CN112695063B - 酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法及其应用。利用烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体为催化剂，催化烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸耦合反应，制备烟酰胺胞嘧啶二核苷酸。在微生物细胞内表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的编码基因，工程菌利用内源代谢物合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸，并且胞内烟酰胺胞嘧啶二核苷酸可作为辅酶，选择性介导氧化还原反应，提高目标代谢产物产量。在一个典型实例中，L‑苹果酸产量提高了79％。在另一个典型实例中，L‑苹果酸生产D‑乳酸的转化率提高了2.4倍。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(nicotinamide cytosine dinucleotide，NCD)的方法及其应用，在微生物细胞内表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的编码基因，工程菌利用内源代谢物合成NCD，并且胞内NCD可作为辅酶，选择性介导氧化还原反应，提高目标代谢产物产量。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及其还原态(NADH)在细胞繁殖、生长、分化、凋亡等生命活动中都起着非常重要的作用(W.Ying,et al.Antioxidants&RedoxSignaling.2008,10,179)。此外，NAD(H)还是许多重要氧化还原酶的辅酶，起传递氢和电子的作用。
由于生物体内NAD(H)同时参与多种反应，因此在大部分目标产物的生物代谢网络中，都会存在一步或多步利用NAD(H)的反应。现阶段通常采用辅因子工程对目标代谢网络进行调控。常见的策略有，1)改变胞内辅酶合成，降解，回补代谢和不同辅酶分子相互转化的能力，2)改变氧化还原酶的辅酶偏好性，3)在细胞内表达可再生辅酶的酶，如葡萄糖脱氢酶等，并在培养环境中额外添加相应酶的底物。但是，由于NAD(H)是一种通用的辅酶，胞内NAD(H)水平及不同氧化态的扰动往往会对细胞生理及代谢等产生难以预测的全局性影响。因此，为了实现特异性调控目标代谢网络，亟需一种方法使目标代谢网络从复杂代谢网络中独立出来，即需要重新设计出一个生物正交系统(K.Shokat,et al.Drug DiscoveryToday.2002,7,872)。
在依赖于NAD类似物的生物正交系统中，NAD(H)类似物可以在该正交代谢途径中传递，而不影响其他利用NAD(H)的代谢途径，同样，其他代谢途径中的NAD(H)也不会影响到生物正交代谢途径。因此，仅靠调控NAD(H)类似物的含量就可以对生物正交系统进行特异性的代谢调控，从而达到提高目标途径产量的目的。
由于依赖于NAD(H)的氧化还原酶与其辅酶的主要结合作用发生在腺嘌呤结合域，吡啶环部分主要起传递电子的作用，因此，为了保证NAD类似物的氧化还原性能，只能对NAD的腺嘌呤环部分进行改造。
目前，大多数NAD类似物均采用化学法合成。但是，化学法合成NAD类似物通常面临步骤繁琐，化学性质不稳定，分离，纯化较困难，且成本较高，不能直接应用于生物体等问题。因此，有人采用酶促方法合成NAD类似物(H.迪费尔，D.海因德尔，C.迈尔，R.施姆克，CARBA-NAD的酶促合成，申请号：201080033434.1)。其借助野生型烟酰胺核糖激酶(RNK)和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT)进行NAD类似物的酶促反应合成。其中，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(nicotinamide/nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase，NMNAT)根据物种来源不同，分别可由基因nadD，nadM，nadR表达，蛋白产物为NadD，NadR，NadM，其可将烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)或烟酸单核苷酸(nicotinic acid mononucleotide，NaMN)和腺苷三磷酸(ATP)进行缩合反应合成NAD或NaAD，是NAD生物合成途径中的关键酶。虽然在体外反应条件下，野生NMNAT也可表现出很低的合成少数NAD类似物的活性(M.Emanuelli,et al.Protein Expression andPurification.2003,27,357)，但不足以用于制备或进行胞内直接合成NAD类似物。
烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(nicotinamide cytosine dinucleotide，NCD)是一种NAD类似物，可作为辅酶介导氧化还原反应。通过构建依赖NCD的氧化还原酶，可以建立生物正交的氧化还原体系，用于控制细胞内代谢过程(D.Ji,et al.Journal of the AmericanChemical Society.2011,133,20857；L.Wang,et al.ACS Catalysis.2017,7,1977)。虽然通过化学方法可以合成NCD，但NCD和NAD一样，不能自由透过细胞膜，成为胞内应用NCD的瓶颈。因此，需要建立一种酶促合成NCD的方法，以利用细胞内源代谢物直接在胞内合成NCD。
基于以上背景和优势，在已有的酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸方法的基础上，本发明利用定向进化的方法，获得合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸效率进一步提升的突变体。
发明内容
针对化学法合成NCD步骤繁琐，分离纯化困难，NCD难以进入细胞等缺点，并且目前尚未发现可高效催化合成NCD的酶，本发明的目的是提供一种高效的酶促合成NCD的方法，以烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体为催化剂，以烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸为底物，催化合成NCD，并且通过在胞内表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，实现直接在胞内合成NCD，应用于选择性调控代谢过程和提高目标代谢产物产量。
一方面，本发明提供了一种酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)的方法，以烟酰胺单核苷酸(NMN)和胞嘧啶核苷三磷酸(CTP)为底物，以烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体为催化剂，合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸。
在一些实施方式中，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶是来源于大肠杆菌的由nadD基因编码的蛋白质(NCBI蛋白数据库编号为NP_415172.1，含1至213位完整氨基酸序列)。
烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体为上述氨基酸序列中的1个及1个以上氨基酸进行突变获得的突变体(突变位点用氨基酸序号和突变前后的氨基酸名称表示，如P22R表示第22位氨基酸由脯氨酸突变成精氨酸，其余位点类似)，包括突变体22C8(P22R)、突变体22D8(P22K)、突变体1D6(P22L/V23L)、突变体1E3(P22F/V23L)、突变体3G8(V23Q/W176Q)、突变体5E11(V23Q/W176E)、突变体2B9(P22Q/V23Q/W176E)、突变体3G7(P22L/V23Q/W176E)、突变体1C1(P22K/C132L/W176L)、突变体1D8(P22K/C132F/W176L)、突变体1D9(P22K/C132L/W176F)、突变体1E4(P22K/C132L/W176Y)、突变体1F11(P22K/C132Q/W176F)、突变体1H9(P22K/C132L/W176Q)、突变体2F10(C132L/T174L/W176R)、突变体2F11(C132F/T174L/W176R)、突变体4G4(C132F/T174Y/W176R)，以及上述突变体与11B4(Y84V/Y118D)或16D8(A86W/Y118N)的组合突变体的一种或两种以上。
本发明获得可以合成NCD的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的操作步骤如下：
1.选择来源于大肠杆菌的NMNAT为模板进行定向进化。
提取大肠杆菌BL21(DE3)的全基因组DNA，PCR扩增得到烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(nicotinamide/nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase，NMNAT)的编码基因nadD的序列，其蛋白表达产物为NadD。
2.构建表达NadD的工程菌。
将表达NadD的编码基因克隆至原核蛋白表达载体中，并转化至大肠杆菌DH10B，将获得的阳性克隆进行测序，测序结果正确的克隆即为野生型NadD表达工程菌。
3.数据库下载大肠杆菌的NadD的晶体结构。
直接在PDB数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中下载来源于大肠杆菌的NadD晶体结构(PDB ID:1K4M)，并对其底物结合域进行分析。
4.设计突变策略。
经过晶体结构分析，选取NadD中ATP结合域的一个或多个氨基酸，构建单位点饱和突变文库及多位点大侧链氨基酸突变文库，饱和突变文库用简并碱基NNK(其中N＝腺嘌呤，鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶；K＝鸟嘌呤或胸腺嘧啶)替换目标突变位点的密码子，多位点大侧链氨基酸突变文库用简并碱基组CKC、TWT、SAA(等摩尔比，其中W＝腺嘌呤或胸腺嘧啶；S＝胞嘧啶或鸟嘌呤)替换目标位点的密码子，设计突变引物，构建突变载体。
5.构建突变文库。
采用RF克隆的方法，参见文献(F.van den Ent,et al.Journal of Biochemicaland Biophysical Methods.2006,67,67)。第一步PCR过程中，模板为野生型NadD表达载体，引物为含有简并碱基或简并碱基组的突变引物，得到的PCR产物进行回收之后作为第二步RF克隆的大引物；第二步PCR过程中，模板仍为野生型NadD表达载体，PCR得到的产物用DpnI限制酶进行消化，并转入大肠杆菌感受态细胞中，得到的转化子即为由可表达NadD突变体的工程菌组成的突变文库。
6.构建突变文库筛选方法。
利用已有的能够识别目标NAD类似物的氧化还原酶进行突变文库筛选，采用酶偶联显色法。筛选显色原理见附图1。
酶偶联显色过程中，NadD的突变文库将底物CTP和NMN进行缩合反应，合成NAD类似物NCD。本领域的熟练技术人员可以采用文献(D.Ji,et al.Journal of the AmericanChemical Society.2011,133,20857)类似的方法，获得能够使NCD还原为NCDH的氧化还原酶作为指示酶，生成NCDH；吩嗪硫酸甲酯(PMS)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)在NCDH的作用下被还原为肉眼可见的黑紫色甲瓒。
7.筛选突变文库。
挑取突变体文库单菌落接种于96深孔板LB液体培养基中，进行菌株培养及突变蛋白的诱导表达；收集菌体细胞进行破碎，离心，上清即为含有可溶的突变蛋白粗酶液。酶偶联显色筛选的反应体系的pH为5.0～11.0，反应液中含有NMN、CTP、金属离子、指示氧化还原酶及其共底物、PMS、NBT和粗酶液上清。
反应液显蓝色的孔对应的突变菌即为疑似目标突变菌，将疑似目标突变菌进行第二次复筛验证，验证正确的菌即为目标突变菌。目标突变菌提取质粒，测序分析，确定突变体蛋白携带的氨基酸突变。
8.纯酶活性验证。
将目标突变菌进行放大培养并诱导表达，得到的培养液离心收集菌体并裂解，离心收集裂解液上清，根据目标突变体的特点进行分离纯化，收集得到的纯酶液验证活性。
验证纯酶活性的反应条件如下：缓冲溶液pH 5.0～11.0，NMN 0.05～10mM，0.02～10mM CTP，0.05～10mM的金属离子，0.01～1mg/mL的纯酶液，25～40℃反应2～4h，终止反应除去蛋白，选择合适的方法分离纯化得到NAD类似物。
纯化得到的类似物进行NMR检测，谱图正确后即可认为对应的突变体为可以合成NCD的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体。
在一些实施方式中，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，由相应的脱氧核糖核酸(DNA)序列编码。
在另一些实施方式中，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，其相应的编码DNA序列，克隆在一种蛋白质表达载体中，用于可控表达。
另一方面，本发明提供一种酶促合成NCD方法的应用。
在一些实施方式中，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，由携带相应突变体的表达载体的微生物细胞产生，纯化相应突变体，并用于体外酶促反应合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸，反应条件为：pH 5.0-9.0(优选pH 7.5)，温度25℃-55℃(优选37℃)，时间0.2-30h(优选4h)；烟酰胺单核苷酸，胞嘧啶核苷三磷酸，酸烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体三者用量摩尔比例为1:0.02-50:0.00002-0.1(优选1:1.2:0.001)。
在一些实施方式中，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，由携带相应突变体的表达载体的微生物细胞产生，细胞经过裂解之后得到粗酶液，并用于体外酶促反应合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸，反应条件为：pH 5.0-9.0(优选pH 7.5)，温度25℃-55℃(优选37℃)，时间0.2-30h(优选4h)；烟酰胺单核苷酸，胞嘧啶核苷三磷酸二者用量摩尔比例为1:0.02-50(优选1:1.2)。
在一些实施方式中，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，由携带相应突变体的表达载体的微生物细胞产生，直接利用细胞内源代谢物烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸，在细胞内原位合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸，反应条件为：pH 5.0-9.0(优选pH 7.5)，温度25℃-55℃(优选37℃)。
在另一些实施方式中，在微生物细胞中表达所述的突变体蛋白，同时表达以NCD为辅酶的一种或两种以上蛋白，构建可被选择性调控的代谢体系，用于提高目标代谢产物产量。
在一些实施方式中，在微生物细胞中表达所述的突变体蛋白，同时表达以烟酰胺胞嘧啶二核苷酸为辅酶的来源于大肠杆菌K12的第310位亮氨酸突变为赖氨酸、第404位谷氨酰胺突变为半胱氨酸的苹果酸酶突变体和来源于施氏假单胞菌WM88的第151位异亮氨酸突变为精氨酸的亚磷酸脱氢酶突变体，并在亚磷酸存在下培养工程菌细胞，提高L-苹果酸产量。
在另一些实施方式中，在微生物细胞中表达所述的突变体蛋白，同时表达以烟酰胺胞嘧啶二核苷酸为辅酶的来源于大肠杆菌K12的第310位亮氨酸突变为赖氨酸、第404位谷氨酰胺突变为半胱氨酸的苹果酸酶突变体和来源于瑞士乳杆菌的第151位异亮氨酸突变为精氨酸、第213位天冬酰胺突变为半胱氨酸的D-乳酸脱氢酶突变体，并在L-苹果酸存在下进行静息细胞催化转化，提高D-乳酸产量。
关于表示方法的说明
ME*表示：来源于大肠杆菌K12的第310位亮氨酸突变为赖氨酸、第404位谷氨酰胺突变为半胱氨酸的苹果酸酶突变体(D.Ji,et al.Journal of the American ChemicalSociety.2011,133,20857)。
PDH*表示：来源于施氏假单胞菌WM88的第151位异亮氨酸突变为精氨酸的亚磷酸脱氢酶突变体(王磊.基于烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的代谢电路研究[博士学位论文].北京：中国科学院大学，2014)。
LDH*表示：来源于瑞士乳杆菌的第151位异亮氨酸突变为精氨酸、第213位天冬酰胺突变为半胱氨酸的D-乳酸脱氢酶突变体(王磊.基于烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的代谢电路研究[博士学位论文].北京：中国科学院大学，2014)。
在提高L-苹果酸产量的实施方式中，选择的宿主为E.coli XZ654(X.Zhang,etal.Applied and Environmental Microbiology.2011,77,427)。在宿主中同时过表达能够合成NCD的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，依赖NCD(H)为辅酶的来源于施氏假单胞菌WM88的第151位异亮氨酸突变为精氨酸的亚磷酸脱氢酶突变体PDH*(将亚磷酸氧化为磷酸的同时将NCD还原为NCDH)和来源于大肠杆菌K12的第310位亮氨酸突变为赖氨酸、第404位谷氨酰胺突变为半胱氨酸的苹果酸酶突变体ME*(以NCDH为还原力催化丙酮酸生成苹果酸)，构建NCD的胞内合成、还原与再生正交系统。将亚磷酸氧化为磷酸的同时将NCD还原为NCDH，在不干扰胞内其他以NAD(H)为辅因子的生命过程的情况下，以NCDH为还原力催化丙酮酸生成L-苹果酸，实现还原力的特异性分配和苹果酸的积累。
在提高D-乳酸产量的实施方式中，选择的宿主为敲除了D-乳酸生成关键酶编码基因ldhA和dld的大肠杆菌BW25113菌株，即BW25113(ΔldhA,dld::cat)(王雪颖.NCD生物合成即应用初探[博士学位论文].北京：中国科学院大学，2018)。将能够合成NCD的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的表达盒替换至宿主基因组中的arsB位点，同时过表达依赖NCD(H)为辅酶的来源于大肠杆菌K12的第310位亮氨酸突变为赖氨酸、第404位谷氨酰胺突变为半胱氨酸的苹果酸酶突变体ME*(将L-苹果酸氧化为丙酮酸，同时生成NCDH)和来源于瑞士乳杆菌的第151位异亮氨酸突变为精氨酸、第213位天冬酰胺突变为半胱氨酸的D-乳酸脱氢酶突变体LDH*(以NCDH为还原力催化丙酮酸生成D-乳酸)，构建NCD的胞内合成、还原与再生正交系统。将L-苹果酸氧化为丙酮酸的同时将NCD还原为NCDH，同时以NCDH为还原力催化丙酮酸生成D-乳酸，实现还原力的特异性分配和D-乳酸的积累。
本发明的优点和有益效果：酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的反应过程简单、条件温和、反应效率高，产物易分离、纯化；底物选择性高，应用于胞内体系时可直接利用细胞内源代谢物烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸，而不利用细胞中其他内源代谢物；在能够内源合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的细胞中同时表达烟酰胺胞嘧啶二核苷酸依赖型酶及多酶组合时，可以将还原力进行特异性传递，用于制备高纯度的目标代谢物而不影响细胞中其他物质代谢。
附图说明
图1 NadD突变文库的筛选原理。其中，CTP是ATP的类似物，NCD是目标NAD类似物，NadD*是烟酰胺核苷酸腺苷转移酶突变体，氧化还原酶作为指示酶在共底物存在的条件下将NAD类似物NCD还原成具有还原性质的NCDH，吩嗪硫酸甲酯(PMS)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)在NCDH的作用下被还原为肉眼可见的黑紫色甲瓒。
图2胞内原位合成NCD并用于提高苹果酸产量的代谢通路。工程菌为XYM023，该菌株敲除了ldhA，ackA，adhE，pflB，mgsA，poxB，frdBC，sfcA，maeB等丙酮酸，苹果酸消耗途径，避免了底物竞争和产物消耗对检测的影响；又过表达了可以合成NCD的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体1E4-11B4，特异性依赖NCDH为还原力的苹果酸酶突变体ME*，和可以使NCDH再生的亚磷酸脱氢酶突变体PDH*。其中，1E4-11B4是来源于大肠杆菌的NadD的突变体1E4和11B4的组合突变体，与野生型NadD相比，其第22位脯氨酸突变为赖氨酸，第84位酪氨酸突变为缬氨酸，第118位酪氨酸突变为天冬氨酸，第132位半胱氨酸突变为异亮氨酸，第176位色氨酸突变为酪氨酸；ME*是来源于大肠杆菌K12的第310位亮氨酸突变为赖氨酸、第404位谷氨酰胺突变为半胱氨酸的苹果酸酶突变体；PDH*是来源于施氏假单胞菌WM88的第151位异亮氨酸突变为精氨酸的亚磷酸脱氢酶突变体。
图3胞内原位合成NCD并用于提高D-乳酸产量的代谢通路。工程菌为XYD042，该菌株敲除了D-乳酸生成途径的两个关键基因ldhA和dld，避免了其他途径产物生成对检测的影响；又将能够合成NCD的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体1F11-16D8的表达盒替换至宿主基因组中的arsB位点；同时过表达依赖NCDH为还原力的D-乳酸脱氢酶突变体LDH*，及可以使NCDH再生的苹果酸酶突变体ME*。其中，1F11-16D8是突变体1F11和16D8的组合突变体，其第22位脯氨酸突变为赖氨酸，第86位丙氨酸突变为色氨酸，第118位酪氨酸突变为天冬酰胺，第132位半胱氨酸突变为谷氨酰胺，第176位色氨酸突变为苯丙氨酸；ME*是来源于大肠杆菌K12的第310位亮氨酸突变为赖氨酸、第404位谷氨酰胺突变为半胱氨酸的苹果酸酶突变体；LDH*是来源于瑞士乳杆菌的第151位异亮氨酸突变为精氨酸、第213位天冬酰胺突变为半胱氨酸的D-乳酸脱氢酶突变体。
图4为蛋白质的三维结构采用Pymol软件进行展示图。
具体实施方式
以下实施例可以进一步阐明本发明，通过参考以下的实施例将更容易理解本发明。这些实施例仅用于示例性说明，而不用于限制本发明。
本发明中，获得能够合成NAD类似物NCD(烟酰胺胞嘧啶二核苷酸)的突变体的操作步骤见发明内容。
表达载体构建均采用RF克隆(F.van den Ent,et al.Journal of Biochemicaland Biophysical Methods.2006,67,67)方法。第一步PCR扩增得到含有目标载体同源臂片段的目标基因，第二步PCR以其为大引物，将其克隆至目标载体上。得到的产物用DpnI限制酶进行消化，并转入宿主感受态细胞中，得到的转化子即为可表达NadD突变体的突变文库。
文库中各突变体表达菌分别以xxx进行编号，其中，xxx为数字和字母的组合，则其突变体蛋白命名方式：xxx；其突变体表达载体命名方式：在野生型表达载体名称后加“-xxx”；其突变体表达菌命名方式：菌株名称加载体名称。如：来源于大肠杆菌的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶NadD的表达载体pUC-NadD转入宿主DH10B中，得到的表达菌命名为DH10B(pUC-NadD)；NadD的突变体表达菌中有一个编号为1E4，其表达的突变体蛋白命名为1E4，突变体表达载体命名为pUC-NadD-1E4，表达菌命名为DH10B(pUC-NadD-1E4)。
突变体蛋白质的诱导表达条件为：挑目标单菌落在37℃ 200rpm过夜活化，转接于新的培养基中，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)0.01～1mM，在15℃～37℃ 200rpm诱导表达目标蛋白。
参考文献(J.Wang,et al.Protein Expression and Purification.2007,53,97)方法，进行蛋白质的诱导，表达，纯化。
蛋白质的浓度测定采用伯乐公司蛋白质浓度测定试剂盒用Bradford法进行测定。
胞内辅因子浓度测定采用辅因子循环策略(S.Kern,et al.Methods inMolecular Biology.2014,1149,311)。
测定NadD及其突变酶利用CTP(胞嘧啶核苷三磷酸)合成NCD的活性时，反应体系中加入：20～1000mM的缓冲溶液pH 5.0～11.0，0.05～10mM的NMN(烟酰胺单核苷酸)，0.02～10mM的CTP，0.05～10mM的金属离子，0.01～1mg/mL的突变纯酶液，5～10mM的L-苹果酸，50U/mL的苹果酸酶突变体ME*纯酶液，在25℃恒温条件下用分光光度计测340nm处吸光度变化。其中，ME*是来源于大肠杆菌K12，第310位亮氨酸突变为赖氨酸、第404位谷氨酰胺突变为半胱氨酸的苹果酸酶突变体。工程菌BL21(DE3)(pET24b-ME*)诱导表达及ME*纯化方法同文献(D.Ji,et al.Journal of the American Chemical Society.2011,133,20857)。
酶活力单位定义：在测定条件下每分钟催化产生1nmol产物所需的酶量，即1U＝1nmol/min。NCDH的摩尔消光系数按6220M-1cm-1计。比酶活用公式1进行计算。其中，Vt为反应液总体积，Vs为加入酶体积，df为稀释倍数，C为酶浓度。
酶反应合成产物的分离纯化采用文献(D.Ji,et al.Journal of the AmericanChemical Society.2011,133,20857)的方法。
粗酶液反应结束后产物NCD的定性与定量采用文献(L.Sorci,et al.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America.2009,106,3083)中HPLC的方法。
发酵培养基中的最小矿物盐培养基采用文献(T.Causey,et al.Proceeding ofthe National Academy of Sciences of the United Stated of America.2003,100,825)中配方。
对比实施例1以CMP和NMN为底物化学法合成NCD
参考文献(纪德彬.基于烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的代谢电路研究[博士学位论文].北京：中国科学院大学，2011)的方法以胞嘧啶核苷单磷酸(CMP)和烟酰胺单核苷酸(NMN)合成NCD。将1g NMN(3mmol)溶于10mL水，用饱和NH4HCO3溶液调pH至7，冻干得到铵型NMN。将1.15g CMP(3.6mmol)溶于20mL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)后加入20mmol三正丁胺，混匀后冻干，得到三正丁胺型CMP。将冻干的NMN溶于60mL无水DMSO(二甲亚砜)中，再依次加入15mmolPh3P(三苯基膦)，15mmol(PyS)2(2,2’-二吡啶二硫醚)，60mmol甲基咪唑，于25℃反应15min。加入20mL无水DMF溶解的三正丁胺型CMP，于25℃反应2h。加入200mL丙酮终止反应，有大量黄色沉淀生成，离心收集沉淀，用150mL丙酮洗涤沉淀三次。沉淀用水溶解后后过甲酸型阴离子交换树脂，用3000mL水洗下未反应的NMN后，用5％甲酸洗下目标产物。浓缩后过DEAE(二乙氨乙基)柱进一步纯化，10mM NH4HCO3溶液洗脱。收集，冻干得铵型目标产物0.79g，产率41.2％。
产物核磁共振数据:1H NMR(D2O,400MHz):δ9.30(s,1H),9.14(d,J＝6.1Hz,1H),8.83(d,J＝7.9Hz,1H),8.16(m,1H),7.74(d,J＝7.6Hz,1H),6.04(d,J＝5.3Hz,1H),5.92(d,J＝7.4Hz,1H),5.77(d,J＝4.0Hz,1H),4.46(m,1H),4.41(m,1H),4.33(m,1H),4.28–4.25(m,1H),4.17–4.09(m,5H),4.02–4.00(m,1H).13C NMR(D2O,100MHz):δ165.5,165.2,156.4,146.0,142.5,141.7,139.9,133.9,128.6,99.9,89.4,87.0,82.5,77.6,74.1,70.7,69.2,64.9,64.7.31P NMR(D2O,162MHz):δ–11.1,–11.3.
对比实施例2以CTP和NMN为底物在无酶条件下合成NCD
150μL反应体系中含HEPE(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)(pH 7.5)50mM，NMN 10mM，CTP12mM，MgCl2 10mM，在25℃恒温条件下反应2h，用等体积氯仿终止反应。离心后取20μL上清，采用文献(L.Sorci,et al.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America.2009,106,3083)中HPLC的方法进行检测。在NCD出峰位置并未检测到目标产物。说明在无酶条件下不能直接利用CTP和NMN合成NCD。
对比实施例3野生NadD催化CTP和NMN合成NCD
参考文献(R.Mehl,et al.Journal of Bacteriology.2000,182,4372)构建来源于大肠杆菌BL21(DE3)的野生型烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶NadD的表达载体，转入大肠杆菌DH10B中，获得工程菌DH10B(pUC-NadD)。参考文献(R.Mehl,et al.Journal ofBacteriology.2000,182,4372)诱导表达并纯化NadD。采用对比实施例2中反应体系，并加入NadD 0.06mg，于25℃恒温条件下反应2h，用等体积氯仿终止反应。离心后取20μL上清，用HPLC进行检测。在NCD出峰位置检测到少量目标产物。
采用与苹果酸酶突变体ME*偶联的方法进行酶活定量分析。反应条件：150μL反应体系中含HEPES(pH 7.5)50mM，CTP 100μM，NMN 4mM，MgCl2 10mM，MnCl2 5mM，L-苹果酸10mM，苹果酸酶突变体ME*纯酶7.5U，加入NadD 0.06mg后启动反应，在25℃恒温条件下用分光光度计测340nm处吸光度变化。测得野生NadD合成NCD的比酶活为0.03U/mg。
对比实施例4以CTP和NMN为底物在酶失活条件下合成NCD
将来源于大肠杆菌的NadD突变体1E4-11B4(P22K/Y84V/Y118D/C132L/W176Y)在100℃水浴加热60min备用。按照对比实施例3的方法检测其合成CTP的活性为0U/mg。说明加热灭活的酶不能催化CTP和NMN合成NCD。
实施例1 22D8催化合成NCD
1.构建突变文库
采用RF克隆(F.van den Ent,et al.Journal of Biochemical and BiophysicalMethods.2006,67,67)的方法构建突变文库。第一步，模板为野生型NadD表达载体pUC-NadD，引物将第22位脯氨酸的密码子替换为简并碱基NNK(N＝A,C,G,T；K＝G,T)，进行PCR反应并回收PCR产物；第二步，模板同第一步，引物为第一步中回收的PCR产物，得到的产物用DpnI限制酶进行消化，并转入DH10B感受态细胞中，得到的转化子即为可表达P22位脯氨酸突变为任意氨基酸的单位点饱和突变文库，各突变体表达菌分别命名为DH10B(pUC-NadD-xxx)，表达蛋白产物命名为xxx。其中，xxx为数字和字母的组合，每个突变菌株对应一个编号，下同。
2.突变文库筛选
挑取突变文库单菌落接种于96深孔板LB液体培养基中，在30℃，200rpm培养72h，诱导表达突变体。在3500rpm条件下离心15min收集菌体，加入细胞裂解剂(50mM HPEPS，1％Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，1mg/mL溶菌酶，pH 7.5)，在37℃，200rpm破碎1h，3500rpm离心获得突变蛋白粗酶液上清。采用酶偶联显色方法进行合成NCD的活性筛选。60μL反应条件为：HEPES(pH 7.5)50mM，CTP 1mM，NMN 4mM，MgCl2 10mM，MnCl2 5mM，L-苹果酸10mM，苹果酸酶突变体ME*3U，PMS(吩嗪硫酸甲酯)0.4mM，NBT(氯化硝基四氮唑蓝)1mM，加入突变蛋白粗酶液10μL，30℃反应1.5h，观察颜色变化，显蓝色的孔所对应的菌株即为疑似可以合成NCD的突变菌株。复筛采用放大培养，在5mL LB液体培养基中诱导表达突变体，筛选方法同上，能重复显蓝色的突变菌株即为目标突变菌株。
选其中显色较快的突变菌DH10B(pUC-NadD-22D8)，提质粒并进行测序，其表达蛋白产物22D8的氨基酸序列与野生型NadD相比，第22位脯氨酸突变为赖氨酸。
3. 22D8催化合成NCD
突变菌DH10B(pUC-NadD-22D8)的培养，诱导表达及22D8的纯化过程同对比实施例3。从10g湿菌体中纯化得到纯酶22D8 67mg/mL，共4mL。测定其利用CTP合成NCD的比酶活方法同对比实施例3，为51.55U/mg，是野生型NadD的1718倍，高于之前专利中获得的突变体的比酶活(突变体NadD4G3的比酶活最高，为44.8U/mg，专利申请号：201510940681.4)。
另外，文献(M.Emanuelli.Protein Expression and Purification.2003,27,357)表达纯化了一种酿酒酵母来源的野生NMNAT-2，其合成NCD的活性为0.02U/mg，也远低于本发明的突变体蛋白。因此，本发明得到的突变体蛋白，催化合成NCD的性能显著优于野生型蛋白，为制备NCD和在细胞内合成NCD提供了新的生物催化剂。
4. 22D8纯酶制备NCD
10mL反应体系中含HEPE(pH 7.5)50mM，NMN 10mM，CTP 12mM，MgCl2 10mM，并加入22D8纯酶8mg，在25℃恒温条件下反应2h。超滤除去蛋白质，将滤出液浓缩后过甲酸型阴离子交换树脂，用水洗下未反应的NMN后，用5％(v/v)甲酸洗下目标产物。浓缩后过DEAE柱进一步纯化，10mM NH4HCO3溶液洗脱。收集，冻干得铵型目标产物43.8mg，产率68.5％。
产物核磁共振数据:1H NMR(D2O,400MHz):δ9.30(s,1H),9.14(d,J＝6.1Hz,1H),8.83(d,J＝7.9Hz,1H),8.16(m,1H),7.74(d,J＝7.6Hz,1H),6.04(d,J＝5.3Hz,1H),5.92(d,J＝7.4Hz,1H),5.77(d,J＝4.0Hz,1H),4.46(m,1H),4.41(m,1H),4.33(m,1H),4.28–4.25(m,1H),4.17–4.09(m,5H),4.02–4.00(m,1H).13C NMR(D2O,100MHz):δ165.5,165.2,156.4,146.0,142.5,141.7,139.9,133.9,128.6,99.9,89.4,87.0,82.5,77.6,74.1,70.7,69.2,64.9,64.7.31P NMR(D2O,162MHz):δ–11.1,–11.3.
与对比实施例1相比，突变体22D8催化制备NCD时，反应过程更简单，且产率更高。说明酶促合成NCD比化学法具有更低的成本及更高的效率。
实施例2 1E4催化合成NCD
1.构建突变文库
采用RF克隆(F.van den Ent,et al.Journal of Biochemical and BiophysicalMethods.2006,67,67)的方法构建突变文库。第一步，模板为实施例1中的突变蛋白表达载体pUC-NadD-22D8，引物为第132位半胱氨酸和第175位色氨酸相应密码子替换为简并碱基组CKC、TWT、SAA(等摩尔比，K＝G,T；W＝A,T；S＝C,G)的引物对，PCR反应并回收产物；第二步，模板同第一步，引物为第一步中回收的PCR产物，得到的产物用DpnI限制酶进行消化，并转入DH10B感受态细胞中，得到的转化子即为可表达NadD突变体的突变文库，各突变体表达菌分别命名为DH10B(pUC-NadD-xxx)，表达蛋白产物命名为xxx。其中，xxx为数字和字母的组合，每个突变菌株对应一个编号，下同。
2.突变文库筛选
突变文库的筛选方法基本同实施例1中突变文库筛选方法，不同之处在于筛选反应体系中CTP的浓度降低至0.1mM。复筛采用放大培养，在5mL LB液体培养基中诱导表达突变体，筛选方法同上，能重复显蓝色的突变菌株即为目标突变菌株。
选其中显色较快的突变菌DH10B(pUC-NadD-1E4)，提质粒并进行测序，其表达蛋白产物1E4的氨基酸序列与野生型NadD相比，第22位脯氨酸突变为赖氨酸，132位半胱氨酸突变为异亮氨酸，176位色氨酸突变为酪氨酸。
3. 1E4催化合成NCD
突变菌DH10B(pUC-NadD-1E4)的培养，诱导表达及1E4的纯化过程同对比实施例3。从12g湿菌体中纯化得到纯酶1E4 98mg/mL，共3.2mL。测定其利用CTP合成NCD的比酶活方法同对比实施例3，为211.74U/mg，分别是野生型NadD和突变体22D8的7058倍和4.1倍。
可见，本发明得到的突变体纯酶1E4催化合成NCD的活性显著高于相应野生型蛋白和之前专利中突变体(专利申请号：201510940681.4)的活性。因此，本发明得到的突变体蛋白，催化合成NCD的性能显著优于野生型蛋白，为制备NCD和在细胞内合成NCD提供了新的生物催化剂。
4. 1E4纯酶制备NCD
10mL反应体系中含Tris(三羟甲基氨基甲烷)(pH 8.0)100mM，NMN 10mM，CTP15mM，MgCl2 8mM，并加入1E4 15mg，在30℃恒温条件下反应2h。超滤除去蛋白质，将滤出液浓缩后过甲酸型阴离子交换树脂，用水洗下未反应的NMN后，用5％甲酸洗下目标产物。浓缩后过DEAE柱进一步纯化，10mM NH4HCO3溶液洗脱。收集，冻干得铵型目标产物59.1mg，产率92.5％。
产物核磁共振数据:1H NMR(D2O,400MHz):δ9.30(s,1H),9.14(d,J＝6.1Hz,1H),8.83(d,J＝7.9Hz,1H),8.16(m,1H),7.74(d,J＝7.6Hz,1H),6.04(d,J＝5.3Hz,1H),5.92(d,J＝7.4Hz,1H),5.77(d,J＝4.0Hz,1H),4.46(m,1H),4.41(m,1H),4.33(m,1H),4.28–4.25(m,1H),4.17–4.09(m,5H),4.02–4.00(m,1H).13C NMR(D2O,100MHz):δ165.5,165.2,156.4,146.0,142.5,141.7,139.9,133.9,128.6,99.9,89.4,87.0,82.5,77.6,74.1,70.7,69.2,64.9,64.7.31P NMR(D2O,162MHz):δ–11.1,–11.3.
与对比实施例1相比，突变体1E4催化制备NCD时，反应过程更简单，且转化率更高。说明酶促合成NCD比化学法具有更低的成本及更高的效率。
实施例3组合突变体1E4-11B4催化合成NCD
1.构建1E4-11B4组合突变体表达载体
采用RF克隆(F.van den Ent,et al.Journal of Biochemical and BiophysicalMethods.2006,67,67)的方法构建组合突变体表达载体。第一步，模板为突变蛋白表达载体pUC-NadD-11B4，上游引物为NadD-33-44-s(ggtctgacgcgggtcacaatcatccctaataatgttcctcc)，下游引物为NadD-119-131-a(gacgatcaaatgtgcattgtcgagtatcgtttcgtattc)，进行PCR反应并回收产物；第二步，模板为突变蛋白表达载体pUC-NadD-1E4，引物为第一步中回收的PCR产物，得到的产物用DpnI限制酶进行消化，并转入DH10B感受态细胞中，得到的转化子即为可表达组合突变体1E4-11B4(第22位脯氨酸突变为赖氨酸，第84位酪氨酸突变为缬氨酸，第118位酪氨酸突变为天冬氨酸，第132位半胱氨酸突变为异亮氨酸，第176位色氨酸突变为酪氨酸)的菌株，命名为DH10B(pUC-NadD-1E4-11B4)。
2. 1E4-11B4催化合成NCD
突变菌DH10B(pUC-NadD-1E4-11B4)的培养，诱导表达及1E4-11B4的纯化过程同对比实施例3。从15g湿菌体中纯化得到纯酶1E4-11B4 121mg/mL，共4.0mL。测定其利用CTP合成NCD的比酶活方法同对比实施例3，为363.57U/mg，分别是野生型NadD、突变体22D8和突变体1E4的12119倍、7.1倍和1.7倍。
可见，本发明得到的组合突变体1E4-11B4催化合成NCD的活性显著高于相应野生型蛋白和之前专利中突变体(专利申请号：201510940681.4)的活性。因此，本发明得到的突变体蛋白，催化合成NCD的性能显著优于野生型蛋白，为制备NCD和在细胞内合成NCD提供了新的生物催化剂。
实施例4 1E4-11B4纯酶制备NCD
200mL 1E4-11B4纯酶制备NCD的体系中含有Tris(pH 7.5)50mM，NMN 15mM，CTP20mM，MgCl2 10mM，1E4-11B4 20mg，在37℃，200rpm反应2h，超滤除去蛋白质，将滤出液浓缩后过甲酸型阴离子交换树脂，用水洗下未反应的NMN后，用5％甲酸洗下目标产物。浓缩后过DEAE柱进一步纯化，10mM NH4HCO3溶液洗脱。收集，冻干得铵型目标产物1.89g，产率98.6％。
产物核磁共振数据:1H NMR(D2O,400MHz):δ9.30(s,1H),9.14(d,J＝6.1Hz,1H),8.83(d,J＝7.9Hz,1H),8.16(m,1H),7.74(d,J＝7.6Hz,1H),6.04(d,J＝5.3Hz,1H),5.92(d,J＝7.4Hz,1H),5.77(d,J＝4.0Hz,1H),4.46(m,1H),4.41(m,1H),4.33(m,1H),4.28–4.25(m,1H),4.17–4.09(m,5H),4.02–4.00(m,1H).13C NMR(D2O,100MHz):δ165.5,165.2,156.4,146.0,142.5,141.7,139.9,133.9,128.6,99.9,89.4,87.0,82.5,77.6,74.1,70.7,69.2,64.9,64.7.31P NMR(D2O,162MHz):δ–11.1,–11.3.
实施例5 1E4-11B4粗酶液制备NCD
将1E4-11B4的表达工程菌DH10B(pUC-NadD-1E4-11B4)划线培养，挑取单菌落接种于5mL LB(含卡那霉素50ng/μL)液体培养基中，在37℃，200rpm过夜活化；将其全部接种于500mL新鲜LB(含卡那霉素50ng/μL和IPTG 1mM)中，在30℃，200rpm培养24h。离心收集菌体，加入50mL细胞裂解液(50mM HPEPS pH 7.5，1％Triton X-100，1mg/mL溶菌酶)，在37℃，200rpm下裂解1h。离心(12000g)处理10min，收集上清，得到1E4-11B4粗酶液。
300mL粗酶液反应体系中含有：Tris(pH 7.5)100mM，NMN 20mM，CTP 25mM，MgCl215mM，1E4-11B4粗酶液40mL，在37℃，200rpm反应4h。超滤除去蛋白质，将滤出液浓缩后过甲酸型阴离子交换树脂，用水洗下未反应的NMN后，用5％甲酸洗下目标产物。浓缩后过DEAE柱进一步纯化，10mM NH4HCO3溶液洗脱。收集，冻干得铵型目标产物3.48g，产率90.8％。
产物核磁共振数据:1H NMR(D2O,400MHz):δ9.30(s,1H),9.14(d,J＝6.1Hz,1H),8.83(d,J＝7.9Hz,1H),8.16(m,1H),7.74(d,J＝7.6Hz,1H),6.04(d,J＝5.3Hz,1H),5.92(d,J＝7.4Hz,1H),5.77(d,J＝4.0Hz,1H),4.46(m,1H),4.41(m,1H),4.33(m,1H),4.28–4.25(m,1H),4.17–4.09(m,5H),4.02–4.00(m,1H).13C NMR(D2O,100MHz):δ165.5,165.2,156.4,146.0,142.5,141.7,139.9,133.9,128.6,99.9,89.4,87.0,82.5,77.6,74.1,70.7,69.2,64.9,64.7.31P NMR(D2O,162MHz):δ–11.1,–11.3.
实施例6 1E4-11B4胞内合成NCD
将1E4-11B4的表达工程菌DH10B(pUC-NadD-1E4-11B4)划线培养，挑取单菌落接种于5mL LB(含卡那霉素50ng/μL)液体培养基中，在37℃，200rpm过夜活化；以初始OD600＝0.05的接种率将其转接于5mL新鲜LB(含卡那霉素50ng/μL和IPTG 1mM)中，在30℃，200rpm培养24h。将菌液稀释至OD600为1.0，取1mL菌液离心(12000g)处理2min，收集菌体；加入500μL 50mM pH 7.2的磷酸盐缓冲液进行重悬，离心(12000g)处理2min，收集菌体；加入150μL0.2M的HCl重悬菌体，55℃加热10min，于0℃中降温5min；再加入150μL 0.1M的NaOH溶液中和，离心(12000g)处理5min，上清即为胞内NCD提取液。
胞内NCD含量的测量采用酶循环法。100μL的反应体系中含有：50mM HEPES(pH7.5)，10mM MgCl2，5mM MnCl2，50U/mL的苹果酸酶突变体ME*纯酶液，10mM L-苹果酸，0.4mMPES，1mM MTT和15μL NCD提取液，用酶标扫描仪检测570nm处吸光度变化。采用0～40μM范围内不同浓度的NCD标准品绘制标准曲线。计算得工程菌DH10B(pUC-NadD-1E4-11B4)胞内NCD含量为307.1μM。
实施例7 1E4-11B4调控苹果酸发酵产量
1.构建苹果酸发酵工程菌需要将能够合成NCD的1E4-11B4，依赖NCD(H)为辅酶的来源于施氏假单胞菌WM88的第151位异亮氨酸突变为精氨酸的亚磷酸脱氢酶突变体PDH*(将亚磷酸氧化为磷酸的同时将NCD还原为NCDH)和来源于大肠杆菌K12的第310位亮氨酸突变为赖氨酸、第404位谷氨酰胺突变为半胱氨酸的苹果酸酶突变体ME*(以NCDH为还原力催化丙酮酸生成苹果酸)，共表达于宿主E.coli XZ654(X.Zhang,et al.Applied andEnvironmental Microbiology.2011,77,427)中。三酶共表达载体以pK载体(王磊.基于烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的代谢电路研究[博士学位论文].北京：中国科学院大学，2014)为模板。采用三步RF克隆的方法。所用到的引物和模板如下表1和表2所示。得到的RF克隆产物经过转化并菌落PCR鉴定正确后提质粒送测序，测序正确的即为目标载体，命名为pK-ME*-1E4-11B4-PDH*。
表1构建共表达载体所用的引物表
| 引物名称 | 引物序列 |
| ME-F | GGATAACAATTTCACACAGGAAACACATATGGAACCAAAAACAAAAAAACAGC |
| ME-R | GGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG |
| PK-ME-F | CCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCC |
| PK-ME-R | GGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCATCCCGGAGACGGTCACAGC |
| PK-NadD-F | GCTGTGACCGTCTCCGGGATGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCC |
| PK-NadD-R | GGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCATCCCGGAGACGGTCACAGC |
表2两步RF克隆所用引物、模板简表
| RF1引物 | RF1模板 | RF2模板 | 目标载体 | |
| 1<sup>st</sup> | ME-F/R | pET24b-ME* | pK | pK-ME* |
| 2<sup>nd</sup> | pK-ME-F/R | pK-ME* | pK-PDH* | pK-ME*-PDH* |
| 3<sup>rd</sup> | pK-NadD-F/R | pUC-NadD-1E4-11B4 | pK-ME*-PDH* | pK-ME*–1E4-11B4-PDH* |
将pK-ME*-1E4-11B4-PDH*电转入E.coli XZ654感受态细胞中，得到的阳性克隆经验证正确后，即为本实施例的工程菌，命名为XYM023，其苹果酸积累途径如附图2所示。
2. 1E4-11B4调控L-苹果酸积累
XYM023发酵产生苹果酸的种子培养基为LB液体培养基，发酵培养基为最小矿物盐培养基添加10％葡萄糖，100mM KHCO3，0.15％乙酸钠，100mM亚磷酸和0.4mM IPTG。过夜活化的种子培养液以1:50的接种率接种于1.5L发酵培养基中，在30℃，200rpm培养72h。
发酵结束后取发酵液1mL加入9mL甲醇乙腈终止液(甲醇：乙腈：水，体积比为40:40:10)终止反应。采用文献方法(X.Zhang,et al.Applied and EnvironmentalMicrobiology.2011,77,427)利用离子色谱分析，发现发酵液苹果酸含量为61g/L，而相同条件下培养E.coli XZ654，发酵液苹果酸含量为34g/L。表明以葡萄糖为碳源时，工程菌XYM023的苹果酸产量提高了79％。在之前专利中，用于合成NCD的NadD突变体为NadD5G4，采用同样条件调控积累L-苹果酸，L-苹果酸产量仅提高30％(专利申请号：201510940681.4)。
本实施例的结果说明，相比于突变体NadD5G4，突变体1E4-11B4在细胞内具备更高的NCD合成效率，且工程菌XYM023可通过在胞内合成NCD，并且在PDH*作用下还原为NCDH，进而被ME*利用，推动ME*途径克服热力学屏障催化L-苹果酸合成，提高了L-苹果酸产量。本专利中，胞内合成NCD及其介导的氧化还原反应体系，为代谢工程提供了新技术。
实施例8 1F11-16D8调控D-乳酸发酵产量
1.构建1F11-16D8组合突变体表达载体
采用RF克隆(F.van den Ent,et al.Journal of Biochemical and BiophysicalMethods.2006,67,67)的方法构建组合突变体表达载体。第一步，模板为突变蛋白表达载体pUC-NadD-16D8，上游引物为NadD-33-44-s(ggtctgacgcgggtcacaatcatccctaataatgttcctcc)，下游引物为NadD-119-131-a(gacgatcaaatgtgcattgtcgagtatcgtttcgtattc)，进行PCR反应并回收产物；第二步，模板为突变蛋白表达载体pUC-NadD-1F11，引物为第一步中回收的PCR产物，得到的产物用DpnI限制酶进行消化，并转入DH10B感受态细胞中，得到的转化子即为可表达组合突变体1F11-16D8(其第22位脯氨酸突变为赖氨酸，第86位丙氨酸突变为色氨酸，第118位酪氨酸突变为天冬酰胺，第132位半胱氨酸突变为谷氨酰胺，第176位色氨酸突变为苯丙氨酸)的菌株，命名为DH10B(pUC-NadD-1F11-16D8)。
2.构建D-乳酸积累工程菌
构建D-乳酸发酵工程菌以敲除了D-乳酸生成途径的两个关键基因ldhA和dld的大肠杆菌为宿主，并利用redβ同源重组系统(Kirill A.Datsenko,et al.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America.2000,97,6640)将由阿拉伯糖诱导的合成NCD的组合突变体1F11-16D8表达盒替换至基因组中arsB位点，获得染色体整合型NCD自给工程菌XYC5016，即BW25113(△ldhA,△dld,arsB::1F11-16D8)。以pK-ME*-PDH*(王磊.基于烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的代谢电路研究[博士学位论文].北京：中国科学院大学，2014)表达载体为模板，采用RF克隆的方法，将LDH*编码基因替换至PDH*编码基因处，得到依赖NCD(H)为辅酶的来源于大肠杆菌K12的第310位亮氨酸突变为赖氨酸、第404位谷氨酰胺突变为半胱氨酸的苹果酸酶突变体ME*和来源于瑞士乳杆菌的第151位异亮氨酸突变为精氨酸、第213位天冬酰胺突变为半胱氨酸的D-乳酸脱氢酶突变体LDH*的双基因共表达载体pK-ME*-LDH*。将其转入染色体整合型NCD自给工程菌XYC5016中，获得集NCD胞内合成、还原(将L-苹果酸氧化为丙酮酸的同时将NCD还原为NCDH)及NCDH利用(以NCDH为还原力催化丙酮酸生成D-乳酸)于一体的D-乳酸积累工程菌XYD042。其D-乳酸积累途径如附图3所示。
3. 1F11-16D8调控D-乳酸积累
XYD042静息细胞催化积累D-乳酸的种子培养基为5mL LB液体培养基；将37℃，200rpm过夜活化的菌株以初始OD600＝0.1的接种率转接于50mL新鲜LB培养基(含阿拉伯糖1mM和IPTG 0.5mM)中30℃，200rpm培养24h；取约含1×1010个细胞的菌液离心并收集菌体，将其重悬于0.5mL静息细胞催化转化反应体系(50mM MOPS(pH 7.5)和10mM L-苹果酸)中，30℃，200rpm反应4h。反应结束后取反应液180μL加入1.62mL甲醇乙腈终止液(甲醇：乙腈：水，体积比为40:40:10)终止反应。
采用文献方法(X.Zhang,et al.Applied and EnvironmentalMicrobiology.2011,77,427)利用离子色谱分析，发现反应液中L-苹果酸消耗4.02mM，生成D-乳酸3.06mM，转化率为76.1％；而相同条件下培养E.coli空白对照菌BW25113(△ldhA,△dld,pK-ME*-LDH*)，其反应液中L-苹果酸消耗3.24mM，生成D-乳酸0.73mM，转化率仅为22.5％。可见，以L-苹果酸提供碳源和还原力时，胞内能够合成NCD的工程菌中L-苹果酸生产D-乳酸的转化率提高了2.4倍。
本实施例的结果说明，在工程菌XYD042中，突变体1F11-16D8可以在细胞内合成NCD，并且在ME*的作用下还原为NCDH，进而被LDH*利用，提高L-苹果酸生成D-乳酸的转化率，推动D-乳酸的积累。本专利中，胞内合成NCD及其介导的氧化还原反应体系，为代谢工程提供了新技术。
表3列出了本发明中其他部分NadD突变体的对CTP的比酶活及其表达工程菌的胞内NCD浓度。比酶活采用对比实施例3中的方法进行测定。胞内NCD浓度采用实施例6的方法进行测定。从结果可以看出，本专利中的突变体蛋白对CTP的比酶活均高于之前专利中突变体的比酶活(专利申请号：201510940681.4)。
表3 NMNAT突变体合成NCD的活性
实施例21烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体晶体解析
分别将烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体1E4-11B4和1F11-11B4进行晶体解析，以获得含有配体NCD的晶体结构。
纯化后的蛋白1E4-11B4和1F11-11B4在1.4M磷酸缓冲液(pH 8.0)中，于16℃培养七天，获得可用于衍射的目的蛋白单晶。数据收集在上海同步辐射光源BL18U1线站进行。衍射数据经过处理、校正和质量检验，获得目的蛋白的结构模型。蛋白质的三维结构采用Pymol软件进行展示，见下图4。
来源于大肠杆菌的由nadD基因编码的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶，NCBI蛋白数据库编号为NP_415172.1，含1至213位完整氨基酸序列，如下:
MKSLQALFGG TFDPVHYGHL KPVETLANLI GLTRVTIIPN NVPPHRPQPE ANSVQRKHMLELAIADKPLF TLDERELKRN APSYTAQTLK EWRQEQGPDV PLAFIIGQDS LLTFPTWYEY ETILDNAHLIVCRRPGYPLE MAQPQYQQWL EDHLTHNPED LHLQPAGKIY LAETPWFNIS ATIIRERLQN GESCEDLLPEPVLTYINQQG LYR
本发明利用烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体为催化剂，催化烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸耦合反应，制备烟酰胺胞嘧啶二核苷酸。在微生物细胞内表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的编码基因，工程菌利用内源代谢物合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸，并且胞内烟酰胺胞嘧啶二核苷酸可作为辅酶，选择性介导氧化还原反应，提高目标代谢产物产量。在一个典型实例中，L-苹果酸产量提高79％。在另一个典型实例中，L-苹果酸生产D-乳酸的转化率提高了2.4倍。
Claims (9)
1.一种酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法，其特征在于：以烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸为底物，以烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体为催化剂，合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸；
所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶为来源于大肠杆菌的由nadD基因编码的蛋白质；
所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，即突变体22C8（P22R）、突变体22D8（P22K）、突变体1D6（P22L/V23L）、突变体1E3（P22F/V23L）、突变体3G8（V23Q/W176Q）、突变体1C1（P22K/C132L/W176L）、突变体1D8（P22K/C132F/W176L）、突变体1E4（P22K/C132L/W176Y）、突变体1F11（P22K/C132Q/W176F）、突变体1H9（P22K/C132L/W176Q），以及1E4-11B4（P22K/C132L/W176Y/Y84V/Y118D）、1F11-11B4（P22K/C132Q/W176F/Y84V/Y118D）、1F11-16D8（P22K/C132Q/W176F/A86W/Y118N）、1H9-11B4（P22K/C132L/W176Q/Y84V/Y118D）、1H9-16D8（P22K/C132L/W176Q/ A86W/Y118N）。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，由相应的DNA序列编码。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，其相应的编码DNA序列，克隆在一种蛋白质表达载体中，用于可控表达。
4.按照权利要求1、2或3所述酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸方法，其特征在于：所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，由携带相应突变体的表达载体的微生物细胞产生，纯化相应突变体，并用于体外酶促反应合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸，反应条件为：pH5.0-9.0，温度25 oC-55 oC，时间0.2 - 30 h；烟酰胺单核苷酸，胞嘧啶核苷三磷酸，酸烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体三者用量摩尔比例为1:0.02-50:0.00002-0.1。
5.按照权利要求1、2或3所述酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸方法，其特征在于：所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，由携带相应突变体的表达载体的微生物细胞产生，细胞经过裂解之后得到粗酶液，并用于体外酶促反应合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸，反应条件为：pH 5.0-9.0，温度25 oC-55 oC，时间0.2 - 30 h；烟酰胺单核苷酸，胞嘧啶核苷三磷酸二者用量摩尔比例为1:0.02-50。
6.按照权利要求1、2或3所述酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸方法，其特征在于：所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，由携带相应突变体的表达载体的微生物细胞产生，直接利用细胞内源代谢物烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸，在细胞内原位合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸，反应条件为：pH 5.0-9.0，温度25 oC-55 oC。
7.一种采用权利要求4、5或6所述酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸方法的过程中连产以烟酰胺胞嘧啶二核苷酸为原料的代谢产物的应用，其特征在于：在微生物细胞中表达权利要求1所述的突变体蛋白，同时表达以烟酰胺胞嘧啶二核苷酸为辅酶的一种或两种以上蛋白，构建可被选择性调控的代谢体系，用于提高目标代谢产物产量。
8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于：在微生物细胞中表达权利要求1所述的突变体蛋白，同时表达以烟酰胺胞嘧啶二核苷酸为辅酶的来源于大肠杆菌K12的第310位亮氨酸突变为赖氨酸、第404位谷氨酰胺突变为半胱氨酸的苹果酸酶突变体和来源于施氏假单胞菌WM88的第151位异亮氨酸突变为精氨酸的亚磷酸脱氢酶突变体，并在亚磷酸存在下培养工程菌细胞，提高L-苹果酸产量。
9.按照权利要求7所述的应用，其特征在于：在微生物细胞中表达权利要求1所述的突变体蛋白，同时表达以烟酰胺胞嘧啶二核苷酸为辅酶的来源于大肠杆菌K12的第310位亮氨酸突变为赖氨酸、第404位谷氨酰胺突变为半胱氨酸的苹果酸酶突变体和来源于瑞士乳杆菌的第151位异亮氨酸突变为精氨酸、第213位天冬酰胺突变为半胱氨酸的D-乳酸脱氢酶突变体，并在L-苹果酸存在下进行静息细胞催化转化，提高D-乳酸产量。
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