ES2575413T3

ES2575413T3 - Cetol-ácido reductoisomerasa que utiliza NADH

Info

Publication number: ES2575413T3
Application number: ES13177890.4T
Authority: ES
Inventors: Yougen Li; Mark J. Nelson; Der-Ing Liao; Daniel P. O'keefe
Original assignee: Butamax Advanced Biofuels LLC
Current assignee: Butamax Advanced Biofuels LLC
Priority date: 2007-12-20
Filing date: 2008-12-18
Publication date: 2016-06-28
Anticipated expiration: 2028-12-18
Also published as: WO2009085953A2; EP2677028A1; EP2222841B1; US20120115197A1; ES2553726T3; US8895307B2; US20090163376A1; EP2222841A2; US20130072394A1; US8222017B2; BRPI0819541A2; CA2709372A1; EP2677028B1; WO2009085953A3; US8129162B2

Abstract

Una enzima cetol-ácido reductoisomerasa como se expone en la ID de SEC Nº: 17, en la que a) el resto 52 se muta; o b) los restos 47, 50 y 52 se mutan; o c) el resto 52 y al menos un resto seleccionado del grupo que consiste en 24, 33, 53, 61, 80, 115, 156, 165 y 170 se mutan; o d) los restos 47, 50, 52 y al menos un resto seleccionado del grupo que consiste en 24, 33, 53, 61, 80, 115, 156, 165 y 170 se mutan; y en la que dicha enzima cetol-ácido reductoisomerasa en el que dicha enzima cetol-ácido reductoisomerasa tiene una preferencia por la unión NADH en lugar de por NADPH, y en donde dicha mutación es una sustitución de aminoácidos.

Description

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Figura 5 -(a) Actividades KARI de mejor desempeño de las bibliotecas E, F y G que utilizan cofactores NADH frente a NADPH. (b) actividades KARI de control positivo frente a Pf5-ilvC de tipo silvestre que utilizan cofactores NADH. La actividad y la desviación estándar se derivaron de al menos tres experimentos paralelos. "Wt" representa el tipo silvestre de Pf5-ilvC y "Neg" significa control negativo.

Los experimentos de las reacciones NADH y NADPH en (a) duraron 30 minutos; en (b) duraron 10 minutos.

Figura 6 -Actividades de mejor desempeño de la biblioteca H que utilizan cofactores NADH frente NADPH. La actividad y la desviación estándar se derivaron de experimentos triples. La información de la mutación es la siguiente: 24F9 = R47P/S50G/T52D; 68F10 = R47P/T52S; 83G10 = R47P/S50D/T52S; 39G4 = R47P/S50C/T52D; 91A9 = R47P/S50CT52D; y C3B11 = R47F/S50A/T52D/V53W

Figura 7 -Termoestabilidad de PF5-ilvC. La actividad restante de la enzima después de calentar a ciertas temperaturas durante 10 min era el número promedio de experimentos triples y se normalizó a la actividad medida a temperatura ambiente.

Figura 8 -Alineamiento múltiple de secuencias entre 5 moléculas KARI que existen en la naturaleza. Las posiciones resaltadas en negrita y gris fueron identificados por PCR propensa a error y de las posiciones solo resaltadas en gris fueron objeto de mutagénesis.

Figura 9 -Alineamiento de las veinticuatro secuencias KARI funcionalmente verificadas. El motivo GxGXX(G/A) involucrado en la unión de NAD(P)H se indica debajo del alineamiento.

Figura 10 -Un ejemplo del alineamiento de Pf5-KARI Pseudomonas fluorescens para el perfil HMM de KARI. Las once posiciones que son responsables de conmutación del co-factor están en negrita y sombreadas en gris.

Tabla 9-es una tabla del perfil HMM de las enzimas KARI descritas en el Ejemplo 5. Los once posiciones en el perfil HMM que representan las columnas en el alineamiento que corresponden a las once posiciones de conmutación del cofactor en Pf-5-KARI Pseudomonas fluorescens están identificadas como posiciones 24, 33, 47, 50, 52, 53, 61, 80, 115, 156 y 170. Las líneas correspondientes a estas posiciones en el archivo de modelo se resaltan en amarillo. La Tabla 9 se presenta adjunta electrónicamente.

Las siguientes secuencias se ajustan a 37 C.F.R. 1.821-1.825 ("Requisitos para las solicitudes de patente que contienen secuencias de nucleótidos y/o divulgaciones de secuencias de aminoácidos -las Reglas de Secuencias") y son compatibles con la Norma ST.25 (1998) de la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual (WIPO) y los requisitos del listado de secuencias de los de EPO y PCT (Reglas 5.2 y 49.5 (a-bis), y la Sección 208 y el Anexo C de las Instrucciones Administrativas). Los símbolos y formato utilizados para los datos de secuencias de nucleótidos y aminoácidos cumplen con las reglas establecidas en 37 CFR §1.822.

Tabla 1

Cebadores de oligonucleótidos utilizados en esta invención

Cebadores de oligonucleótidos utilizados en esta invención

ID de SECUENCIA No.: SECUENCIA Descripción

1: TGATGAACATCTTCGCGTATTCGCCGTCCT Cebador inverso para el vector pBAD

2: imagen4 Cebador directo de biblioteca C

3: imagen5 Cebador directo de biblioteca E

4: imagen6 Cebador directo de biblioteca F

5: imagen7 Cebador directo de biblioteca G

6: imagen8 Cebador directo de biblioteca H

7: AAGATTAGCGGATCCTACCT Cebador de secuenciación

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Cebadores de oligonucleótidos utilizados en esta invención

ID de SECUENCIA No.: SECUENCIA Descripción

(directo)

8: AACAGCCAAGCTTTTAGTTC Cebador de secuenciación (inverso)

20: CTCTCTACTGTTTCTCCATACCCG pBAD_266-021308f

21: CAAGCCGTGGGCTTCAGCCTTGGCKNN PF5_53Mt022908r

22: CGGTTTCAGTCTCGTCCTTGAAG pBAD_866-021308

49: GCTCAAGCANNKAACCTGAAGG pBAD-405-C33_090808f

50: CCTTCAGGTTKNNTGCTTGAGC pBAD-427-C33_090808r

51: GTAGACGTGNNKGTTGGCCTG pBAD-435-T43_090808f

52: CAGGCCAACKNNCACGTCTAC pBAD-456-T43_090808r

53: CTGAAGCCNNKGGCNNKAAAGTGAC pBAD-484H59L61_090808f

54: GTCACTTTKNNGCCKNNGGCTTCAG pBAD-509H59L61_090808r

55: GCAGCCGTTNNKGGTGCCGACT pBAD-519-A71_090808f

56: AGTCGGCACCKNNAACGGCTGC pBAD-541-A71_090808r

57: CATGATCCTGNNKCCGGACGAG pBAD-545-T80_090808f

58: CTCGTCCGGKNNCAGGATCATG pBAD-567-T80_090808r

59: CAAGAAGGGCNNKACTCTGGCCT pBAD-608-A101_090808f

60: AGGCCAGAGTKNNGCCCTTCTTG pBAD-631-A101_090808r

61: GTTGTGCCTNNKGCCGACCTCG pBAD-663-R119_090808f

62: CGAGGTCGGCKNNAGGCACAAC pBAD-685-R119_090808r

Las secuencias adicionales utilizadas en la aplicación se enumeran a continuación. En esta divulgación se utilizan los nombres abreviados de los genes entre paréntesis.

ID de SEC Nº: 9: Methanococcus maripaludis C5-ilvC (MMC5) -Número de Acceso al Banco de Genes NC_009135.1 Región: 901034..902026

5 ID de SEC Nº: 10: es la Methanococcus maripaludis S2-ilvC (MMS2) -Número de Acceso al Banco de Genes NC_005791.1 Región: 645729..646721

ID de SEC Nº: 11: es la Methanococcus vannielii SB-ilv5 (MVSB) -Número de Acceso al Banco de Genes NZ_AAWX01000002.1 Región: 302214..303206

ID de SEC Nº: 12: es la Saccharomyces cerevisiae ilv5 (ilv5) -Número de Acceso al Banco de Genes NC_001144.4 10 Región: 838065..839252

ID de SEC Nº: 13: es la Sulfolobus solfataricus P2 ilvC (KARI-D1) -Número de Acceso al Banco de Genes NC_002754.1 Región: 506253..507260

ID de SEC Nº: 14: es la Pyrobaculum aerophilum str. IM2 ilvC (KARI-D2) -Número de Acceso al Banco de Genes NC_003364.1 Región: 1976281..1977267

15 ID de SEC Nº: 15: es la Ralstonia solanacearum GMI1000 ilvC (KARI-S1) -Número de Acceso al Banco de Genes NC_003295.1 Región: 2248264..2249280

ID de SEC Nº: 16: es la Pseudomonas aeruginosa PAO1 ilvC -Número de Acceso al Banco de Genes NC_002516 Región: 5272455..5273471

ID de SEC Nº: 17: es la Pseudomonas fluorescens PF5 ilvC -Número de Acceso al Banco de Genes NC_004129 20 Región: 6017379..6018395

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ID de SEC Nº: 18: es la Spinacia oleracea ilvC (Spinach-KARI) -Número de Acceso al Banco de Genes NC_002516

Región: 1..2050. ID de SEC Nº: 19: es la secuencia de aminoácidos del mutante (Y24F/R47Y/S50A/T52D/V53A/L61F/G170A) de la proteína nativa ilvC de Pseudomonas fluorescens.

SEQ ID NO: 23 es la SEC de ADN del mutante (Y24F/R47Y/S50A/ T52D/V53A/L61 F/ G170A) de la proteína nativa ilvC de Pseudomonas fluorescens. ID de SEC Nº: 24: es la SEC de aminoácidos de la ZB1 mutante (Y24F/R47Y/S50A/T52D/V53A/L61 F/A156V) ID de SEC Nº: 25: es la SEC de aminoácidos de la ZF3 mutante (Y24F/C33L/R47YIS50A/T52D/V53A/L61F) ID de SEC Nº: 26: es la SEC de aminoácidos de la ZF2 mutante (Y24F/C33L/R47Y/S50AIT52D/V53A/L61 F/A156V)

ID de SEC Nº: 27: es la SEC de aminoácidos de la ZB3 mutante (Y24F/C33L/R47Y/S50A/T52D/V53A/L61F/G170A) ID de SEC Nº: 28: es la SEC de aminoácidos del Z4B8 mutante (C33L/R47Y/S50A/T52D/V53A1L61F/T801IA156V/G170A)

ID de SEC Nº: 29: es una secuencia de aminoácidos de consenso que comprende todas las mutaciones puntuales KARI verificadas experimentalmente basadas en la ID de SEC Nº: 17. ID de SEC Nº: 30: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Natronomonas pharaonis DSM 2160 ID de SEC Nº: 31: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 ID de SEC Nº: 32: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 ID de SEC Nº: 33: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Phaeospirilum molischianum ID de SEC Nº: 34: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Zymomonas mobilis subsp. mobilis ZM4 ID de SEC Nº: 35: es la secuencia de aminoácidos para KARI Alkalilimnicola ehrlichei MLHE-1 ID de SEC Nº: 36: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Campylobacter lari RM2100 ID de SEC Nº: 37: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Marinobacter aquaeolei VT8 ID de SEC Nº: 38: es la secuencia de aminoácidos para KARI Psychrobacter arcticus 273-4 ID de SEC Nº: 39: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Hahella chejuensis KCTC2396 ID de SEC Nº: 40: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Thiobacillus denitrificans ATCC25259 ID de SEC Nº: 41: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Azotobacter vinelandii AvOP ID de SEC Nº: 42: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Pseudomonas syringae pv. syringae B728a ID de SEC Nº: 43: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000 ID de SEC Nº: 44: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Pseudomonas putida KT2440 ID de SEC Nº: 45: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Pseudomonas entomophila L48 ID de SEC Nº: 46: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Pseudomonas mendocina ymp ID de SEC Nº: 47: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Bacillus cereus ATCC10987 NP_977840.1

ID de SEC Nº: 48: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Bacillus cereus ATCC10987 NP_978252.1 ID de SEC Nº: 63: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Escherichia coli-Número de Acceso al Banco de Genes P05793

ID de SEC Nº: 64: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Marine Gamma Proteobacterium HTCC2207 -

Número de Acceso al Banco de Genes ZP_01224863.1 ID de SEC Nº: 65: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Desulfuromonas acetoxidans -Número de Acceso al Banco de Genes ZP_01313517.1

ID de SEC Nº: 66: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Pisum sativum (Pea) -Número de Acceso al Banco de Genes 082043

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dihidroxi-isovalerato a -cetoisovalerato. Las acetohidroxiácido deshidratasas preferidas son conocidas por el número EC 4.2.1.9. Estas enzimas están disponibles a partir de en una amplia variedad de microorganismos, que incluyen, pero no se limitan a E. coli (Nº en el Banco de Genes: YP_026248, NC_000913, S. cerevisiae (Nº en el Banco de Genes: NP_012550, NC_001142), M. maripaludis (Nº en el Banco de Genes: CAF29874, BX957219), y B. subtilis (Nº en el Banco de Genes: CAB14105, Z99115).

La expresión "-cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada" se refiere a una enzima que cataliza la transformación de -cetoisovalerato a isobutiraldehido y CO2. Las -cetoácido descarboxilasas de cadena ramificada preferidas son conocidas por el número EC 4.1.1.72 y están disponibles a partir de una serie de fuentes, que incluyen, pero no se limitan a Lactococcus lactis (Nº en el Banco de Genes: AAS49166, AY548760; CAG34226, AJ746364, Salmonella typhimurium (Nº en el Banco de Genes: NP-461346, NC-003197), y Clostridium acetobutylicum (Nº en el Banco de Genes: NP-149189, NC-001988).

La expresión "alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada" se refiere a una enzima que cataliza la transformación de isobutiraldehido a isobutanol. Las alcohol deshidrogenasas de cadena ramificada preferidas son conocidas por el número EC 1.1.1.265, pero también pueden ser clasificadas bajo otras alcohol deshidrogenasas (específicamente, EC 1.1.1.1 o 1.1.1.2). Estas enzimas utilizan NADH (nicotinamida adenina dinucleótido reducida) y/o NADPH como donante de electrones y están disponibles a partir de una serie de fuentes, que incluyen, pero no se limitan a S. cerevisiae (Nº en el Banco de Genes: NP-010656, NC-001136; NP-014051, NC-001145), E. coli (Nº en el Banco de Genes: NP-417484, y C. acetobutylicum (Nº en el Banco de Genes: NP-349892, NC-003030).

La expresión "ceto ácido deshidrogenasa de cadena ramificada" se refiere a una enzima que cataliza la transformación de -cetoisovalerato a isobutiril-CoA (isobutiril-cofactor A), utilizando NAD+ (nicotinamida adenina dinucleótido) como aceptor de electrones. Las cetoácido deshidrogenasas de cadena ramificada preferidas son conocidas por el número EC 1.2.4.4. Estas cetoácido deshidrogenasas de cadena ramificada comprenden cuatro subunidades, y las secuencias de todas las subunidades están disponibles en una amplia variedad de microorganismos, que incluyen, pero no se limitan a B. subtilis (Nº en el Banco de Genes: CAB14336, Z99116; CAB14335, Z99116; CAB14334, Z99116, y CAB14337, Z99116) y Pseudomonas putida (Nº en el Banco de Genes: AAA65614, M57613; AAA65615, M57613; AAA65617, M57613, y AAA65618, M57613).

Los términos "kcat" y "Km" son conocidos por los expertos en la técnica y se describen en Enzyme estructure and Mechanism, 2ª ed. (Ferst; W.H. Freeman: NY, 1985; pág. 98-120). La expresión "kcat", a menudo llamado el "número de rotación", se define como el número máximo de moléculas de substrato transformadas a productos por sitio activo por unidad de tiempo, o el número de veces que la enzima da la vuelta por unidad de tiempo. kcat = Vmax/[E], donde [E] es la concentración de la enzima (Ferst, supra). Los términos "rotación total" y "número de rotación total" se utilizan en el presente documento para referirse a la cantidad de producto formado por la reacción de una enzima KARI con substrato.

La expresión "eficiencia catalítica" se define como la kcat/KM de una enzima. La eficiencia catalítica se utiliza para cuantificar la especificidad de una enzima por un substrato.

La expresión "molécula de ácido nucleico aislada", "fragmento de ácido nucleico aislado" y "construcción genética" se usan de forma intercambiable y significará un polímero de ARN o ADN que es monocatenario o bicatenario, que contiene opcionalmente, bases de nucleótidos sintéticas, no natural o alteradas. Un fragmento de ácido nucleico aislado en forma de un polímero de ADN puede estar compuesto de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico

o ADN sintético.

El término "aminoácido" se refiere a la unidad estructural química básica de una proteína o polipéptido. Las siguientes abreviaturas se usan en el presente documento para identificar aminoácidos específicos:

Aminoácido: Abreviaturas de tres letras Abreviaturas de una letra

Alanina: Ala A

Arginina: Arg R

Asparagina: Asn N

Ácido aspártico: Asp D

Cisteína: Cys C

Glutamina: Gln Q

Ácido glutámico: Glu E

Glicina: Gly G

Histidina: Su H

Leucina: Leu L

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de las 12 posiciones en Pseudomonas fluorescens Pf-5 que conmutan el cofactor de NADPH por NADH. Los once nodos, tal como se define en la sección de construcción del perfil HMM, en el perfil HMM que representan las columnas del alineamiento que corresponden a las once posiciones de conmutación del co-factor en Pseudomonas fluorescens Pf-5 KARI se identifican como nodo 24, 33, 47, 50, 52, 53, 61, 80, 115, 156 y 170. Las líneas correspondientes a estos nodos en el archivo del modelo son identificadas en la Tabla 9. Un experto en la técnica podrá identificar fácilmente estas 12 posiciones en la secuencia de aminoácidos de una proteína KARI a partir del alineamiento de la secuencia con el perfil HMM utilizando el programa de hmmsearch en el paquete HMMER.

Las enzimas KARI identificadas por este procedimiento, incluyen tanto las enzimas KARI de Clase I como de Clase II de fuentes naturales microbianas o de plantas. Cualquier KARI identificada por este procedimiento se puede utilizar para la expresión heteróloga en las células microbianas.

Por ejemplo, cada uno de los fragmentos de ácido nucleico que codifican KARI descrito en el presente documento pueden utilizarse para aislar genes que codifican proteínas homólogas. El aislamiento de genes homólogos utilizando protocolos dependientes de la secuencia es bien conocido en la técnica. Ejemplos de protocolos dependientes de la secuencia incluyen, pero no se limitan a: 1) procedimientos de hibridación de ácido nucleico; 2) procedimientos de amplificación de ADN y de ARN, como se ejemplifica mediante diversos usos de tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos [por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), Mullis et al., patente de EE.UU. No. 4.683.202; reacción en cadena de la ligasa (LCR), Tabor, S. et al., Proc. Acad. Sci. EE.UU. 82: 1074 (1985); o amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), Walker, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 392 (1992)]; y 3) procedimientos de construcción de bibliotecas y detección por complementariedad.

Aunque la homología de secuencia entre las enzimas KARI de Clase I y Clase II es baja, la estructura tridimensional de ambas clases de enzimas, particularmente alrededor del sitio activo y de los dominios de unión a nucleótido está altamente conservada (Tygai, R., et al., Protein Science, 34: 399-408, 2001). Los restos de aminoácidos clave que conforman el bolsillo de unión al substrato son altamente conservadas entre estas dos clases incluso aunque no puedan alienarse bien en una simple comparación de secuencias. Puede concluirse, por lo tanto, que los restos que afectan a la especificidad del cofactor identificados en la KARI Clase I (p. ej., las posiciones 24, 33, 47, 50, 52, 53, 61, 80, 115, 156, y 170 de PF5 KARI) pueden hacerse extensibles a las enzimas KARI Clase II.

Rutas biosintéticas del isobutanol

Los microorganismos que utilizan hidratos de carbono emplean la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), la ruta de Entner y Doudoroff y el ciclo de las pentosas fosfato como las rutas metabólicas centrales, rutas metabólicas que proporcionan energía y precursores celulares para el crecimiento y el mantenimiento. Estas rutas tienen en común el intermedio gliceraldehido-3-fosfato y, en última instancia, se forma piruvato directamente o en combinación con la ruta de EMP. Posteriormente, piruvato se transforma en acetil-cofactor A (acetil-CoA) a través de una variedad de medios. Acetil-CoA sirve como un intermedio clave, por ejemplo, en la generación de ácidos grasos, aminoácidos y metabolitos secundarios. Las reacciones combinadas de transformación de azúcar en piruvato producen energía (p. ej., adenosina-5'-trifosfato, ATP) y equivalentes de reducción (por ejemplo, nicotinamida adenina dinucleótido reducida, NADH, y nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducida, NADPH). NADH y NADPH se deben reciclar a sus formas oxidadas (NAD+ y NADP+, respectivamente). En presencia de aceptores de electrones inorgánicos (p.

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ej., O2, NO3 y SO42-), los equivalentes de reducción se pueden usar para aumentar el conjunto de energía; como alternativa, se puede formar un subproducto de carbono reducido.

Hay cuatro rutas potenciales para la producción de isobutanol a partir de fuentes de hidratos de carbono con microorganismos recombinantes como se muestra en la Figura 1. Todas las rutas potenciales para la transformación de hidratos de carbono en isobutanol se han descrito en la solicitud de patente de EE.UU. de propiedad común nº 11/586315.

La ruta preferida para la transformación de piruvato a isobutanol consta de etapas enzimáticos "a", "b", "c", "d" y "e" (Figura 1) e incluye las siguientes transformaciones de substrato a producto:

a) de piruvato a acetolactato, catalizada, por ejemplo, por acetolactato sintasa,

b) de (S)-acetolactato a 2,3-dihidroxiisovalerato, catalizada, por ejemplo, por acetohidroxiácido isomeroreductasa,

c) de 2,3-dihidroxiisovalerato a -cetoisovalerato, catalizada, por ejemplo, por acetohidroxiácido deshidratasa,

d) de -cetoisovalerato a isobutiraldehido, catalizada, por ejemplo, mediante un cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada, y

e) isobutiraldehido a isobutanol, catalizada, por ejemplo, un alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada.

Esta ruta combina enzimas implicadas en rutas bien caracterizadas para biosíntesis de valina (piruvato a cetoisovalerato) y el catabolismo de valina (-cetoisovalerato a isobutanol). Dado que muchas enzimas de biosíntesis de valina también catalizan reacciones análogas en la ruta de la biosíntesis de isoleucina, la especificidad del substrato es una consideración importante en la selección de las fuentes de genes. Por esta razón, los genes

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invención incluyendo, pero sin limitarse a CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (útiles para la expresión en Saccharomyces); AOX1 (útil para la expresión en Pichia); y lac, ara, tet, trp, IPL, IPR, T7, tac y trc (útiles para la expresión en Escherichia coli, Alcaligenes y Pseudomonas), así como los promotores amy, abr y npr, y diversos promotores de fagos útiles para la expresión en Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis y Paenibacillus macerans.

Regiones de control de terminación también se pueden derivar de diversos genes nativos para los anfitriones preferidos. Opcionalmente, un sitio de terminación puede ser innecesario, sin embargo, es más preferido si está incluido.

Ciertos vectores son capaces de replicarse en una amplia gama de bacterias anfitrionas y se pueden transferir por conjugación. Están disponibles la secuencia completa y anotada de pRK404 y las de tres vectores relacionados, pRK437, pRK442 y pRK442(H). Estos derivados han demostrado ser valiosas herramientas para la manipulación genética en bacterias Gram-negativas (Scott et al., Plasmid 50, 74-79, 2003). Varios derivados del plásmido de la amplia gama de anfitriones Inc P4 plasmid RSF1010 también están disponibles con promotores que pueden funcionar en una gama de bacterias Gram-negativas. Los plásmidos pAYC36 y pAYC37 tienen promotores activos junto con sitios de clonación múltiple para permitir la expresión de genes heterólogos en bacterias Gram-negativas.

También están ampliamente disponibles herramientas para la sustitución cromosómica de los genes. Por ejemplo, una variante termosensible del replicón pWV101 de una amplia gama de anfitrionas se ha modificado para construir un plásmido pVE6002 que se puede utilizar para efectuar la sustitución de genes en una gama de bacterias Grampositivas (Maguin et al., J. Bacteriol. 174, 5633-5638, 1992). Además, se dispone de transposomas in vitro para crear mutaciones aleatorias en una variedad de genomas de fuentes comerciales tales como EPICENTRE®.

La expresión de una ruta de biosíntesis de isobutanol en varios anfitrionas microbianas preferidas se describe con más detalle a continuación.

Expresión de una ruta biosintética de isobutanol en E. coli

Los vectores o casetes útiles para la transformación de E. coli son comunes y disponibles comercialmente de las empresas enumeradas anteriormente. Por ejemplo, los genes de una ruta biosintética de isobutanol se pueden aislar de diversas fuentes, clonado en un vector pUC19 modificado y transformado en E. coli NM522.

Expresión de una ruta biosintética de isobutanol en Rhodococcus erythropolis

Una serie de vectores lanzadera E. coli-Rhodococcus están disponibles para la expresión en R. erythropolis, que incluyen, pero no se limitan a pRhBR17 y pDA71 (Kostichka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 62, 61-68, 2003). Además, una serie de promotores están disponibles para la expresión génica heteróloga en R. erythropolis (Nakashima et al., Appl. Environ. Microbiol. 70, 5557-5568, 2004 y Tao et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 346354, 2005). La disrupción de genes diana de los genes cromosómicos en R. erythropolis puede ser creada utilizando el procedimiento descrito por Tao et al., supra, y Brans et al. (Appl. Environ. Microbiol. 66, 2029-2036, 2000).

Los genes heterólogos requeridos para la producción de isobutanol, como se describió anteriormente, pueden ser clonado inicialmente en pDA71 o pRhBR71 y transformados en E. coli. Los vectores pueden después ser transformados en R. erythropolis mediante electroporación, como se describe por Kostichka et al., supra. Los recombinantes pueden cultivarse en un medio sintético que contiene glucosa y la producción de isobutanol se puede seguir utilizando procedimientos conocidos en la técnica.

Expresión de una ruta biosintética de isobutanol en B. subtilis

Los procedimientos para la expresión génica y la creación de mutaciones en B. subtilis son también bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los genes de una ruta biosintética de isobutanol se pueden aislar de diversas fuentes, clonados en un vector pUC19 modificado y transformados en Bacillus subtilis BE1010. Además, los cinco genes de una ruta biosintética de isobutanol se pueden dividir en dos operones para la expresión. Los tres genes de la ruta (bubB, ilvD y kivD) pueden integrarse en el cromosoma de Bacillus subtilis BE1010 (Payne, et al., J. Bacteriol. 173, 2278-2282, 1991). Los dos genes restantes (ilvC y bdhB) pueden clonarse en un vector de expresión y transformarse en la cepa de Bacillus que lleva los genes de isobutanol integrados.

Expresión de una ruta biosintética de isobutanol en B. licheniformis

La mayoría de los plásmidos y vectores lanzadera que se replican en B. subtilis pueden utilizarse para transformar

B. licheniformis por cualquier transformación o electroporación de protoplastos. Los genes requeridos para la producción de isobutanol se pueden clonar en plásmidos pBE20 o derivados de pBE60 (Nagarajan et al., Gene 114, 121-126, 1992). Los procedimientos para transformar B. licheniformis son conocidos en la técnica (Fleming et al. Appl. Environ. Microbiol., 61, 3775-3780, 1995). Los plásmidos construidos para expresión en B. subtilis pueden ser transformados en B. licheniformis para producir una anfitriona microbiana recombinante que produce isobutanol.

Expresión de una ruta biosintética de isobutanol en Paenibacillus macerans

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Zymo Research, Orange, CA) según lo recomendado por el fabricante. Tabla 2 -Genotecas

Nombre de la biblioteca: Patrones Posición o posiciones de direccionamiento de Pf5_ilvC Cebadores usados

C: PF5_ilvc 47, 50, 52 y 53 ID de SEC Nº:

E: PF5_ilvc 47 ID de SEC Nº:

F: PF5_ilvc 50 ID de SEC Nº:

G: PF5_ilvc 52 ID de SEC Nº:

H: PF5_ilvc 47, 50 y 52 ID de SEC Nº:

N: Buenos mutantes de la biblioteca C 53 ID de SEC Nº:

O: Buenos mutantes de la biblioteca H 53 ID de SEC Nº:

Los MegaCebadores se utilizaron después para generar genotecas utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange II XL (nº de Catálogo 200524, Stratagene, La Jolla CA). Una mezcla de reacción de 50 μl contenía: 5,0 5 μl de 10 veces tampón de reacción, 1,0 μl de 50 ng/μl de molde, 42 μl de MegaCebador, 1.0 μl de mezcla dNTP 40 mM, 1,0 μl de Pfu-Ultra ADN polimerasa. Excepto por el MegaCebador y los moldes, todos los reactivos utilizados en el presente documento fueron suministrados con el kit indicado anteriormente. Esta mezcla de reacción se colocó en un tubo de PCR de capacidad 200 μl de pared delgada y se utilizaron las siguientes reacciones para la PCR: La temperatura de partida era de 95ºC durante 30 s seguido por 25 ciclos de calentamiento/enfriamiento. Cada ciclo 10 consistía en 95ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 min y 68ºC durante 6 min. A la finalización de los ciclos de temperatura, las muestras se mantuvieron a 68ºC durante 8 min más, y después se mantuvieron a 4ºC para el procesamiento posterior. Enzima de restricción Dpn I (1,0 μl) (suministrada con el kit anterior) se añadía directamente a la mezcla de reacción terminada, la digestión enzimática se realizó a 37ºC durante 1 hora y el producto de PCR se limpió utilizando un kit de limpieza de ADN (Zymo Research). El producto de PCR limpiado (10

15 μl) contenía genes mutados para una genoteca.

El producto de PCR limpiado fue transformado en una cepa electro-competente de E. coli Bw25113 (ΔilvC) utilizando un BioRad Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA). Los clones transformados fueron rayados sobre placas con agar que contenían el medio Luria Broth y 100 μg/ml de ampicilina (nº de Catálogo L1004, Teknova Inc. Hollister, CA) y se incubaron a 37ºC durante la noche. Decenas de clones fueron escogidos al azar para la

20 secuenciación de ADN para confirmar la calidad de la biblioteca.

Tabla 3

Lista de algunos mutantes que tienen actividades NADH identificadas desde las bibliotecas de saturación

Mutante: Posición 47 Posición 50 Posición 52 Posición 53

SD2: R47Y S50A T52H V53W

SB1: R47Y S50A T52G V53W

SE1: R47A S50W T52G V53W

SH2: R47N S50W T52N V53W

SB2: R47I T52G V53W

SG1: R47Y T52G V53W

SB3: R47G S50W T52G V53W

SE2: R47P S50E T52A V53W

SD3: R47L S50W T52G V53W

C2A6: R47I S50G T52D V53W

C3E11: R47A S50M T52D V53W

C3A7: R47Y S50A T52D V53W

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Mutante: Posición 47 Posición 50 Posición 52 Posición 53

C3B11: R47F S50A T52D V53W

C4A5: R47Y S50A T52S V53W

C3B12: R47I T52D V53W

C4H7: R47I T52S V53W

C1D3: R47G S50M T52D V53W

C4D12: R47C S50W T52G V53W

C1G7: R47P S50G T52D V53W

C2F6: R47P S50V T52D V53W

C1C4: R47P S50E T52S V53W

6924F9: R47P S50G T52D

6881E11: R47P S50N T52C

6868F10: R47P T52S

6883G10: R47P S50D T52S

6939G4: R47P S50C T52D

11463D8: R47P S50F T52D

9667A11: R47N S50N T52D V53A

9675C8: R47Y S50A T52D V53A

9650E5: R47N S50W T52G V53H

9875B9: R47N S50N T52D V53W

9862B9: R47D S50W T52G V53W

9728G11: R47N S50W T52G V53W

11461D8: R47F S50A T52D V53A

11461A2: R47P S50F T52D V53I

Ejemplo 2

Construcción de bibliotecas de PCR propensas a error

Varias series de bibliotecas de PCR propensas a error (epPCR) se crearon utilizando el kit GeneMorph II (Stratagene) según lo recomendado por el fabricante. Todas las bibliotecas epPCR se dirigen al N-terminal de 5 PF5_KARI. El cebador directo (ID de SEC Nº: 20) y el cebador inverso (ID de SEC Nº: 22) se utilizaron para todas las bibliotecas ePCR.

Los moldes de ADN para cada biblioteca epPCR eran mutantes con relativamente buenas actividades NADH a partir de la biblioteca anterior. Por ejemplo: los moldes de ADN para la n-ésima biblioteca epPCR eran mutantes con buenas actividades de NADH a partir de la (n-1)-ésima biblioteca epPCR. Los moldes de la primera biblioteca 10 epPCR eran mutantes con relativamente buenas actividades de NADH a partir de bibliotecas de N y O. La tasa de mutaciones de la biblioteca obtenida con este kit fue controlada mediante la cantidad de molde añadido en la mezcla de reacción y el número de ciclos de amplificación. Típicamente, se utilizó 1,0 ng de cada molde de ADN en 100 μl de mezcla de reacción. El número de ciclos de amplificación era de 70. Las condiciones siguientes se utilizaron para la reacción de PCR: La temperatura de partida era de 95ºC durante 30 s seguido por 70 ciclos de 15 calentamiento/enfriamiento. Cada ciclo consistía en 95ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 min, y 70ºC durante 2 min. Después de que los primeros 35 ciclos de calentamiento/enfriamiento terminaron, se añadieron más dNTP y ADN polimerasa Mutazyme II. El producto de PCR se limpió utilizando un kit de limpieza de ADN (nº de Catálogo D4003, Zymo Research, Orange, CA) según lo recomendado por el fabricante. El producto de PCR limpiado se trató como megacebador y se introdujo en el vector utilizando el kit Quickchange como se describe en el Ejemplo 1. La

20 Tabla 4 siguiente enumera los mutantes KARI obtenidos y la mejora significativa observada en sus uniones NADH. La Km se redujo desde 1.100 μM para el C3B11 mutante hasta 50 μM para 12957G9 mutante.

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Ejemplo 5

Identificación de los aminoácidos implicados en la unión del cofactor en KARI para conmutar la especificidad del cofactor utilizando herramientas bioinformáticas

Para descubrir si las secuencias KARI existentes en la naturaleza podrían proporcionar pistas para las posiciones de 5 aminoácidos que deberían ser objeto de mutagénesis, se realizó el alineamiento múltiple de secuencias (MSA) utilizando PF5-KARI, su cercano homólogo PA01_KARI y tres secuencias KARI con actividad NADH medible, es decir, B. Cereus ilvC1 e ilvC2 y espinaca KARI (Fig. 8). Sobre la base del alineamiento múltiple de secuencias, las posiciones 33, 43, 59, 61, 71, 80, 101, y 119 fueron seleccionados para la mutagénesis de saturación. Mutagénesis de saturación en todas estas posiciones se realizó simultáneamente utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio 10 QuickChange II XL (nº de Catálogo 200524, Stratagene, La Jolla CA) con el protocolo sugerido por el fabricante. El material de partida para esta mutagénesis era un molde mixto consistente en mutantes ya identificados en la Tabla 4 y en el Ejemplo 2. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 5. La biblioteca de mutantes obtenidos de este modo fueron nombrados biblioteca Z". Los mutantes con buena actividad NADH de esta biblioteca se identificaron utilizando cribado de alto rendimiento y su actividad KARI y la Km para NADH se midieron como se describió 15 anteriormente. Estos mutantes (enumerados en la Tabla 6) poseen Km mucho menores para NADH en comparación con los moldes de los padres (Tabla 4). Se creó un megacebador utilizando cebadores (ID de SEC Nº. 20 y 58) y mutaciones en las posiciones 156 y 170 fueron eliminadas. El cribado posterior de este conjunto de mutantes identificó el mutante 3361 G8 (ID de SEC Nº: 67) (Tabla 7). Los aciertos de la biblioteca Z fueron sometidos además a mutagénesis de saturación en la posición 53 utilizando cebadores (ID de SEC Nº 20 y 21), y el cribado posterior 20 identificó los mutantes restantes en la Tabla 7. Como se muestra en la Tabla 7, los nuevos mutantes poseían mucha menor Km para NADH (p. ej., 4,0 a 5,5 μM) en comparación con los mutantes enumerados en la Tabla 6 (p. ej., 14-40 μM).

Tabla 5

Cebadores para el Ejemplo 5

Posición o Posiciones dirigidas de Pf5_ilvC: Cebadores

33: pBAD-405-C33_090808f: GCTCAAGCANNKAACCTGAAGG (ID de SEC Nº: 49) pBAD-427-C33_090808r: CCTTCAGGTTKNNTGCTTGAGC (ID de SEC Nº: 50)

43: pBAD-435-T43_090808f:GTAGACGTGNNKGTTGGCCTG (ID de SEC Nº: 51) pBAD-456-T43_090808r:CAGGCCAACKNNCACGTCTAC (ID de SEC Nº: 52)

59 y 61: pBAD-484-H59L61_090808f:CTGAAGCCNNKGGCNNKAAAGTGAC (ID de SEC Nº: 53) pBAD-509-H59L61_090808r:GTCACTTTKNNGCCKNNGGCTTCAG (ID de SEC Nº: 54)

71: pBAD-519-A71_090808f: GCAGCCGTTNNKGGTGCCGACT (ID de SEC Nº: 55) pBAD-541-A71_090808r: AGTCGGCACCKNNAACGGCTGC (ID de SEC Nº: 56)

80: pBAD-545-T80_090808f: CATGATCCTGNNKCCGGACGAG (ID de SEC Nº: 57) pBAD-567-T80_090808r: CTCGTCCGGKNNCAGGATCATG (ID de SEC Nº: 58)

101: pBAD-608-A101_090808f: CAAGAAGGGCNNKACTCTGGCCT (ID de SEC Nº: 59) pBAD-631-A101_090808r: AGGCCAGAGTKNNGCCCTTCTTG (ID de SEC Nº: 60)

119: pBAD-663-R119_090808f: GTTGTGCCTNNKGCCGACCTCG (ID de SEC Nº: 61) pBAD-685-R119_090808r: CGAGGTCGGCKNNAGGCACAAC (ID de SEC Nº: 62)

Tabla 6

Lista de algunos mutantes con sus valores de Km medidos (las posiciones mutadas en esos mutantes se identificaron mediante herramientas bioinformáticas)

Mutante: Posiciones de la Mutación NADH Km (µM)

ZB1: Y24F/R47Y/S50A/T52D/V53A/L61F/A156V (ID de SEC Nº: 24) 40

ZF3: Y24F/C33L1R47Y/S50A/T52D/V53A/L61F (ID de SEC Nº: 25) 21

ZF2: Y24F/C33L/R47Y/S50A/T52D/V53A/L61F/A156V (ID de SEC Nº: 26) 17

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Claims

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