CN103620046A - 在发酵期间用于酶促生产醇酯的脂肪酶的原位表达 - Google Patents

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Abstract

本文公开了在发酵期间通过提供醇生产微生物生产醇酯的方法，所述微生物还包含编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸。

Description

在发酵期间用于酶促生产醇酯的脂肪酶的原位表达
技术领域
本发明涉及包括乙醇和丁醇的醇的发酵生产、以及采用原位产物移除方法的用于改善醇发酵的方法。
背景技术
醇在工业和科学中具有多种用途。例如醇可用作饮料(即，乙醇)、燃料、试剂、溶剂、和防腐败剂。例如丁醇是一种醇，它是重要的工业化学品，具有多种用途，包括用作燃料添加剂，在塑料工业中用作化学原料，以及在食品和风味剂工业中用作食品级的提取剂。因此，高度需求醇如丁醇以及不依赖不可再生资源的高效生产方法。
利用微生物发酵生产醇是一种这样的生产方法，其利用来自可再生原料的底物。在丁醇生产中，具体地讲一些生产高产量丁醇的微生物也具有低的丁醇毒性阀值，使得当生产丁醇时需要从发酵罐中去除丁醇。因此，存在对开发用于以高产率生产丁醇(尽管生产丁醇的微生物在发酵培养基中有低的丁醇毒性阈值)的有效方法和体系的持续需求。原位产物移除(ISPR)(也被称为提取发酵)可用于从其生产的发酵容器中取出丁醇(或其它发酵的醇)，从而使微生物以高产率生产丁醇。本领域已经描述过的一种用于移除发酵性醇的ISPR方法是液-液提取(美国专利申请公布20090305370)。一般来讲，关于丁醇发酵，例如，所述发酵培养基与有机提取剂接触。所述有机提取剂和所述发酵培养基形成两相混合物。丁醇被分配至有机提取剂相，降低了在与微生物接触的水相中的浓度，从而限制了微生物在抑制性的丁醇中的暴露。液-液提取由以下步骤引起：接触提取剂和发酵液体培养基以将产物醇传递到提取剂中；分离提取剂相与水相；以及优选地，再循环利用提取剂，同时在长期运行期间最小化提取剂分配系数的降低。
每一个循环，提取剂可随着时间进行而被污染，例如通过作为可水解的淀粉的原料被进料至发酵容器中的生物质中存在的脂质的积累。例如，在葡萄糖转化为丁醇的过程中加载至发酵容器的液化玉米醪可产生包含玉米油的发酵液体培养基，其通过同时的糖化和发酵产生(所述液化的醪的糖化在发酵过程中通过用于产生葡萄糖的葡糖淀粉酶的添加而发生)。在ISPR过程中，玉米油脂质溶解于提取剂中可导致脂质浓度随着每次提取剂的循环利用而积累，这使得产物醇在提取剂中的分配系数降低，因为提取剂中的脂质浓度随着每次循环利用而升高。
将液化醪中存在的脂质转化成可在ISPR中使用的提取剂是一种减少进料于发酵容器中的脂质量的方法，它通过向发酵加入作为酯化作用催化剂的脂肪酶，用脂肪酸酯化在发酵期间产生的产物醇。此类方法在例如美国申请公布20110312044和20110312043，以及PCT申请公布WO2011／159998中有描述，上述文献以引用方式并入本文。
一直需要可供选择的提取发酵方法，其也能够减少与向发酵加入脂肪酶相关联的成本。
发明内容
本文提供的方法包括：a)提供发酵培养基，其包含来源于生物质原料的可发酵碳底物、产自来源于生物质原料的可发酵碳底物的醇、和醇生产微生物，其中醇生产微生物包含编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸，并且该微生物表达并展示或分泌所述多肽，使得发酵培养基中存在脂肪酶活性；b)使发酵培养基与羧酸接触；其中脂肪酶活性以在细胞外将由微生物产生的醇的至少一部分转化成醇酯的足够量存在于发酵培养基中。在实施例中，醇生产微生物是酵母。在实施例中，编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸是经工程化的。在实施例中，该方法还包括使发酵培养基与提取剂接触以形成包括水相和有机相的两相混合物。在实施例中，提取剂包括所述羧酸。在实施例中，产物醇是C2-C8烷基醇。在实施例中，产物醇是乙醇。在实施例中，醇酯包括脂肪酸乙酯。在实施例中，产物醇是丁醇。在实施例中，醇酯包括脂肪酸丁酯。在实施例中，醇酯还包括脂肪酸乙酯。
在实施例中，本文提供的具有脂肪酶活性的多肽展示在微生物表面上。在实施例中，分泌出具有脂肪酶活性的多肽。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID NO：249、250、251、252、253或它们的片段中的任何一个具有至少约70％同一性，至少约80％同一性，至少约90％同一性，或至少约95％同一性的序列。在实施例中，编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸包含与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、8、9、46、48、50、52、54、255、271或273的多核苷酸具有至少约70％同一性的序列。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽包含与具有SEQ ID NO：2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或274的多肽或它们的活性片段具有至少约70％同一性，至少约80％同一性，至少约90％同一性，或至少约95％同一性的序列。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽不包含糖基化基序。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽是没有糖基化的。
在实施例中，羧酸包括游离脂肪酸，所述游离脂肪酸来源于玉米油、低芥酸菜子油、棕榈油、亚麻籽油、麻风树油、或大豆油。在实施例中，羧酸来源于与可发酵碳底物相同的生物质原料。在实施例中，羧酸包括具有C12-C22直链或支化的脂肪链的羧酸。在实施例中，与提取剂的接触和与羧酸的接触同时发生。在实施例中，至少约60％有效滴度的由微生物产生的醇被转化成醇酯。在实施例中，发酵培养基还包含甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合，并且脂肪酶活性甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合的至少一部分水解以形成游离脂肪酸。
在实施例中，在发酵期间产生的醇的有效滴度大于由不包含编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸的醇生产微生物在发酵期间产生的醇的有效滴度，并且该微生物表达并分泌或展示所述多肽，使得发酵培养基中存在该脂肪酶活性。在实施例中，在发酵期间产生的醇的有效速率大于由不包含编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸的醇生产微生物在发酵期间产生的醇的有效速率，并且该微生物表达并分泌或展示所述多肽，使得发酵培养基中存在该脂肪酶活性。
本文也提供了重组宿主细胞，其包含工程化的醇生产途径；和工程化的多核苷酸，其编码具有脂肪酶活性的多肽。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID NO：2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或274或它们的活性片段具有至少约70％同一性，至少约80％同一性，至少约90％同一性，或至少约95％同一性的序列。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID NO：249、250、251、252、253或它们的片段中的任何一个具有至少约70％同一性，至少约80％同一性，至少约90％同一性，或至少约95％同一性的序列。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽不包含糖基化基序。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽是没有糖基化的。在实施例中，编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、8、9、46、48、50、52、54、255、271或273具有至少约70％同一性，至少约80％同一性，至少约90％同一性，或至少约95％同一性的序列。
本文也提供了重组宿主细胞，其包含醇生产途径；和工程化的多核苷酸，其编码具有脂肪酶活性的多肽，其中该具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID NO：2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或274或它们的活性片段具有至少约70％同一性，至少约80％同一性，至少约90％同一性，或至少约95％同一性的序列。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽还包含与SEQ ID NO：249、250、251、252、253或它们的片段中的任何一个具有至少约70％同一性，至少约80％同一性，至少约90％同一性，或至少约95％同一性的序列。在实施例中，醇生产途径是丁醇生产途径。在实施例中，丁醇生产途径是异丁醇生产途径。在实施例中，宿主细胞还包含降低的或消除的丙酮酸脱羧酶活性。
本文也提供了提高醇生产微生物对所产生醇的耐受性的方法，该方法包括：工程化微生物以表达并分泌或展示具有脂肪酶活性的多肽；在使得微生物产生醇的条件下，使工程化的微生物与甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、磷脂、游离脂肪酸、或它们的混合物以及碳底物接触。在实施例中，使工程化的微生物与甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合接触，并且其中分泌的或展示的脂肪酶将甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合的至少一部分转化成游离脂肪酸。在实施例中，脂肪酶催化醇酯的形成。在实施例中，微生物产生醇的有效滴度大于由未经工程化以表达并分泌具有脂肪酶活性的多肽的微生物产生的醇的有效滴度。在实施例中，微生物还包含工程化的醇生物合成途径。在实施例中，工程化的醇生物合成途径是1-丁醇、2-丁醇、或异丁醇生物合成途径。在实施例中，异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：丙酮酸至乙酰乳酸；乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；2-酮异戊酸至异丁醛；以及异丁醛至异丁醇。
本文提供了在发酵期间生产丁酯的方法，该方法包括提供发酵培养基，所述发酵培养基包含碳底物以及甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的混合物；以及使发酵培养基与包含丁醇生物合成途径的醇生产微生物接触，其中所述微生物还包含编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸，并且所述微生物表达并分泌或展示该多肽，使得发酵培养基中存在脂肪酶活性。在实施例中，发酵培养基还包含一种或多种羧酸。在实施例中，碳底物来源于生物质。在实施例中，生物质是玉米或甘蔗。在实施例中，碳底物以及甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂来源于相同的生物质。
本文提供了发酵培养基，其包含醇生产微生物、丁酯和丁醇，该醇生产微生物包含丁醇生物合成途径并且还包含编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸，所述多肽被表达并分泌或展示。
还提供了包含本文所述的微生物的动物饲料产品。
附图和序列说明
并入本文并成为说明书的一部分的附图和序列表示出了本发明，并且与说明书一起进一步用来解释本发明的原理并使得本领域的技术人员能够利用本发明。
图1示意性地示出了本发明的示例性方法和体系，其中微生物与羧酸和／或天然的油一起被提供至发酵容器。
图2描绘了从丙酮酸生物合成异丁醇的生物合成途径例子。
图3是质粒pRS423：：TEF1(M4)-CdLIP1(“pNAK10”；SEQ ID NO：45；参见实例1)的图谱，该质粒携带畸形假丝酵母(Candida deformans)LIP1脂肪酶，它在组成型TEF1(M4)启动子(Nevoigt E，Kohnke J，Fischer CR，Alper H，Stahl U，&Stephanopoulos G(2006)，Engineering ofpromoter replacement cassettesfor fine-tuning of gene expression inSaccharomyces cerevisiae.Appl Environ Microbiol72：5266-5273)和CYC1转录终止子的转录控制下，位于酵母-大肠杆菌穿梭载体中。
图4是质粒pRS423：：TEF1(M4)-THlip(“pTVAN2”；SEQ ID NO：100；参见实例2)的图谱，该质粒携带疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)Tlan脂肪酶，它在组成型TEF1(M4)启动子(Nevoigt E等人)和CYC1转录终止子的转录控制下，位于酵母-大肠杆菌穿梭载体中。
图5是质粒pRS423：：TEF1(M4)-CalB(“pTVAN3”；SEQ ID NO：101；参见实例7)的图谱，该质粒携带南极假丝酵母(Candidaantarctica)CalB脂肪酶，它在组成型TEF1(M4)启动子(Nevoigt E等人)和CYC1转录终止子的转录控制下，位于酵母-大肠杆菌穿梭载体中。
图6是质粒pYZ090ΔalsS(SEQ ID NO：43；参见实例)的图谱，该质粒携带酮醇酸还原异构酶(KARI)的ORF，位于酵母-大肠杆菌穿梭载体中。
图7质粒pBP915(SEQ ID NO：44；参见实例9和10)的图谱，该质粒携带编码二羟基酸脱水酶和醇脱氢酶的ORF，位于酵母-大肠杆菌穿梭载体中。
SEQ ID NO：1和2是来自南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶B(“CalB”)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：3和4是来自畸形假丝酵母(Candida deformans)的脂肪酶1(“LIP1”)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：5和6是来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)的Tlan脂肪酶(“Tlan”)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：255和256是来自塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)的脂肪酶3(“lip3”)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：7、8、9和257是来自南极假丝酵母(Candidaantarctica)、畸形假丝酵母(Candida deformans)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)和塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)的CalB、LIP1、Tlan和lip3脂肪酶的编码序列，它们经密码子优化以在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中表达。
SEQ ID NO：46和47是具有修饰N99A的CalB变体的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：48和49是具有修饰N146A的LIP1变体的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：50和51是具有修饰N167A的LIP1变体的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：52和53是具有修饰N146A和N167A的LIP1变体的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：54和55是具有修饰N55A的Tlan变体的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：271和272是具有修饰N59A的lip3变体的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：273和274是具有修饰N269A的lip3变体的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：275和276是具有修饰N59A和N269A的lip3变体的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：241和248是来自白曲霉(Aspergillus kawachii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：249和254是啤酒糖酵母(S.cerevisiae)的细胞表面锚定域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：258和259是来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)和印度拜耶林克氏菌(Beijerinkia indica)的醇脱氢酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：260和261是来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和格氏李斯特菌(Listeria grayi)的酮酸脱羧酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：262和263是来自变异链球菌(Streptococcus mutans)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的二羟基酸脱水酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10-45、56—144、153-238、240、264-270、和278是实例中所述的合成构建体和引物的序列。
具体实施方式
除非另行定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。如发生矛盾，以本专利申请(包括其定义)为准。此外，除非上下文另有所需，单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。为所有目的，所有的出版物、专利、以及本文提及的其它参考资料均全文以引用方式并入本文。
为了进一步限定本发明，本文提供了以下术语和定义。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或它们的任何其它变型将被理解为是指包括指定的整数或整数组但不排除任何其它整数或整数组。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下任何一个均表示满足条件A或B：A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。
同样，涉及元素或组分实例(即次数)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数形式，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，术语“发明”或“本发明”为非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施例，而是涵盖如专利申请所述的所有可能的实施例。
如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用在产生浓缩物或溶液的一般测定和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等。术语“约”还涵盖由于相对于由特定起始混合物所得的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求都包括量的等同量。在一个实施例中，术语“约”指在报告数值的10％范围内，或者在报告数值的5％范围内。
如本文所用，“生物质”指包含可水解多糖的天然产物，所述多糖提供可发酵糖，包括来源于天然来源如玉米、甘蔗、小麦、纤维素或木质纤维素材料以及包含纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖、二糖和／或单糖、以及它们的混合物的材料的任何糖和淀粉。生物质也可包含附加组分如蛋白质和／或脂质。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的例子包括但不限于：玉米粒、玉米棒、作物残余物如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、黑麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、大豆、从谷物的研磨获得的组分、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物。例如，可通过本领域已知的任何加工方法，利用发酵加工生物质以从生物质中形成麦芽浆或果汁或糖蜜或水解产物，所述方法例如研磨、处理和／或液化，并且它们包含可发酵糖并可包含一定量的水。例如，可通过本领域技术人员已知的任何方法来加工纤维素和／或木质纤维素生物质以获得包含可发酵糖的水解产物。在美国专利申请公布US20070031918A1中公开了低氨预处理，该专利申请以引用方式并入本文。纤维素和／或木质纤维素生物质的酶促糖化通常利用酶聚生体来降解纤维素和半纤维素以产生包含糖的水解产物，所述糖包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。(适于纤维素和／或木质纤维素生物质的糖化酶综述于Lynd，L.R.等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.，66：506-577，2002)。
麦芽浆或果汁或糖蜜或水解产物可包括如本文所述的原料12和原料浆液16。含水原料流可通过本领域已知的任何加工方法，利用发酵加工生物质来源于生物质或从生物质中形成，所述方法例如研磨、处理和／或液化，并且它们包含可发酵碳源(例如糖)和水。含水原料流可包括如本文所述的原料12和原料浆液16。
如本文所用，“产物醇”指在发酵过程中能够由微生物产生的任何醇，所述微生物利用生物质作为可发酵碳底物的来源。产物醇包括但不限于C1-C8烷醇。在实施例中，产物醇为C2-C8烷基醇。在另外的实施例中，产物醇为C2-C5烷基醇。应当理解，C1-C8烷醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇。同样地，C2-C8烷基醇包括但不限于乙醇、丙醇、丁醇和戊醇。“醇”本文也用于指产物醇。
如本文所用，“丁醇”特指单独的或它们的混合物形式的丁醇异构体1-丁醇(1-BuOH)、2-丁醇(2-BuOH)、和／或异丁醇(iBuOH或i-BuOH或I-BUOH，也称为2-甲基-1-丙醇)。
如本文所用，“丙醇”指丙醇异构体异丙醇或1-丙醇。
如本文所用，“戊醇”指戊醇异构体1-戊醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、2，2-二甲基-1-丙醇、3-戊醇、2-戊醇、3-甲基-2-丁醇、或2-甲基-2-丁醇。
如本文所用，“原位产物移除(ISPR)”指从诸如发酵的生物过程中，当产物生成时选择性移出特定的发酵产物以控制生物过程中的产物浓度。
如本文所用，“可发酵碳源”或“可发酵碳底物”是指能够由本文所公开的微生物代谢以产生发酵醇的碳源。适当的可发酵的碳源包括但不限于单糖，如葡萄糖或果糖；二糖，如乳糖或蔗糖；低聚糖；多糖，如淀粉或纤维素；包括甲烷的一碳底物；以及它们的混合物。
如本文所用，“原料”是指发酵过程中的原料，所述原料包含具有或不具有不溶解的固体的可发酵碳源，并且如果适用，所述原料在通过进一步加工(例如通过液化、糖化、或其它方法)已经从淀粉中释放可发酵碳源或从复糖降解中获取可发酵碳源之前或之后包含可发酵碳源。原料包括或来源于生物质。适宜的原料包括但不限于黑麦、小麦、玉米、甘蔗、以及它们的混合物。
如本文所用，“不溶解的固体”是指原料的不可发酵部分，例如胚芽、纤维和谷蛋白。
如本文所用，“发酵液体培养基”是指水、糖、溶解的固体、微生物产生的醇、产物醇及发酵容器内具有的所有其它物质组分的混合物，其中产物醇通过在微生物的存在下使糖反应生成醇、水和二氧化碳(CO2)而制得。有时，如本文所用，术语“发酵培养基”和“发酵混合物”能够与“发酵液体培养基”同义使用。
如本文所用，“发酵容器”是指在其中进行发酵反应的容器，产物醇如丁醇通过发酵反应由糖制备。
如本文所用，术语“有效滴度”是指每升发酵培养基通过发酵产生的特定醇(例如丁醇)或通过醇的酯化作用产生的醇酯的醇等同物的总量。例如，在单位体积发酵中的丁醇的有效滴度包括：(i)发酵培养基中的丁醇量；(ii)由有机提取剂回收的丁醇量；(iii)如果使用汽提，从气相回收的丁醇量，和(iv)在有机相或水相中的丁酯的当量醇。
如本文所用，“糖化”是指低聚糖降解成单糖。“同步糖化和发酵”是指发酵和糖化在相同容器中同时发生。
如本文所用，“糖化酶”指能够水解多糖和／或低聚糖例如糖原、淀粉的α-1，4-糖苷键的一种或多种酶。糖化酶也可包括能够水解纤维素或木质纤维素材料的酶。
如本文所用，“脂肪酶活性”是指催化水不溶性的或低水溶性的脂质底物中的酯化学键水解的酶活性。脂肪酶是酯酶的一个亚类，并且就其本身而言，“脂肪酶活性”也指催化酯水解成羧酸和醇的酶活性，并且如本文所用，“脂肪酶活性”也指将醇和羧酸酯化成羧酸醇酯的酶活性。
如本文所用，“糖基化”是将碳水化合物分子酶促加成到生物大分子如蛋白上，这可能发生在蛋白定向分泌到细胞外时。在O-糖基化蛋白中，碳水化合物连接到丝氨酸、苏氨酸、或酪氨酸残基的羟基上。在N-糖基化蛋白中，碳水化合物连接到共有序列NXS／T中的天冬酰胺(N)残基的酰胺侧链上，其中X是任何氨基酸并且S／T是丝氨酸或苏氨酸。如本文所用，“糖基化的”是指具有共价连接的碳水化合物的蛋白分子。
如本文所用，“液化容器”指在其中进行液化的容器。液化是其中低聚糖从原料中释放出来的过程。在其中原料是玉米的实施例中，低聚糖在液化期间从玉米淀粉内容物中释放出来。
如本文所用，术语“分离”与“回收”同义，并且是指从初始混合物中移除化合物以获得纯度或浓度比初始混合物中的所述化合物纯度或浓度更高的化合物。
术语“与水不混溶的”或“不溶的”是指化学组分如提取剂或溶剂不能够以形成单一液相的形式与水溶液如发酵液体培养基混合。
如本文所用，“提取剂”或“ISPR提取剂”是指用于提取任何产物醇如丁醇，或用于提取通过催化剂从产物醇和羧酸或脂质产生的任何产物醇酯的有机溶剂。有时，如本文所用，术语“溶剂”可与“提取剂”同义地使用。就本文所述的过程而言，提取剂是与水不混溶的。
如本文所用，“天然的油”是指从植物(例如生物质)或动物获得的脂质。如本文所用，“植物来源的油”特别地指从植物获得的脂质。有时，“脂质”可与“油”和“酰基甘油酯”同义地使用。天然的油包括但不限于：牛油，玉米，卡诺拉，癸酸／辛酸甘油三酯，蓖麻，椰子，棉籽，鱼，荷荷巴油，猪油，亚麻籽，牛蹄油，奥蒂油，棕榈，花生，菜籽，大米，红花，大豆，葵花子，油桐，麻风树油和植物油混合物。
如本文所用，术语“有机相”是指通过使发酵液体培养基和与水不混溶的有机提取剂接触而获得的两相混合物中的非水相。
如本文所用，术语“脂肪酸”指具有C4-C28碳原子(最常见地为C12-C24碳原子)的羧酸(例如脂族一元羧酸)，其是饱和或不饱和的。脂肪酸还可以是支化的或非支化的。脂肪酸在动物或植物的脂肪、油或蜡中可来源于或包含于酯化的形式。脂肪酸可以甘油酯形式在脂肪和脂肪油中天然存在，或者可通过水解脂肪或通过合成获得。术语脂肪酸可以描述单种化学物质或脂肪酸的混合物。脂肪酸可包括质子化的和非质子化的脂肪酸的混合物，其中非质子化的脂肪酸是非质子化的脂肪酸盐(例如钠、钾、铵、或钙离子盐)。此外，术语脂肪酸还可涵盖游离脂肪酸。
本文所用术语“脂肪醇”是指具有C4-C22碳原子的脂肪链的醇，其中的脂肪链为饱和的或不饱和的。
如本文所用，术语“脂肪醛”是指具有C4-C22碳原子的脂族链的醛，所述脂族链为饱和的或不饱和的。
如本文所用，术语“羧酸”是指具有化学通式-COOH的任何有机化合物，其中碳原子通过双键与氧原子键合形成羰基(-C=O)并且通过单键形成羟基(-OH)。羧酸可为质子化羧酸的形式、或羧酸盐形式(例如铵、钠、或钾盐)、或质子化羧酸与羧酸盐混合物的形式。术语羧酸可描述单独的化学物质(例如油酸)或羧酸的混合物，其可通过例如水解生物质来源的脂肪酸酯或甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂产生。
如本文所用，术语“丁醇生物合成途径”或“丁醇生产途径”是指产生1-丁醇、2-丁醇或异丁醇的酶途径。
如本文所用，术语“1-丁醇生物合成途径”或“1-丁醇生产途径”是指从乙酰-辅酶A(乙酰-CoA)产生1-丁醇的酶途径。
如本文所用，术语“2-丁醇生物合成途径”或“2-丁醇生产途径”是指从丙酮酸产生2-丁醇的酶途径。
如本文所用，术语“异丁醇生物合成途径”或“异丁醇生产途径”是指从丙酮酸产生异丁醇的酶途径。
如本文所用，术语“醇生物合成途径”或“醇生产途径”是指将碳底物转化成醇的酶途径。包含“工程化的醇生产途径”的重组宿主细胞是指包含修饰途径的宿主细胞，该途径以与宿主细胞中通常存在的途径不同的方式生产醇。此类差异包括生产通常宿主细胞不生产的醇，或者提高产量或更有效地生产。
术语“基因”指能够被表达为特定蛋白质的核酸片段，其任选包括编码序列前的调节序列(5’非编码序列)和编码序列后的调节序列(3’非编码序列)。“天然基因”指自然状态下与其自身的调控序列一起的基因。“嵌合基因”是指包含天然地不一起存在的调控和编码序列的非天然的任何基因(即，它是从其天然状态被修饰的或是来自另外的来源的)。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源性基因”指在生物体基因组中处于其天然位置的天然基因。“外来基因”或“异源性基因”指宿主生物中通常不作为天然基因存在的但是通过转基因被导入到宿主生物中的基因。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因或嵌合基因。
如本文所用，术语“编码区”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指位于编码序列的上游(5’非编码序列)、中间或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
术语“多核苷酸”旨在包括单数的核酸以及复数的核酸，并且是指核酸分子或构建体例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。如本文所用，“基因”是多核苷酸。多核苷酸可包含全长基因或cDNA序列的核苷酸序列，或其片段，包括非翻译的5’和3’序列以及编码序列。所述多核苷酸可由任何多核糖核酸或多脱氧核糖核酸组成，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA(例如，异源性DNA)。例如，多核苷酸能够由单链和双链DNA构成，其为单链和双链区域的混合物；单链和双链RNA，其为单链和双链区域的混合物；包含DNA和RNA的杂合分子，其可为单链或，更典型地双链或单链和双链区域的混合物。“多核苷酸”包含了化学地、酶学地、或代谢地改性的形式。
如本文所用，“工程化的多核苷酸”是指已经从天然存在的形式发生改变的多核苷酸，或者通过转基因如转化将多核苷酸引入宿主生物。此类修饰包括例如连接两个天然不相连的序列，例如操作地连接天然不操作地连接的编码序列与启动子，或者将两个编码序列连接到一起以形成嵌合编码序列。此类修饰也包括改变天然存在的多核苷酸的一个或多个核苷酸，包括碱基替换、插入、或缺失。
多核苷酸序列可被称为“分离的”，其中它被从其天然的环境中移出。例如，包含在载体中的编码具有二羟酸脱水酶活性多肽或多肽片段的异源性多核苷酸，出于本发明的目的可被认为是分离的。分离的多核苷酸的另一个例子包括异源宿主细胞拥有的重组多核苷酸或溶液中的纯化的(部分地或基本上)多核苷酸。根据本发明分离的多核苷酸或核酸还包括此类人工合成生产的分子。DNA聚合物形式的分离的多核苷酸片段可由一个或更多个cDNA、基因组DNA或合成DNA片段构成。
如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也被称为肽键)线性连接组成的分子。术语“多肽”是指任何两个或更多个氨基酸的链，并且不涉及产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”、或其他任何用于指由两个或更多个氨基酸组成的一条链或多条链的术语，都包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可用于取代或与这些术语中任一项互换使用。一条多肽可来源于天然生物源或由重组技术产生，但不一定是由一条指定的核酸序列翻译的。它可由任何方式生成，包括通过化学合成。
“分离的”多肽或其片段、变体、或衍生物，是指不在其天然环境下的多肽。不需要特别的纯化水平。例如，分离的多肽能够从它原生的或天然的环境中去除。在宿主细胞中重组产生的多种多肽和蛋白质考虑以所述发明目的进行分离，即为原生的或重组的多肽，其已通过任何适宜的技术分离、分馏、或部分或大幅纯化。
如本文所用，“重组微生物”是指通过重组DNA技术的使用(例如，通过工程化宿主细胞以包含生物合成途径如丁醇的生物合成途径)被改造的微生物如细菌和酵母。
如本文所用，术语“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子来确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，期望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
术语“经密码子最优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物体通常的密码子使用。此类优化包括将至少一个、或多于一个、或显著的数目的密码子替换为在那种生物体中使用频率更高的一个或多个密码子。
包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的偏差，允许编码该基因的序列中的变型。由于每一密码子由三个核苷酸组成，而组成DNA的核苷酸限于四种特异性碱基，存在64种可能的核苷酸组合，其中的61种编码氨基酸(其余三种密码子编码结束翻译的信号)。显示哪个密码子编码哪个氨基酸的“遗传密码”在本文中作为表1示出。因此，许多氨基酸被分配了多于一种的密码子。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四种三联体编码，丝氨酸和精氨酸由六种，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。这种简并性允许DNA碱基组成在宽范围内变化而不会改变由该DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。
表1：标准遗传密码
对于使用特定密码子来编码特定氨基酸向延伸中的肽链中的插入，许多生物表现出偏倚。密码子偏好、或密码子偏倚性、生物体间密码子使用的差异是遗传密码子的简并性造成的，在很多生物体中有很详细的记录。密码子偏倚性常与信使RNA(mRNA)的翻译效率有关，这继而据信取决于特别是被翻译的密码子的特性和特定转运RNA(tRNA)分子的可用性。选定的tRNA在细胞中的优势一般而言反映了在肽的合成中最经常使用的密码子。相应地，能够基于密码子优化对基因进行加工，以使基因在给定生物中的表达最优化。
考虑到对于多种多样的动物、植物和微生物物种存在大量的基因序列，计算密码子使用的相对频率是可能的。密码子使用表是易得的，例如在http：／／www.kazusa.or.jp／codon／(2008年3月20日访问)提供的“密码子使用数据库”，并且这些表格可以在许多方面进行调整。参见Nakamura，Y.等人.Nucl.Acids Res.28：292(2000)。从GenBank Release128.0[2002年2月15日]计算的酵母的密码子使用表被重制为下文的表2。该表使用mRNA命名，因此，该表使用存在于RNA中的尿嘧啶(U)，而不是存在于DNA中的胸腺嘧啶(T)。表2经过了调整，因此计算了每个氨基酸的频率，而非全部64个密码子。
表2：啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因的密码子使用表
Figure BDA0000432348610000171
Figure BDA0000432348610000181
通过利用该表或类似的表，本领域的普通技术人员能够将这些频率应用于任何给定的多肽序列，并产生密码子优化的编码所述多肽的编码区的核酸片段，但其使用针对给定的物种优化的密码子。
以优化的频率随机分配密码子来编码给定的多肽序列，能够通过计算每种氨基酸的密码子频率，然后随机地为给多肽序列分配密码子而人工地实现。此外，多种算法和计算机软件程序是本领域的普通技术人员容易获得的。例如，可从DNAstar，Inc.，Madison，WI获得的Lasergene软件包中的“EditSeq”功能，可从InforMax，Inc.，Bethesda，MD获得的VectorNTI套件中的“backtranslation”功能，和可从Accelrys，Inc.，San Diego，CA获得的GCG—Wisconsin软件包中的“backtranslate”功能。此外，多种用于对编码区序列进行密码子优化的资源是可公开获得的，例如http：／／www.entelechon.com／bioinformatics／backtranslation.php?lang=eng(2008年4月15日访问)的“backtranslation”功能，和可在http：／／bioinfo.pbi.nrc.ca：8090／EMBOSS／index.html(2002年7月9日访问)使用的“backtranseq”功能。构建基本的算法来基于给定的频率分配密码子也能够由本领域的普通技术人员用基本的数学函数实现。
密码子优化的编码区也可通过本领域的技术人员已知的多个方法进行设计，包括软件包如“synthetic gene designer”(userpages.umbc.edu／～wug1／codon／sgd／，发布于2012年3月19日)。
当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时，多核苷酸或核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交和洗涤条件为人们所熟知，示例参见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold SpringHarbor，NY(1989)，尤其是在该文献第11章和表11.1中进行了例示。温度和离子强度条件确定杂交的“严格性”。可调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤确定严格性条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6X SSC、0.5％SDS在室温下洗涤15分钟，然后用2X SSC、0.5％SDS在45℃下重复30分钟，再用0.2XSSC、0.5％SDS在50℃下重复洗涤两次，每次30分钟。更优选的一组严格性条件采用更高的温度，其中洗涤与上述洗涤相同，不同的是最后两次在0.2X SSC、0.5％SDS中洗涤30分钟时的温度被增加到60℃。另一组优选的高度严格性条件是最后两次洗涤在65℃下用0.1X SSC，0.1％SDS进行。例如，另一组严格性条件包括在0.1X SSC、0.1％SDS中在65℃下杂交并用2X SSC、0.1％SDS洗涤，随后用0.1X SSC、0.1％SDS洗涤。
杂交需要两种核酸含有互补序列，但取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互补的程度，它们为本领域熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体Tm的值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对Tm应较高的)按下列顺序依次降低：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经获得了计算Tm的公式(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等人，同上，11.7—11.8)。在一个实施例中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸；更优选至少约20个核苷酸；最优选长度为至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以推定鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))的算法通过计算机自动化的序列比对和鉴定进行的。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有十个或更多邻接氨基酸或者三十个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(如DNA杂交)和基因分离(如细菌菌落或噬斑的原位杂交)的方法中。此外，12—15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“主要部分”包含的序列足以特异性地鉴定和／或分离包含该序列的核酸片段。本说明书教导了编码特定蛋白质的完整氨基酸和核苷酸序列。具有如本文报道序列的有益效果，技术人员现在可使用全部公布序列或它们的主要部分用于本领域技术人员已知的目的。相应地，本发明包括如本文所提供的完全序列，以及那些上述序列的基本部分。
术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
如本领域已知的，术语“百分比同一性”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。在本领域中，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联的程度，根据具体情况，它由这些序列的序列串之间的匹配程度确定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包括但不限于下列文献中所公开的那些：1.)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)Oxford University：NY(1988)；2.)Biocomputing：Informaticsand Genome Projects(Smith，D.W.编辑)Academic：NY(1993)；3.)Computer Analysis ofSequence Data，PartI(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humania：NJ(1994)；4.)Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.编辑)Academic(1987)；以及5.)Sequence AnalysisPrimer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)Stockton：NY(1991)。
设定确定同一性的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和百分比同一性计算可以用LASERGENE生物信息学计算软件包(LASERGENE bioinformatics computing suite(DNASTAR Inc.，Madison，WI))中的MegAlignTM程序进行。序列的多重比对使用“Clustal比对方法”进行，该方法涵盖若干个不同的算法，包括对应于称为Clustal V的比对方法的“Clustal V比对方法”(公开于Higgins和Sharp，CABIOS.5：151—153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189—191(1992))中，并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)中的MegAlignTM程序中找到的比对方法。对于多重比对，默认值对应于GAP PENALTY=10、以及GAP LENGTHPENALTY=10。用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE=1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5、以及DIAGONALS SAVED=5。对于核酸，这些参数为KTUPLE=2、GAPPENALTY=5、WINDOW=4、以及DIAGONALS SAVED=4。在用Clustal V程序进行序列比对后，有可能通过观察相同程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。此外，也可以使用“Clustal W比对方法”，该方法相当于称为Clustal W(在Higgins和Sharp，CABIOS；5：151—153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8：189—191(1992)中有所描述)，并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)中的MegAlignTMv6.1程序中找到的比对方法。用于多重比对的默认参数(GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=0.2、Delay Divergen Seqs(％)=30、DNA Transition Weight=0.5、Protein Weight Matrix=Gonnet系列、以及DNA Weight Matrix＝IUB)。在使用Clustal W程序对序列进行比对之后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。
本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于鉴定多肽，包括来自其它物种的变体或多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。有用的一致性百分比例子包括但不限于：55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％、或55％至100％的任何正数百分比在描述本发明时可以是有用的，如55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。合适的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，更优选至少200个氨基酸，最优选至少250个氨基酸的多肽。
术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件包括但不限于：1.)GCG程序套件(Wisconsin Package Version9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2.)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4.)Sequencher(GeneCodes Corporation，Ann Arbor，MI)；以及5.)FASTA程序，其结合了Smith-Waterman算法(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date1992，111-20。编辑：Suhai，Sandor，Plenum：New York，NY)。在本专利申请的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，分析结果将基于所参考程序的“默认值”，除非另外指明。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文称为“Maniatis”)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版(1987)。此处所用的附加的方法参见Methods in Enzymology，第194卷，Guide toYeast Genetics and Molecular and Cell Biology(部分A，2004，Christine Guthrie和GeraldR.Fink(编辑)，Elsevier Academic Press，SanDiego，CA)。
对本文所公开的重组宿主细胞的遗传操纵能够利用标准遗传技术和筛选进行，并且能够在任何适合遗传操纵的宿主细胞中完成(Methods in YeastGenetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页)。在实施例中，重组宿主细胞是大肠杆菌。在实施例中，本文所公开的重组宿主细胞能够是对遗传修饰和重组基因的表达有用的任何酵母或真菌宿主。在其它实施例中，重组宿主细胞可为以下菌属的一员：接合酵母属(Zygosaccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、德克酵母属(Dekkera)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、球拟酵母属(Torulopsis)、酒香酵母属(Brettanomyces)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、克鲁维酵母属(Kluyveromyce)、和假丝酵母属(Candida)的一些菌种。在另一个实施例中，重组宿主细胞可为啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
申请人已经发现能够表达并将脂肪酶分泌到发酵培养基中的重组宿主细胞产生催化剂，其将催化醇和羧酸的酯化作用。此类宿主细胞改善了在醇的发酵生产中使用的宿主细胞，因为醇的酯化作用可允许细胞以较高的效率生产醇，或者生产的醇量多于将对宿主细胞产生毒性效应的醇量。使用此类重组微生物也能够减少或消除对加入纯化脂肪酶到发酵培养基以进行本文所述方法的需要，这可提供成本和操作方面的优点。
此外，醇的发酵生产通常利用可再生的生物质原料以提供碳底物，重组微生物将碳底物转化成产物醇。此类原料可包含一定量的甘油三酯。当实施提取发酵以从发酵中移除产物醇时，甘油三酯可随着时间而积聚，降低提取剂的分配系数和再循环能力。本文提供的重组宿主细胞分泌的脂肪酶能够有利地将甘油三酯水解成游离脂肪酸，其可为酯化作用的底物，并且其也可对产物醇提取剂的分配系数产生较小的效应。
具有脂肪酶活性的多肽
本文所公开的重组宿主细胞包含具有多肽的多核苷酸，所述多肽具有脂肪酶活性。脂肪酶多核苷酸和多肽的例子以及它们所来源的生物在表3中提供。
表3：脂肪酶多核苷酸和多肽例子
Figure BDA0000432348610000241
Figure BDA0000432348610000251
使用表3所述的脂肪酶作为查询序列对在国家生物技术信息中心的非冗余蛋白序列数据库进行的BLAST分析，从而鉴定具有高(>90％)序列相似性的蛋白。结果在表4中示出(信息于2012年1月22日从国家生物技术信息中心的非冗余蛋白序列数据库检索得到)。虽然认为具有大于90％的序列相似性的蛋白是与本文所述脂肪酶具有相似性的脂肪酶，但是将与查询序列具有低至～30％的相似性的序列注释为脂肪酶并且设想与本文所述的方法和组合物一起使用。
表4：另外的脂肪酶多肽例子
Figure BDA0000432348610000261
除了上文以及表3和4中所述的脂肪酶之外，适用的脂肪酶序列可来源于任何来源，包括例如梨头霉属(Absidia)、无色杆菌属(Achromobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、产碱菌属(Alcaligenes)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、无色杆菌属(Achromobacter)、出芽短梗霉(Aureobasidium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、白僵菌属(Beauveria)、环丝菌属(Brochothrix)、假丝酵母属(Candida)、色杆菌属(Chromobacter)、鬼伞属(Coprinus)、镰孢属(Fusarium)、地霉属(Geotricum)、汉逊酵母属(Hansenula)、腐质霉属(Humicola)、Hyphozyma属、乳杆菌属(Lactobacillus)、绿僵菌属(Metarhizium)、毛霉属(Mucor)、丛赤壳属(Nectria)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、丝核菌属(Rhizoctonia)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉(Rhizopus)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、糖酵母属(Saccharomyces)、猪属(Sus)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、嗜热真菌属(Thermomyces)、Thiarosporella、木霉属(Trichoderma)、轮枝孢属(Verticillium)、和／或耶氏酵母属(Yarrowia)菌株。在实施例中，脂肪酶的来源选自布氏犁头霉(Absidia blakesleena)、伞状犁头霉(Absidia corymbifera)、解毒无色杆菌(Achromobacter iophagus)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、芸苔生链格孢(Alternaria brassiciola)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、白曲霉(Aspergillus kawachii)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstrearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、热杀索丝菌(Brochothrix thermosohata)、柱状假丝酵母(Candida cylindracea)(皱褶假丝酵母(Candida rugosa))、副解脂假丝酵母(Candidaparalipolytica)、南极假丝酵母(Candida Antarctica)脂肪酶A、南极假丝酵母(Candida Antarctica)脂肪酶B、欧诺比假丝酵母(Candidaernobii)、畸形假丝酵母(Candida deformans)、嗜热假丝酵母(Candidathermophila)、粘稠色杆菌(Chromobacter viscosum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinerius)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、茄病镰孢(Fusarium solani)、茄病镰孢(Fusarium solani pisi)、小麦黄色镰孢(Fusarium roseum culmorum)、帚状地霉(Geotricum penicillatum)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、短小腐质霉(Humicola brevispora)、短小腐质霉高温变种(Humicola brevis var.thermoidea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、圆弧青霉(Penicillium cyclopium)、皮落青霉(Penicillium crustosum)、扩展青霉(Penicillium expansum)、青霉属I(Penicillium sp.I)、青霉属II(Penicillium sp.II)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)(即洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)、嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonasmaltophilia)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、解脂臭味假单胞菌(Pseudomonas mephitica lipolytica)、产碱假单胞菌(Pseudomonasalcaligenes)、苗床假单胞菌(Pseudomonas plantari)、类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、和威斯康星假单胞菌(Pseudomonas wisconsinensis)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、日本根霉(Rhizopus japonicus)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)、结筛根霉(Rhizopus nodosus)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、芝谷掷孢酵母(Sporobolomycesshibatanus)、野猪(Sus scrofa)、嗜热踝节菌(Talaromycesthermophiles)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)(曾被命名为柔毛腐质霉(Humicola lanuginose))、Thiarosporella phaseolina、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。在实施例中，脂肪酶选自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶、曲霉属(Aspergillus sp.)脂肪酶、黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)lip3、南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)脂肪酶、娄地青霉(Penicillium roqueforti)脂肪酶、沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶、爪哇毛霉(Mucorjavanicus)脂肪酶、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)脂肪酶、产碱菌属(Alcaligenes sp.)脂肪酶、皱落假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)脂肪酶、畸形假丝酵母(Candida deformans)脂肪酶、来自白地霉(Geotrichum candidum)的脂肪酶A和B、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)脂肪酶、赤球丛赤壳菌(Nectria haematococca)脂肪酶、异孢镰孢菌(Fusarium heterosporum)脂肪酶、德氏根霉(Rhizopus delemar)脂肪酶、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、少根根霉(Rhizopus arrhizus)脂肪酶、和米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶。
本领域的技术人员将会知道编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸序列，例如在上表中的或来源于指示来源的多核苷酸序列，可经密码子优化用于重组宿主细胞。此外，本领域的技术人员将会知道，可将给定的多肽序列截短或进行保守取代，同时不会除去该多肽的脂肪酶活性。因此，本文提供了具有与提供的序列及其活性片段具有至少约75％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约97％，或至少约99％同一性的多肽。还提供了编码此类多肽的多核苷酸。
对于本文所述方法和宿主细胞的实施例，可由微生物表达并分泌具有脂肪酶活性的多肽，使得在产物醇生产期间脂肪酶在发酵培养基中具有活性。本领域的技术人员将会知道，在微生物表面上表达的多肽，诸如通过分泌途径加工的细胞壁蛋白，将被认为是被分泌的，因为在细胞表面上表达的多肽活性在细胞外可用。因此，在实施例中，在微生物表面上表达分泌的脂肪酶。蛋白的表面表达是本领域已知的，其修饰多肽以使它们靶向表面表达。(Washida，M.，S.Takahashi，M.Ueda和A.Tanaka(2001)。“Spacer-mediated display of active lipase on the yeast cell surface。”ApplMicrobiol Biotechnol56(5-6)：681-686，Matsumoto，T.，H.Fukuda，M.Ueda，A.Tanaka和A.Kondo(2002)。“Construction of yeast strains withhigh cell surface lipase activity by using novel display systems based on the Flolpflocculation functional domain。”Appl Environ Microbiol68(9)：4517—4522，Mormeneo，M.，I.Andres，C.Bofill，P.Diaz和J.Zueco(2008)。“Efficient secretion of Bacillus subtilis lipase A in Saccharomyces cerevisiae bytranslational fusion to the Pir4cell wall protein。”Appl.Microbiol.Biotechnol.80(3)：437-445，Liu，W.，H.Zhao，B.Jia，L.Xu和Y.Yan(2010)。“Surface display of active lipase in Saccharomyces cerevisiae usingCwp2as an anchor protein。”Biotechnology Letters32(2)：255-260，Su，G.-d.，X.Zhang和Y.Lin(2010)。“Surface display of active lipase inPichia pastoris using Sed1as an anchor protein。”Biotechnology Letters32(8)：1131—1136，Kuroda，K.和M.Ueda(2011)。“Cell surfaceengineering of yeast for applications in white biotechnology。”BiotechnologyLetters33(1)：1-9)。在实施例中，本文提供的多肽结合到将多肽靶向细胞表面的蛋白域上。在实施例中，本文提供的多肽结合到域Flo1p、Pir4、Sed1、Sag1p、Cwp2、或Aga2上。在实施例中，本文提供的多肽结合到具有GPI锚定基序的蛋白或蛋白片段上。GPI锚定基序是本领域的技术人员已知的，并且可通过生物信息学进行预测，例如通过使用预测引擎(例如，在线预测引擎，mendel.imp.ac.at／gpi／fungi_server.html，访问于2012年3月19日)。(Eisenhaber B.等人，“A sensitive predictor for potential GPI lipidmodification sites in fungal protein sequences and its application to genome-widestudies for Aspergillus nidulans，Candida albicans，Neurospora crassa，Saccharomyces cerevisiae，and Schizosaccharomyces pombe”J Mol Biol.2004Mar19；337(2)：243-53。)可使用的多肽序列域(其将多肽靶向啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞表面)的例子在表5中示出。表5中蛋白的系统命名根据糖酵母属基因组数据库(Saccharomyces GenomeDatabase，“SGD”；在线网址www.yeastgenome.org/；信息检索于2012年3月13日)。配有这一公开的本领域技术人员将能够使用例子的多肽序列和本领域已知的其它此类序列构建将脂肪酶活性靶向重组微生物细胞表面的多肽。
表5：用于表面展示的啤酒糖酵母(S.cerevisiae)蛋白的细胞表面锚定 域的多肽序列。
Figure BDA0000432348610000301
Figure BDA0000432348610000302
共表达Aga2域与Aga1(SGD系统命名：YNR044W；SEQ ID NO：254)
在实施例中，可修饰本文提供的脂肪酶多肽序列，使得糖基化，包括但不限于N-糖基化，被减少或消除。此类修饰可通过突变编码多肽的多核苷酸，使得一个或多个糖基化基序被除去来进行。在实施例中，糖基化基序是N-糖基化基序。在实施例中，糖基化基序是NXS／T。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽不含有糖基化基序NXS／T。
可通过本领域已知的任何方法减少或消除糖基化。例如，可使用糖基化抑制剂如衣霉素，或者可改变宿主细胞内的糖基化机制。也可使用本领域已知的技术，通过定点诱变除去糖基化基序。例如，可使用可商购获得的试剂盒(例如QuikChange II XL定点诱变试剂盒，目录号200524，Stratagene，La Jolla，CA)进行定点诱变。定点诱变可通过Kunkel的方法进行，该方法涉及将尿嘧啶掺入需诱变的模板(Kunkel TA(1985)，Rapidand efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-492)，或者可通过掺入磷硫酰的方法进行(TaylorJW，Ott J，&Eckstein F(1985)，The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA.Nucleic Acids Res13：8765-8785)，或者通过本领域已知的其它方法体外和体内进行。用于诱变靶向位点的引物设计是本领域熟知的，并且序列分析如用于鉴定诱变靶向位点的多序列对比同样是熟知的。
在实施例中，进行诱变使得基序的N被任何其它天然存在的氨基酸(A、R、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、或V；参见表1)替换。在实施例中，基序的N用A替换。在实施例中，进行诱变使得基序的S／T被任何其它天然存在的氨基酸(A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、W、Y、或V；参见表1)替换。在实施例中，N和S／T均用任何其它天然存在的氨基酸(在N残基上的A、R、J、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、W、Y、或V、或S或T；在T残基上的A、R、J、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、W、Y、或V、S或N；在S残基上的A、R、J、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、W、Y、或V、或T或N)替换。在实施例中，糖基化基序NXS／T被基序AXS／T替换。
在一个非限制性例子中，畸形假丝酵母(C.deformans)包含两个糖基化序列，在密码子146的NIS和在167的NNT。在实施例中，那些糖基化位点中的之一或二者靶向替换并且指示的糖基化位点分别用AIS和ANT替换。南极假丝酵母(C.antarctica)在99具有NDT，并且疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)在55具有NIT。在实施例中，突变指示的糖基化位点，使得序列在指示位置为ADT和AIT。
在表6中给出的是预测的糖基化位点脂肪酶开放阅读框，它们来自畸形假丝酵母(C.deformans)、南极假丝酵母(C.antarctica)、和疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)，以及废弃那些位点的突变例子。第一列列出了多肽中出现糖基化位点的位置。第二列给出了在该位置的糖基化序列，以及在密码子优化的多核苷酸中编码它的DNA序列。第三列给出了诱变后在该位置的多肽序列，以及影响该氨基酸改变所需的DNA序列。
表6：预测的糖基化位点
此外，具有表6中列出的两个修饰(N146A和N167A)的畸形假丝酵母(Candida deformans)脂肪酶的核酸和氨基酸序列作为SEQ ID NO：52和53被给出。具有表6中列出的两个修饰(N59A和N269A)的塔宾曲霉(A.tubingensis)脂肪酶的核酸和氨基酸序列作为SEQ ID NO：275和276被给出。
如例子所示，使用本领域已知的和／或本文提供的技术，本领域的技术人员能够以本文提供的方法和组合物容易地修饰脂肪酶中的糖基化基序并测定此类脂肪酶的活性。
本领域的技术人员将会知道，本文提供了具有与提供的序列及其活性片段具有至少约75％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约97％，或至少约99％同一性的多肽。还提供了编码此类多肽的多核苷酸。本领域的技术人员也将认识到本文提供的序列的活性变体能够使用本领域已知的和／或本文所述的技术产生，用于本文所述的方法和组合物。
重组微生物和丁醇生物合成途径
不受理论的束缚，据信本文所述的改善和方法连同任何产生醇的微生物可为有用的，尤其是以高于它们的耐受性水平的滴度产生醇的那些重组微生物。
产生醇的微生物是本领域已知的。例如，甲烷通过甲烷氧化菌(例如，发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium))的发酵性氧化产生甲醇，使甲醇(C1烷基醇)与羧酸和催化剂接触可使所述羧酸与甲醇酯化形成所述羧酸的甲醇酯。野生型酵母菌株CEN.PK113-7D(CBS8340，Centraal Buro voor Schimmelculture；van Dijken JP等人，2000，Aninterlaboratory comparison of physiological and genetic properties of fourSaccharomyces cerevisiae strains.Enzyme Microb.Technol.26：706-714)能够产生乙醇；使乙醇接触羧酸和能够酯化羧酸与乙醇的催化剂形成乙酯。
产生醇的重组微生物也是本领域已知的(例如Ohta等人，1991，Appl.Environ.Microbiol.57：893-900；Underwood等人，2002，Appl.Environ.Microbiol.68：1071-1081；Shen和Liao，2008，Metab.Eng.10：312-320；Hahnai等人，2007，Appl.Environ.Microbiol.73：7814-7818；美国专利5,514,583、美国专利5,712,133；PCT申请公布WO1995028476；Feldmann等人，1992，Appl.Microbiol.Biotechnol.38：354-361；Zhang等人，1995，Science267：240-243；20070031918A1；美国专利7,223,575、美国专利7,741,119；US20090203099A1；美国申请公布2009／0246846A1；和PCT申请公布WO2010／075241，它们以引用方式并入本文)。
能够产生丁醇的适合的重组微生物是本领域已知的，并且本文描述了某些能够产生丁醇的适合的微生物。通过生物合成途径产生丁醇的重组微生物可包括下列的属的成员：梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、伊萨酵母属(Issatchenkia)或糖酵母属(Saccharomyces)。在一个实施例中，重组微生物可选自大肠杆菌(Escherichia coli)，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一个实施例中，所述重组微生物是酵母。在一个实施例中，所述重组微生物为克拉布特里阳性酵母，其选自糖酵母属(Saccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、德克酵母属(Dekkera)、球拟酵母属(Torulopsis)、酒香酵母属(Brettanomyces)、以及假丝酵母属(Candida)的一些菌种。克拉布特里阳性酵母的菌种包括但不限于啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克鲁维酵母(Saccharomyceskluyveri)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、芽殖酵母(Saccharomyces mikitae)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)和光滑假丝酵母(Candida glabrata)。在一些实施例中，所述宿主细胞是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)酵母为本领域所已知并可购自多种来源，包括但不限于美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)、Centraalbureau voorSchimmelcultures(CBS)真菌生物多样性中心、LeSaffre、Gert Strand AB、Ferm Solutions、North American Bioproducts、Martrex和Lallemand。啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)包括但不限于BY4741、CEN.PK113—7D、
Figure BDA0000432348610000341
酵母、Ferm ProTM酵母、
Figure BDA0000432348610000342
XR酵母、Gert StrandPrestige Batch Turbo alcohol酵母、Gert Strand Pot Distillers酵母、Gert StrandDistillers Turbo酵母、FerMaxTMGreen酵母、FerMaxTMGold酵母、
Figure BDA0000432348610000351
酵母、BG-1、PE-2、CAT-1、CBS7959、CBS7960和CBS7961。
此外，已经描述了包含1-丁醇生物合成途径(美国专利申请公布US20080182308A1，以引用方式并入本文)、2-丁醇生物合成途径(以引用方式并入本文的美国专利公开公布US20070259410A1和以引用方式并入本文的US20070292927)、和异丁醇生物合成途径(美国专利公开公布US20070092957，以引用方式并入本文)的重组微生物生产宿主。
利用微生物以及生产丁醇的微生物的发酵生产丁醇在例如美国专利公开2009／0305370中公开，该文献以引用方式并入本文。在一些实施例中，微生物包含丁醇生物合成途径。在实施例中，微生物中的异源性多核苷酸编码至少一个、至少两个、至少三个、或至少四个多肽，它们催化途径中底物至产物的转化。在实施例中，微生物中的异源性多核苷酸编码所有多肽，它们催化途径中底物至产物的转化。在一些实施例中，所述微生物包含减少或消除的丙酮酸脱羧酶活性。基本上不含丙酮酸脱羧酶活性的微生物在美国专利申请公布20090305363中进行了描述，其以引用方式并入本文。基本上不含具有NAD-依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶活性的酶如GPD2的微生物也描述于该专利中。
丁醇生物合成途径
某些合适的异丁醇生物合成途径在美国专利申请公布US20070092957中公开，该专利以引用方式并入本文。在图2中提供公开的异丁醇生物合成途径的图表。如以引用方式并入本文的美国专利申请公布US20070092957A1所述，在异丁醇生物合成途径例子中的步骤包括以下转化：
-丙酮酸转化成乙酰乳酸(参见图2，其中途径的步骤a)，例如受乙酰乳酸合酶催化；
-乙酰乳酸转化成2，3-二羟基异戊酸(参见图2，其中途径的步骤b)，例如受KARI催化；
-2，3-二羟基异戊酸转化成2-酮异戊酸(参见图2，其中途径的步骤c)，例如受乙酰羟酸脱水酶，也叫二羟酸脱水酶(DHAD)催化；
-2-酮异戊酸转化成异丁醛(参见图2，其中途径步骤d)，例如受支链2-酮酸脱羧酶催化；以及
-异丁醛转化成异丁醇(参见图2，其中途径的步骤e)，例如受支链醇脱氢酶催化。
可供选择的途径的步骤f、g、h、i、j和k的底物至产物转化在美国专利申请公布US2007／0092957A1中有所描述，其以引用方式并入本文。
可用于上述底物至产物转化以及那些附加的异丁醇途径的基因和多肽在美国专利申请公布20070092957中有所描述，其以引用方式并入本文。美国申请公布20070092957和20100081154描述了二羟基酸脱水酶(DHAD)，包括来自变异链球菌(Streptococcus mutans)(SEQ ID NO：262)的DHAD和来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(SEQ ID NO：263)的DHAD。美国专利申请公布2009／0269823和2011／0269199A1描述了醇脱氢酶，包括来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)(SEQ ID NO：258)的醇脱氢酶和来自印度拜耶林克氏菌(Beijerinkiaindica)(SEQ ID NO：259)醇脱氢酶。酮醇酸还原异构酶(KARI)的描述参见美国专利申请公布20080261230A1、20090163376、20100197519、和PCT申请公布WO／2011／041415，它们全部以引用方式并入本文。酮酸脱羧酶包括来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(SEQ ID NO：260)和格氏李斯特菌(Listeria grayi)(SEQ ID NO：261)的那些。
另外在以引用方式并入本文的美国专利7,851,188和7,993,889中描述了使用公开的生物合成途径构建细菌与酵母的嵌合基因和基因工程以生产异丁醇。
在另一个实施例中，异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
-丙酮酸至乙酰乳酸的转化，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
-乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的转化，其可被例如酮醇酸还原异构酶催化；
-2，3-二羟基异戊酸至a-酮异戊酸的转化，其可被例如二羟基酸脱水酶催化；
-α-酮异戊酸至缬氨酸的转化，其可被例如转氨酶或缬氨酸脱氢酶催化；
-缬氨酸至异丁胺的转化，其可被例如缬氨酸脱羧酶催化；
-异丁胺至异丁醛的转化，其可被例如ω转氨酶催化；以及
-异丁醛至异丁醇的转化，其可被例如支链醇脱氢酶催化。
在另一个实施例中，异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
-丙酮酸至乙酰乳酸的转化，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
-乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的转化，其可被例如乙酰羟酸催化；
-2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸的转化，其可被例如乙酰羟酸脱水酶催化；
-α-酮异戊酸至异丁酰-CoA的转化，其可被例如支链酮酸脱氢酶催化；
-异丁酰-CoA至异丁醛的转化，其可被例如乙酰化醛脱氢酶催化；以及
-异丁醛至异丁醇的转化，其可被例如支链醇脱氢酶催化。
在另一个实施例中，异丁醇生物合成途径包括如图2中步骤k、g、和e所示的底物至产物的转化。
用于生产可使用的1-丁醇的生物合成途径包括在美国申请公布2008／0182308中描述的那些，其以引用的方式并入本文。在一个实施例中，1-丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
-a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA的转化，其可被例如乙酰-CoA乙酰转移酶催化；
-b)乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酸-CoA的转化，其可被例如3-羟丁酸-CoA脱氢酶催化；
-c)3-羟丁酸-CoA至丁烯酰-CoA的转化，其可被例如巴豆酸酶催化；
-d)丁烯酰-CoA至丁酰-CoA的转化，其可被例如丁酰-CoA脱氢酶催化；
-e)丁酰-CoA至丁醛的转化，其可被例如丁醛脱氢酶催化；以及
-f)丁醛至1-丁醇的转化，其可被例如丁醇脱氢酶催化。
用于生产可使用的2-丁醇的生物合成途径包括在美国申请公布2007／0259410和美国申请公布2009／0155870中描述的那些，它们以引用的方式并入本文。在一个实施例中，2-丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
-a)丙酮酸至α-乙酰乳酸的转化，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
-b)α-乙酰乳酸至乙偶姻的转化，其可被例如乙酰乳酸脱羧酶催化；
-c)乙偶姻至3-氨基-2-丁醇的转化，其可被例如乙偶姻胺化酶催化；
-d)3-氨基-2-丁醇至3-氨基-2-丁醇磷酸的转化，其可被例如氨基丁醇激酶催化；
-e)3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮的转化，其可被例如氨基丁醇磷酸磷酸化酶催化；以及
-f)2-丁酮至2-丁醇，其可被例如丁醇脱氢酶催化。
在另一个实施例中，2-丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
-a)丙酮酸至α-乙酰乳酸的转化，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
-b)α-乙酰乳酸至乙偶姻的转化，其可被例如乙酰乳酸脱羧酶催化；
-c)乙偶姻至2，3-丁二醇的转化，其可被例如丁二醇脱氢酶催化；
-d)2，3-丁二醇至2-丁酮的转化，其可被例如二醇脱水酶催化；以及
-e)2-丁酮至2-丁醇，其可被例如丁醇脱氢酶催化。
用于原位产物移除的方法
本文所述的改善微生物和方法可与其它原位产物移除方法结合使用，例如在PCT申请公布WO2011／159998中描述的那些，该专利申请以引用方式并入本文。图1展示了按照本发明的实施例，用于生产产物醇如乙醇或丁醇的例子工艺流程图。如图所示，可将原料12引入液化容器10的入口并进行液化以产生原料浆液16。原料12包含提供可发酵的碳底物(例如，可发酵糖如葡萄糖)的可水解的多糖，并且可以是生物质，例如但不限于黑麦、小麦、甘蔗、或玉米，或者可来源于生物质。在一些实施例中，原料12可以是分级的生物质的一种或多种组分，在其他实施例中，原料12可以是磨碎的、未分级的生物质。在一些实施例中，原料12可以是玉米，例如干燥、磨碎、未分级的玉米粒，并且未溶解的颗粒可包括胚芽、纤维、和谷蛋白。不溶解固体是原料12的不可发酵部分。对于本文图示实施例讨论的目的，原料12将通常被描述为碾磨形成的未分级玉米，其中不液化固体尚未从中分离出来。然而，应当理解本文所述的示例性方法和体系可经修改用于不同的原料，无论其是否经过分级，这对本领域的技术人员来说是显而易见的。
液化原料12的方法涉及将原料12中的多糖水解成包括例如糊精和低聚糖在内的糖。可使用工业上通常利用的任何已知的液化方法以及相应的液化容器，包括但不限于酸方法、酸-酶方法、或酶方法。可单独或组合使用此类方法。在一些实施例中，可利用所述酶方法并且可将适用的酶14，例如α-淀粉酶，引入液化容器10的入口。也可将水引入液化容器10。在实施例中，糖化酶(例如，葡糖淀粉酶)也可被引入液化容器10。
由液化原料12制得的原料浆液16包含可发酵碳底物(例如糖)，以及任选地根椐原料包含油形式的甘油三酯和来源于原料的不溶解的固体。原料浆液16可从液化容器10的出口排出。在一些实施例中，原料12是玉米或玉米籽粒，并且因此原料浆液16是玉米醪浆液。在一些实施例中，原料12是木质纤维素原料，因此原料浆液16可以是木质纤维素水解产物。在一些实施例中，在将原料浆液16引入发酵容器之前从其中移除不溶解的固体。
将原料浆液16连同包含编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸的微生物一起引入发酵容器30，该脂肪酶活性根据本发明32提供。发酵容器30被配置为使浆液16发酵以产生醇。具体地，微生物32接触浆液16中的可发酵碳底物以产生产物醇。浆液可包括可发酵碳源，例如低聚糖形式的可发酵碳源，以及水。
在一些实施例中，浆液16被提供至糖化过程以将浆液16中复杂的糖类(例如，低聚糖)裂解为可被微生物32容易地代谢的单糖。工业上通常利用的任何已知的糖化方法均可被使用，包括但不限于酸方法、酸-酶方法、或酶方法。在一些实施例中，同步糖化和发酵(SSF)可如图1所示在发酵容器30内发生。在一些实施例中，可将酶38如葡糖淀粉酶引入发酵容器30中的入口以将淀粉或低聚糖裂解成能够被微生物32代谢的葡萄糖。
将羧酸28和／或包含甘油三酯26的天然油连同任选催化剂42一起引入发酵容器30。任选的催化剂42可在酶38之前、之后、或同时被引入。因此，在一些实施例中，酶38和任选的催化剂42的添加可为分步的(例如先加入催化剂42，然后加入酶38，或者相反地加入它们)或基本上同步的(即，恰好与人或机器一下添加花费的时间相同的时间，或者一种酶／催化剂紧接着其它催化剂／酶加入，其时间为人或机器两下添加花费的时间)。任选的催化剂42能够酯化产物醇与羧酸28以形成醇酯，并且在实施例中其为经纯化的脂肪酶。例如，就丁醇的生产而言，任选的催化剂42能够使丁醇与羧酸28酯化以形成丁酯。据信催化剂42任选地用于本文所述方法，因为重组微生物将表达并展示或分泌脂肪酶到发酵培养基中以催化酯化作用。然而，可能期望加入经纯化的脂肪酶(任选的催化剂42)并且本文提供的方法和微生物允许减少加入的任选催化剂42的量。
在将包含甘油三酯26的天然油补充到发酵容器30中的情况下，通过使油26与具有脂肪酶活性的多肽如本文提供的微生物分泌或展示的多肽和／或任选的催化剂42接触，油26中至少一部分酰基甘油酯可水解成羧酸28。在一些实施例中，所得到的酸／油组合物包括来自所述油中的酰基甘油酯的部分水解的甘油单酯和／或甘油二酯。在一些实施例中，所得到的酸／油组合物包括酰基甘油酯水解的副产物甘油。
此外，根椐原料，来源于原料12的油中并且存在于浆液16中的酰基甘油酯还可被水解为羧酸28。在一些实施例中，液体培养基中羧酸的浓度足以形成两相发酵混合物，其包含有机相和水相。
羧酸28可以是任何能够与产物醇(例如丁醇或乙醇)酯化以产生所述羧酸的醇酯的羧酸。例如，在一些实施例中，羧酸28可为游离脂肪酸，并且在一些实施例中，羧酸或游离脂肪酸具有4至28个碳的链长，在其它实施例中4至22个碳，在其它实施例中8至22个碳，在其它实施例中10至28个碳，在其它实施例中10至22个碳，在其它实施例中12至22个碳，在其它实施例中4至18个碳，在其它实施例中12至22个碳，并且在其它实施例中12至18个碳，并且在其它实施例中16至22个碳。在一些实施例中，羧酸28是一种或多种下列的脂肪酸：杜鹃花酸、癸酸、辛酸、蓖麻、椰子(即，作为天然存在的脂肪酸的组合，例如包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、辛酸、癸酸、硬脂酸、己酸、花生酸、油酸、和亚油酸)、异硬脂酸、月桂酸、亚麻籽、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油、棕榈酸、棕榈仁、壬酸、蓖麻油酸、癸二酸、大豆、硬脂酸、妥尔油、牛油、和#12羟基硬脂酸。在一些实施例中，羧酸28是一种或多种二酸，例如壬二酸和癸二酸。在一些实施例中，羧酸28是一种或多种饱和一元羧酸，具有限定的碳链支链，其中所述羧酸或它们的混合物通过氧化熟知的称为Guerbet醇的2-烷基-1-链烷醇进行制备，其中羧酸具有12至22个总碳原子数。
因此，在一些实施例中，羧酸28可以是两种或更多种不同脂肪酸的混合物。在一些实施例中，羧酸28包括来源于酰基甘油酯的水解的游离脂肪酸，所述水解通过本领域已知的任何方法进行，包括化学的或酶的水解。在一些实施例中，如上文所述，使用酶作为催化剂42，羧酸28可通过油的甘油酯的酶水解而来源于天然的油26。在一些实施例中，所述脂肪酸或它们的混合物包含不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸的存在降低熔点，提供处理方面的优点。不饱和脂肪酸中，那些单不饱和脂肪酸，即，具有单个碳-碳双键的脂肪酸，可提供相对于不进行适当加热的熔点和方法所考虑的氧化稳定性的优点。
在一些实施例中，天然的油26可以是牛油、玉米油、低芥酸菜子油、癸／辛酸的甘油三酯、蓖麻油、椰子油、棉籽油、鱼油、霍霍巴油、猪油、亚麻籽油、牛蹄油、奥蒂油、棕榈油、花生油、油菜籽油、稻米油、红花油、大豆油、向日葵油、桐树油、麻风树油、南瓜油、棕榈油、葡萄籽油、和植物油共混物(或可被纯化为较高浓度的不同链长和不饱和水平(即，18：1)的油)。在一些实施例中，天然的油26是两种或更多种天然的油的混合物，例如棕榈油和大豆油的混合物。在一些实施例中，天然的油26是植物来源的油。在一些实施例中，植物来源的油可来源于发酵过程中可利用的生物质，但这是不一定的。所述生物质可以是与原料12所得自的相同的或不同的来源。因此，例如，在一些实施例中，油26可来源于玉米，而原料12可以是甘蔗。例如，在一些实施例中，油26可来源于玉米，并且原料12的生物质来源也是玉米。就油26对原料12而言，不同生物质来源的任何可能的组合均可被使用，如对于本领域的技术人员应当显而易见的。在一些实施例中，油26来源于所述发酵过程中所使用的生物质。因此，在一些实施例中油26直接来源于原料12。例如，当原料12是玉米时，那么油26是原料的组分玉米油并且可与浆液16一起被引入发酵容器30中。
在发酵容器30中，由微生物32产生的醇与羧酸28被由微生物分泌的具有脂肪酶活性的多肽(以及任选地催化剂42)酯化以形成醇酯。例如，就丁醇生产的情况而言，使由微生物32产生的丁醇与羧酸28酯化以形成丁酯。原位产物移出(ISPR)可被用于将醇酯从发酵液体培养基中移出。利用表达并分泌或展示具有脂肪酶活性的多肽以形成酯的重组微生物结合ISPR能够改善发酵性能。不受理论的束缚，据信发酵培养基中的脂肪酶活性和在发酵期间产物醇的酯化作用可改善微生物生产产物醇的能力，该能力对于生产宿主细胞具有毒性的产物醇来说是尤其期望的。因此，本文通过工程化微生物以生产并分泌具有脂肪酶活性的多肽，提供了改善微生物对产物醇耐受性的方法。
在实施例中，与使用ISPR而不使用产生脂肪酶的微生物的类似发酵中的有效滴度相比，使用微生物产生脂肪酶以形成酯结合ISPR(例如，液-液提取)可使有效滴度提高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约100％。相似地，在实施例中，与使用ISPR而不使用产生脂肪酶的微生物的类似发酵中的有效速率相比，使用微生物产生脂肪酶以形成酯结合ISPR(例如，液-液提取)可使有效速率提高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约100％。在实施例中，有效收率提高了至少约10、至少约20％、至少约30％、至少约40％、或至少约50％。在一些实施例中，在醇的酯化作用之后得到的发酵液体培养基可包含游离的(即，未酯化的)醇，并且在一些实施例中，在醇的酯化作用之后的发酵液体培养基中的游离醇的浓度，当产物醇是丁醇时为不高于1、3、6、10、15、20、25、3025、40、45、50、55、或60g／L，或者当产物醇是乙醇时，在醇的酯化作用之后的发酵液体培养基中的游离醇的浓度为不高于15、20、25、3025、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100g／L。在一些实施例中，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，或至少约90％的有效滴度的醇被转化成醇酯。
在一些实施例中，发酵液体培养基在发酵过程中与提取剂接触以形成包括水相和有机相的两相混合物。可根据美国专利申请公布2009／0305370所述的方法进行此类液-液提取，其公开内容全文并入本文。美国专利申请公布2009／0305370描述了生产丁醇和采用液-液提取从发酵液体培养基中回收丁醇的方法，所述方法包括以下步骤：使发酵液体培养基与水不混溶的提取剂接触，以形成包含水相和有机相的两相混合物。通常，提取剂可以是选自饱和的、单不饱和的、多不饱和的(以及它们的混合物)C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺、以及它们的混合物的有机提取剂。提取剂还可为有机提取剂，其选自饱和的、单不饱和的、多不饱和的(以及它们的混合物)C4-C22脂肪醇、C4-C28脂肪酸、C4-C28脂肪酸酯、C4-C22脂肪醛、以及它们的混合物。合适提取剂的例子包括包含至少一种溶剂的提取剂，所述溶剂选自油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、十四烷基醇、硬脂醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、月桂醛、1-壬醇、1-癸醇、1-十一烷醇、2-十一烷醇、1-壬醛、2-丁基辛醇、2-丁基-辛酸以及它们的混合物。在实施例中，所述提取剂包含油醇。在实施例中，所述提取剂包含支链饱和醇，例如可以商品名
Figure BDA0000432348610000431
12(Sasol，Houston，TX)或Jarcol I-12(JarchemIndustries，Inc.，Newark，NJ)商购获得的2-丁基辛醇。在实施例中，所述提取剂包含支链羧酸，例如可分别以商品名12、
Figure BDA0000432348610000433
16知
Figure BDA0000432348610000434
24(Sasol，Houston，TX)商购获得的2-丁基辛酸、2-己基癸酸、或2-癸基十四酸。为了用于本文所述的方法，用于ISPR的提取剂通常是非醇的提取剂以便避免通过羧酸28与醇提取剂的催化酯化消耗发酵容器30中的羧酸28(那样较少的羧酸将可供用于与产物醇的酯化作用。例如，如果油醇用作ISPR提取剂，那么由于存在脂肪酶活性，油醇的羧酸酯可在发酵容器中产生。
按照图1的实施例，羧酸28也可作为ISPR提取剂28或其组分。如先前所指出的，羧酸28可被提供、和／或在天然的油26被提供至发酵容器30的情况下原位形成、和／或在原料16包括可被水解的油形式甘油三酯的情况下原位形成。在一些实施例中，ISPR提取剂28包括游离脂肪酸。在一些实施例中，ISPR提取剂28包括玉米油脂肪酸(COFA)。在一些实施例中，油26是玉米油，从而ISPR提取剂28是COFA。ISPR提取剂(脂肪酸)28与发酵液体培养基接触并形成包括水相34和有机相的两相混合物。在发酵液体培养基中形成的产物醇酯优先分配至有机相中，形成包含酯的有机相36。发酵液体培养基中任何游离的产物醇也优先分配到包含酯的有机相中。所述两相混合物可作为流39被移出发酵容器30并被引入容器35中，包含酯的有机相36在其中与有机相34分离。两相混合物39分离为包含酯的有机相36和水相34可使用本领域中已知的任何方法实现，包括但不限于虹吸、送气、滗析、离心、使用重力沉降槽、膜辅助的相分裂等。水相34的全部或部分可作为发酵培养基被循环至发酵容器30(如图所示)，或被废弃并被新鲜培养基替换，或被处理以移除任何残余的产物醇然后循环至发酵容器30。
根据图1，包含酯的有机相36被引入容器50中，醇酯在其中与一种或多种底物52反应以回收产物醇54。可使用在本领域中已知的和／或在以引用方式并入的PCT申请公布WO2011／159998中描述的任何方法回收产物醇54，从而从醇酯中获取醇。
实例
如本文所用，使用的缩写含义如下：“L”指升，“mL”指毫升，“μL”指微升。
一般方法
在水相和提取剂相中的反应产物的GC分析
样品(大约5.0g)从搅拌后的包含玉米油脂肪酸(COFA)作为提取剂的反应混合物或发酵液体培养基中移出，并且进行离心以分离水相和提取剂相。所得水相或提取剂相的样品(大约0.50g，记录实际重量)溶解在4.50mL5.5556mg／mL十五烷酸甲酯(C15：0FAME，外标)在异丙醇中的溶液中。离心所得溶液以除去任何悬浮固体，然后将大约1.25mL所得上清液加到2.0mL Agilent GC样品小瓶中，并且小瓶用PTFE膜封端。在配有7683B进样器和自动取样机的Agilent6890GC上分析样品的异丁醇或脂肪酸脂肪酸丁酯。柱是Agilent DB-FFAP柱(30m×0.25mm ID，0.25um膜)。载气为氦气，流速为1.8mL／分钟，在80℃用恒定顶部压力测量；250℃的进样器分流为20：1；炉温为80℃2.0分钟，以10℃／分钟从80℃至250℃，然后是250℃20分钟。火焰离子化检测器在250℃使用。使用以下GC标准物(Nu-Chek Prep；Elysian，MN)确认脂肪酸异丁酯产物同一性：异丁基棕榈酸酯、异硬脂酸丁酯、异油酸丁酯、异丁基亚油酸酯、异丁基亚麻酸酯、异丁基花生酸酯。
菌株的构建
表7：
实例中使用的菌株基因型
Figure BDA0000432348610000461
表8：
实例中使用的构建体的特征信息
Figure BDA0000432348610000462
Figure BDA0000432348610000471
Figure BDA0000432348610000481
PNY1500的构建
所述菌株BP857(“PNY1500”)来源于CEN.PK113-7D(CBS8340；Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)Fungal BiodiversityCentre，Netherlands)并包含下列基因的缺失：URA3、HIS3。
URA3缺失
为删除内源URA3编码区，ura3：：loxP-kanMX-loxP盒通过PCR扩增自pLA54模板DNA(SEQ ID NO：25)。pLA54包含乳酸克鲁维酵母(K.lactis)TEF1启动子和kanMX标记，并且侧接loxP位点，以允许Cre重组酶参与重组并去除标记。使用Phusion DNA聚合酶(New EnglandBioLabs；Ipswich，MA)和引物BK505与BK506(SEQ ID NO：26和27)进行PCR。每种引物的URA3部分来源于URA3启动子上游5’区，和编码区下游3’区，使得loxP-kanMX-loxP标记的整合导致URA3编码区的替换。使用标准的遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201—202页)将所述PCR产物转化到CEN.PK113-7D中，并且于30℃在包含G418(100μg／mL)的YPD上对转化子进行选择。筛选的转化子的正确整合通过PCR来验证，使用引物LA468和LA492(SEQ ID NO：28和29)，并命名为CEN.PK113-7DΔura3：：kanMX。
HIS3缺失
用于无痕HIS3缺失的PCR盒的四个片段的扩增使用Phusion HighFidelity PCR Master Mix(New England BioLabs)并以CEN.PK113-7D基因组DNA为模板，所述基因组DNA用Gentra Puregene Yeast／Bact试剂盒(Qiagen；Valencia，CA)制备。HIS3片段A的扩增使用引物oBP452(SEQID NO：30)和引物oBP453(SEQ ID NO：31)，其包含与HIS3片段B的5′端同源的5′尾。HIS3片段B的扩增使用引物oBP454(SEQ ID NO：32)，其包含与HIS3片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP455(SEQ ID NO：33)，其包含与HIS3片段U的5′端同源的5′尾。HIS3片段U的扩增使用引物oBP456(SEQ ID NO：34)，其包含与HIS3片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP457(SEQ ID NO：35)，其包含与HIS3片段C的5′端同源的5′尾。HIS3片段C的扩增使用引物oBP458(SEQ ID NO：36)，其包含与HIS3片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP459(SEQ ID NO：37)。用PCR Purification试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。HIS3片段AB通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段A和HIS3片段B并用引物oBP452(SEQ IDNO：30)和oBP455(SEQ ID NO：33)扩增。HIS3片段UC通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段U和HIS3片段C并用引物oBP456(SEQ ID NO：34)和oBP459(SEQ ID NO：37)扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction试剂盒(Qiagen)纯化。HIS3ABUC盒通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段AB和HIS3片段UC并用引物oBP452(SEQ ID NO：30)和oBP459(SEQ ID NO：37)扩增。用PCR Purification试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。
制备CEN.PK113—7DΔura3：：kanMX的感受态细胞，并用HIS3ABUCPCR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒(ZymoResearch；Orange，CA)。将转化混合物在30℃下涂布到缺乏尿嘧啶并补充了2％的葡萄糖的合成完全培养基上。具有his3敲除的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP460(SEQ ID NO：38)和oBP461(SEQ ID NO：39)，使用由Gentra Puregene Yeast／Bact试剂盒(Qiagen)制备的基因组DNA。正确的转化子选择为菌株CEN.PK113—7DΔura3：：kanMXΔhis3:：URA3。
从Δura3位点移除KanMX标记以及从Δhis3位点移除URA3标记
所述KanMX标记通过用pRS423：：PGAL1-cre(SEQ ID NO：40)转化CEN.PK113-7DΔura3：：kanMXΔhis3：：URA3而去除，使用Frozen-EZ YeastTransformation II试剂盒(Zymo Research)并在30℃涂布到缺乏组氨酸和尿嘧啶并补充了2％的葡萄糖的合成完全培养基上。转化子于30℃在补充了1％的半乳糖的YP上生长～6小时以诱导Cre重组酶和KanMX标记的切除，并在30℃涂布到YPD(2％葡萄糖)平板上以复苏。分离物过夜生长在YPD中并在30℃涂布到包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的分离物。使抗5-氟-乳清酸的分离物生长并涂布到YPD中以去除pRS423：:PGAL1-cre质粒。检测分离物中KanMX标记和URA3标记的丢失，并通过在YPD+G418平板、缺乏尿嘧啶的合成完全培养基平板、和缺乏组氨酸的合成完全培养基平板的生长检测，检测pRS423：：PGAL1-cre质粒的丢失。对G418敏感并为尿嘧啶和组氨酸营养缺陷性的正确的分离物被选为菌株CEN.PK113—7DΔura3：：loxPΔhis3并命名为BP857。所述缺失和标记移除通过PCR和测序确认，所用引物为oBP450(SEQ ID NO：41)和oBP451(SEQ ID NO：42)用于Δura3，以及引物oBP460(SEQ ID NO：38)和oBP461(SEQ ID NO：39)用于Δhis3，使用由Gentra Puregene Yeast／Bact试剂盒(Qiagen)制备的基因组DNA。
菌株PNY2205的构建
PDC6缺失
用于无痕PDC6缺失的PCR盒的四个片段的扩增使用Phusion HighFidelity PCR Master Mix(New England BioLabs)并以CEN.PK113—7D基因组DNA为模板，所述基因组DNA用Gentra Puregene Yeast／Bact试剂盒(Qiagen)制备。PDC6片段A的扩增使用引物oBP440(SEQ ID NO：18)和引物oBP441(SEQ ID NO：19)，其包含与PDC6片段B的5′端同源的5′尾。PDC6片段B的扩增使用引物oBP442(SEQ ID NO：20)，其包含与PDC6片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP443(SEQ ID NO：21)，其包含与PDC6片段U的5′端同源的5′尾。PDC6片段U的扩增使用引物oBP444(SEQ ID NO：22)，其包含与PDC6片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP445(SEQ ID NO：23)，其包含与PDC6片段C的5′端同源的5′尾。PDC6片段C的扩增使用引物oBP446(SEQ ID NO：24)，其包含与PDC6片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP447(SEQ ID NO：56)。用PCR Purification试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。PDC6片段AB通过重叠PCR生成，通过混合PDC6片段A和PDC6片段B并用引物oBP440(SEQID NO：18)和oBP443(SEQ ID NO：21)扩增。PDC6片段UC通过重叠PCR生成，通过混合PDC6片段U和PDC6片段C并用引物oBP444(SEQID NO：22)和oBP447(SEQ ID NO：56)扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction试剂盒(Qiagen)纯化。所述PDC6ABUC盒通过重叠PCR生成，通过混合PDC6片段AB和PDC6片段UC并用引物oBP440(SEQ ID NO：18)和oBP447(SEQ ID NO：56)扩增。用PCR Purification试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。
制备CEN.PK113—7DΔura3：：loxPΔhis3的感受态细胞，并用PDC6ABUC PCR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒(ZymoResearch)。将转化混合物在30℃下涂布到缺乏尿嘧啶并补充了2％的葡萄糖的合成完全培养基上。带有pdc6敲除的转化子通过PCR进行筛选，所用引物为oBP448(SEQ ID NO：57)和oBP449(SEQ ID NO：58)，使用由Gentra Puregene Yeast／Bact试剂盒(Qiagen)制备的基因组DNA。正确的转化子被选为菌株CEN.PK113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6：：URA3。
CEN.PK113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6：：URA3过夜生长在YPD中并在30℃涂布到包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的分离物。所述缺失和标记移除通过PCR和测序确认，所用引物为oBP448(SEQ ID NO：57)和oBP449(SEQ ID NO：58)，使用由Gentra Puregene Yeast／Bact试剂盒(Qiagen)制备的基因组DNA。来自分离物的PDC6基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，所用PDC6的编码区的特异性引物为oBP554(SEQ ID NO：59)和oBP555(SEQ ID NO：60)。正确的分离物被选为菌株CEN.PK113—7DΔura3：:loxPΔhis3Δpdc6并被命名为BP891。
PDC1缺失ilvDSm整合
所述PDC1基因被删除并被ilvD替换，其编码区来自变异链球菌(Streptococcus mutans)ATCC700610。所述A片段接着来自变异链球菌(Streptococcus mutans)的ilvD编码区，对于用于PDC1缺失-ilvDSm整合的PCR盒，使用Phusion High Fidelity PCR Master Mix(New EnglandBioLabs)进行扩增并用NYLA83基因组DNA作为模板，所述基因组DNA用Gentra Puregene Yeast／Bact试剂盒(Qiagen)制备。NYLA83是美国专利申请公布2009／0305363(该专利全文以引用方式并入本文)中描述的携带着PDC1缺失-ilvDSm整合的菌株(构建描述于美国专利申请公布20110124060中，该专利全文以引用方式并入本文)。PDC1片段A—ilvDSm的扩增使用引物oBP513(SEQ ID NO：61)和引物oBP515(SEQ ID NO：62)，其包含与PDC1片段B的5′端同源的5′尾。所述用于PDC1缺失-ilvDSm整合的PCR盒的片段B、U和C使用Phusion High Fidelity PCRMaster Mix(New England BioLabs)进行扩增并用CEN.PK113—7D基因组DNA作为模板，所述基因组DNA用Gentra Puregene Yeast／Bact试剂盒(Qiagen)制备。PDC1片段B的扩增使用引物oBP516(SEQ ID NO：63)，其包含与PDC1片段A—ilvDSm的3′端同源的5′尾，和引物oBP517(SEQ ID NO：64)，其包含与PDC1片段U的5′端同源的5′尾。PDC1片段U的扩增使用引物oBP518(SEQ ID NO：65)，其包含与PDC1片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP519(SEQ ID NO：66)，其包含与PDC1片段C的5′端同源的5′尾。PDC1片段C的扩增使用引物oBP520(SEQ ID NO：67)，其包含与PDC1片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP521(SEQ IDNO：68)。用PCR Purification试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。PDC1片段A-ilvDSm-B通过重叠PCR生成，通过混合PDC1片段A-ilvDSm(SEQ IDNO：171)和PDC1片段B并使用引物oBP513(SEQ ID NO：61)和oBP517(SEQ ID NO：64)扩增。PDC1片段UC通过重叠PCR生成，通过混合PDC1片段U和PDC1片段C并用引物oBP518(SEQ ID NO：65)和oBP521(SEQ ID NO：68)扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction试剂盒(Qiagen)纯化。所述PDC1A—ilvDSm-BUC盒(SEQ ID NO：172)通过重叠PCR生成，通过混合PDC1片段A—ilvDSm-B和PDC1片段UC并使用引物oBP513(SEQ ID NO：61)和oBP521(SEQID NO：68)扩增。用PCR Purification试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。
制备CEN.PK113—7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6的感受态细胞，并用PDC1A—ilvDSm-BUC PCR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒(Zymo Research)。将转化混合物在30℃下涂布到缺乏尿嘧啶并补充了2％的葡萄糖的合成完全培养基上。具有pdc1敲除-ilvDSm整合的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP511(SEQ ID NO：69)和oBP512(SEQ ID NO：70)，使用由Gentra Puregene Yeast／Bact试剂盒(Qiagen)制备的基因组DNA。来自分离物的PDC1基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，所用的PDC1编码区的特异性引物为oBP550(SEQ ID NO：71)和oBP551(SEQ ID NO：72)。正确的转化子被选为菌株CEN.PK113—7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSm—URA3。
CEN.PK113—7DΔura3：:loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSm—URA3过夜生长在YPD中并在30℃涂布到包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。所述PDC1的缺失、ilvDSm的整合以及标记的移除通过PCR和测序来确认，所用引物为oBP511(SEQ ID NO：69)和oBP512(SEQ ID NO：70)，使用由Gentra PuregeneYeast／Bact试剂盒(Qiagen)制备的基因组DNA。正确的分离物被选为菌株CEN.PK113—7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSm并命名为BP907。
PDC5缺失sadB整合
所述PDC5基因被删除并被sadB编码区替换，所述编码区来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)(sadB基因在美国专利申请2009／0269823中有所描述，该文献全文以引用方式并入本文)。对于PDC5缺失-sadB整合的PCR盒的一个片段首先克隆到质粒pUC19-URA3MCS中。
pUC19-URA3MCS是基于pUC19(SEQ ID NO：94)的并包含处于多克隆位点(MCS)内的URA3基因的序列，该基因来自啤酒糖酵母(S.cerevisiae)。pUC19包含pMB1复制子和一个编码β-内酰胺酶的基因，该基因负责在大肠杆菌中的复制与选择。除URA3的编码序列外，该基因的上游至下游序列都被包括用于在酵母中表达URA3。所述载体能用于克隆的目的，并且能用做酵母整合载体。
所述DNA涵盖了URA3编码区，连同URA3编码区上游250bp和下游150bp，所述序列来自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEN.PK113-7D基因组DNA，其扩增使用引物oBP438(SEQ ID NO：89)，其包含BamHI、AscI、PmeI、和FseI限制性位点，和oBP439(SEQ ID NO：90)，其包含XbaI、PacI、和NotI限制性位点，使用Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix(New England BioLabs)。基因组DNA使用Gentra PuregeneYeast／Bact试剂盒(Qiagen)来制备。所述PCR产物和pUC19经BamHI和XbaI消化后，用T4DNA连接酶连接生成载体pUC19-URA3MCS。所述载体通过PCR和测序确认，所用引物为oBP264(SEQ ID NO：91)和oBP265(SEQ ID NO：92)。
所述sadB编码序列和PDC5片段B克隆到pUC19-URA3MCS生成PDC5A-sadB—BUC PCR盒的sadB—BU部分。所述sadB编码序列扩增以pLH468-sadB(SEQ ID NO：93)作为模板，使用引物oBP530(SEQ ID NO：73)，其包含AscI限制性位点，和引物oBP531(SEQ ID NO：74)，其包含与PDC5片段B的5′端同源的5′尾。PDC5片段B的扩增使用引物oBP532(SEQ ID NO：75)，其包含与sadB的3′端同源性的5′尾，和引物oBP533(SEQ ID NO：76)，其包含Pmel限制性位点。用PCR Purification试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。sadB-PDC5片段B通过重叠PCR生成，通过混合sadB片段U和PDC5片段B并用引物oBP530(SEQ ID NO：73)和oBP533(SEQ ID NO：76)扩增。在用合适的酶消化后，所得PCR产物经AscI和PmeI消化用T4DNA连接酶连接到pUC19-URA3MCS对应的位点上。所得质粒用作模板以扩增sadB-片段B-片段U，所用引物为oBP536(SEQ ID NO：77)和oBP546(SEQ ID NO：78)，其包含与PDC5片段C的5′端同源的5′尾。PDC5片段C的扩增使用引物oBP547(SEQ ID NO：79)，其包含与PDC5sadB-片段B-片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP539(SEQ ID NO：80)。用PCR Purification试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。PDC5sadB-片段B-片段U-片段C通过重叠PCR生成，通过混合PDC5sadB-片段B-片段U和PDC5片段C并用引物oBP536(SEQ ID NO：77)和oBP539(SEQ ID NO：80)扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上纯化接着使用Gel Extraction试剂盒(Qiagen)。PDC5A-sadB-BUC盒(SEQID NO：173)通过扩增PDC5sadB-片段B-片段U-片段C生成，所用引物为oBP542(SEQ ID NO：81)，其包含与天然的PDC5编码序列上游紧接的50个核苷酸同源的5′尾，和oBP539(SEQ ID NO：80)。用PCR Purification试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。
制备CEN.PK113—7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1:：ilvDSm的感受态细胞，并用PDC5A-sadB—BUC PCR盒转化，使用Frozen-EZ YeastTrahsformation II试剂盒(Zymo Research)。将转化混合物在30℃下涂布到缺乏尿嘧啶并补充了1％的乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上。具有pdc5敲除sadB整合的转化子通过PCR进行筛选，所用引物为oBP540(SEQ ID NO：82)和oBP541(SEQ ID NO：83)，使用由Gentra PuregeneYeast／Bact试剂盒(Qiagen)制备的基因组DNA。来自分离物的PDC5基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，所用的PDC5编码区的特异性引物为oBP552(SEQ ID NO：84)和oBP553(SEQ ID NO：85)。正确的转化子被选为菌株CEN.PK113—7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSmΔpdc5：：sadB—URA3。
CEN.PK113—7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：:ilvDSmΔpdc5：：sadB—URA3过夜生长在YPE(0.1％乙醇)中并在30℃涂布到补充了乙醇(无葡萄糖)并包含包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的分离物。所述PDC5缺失、sadB整合以及标记移除是通过PCR确认的，所用引物为oBP540(SEQ ID NO：82)和oBP541(SEQ IDNO：83)，使用由Gentra Puregene Yeast／Bact试剂盒(Qiagen)制备的基因组DNA。所述正确的分离物被选为菌株CEN.PK113—7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSmΔpdc5：：sadB并命名为BP913。
GPD2缺失
为删除内源的GPD2编码区，gpd2：：loxP—URA3-loxP盒(SEQ ID NO：174)进行PCR扩增，使用loxP—URA3-loxP PCR作为模板DNA。loxP—URA3-loxP(SEQ ID NO：170)包含侧接loxP重组酶位点的来自pRS426的URA3标记。PCR使用Phusion DNA聚合酶以及引物LA512(SEQ ID NO：95)和LA513(SEQ ID NO：96)。每种引物的GPD2部分来源于GPD2编码区上游5’区和编码区下游3’区，使得loxP—URA3-loxP标记的整合导致GPD2编码区的替换。将PCR产物转化到BP913并且转化子在缺乏尿嘧啶且补充了1％的乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上筛选。通过PCR筛选了转化子以验证正确的整合，所用引物为oBP582(SEQ ID：86)和AA270(SEQ ID NO：87)。
所述URA3标记的循环是通过转化pRS423：：PGAL1-cre并在30℃涂布到缺乏组氨酸且补充了1％的乙醇的合成完全培养基上。在补充1％的乙醇并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，转化子是有条斑纹状的，并且在30℃孵育以选择已经失去了URA3标记的转化子的分离物。抗5-氟-乳清酸的分离物生长在YPE(1％乙醇)上以移除pRS423：：PGAL1-cre质粒。所述缺失和标记移除通过PCR确认，所用引物为oBP582(SEQ IDNO：86)和oBP591(SEQ ID NO：88)。正确的分离物被选为菌株CEN.PK113—7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSmΔpdc5：：sadBΔgpd2：：loxP并命名为PNY1503(BP1064)。
FRA2缺失
FRA2缺失被设计为从编码序列3’端删除250个核苷酸，保留FRA2编码序列的最初113个核苷酸不动。一个阅读框终止密码子出现在去除下游7个核苷酸的位置。用于无痕FRA2缺失的PCR盒的四个片段的扩增使用Phusion High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabs)并以CEN.PK113-7D基因组DNA为模板，所述基因组DNA用Gentra Puregene Yeast／Bact试剂盒(Qiagen)制备。FRA2片段A的扩增使用引物oBP594(SEQ ID NO：99)和引物oBP595(SEQ ID NO：102)，其包含与FRA2片段B的5′端同源的5′尾。FRA2片段B的扩增使用引物oBP596(SEQ ID NO：103)，其包含与FRA2片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP597(SEQ ID NO：104)，其包含与FRA2片段U的5′端同源的5′尾。FRA2片段U的扩增使用引物oBP598(SEQ ID NO：105)，其包含与FRA2片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP599(SEQ ID NO：106)，其包含与FRA2片段C的5′端同源的5′尾。FRA2片段C的扩增使用引物oBP600(SEQ ID NO：107)，其包含与FRA2片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP601(SEQ ID NO：108)。用PCR Purification试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。FRA2片段AB是通过重叠PCR生成的，通过混合FRA2片段A和FRA2片段B并用引物oBP594(SEQ ID NO：99)和oBP597(SEQ ID NO：104)扩增。FR42片段UC是通过重叠PCR生成的，通过混合FRA2片段U和FRA2片段C并用引物oBP598(SEQ ID NO：105)和oBP601(SEQ ID NO：108)扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction试剂盒(Qiagen)纯化。所述FRA2ABUC盒是通过重叠PCR生成的，通过混合FRA2片段AB和FRA2片段UC并用引物oBP594(SEQ ID NO：99)和oBP601(SEQID NO：108)扩增。用PCR Purification试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。
制备PNY1503的感受态细胞并用FRA2ABUC PCR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒(Zymo Research)。将转化混合物在30℃下涂布到缺乏尿嘧啶并补充了1％的乙醇的合成完全培养基上。带有fra2敲除的转化子通过PCR筛选，使用引物为oBP602(SEQ ID NO：109)和oBP603(SEQ ID NO：110)，使用由Gentra Puregene Yeast／Bact试剂盒(Qiagen)制备的基因组DNA。使正确的转化子在YPE(酵母提取物、蛋白质胨、1％乙醇)中生长，并在30℃涂布到包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上以选择失去URA3标记的分离物。通过PCR确认缺失和标记移除，所述PCR用引物oBP602(SEQ ID NO：109)和oBP603(SEQID NO：110)，使用由Gentra Puregene Yeast／Bact试剂盒(Qiagen)制备的基因组DNA。来自分离物的FRA2基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，使用FRA2编码区特异性的引物，oBP605(SEQ ID NO：111)和oBP606(SEQ ID NO：112)。所述正确的分离物被选择为菌株CEN.PK113—7DMATa ura3Δ：：loxP his3Δpdc6Δpdc1Δ：：P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1tpdc5Δ：：P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5t gpd2Δ：：loxP fra2Δ并命名为PNY1505(BP1135)。
ADH1的缺失和kivDLl(y)的整合
ADH1基因被删除，并被来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的kivD编码区替换，所述kivD编码区是针对在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中的表达经过密码子优化的。将ADH1缺失-kivD_Ll(y)整合无痕盒首先克隆进质粒pUC19-URA3MCS中。
来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的经密码子优化以在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中表达的kivD编码区使用pLH468(SEQ ID NO：129)作为模板，使用引物oBP562(SEQ ID NO：113)，其包含PmeI限制性位点，和引物oBP563(SEQ ID NO：114)，其包含与ADH1片段B的5′端同源的5′尾。ADH1片段B扩增自基因组DNA，如上所述制备，所用引物为oBP564(SEQ ID NO：115)，其包含与kivD_Ll(y)的3’端同源的5’尾，和引物oBP565(SEQ ID NO：116)，其包含FseI限制性位点。用PCR Purification试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。kivD_Ll(y)—ADH1片段B通过重叠PCR生成，通过混合kivD_Ll(y)和ADH1片段B PCR产物并用引物oBP562(SEQ ID NO：113)和oBP565(SEQ ID NO：116)扩增。所得到的PCR产物用PmeI和FseI消化，用T4DNA连接酶连到用适合的酶消化过的pUC19-URA3MCS的对应的位点上。ADH1片段A扩增自基因组DNA，所用引物为oBP505(SEQ ID NO：117)，其包含SacI限制性位点，和引物oBP506(SEQ ID NO：118)，其包含AscI限制性位点。用SacI和AscI消化ADH1片段A PCR产物，并用T4DNA连接酶连接进包含kivD_Ll(y)-ADH1片段B的质粒的相应位点。ADH1片段C扩增自基因组DNA，所用引物为oBP507(SEQ ID NO：119)，其包含PacI限制性位点，和引物oBP508(SEQ ID NO：120)，其包含SalI限制性位点。用PacI和SalI消化ADH1片段C PCR产物，并用T4DNA连接酶连接至包含ADH1片段A-kivD_Ll(y)-ADH1片段B的质粒的相应位点。从载体pRS316-UAS(PGK1)-PFBA1-GUS(SEQ ID NO：130)扩增混合启动子UAS(PGK1)-PFBA1，扩增使用引物oBP674(SEQ ID NO：121)，其包含AscI限制性位点，和引物oBP675(SEQ ID NO：122)，其包含Pmel限制性位点。用PacI和SalI消化UAS(PGK1)-PFBA1PCR产物，并用T4DNA连接酶连接至包含kivD_Ll(y)-ADH1片段ABC的质粒的相应位点。从所得到的质粒扩增了整个整合盒并用PCR Purification试剂盒(Qiagen)进行了纯化，扩增使用引物oBP505(SEQ ID NO：117)和oBP508(SEQ ID NO：120)。
制备了PNY1505的感受态细胞，并使用Frozen-EZ YeastTransformation II试剂盒(Zymo Research)，用以上构建的ADH1-kivD_Ll(y)PCR盒转化了感受态细胞。将转化混合物在30℃下涂布到缺乏尿嘧啶并补充了1％的乙醇的合成完全培养基上。使转化子在YPE(1％乙醇)中生长并且被涂布到合成完全培养基上，所述培养基包含5-氟-乳清酸(0.1％)，在30℃选择丢失URA3标记的分离物。ADH1的缺失和kivD_Ll(y)的整合通过PCR来确认，所用外部引物为oBP495(SEQ ID NO：123)和oBP496(SEQ ID NO：124)，以及使用了kivD_Ll(y)特异性引物oBP562(SEQ ID NO：113)和外部引物oBP496(SEQ ID NO：124)，使用由Gentra Puregene Yeast／Bact试剂盒(Qiagen)制备的基因组DNA。正确的分离物被选择为菌株CEN.PK113—7D MATa ura3Δ：：loxP his3Δpdc6Δpdc1Δ：：P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1tpdc5Δ：：P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5tgpd2Δ：：loxP fra2Δadh1Δ：：UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_Ll(y)-ADH1t，并被命名为PNY1507(BP1201)。
整合载体pUC19-kan：：pdc1：：FBA—alsS：：TRX1的构建
FBA—alsS—CYCt盒通过从pRS426：：GPD：：alsS：：CYC(如美国专利7,851,188所述，该文献全文以引用方式并入本文)中将1.7kb BbvCI／PacI片段移到pRS426：：FBA：：ILV5::CYC(如美国专利7,851,188所述，该文献全文以引用方式并入本文)中进行构建，其之前已经用BbvCI／PacI进行了消化以释放ILV5基因。连接反应被转化至大肠杆菌(E.coli)TOP10细胞，并通过PCR筛选了转化子，所用的引物为N98SeqF1(SEQ ID NO：125)和N99SeqR2(SEQ ID NO：126)。用BglII和NotI从所述载体分离了FBA-alsS—CYCt盒，用于克隆进AflII位点的pUC19-URA3：：ilvD-TRX1(Klenow片段被用于制备适合连接的末端)。获得了包含以全部两种取向位于所述载体中的alsS盒的转化子，并通过PCR加以确认，所使用的引物对于构造“A”而言是N98SeqF4(SEQ ID NO：127)和N1111(SEQ ID NO：128)，对于构造“B”而言是N98SeqF4(SEQ ID NO：127)和N1110(SEQ ID NO：153)。然后，通过移除URA3基因(1.2kb NotI／NaeI片段)和添加遗传霉素盒，制备了“A”构造载体的遗传霉素选择性版本。Klenow片段被用于制备全部的适合用于连接的末端，并通过PCR筛选了转化子以选择以与之前的URA3标记相同的取向具有遗传霉素抗性基因的克隆，所用的引物为BK468(SEQ ID NO：131)和N160SeqF5(SEQ ID NO：154)。所得到的克隆被称为pUC19-kan：：pdc1：：FBA—alsS：：TRX1(克隆A)(SEQ ID NO：155)。
alsS整合菌株的构建
用PmeI使上文所述的pUC19-kan：：pdc1：：FBA—alsS整合载体线性化，并转入了PNY1507。PmeI在克隆的pdc1-TRX1基因间区域内内切载体并因此导致在该位点的靶向整合(Rodney Rothstein，Methods in Enzymology，1991，第194卷，第281—301页)。在添加了50μg／ml G418的YPE上选择了转化子。通过PCR，就整合事件对形成斑片的转化子进行了筛选，所用的引物为N160SeqF5(SEQ ID NO：154)和oBP512(SEQ ID NO：70)。通过评估菌株制造异丁醇的能力，针对乙酰乳酸合酶功能对两个转化子进行了间接测试。为了进行该测试，在大肠杆菌-酵母穿梭载体(pYZ090ΔalsS和pBP915；分别是SEQ ID NO：43和44)上提供了附加的异丁醇途径基因。一个克隆称为PNY2205。不含质粒的亲本菌株被命名为PNY2204(MATaura3Δ：：loxP his3Δpdc6Δpdc1Δ：：P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t-pUC19-loxP—kanMX-loxP—P[FBA1]-ALS|alsS_Bs—CYC1t pdc5Δ::P[PDC5]-ADH|sadB_Ax—PDC5t gpd2Δ：：loxP fra2Δadh1Δ：：UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_Ll(y)-ADH1t)。
菌株PNY2211的构建
以多步骤从啤酒糖酵母(S.cerevisiae)菌株PNY1507中构建PNY2211，如下列段落所述。首先所述菌株经修饰以包含磷酸酮(醇)酶基因。接下来，使用靶向邻近磷酸酮(醇)酶基因的整合载体将乙酰乳酸合酶基因(alsS)加到菌株中。最后，使用同源重组除去磷酸酮(醇)酶基因和整合载体序列，导致alsS无痕插入到在pdc1Δ：：ilvD和染色体XII的原生TRX1基因之间的基因间区域。所得基因型PNY2211是MATa ura3Δ：：loxPhis3Δpdc6Δpdc1Δ：：P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t-P[FBA1]-ALS|alsS_Bs—CYC1t pdc5Δ：：P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5t gpd2Δ：：loxP fra2Δadh1Δ：：UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_Ll(y)-ADHlt。
通过同源重组将磷酸酮(醇)酶基因盒导入PNY1507中。如下生成整合构建体。质粒pRS423：：CUP1-alsS+FBA-budA(之前在US2009／0305363中有所描述，该文献全文以引用方式并入本文)用NotI和XmaI消化以去除1.8kb的FBA-budA序列，并且在用Klenow片段处理后再连接载体。接下来，用TEF1启动子变体替换CUP1启动子变体(M4变体，如之前由Nevoigt等人，Appl.Environ.Microbiol.72：5266—5273(2006)所述的变体，该文献全文以引用方式并入本文)，该替换经由来自DNA2.0(MenloPark，CA)的DNA合成和载体构建服务完成。所得质粒pRS423：：TEF(M4)-alsS用StuI和MluI酶切(除去包含部分alsS基因和CYC1终止子的1.6kb的部分)，然后与4kb的PCR产物混合，所述PCR产物从pRS426：：GPD-xpk1+ADH-eutD(SEQ ID NO：175)中用引物N1176(SEQID NO：164)和N1177(SEQ ID NO：165)生成，以及与0.8kb的PCR产物DNA混合，所述PCR产物从酵母基因组DNA(ENO1启动子区域)中使用引物N822(SEQ ID NO：160)和N1178(SEQ ID NO：166)生成，并使用缺口修复克隆方法被转化到啤酒糖酵母(S.cerevisiae)菌株BY4741(ATCC#201388)中，参见Ma等人，Gene58：201—216(1987)。通过将细胞涂布到无组氨酸的合成完全培养基上获得转化子。正确装配的期望质粒(pRS423：:TEF1(M4)-xpk1+ENO1-eutD，SEQ ID NO：156)通过使用PCR引物N821和N1115(分别是SEQ ID NO：159和163)并通过限制性消化(BgII)进行确认。随后对两个克隆测序。通过用SacI和NotI消化分离3.1kb的TEF(M4)-xpk1基因并将其克隆到pUC19-URA3：：ilvD-TRX1载体中(Clone A，用AflII切除)。克隆片段用Klenow片段处理以生成平末端用于连接。将连接反应产物转化到大肠杆菌Stbl3细胞中，选择氨苄青霉素抗性。TEF1(M4)-xpk1的插入通过PCR(引物N1110(SEQID NO：153)和N1114(SEQ ID NO：162))确认。所述载体用线性化AflII并用Klenow片段处理。在WO2011159853A1(以引用的方式并入本文)中描述的1.8kb KpnI—HincII遗传霉素抗性盒通过在用Klenow片段处理后连接进行克隆。将连接反应产物转化到大肠杆菌Stbl3细胞中，选择氨苄青霉素抗性。遗传霉素盒的插入通过PCR(引物N160SeqF5(SEQ ID NO：154)和BK468(SEQ ID NO：131))确认。本文提供了质粒序列(pUC19-URA3：：pdc1：：TEF(M4)-xpk1：：kan，SEQ ID NO：157)。
分离所得整合盒(pdc1：：TEF1(M4)-xpk1：：KanMX：：TRX1)(AscI和NaeI消化产生的5.3kb条带，其进行凝胶纯化)并将其转化到PNY1507中，所述转化使用Zymo Research Frozen-EZ Yeast Transformation试剂盒(目录号T2001)。通过涂布到YPE加50μg／ml G418上选择转化子。在期望基因座上的整合通过PCR(引物N886和N1214，分别是SEQ ID NO：161和167)进行确认。接下来，编码Cre重组酶的质粒pRS423：：GAL1p—Cre(SEQ ID NO：169)用于除去loxP-侧接的KanMX盒。正确的盒移除通过PCR(引物oBP512和N160SeqF5(分别是SEQ ID NO：168和154))进行确认。最后，使用包括的遗传霉素选择标记将本文所述的alsS整合质粒(SEQ ID NO：155；pUC19-kan：：pdcl：：FBA-alsS：：TRX1，clone A)转化到这个菌株中。测试两个整合体的乙酰乳酸合酶活性，该测试通过用质粒pYZ090ΔalsS(SEQ ID NO：43)和pBP915(SEQ ID NO：44)转化进行，使用Amberg、Burke和Strathern“Methods in Yeast Genetics”(2005)中的Protocol#2，并且评估包含葡萄糖的培养基中的生长和异丁醇生产(生长和异丁醇测量方法如下：使所有菌株在缺乏组氨酸和尿嘧啶的合成完全培养基上生长，其包含0.3％的葡萄糖和0.3％的乙醇作为碳源(在125mL通气Erlenmeye烧瓶中的10mL培养基(VWR目录号89095-260)。在过夜培养后(30℃，在250rpm的
Figure BDA0000432348610000621
40New Brunswick Scientific Shaker中)，在包含2％葡萄糖和0.05％乙醇的合成完全培养基中(在125mL紧密封口的Erlenmeyer烧瓶中的20mL培养基(VWR目录号89095—260))将培养物稀释到0.2OD(Eppendorf BioPhotometer测量)。在培养48小时后(30℃，在250rpm的
Figure BDA0000432348610000622
40New Brunswick Scientific Shaker中)，培养物上清液(使用Spin-X离心管过滤单位，Costar目录号8169)用HPLC，按照美国专利申请公布20070092957所述的方法进行分析)。两个克隆中的一个是阳性的并且称为PNY2218。
PNY2218用Cre重组酶处理，并且通过PCR(引物N886和N160SeqR5；SEQ ID NO：161和158)筛选丢失xpk1基因和pUC19整合载体序列的所得克隆。在整合载体插入期间重组xpk1的DNA上游和导入的同源DNA后，这仅留下整合到pdc1-TRX1基因间区域的alsS基因(为“无痕”插入，因为载体、标记基因和loxP序列丢失)。虽然这种重组可在任何点上发生，载体整合似乎在无遗传霉素选择的情况下是稳定的，并且仅在引入Cre重组酶后观察到所述重组事件。一个克隆称为PNY2211。
啤酒糖酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)PNY2242的构建
以多个步骤从(上文所述的)PNY1507构建了菌株PNY2242。首先，将包含FBA1启动子、alsS编码区、和CYC1终止子的嵌合基因整合进染色体XII，位于TRX1基因上游。所述修饰的基因座序列为SEQ ID No：176。下一步，编码马肝乙醇脱氢酶基因的两个拷贝整合至染色VII和XVI中。在染色体VII上，包含PDC1启动子，hADH编码区和ADH1终止子的嵌合基因被放置在fra2Δ基因座(FRA2的最初的缺失如上文所述)。所述修饰的基因座序列为SEQ ID No：177。在染色体XVI上，包含PDC5启动子、hADH编码区和ADH1终止子的嵌合基因整合至之前由长期重复元件YPRCΔ15占据的区域。所述修饰的基因座序列为SEQ ID No：178。然后删除了天然的基因YMR226c和ALD6。YMR226c的消除仅无缝去除了其编码区。所述修饰的基因座序列为SEQ ID No：179。使用CRE-lox介导的标记移除(上文所述的方法)，删除了ALD6编码区以及700bp的上游序列，因此所得到的基因座包含一个loxP位点。所述修饰的基因座序列为SEQ IDNo：180。最后，将质粒引入菌株以表达Anaerostipes caccae变体KARI(pLH702，SEQ ID.No.181)和DHAD(pYZ067DkivDDhADH，SEQ ID.No.182)，得到菌株PNY2242。
PNY1528的构建
PNY1528(整合进PNY2211的hADH)
缺失／整合是通过用包含与靶区域上游和下游有同源性的区域的PCR产物和用于转化子选择的URA3基因进行的同源重组产生的。所述URA3基因通过同源性重组去除以生成无痕的缺失／整合。
所述无痕的缺失／整合步骤是改编自Akada等人，Yeast，23：399(2006)。针对每一缺失／整合的PCR盒，是通过组合四个片段A-B-U-C和待整合的基因得到的，所述整合是通过在通过PCR扩增整个盒用于缺失／整合过程之前，将各个片段克隆进质粒进行的。待整合的基因在所述盒中被包括在片段A和B之间。所述PCR盒包含选择性反向选择标记，URA3(片段U)，其由天然的CEN.PK113—7D URA3基因与启动子(所述URA3基因的250bp上游)和终止子(所述URA3基因的150bp下游)区域一起组成。片段A和C(每个大约100至500bp长)对应于紧接靶区域上游的序列(片段A)和靶区域3’序列(片段C)。片段A和C用于通过同源重组将盒整合到染色体中。片段B(500bp长)对应于紧接靶区域下游的500bp并用于通过同源性重组，从染色体上切除URA3标记和片段C，在盒整合到染色体时生成对应于片段B的序列的直接重复。
YPRCΔ15的缺失和马肝脏adh的整合
YPRCΔ15基因座被删除，并被针对在啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)中的表达经密码子优化的马肝脏adh基因、连同来自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的PDC5启动子区域(538bp)和来自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的ADH1终止子区域(316bp)替换。用于YPRCΔ15缺失-P[PDC5]-adh_HL(y)-ADH1t整合的无痕盒被首先克隆进质粒pUC19-URA3MCS。
使用Phusion High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabs；Ipswich，MA)和CEN.PK113—7D基因组DNA作为模板扩增了片段A—B—U—C，所述基因组DNA用Gentra Puregene Yeast／Bact试剂盒(Qiagen Valencia，CA)制备。YPRCΔ15片段A扩增自基因组DNA，所用引物为oBP622(SEQ ID NO：142)，其包含KpnI限制性位点，和引物oBP623(SEQ IDNO：143)，其包含与YPRCΔ15片段B的5’端同源的5’尾。YPRCΔ15片段B扩增自基因组DNA，所用引物oBP624(SEQ ID NO：144)，其包含与YPRCΔ15片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP625(SEQ ID NO：189)，其包含FseI限制性位点。用PCR Purification试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。YPRCΔ15片段A—YPRCΔ15片段B是通过重叠PCR生成的，通过混合YPRCΔ15片段A和YPRCΔ15片段B的PCR产物并用引物oBP622(SEQ ID NO：142)和oBP625(SEQ ID NO：189)扩增。所述所得PCR产物用KpnI和FseI消化，用T4DNA连接酶连到用适宜的酶消化过的pUC19-URA3MCS的对应的位点上。YPRCΔ15片段C扩增自基因组DNA，所用引物为oBP626(SEQ ID NO：190)，其包含NotI限制性位点，和引物oBP627(SEQ ID NO：191)，其包含PacI限制性位点。所述YPRCΔ15片段C PCR产物用NotI和PacI消化，并且用T4DNA连接酶连到包含YPRCΔ15片段AB的质粒的对应的位点上。从CEN.PK113—7D基因组DNA扩增了PDC5启动子区域，所用引物为HY21(SEQ ID NO：192)，其包含AscI限制性位点，和引物HY24(SEQ ID NO：193)，其包含与adh_Hl(y)的5’端同源的5’尾。adh_Hl(y)-ADH1t扩增自pBP915(SEQ ID NO：44)，所用引物为HY25(SEQ ID NO：194)，其包含与P[PDC5]的3′端同源的5′尾，和引物HY4(SEQ ID NO：195)，其包含Pmel限制性位点。用PCR Purification试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。通过混合P[PDC5]和adh_HL(y)-ADH1tPCR产物并用引物HY21(SEQ ID NO：192)和HY4(SEQ ID NO：195)扩增，通过重叠PCR构建了P[PDC5]-adh_HL(y)-ADH1t。所得到的PCR产物用AscI和PmeI消化，并用T4DNA连接酶连到包含YPRCΔ15片段ABC的质粒的对应位点上。所述整个整合盒从所得质粒扩增，所用引物为oBP622(SEQ ID NO：142)和oBP627(SEQ ID NO：191)。
制备PNY2211的感受态细胞并用YPRCΔ15缺失-P[PDC5]-adh_HL(y)-ADH1t整合盒PCR产物转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒(Zymo Research；Orange，CA)。将转化混合物在30℃下涂布到缺乏尿嘧啶并补充了1％的乙醇的合成完全培养基上。使用引物URA3-end F(SEQ ID NO：196)和oBP637(SEQ ID NO：197)，通过PCR筛选了转化子。使正确的转化子在YPE(1％乙醇)中并在30℃涂布到补充了1％的乙醇，并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上生长，以选择失去了URA3标记的分离物。通过PCR确认了YPRCΔ15的缺失和P[PDC5]-adh_HL(y)-ADH1t的整合，所用外部引物为oBP636(SEQ ID NO：198)和oBP637(SEQ ID NO：197)，使用由YeaStar Genomic DNA试剂盒(ZymoResearch)制备的基因组DNA。下列基因型的正确的分离株被选择用于进一步的修饰：CEN.PK113—7D MATa ura3Δ：：loxP his3Δpdc6Δpdc1Δ：：P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t—P[FBA1]-ALS|alsS_Bs—CYC1tpdc5Δ：：P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5t gpd2Δ：：loxP fra2Δadh1Δ：：UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_Ll(y)-ADH1t yprcΔ15Δ：：P[PDC5]-ADH|adh_Hl—ADH1t。
在fra2Δ的马肝脏adh整合
针对在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达经密码子优化的马肝脏adh基因、连同来自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的PDC1启动子区域(870bp)和来自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的ADH1终止子区域(316bp)，被整合进fra2缺失的位点。用于fra2Δ-P[PDC1]-adh_HL(y)-ADH1t整合的无痕盒被首先克隆进质粒pUC19-URA3MCS。
使用PhusionHigh Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabs；Ipswich，MA)并用CEN.PK113—7D基因组DNA作为模板扩增了片段A—B—U—C，所述基因组DNA用Gentra Puregene Yeast／Bact试剂盒(QiagenValencia，CA)制备。fra2Δ片段C扩增自基因组DNA，所用引物为oBP695(SEQ ID NO：199)，其包含NotI限制性位点，和引物oBP696(SEQ IDNO：137)，其包含PacI限制性位点。用NotI和PacI消化了fra2Δ片段CPCR产物，并用T4DNA连接酶连接至pUC19-URA3MCS的对应位点。从基因组DNA扩增了fra2Δ片段B，所用引物为oBP693(SEQ ID NO：201)，其包含PmeI限制性位点，和引物oBP694(SEQ ID NO：202)，其包含FseI限制性位点。用PmeI和FseI消化了所得到的PCR产物，并用T4DNA连接酶连接至用适当的酶消化后的包含fra2Δ片段C的质粒的对应位点。从基因组DNA扩增了fra2Δ片段A，所用引物为oBP691(SEQ ID NO：136)，其包含BamHI和AsiSI限制性位点，和引物oBP692(SEQ ID NO：204)，其包含AscI和SwaI限制性位点。用BamHI和AscI消化了fra2Δ片段A PCR产物，并用T4DNA连接酶连接至用适当的酶消化后的包含fra2Δ片段BC的质粒的对应位点。从CEN.PK113—7D基因组DNA扩增了PDC1启动子区域，所用引物为HY16(SEQ ID NO：205)，其包含AscI限制性位点，和引物HY19(SEQ ID NO：206)，其包含与adh_Hl(y)的5’端同源的5’尾。adh_Hl(y)-ADH1t扩增自pBP915，所用引物为HY20(SEQ IDNO：203)，其包含与P[PDC1]的3′端同源的5′尾，和引物HY4(SEQ IDNO：195)，其包含Pmel限制性位点。用PCR Purification试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。通过混合P[PDC1]和adh_HL(y)-ADH1t PCR产物并用引物HY16(SEQ ID NO：205)和HY4(SEQ ID NO：195)扩增，通过重叠PCR构建了P[PDC1]-adh_HL(y)-ADH1t。所得到的PCR产物用AscI和PmeI消化，并用T4DNA连接酶连到包含fra2Δ片段ABC的质粒的对应位点上。从所得到的质粒扩增了整个整合盒并用PCR Purification试剂盒(Qiagen)进行了纯化，扩增使用引物oBP691(SEQ ID NO：136)和oBP696(SEQ ID NO：137)。
制备了具有整合在YPRCΔ15的adh_Hl(y)的PNY2211变体的感受态细胞，并使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒(Zymo Research)，用fra2Δ-P[PDC1]-adh_HL(y)-ADH1t整合盒PCR产物进行了转化。将转化混合物在30℃下涂布到缺乏尿嘧啶并补充了1％的乙醇的合成完全培养基上。使用引物URA3-end F(SEQ ID NO：196)和oBP731(SEQ ID NO：139)，通过PCR筛选了转化子。使正确的转化子在YPE(1％乙醇)中并在30℃涂布到补充了1％的乙醇，并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上生长，以选择失去了URA3标记的分离物。通过菌落PCR确认了P[PDC1]-adh_HL(y)-ADH1t的整合，使用了内部引物HY31(SEQ ID NO：200)和外部引物oBP731(SEQ ID NO：139)，以及使用外部引物oBP730(SEQ ID NO：138)和oBP731(SEQ ID NO：139)，并使用由YeaStarGenomic DNA试剂盒(Zymo Research)制备的基因组DNA的PCR。下列基因型的正确的分离株被命名为PNY1528：CEN.PK113—7D MATaura3Δ：：loxP his3Δpdc6Δpdc1Δ：：P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t—P[FBA1]-ALS|alsS_Bs—CYC1t pdc5Δ：：P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5t gpd2Δ：：loxPfra2Δ：：P[PDC1]-ADH|adh_Hl—ADH1t adh1Δ：：UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_Ll(y)-ADH1t yprcΔ15Δ：：P[PDC5]-ADH|adh_Hl—ADH1t。
PNY1556的构建
在此描述的是用于用kivD_Lg(y)或kivD_Mc(y)在adh1Δ基因座替换PNY1528中的kivD_Ll(y)的染色体拷贝的构建体的装配，和表达kivD的菌株PNY1556的构建。
缺失／整合是通过用包含与靶区域上游和下游有同源性的区域的PCR产物和用于转化子选择的URA3基因进行的同源重组产生的，如上文中所描述的。
用于整合kivD_Lg(y)的质粒来源于被构建体为将UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_Ll(y)整合进啤酒糖酵母(Saccaromyces cerevisiae)的ADH1基因座的质粒。用于将UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_Ll(y)整合进ADH1基因座的质粒的构建描述于下文中。所述质粒被构建在pUC19-URA3MCS中。
ADH1缺失／UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD Ll(y)整合质粒的构建
扩增了来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的经密码子优化以在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的kivD编码区kivD_Ll(y)，扩增使用pLH468(SEQ ID NO：129)作为模板，所用引物为oBP562(SEQID NO：113)，其包含PmeI限制性位点，和引物oBP563(SEQ ID NO：114)，其包含与ADH1片段B的5’端同源的5’尾。ADH1片段B扩增自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEN.PK113—7D基因组DNA，所用引物为oBP564(SEQ ID NQ：115)，其包含与kivD_Ll(y)的3’端同源的5’尾，和引物oBP565(SEQ ID NO：116)，其包含FseI限制性位点。用PCR Purification试剂盒(Qiagen；Valencia，CA)纯化PCR产物。通过混合kivD_Ll(y)和ADH1片段B PCR产物并用引物oBP562(SEQ ID NO：113)和oBP565(SEQ ID NO116)扩增，通过重叠PCR构建了kivD_Ll(y)-ADH1片段B。所得到的PCR产物用PmeI和FseI消化，用T4DNA连接酶连到用适合的酶消化过的pUC19-URA3MCS的对应的位点上。ADH1片段A扩增自基因组DNA，所用引物为oBP505(SEQ ID NO：117)，其包含SacI限制性位点，和引物oBP506(SEQ ID NO：118)，其包含AscI限制性位点。用SacI和AscI消化了ADH1片段APCR产物，并用T4DNA连接酶连接进包含kivD_Ll(y)-ADH1片段B的质粒的相应位点。从基因组DNA扩增了ADH1片段C，扩增所用引物为oBP507(SEQ ID NO：119)，其包含PacI限制性位点，和引物oBP508(SEQ ID NO：120)，其包含SalI限制性位点。用PacI和SalI消化ADH1片段C PCR产物，并用T4DNA连接酶连接至包含ADH1片段A—kivD_Ll(y)-ADH1片段B的质粒的相应位点。从载体pRS316-UAS(PGK1)-PFBA1-GUS(SEQ ID NO：130)扩增了混合启动子UAS(PGK1)-PFBA1，所用引物为oBP674(SEQ ID NO：121)，其包含AscI限制性位点，和引物oBP675(SEQ ID NO：122)，其包含Pmel限制性位点。用AscI和PmeI消化了UAS(PGK1)-PFBA1PCR产物，并用T4DNA连接酶连接至包含kivD_Ll(y)-ADH1片段ABC的质粒的相应位点，以产生pBP1181。
从ADH1缺失／UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_Ll(y)整合质粒pBP1181移除了kivD_Ll(y)。用PmeI和FseI消化了质粒，在琼脂糖凝胶上纯化了大的DNA片段，然后使用了凝胶提取试剂盒(Qiagen)。使用引物oBP821(SEQ ID NO：207)，其包含PmeI限制性位点，和引物oBP484(SEQ IDNO：208)，其包含FseI限制性位点，从pBP1181扩增了ADH1片段B。用PmeI和FseI消化了ADH1片段B PCR产物，并用T4DNA连接酶连接至上述凝胶纯化的大的DNA片段的相应位点。对应于kivD_Ll(y)3’500bp的PCR片段被克隆进所得到的载体，用于PNY1528中的kivD_Ll(y)的靶向删除。使用引物oBP822(SEQ ID NO：209)，其包含NotI限制性位点，和引物oBP823(SEQ ID NO：210)，其包含PacI限制性位点，从pBP1181扩增了片段。用NotI和PacI消化了所述片段，并用T4DNA连接酶连接至用适当的限制性酶消化后的带有kivD_L1(y)删除的上述质粒中URA3下游的对应位点。所得到的质粒被命名为pBP1716。
由DNA2.0(Menlo Park，CA)合成了针对在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达经密码子优化的来自格氏李斯特菌(Listeria grayi)的kivD编码区(SEQ ID NO：211)kivD Lg(y)，使用引物oBP828(SEQ ID NO：212)，其包含PmeI限制性位点，和oBP829(SEQ ID NO：213)，其包含PmeI限制性位点，扩增了kivD Lg(y)。所得到的PCR产物用PmeI消化，并用T4DNA连接酶连到用适合的酶消化过的pBP1716中的对应位点。使用引物FBAp-F(SEQ ID NO：97)和oBP829(SEQ ID NO：213)，通过PCR检验了所克隆的基因的取向。具有正确取向的kivD_Lg(y)的分离株被命名为pBP1719。
使用引物oBP505(SEQ ID NO：117)和oBP823(SEQ ID NO：210)，从pBP1719扩增了kivD_Ll(y)缺失／kivD_Lg(y)整合盒。制备PNY1528的感受态细胞并用PCR产物转化，使用了Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒(Zymo Research；Orange，CA)。将转化混合物在30℃下涂布到缺乏尿嘧啶并补充了1％的乙醇的合成完全培养基上。使转化子在YPE(1％乙醇)并在30℃涂布到补充了1％的乙醇，并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上生长，以选择失去了URA3标记的分离物。通过PCR来确认了kivD_Ll(y)的缺失和kivD_Lg(y)的整合，所用引物为oBP674(SEQ ID NO：162)和oBP830(SEQ ID NO：214)，使用由YeaStarGenomic DNA试剂盒(Zymo Research)制备的基因组DNA。正确的分离株在相同的基因座包含kivD_Lg(y)并从与PNY1528中的kivD_Ll(y)相同的启动子表达，并被命名为PNY1556。
实例1
畸形假丝酵母(Candida deformans)LIP1脂肪酶在酵母中的表达
来自畸形假丝酵母(C.deformans)的原生LIP1脂肪酶的DNA序列获取自GenBank(登录号AJ428393)，并且开放阅读框(ORF)经优化以在酵母中表达(DNA2.0)。所得DNA序列与野生型序列具有76％序列同一性，并且编码相同的蛋白。
合成包含表达优化的ORF序列的DNA(DNA2.0)，并且通过缺口修复克隆将所得DNA分子克隆进酵母-大肠杆菌穿梭载体中(Oldenburg KR，Vo KT，Michaelis S，&Paddon C(1997)Recombination-mediated PCR—directed plasmid construction in vivo in yeast.Nucleic Acids Res25：451-452)。简而言之，LIP1脂肪酶ORF使用引物AK10—33CdL5和AK10—34_CdL3(分别是SEQ ID NO：10和11)进行扩增，它们包括与质粒pNAK34(SEQID NO：232)中的区域同源的5’区。将所得PCR产物与已经用PacI限制性内切核酸酶线性化的pNAK34一起共转化到啤酒糖酵母(S.cerevisiae)菌株PN Y1500中，该转化通过基本上如(Gietz RD&Woods RA(2006)Yeast transformation by the LiAc／S S Carrier DNA／PEG method.Methods MolBiol313：107—120)所述的乙酸锂／PEG转化进行。将转化反应涂布到合成完全琼脂培养基(Sherman F(2002)Getting started with yeast.Methods inEnzymology350：3-41)上，该培养基包含2％葡萄糖和不含组氨酸的营养缺陷混合物(Formedium，UK，目录号DSCK-042；SCD—His培养基)。在30℃孵育3天后，挑取His+菌落用于进一步分析。
将LIP1脂肪酶阳性分离物涂布在包含甘油三丁酸酯的SC—His培养基上并在30℃孵育3天。LIP1脂肪酶阳性分离物具有围绕它们的透明区，指示它们分泌能够水解甘油三丁酸酯的功能性脂肪酶；与之相反，对照酵母菌株不引起琼脂培养基中的甘油三丁酸酯出现透明区。来自3个分离物的质粒通过质粒拯救(Robzyk K&Kassir Y(1992)A simple and highly efficientprocedure for rescuing autonomous plasmids from yeast.Nucleic Acids Res.20：3790)回收，并且使用M13-反向和T7-启动子引物(分别是SEQ ID NO：16和17)，在ABI Prism3730xl DNA Analyzer上使用BigDye TerminatorCycle测序化学进行测序。该序列与缺口修复克隆方法(数据未示出)的预测质粒产物完全匹配。所得质粒是pNAK10(SEQ ID NO：45；图3)。
实例2
在酵母中表达疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶
来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的原生脂肪酶(Tlan脂肪酶)的DNA序列获取自GenBank(登录号AF054513)，并且该序列经优化以在酵母中表达(DNA2.0)。所得DNA序列与野生型序列具有76％序列同一性，并且编码相同的蛋白。
合成包含表达优化的ORF序列的DNA(DNA2.0)，并且通过如实例1的缺口修复克隆将所得DNA分子克隆进酵母-大肠杆菌穿梭载体中。简而言之，合成的疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)Tlan脂肪酶ORF使用引物AK10-42_Tl5—1和AK10-43_Tl3(分别是SEQ ID NO：12和13)进行扩增，它们包括与质粒pNAK10(SEQ ID NO：45；图3)中的区域同源的5’区。将所得PCR产物与已经用SpeI限制性内切核酸酶线性化的pNAK10一起共转化到啤酒糖酵母(S.cerevisiae)菌株PNY1500中。将转化反应涂布到SCD-His培养基上)。在30℃孵育3天后，通过菌落PCR分析菌落的包含Tlan脂肪酶序列的质粒，该菌落PCR使用引物AK10-41_Tl5—1和AK10—42_Tl3(SEQ ID NO：12和13)。
将Tlan脂肪酶阳性分离物涂布在包含甘油三丁酸酯的SCD-His培养基上并在30℃孵育3天。Tlan脂肪酶阳性分离物具有围绕它们的透明区，指示它们分泌功能性脂肪酶活性；与之相反，对照酵母菌株不引起琼脂培养基中的甘油三丁酸酯出现透明区。通过质粒拯救回收来自三个分离物的质粒，并且使用M13-反向和T7-启动子引物(SEQ ID NO：16和17)。该序列与缺口修复克隆方法(数据未示出)的预测质粒产物完全匹配。一个质粒称为pTVAN2(SEQ ID NO：100)。
实例3
疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)脂肪酶在酵母中的大规模表达
来自实例2的一个阳性分离物，PNY1020，在SCD-His培养基中预培养过夜，并且这被用于涂布SCD-His培养基的四个500mL培养物；两个培养物用天冬酰胺酰糖基化抑制剂衣霉素(5μg／mL；Sigma-Aldrich，St.LouisMO)处理。将烧瓶在振荡培养箱中以30℃和250rpm条件孵育。在8小时后，将50mL YPD培养基(酵母提取物，10g／L；蛋白胨，20g／L；葡萄糖，20g／L)加到每个烧瓶中，并且将培养物孵育过夜。第二天早晨，在耗尽葡萄糖后，培养物在4℃下以8000rpm离心10分钟。通过10,000道尔顿的分子量截留过滤器将上清液加压浓缩大约500倍。测量保留物的蛋白浓度，并且通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析20μg蛋白，该电泳使用4—12％的丙烯酰胺Bis-Tris凝胶(Invitrogen，Carlsbad CA)，根据制造商的说明书进行。凝胶用Coomassie Blue R-250染色并脱色。衣霉素处理过的蛋白具有较低的分子量，表现为它在凝胶中较高的移动性(未示出)。Tlan脂肪酶条带的特性通过氨基-末端测序进行确认。
预测保留物中Tlan脂肪酶蛋白(经或未经衣霉素处理后表达的)的浓度为基于SDS—PAGE分析25％的总可溶解蛋白，并且这两种包含Tlan脂肪酶蛋白的保留物(经或未经衣霉素处理后表达的)用作体外酯化异丁醇与玉米油脂肪酸的催化剂(实例5)。
实例4
玉米油脂肪酸的生产
将750g粗制玉米油、2112g水和285g50％氢氧化钠溶液装入配备了机械搅拌器、热电偶、加热罩、冷凝器、和氮气三通的5升圆底烧瓶。混合物被加热至90℃并保持两小时，在这段时间中，其变成了稠密的乳液状单相。在这段时间末期薄层色谱法指示在混合物中无剩余的玉米油。然后将混合物冷却至74℃并加入900g25％硫酸以酸化混合物，然后将其冷却至50℃并分离水层。油层用1500mL40℃的水洗涤两次，然后用1L饱和盐水洗涤一次，并且随后在硫酸镁上干燥并通过硅藻土过滤。产物是610g清澈的红色的油。通过AOCS方法Ca5a-40对游离脂肪酸的滴定显示95％的脂肪酸含量，其以油酸表达。通过将在1mL干吡啶中将样品(104mg)与100uL的N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺进行反应而对样品进行硅烷化。对硅烷化的产物的气相色谱-质谱联用(GCMS)分析显示了16:0、18：2、18:1、18：0、和20:0羧酸的TMS(三甲基硅基)衍生物的存在。
实例5
通过由分泌脂肪酶催化的异丁醇和玉米油脂肪酸的反应生产异丁基- COFA酯
反应混合物包含3.6g异丁醇(2-甲基-1-丙醇)，14.7g由玉米油制备的玉米油脂肪酸(COFA)(实例4)，45.1g含水的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(0.20M，pH5.4)，和0.487mg(在水相中10ppm；表7)或0.974mg(在水相中20ppm；表9)的Tlan脂肪酶蛋白(经或未经衣霉素处理后表达的；实例3)，在30℃搅拌该混合物，并且在预定时间点从每个反应混合物中取出样品，立即离心，并且针对异丁醇(iBuOH)和玉米油脂肪酸异丁酯(iBuO-COFA)分离并分析水层和有机层(表10)。包含脂肪酶的反应产生比对照反应显著更多的iBuO-COFA；在衣霉素存在的情况下酵母分泌的脂肪酶样品比无抑制剂存在的情况下产生显著更多的iBuO-COFA。
表9：在将异丁醇(iBuOH)转化成玉米油脂肪酸异丁酯(iBuO— COFA)的反应中的Tlan浓度。
Figure BDA0000432348610000741
表10：对于表9中所述的反应在含水级份(AQ)和有机级份(ORG)中存在的异丁醇(iBuOH)和玉米油脂肪酸的异丁酯(iBuO—COFA)的重量。
Figure BDA0000432348610000742
Figure BDA0000432348610000751
实例6
在酵母培养期间生产脂肪酸丁酯
Tlan脂肪酶分离物PNY1020和对照菌株PNY908在SCD—His培养基中预培养，并且用于涂布包含25mL SC—His培养基的烧瓶(具有密封的顶盖)。烧瓶用8.25g无菌COFA(33％w／w)、异丁醇(0.50g，在生长8小时后加入)、和衣霉素(Tnm，最终浓度5μg／ml)改良如下(表11)：
表11：
Figure BDA0000432348610000752
在30℃以250孵育烧瓶，并在24小时和96小时的孵育后取样。通过HPLC和GC分析样品在水相中的葡萄糖、乙醇、异丁醇、和烷基脂肪酸酯，并且通过GC分析有机相中的异丁醇和烷基脂肪酸酯(表12和13)。当将异丁醇和COFA加到培养物中时，表达脂肪酶的菌株(烧瓶F8和F9)产生比对照菌株(烧瓶F4)更多的iBuO-COFA。用衣霉素处理过的细胞比未经抑制剂处理的细胞产生更多的酯。
表12：含水F1-F10样品的HPLC分析。
样品 时间 葡萄糖 甘油 乙酸盐 乙醇 iBuOH
(小时) (mM) (mM) (mM) (mM) (mM)
F1 24 0.1 2.5 8.2 170.4 0.8
F2 24 0.1 3.3 7.3 1794 12
F3 24 50.9 1.6 3.5 106.4 266.6
F4 24 0.0 1.5 5.5 182.0 144.3
F5 24 0.1 3.9 10.5 1711 05
F6 24 0.1 5.0 7.9 184.7 0.1
F7 24 89.9 1.1 2.4 39.0 267.2
F8 24 0.1 1.8 1.7 189.9 144.6
F9 24 659 17 26 80.7 1435
F10 24 10.8 16.6 5.4 1416 0.4
F1 96 0.0 0.7 91.7 0.3
F2 96 0.0 3.1 7.0 179.3 01
F3 96 50.6 1.2 3.0 1086 247.9
F4 96 0.0 1.6 7.2 183.8 130.0
F5 96 0.0 3.3 9.2 1639 01
F6 96 0.0 4.9 9.7 182.6 01
F7 96 90.3 0.9 1.5 38.6 248.6
F8 96 0.0 1.9 20 1907 1281
F9 96 0.7 2.1 1.2 1842 1285
F10 96 0.0 17.8 2.2 1532 0.1
表13：对于表11中所述的摇瓶培养物在含水级份(AQ)和有机级份(ORG)中存在的异丁醇(iBuOH)和玉米油脂肪酸的异丁酯(iBuO—COFA)的重量。
Figure BDA0000432348610000771
实例7
南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B在酵母中的表达
南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B(CalB脂肪酶)的DNA序列获取自GenBank(登录号Z30645)，并且该序列经优化以在酵母中表达(DNA2.0，Menlo Park，CA)。所得DNA序列与野生型序列具有72％序列同一性，并且编码相同的蛋白。
合成包含表达优化的CalB开放阅读框(ORF)序列的DNA(DNA2.0)，并且通过的缺口修复克隆将所得DNA分子克隆进酵母-大肠杆菌穿梭载体中。简而言之，CalB脂肪酶ORF使用引物CALBL_gap_for和CALBL_gap_rev(SEQ ID NO：14和15)进行扩增，它们包括与质粒pNAK34(SEQ ID NO：232)中的区域同源的5’区。通过乙酸锂／PEG转化，将所得PCR产物与已经用HpaI限制性内切核酸酶线性化的质粒pNAK33(SEQ ID NO：231)、pNAK34(SEQ ID NO：232)、或pNAK35(SEQ IDNO：233)一起共转化到啤酒糖酵母(S.cerevisiae)菌株PNY1500中。将转化反应涂布到SCD—His培养基上。在30℃孵育3天后，通过菌落PCR分析菌落的包含CalB脂肪酶序列的质粒，该菌落PCR使用引物CALBL_gap_for和CALBL_gap_rev(SEQ ID NO：14和15)。
将CalB脂肪酶阳性分离物涂布在包含甘油三丁酸酯的SCD—His培养基上并在30℃孵育3天。CalB脂肪酶阳性分离物具有围绕它们的透明区，指示它们分泌功能性脂肪酶活性；与之相反，对照酵母菌株不引起琼脂培养基中的甘油三丁酸酯出现透明区。通过质粒拯救回收来自3个分离物的质粒，并且使用M13-反向和T7-启动子引物(SEQ ID NO：16和17)。该序列与缺口修复克隆方法的预测质粒产物完全匹配。所得质粒称为pTVAN7(TEF1(M2)启动子)、pTVAN3(TEF1(M4)启动子)、和pTVAN8(TEF1(M6)启动子)(分别是SEQ ID NO：278、101、和240)。
实例8
Tlan脂肪酶的表面展示
如下引入将分泌的疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)脂肪酶固定到酵母细胞表面上的域。酵母基因组DNA(PNY1500)用作PCR反应中的模板，所用引物为AK11-46和AK11-47(分别是SEQ ID NO：215和216)，它们扩增由SAG1编码的酵母α-凝集素蛋白的C-末端320个氨基酸的密码子，并且在包含富含甘氨酸和丝氨酸的连接区的5’端添加一个序列。使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs)，根据制造商的说明书完成扩增。
这个GS—SAG1DNA是克隆进pCR—BluntII—TOPO(InVitrogen)并转化到DH5α的TOPO。pGS—SAG1质粒(SEQ ID NO：217)通过mini-prep(Qiagen)回收并且通过DNA测序确认正确的序列。DNA使用引物Sagtgap1和Sagtgap2(分别是SEQ ID NO：218和219)进行扩增，它们包括同源区域以缺口修复克隆进脂肪酶表达载体pTVAN11、pTVAN12、和pTVAN13(分别是SEQ ID NO：220、221、和222)。经纯化的PCR产物与PacI消化过的pTVAN11(TEF1(M2)启动子)、pTVAN12(TEF1(M4)启动子)、或pTVAN13(TEF1(M6)启动子)一起转化到酵母菌株PNY1500中。将转化反应涂布到SCD-His培养基；表现出测试阳性的菌落在甘油三丁酸酯平板上表达脂肪酶活性。从这些分离物(Yeast PlasmidMiniprep试剂盒，Zymo Research)中拯救质粒并转化到大肠杆菌DH5α中并进行纯化。序列分析示出脂肪酶-SAG1嵌合体的期望核苷酸序列。
表达脂肪酶的菌株(PNY1052、PNY1053、和PNY1054)和对照菌株(PNY1500)在30℃和250rpm条件下孵育的250mL通气顶盖烧瓶中的50mL SCD-His培养基中生长过夜。第二天早晨，将21.5mL培养物转移到125mL烧瓶(密封顶盖)中，加入1.75mL葡萄糖(500g／L)，2.5mL10XYEP(100g／L酵母提取物，200g／L蛋白胨)，和0.313mL异丁醇。取出样品，随后加入10.3mL COFA和无菌搅拌棒，送回烧瓶进行孵育。在24小时后取出样品(5mL)进行HPLC和GC分析，并且加入1.75mL葡萄糖和0.313mL异丁醇。在72小时后取出第二样品。如上所述分析样品(表14)。表达SAG1-脂肪酶嵌合体的菌株比对照菌株产生更多的脂肪酸丁酯(FABE)。菌株PNY1054具有驱动嵌合体转录的最强启动子，它产生比对照菌株多6倍的FABE，而具有较弱启动子的菌株产生仅比对照菌株多～30％的FABE。
表14：在指示菌株摇瓶培养物的水相和有机相中的异丁醇(iBuOH) 和脂肪酸异丁酯(FABE)的测得量。
Figure BDA0000432348610000791
Figure BDA0000432348610000801
实例9
细胞表面展示：细胞关联测试
进行这一实验以确定由SAG1-脂肪酶嵌合体表达的脂肪酶活性是否事实上是细胞关联的或者被分泌到培养液中。
表达脂肪酶的菌株(PNY1052、PNY1053、和PNY1054)和对照菌株(PNY1500)在30℃和250rpm条件下孵育的250mL通气顶盖烧瓶中的25mL SCD-His培养基(6.7g／L酵母氮源-无氨基酸，1926mg不含组氨酸的营养缺陷混合物，20g／L葡萄糖)中生长24小时。随后离心分离细胞和培养液；洗涤细胞沉淀物两次并重悬在pH5.5的25mL50mM MES缓冲液中。用pH5.5的1M MES缓冲液将所用的无细胞培养基调节到50mM。将异丁醇(最终浓度20g／L)和COFA(33％wt／wt)加到所用的培养基和细胞悬浮液中。两个反应在30℃和250rpm条件下孵育72小时。如上所述通过GC分析样品(表15)。在用COFA和异丁醇孵育72小时后，表达脂肪酶的细胞的悬浮液形成比对照细胞悬浮液多～2.5倍的FABE。与之相反，在无细胞培养基样品中的FABE积聚无差异，表明在这些条件下Sag1-脂肪酶嵌合蛋白是特异性细胞相关联的。
表15：在指示菌株摇瓶培养物的水相和有机相中的异丁醇(iBuOH) 和脂肪酸异丁酯(FABE)的测得量。
Figure BDA0000432348610000802
实例10
工程化异丁醇生产酵母以分泌疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)脂 肪酶
Tlan脂肪酶转基因扩增自质粒pTVAN6(SEQ ID NO：183)，该扩增使用寡核苷酸AK11—24(SEQ ID NO：132)和AK11—25(SEQ ID NO：133)，它们在它们的5’端包括AscI位点。PCR产物用AscI消化并连接到AscI消化的pBP1236(SEQ ID NO：185)。这一质粒用于实施Akada等人(Akada R等人，(2006)，PCR-mediated seamless gene deletion and markerrecycling in Saccharomyces cerevisiae.Yeast23：399-405)的技术，用于在酵母的fra2Δ基因座的转基因整合。将连接混合物转化到感受态大肠杆菌DH5α(Invitrogen，Carlsbad CA)中并涂布到LB-氨苄青霉素琼脂板上。来自这一平板的菌落在LB-氨苄青霉素中生长过夜，并且使用Qiaprep SpinMiniprep试剂盒分离质粒DNA。重组质粒通过AscI消化和琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。DNA测序用于鉴定构建体中的脂肪酶转基因的方向。质粒pNAK15(SEQ ID NO：186)包含反向的野生型脂肪酶转基因，并且pNAK16(SEQ ID NO：187)包含正向的野生型脂肪酶转基因。
从这些质粒中扩增脂肪酶转基因与使它们定向在fra2Δ上整合的侧翼DNA(并且其包括URA3基因作为选择性标记)，扩增所用引物为oBP691(SEQ ID NO：136)和oBP696(SEQ ID NO：137)。使用QIAQuick PCRPurification试剂盒纯化并浓缩PCR产物。酵母菌株PNY2211(如上所述构建)在30℃和250rpm条件下，在YPE培养基(10g／L酵母提取物，20g／L蛋白胨，20mL／l95％乙醇)中生长过夜，并且用PCR产物转化，随后涂布到SCE—Ura琼脂培养基(6.7g／L酵母氮源-无氨基酸(YNB；Difco291940，BD，Franklin Lakes NJ)，1926mg／L不含Ura的营养缺陷混合物(DSCK102，Formedium，Norfolk UK)，20mL／L95％乙醇)上。将Ura+菌落涂布到新制培养基上，随后再涂布到FOA培养基(6.7g／L YNB，1g/L5-氟乳清酸，200mg／L尿嘧啶，20mL／l95％乙醇)上以选择分离物，该分离物已经丢失了URA3选择标记。
检查抗FOA转化子是否正确整合转基因以及通过菌落PCR检查选择标记是否丢失，该菌落PCR使用如下的整合盒每个侧翼的引物对：对于具有正向转基因的构建体(来自pNAK16)，使用引物对AK11—26(SEQ ID NO：134)和oBP730(SEQ ID NO：138)、以及AK11-27(SEQ ID NO：135)和oBP731(SEQ ID NO：139)。对于具有反向转基因的构建体(来自pNAK15和pNAK17)，使用引物对AK11—27(SEQ ID NO：135)和oBP730(SEQ5ID NO：138)、以及AK11—26(SEQ ID NO：134)和oBP731(SEQ ID NO：139)。选择产生正确的PCR产物的分离物进行进一步研究，并命名为PNY931(反向)、PNY932(正向)、和PNY933(反向，N55A突变)。
使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis试剂盒(Strategene，La JollaCA)，按照制造商的说明书，进行了Tlan脂肪酶的残基55(N-糖基化位点0中)处的天冬酰胺至丙氨酸的诱变，结合了质粒pNAK15(SEQ ID NO：186)和下列引物：
在使用与试剂盒一起提供的热稳定聚合酶，利用诱变引物扩增质粒主链后，用DpnI限制性内切核酸酶消化DNA。将处理后的质粒转化到大肠杆菌(E.coli)XL1-Blue感受态细胞中，并且使用Qiaprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)回收。通过对诱变质粒的DNA序列分析鉴定突变的克隆。一种此类质粒被命名为pNAK17(SEQ ID NO：189)。
脂肪酶整合酵母菌株和它们的亲本菌株PNY2211用质粒pBP915(SEQID NO：44)和pYZ090ΔalsS(SEQ ID NO：43)转化以引入异丁醇代谢途径。菌株在YPE培养基中培养过夜，随后如上所述用质粒DNA转化，并且涂布到SCE-His-Ura琼脂培养基(6.7g／L YNB，1850mg／L营养缺陷混合物-His—Ura(DSCK162，Formedium)，20mL／l95％乙醇)上。菌落再涂布到SCE-His-Ura琼脂培养基上，并且命名为PNY934、PNY935、和PNY936。
实例11
通过异源脂肪酶表达生产异丁醇和脂肪酸异丁酯
将菌株PNY934和PNY935涂布到SC-His-Ura DE琼脂培养基(6.7g／L YNB，1850mg／L营养缺陷混合物-His-Ura，3g／L葡萄糖，3mL／l95％乙醇)上；这些细胞连同对照菌株PNY2242的细胞(其产生异丁醇，但是不分泌异源脂肪酶)一起用于涂布3mL SC-His-Ura DE培养基的预培养物。这些生长～6小时。2mL用于接种在配有通气顶盖的250mL烧瓶中的50mL相同培养基；这些生长过夜至光密度(OD600)～1。第二天早晨，加入葡萄糖、酵母提取物、和蛋白胨，使它们的浓度分别为35、10、和20g／L，最终体积为75mL。将这一培养物平均分配到三个相同的125mL摇瓶(密封顶盖，包含搅拌棒)中，随后加入10.3mL玉米油脂肪酸(COFA)并将烧瓶在30℃和250rpm条件下孵育。在0小时(0.6mL，在加入COFA前)以及24小时和72小时(每个5mL，在完全混合水相和COFA相之后)取样。如前文所述，通过HPLC和GC分析样品。在24小时加入1.5mL500g／L葡萄糖。
在这些发酵中产生的异丁醇在3个级份之间分配：在水相和COFA相中的游离异丁醇，和通过异丁醇与脂肪酸的酯化产生的脂肪酸异丁酯(FABE)级份。如表16所示，分泌脂肪酶的菌株产生相当多的FABE，而对照菌株仅产生少量的FABE，其仅占分泌脂肪酶的菌株产生的FABE的～12％。脂肪酶催化异丁醇酯化成FABE导致水相异丁醇浓度降低，按体系中异丁醇总量百分比计约为10％，在24小时为53％至43％，并且在72小时为45％至～31％。
表16：在指示菌株摇瓶培养物的水相和有机相中的异丁醇(iBuOH)和脂肪酸异丁酯(FABE)的测得量。示出了三个相同烧瓶的平均±标准偏差。根据由于取样造成的体积损耗对量进行修正。
Figure BDA0000432348610000831
Figure BDA0000432348610000841
实例12
通过异源脂肪酶分泌生产异丁醇和脂肪酸异丁酯-比较糖基化的和非糖 基化的脂肪酶
重复前文实例的实验，包括菌株PNY936，其分泌Tlan脂肪酶的N55A突变体。在这个实验中，在24小时以及48小时后两次加入葡萄糖(1.5mL500g／L的葡萄糖)。
分泌脂肪酶的菌株比对照菌株产生更多的FABE(在这种情况下多～5—6倍)。作为FABE形成的结果，在含水级份中的总异丁醇的比例降低，在24小时降低～10％并且在72小时降低～15％。在其中分泌脂肪酶的产异丁醇菌生长的培养物比对照物产生显著更多的FABE级份。在用PNY936菌株(分泌糖基化-变体脂肪酶)的发酵中产生的FABE量不显著不同于由分泌野生型脂肪酶的菌株产生的FABE量。
表17：在指示菌株摇瓶培养物的水相和有机相中的异丁醇(iBuOH)和脂肪酸异丁酯(FABE)的测得量。示出了三个相同烧瓶的平均±标准偏差。根据由于取样造成的体积损耗对量进行修正。
Figure BDA0000432348610000842
实例13
工程化异丁醇生产酵母以表达畸形假丝酵母(C.deformans)和南极假 丝酵母(C.antarctica)脂肪酶
编码分别来自畸形假丝酵母(C.deformans)和南极假丝酵母(C.antarctica)的野生型脂肪酶的LIP1和CalB脂肪酶转基因从质粒pNAK10(SEQ ID NO：45)、pNAK31(SEQ ID NO：238)和pTVAN8(SEQ ID NO：240)中进行扩增，该扩增使用寡核苷酸AK11—24(SEQ ID NO：132)和AK11—25(SEQ ID NO：133)，它们在它们的5’端包括AscI位点。PCR产物用AscI消化并连接到AscI消化的pNAK36(SEQ ID NO：223)。将连接混合物转化到感受态大肠杆菌DH5α(Invitrogen)中并涂布到LB-氨苄青霉素琼脂板上。来自这一平板的菌落在LB-氨苄青霉素中生长过夜，并且使用Qiaprep Spin Miniprep试剂盒分离质粒DNA。重组质粒通过AscI消化和琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。质粒pNAK38(SEQ ID NO：224)包含在TEF1(M6)启动子控制下的CalB脂肪酶，pNAK37(SEQ ID NO：225)包含在TEF1(M4)启动子控制下的LIP1脂肪酶，并且pNAK39(SEQ ID NO：226)包含在TEF1(M6)启动子控制下的LIP1脂肪酶。
从这些质粒中扩增脂肪酶转基因与使它们定向在gpd2Δ上整合的侧翼DNA(并且其包括URA3基因作为选择性标记)，扩增所用引物为oBP691(SEQ ID NO：136)和oBP696(SEQ ID NO：137)。使用QIAQuick PCRPurification试剂盒纯化并浓缩PCR产物。酵母菌株PNY1556在30℃和250rpm条件下，在YPE培养基(10g／L酵母提取物，20g／L蛋白胨，20mL／l95％乙醇)中生长过夜，并且用PCR产物转化，随后涂布到SCE-Ura琼脂培养基上。将Ura+菌落涂布到新制培养基上，随后再涂布到FOA培养基上以选择已经丢失了选择性标记的分离物。
检查抗FOA转化子是否正确整合转基因以及通过菌落PCR检查选择标记是否丢失，该菌落PCR使用如下的整合盒每个侧翼的引物对：基因组DNA使用PureGene试剂盒(Qiagen)，基本上如制造商所述进行纯化。这用作PCR反应的模板，该反应使用寡聚物HY48(SEQ ID NO：227)和HY49(SEQ ID NO：228)。将阳性整合体涂布到FOA培养基上，并且回收抗FOA的分离物。已经从gpd2Δ基因座上丢失了URA3标记的分离物通过PCR进行鉴定，如上所述使用寡聚物HY48和HY49。
脂肪酶整合酵母菌株和对照菌株，PNY1556，用质粒pBP2092(SEQID NO：237)进行转化以引入异丁醇代谢途径，如下所述：菌株在YPE培养基中培养过夜，随后如上所述用质粒DNA转化，并且涂布到SCE-His琼脂培养基上。将菌落再涂布到SCE—Ura琼脂培养基上，并且命名为PNY1022(TEF1(M4)-LIP1)、PNY1023(TEF1(M6)-LIP1)、和PNY1024(TEF1(M4)-CalB)。
实例14
通过在产异丁醇菌中异源表达畸形假丝酵母(C.deformans)和南极假 丝酵母(C.antarctica)脂肪酶生产异丁醇和脂肪酸异丁酯
将菌株PNY1022、PNY1023、和PNY1024再涂布到SC-Ura DE琼脂培养基上；这些细胞用于接种3mL SC-His-Ura DE培养基的预培养物，它生长～6小时。2mL用于接种在配有通气顶盖的250mL烧瓶中的50mL相同培养基；这些生长过夜至光密度(OD600)～1。第二天早晨，加入葡萄糖、酵母提取物、和蛋白胨，使它们的浓度分别为35、10、和20g／l，最终体积为75mL。将这一培养物平均分配到三个相同的125mL摇瓶(密封顶盖，包含搅拌棒)中，加入10.3mL玉米油脂肪酸(COFA)并将烧瓶在30℃和250rpm条件下孵育。在0小时(在加入COFA前)，以及24小时、48小时、和94小时(在完全混合水相和COFA相之后)取样。通过HPLC和GC分析样品。在24小时，加入1.5mL500g／L葡萄糖(1.2mL至PNY1556培养物中)；在48小时，将1.6mL葡萄糖加到每个烧瓶中。
在这些发酵中产生的异丁醇在3相之间分配：在水相和COFA相中的游离异丁醇，和通过异丁醇与脂肪酸的酯化产生的脂肪酸异丁酯(FABE)。如表18所示，表达畸形假丝酵母(C.deformans)脂肪酶的菌株在24和94小时生产相当多的FABE。PNY1023具有驱动畸形假丝酵母(C.deformans)脂肪酶转基因表达的较强启动子，它制备的FABE大约为PNY1022制备的FABE的两倍。令人感兴趣地是，到94小时PNY1023比其它菌株产生显著更多的总异丁醇。
表达CalB脂肪酶的菌株产生比表达畸形假丝酵母(C.deformans)酶的菌株少得多的FABE，但是在它的烧瓶中有比对照发酵显著更多的FABE。对照菌株(无脂肪酶转基因)到94小时仅将10mg异丁醇酯化成FABE，这可能是由于内源性的脂肪酶活性。由表达脂肪酶的产异丁醇菌进行的发酵全部表现出比对照发酵显著更低的水相异丁醇浓度。在用畸形假丝酵母(C.deformans)表达菌株(PNY1022和PNY1023)发酵的情况下，这对应于FABE的显著积聚；表达南极假丝酵母(C.antarctica)的菌株积聚少得多的酯。对于畸形假丝酵母(C.deformans)表达菌株，当使用弱启动子表达脂肪酶基因时，总异丁醇产量相当于无脂肪酶对照；当使用强启动子时，总异丁醇产量比对照高24％。
表18：在指示菌株摇瓶培养物的水相和有机相中的异丁醇(iBuOH) 和脂肪酸异丁酯(FABE)的测得量。
Figure BDA0000432348610000871
实例15
在酵母中表达塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)LIP3脂肪酶
合成编码塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)LIP3脂肪酶的DNA(DNA2.0)，该合成使用经优化用于在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中表达的密码子。使用引物Atublip1和AtubLip2(分别是SEQ ID NO：229和230)，利用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs)扩增这个DNA。将PCR产物连同缺口质粒pNAK33(TEF1(M2)启动子)、pNAK34(TEF1(M4)启动子)、和pNAK35(TEF1(M6)启动子)(分别是SEQ ID NO：231、232、和233)一起转化到酵母菌株PNY1500中。将转化反应涂布到SCD-His培养基；表现出测试阳性的菌落在甘油三丁酸酯平板上表达脂肪酶活性。从这些分离物(Yeast Plasmid Miniprep试剂盒，ZymoResearch)中拯救质粒并转化到大肠杆菌DH5α中并进行纯化。序列分析示出塔宾曲霉(A.tubingensis)脂肪酶转基因的期望核苷酸序列。它们分别对于TEF1(M2)、TEF1(M4)、和TEF1(M6)启动子变体((分别是SEQ ID NO：234、235、和236))分别命名为pTVAN9、pTVAN4、和pTVAN10。
表达脂肪酶的菌株PNY1055(pTVAN9)、PNY1056(pTVAN4)、和PNY1057(pTVAN10)以及野生型对照菌株(PNY827)在30℃和250rpm条件下孵育的250mL通气顶盖烧瓶中的50mL SCD-His培养基中生长过夜。第二天早晨，将22mL培养物转移到125mL烧瓶(密封顶盖)中，加入1.75mL葡萄糖(500g／L)，2.5mL10X YEP(100g／L酵母提取物，200g／L蛋白胨)，和0.313mL异丁醇。取出样品，随后加入10.3mL COFA和无菌搅拌棒，送回烧瓶进行孵育。在24小时后取出样品(5mL)进行HPLC和GC分析，并且加入1.75mL葡萄糖和0.313mL异丁醇。在96小时后取出第二样品。如上所述分析样品。表达脂肪酶的菌株能够将异丁醇酯化成FABE；在96小时，由这些菌株形成的FABE量比由对照菌株形成的FABE量多十倍。如上所示，通过具有中等强度的驱动脂肪酶转录的启动子的菌株形成最大量的FABE。
表19：在指示菌株摇瓶培养物的水相和有机相中的异丁醇(iBuOH) 和脂肪酸异丁酯(FABE)的测得量。
实例16
在酵母中表达的脂肪酶糖基化的基因去除
N-糖基化序列匹配天冬酰胺酰糖基化的共有位点，N-X-S／T(DrickamerK&Taylor ME(2006)Introduction to Glycobiology(第2版)OxfordUniversity Press，USA)，它们在LIP1和CalB中鉴定。LIP1具有两个糖基化位点(在残基146的NIS和在残基167的NNT)，并且CalB具有一个糖基化位点(在残基99的NDT)。如下所述通过在所有情况下用A替换N的定点诱变(并且用于在LIP1中形成双突变体)改变这些。
使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis试剂盒(Strategene，La JollaCA)，根据制造商的说明书进行诱变，组合以下质粒和引物：
Figure BDA0000432348610000891
在使用与试剂盒一起提供的热稳定聚合酶，利用诱变引物扩增质粒主链后，用DpnI限制性内切核酸酶消化DNA。将处理后的质粒转化到大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞中，并且使用Qiaprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)回收。通过对诱变质粒的DNA序列分析鉴定突变的克隆。质粒分别命名为pTVAN20、pTVAN25、pTVAN26、和pTVAN27。将质粒(和具有野生型脂肪酶基因的对照质粒)转化到PNY1500酵母菌株中。
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Claims (48)

1.方法，包括：
提供发酵培养基，所述发酵培养基包含来源于生物质原料的可发酵碳底物、产自来源于生物质原料的可发酵碳底物的醇和醇生产酵母微生物，其中所述醇生产微生物包含编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸，并且所述微生物表达并展示或分泌所述多肽，使得所述发酵培养基中存在所述脂肪酶活性；
使所述发酵培养基与羧酸接触；
其中所述脂肪酶活性以在细胞外将由所述微生物产生的醇的至少一部分转化成醇酯的足够量存在于所述发酵培养基中。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括使所述发酵培养基与提取剂接触以形成包括水相和有机相的两相混合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述提取剂包括所述羧酸。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产物醇是C2-C8烷基醇。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产物醇是乙醇。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述醇酯包括脂肪酸乙酯。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述产物醇是丁醇。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述醇酯包括脂肪酸丁酯。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述醇酯还包括脂肪酸乙酯。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽在所述酵母微生物的表面上展示。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID NO：249、250、251、252、253或它们的片段中的任何一个具有至少约70％同一性的序列。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸包含与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、8、9、46、48、50、52、54、255、271或273的多核苷酸具有至少约70％同一性的序列。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含与具有SEQ ID NO：2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或274的多肽或它们的活性片段具有至少约70％同一性的序列。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽不包含糖基化基序。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽是没有糖基化的。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述羧酸包括游离脂肪酸，所述游离脂肪酸来源于玉米油、低芥酸菜子油、棕榈油、亚麻籽油、麻风树油、或大豆油。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述羧酸来源于与所述可发酵碳底物相同的生物质原料。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述羧酸包括具有C12-C22直链或支化的脂肪链的羧酸。
19.根据权利要求2—18中任一项所述的方法，其中所述与提取剂的接触和所述与羧酸的接触同时发生。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少约60％有效滴度的由所述微生物产生的醇被转化成醇酯。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基还包含甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合，并且其中所述脂肪酶活性使所述甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合的至少一部分水解以形成游离脂肪酸。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述在发酵期间产生的醇的有效滴度大于由不包含编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸的醇生产微生物在发酵期间产生的醇的有效滴度，并且所述微生物表达并分泌或展示所述多肽，使得所述发酵培养基中存在所述脂肪酶活性。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述在发酵期间产生的醇的有效速率大于由不包含编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸的醇生产微生物在发酵期间醇产生的速率，并且所述微生物表达并分泌或展示所述多肽，使得所述发酵培养基中存在所述脂肪酶活性。
24.重组宿主细胞，包含：
工程化的醇生产途径；和
工程化的多核苷酸，其编码具有脂肪酶活性的多肽。
25.根据权利要求24所述的重组宿主细胞，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID NO：2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或274或它们的活性片段具有至少约70％同一性的序列。
26.根据权利要求24或25所述的重组宿主细胞，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID NO：249、250、251、252、253或它们的片段中的任何一个具有至少约70％同一性的序列。
27.根据权利要求26所述的重组宿主细胞，其中所述具有脂肪酶活性的多肽不包含糖基化基序。
28.根据权利要求24-27中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述具有脂肪酶活性的多肽是没有糖基化的。
29.根据权利要求24所述的重组宿主细胞，其中所述编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、8、9、46、48、50、52、54、255、271或273具有至少约70％同一性的序列。
30.重组宿主细胞，包含：
醇生产途径；和
工程化的多核苷酸，其编码具有脂肪酶活性的多肽，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID NO：2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或274或它们的活性片段具有至少约70％同一性的序列。
31.根据权利要求30所述的重组宿主细胞，其中所述具有脂肪酶活性的多肽还包含与SEQ ID NO：249、250、251、252、253或它们的片段中的任何一个具有至少约70％同一性的序列。
32.根据权利要求24—31中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述醇生产途径是丁醇生产途径。
33.根据权利要求32所述的重组宿主细胞，其中所述丁醇生产途径是异丁醇生产途径。
34.根据权利要求24—33中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含减少的或消除的丙酮酸脱羧酶活性。
35.提高醇生产微生物对所产生醇的耐受性的方法，所述方法包括：
工程化微生物以表达并分泌或展示具有脂肪酶活性的多肽；
在使得所述微生物产生醇的条件下，使所述工程化的微生物与下列接触：
甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、磷脂、游离脂肪酸、或它们的混合物；以及
碳底物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中使所述工程化的微生物与甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合接触，并且其中所述分泌的或展示的脂肪酶将所述甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合的至少一部分转化成游离脂肪酸。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述脂肪酶催化醇酯的形成。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述微生物产生的醇的有效滴度大于由未经工程化以表达并分泌具有脂肪酶活性的多肽的微生物产生的醇的有效滴度。
39.根据权利要求35—38中任一项所述的方法，其中所述醇生物合成途径是工程化的醇生物合成途径。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述工程化的醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
丙酮酸至乙酰乳酸；
乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；
2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；
2-酮异戊酸至异丁醛；以及
异丁醛至异丁醇。
42.在发酵期间生产丁酯的方法，包括：
提供发酵培养基，所述发酵培养基包含碳底物以及甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的混合物；以及
使所述发酵培养基与包含丁醇生物合成途径的醇生产微生物接触，其中所述微生物还包含编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸，并且所述微生物表达并分泌或展示所述多肽，使得所述发酵培养基中存在所述脂肪酶活性。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述发酵培养基还包含一种或多种羧酸。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述碳底物来源于生物质。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述生物质是玉米或甘蔗。
46.根据权利要求42所述的方法，其中所述碳底物以及所述甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂均来源于所述相同的生物质。
47.发酵培养基，包含醇生产微生物、丁酯和丁醇，所述醇生产微生物包含丁醇生物合成途径并且还包含编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸，所述多肽被表达并分泌或展示。
48.动物饲料产品，包含权利要求24—34中任一项的微生物。
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