CN110396509B - 改变葡萄糖脱氢酶的辅酶活性和偏好性的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种改变葡萄糖脱氢酶的辅酶活性和偏好性的方法及其应用，涉及基因工程技术领域。本发明所述方法通过对葡萄糖脱氢酶保守序列GXXXGXG第四位氨基酸进行定点突变，无需通过大量筛选就可以简单直接获得改变辅酶活性和偏好性的突变蛋白，可以广泛应用酶催化辅酶再生反应。在本发明实施例中，通过对不同来源的葡萄糖脱氢酶中广泛存在的保守序列GXXXGXG中与烟酰胺辅酶核糖2’‑磷酸结合的第4位氨基酸进行定点突变，最终得到四种葡萄糖脱氢酶突变体T17G、T17K、T17R以及K17G，且经过验证，其酶活以及偏好性等都发生了变化。

Description

改变葡萄糖脱氢酶的辅酶活性和偏好性的方法及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种改变葡萄糖脱氢酶的辅酶活性和偏好性的方法及其应用。
背景技术
氧化还原酶是一类催化氧化还原反应的酶，有氧化性和还原性两种形式。在所有的氧化还原酶中大约80％需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+/NADH)作为辅酶，10％的酶以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+/NADPH)为辅酶，只有很少一部分以黄素(FMN/FAD)和辅酶Q(PQQ)为辅酶。辅酶在氧化还原反应中起着电子转移的作用，随着反应的继续进行，辅酶会逐渐被还原成NAD(P)H，最终导致反应的中止。要使氧化还原酶催化继续反应，就必须要持续的补加NAD(P)+，但由于辅酶NAD(P)+价格昂贵，如果没有有效还原性辅酶NAD(P)H再生的方法，将使氧化还原酶催化的工业化受到限制。
目前再生辅酶NAD(P)H的方法有四种：酶法、化学法、电化学法和光化学再生法。由于酶法再生效率较高，反应条件温和，成为常用的辅酶再生方法。酶法再生需要建立第二酶反应，使用第二种酶和底物，这种酶可以将NAD(P)H氧化为NAD(P)+，构成辅酶再生的循环系统。葡萄糖脱氢酶由于对辅酶NAD+/NADP+均具有较好的活性广泛用于的氧化还原酶催化反应中辅酶再生系统。
葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase,GDH)属于短链脱氢酶，是乙醇脱氢酶家族的成员。可广泛用做血糖浓度的诊断用酶或者生物燃料电池。GDH有四个相同的亚基组成，大小约为28KD。葡萄糖脱氢酶GDH作为磷酸戊糖代谢途径关键的酶，以NAD(P)+为辅酶并且特异性的催化D-葡萄糖生成β-D-葡萄糖酸内酯。GDH以廉价葡萄糖为底物，反应产物葡萄糖酸内酯对环境也不会造成污染，使得GDH在辅酶NADPH再生中也具有很大的潜在应用价值。
目前对葡萄糖脱氢酶的辅酶活性和偏好性改变的定向进化研究工作主要集中以下两个方面：一是在对GDH基因进行随机突变建立GDH基因突变文库，通过对突变蛋白进行高通量筛选获得目标突变蛋白；二是对GDH辅酶活性中心多个氨基酸残基进行饱和突变，再通过高通量筛选的方法获得目标蛋白。以上两种方法均存在需要对GDH蛋白多个位点进行突变，突变蛋白样本大无效突变多，筛选工作繁琐且很难筛选到需要的目标蛋白，难以在实际生产中应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种改变葡萄糖脱氢酶的辅酶活性和偏好性的方法及其应用，通过对葡萄糖脱氢酶的保守序列中的第4位氨基酸进行定点突变，无需通过大量筛选就可以简单直接获得改变辅酶活性和偏好性的突变蛋白，可以广泛应用酶催化辅酶再生反应。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种改变葡萄糖脱氢酶的辅酶活性和偏好性的方法，对所述葡萄糖脱氢酶的保守序列中第4位氨基酸进行点突变。
优选的，所述葡萄糖脱氢酶的保守序列为与烟酰胺辅酶结合的活性中心保守序列，所述保守序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了利用所述方法构建得到的葡萄糖脱氢酶突变体，所述葡萄糖脱氢酶突变体的保守序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.2～5任一项所示。
本发明还提供了一种构建所述葡萄糖脱氢酶突变体的突变引物组，所述突变引物组的序列如SEQ ID NO.6～7、SEQ ID NO.8～9、SEQ ID NO.10～11或SEQ ID NO.12～13所示。
本发明还提供了所述方法或所述葡萄糖脱氢酶突变体或所述突变引物组在氧化还原酶催化反应过程中辅酶再生系统中的应用。
本发明还提供了所述方法或所述葡萄糖脱氢酶突变体或所述突变引物组在生物燃料电池中的应用。
本发明提供了一种改变葡萄糖脱氢酶的辅酶活性和偏好性的方法，对所述葡萄糖脱氢酶的保守序列中第4位氨基酸进行点突变。本发明所述方法通过对葡萄糖脱氢酶的保守序列中的第4位氨基酸进行定点突变，无需通过大量筛选就可以简单直接获得改变辅酶活性和偏好性的突变蛋白，可以广泛应用酶催化辅酶再生反应。在本发明实施例中，通过对来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium IWG3)的葡萄糖脱氢酶GDH DN46(以下简称为GDH DN46)以及来源于巨型芽孢杆菌(Bacillus megaterium AS1.223)葡萄糖脱氢酶GDH233(以下简称为GDH223)的葡萄糖脱氢酶中广泛存在的保守序列GXXXGXG中与烟酰胺辅酶核糖2’-磷酸结合的第4位氨基酸进行定点突变，最终得到四种葡萄糖脱氢酶突变体T17G、T17K、T17R以及K17G，并在BL21感受态细胞中进行表达，纯化和酶活测定，结果显示，突变体T17G对NAD+的酶活下降，大约下降了24.8％，对NADP+的酶活提高，提高了28.1％，同时辅酶的偏好性由野生型的NAD+转变为NADP+；突变体T17K相对于野生型GDH DN46，对NAD+、NADP+的酶活都下降，对NAD+和NADP+的酶活分别下降了24.8％和28.1％；突变体T17R相对于野生型GDH DN46，对NAD(P)+的酶活下降幅度都很大，对NAD+的酶活大约下降了80％，对NADP+的酶活大约下降了97％；突变体K17G相对于野生型GDH 223，对NAD(P)+的酶活都有不同程度的提高，对NAD+的酶活大约提高了104.58％，对NADP+的酶活提高幅度很大，得到的单突变体K17G可以更好的应用于NAD(P)H的再生。
附图说明
图1为GDH DN 46突变体的表达及纯化，其中条带1、2为野生型GDH DN 46的粗酶和纯酶，条带3、4为突变体T17G的粗酶和纯酶，条带5、6为突变体T17K的粗酶和纯酶，条带7、8为突变体T17R的粗酶和纯酶；
图2为GDH223突变体K17G的表达及纯化，其中条带1、2为野生型GDH223的粗酶和纯酶，条带3、4为突变体K17G的粗酶和纯酶；
图3为突变体酶活的测定；
图4为辅酶再生系统的原理模式图；
图5为生物电池的原理模式图。
具体实施方式
本发明提供了一种改变葡萄糖脱氢酶的辅酶活性和偏好性的方法，对所述葡萄糖脱氢酶的保守序列中第4位氨基酸进行点突变。
本发明所述葡萄糖脱氢酶的保守序列为与烟酰胺辅酶结合的活性中心保守序列，所述保守序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：GXXXGXG，所述保守序列为葡萄糖脱氢酶完整氨基酸序列中的14→20位点，发生点突变的为第17位点。
本发明提供了利用所述方法构建得到的葡萄糖脱氢酶突变体，所述葡萄糖脱氢酶突变体的保守序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.2～5任一项所示。
在本发明中，为方便说明本发明的方案，在本发明实施例中，以来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium IWG3)的葡萄糖脱氢酶GDH DN46(以下简称为GDH DN46)以及来源于巨型芽孢杆菌(Bacillus megaterium AS1.223)葡萄糖脱氢酶GDH233(以下简称为GDH223)为例，分别对GDH DN46和GDH223的17位点氨基酸进行定点突变，构建了GDH DN46的3个突变体T17G、T17K和T17R和GDH223的突变体K17G，但不能将其视为本发明的具体保护范围。在本发明实施例中，所述葡萄糖脱氢酶突变体的保守序列的氨基酸序列如表1所示：
表1突变体保守序列名称及序列
突变体 SEQ ID NO 序列
T17G 2 GXXGGXG
T17K 3 GXXKGXG
T17R 4 GXXRGXG
K17G 5 GXXGGXG
本发明还提供了一种构建所述葡萄糖脱氢酶突变体的突变引物组，所述突变引物组的序列如SEQ ID NO.6～7、SEQ ID NO.8～9、SEQ ID NO.10～11或SEQ ID NO.12～13所示。
在本发明中，所述突变引物组与葡萄糖脱氢酶突变体的对应关系如表2所示：
表2突变引物与突变体之间的对应关系
Figure GDA0002790541100000041
Figure GDA0002790541100000051
表2中，引物序列下划线部分为突变位点。
在本发明中，当应用所述突变引物组进行葡萄糖定点突变时，优选的以重组质粒为模板，所述重组质粒优选以pET28a为基础质粒，通过人工合成或克隆的方法，使pET28a质粒上包含有葡萄糖脱氢酶序列，在本发明实施例中，分别将两种不同来源的重组质粒明明为pET28a-GDH DN46和pET28a-GDH223。
本发明优选通过PCR的方式进行所述定点突变，所述PCR的体系优选为20μL体系，包括：模板DNA 50～100ng，突变引物(10μM)各1μL，Prime STAR Max DNAPolyase 10μL，ddH2O补充至20μL。本发明所述PCR的程序，优选包括：94℃预变性4min；94℃变性20s，62℃退火20s，72℃延伸3min，30循环；72℃延伸10min；4℃保存。
本发明在所述PCR后，优选还包括验证是否已经成功构建突变质粒，本发明对所述验证方法并没有特殊限定，优选将所述PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。本发明将验证正确的PCR产物用DpnI酶在37℃下消化2h，用于降解非突变型质粒模板；将用DpnI酶消化后的PCR产物直接转入到BL21感受态细胞中；挑取转化后的单菌落进行菌落PCR验证，并进行测序。本发明利用上述方法得到大肠杆菌BL21-pET28a-GDH DN46和BL21-pET28a-GDH 223后，优选还包括突变体的表达和纯化。本发明对所述表达和纯化的方法并没有特殊限定，优选利用IPTG诱导法和SDS-PAGE纯化法即可。
本发明还提供了所述方法或所述葡萄糖脱氢酶突变体或所述突变引物组在氧化还原酶催化反应过程中辅酶再生系统中的应用。在本发明中，所述再生，主要是与另外一种可以利用辅酶NADPH的酶构成一个偶联系统，可以源源不断地产生NAD(P)+。
本发明还提供了所述方法或所述葡萄糖脱氢酶突变体或所述突变引物组在生物燃料电池中的应用。在本发明中，将其应用到生物电池的原理如图5所示。
下面结合实施例对本发明提供的一种改变葡萄糖脱氢酶的辅酶活性和偏好性的方法及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
突变体T17G的构建及酶活测定
将大肠杆菌BL21-pET28a-GDH DN46采用LB培养基在37℃下扩增培养16h，得到BL21菌体。对菌体在13000rpm条件下离心收集菌体，对菌体进行pET28a-GDH DN46质粒提取，提取的质粒作为模板用来PCR定点突变构建突变质粒pET28a-GDH DN46 T17G，突变引物如下所示(5’-3’)，其中下划线部分为突变位点：
IF(SEQ ID NO.6)CATAGACTTTCCCAGTCCACCAGAAGATC
IR(SEQ ID NO.7)GGTGGACTGGGAAAGTCTATGGCTATTC
构建成功的PCR产物用DpnI酶在37℃条件下酶切2个小时，用于消化其中未突变的质粒模板。消化后的产物直接转入到BL21感受态细胞中。挑取转化后的单菌落进行菌落PCR验证，并进行测序。测序结果正确说明已经成功的构建出突变体T17G。
将测序成功的重组大肠杆菌按1％的接种量接种到含有50g/mL卡那霉素的LB培养基中，在37℃，200rpm，振荡培养3h后加入IPTG诱导剂，在相同温度下，继续培养12h后以7000rpm离心10min，收集沉淀物，得到诱导表达后的菌体。将菌体沉淀用PBS洗涤两遍，离心条件同上。将重悬后的菌液进行超声破碎，条件为200W，工作3sec，暂停6sec，90次。破碎完毕后将破碎液进行离心分离(10000rpm,30min)，收集上清粗酶液。将粗酶液用镍柱进行纯化，纯化效果如图1中1-a条带3和4所示，相对于粗酶液来说，已经去除了大部分杂蛋白，目标蛋白占据总蛋白的95％以上，可以用于后续有关酶活性的测定。
对突变体野生型酶活的测定
反应总体系为220μL，其中包括0.2M的葡萄糖50μL，11μL的辅酶(NAD+,NADP+),纯酶液10μL，20mM,PH为7.2的PBS添加至220μL。在酶标仪中测定340nm处的吸光值变化。
Figure GDA0002790541100000071
Figure GDA0002790541100000072
其中，Vs：反应总体积(mL)；Vt酶体积(mL)；ΔA：吸光度变化值；Δt：吸光度变化的时间(min)；L：光程(cm)；ε：摩尔吸光系数(6.22mL·(μmol·cm)-1)。
结果如图3中3-a所示，相对于野生型GDH DN46来说，突变体T17G对NAD+的酶活下降，大约下降了24.8％，对NADP+的酶活提高，提高了28.1％。同时辅酶的偏好性由野生型的NAD+转变为NADP+。
实施例2
突变体T17K的构建及酶活测定
除突变引物与实施例1不同外，其余条件均与实施例1相同：构建突变质粒pET28a-GDH DN46 T17K的突变引物如下所示(5’-3’)，其中下划线部分为突变位点：
IF(SEQ ID NO.8)GACTTTCCCAGTCCCTTAGAAGATCCAG
IR(SEQ ID NO.9)AGGGACTGGGAAAGTCTATGGCTATTCG
对收集得到的上清粗酶液进行纯化，纯化效果如图1中1-b的条带5和6所示，相对于粗酶液来说，已经去除了大部分杂蛋白，目标蛋白占据总蛋白的95％以上，可以用于后续有关酶活性的测定。
测定酶活数据如图3中3-a所示，相对于野生型GDH DN46来说，突变体T17K对NAD+、NADP+的酶活都下降，对NAD+和NADP+的酶活分别下降了24.8％和28.1％。
实施例3
突变体T17R的构建及酶活测定
除突变引物与实施例1不同外，其余条件均与实施例1相同：构建突变质粒pET28a-GDH DN46 T17R的突变引物如下所示(5’-3’)，其中下划线部分为突变位点：
IF(SEQ ID NO.10)GACTTTCCCAGTCCTCTAGAAGATCCAG
IR(SEQ ID NO.11)GAGGACTGGGAAAGTCTATGGCTATTCG
对收集得到的上清粗酶液进行纯化，纯化效果如图1中1-b的条带7和8所示，相对于粗酶液来说，已经去除了大部分杂蛋白，目标蛋白占据总蛋白的95％以上，可以用于后续有关酶活性的测定。
测定酶活数据如图3中3-a所示，相对于野生型GDH DN46来说，突变体T17R的酶活对NAD(P)+下降幅度都很大，对NAD+的酶活大约下降了80％，对NADP+的酶活大约下降了97％。
实施例4
突变体K17G的构建及酶活测定
与实施例相比，利用原始菌体不同，本实施例利用大肠杆菌BL21-pET28a-GDH223，且利用PCR定点突变构建突变质粒pET28a-GDH DN46 T17G，突变引物如下所示(5’-3’)，其中下划线部分为突变位点：
IF(SEQ ID NO.12)CATTGCGCGACCCAATCCTCCTGATCCGCC
IR(SEQ ID NO.13)GGAGGATTGGGTCGCGCAATGGCCGTTC
对收集得到的上清粗酶液进行纯化，纯化效果如图2中2-b条带3和4所示，相对于粗酶液来说，已经去除了大部分杂蛋白，目标蛋白占据总蛋白的95％以上，可以用于后续有关酶活性的测定。
测定酶活数据如图3中3-b所示，相对于野生型GDH 223来说，突变体K17G的酶活对NAD(P)+都有不同程度的提高，对NAD+的酶活大约提高了104.58％，对NADP+的酶活提高幅度很大。得到的单突变体K17G可以更好的应用于NAD(P)H的再生。
本发明提供了一种改变葡萄糖脱氢酶的辅酶活性和偏好性的方法及其应用，通过对葡萄糖脱氢酶保守序列GXXXGXG第四位氨基酸进行定点突变，无需通过大量筛选就可以简单直接获得改变辅酶活性和偏好性的突变蛋白，可以广泛应用酶催化辅酶再生反应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种改变葡萄糖脱氢酶的辅酶活性和偏好性的方法，其特征在于，对所述葡萄糖脱氢酶的保守序列中第4位氨基酸进行点突变；
所述葡萄糖脱氢酶的保守序列为与烟酰胺辅酶结合的活性中心保守序列，所述保守序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
经过所述点突变后得到的葡萄糖脱氢酶突变体的保守序列的氨基酸序列如SEQ IDNO.2～5任一项所示；
所述葡萄糖脱氢酶为来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium IWG3)的葡萄糖脱氢酶GDH DN46和来源于巨型芽孢杆菌(Bacillus megaterium AS1.223)葡萄糖脱氢酶GDH233。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，构建所述葡萄糖脱氢酶突变体的突变引物组的序列如SEQ ID NO.6～7、SEQ ID NO.8～9、SEQ ID NO.10～11或SEQ ID NO.12～13所示。
3.权利要求1或2所述方法在氧化还原酶催化反应过程中辅酶再生系统中的应用。
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