转化至啤酒糖酵母（S.cerevisiae）菌株BY4741。转化子在缺乏亮氨酸的合成完全培养基上选择。采用引物N142和N459（SEQ ID NO:729和730）通过PCR确认正确的重组事件，生成pRS425::GPM-sadB。
构建pdc6::P GPM1 -sadB整合盒和PDC6缺失
通过连接pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t-URA3r和GPM-sadB-ADHt片段（SEQ ID NO:723）以制备整合盒，从pRS425::GPM-sadB（SEQ ID NO:720）至来自pUC19-URA3r.pUC19-URA3r（SEQ ID NO:724）的URA3r基因，包含来自pRS426（ATCC#77107）的URA3r标记，侧翼为75bp同源重复序列以使体内同源重组和URA3标记的去除。以pRS425::GPM-sadB和pUC19-URA3r质粒DNA作为模板，利用Phusion DNA聚合酶（NewEngland Biolabs Inc.，Beverly，MA；目录号F-540S）和引物114117-11A至114117-11D（SEQ ID NO:731，732，733和734），以及114117-13A和114117-13B（SEQ ID NO:735和736），通过重叠延伸PCR（SOEPCR）（如Horton等人（1989）Gene77:61-68所述）将上述两种DNA片段相连。
SOE PCR的外侧引物（114117-13A和114117-13B）包含5'和3'~50bp分别与PDC6启动子和终止子的上游和下游区域同源的区域。利用标准遗传学技术（Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页），将完整的盒PCR片段转入了BY4700（ATCC#200866），并将转化体在30℃培养于不含尿嘧啶且补充了2%葡萄糖的合成的完全培养基上。转化子通过PCR进行筛选，所用引物为112590-34G和112590-34H（SEQ ID NO:737和738），以及112590-34F和112590-49E（SEQ ID NO:739和740）通过PCR筛选转化体，以确定在带有PDC6编码区的缺失的PDC6基因座的整合。通过按照标准规程在30℃涂布于补充2%葡萄糖和5-FOA的合成完全培养基上，对所述URA3r标记进行回收利用。通过将来自上述5-FOA平板的菌落接种至SD-URA培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。得到的经过鉴定的菌株具有下列基因型：BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t。
构建pdc1P PDC1 -ilvD整合盒和PDC1缺失
通过连接pdc1::PPDC1-ilvD-FBA1t-URA3r和ilvD-FBA1t片段（SEQ IDNO:741）以制备整合盒，通过SOE PCR从pLH468（SEQ ID NO:1888）至来源于pUC19-URA3r的URA3r基因（如Horton等人（1989）Gene77:61-68所述），用pLH468和pUC19-URA3r质粒DNA为模板，使用Phusion DNA聚合酶（New England Biolabs Inc.，Beverly，MA；目录号F-540S）和引物114117-27A至114117-27D（SEQ ID NO:742，743，744和745）进行。
SOE PCR的外侧引物（114117-27A和114117-27D）包含5'和3'~50bp与PDC1启动子的下游区域和PDC1编码序列的下游区域同源的区域。利用标准遗传学技术（Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页），将完整的盒PCR片段转入了BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t，并将转化体在30℃培养于不含尿嘧啶且补充了2%葡萄糖的合成的完全培养基上。利用引物114117-36D和135（SEQ ID NO746和747），以及引物112590-49E和112590-30F（SEQ ID NO740和748），通过PCR对转化体进行了筛选，以验证PDC1编码区的缺失在PDC1基因座处的整合。通过按照标准规程在30℃涂布于补充2%葡萄糖和5-FOA的合成完全培养基上，对所述URA3r标记进行回收利用。通过将来自上述5-FOA平板的菌落接种至SD-URA培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。得到的经过鉴定的菌株“NYLA67”具有下列基因型：BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1tpdc1::PPDC1-ilvD-FBA1t。
HIS3缺失
为了缺失内源HIS3编码区，通过PCR从URA3r2模板DNA（SEQ IDNO:749）扩增his3::URA3r2盒。URA3r2包含来自pRS426（ATCC#77107）的URA3标记，该标记两翼为500bp的同源重复序列，以允许体内同源重组和URA3标记的移除。PCR系利用Phusion DNA聚合酶，以及引物114117-45A和114117-45B（SEQ ID NO:750和751）进行，其产生了~2.3kb的PCR产物。每种引物的HIS3部分来源于HIS3启动子上游的5’区和编码区下游的3’区，如此URA3r2标记的整合导致HIS3编码区的替换。利用标准遗传学技术（Methods in Yeast Genetics，2005，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页），将PCR产物转化到NYLA67中，并将转化体在30℃培养于不含尿嘧啶且补充了2%葡萄糖的合成完全培养基上。通过在30℃下将转化子重复接种到缺乏组氨酸并补充有2%葡萄糖的合成完全培养基上来筛选转化子以验证整合正确。通过按照标准规程在30℃下置于补充有2%葡萄糖和5-FOA的合成完全培养基上再利用URA3r标记。通过将来自上述5-FOA平板的菌落接种至SD-URA培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株NYLA73具有下列基因型：BY4700pdc6::PGPMl-sadB-ADH1tpdc1::PPDC1-ilvD-FBA1tΔhis3。
构建pdc5::kanMX整合盒和PDC5缺失
利用Phusion DNA聚合酶，以及引物PDC5::KanMXF和PDC5::KanMXR（SEQ ID NO:752和753），从菌株YLR134W染色体DNA（ATCC No.4034091）PCR扩增了pdc5::kanMX4盒，产生了~2.2kb的PCR产物。每种引物的PDC5部分来源于PDC5启动子上游的5’区和编码区下游的3’区，使得kanMX4标记的整合导致PDC5编码区的替换。利用标准遗传学技术（Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页）将PCR产物转化到NYLA73中，并且在补充1%乙醇和遗传霉素（200μg/ml）的YP培养基上，在30℃下选择转化体。使用引物PDC5kofor和N175（SEQ ID NO:754和755），通过PCR筛选转化体以验证在带有PDC5编码区替换的PDC基因座的正确整合。经鉴定的正确的转化体具有下列基因型：BY4700pdc6::PGPMl-sadB-ADH1t pdc1::PPDC1-ilvD-FBA1tΔhis3pdc5::kanMX4。该菌株被命名为NYLA74。
HXK2（己糖激酶II）缺失
hxk2::URA3r盒通过PCR从URA3r2模板（如上所述）中扩增出来，所述PCR使用Phusion DNA聚合酶和引物384和385（SEQ ID NOs:756和757），生成~2.3kb的PCR产物。每种HXK2引物的部分来源于启动子上游的5’区和编码区下游的3'HXK2区域，如此URA3r2标记的整合导致HXK2编码区的替换。利用标准遗传学技术（Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页）将PCR产物转化到NYLA73中，并且在缺乏尿嘧啶并补充有2%葡萄糖的合成完全培养基上，在30℃下选择转化子。通过使用引物N869和N871（SEQ ID NO:758和759）的PCR筛选转化子以验证在HXK2基因座上发生的HXK2编码区取代整合正确。通过按照标准规程在30℃涂布于补充2%葡萄糖和5-FOA的合成完全培养基上，对所述URA3r2标记进行回收利用。通过从5-FOA平板上涂布接种菌落到SD-URA培养基上以验证生长缺失来证实标记的移除，并且通过使用引物N946和N947（SEQID NO:760和761）的PCR来验证正确的标记移除。所得经鉴定的菌株被命名为NYLA83，其具有下列基因型：BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1tpdc1::PPDC1-ilvD-FBA1tΔhis3Δhxk2。
实施例12
构建啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株PNY2257
菌株PNY2242是从BP913经多个步骤构建而成的（如上所述）。首先，去除了染色体XV上的天然GPD2基因。其编码区采用CRE-lox介导的标记移除进行去除（方法学如上所述），因此所得的基因座包含一个loxP位点。所述修饰的基因座的序列为SEQ ID NO:1899（上游区域=nt1-500；loxP位点=nt531-564；下游区域=nt616-1115）。其次，去除了在染色体VII上的天然FRA2基因。FRA2的消除是仅无缝去除编码区。所述修饰的基因座序列为SEQ ID NO:1900（上游区域=nt1-501；下游区域=nt526-1025）。下一步，去除了染色体XV上的ADH1基因，以及插入了包含UAS（PGK1）-FBA1启动子和kivD编码区的嵌合基因。使用天然的ADH1终止子形成完整的基因。所述修饰的基因座序列为SEQ ID No:1901（上游区域=nt1-500；UAS（PGK1）FBA启动子=nt509-1233；kivD编码区=nt1242-2888；下游区域（包括终止子）=nt2889-3388）。下一步，包含FBA1启动子、alsS编码区和CYC1终止子的嵌合基因整合至染色体XII，TRX1基因的上游。所述修饰的基因座序列为SEQ ID No:1902（上游区域=nt1-154；FBA1启动子=nt155-802；alsS CDS=nt810-2525；CYC1终止子=nt2534-2788；下游区域=nt2790-3015）。下一步，编码马肝乙醇脱氢酶基因的两个拷贝整合至染色VII和XVI中。在染色体VII上，包含PDC1启动子，hADH编码区和ADH1终止子的嵌合基因放置在fra2Δ基因座（原始FRA2的去除如上所述）。所述修饰的基因座序列为SEQ ID No:1903（上游区域=nt1-300；PDC1启动子=nt309-1178；hADH编码区=nt1179-2306；ADH1终止子=nt2315-2630；下游区域=nt2639-2900）。在染色体XVI上，包含PDC5启动子、hADH编码区和ADH1终止子的嵌合基因整合至之前由长期重复元件YPRCdelta15占据的区域。所述修饰的基因座序列为SEQ ID No:1904（上游区域=nt1-150；PDC5启动子=nt159-696；hADH编码区=nt697-1824；ADH1终止子=nt1833-2148；下游区域=nt2157-2656）。然后天然的YMR226c和ALD6基因被去除了。YMR226c的消除仅无缝去除了其编码区。所述修饰的基因座序列为SEQID No:1905（上游区域=nt1-250；下游区域=nt251-451）。ALD6编码区加上700bp的上游序列用CRE-lox介导的标记移除方法去除了，因此所得基因座包含一个loxP位点。所述修饰的基因座序列为SEQ ID No:1906（上游区域=nt1-500；loxP位点=nt551-584；下游区域=nt678-1128）。实施例8中所述的遗传霉素选择的磷酸酮醇酶表达载体转化至这个菌株中并进行确认如上所述（其基因座描绘在图6中）。最后，质粒被导入菌株中表达KARI（pLH702，质粒SEQ ID No:1907）和DHAD（pYZ067DkivDDhADH，SEQ ID No:1908），所得的菌株被命名为PNY2257。包含所有以上元件、除了磷酸酮醇酶途径构建体的对照菌株被称为PNY2242。
如之前的实施例中所述测定生长速率。经过24小时，PNY2257在没有乙醇或其它二碳补充下表现的生长速率，与观察到的提供了补充的PNY2242的那些生长速率相似。

Claims (35)

1.重组宿主细胞，包含：
(i)编码多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变或替换或它们的组合，所述多肽将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA；和
(ii)编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA的多肽是丙酮酸脱羧酶、丙酮酸-甲酸裂解酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶或丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶。
3.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含：
(iii)编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。
4.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中与包含（i）且不包含（ii）或（iii）的重组真核宿主细胞相比，所述宿主细胞在培养物中的生长对外源二碳底物具有降低的需求。
5.重组宿主细胞，包含：
(i)编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换；和
(ii)编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸。
6.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含：
(iii)编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。
7.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其中与包含（i）且不包含（ii）或（iii）的重组真核宿主细胞相比，所述宿主细胞在培养物中的生长对外源二碳底物具有降低的需求。
8.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其中与包含（i）且不包含（ii）或（iii）的宿主细胞相比时，所述宿主细胞在不补充外源碳底物的培养基中具有改善的生长。
9.根据权利要求8所述的重组宿主细胞，其中所述外源二碳底物是乙醇或乙酸。
10.根据权利要求3所述的重组宿主细胞，包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换，其中所述至少一个缺失、突变和/或替换引起丙酮酸脱羧酶活性的降低或消除。
11.根据权利要求10中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因是PDC1、PDC5、PDC6或它们的组合；并且所述宿主细胞是啤酒糖酵母（S.cerevisiae）。
12.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其中所述编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸是来自植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）的xpk1、来自戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）MD363的xpkA或来自乳酸双歧杆菌（B.lactis）的6-磷酸磷酸酮醇酶。
13.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其中所述具有磷酸酮醇酶活性的多肽与SEQ ID NO:481或其活性片段包含至少85%的同一性。
14.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其中所述编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸是来自植物乳杆菌的EutD或来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的磷酸转乙酰酶。
15.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其中所述多肽与SEQ ID NO:1472或其活性片段包含至少85%的同一性。
16.根据权利要求5中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是下列属的成员：梭菌属（Clostridium）、发酵单胞菌属（Zymomonas）、埃希氏菌属（Escherichia）、沙门氏菌属（Salmonella）、沙雷氏菌属（Serratia）、欧文氏菌属（Erwinia）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、志贺氏菌属（Shigella）、红球菌属（Rhodococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、肠球菌属（Enterococcus）、产碱菌属（Alcaligenes）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、节杆菌属（Arthrobacter）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、短杆菌属（Brevibacterium）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、耶氏酵母属（Yarrowia）、毕赤酵母属（Pichia）、假丝酵母属（Candida）、汉逊酵母属（Hansenula）或糖酵母属（Saccharomyces）。
17.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是啤酒糖酵母。
18.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，还包含利用丙酮酸的生物合成途径，其中所述利用丙酮酸的生物合成途径形成选自下列的产物：2,3-丁二醇、2-丁醇、2-丁酮、缬氨酸、亮氨酸、乳酸、苹果酸和异戊醇。
19.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，还包含利用丙酮酸的生物合成途径，其中所述利用丙酮酸的生物合成途径是异丁醇生物合成途径，所述异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
(i)丙酮酸至乙酰乳酸的转化；
(ii)乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸的转化；
(iii)2,3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸的转化；
(iv)2-酮异戊酸至异丁醛的转化；以及
(v)异丁醛至异丁醇的转化；并且
其中所述重组宿主细胞产生异丁醇。
20.根据权利要求18所述的重组宿主细胞，其中所述利用丙酮酸的生物合成途径是2-丁酮生物合成途径，所述2-丁酮生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
(i)丙酮酸至乙酰乳酸的转化；
(ii)乙酰乳酸至乙偶姻的转化；
(iii)乙偶姻至2,3-丁二醇的转化；以及
(iv)2,3-丁二醇至2-丁酮的转化；并且
其中所述重组宿主细胞产生2-丁酮。
21.根据权利要求18所述的重组宿主细胞，其中所述利用丙酮酸的生物合成途径是2-丁醇生物合成途径，所述2-丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
(i)丙酮酸至乙酰乳酸的转化；
(ii)乙酰乳酸至乙偶姻的转化；
(iii)乙偶姻至2,3-丁二醇的转化；
(iv)2,3-丁二醇至2-丁酮的转化；以及
(v)2-丁酮至2-丁醇的转化；并且
其中所述重组宿主细胞产生2-丁醇。
22.生产2,3-丁二醇、2-丁醇、2-丁酮、缬氨酸、亮氨酸、乳酸、苹果酸、丙氨酸、富马酸、琥珀酸或异戊醇的方法，包括使权利要求18的重组宿主细胞在产生所述产物的条件下生长且任选地回收所述产物。
23.生产异丁醇的方法，包括使权利要求19的重组宿主细胞在产生所述产物的条件下生长且任选地回收所述产物。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述重组宿主细胞包含2-丁酮生物合成途径，所述2-丁酮生物合成途径包含编码多肽的至少一种DNA分子，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：
(i)丙酮酸至乙酰乳酸的转化；
(ii)乙酰乳酸至乙偶姻的转化；
(iii)乙偶姻至2,3-丁二醇的转化；以及
(iv)2,3-丁二醇至2-丁酮的转化；
并且其中所述产物是2-丁酮。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述重组宿主细胞包含2-丁醇生物合成途径，所述2-丁醇生物合成途径包含编码多肽的至少一种DNA分子，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：
(i)丙酮酸至乙酰乳酸的转化；
(ii)乙酰乳酸至乙偶姻的转化；
(iii)乙偶姻至2,3-丁二醇的转化；
(iv)2,3-丁二醇至2-丁酮的转化；以及
(v)2-丁酮至2-丁醇的转化；
并且其中所述产物是2-丁醇。
26.制备重组宿主细胞的方法，包括：
用编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化宿主细胞，所述宿主细胞包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述方法还包括：
用编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。
28.改善重组宿主细胞的生长的方法，所述重组宿主细胞包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变或替换，所述方法包括：
用编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述方法还包括：
用编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。
30.根据权利要求28所述的方法，还包括使所述重组宿主细胞在包含限制的碳底物的培养基中生长。
31.降低重组宿主细胞的生长对外源二碳底物的需求的方法，所述重组宿主细胞包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变或替换，所述方法包括：
用编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述方法还包括：
用编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。
33.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其中所述磷酸酮醇酶以小于7.5E-242的E值匹配表6中给出的序型HMM。
34.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其中所述磷酸酮醇酶以小于7.5E-242、1.1E-124、2.1E-49、7.8E-37的E值分别匹配表6、7、8和9中给出的序型HMM。
35.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，还包含磷酸转乙酰酶，所述磷酸转乙酰酶以小于5E-34的E值匹配表14中给出的序型HMM。
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