CN104284981A - 在针对产丁醇生物的培养基中补充乙酸盐 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及工业微生物和醇生产领域。更具体地，本发明涉及当微生物在包含乙酸盐的发酵培养基中生长时通过重组微生物改善丁醇异构体的生产，所述重组微生物包含经工程化的丁醇途径和破坏的在发酵过程中产生副产物的途径的基因的活性。在实施例中，在包含乙酸盐作为2碳补充物的发酵培养基中，重组微生物具有提高的生长速率。

Description

在针对产丁醇生物的培养基中补充乙酸盐
技术领域
本发明涉及工业微生物和醇生产领域。更具体地，本发明涉及当微生物在包含乙酸盐的发酵培养基中生长时通过重组微生物改善了丁醇异构体的发酵生产，所述重组微生物包含经工程化的丁醇途径。
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求提交于2012年3月23日的美国临时专利申请序列号61/615，174的优先权，并且其全文以引用方式并入本文。
引用经由Efs-Web以电子方式递交的序列表
以电子方式递交的序列表的内容(20120315_CL5681USNP_SEQLIST_ST25；大小：294,486；创建日期：2013年3月14日)随同此文件提交，其全文以引用方式并入本文。
背景技术
丁醇是一种具有多种应用的重要工业化学品，其中其作为燃料或燃料添加剂的潜力尤为重要。丁醇是优选的燃料或燃料添加剂，因为它在标准内燃机中燃烧时仅生成CO2并且几乎不产生或根本不产生SOx或NOx。尽管丁醇是一种四碳醇，但是其具有与汽油相似的能含量，并且可以与任何化石燃料共混。另外，丁醇的腐蚀性不及乙醇，是目前为止最优选的燃料添加剂。
丁醇也对燃料电池产业中的氢分配问题的具有潜在影响。如今，由于氢的运输和分配存在安全隐患，燃料电池饱受困扰。然而，可以容易地对丁醇重整其氢含量，并且可以通过现有的加油站以燃料电池或汽车所需的纯度进行分配。丁醇也在塑料工业中被用作化学原料、以及在食品和风味剂工业中被用作食品级的萃取剂。每年，通过石油化学手段生产100至120亿磅的丁醇，并且对该日用化学品的需求将来很可能还会增加。
化学合成的异丁醇方法是已知的，如羰基合成、一氧化碳的催化氢化(Ullmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第6版，Wiley-VCHVerlag GmbH and Co.，Weinheim，Germany，第5卷，第716-719页(2003))和甲醇与正丙醇的格尔伯特缩合(Carlini等人，J.Molec.Catal.A.Chem.，220：215-220(2004))。这些工艺利用衍生自石油化学品的起始材料，通常昂贵，并且对环境不友好。由植物来源的原材料生产异丁醇能够使化石燃料的使用最小化。
作为酵母发酵的副产物，生物方法产生的异丁醇是微量的。它是由酵母不完全代谢氨基酸形成的“杂醇油”的一种次要组分。异丁醇具体地讲是由L-缬氨酸的分解代谢制得的。在L-缬氨酸的胺基作为氮源被利用后，所得的α-酮酸被酶脱羧并还原成异丁醇，这就是所谓的Ehrlich途径(Dickinson等人，J.Biol.Chem.273：25752-25756，1998)(“Dickinson”)。发酵培养基中加入外源L-缬氨酸可提高异丁醇的收率，如Dickinson等人所述，其中据报道通过在发酵液体培养基中提供浓度为20g/L的L-缬氨酸能获得3g/L的异丁醇收率。然而，对于工业规模生产异丁醇使用缬氨酸为原料成本过高。
先前在例如美国专利7,851,188和7,993,889中已经描述了表达经工程化的生物合成途径的微生物用于直接由糖类产生丁醇，包括异丁醇。此类产丁醇生物还可包括为了使丁醇异构体收率最大化而破坏参与发酵过程中副产物形成的某些基因。这些参与副产物形成的基因包括对于形成乙醇(参见美国专利申请公布20090305363)和形成异丁酸必需的基因。(参见PCT专利申请公布WO2012/129555)。破坏了对于形成乙醇必需的基因(例如，PDC基因)的微生物需要外源的2碳补充物用于正常生长。通常通过在培养基中添加少量乙醇满足对于2碳补充物的需要。例如，美国专利申请公布20090305363(以引用方式并入本文)描述了基因敲除了PDC的酵母菌株不能在包含2％葡萄糖作为碳源的培养基中生长，但发现在补充了少量乙醇的包含葡萄糖的培养基上生长良好。
在一些情况下，除了破坏PDC基因，破坏对于生成异丁酸必需的基因(例如，ALD6)的产丁醇生物可改变生长和产生丁醇的能力，即使在乙醇被用作2碳补充物时。虽然本领域已有对此类挑战的方法的描述，例如通过工程化所述菌株以降低2碳依赖(参见，例如，美国专利申请公布20120156735)，替换或补充此类策略的替代形式或补充的方法将代表本领域的进展。
发明内容
本文提供了生产丁醇的方法，其包括：
a.提供重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：
i.经工程化的丁醇生物合成途径；以及
b.使a)的宿主细胞与发酵培养基接触，所述发酵培养基包含：
i.可发酵的碳底物；和
ii乙酸盐；
其中所述重组宿主细胞已经经工程化以降低或消除丙酮酸脱羧酶(PDC)活性以及任选地醛脱氢酶活性；并且由此经由所述经工程化的丁醇生物合成途径来直接由可发酵的碳底物产生丁醇。在实施例中，将乙酸盐加入到发酵培养基。在实施例中，乙酸盐以足以使所述宿主细胞生长的量存在。在实施例中，乙酸盐以足以改善丁醇产生的量存在。在实施例中，将乙酸盐加入到发酵培养基。在实施例中，乙酸盐来自可再生的原料源。
本发明的一个实施例涉及生产丁醇的方法，其包括：
a.提供重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：
i.经工程化的丁醇生物合成途径；以及
b.使a)的宿主细胞与发酵培养基接触，所述发酵培养基包含：
i.可发酵的碳底物；和
ii对于a)的宿主细胞的生长以及对于丁醇产生足够量的作为2碳补充物的乙酸盐，其中将所述乙酸盐加入到所述发酵培养基；
其中所述重组宿主细胞已经经工程化以降低或消除丙酮酸脱羧酶(PDC)活性和醛脱氢酶活性；并且由此经由所述经工程化的丁醇生物合成途径来直接由可发酵的碳底物产生丁醇。
本发明的一个实施例涉及生产异丁醇的方法，其包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至乙酰乳酸(途径步骤a)；
b)来自a)的乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸(途径步骤b)；
c)来自b)的2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸(途径步骤c)；
d)来自c)的α-酮异戊酸至异丁醛(途径步骤d)；以及
e)来自d)的异丁醛至异丁醇(途径步骤e)；
并且其中
i)步骤a)的底物至产物的转化是通过乙酰乳酸合酶进行的；
ii)步骤b)的底物至产物的转化是通过乙酰羟酸异构还原酶进行的；
iii)步骤c)的底物至产物的转化是通过二羟酸脱水酶进行的；
iv)步骤d)的底物至产物的转化是通过α-酮酸脱羧酶进行的；并且
v)步骤e)的底物至产物的转化是通过醇脱氢酶进行的；
由此经由所述工程化的生物合成途径来直接由丙酮酸产生异丁醇。
本发明的一个实施例涉及生产异丁醇的方法，其包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至乙酰乳酸(途径步骤a)；
b)来自a)的乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸(途径步骤b)；
c)来自b)的2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸(途径步骤c)；
d)来自c)的α-酮异戊酸至异丁酰-CoA(途径步骤f)；以及
e)来自d)的异丁酰-CoA至异丁醛(途径步骤g)；
f)来自e)的异丁醛至异丁醇(途径步骤e)；
并且其中
i)步骤a)的底物至产物的转化是通过乙酰乳酸合酶进行的；
ii)步骤b)的底物至产物的转化是通过乙酰羟酸异构还原酶进行的；
iii)步骤c)的底物至产物的转化是通过二羟酸脱水酶进行的；
iv)步骤d)的底物至产物的转化是通过支链酮酸脱氢酶进行的；
v)步骤e)的底物至产物的转化是通过乙酰化醛脱氢酶进行的；并且
vi)步骤f)的底物至产物的转化是通过醇脱氢酶进行的；
由此经由所述经工程化的生物合成途径来直接由丙酮酸产生异丁醇。
本发明的一个实施例涉及组合物，其包含：
a)重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：
i)经工程化的丁醇生物合成途径；和
b)发酵培养基，所述发酵培养基包含：
i)可发酵的碳底物；和
ii)对于a)的宿主细胞的生长以及对于丁醇产生足够量的乙酸盐；
其中所述重组宿主细胞已经经工程化以降低或消除丙酮酸脱羧酶(PDC)活性和醛脱氢酶活性。
在实施例中，将乙酸盐加入到发酵培养基。在实施例中，乙酸盐是来自可再生的原料源。在实施例中，乙酸盐和碳底物均来自可再生的原料源。
本发明的一个实施例涉及组合物，其中所述发酵培养基还包含丁醇。
本发明的一个实施例涉及生产丁醇的方法，其包括将所述组合物保持在通过工程化的丁醇生物合成途径直接由可发酵的碳底物产生丁醇的条件下。
本发明的一个实施例涉及由本文所公开的方法而产生的丁醇。
在一些实施例中，所述具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽是PDC1、PDC5、PDC6、或它们的组合。在一些实施例中，所述具有醛脱氢酶活性的多肽是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6、或它们的组合。
在一些实施例中，所述宿主细胞已经经工程化或进化以降低或消除对于用于它们生长的外源二碳底物补充物的需求。
在一些实施例中，所述宿主细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源多核苷酸、编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源多核苷酸、或两者。
在一些实施例中，所述宿主细胞是细菌或酵母。
在一些实施例中，所述宿主细胞是经受异丁醇产生条件的全细胞催化剂。
在一些实施例中，所产生的丁醇是异丁醇。在一些实施例中，所产生的丁醇是1-丁醇。
在一些实施例中，所述方法还包括回收所述丁醇。在一些实施例中，所述回收是通过蒸馏、液-液萃取、吸附、滗析、全蒸发、或它们的组合进行的。在一些实施例中，所述方法还包括从所述发酵培养基除去固体。在一些实施例中，所述除去步骤发生在回收步骤之前。在一些实施例中，所述除去是通过离心、过滤或滗析进行的。
附图说明
图1描绘了不同的异丁醇生物合成途径。标记为“a”、“b”、“c”、“d”、“e”、“f”和“g”的步骤代表下述底物至产物的转化。步骤“a”可由例如乙酰乳酸合酶催化。步骤“b”可由例如乙酰羟酸还原异构酶催化。步骤“c”可由例如二羟酸脱水酶催化。步骤“d”可由例如支链酮酸脱羧酶催化。步骤“e”可由例如支链醇脱氢酶催化。步骤“f”可由例如支链酮酸脱氢酶催化。步骤“g”可由例如乙酰醛脱氢酶催化。
图2描绘了1-丁醇生物合成途径。标记为“a”、“b”、“c”、“d”、“e”、和“f”的步骤代表下述底物至产物的转化。步骤“a”可由例如乙酰-CoA乙酰转移酶催化。步骤“b”可由例如3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶催化。步骤“c”可由例如巴豆酸酶催化。步骤“d”可由例如丁酰基-CoA脱氢酶催化。步骤“e”可由例如丁醛脱氢酶催化。步骤“f”可由例如丁醇脱氢酶催化。
具体实施方式
本文引用的所有文件，包括期刊文章或摘要、已发表的或对应于美国或外国专利申请的、公布的或外国专利的、或任何其他文件，每一份整体以引用方式并入本文，包括被引用文件中存在的所有数据、表格、图片和文字。
本领域的那些技术人员将认识到，或能够使用不超出常规的实验探知本文所述发明的具体实施例的多个当量。此类当量旨在由权利要求书所涵盖。
本文提供的是使用表达经工程化的丁醇生物合成途径并且破坏了一个或多个参与发酵过程中副产物形成的基因的重组微生物发酵生产丁醇异构体的方法，其中将乙酸盐加入到所述发酵培养基。
如本文所公开，申请者已经发现当缺失了PDC基因(并且任选地缺失ALD6基因)的产丁醇生物在带有乙酸盐(作为外源2碳补充物)的发酵培养基中生长时，改善了生长速率或丁醇异构体产生。由于乙酸盐比乙醇便宜，使用乙酸盐作为2碳补充物降低了丁醇异构体的生产成本。
在实施例中，具有PDC-KO表型的宿主细胞可包含降低或消除了对用于它们生长的外源二碳底物补充物的需求。例如，具有PDC-KO表型的宿主细胞可经工程化(包括但不限于例如包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源多核苷酸和/或编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源多核苷酸)或进化以降低或消除对用于生长的2碳补充物的需求。虽然在此类实施例中，至少在理论上，乙酸盐对于满足2碳营养缺陷型可能不是绝对必需的，如例子中所述，本文提供的方法能改善使用此类宿主细胞的丁醇产生。
除非另行定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。如发生矛盾，以本专利申请(包括其定义)为准。此外，除非上下文另有所需，单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。为所有目的，所有的出版物、专利、以及本文提及的其它参考资料均全文以引用方式并入本文。
下文公开了合适的方法和材料，虽然在本发明的实施或试验过程中也可以使用与本文所公开的那些类似或等同的方法和材料。材料、方法和例子仅是例示性的并且不旨在进行限制。根据具体实施方式和权利要求，本发明的其他特点和优点将显而易见。为了进一步限定本发明，本文提供了以下术语和定义。
如本文所用，术语“包含/包括(comprises、comprising、includes、including)”、“具有(has、having)”、“含有(contains、containing)”或它们的任何其它变型将被理解为是指包括指定的整数或整数组但不排除任何其它整数或整数组。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而能够包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非明确指明相反，“或”是指包含性的“或”，并且不指排他性的“或”。例如，以下中任一者均满足条件A或B：A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。
如本文所用，如整个说明书和权利要求中所使用的，术语“由...组成”或诸如“由...组成”的不同时态的变型表明包括任何列举的整数或整数组，但是无附加整数或整数组可加入到指定的方法、结构或组合物中。
如本文所用，如整个说明书和权利要求中所使用的，术语“基本上由...组成”或诸如“基本上由...组成”的不同时态的变型表明包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括未显著改变指定的方法、结构或组合物的基本或新颖特性的任何列举的整数或整数组。参见M.P.E.P.§2111.03。
此外，涉及元素或组分实例(即出现)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在为非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
本文所用术语“发明”或“本发明”为非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施例，而是涵盖如专利申请所述的所有可能的实施例。
如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量或本文所述反应条件的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于制备浓缩物或溶液的一般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；通过用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等。术语“约”还包括由于产生自特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施例中，术语“约”指在报告数值的10％范围内，并且有时在报告数值的5％范围内。
在一些情况下，如本文使用的“生物质”是指产生发酵产物的微生物的细胞生物质，通常单位为g/L干细胞重(dcw)。
术语“发酵产物”包括所关注的任何所需的产物，包括但不限于1-丁醇、异丁醇等。
术语“丁醇异构体”或“丁醇”是指1-丁醇、异丁醇、或它们的混合物。异丁醇也被称为2-甲基-1-丙醇。
本文所用术语“丁醇生物合成途径”是指产生1-丁醇或异丁醇的酶途径。例如，美国专利7,993,889公开了丁醇生物合成途径，其以引用方式并入本文。
术语“异丁醇生物合成”途径是指产生异丁醇的酶途径。有时“异丁醇生物合成途径”与“异丁醇生产途径”同义地被使用。
本文所用术语“1-丁醇生物合成途径”是指产生1-丁醇的酶途径。
“重组宿主细胞”被定义为经过遗传学操作以表达生物合成生产途径的宿主细胞，其中所述宿主细胞相对于未改性的宿主细胞产生生物合成产物的量更大或产生未改性宿主细胞通常不会产生的生物合成产物。
应用于丁醇生物合成途径的术语“经工程化的”是指所述丁醇生物合成途径经过操作使得来自丙酮酸通过经工程化的丁醇生物合成途径的碳通量最大化，从而直接增加产自可发酵碳底物的丁醇数量。此类工程化包括表达异源多核苷酸或多肽、过表达内源多核苷酸或多肽、将天然不定位在细胞溶胶的蛋白质定位在细胞溶胶、增加辅因子可用性、降低竞争性途径的活性等。
术语“可发酵的碳底物”是指能被微生物代谢的碳源，诸如本文所公开的那些。合适的可发酵碳底物包括但不限于糖类，包括单糖，诸如葡萄糖、果糖、阿拉伯糖或木糖；寡糖，诸如乳糖或蔗糖；多糖，诸如淀粉、纤维素、木质纤维素或半纤维素；单碳底物、脂肪酸；以及上述物质的组合。
本文所用“发酵培养基”是指水、可发酵碳底物、液化固体、发酵产物及发酵容器内具有的所有其它物质组分的混合物，其中所述发酵产物通过在微生物存在的情况下使可发酵碳底物反应产生发酵产物、水和二氧化碳(CO2)而制得。有时，本文所用术语“发酵液体培养基”和“发酵混合物”可与“发酵培养基”同义使用。
本文所用术语“有氧条件”是指有氧气存在下的生长条件。
本文所用术语“微氧条件”是指具有低水平溶解氧的生长条件。例如，所述氧气水平可少于约1％的空气饱和度。
本文所用术语“厌氧条件”是指不存在氧气的生长条件。
术语“碳底物”是指能够被本文所公开的重组宿主细胞代谢的碳源。本文提供了非限制性的碳底物的例子，包括但不限于单糖、寡糖、多糖、乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐、甘油、二氧化碳、乙酸盐、甲醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、右旋糖、以及它们的混合物。
术语“2碳补充物”是指具有两个碳原子的碳源，在被加入到发酵培养基时，所述2碳补充物使破坏了参与发酵过程中形成副产物的蛋白活性的产丁醇生物的生长和/或丁醇产生增加。2碳补充物的非限制性例子包括乙酸盐和乙醇。
本文所用术语“产丁醇生物”是指能产生丁醇异构体的微生物。此类微生物通常是包含经工程化的丁醇生物合成途径的重组微生物。本文所用术语“产异丁醇生物”是指能产生异丁醇异构体的微生物。此类微生物通常是包含经工程化的异丁醇生物合成途径的重组微生物。
本文所用术语“PDC基因敲除”是指在编码具有PDC活性的多肽的多核苷酸或基因中、或在具有PDC1、PDC5或PDC6活性的内源多肽、或它们的任何组合中包含破坏、缺失、突变和/或替换，使得PDC活性消除或降低。
本文所用术语“ALD基因敲除”是指在编码具有醛脱氢酶活性的多肽的多核苷酸或基因中、或在具有ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、或ALD6活性的内源多肽、或它们的任何组合中包含破坏、缺失、突变和/或替换，使得ALD活性消除或降低。
如本文所用，术语“改善的丁醇生产”是指在丁醇产生参数中的改善，包括但不限于增加收率、有效速率、有效滴度或比活性或减少至少一种副产物(诸如异丁酸)收率中的至少一项。相对于乙酸盐不存在情况下的适当对照方法来确定与与乙酸盐相关联的增加或减少。
如本文所用，术语“收率”指以g/g表示的产物量/碳源量。可将收率例示为用葡萄糖作为碳源。应当理解，除非另外指明，将收率表达为理论收率的百分比。对于微生物或代谢途径，将“理论收率”定义为每个底物总量能够产生的产物最大量，所述最大量通过化学计量用于制备所述产物的代谢途径获得。例如，一种典型的葡萄糖至异丙醇的转化的理论收率是0.33g/g。同样地，从0.297g/g葡萄糖中产生的异丙醇的收率将被表达为90％的理论量或90％的理论收率。应当理解，虽然在本公开中将收率例示为用葡萄糖作为碳源，本发明能够应用于其他碳源并且所述收率可能取决于使用的碳源而变化。本领域的技术人员能够计算不同碳源的收率。
本文所用术语“有效滴度”是指每升发酵培养基通过发酵生产的丁醇异构体的总量。丁醇异构体的总量包括：(i)发酵培养基中的丁醇量；(ii)由有机萃取剂回收的丁醇异构体量；以及(iii)如果利用气提，由气相回收的丁醇异构体量。
本文所用术语“有效产率”是指每升发酵培养基通过发酵每小时产生的丁醇异构体总量。
本文所用术语“比收率”是指每克细胞的干细胞重每单位时间产生的丁醇异构体的克数。
本文所用术语“生长速率”是指微生物在培养基中生长的速率。能够通过例如测量在600纳米处的光密度来监控所述重组微生物的生长速率。倍增时间可以从生长曲线的对数部分计算并用作生长率的量度。
用于本发明的多肽和多核苷酸
如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也被称为肽键)线性连接组成的分子。术语“多肽”是指任何两个或更多个氨基酸的链，并且不涉及产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”、或其它任何用于指由两个或更多个氨基酸组成的一条链或多条链的术语，都包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可用于取代或与这些术语中任一项互换使用。多肽可来源于天然生物源或由重组技术产生，但不一定是由指定的核酸序列翻译的。它可由任何方式生成，包括通过化学合成。本发明所用的所述多肽包括全长多肽及其片段。
以“分离的”多肽或片段形式的变体和其衍生物拟为不在其自然环境下的多肽。不需要特别的纯化水平。例如，分离的多肽能够从它原生的或天然的环境中去除。为了本发明的目的，在宿主细胞中重组产生的多肽和表达的蛋白质被认为是分离的，即为天然的或重组的多肽，其已通过任何适合的技术被分离、分馏、或部分地或充分地纯化。
适用于本发明的多肽和其它酶及其片段是由多核苷酸编码的。术语“多核苷酸”旨在涵盖单个核酸以及多个核酸，并且指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、病毒来源的RNA、或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(如酰胺键，诸如存在于肽核酸(PNA)中的酰胺键)。术语“核酸”指任何一个或多个核酸片段，例如DNA或RNA片段，它们存在于多核苷酸中。如本发明所述的多核苷酸还包括合成产生的此类分子。本发明的多核苷酸可为宿主细胞天然具有的或异源的。此外，多核苷酸或核酸可为或可包括调控元件如启动子、核糖体结合位点、或转录终止子。
在某些实施例中，所述多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可包括启动子和/或其他转录或翻译控制元件，它们可操作地结合一个或多个编码区。可操作地结合是基因产物如多肽的编码区与一个或多个调控序列以将基因产物的表达置于调控序列的影响或控制下的方式结合。两个DNA片段(例如多肽编码区和与其相关联的启动子)，如果启动子功能的诱导导致编码期望基因产物的mRNA转录并且如果两个DNA片段间的连锁本质不干扰表达调控序列引导基因产物表达的能力或干扰DNA模板被转录的能力，它们是“可操作地结合的”。因此，如果启动子能够影响核酸的转录，该启动子区将与编码多肽的核酸可操作地结合。除启动子之外的其他转录控制元件例如增强子、操纵子、阻遏蛋白和转录终止信号可与所述多核苷酸可操作地结合。本文公开了适用的启动子和其他转录控制区。
多核苷酸序列可意为“分离的”，其中它从天然的环境中移除出来。例如，出于本发明的目的分离了异源多核苷酸，其编码具有酶活性(例如，将底物转化成木酮糖的能力)的多肽或多肽片段。分离的多核苷酸的另一个例子包括异源宿主细胞拥有的重组多核苷酸或溶液中的纯化的(部分地或基本上)多核苷酸。根据本发明分离的多核苷酸或核酸还包括此类人工合成生产的分子。DNA聚合物形式的分离的多核苷酸片段可以由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。
术语“基因”指能够被表达为特定蛋白质的核酸片段，其任选包括编码序列前的调节序列(5′非编码序列)和编码序列后的调节序列(3′非编码序列)。
如本文所用，“编码区”或“ORF”是核酸的一部分，其由翻译成氨基酸的密码子组成。虽然“终止密码子”(TAG、TGA、或TAA)不翻译成氨基酸，如果存在的话，可认为它是编码区的一部分，但是任何侧接序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5′和3′非翻译区等，不是编码区的一部分。“合适的调控序列”是指位于编码序列上游(5′非编码序列)、中间、或下游(3′非编码序列)并影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
多种翻译控制元件时本领域的普通技术人员已知的。这些元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子、以及来源于病毒体系的元件(尤其是内部核糖体进入位点或IRES)。在其它实施例中，本发明的多核苷酸是RNA，例如信使RNA(mRNA)形式的RNA。本发明的RNA可为单链的或双链的。
如本文所用，术语“转化”指将核酸片段转移至宿主生物体的基因组内，导致在基因上稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“重组”或“转化”生物体。
术语“质粒”、“载体”和“盒”指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。此类元件可以是线性或环状的、单链或双链DNA或RNA的、来源于任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，在其中许多核苷酸序列已被接合或组合为能够将针对所选择的基因产物的启动子片段和DNA序列与适当的3′非翻译序列一起导入细胞中的独特构造。“转化盒”指含有外来基因并且除了该外来基因外还含有有利于转化特定宿主细胞转化的元件的特定载体。“表达盒”指包含外来基因并且除该外来基因以外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的元件的特定载体。
如本文所用，“天然的”是指多核苷酸、基因或多肽的形式与天然存在的一样，带有其自身的调节序列(如果存在调节序列)。
术语“内源的”当用于指多核苷酸、基因、或多肽时是指在生物体基因组中处于其天然位置的天然多核苷酸或基因，或者对于天然多肽，从基因组中的该位置被转录和翻译。
术语“异源的”当用于指多核苷酸、基因、或多肽时是指通常不存在于宿主生物中的多核苷酸、基因、或多肽。“异源”也包括原生的编码区、或它们的一部分，即以不同于对应的原生基因的形式重新导入源生物体，例如，不在所述生物体基因组中的原生位置上。所述异源多核苷酸或基因可通过例如基因转移的方式导入宿主生物体。异源基因可包括具有被重新引入天然宿主的非天然调控区的天然编码区。“转基因”是已通过转化方法被引入基因组内的基因。
“调控序列”是指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调控序列可包括启动子、增强子、操作子、抑制子、转录终止信号、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的核酸序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整个来源于天然基因、或者可由来源于天然存在的不同启动子的不同元件组成、或者甚至包含合成的核酸片段。本领域的技术人员知道，不同的启动子可指导基因在不同的组织或细胞类型中、在不同的发育阶段、或响应于不同的环境或生理条件的表达。导致基因在大多数细胞类型中在大多数时候表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。在另一方面，“诱导型启动子”导致基因在该启动子被诱导或被启动子特异性的信号或分子开启时被表达。此外还认识到，由于大多数情况下调控序列的确切界限还未被彻底地界定，不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。例如，应当理解，“FBA1启动子”能够被用于指来源于FBA1基因的启动子区的片段。
如本文所用，术语“终止子”是指位于编码序列下游的DNA序列。这包括聚腺苷酸化识别序列以及编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3′端。3′区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。已经认识到，由于大多数情况下调控序列的确切界限还未被彻底地界定，不同长度的DNA片段可具有相同的终止子活性。例如，应当理解，“CYC1终止子”可用于指来源于CYC1基因终止子区的片段。
术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。
如本文所用，术语“表达”指源于本发明核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
本文所使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且描述在下列文献中：Sambrook等人(Sambrook、Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)(下文称为“Maniatis”)；和Silhavy等人(Silhavy等人，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor，NY，1984)；以及Ausubel，F.M.等人(Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology，由Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版，1987)。
丁醇生物合成途径
利用碳水化合物的微生物将Embden-Meyerhof-Parnas(EMP)途径、Entner-Doudoroff途径和戊糖磷酸循环用作中心代谢途径以便为生长和维持提供能量和细胞前体。这些途径均有中间体3-磷酸甘油醛，而且最终会直接形成丙酮酸或与EMP途径结合形成丙酮酸。随后，经由多种方法将丙酮酸转化为乙酰-辅酶A(乙酰-CoA)。乙酰-CoA是关键中间体，例如在生成脂肪酸、氨基酸和次级代谢物的途径中它是关键中间产物。糖转化为丙酮酸的组合反应产生能量(例如腺苷-5′-三磷酸，ATP)和还原型等价物(例如，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，以及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐NADPH)。NADH和NADPH必须被循环以形成其氧化形式(分别为NAD+和NADP+)。在存在无机电子受体(如，O2、NO，3 -和5O4 2-)的情况下，所述还原型等价物可以用于增加能量池；或者可形成还原型碳副产物。
在例如美国专利7,851,188和7,993,889中描述了可用于本发明的从可发酵碳底物产生丁醇异构体的经工程化的生物合成途径，其以引用方式并入本文。在一个实施例中，所述经工程化的丁醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径，其包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸，其可被例如乙酰羟酸异构酶催化；
c)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸，其可被例如二羟基酸脱水酶催化：
d)α-酮异戊酸至异丁醛，其可被例如α-酮酸脱羧酶催化；以及
e)异丁醛至异丁醇，其可被例如醇脱氢酶催化。
在另一个实施例中，异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸，其可被例如乙酰羟酸异构酶催化；
c)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸，其可被例如二羟基酸脱水酶催化；
d)α-酮异戊酸至异丁酰-CoA，其可被例如支链酮酸脱氢酶催化；
e)异丁酰-CoA至异丁醛，其可被例如乙酰化醛脱氢酶催化；以及
f)异丁醛至异丁醇，其可被例如醇脱氢酶催化。
用于生产可使用的1-丁醇的经工程化的生物合成途径包括在美国专利申请公布20080182308中描述的那些，其以引用的方式并入本文。在一个实施例中，1-丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA，其可被例如乙酰-CoA乙酰转移酶催化；
b)乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酸-CoA，其可被例如3-羟丁酸-CoA脱氢酶催化；
c)3-羟丁酸-CoA至丁烯酰-CoA，其可被例如巴豆酸酶催化；
d)丁烯酰-CoA至丁酰-CoA，其可被例如丁酰-CoA脱氢酶催化；
e)丁酰-CoA至丁醛，其可被例如丁醛脱氢酶催化；以及
f)丁醛至1-丁醇，其可被例如丁醇脱氢酶催化。
在一个实施例中，本发明从源自植物的碳源来生产丁醇，避免了与丁醇生产的标准石油化学工艺相关的负面的环境影响。在一个实施例中，本发明提供使用包含经工程化的丁醇生物合成途径的重组工业宿主细胞生产丁醇的方法。
在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径包括至少一个多核苷酸、至少两个多核苷酸、至少三个多核苷酸、或至少四个多核苷酸，它/它们对宿主细胞是异源的。在一些实施例中，在重组宿主细胞中丁醇生物合成途径的每种产物转化过程的底物是由异源多肽进行催化的。在实施例中，催化乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的底物至产物的转化的多肽和/或催化异丁醛至异丁醇的底物至产物的转化的多肽能够利用NADH作为辅因子。
在一些实施例中，所述产丁醇生物的经工程化的丁醇途径包括至少一个多肽，所述多肽选自具有下列酶学委员会编号的酶：EC2.2.1.6、EC1.1.1.86、EC4.2.1.9、EC4.1.1.72、EC1.1.1.1、EC1.1.1.265、EC1.1.1.2、EC1.2.4.4、EC1.3.99.2、EC1.2.1.10、EC2.3.1.9、EC2.3.1.16、EC1.1.1.35、EC1.1.1.157、EC1.1.1.36、EC4.2.1.17、EC4.2.1.55、EC1.3.1.44、EC1.3.1.38和EC1.2.1.57。
在一些实施例中，所述产丁醇生物的经工程化的丁醇途径包括至少一个选自下列酶的多肽：乙酰乳酸合酶、乙酰羟酸异构还原酶、二羟酸脱水酶、支链α-酮酸脱羧酶、支链醇脱氢酶、乙酰化醛脱氢酶、支链酮酸脱氢酶、丁酰-CoA脱氢酶、丁醛脱氢酶、乙酰-CoA乙酰转移酶、3-羟丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脱氢酶、丁醇脱氢酶和丁醛脱氢酶。
术语“乙酰羟酸合酶”和“乙酰乳酸合酶”(缩写为“ALS”)本文互换使用，是指任何具有乙酰乳酸合酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催化丙酮酸转化为乙酰乳酸和CO2的多肽。已知乙酰乳酸合酶的例子为EC编号2.2.1.6(Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，SanDiego)。这些未经修饰的酶可得自多种来源，包括但不限于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(GenBank No：CAB15618和Z99122，分另是NCBI(National Center for Biotechnology Information)氨基酸序列、NCBI核苷酸序列)、肺炎克雷伯氏菌(Klebslella pneumonlae)(GenBank No：AAA25079和M73842)、以及乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(GenBankNo：AAA25161和L16975)。
术语“酮醇酸还原异构酶”(“KARI”)、“乙酰羟酸异构还原酶”和“乙酰羟酸还原异构酶”将可互换使用，是指任何具有酮醇酸还原异构酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括能够催化(S)-乙酰乳酸转化为2，3-二羟基异戊酸反应的多肽。KARI酶的例子可归类为EC编号EC1.1.1.86(Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，San Diego)，并且得自多种微生物，包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)(SEQ ID NO：1)(GenBank No：NP_418222和NC_000913)、啤酒糖酵母(Saccharomycescerevlslae)(GenBank No：NP_013459和NC_001144)、海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)(GenBank No：CAF30210和BX957220)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(SEQ ID NO：2)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(GenBank No：CAB14789和Z99118)。KARI包括粪厌氧棒状菌(Anaerostipes caccae)KARI变体“K9G9”(SEQ ID NO：132)、“K9D3”(SEQ ID NO：133)、“K9JBP4P”(SEQ ID NO：130)、和“K9SB2-SH”(SEQ ID NO：126)。美国专利7,910,342，和8,129,162；美国专利申请公布20100197519；和国际专利申请公布WO/201I/041415中描述了酮醇酸还原异构酶(KARI)，其以引用方式并入本文。本文所公开的KARI的例子是来源于乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaerugmosa)PAO1和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)PF5突变体的那些。在一些实施例中，KARI利用NADH作为辅因子。在一些实施例中，KARI利用NADPH作为辅因子。PCT专利申请公布WO2012/129555还描述了本发明中可用的KARI变体，以引用方式并入本文。
术语“乙酰羟酸脱水酶”和“二羟酸脱水酶”(“DHAD”)是指任何具有二羟酸脱水酶的生物学活性的多肽。此类多肽包括催化2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸的多肽。已知二羟酸脱水酶例子是EC编号4.2.1.9。此类酶可得自多种微生物，包括但不限于大肠杆菌(E.cali)(GenBank No：YP_026248和NC_000913)、啤酒糖酵母(S.cerevlslae)(GenBank No：NP_012550和NC_001142)、海沼甲烷球菌(M.maripaludis)(GenBank No：CAF29874和BX957219)、和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(GenBank No：CAB14105和Z99115)，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(SEQ ID NO：3)，变异链球菌(Streptococcusmutans)(SEQ ID NO：4)和粗糙链孢霉(N.crassa)。美国专利申请公布20100081154A1和美国专利7,993,889(其以引用方式并入本文)描述了二羟酸脱水酶(DHAD)，其包括来自变异链球菌(Streptococcus mutans)的DHAD(SEQ ID NO：131)。合适的DHAD也包括变异链球菌(Streptococcus mutans)的变体诸如“L2V4”(SEQ ID NO：134)。
术语“支链α-酮酸脱羧酶”或“α-酮酸脱羧酶”或“α-酮异戊酸脱羧酶”或“2-酮异戊酸脱羧酶”(“KIVD”)是指任何具有2-酮异戊酸脱羧酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催化α-酮异戊酸转化为异丁醛和CO2的多肽。已知支链α-酮酸脱羧酶的例子为EC编号4.1.1.72，并且得自许多来源，包括但不限于乳酸乳球菌(Lactococcus lactls)(GenBank No：AAS49166、AY548760、CAG34226、和AJ746364)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(GenBank No：NP_461346和NC_003197)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(GenBank No：NP_149189和NC_001988)、溶酪巨球菌(Macrococcus caseolyticus)(SEQ ID NO：5)、和格氏李斯特菌(Listeria grayi)(SEQ ID NO：6)。
术语“支链醇脱氢酶”或“醇脱氢酶”(“ADH”)是指任何具有醇脱氢酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催化异丁醛转化为异丁醇的多肽。支链醇脱氢酶的例子是已知EC编号1.1.1.265的酶，但是所述酶也可被归类为其它醇脱氢酶(具体地讲，EC1.1.1.1或1.1.1.2)。醇脱氢酶可使用NADPH或NADH作为辅因子。这些酶可得自多种来源，包括但不限于啤酒糖酵母(S.cerevlslae)(GenBank No：NP_010656、NC_001136、NP_014051和NC_001145)、大肠杆菌(E.coli.)(GenBank No：NP_417484和NC_000913)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(GenBank No：NP 349892、NC_003030、NP_349891和NC_003030)、印度拜叶林克氏菌(B.indica)(SEQ ID NO：7)、和木糖氧化无色杆菌(A.xylosoxidans)(SEQ ID NO：8)。美国专利申请公布20090269823A1(其以引用方式并入本文)描述了一种来源于木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)的醇脱氢酶(ADH)SadB。醇脱氢酶也包括马肝ADH和印度拜叶林克氏菌(Beijerinkia indica)ADH(如美国专利申请公布20110269199所述，其以引用方式并入本文)。
术语“丁醇脱氢酶”是指任何具有丁醇脱氢酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催化异丁醛转化为异丁醇或2-丁酮转化为2-丁醇的多肽。丁醇脱氢酶是乙醇脱氢酶大家族中的一个子集。丁醇脱氢酶可以是NADH或NADPH依赖型。所述NADH依赖型酶已知为EC1.1.1.1并且可得自例如赤红球菌(Rhodococcus ruber)(GenBank No：CAD36475和AJ491307)。NADPH依赖型酶已知为EC1.1.1.2并且可得自例如强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(GenBank No：AAC25556和AF013169)。另外，丁醇脱氢酶得自大肠杆菌(Escherichia coli)(GenBank No：NP_417484和NC_000913)，并且环己醇脱氢酶得自不动杆菌属(Acinetobacter sp.)(GenBank No：AAG10026和AF282240)。术语“丁醇脱氢酶”也指催化丁醛转化成1-丁醇的酶，其使用NADH或NADPH作为辅因子。丁醇脱氢酶得自例如丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(GenBank No：NP_149325和NC_001988(注：这个酶同时具有醛和醇脱氢酶活性)、NP_349891、NC_003030、NP_349892和NC_003030)和大肠杆菌(E.coli)(GenBankNo：NP_417484和NC_000913)。
术语“支链酮酸脱氢酶”是指任何具有支链酮酸脱氢酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催化α-酮异戊酸转化为异丁酰-CoA(异丁酰辅酶A)的多肽，通常使用NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)作为电子受体。支链酮酸脱氢酶的例子已知其编号为EC1.2.4.4。此类支链酮酸脱氢酶由四个亚基构成，并且来自所有亚基的序列可得自多种微生物，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(GenBank No：CAB14336、Z99116、CAB14335、Z99116、CAB14334、Z99116、CAB14337、和Z99116)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)(GenBank No：AAA65614、M57613、AAA65615、M57613、AAA65617、M57613、AAA65618和M57613)。
术语“乙酰化醛脱氢酶”是指任何具有乙酰化醛脱氢酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催化异丁酰-CoA转化为异丁醛的多肽，其通常使用NADH或NADPH作为电子供体。已知乙酰化醛脱氢酶的例子为EC编号1.2.1.10和1.2.1.57。此类酶得自多种来源，包括但不限于拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)(GenBank No：AAD31841和AF157306)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(GenBank No：NP_149325、NC_001988、NP_149199和NC_001988)、恶臭假单胞菌(P.putida)(GenBank No：AAA89106和U13232)、和嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(GenBank No：YP_145486和NC_006461)。
术语“乙酰-CoA乙酰转移酶”是指任何具有乙酰-CoA乙酰转移酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催化两分子乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA和辅酶A(CoA)的多肽。乙酰-CoA乙酰转移酶的例子是具有对短链酰基-CoA和乙酰-CoA的底物偏好(在正向上反应)的乙酰-CoA乙酰转移酶，并且该酶归类为E.C.2.3.1.9[Enzyme Nomenclature 1992，AcademicPress，San Diego]；但是具有更广泛底物范围的酶(E.C.2.3.1.16)也将具有功能。乙酰-CoA乙酰转移酶得自多种来源，例如，大肠杆菌(Escherichia coli)(GenBank No：NP_416728和NC_000913)、丙酮丁醇梭菌(Clostrudium acetobutylicum)(GenBank No：NP_349476.1、NC_003030、NP_149242和NC_001988)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(GenBank No：NP_390297和NC_000964)、和啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank No：NP_015297和NC_001148)。
术语“3-羟丁酰-CoA脱氢酶”是指任何具有3-羟丁酰-CoA脱氢酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催化乙酰乙酰-CoA转化为3-羟丁酰-CoA的多肽。3-羟丁酰-CoA脱氢酶的例子可为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)-依赖型的、具有对(S)-3-羟丁酰-CoA或(R)-3-羟丁酰-CoA的底物偏好的酶。例子可分别归类为E.C.1.1.1.35和E.C.1.1.1.30。另外，3-羟丁酰-CoA脱氢酶可为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)-依赖型的、具有对(S)-3-羟丁酰-CoA或(R)-3-羟丁酰-CoA的底物偏好的酶，并且其可分别归类为E.C.1.1.1.157和E.C.1.1.1.36。3-羟丁酰-CoA脱氢酶得自多种来源，例如，丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(GenBank No：NP_349314和NC_003030)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(GenBank No：AAB09614和U29084)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)(GenBank No：YP_294481和NC_007347)、和真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)(GenBank No：AAA21973和J04987)。
术语“巴豆酸酶”是指任何具有巴豆酸酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催化3-羟丁酰-CoA转化为巴豆酰-CoA和H2O的多肽。巴豆酸酶的例子可具有对(S)-3-羟丁酰-CoA或(R)-3-羟丁酰-CoA的底物偏好并可分别归类为E.C.4.2.1.17和E.C.4.2.1.55。巴豆酸酶得自多种来源，例如，大肠杆菌(E.coli)(GenBank No：NP_415911和NC_000913)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(GenBank No：NP_349318和NC_003030)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(GenBank No：CAB13705和Z99113)、和豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)(GenBank No：BAA21816和D88825)。
术语“丁酰-CoA脱氢酶”是指任何具有丁酰-CoA脱氢酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催化巴豆酰-CoA转化为丁酰-CoA的多肽。丁酰-CoA脱氢酶的例子可为NADH-依赖型的、NADPH-依赖型的、或黄素-依赖型的，并且可分别归类为E.C.1.3.1.44、E.C.1.3.1.38、和E.C.1.3.99.2。丁酰-CoA脱氢酶得自多种来源，例如丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(GenBank No：NP_347102和NC_003030)、小眼虫(Euglena gracilis)(GenBank No：Q5EU90和AY741582)、山丘链霉菌(Streptomycescollinus)(GenBank No：AAA92890和U37135)、和天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)(GenBank No：CAA22721和AL939127)。
术语“丁醛脱氢酶”是指任何具有丁醛脱氢酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催化丁酰-CoA转化为丁醛的多肽，其使用NADH或NADPH作为辅因子。丁醛脱氢酶具有对NADH的偏好性，该酶已知为E.C.1.2.1.57并且得自例如拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)(GenBank No：AAD31841和AF157306)和丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(GenBankNo：NP 149325和NC 001988)。
宿主细胞
用于丁醇产生的宿主细胞可选自细菌和酵母。在实施例中，合适的宿主细胞包括任何可用于基因改性和重组基因表达的细菌或酵母。选择合适微生物宿主的标准包括如下：对所产生的丁醇异构体的固有耐受性、对葡萄糖的高利用率、用于基因操纵的遗传工具的可用性、以及产生稳定的染色体变异的能力。
在基因方面修饰宿主的能力对任何重组微生物的产生来说十分关键。基因转移技术的模式可以是电穿孔、接合、转导或自然转化。可利用多种宿主接合性质粒和药物抗性标记。基于可在宿主中产生作用的抗生素抗性标记的性质，针对该宿主生物体来定制克隆载体。
还必须操纵微生物宿主以便通过删除多种基因而使竞争碳流的途径失活。这就需要存在转座子或染色体整合载体用以引导失活。此外，生产宿主应能受到化学诱变以便得到改善的丁醇固有耐受性的突变体。
所述用于产生丁醇异构体的微生物宿主细胞优选地耐受所产生的丁醇异构体，使得丁醇异构体的收率不会受到丁醇异构体毒性的限制。在一个实施例中，所述用于异丁醇产生的宿主耐受异丁醇。对异丁醇耐受的合适的宿主菌株可通过美国专利7,993,889(以引用方式并入本文)所述的基于菌株固有耐受性的筛选方法进行鉴定。
所述用于异丁醇产生的微生物宿主也可高速利用碳水化合物，包括单糖、寡糖和多糖。大多数微生物都能够利用碳水化合物。然而，某些环境微生物不能高效利用碳水化合物，因此它们将不是合适的宿主。
基于上述标准，用于生产丁醇的适当的微生物宿主包括但不限于梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、和糖酵母属(Saccharomyces)的成员。优选的宿主包括：大肠杆菌(Escherichiacoli)、真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcus faeclum)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、白假丝酵母(Candida albicans)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、大肠杆菌(E.coli)、植物乳杆菌(L.plantarum)和啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些实施例中，所述宿主细胞是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。啤酒糖酵母(S.cerevlslae)为本领域所已知并可购自多种来源，包括但不限于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD)；Centraalbureau voorSchimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversitv Centre；LeSaffre；Gert StrandAB；Ferm Solutions；North American Bioproducts；Martrex和Lallemand。啤酒糖酵母(S.cerevisiae)包括但不限于BY4741、CEN.PK 113-7D、Ethanol Red酵母、Ferm ProTM酵母、Bio-FermXR酵母、Gert StrandPrestige Batch Turbo alcohol酵母、Gert Strand Pot Distillers酵母、GertStrand Distillers Turbo酵母、FerMaxTM Green酵母、FerMaxTM Gold酵母、Thermosacc酵母、BG-1、PE-2、CAT-1、CBS7959、CBS7960和CBS7961。
用于异丁醇产生的宿主细胞
可以采用本领域熟知的技术来构建含有必需基因的重组微生物，所述必需基因编码用于将可发酵碳底物转化为丁醇异构体的酶途径。如例如美国专利7,993,889所述，在本发明中，编码本发明其中一种丁醇生物合成途径的酶的基因可从多个来源分离获得，所述酶例如乙酰乳酸合酶、乙酰羟酸异构还原酶、二羟酸脱水酶、支链α-酮酸脱羧酶、和支链醇脱氢酶。
一旦鉴定和分离了相关的途径基因，就可将所述丁醇生物合成途径的相关酶导入宿主细胞或操作所述丁醇生物合成途径的相关酶以生成产丁醇生物，如例如美国专利7,993,889所述。所生成的产丁醇生物包含经工程化的丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述产丁醇生物是产异丁醇生物，其包含经工程化的异丁醇生物合成途径。
在一些实施例中，所述产丁醇生物是酵母。在一些实施例中，所述产丁醇生物是细菌。在一些实施例中，所述产丁醇生物是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
在一些实施例中，经工程化的产丁醇生物包含一个或多个多肽，所述多肽选自具有下列酶学委员会编号的酶：EC2.2.1.6、EC1.1.1.86、EC4.2.1.9、EC4.1.1.72、EC1.1.1.1、EC1.1.1.265、EC1.1.1.2、EC1.2.4.4、EC1.3.99.2、EC1.2.1.10、EC2.3.1.9、EC2.3.1.16、EC1.1.1.35、EC1.1.1.157、EC1.1.1.36、EC4.2.1.17、EC4.2.1.55、EC1.3.1.44、EC1.3.1.38和EC1.2.1.57。
在一些实施例中，经工程化的产异丁醇生物包含一个或多个多肽，所述多肽选自乙酰乳酸合酶、乙酰羟酸异构还原酶、二羟酸脱水酶、支链α-酮酸脱羧酶、支链醇脱氢酶、乙酰化醛脱氢酶、支链酮酸脱氢酶、丁酰-CoA脱氢酶、丁醛脱氢酶、乙酰-CoA乙酰转移酶、3-羟丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脱氢酶、丁醇脱氢酶、和丁醛脱氢酶。
在一些实施例中，通常定位于线粒体的丁醇生物合成途径的酶不定位于线粒体。在一些实施例中，经工程化的丁醇生物合成途径的酶定位于细胞溶胶。在一些实施例中，通过去除线粒体靶向序列将所述生物合成途径的酶定位于细胞溶胶。在一些实施例中，如例如美国专利7,993,889所述，通过生成新的起始密码子消除线粒体靶向，其以引用方式并入本文。在一些实施例中，所述定位于细胞溶胶的生物合成途径的酶是DHAD。在一些实施例中，所述定位于细胞溶胶的来自生物合成途径的酶是KARI。
在一些实施例中，经工程化的丁醇生物合成途径的酶可使用NADH或NADPH作为辅因子，其中NADH或NADPH起到电子供体的作用。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径的一个或多个酶使用NADH作为电子供体。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径的一个或多个酶使用NADPH作为电子供体。
产丁醇生物的其他修饰
本文所提供的产丁醇生物还可包含一种或多种其他修饰。此类修饰，例如，可包括破坏基因的活性，所述基因参与通过经工程化的丁醇生物合成途径在丁醇异构体的发酵生产过程中产生副产物。破坏参与在发酵生产丁醇异构体的过程中产生副产物的基因的活性降低了来自碳流竞争性途径的收率损耗并且增加了丁醇产生。在一些实施例中，此类修饰包括破坏丙酮酸脱羧酶、醛脱氢酶或两者的活性。
术语“丙酮酸脱羧酶”是指任何具有丙酮酸脱羧酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催化丙酮酸脱羧转化为乙醛和二氧化碳的多肽。丙酮酸脱氢酶已知为EC编号4.1.1.1。能通过本领域所熟知的和PCT专利申请公布WO2012/129555中所公开的方法测定此类多肽。这些酶存在于多种酵母中，包括啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank No：CAA97575、CAA97705和CAA97091)。在美国专利申请公布2009035363中提供了PDC的其他例子，其以引用方式并入本文。
在一些实施例中，本文所公开的产丁醇生物在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源多核苷酸和/或基因中、或具有丙酮酸脱羧酶活性的内源多肽中能包含一个修饰或破坏。在一些实施例中，本文所公开的产丁醇生物在编码具有PDC活性的多肽的内源多核苷酸或基因中、或具有PDC活性的内源多肽中能包含一个缺失、突变和/或替换。此类修饰、破坏、缺失、突变、和/或替换能够导致PDC活性被降低或消除，导致例如，PDC基因敲除(PDC-KO)表型。
酵母中的内源丙酮酸脱羧酶将丙酮酸转化成乙醛，然后将其转化成乙醇或经由乙酸转化成乙酰-CoA。酵母可具有一个或多个编码丙酮酸脱羧酶的基因。例如在光滑假丝酵母(Candida glabrata)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)中有一个编码丙酮酸脱羧酶的基因，而在糖酵母属(Saccharomyces)中有三个丙酮酸脱羧酶的同功酶，它们由PDC1、PCD5和/或PDC6基因编码。在一些实施例中，在酵母细胞中存在的至少一个PDC基因是灭活的。如果使用的酵母细胞具有多于一种的表达(活性)PDC基因，那么可修饰或灭活每个活性PDC基因，从而制备pdc-细胞。例如，在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中可修饰或灭活PDC1、PDC5和PDC6基因。如果在发酵条件下PDC基因没有活性不能用，那么此类基因就不需要修饰或灭活。在一些实施例中，缺失或下调的丙酮酸脱羧酶选自：PDC1、PDC5、PDC6、以及它们的组合。美国专利申请公布20090305363和PCT专利申请公布WO2012/129555(以引用方式并入本文)还描述了在内源丙酮酸脱羧酶中的修饰，并且以引用方式并入本文。美国专利申请公布20090305363(以引用的方式并入本文)公开了通过工程化酵母以增加丙酮酸转化为乙酰乳酸，所述工程化酵母表达定位于胞质溶胶的乙酰乳酸合酶并且基本消除了丙酮酸脱羧酶的活性。能使用各种方法鉴定具有降低的酶活性的酵母。例如，能使用通用方法鉴定具有减小的丙酮酸脱羧酶活性的酵母，所述方法包括，例如，通过气相色谱法测定乙醇形成。
其他靶基因，诸如编码丙酮酸脱羧酶蛋白质的那些，其具有与丙酮酸脱羧酶至少约70-75％、至少约75-85％、至少约80-85％、至少约85-90％、至少约90-95％、或至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性，所述基因可在文献中或在技术人员所熟知生物信息学数据库中鉴定。在美国专利申请公布20090305363和PCT专利申请公布WO2012/129555中详细描述了破坏丙酮酸脱羧酶活性的方法以及鉴定具有改性或缺失丙酮酸脱羧酶的产丁醇生物的方法。
在一些实施例中，产丁醇生物包含降低甘油-3-磷酸脱氢酶的活性的修饰，和/或破坏至少一个编码具有PDC活性的多肽基因，或破坏至少一个编码控制PDC基因表达的调控元件的基因，如美国专利申请公布20090305363和PCT专利申请公布WO2012/129555中所述，所述修饰将提供增加的通过Entner-Doudoroff途径的碳通量，或降低当量余量，如美国专利申请公布20100120105(其以引用方式并入本文)所述。在美国专利申请公布20110124060中描述了带有灭活的内源PDC基因和经工程化的生物合成途径的酵母细胞，当葡萄糖阻遏减少时改善了生长和产物收率，其以引用方式并入本文。
术语“醛脱氢酶”是指任何具有醛脱氢酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催化醛氧化(脱氢)的多肽(Wang等人，J.Bacteriol.180：822-30，1998；Navarro-Avino等人，Yeast 15：829-42，1999；和Saint-Prix等人，Microbiology 150：2209-20，2004)。此类多肽包括催化异丁醛转化至异丁酸的多肽。此类多肽也包括对应于EC编号1.2.1.3、EC1.2.1.4或1.2.1.5的多肽。能通过本领域所熟知的和PCT专利申请公布WO2012/129555中所公开的方法测定此类多肽。
在一些实施例中，产丁醇生物能在编码具有醛脱氢酶(ALD)和/或醛氧化酶活性的多肽的内源多核苷酸或基因中包含缺失、突变和/或替换，或在具有醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性的内源多肽中包含缺失、突变和/或替换。在一些实施例中，本发明的重组宿主细胞可为啤酒糖酵母(S.cerevisiae)，并且具有醛脱氢酶活性的多肽可为ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6、或它们的组合。在一些实施例中，重组宿主细胞可为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，并且具有醛脱氢酶活性的多肽可为KLLA0F00440、KLLA0E23057、KLLA0D10021、KLLA0D09999G、或它们的组合。在其它实施例中，重组宿主细胞可为树干毕赤酵母(Pichiastipitis)，并且具有醛脱氢酶活性的多肽可为ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD7、或它们的组合。在其它实施例中，重组宿主细胞可为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，并且具有醛脱氢酶活性的多肽可为AldH。在其它实施例中，重组宿主细胞可为大肠杆菌(E.coli)，并且具有醛脱氢酶活性的多肽可为aldA、aldB、aldH、或它们的组合。
在一些实施例中，所述具有醛脱氢酶活性的多肽是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的ALD6或其同源物。此类修饰、破坏、缺失、突变、和/或替换能够导致ALD活性被降低或消除，导致例如，ALD6基因敲除(ALD6-KO)表型。在PCT专利申请公布WO2012/129555中提供了更详细的醛脱氢酶多核苷酸、基因和多核苷酸的例子，其能在重组宿主细胞中作为改性或灭活的靶标。
能使用醛脱氢酶基因的内部和外部引物进行PCR筛选，或使用为醛脱氢酶基因序列设计的探针通过Southern印记法来验证特定醛脱氢酶的破坏。作为另外一种选择，能利用气相色谱-质谱或液相色谱来筛选暴露于异丁醛的菌株用于降低异丁酸的形成。例如，筛选降低了异丁酸形成的菌株的方法包括：a)提供菌株，其在编码具有醛脱氢酶活性的多肽的多核苷酸中和/或在编码具有醛氧化酶活性的多肽的多核苷酸中包含修饰；b)使所述细胞与异丁醛接触；以及c)测定异丁酸形成；其中在与不具有所述修饰的对照菌株相比，异丁酸的形成降低了。在一些实施例中，使用气相色谱-质谱进行测定。在例如PCT专利申请公布WO2012/129555中详细描述了针对醛脱氢酶的多核苷酸、基因或多肽的缺失、突变和/或替换的方法以及鉴定破坏醛脱氢酶活性的方法。
其他靶基因，诸如编码醛脱氢酶蛋白质的那些，其具有与醛脱氢酶至少约70-75％、至少约75-85％、至少约80-85％、至少约85-90％、至少约90-95％、或至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性，所述基因可在文献中或在技术人员所熟知生物信息学数据库中鉴定。
在一些实施例中，本文所述的产丁醇生物能包含降低或消除的醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性，如PCT专利申请公布WO2012/129555中所述。在一些实施例中，具有降低或消除的醛脱氢酶活性的产丁醇生物能通过经工程化的生物合成途径产生丁醇异构体，其收率或数量比不包含降低或消除的醛脱氢酶活性的产丁醇生物产生的相同异构体的收率或数量更高。
在一些实施例中，如本文所述产丁醇生物可在编码多肽的内源多核苷酸或基因中包含缺失、突变和/或替换，所述多肽参与在发酵生产丁醇异构体过程中产生副产物的途径。在一些实施例中，产丁醇生物可在内源多肽中包含一处或多处缺失、突变和/或替换，所述内源多肽参与在发酵生产丁醇异构体过程中产生副产物的途径。在一些实施例中，这些修饰存在于编码FRA2(铁阻遏蛋白)、CCC1(推测的液泡Fe2+/Mn2+转运蛋白)或GPD2(甘油-2-磷酸脱氢酶)的基因或多核苷酸中或具有FRA2、CCC1或GPD2活性的多肽及其组合中。
在其它实施例中，修饰包括整合至少一个编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径中一个步骤。其他修改包括编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的内源多核苷酸中的至少一个缺失、突变、和/或替换。在实施例中，所述具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽为啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisae)的YMR226C或其同源物。
在实施例中，宿主细胞可包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源多核苷酸和/或编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源多核苷酸，诸如，例如由SEQ ID NO：262和263编码的那些，以及如PCT专利申请公布WO2011/159853中所述的。如本文所述，这样改性的PDC-KO细胞相比于PDC-KO细胞表现出降低或消除对于用于它们生长的外源二碳底物补充物的需求。因此，如例子中所表明的，本文所提供的方法提供了如下优势：经工程化的重组宿主细胞降低或消除丙酮酸脱羧酶(PDC)活性并且包含降低或消除对于用于它们生长的外源二碳底物补充物的需求。
发酵培养基
本发明的发酵培养基必须含有合适的可发酵碳底物。合适的可发酵碳底物包括但不限于单糖，诸如葡萄糖、果糖、木糖或阿拉伯糖；寡糖诸如乳糖、麦芽糖、半乳糖或蔗糖；多糖诸如淀粉或纤维素；或它们的组合。合适的可发酵碳底物可包括来自可再生原料的未纯化的混合物，诸如奶酪乳清渗透物、玉米浆、糖用甜菜糖蜜和大麦麦芽。另外，可发酵碳底物也可以是已被证明可以被代谢转化为关键生化中间产物的一碳底物，诸如二氧化碳或甲醇。除了一碳和二碳可发酵底物之外，甲基营养生物体也已知可以利用多种其它含碳化合物，例如甲胺、葡糖胺和用于代谢活动的多种氨基酸。例如，甲基营养酵母已知可利用来自甲胺的碳来形成海藻糖或甘油(Bellion等人，Microb.Growth C1 Compd.，[Int.Symp.]，第7版，415-32。编辑：Murrell，J.Collin；Kelly，Don P.Publisher：Intercept，Andover，UK(1993))。类似地，假丝酵母属(Candida)的各种菌种将会代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.，153：485-489(1990))。因此，预期本发明中利用的碳的来源可涵盖广阔范围的包含碳的底物，并将仅受生物体的选择的限制。其他碳底物可包括乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐或甘油。
尽管预期以上提及的所有可发酵碳底物及它们的混合物均适用于本发明，优选的可发酵碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖，或者是它们与5碳糖诸如木糖和阿拉伯糖的混合物。蔗糖可来源于可再生的糖源如甘蔗、糖用甜菜、木薯、甜高粱、或它们的混合物。葡萄糖和右旋糖可通过淀粉基原料包括谷物如玉米、小麦、黑麦、大麦、燕麦、以及它们的混合物的糖化来源于可再生的谷物来源。此外，可发酵的糖类可通过预处理和糖化过程来源于可再生的纤维素的或木质纤维素的生物质，如例如美国专利7,932,063中所述，该专利以引用方式并入本文。生物质包括包含纤维素、并且任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。生物质也可包含其他组分诸如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的例子包括但不限于：玉米粒、玉米芯、作物残余物如玉米壳、玉米秸秆、玉米纤维、草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、蔗渣、高粱、大豆、从谷物的研磨中获得组分、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥、以及它们的混合物。
在一些实施例中，所述可发酵的碳底物是来源于玉米的葡萄糖。在一些实施例中，所述可发酵的碳底物是来源于小麦的葡萄糖。在一些实施例中，所述可发酵的碳底物是来源于甘蔗的蔗糖。在一些实施例中，所述可发酵的碳底物是木糖。
除了合适的碳源外，发酵培养基还必须含有本领域的技术人员已知的适于培养物生长并促进生产异丁醇所必需的酶途径的矿物质、盐、辅因子、缓冲剂及其他组分。
在一些实施例中，本发明中的所述发酵培养基含有乙酸盐作为外源2碳源，其以足以满足所述重组宿主细胞的生长的量被加入到所述发酵培养基作为补充物。在一些实施例中，所述发酵培养基中加入了足以改善丁醇产生的量的乙酸盐。在一些实施例中，加入到所述发酵培养基的乙酸盐在约0.1mM至约50mM的范围内。在一些实施例中，被加入到所述发酵培养基的乙酸盐为0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。在一些实施例中，在所述发酵培养基中糖类与2碳补充物的比率为95：5、90：10、85：15、80：20、75：25或70：30。在一些实施例中，在生长期、生产期或两者加入乙酸盐。
在一些实施例中，所述发酵培养基还可包含丁醇。在一些实施例中，丁醇在约0.01mM至约500mM的范围内。在一些实施例中，丁醇为0.01mM、1.0mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM、210mM、220mM、230mM、240mM、250mM、260mM、270mM、280mM、290mM、300mM、310mM、320mM、330mM、340mM、350mM、360mM、370mM、380mM、390mM、400mM、410mM、420mM、430mM、440mM、450mM、460mM、470mM、480mM、490mM或500mM。在一些实施例中，存在于所述发酵培养基中的丁醇为丁醇理论收率的约0.01％至约100％。在一些实施例中，存在于所述发酵培养基中的丁醇为丁醇理论收率的0.01％、0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
在一些实施例中，改善的丁醇生产表现为增加收率、有效速率、有效滴度，或比生产率。在实施例中，收率、有效速率、有效滴度，或比生产率的至少一个增加了至少约3％、至少约5％、或至少约10％。
在一些实施例中，改善的丁醇生产表现为副产物收率的下降。在实施例中，副产物收率下降了至少约3％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、或至少约50、或至少约70％。在实施例中，所述副产物为异丁酸。
发酵条件
通常，细胞在约20℃至约40℃范围的温度在适当的培养基中生长。在一些实施例中，细胞生长的温度为20℃、22℃、25℃、27℃、30℃、32℃、35℃、37℃或40℃。本发明中适合的生长培养基包括常规的商品化制备的培养基，例如Luria Bertani(LB)液体培养基、沙氏葡糖(SD)液体培养基、酵母培养基(YM)液体培养基、或包括酵母氮源、硫酸铵和右旋糖(作为碳/能源)的液体培养基，或YPD培养基，一种针对大多数啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株的生长优化比例的蛋白胨、酵母提取物、和右旋糖的混合物。其他限定或合成生长培养基也可被使用，并且适合特定微生物的生长的培养基将是微生物学或发酵科学领域的技术人员已知的。已知可以直接或间接调节分解代谢物阻遏的试剂，如环腺苷酸2′：3′单磷酸，也可以掺入发酵培养基中。
适合发酵的pH范围是从约pH3.0至约pH9.0。在一个实施例中，约pH4.0至约pH8.0被用于初始条件。在另一个实施例中，约pH3.5至约pH9.0被用于初始条件。在一个实施例中，约pH4.5至约pH6.5被用于初始条件。在一个实施例中，约pH5.0至约pH8.0被用于初始条件。适宜酵母发酵的pH值范围通常为约pH3.0至约pH9.0。适宜其它微生物体发酵的pH值范围为约pH3.0至约pH7.5。
在一些实施例中，所述发酵培养基与所述重组微生物的接触是在厌氧或微氧条件下进行的。
在一些实施例中，丁醇是在下列生长期中的一个或多个中产生的：高生长的对数期、温和通过静态延滞期、稳定期、稳态生长期以及它们的组合。
工业分批和连续发酵
在一些实施例中，可使用分批或连续发酵生产丁醇异构体。可使用分批发酵方法产生丁醇异构体，诸如异丁醇。经典的分批发酵是封闭体系，在其中培养基的组成在发酵开始时被设定，并且在发酵过程中不受人工改变。因此在发酵开始时，用所需生物体对培养基进行接种，在不向系统添加任何物质的情况下进行发酵。然而，通常来说，“分批”发酵是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批发酵系统中，代谢产物和生物质组成持续改变直至发酵结束时。在分批培养物内，细胞缓慢通过静态延滞期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。通常，对数期中的细胞负责产生大部分终产物或中间产物。
标准的分批体系的变型是补料-分批体系。补料-分批发酵方法也适用于本发明，并且包括典型的分批体系，不同之处在于底物随着发酵过程递增地被添加。在代谢产物往往抑制细胞的代谢作用以及其中期望培养基中具有有限量的底物时，补料分批式系统是有用的。补料分批式系统中的实际底物浓度难于测量并因而可根据一些可测量因素例如pH、溶解氧以及废气如CO2的分压进行评估。分批发酵和补料-分批发酵在本领域内是常用的且众所周知，并且例子可见于如下文献：Thomas D.Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA)。(1989)(“Brock”)，或Deshpande，MukundV.，Appl.Biochem.Biotechnol，36：227，(1992)，该文献以引用方式并入本文。
可使用连续发酵方法产生丁醇异构体，诸如异丁醇。连续发酵是一种开放式系统，其中将设定好的发酵培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续发酵一般而言使培养物维持在恒定的高密度，其中细胞主要处于对数期生长。连续发酵考虑到影响细胞生长或终产物浓度的一种因素或任何数量的因素的调节。例如，一种方法将维持限制性营养物质诸如碳源或氮水平处于固定速率并允许所有其它参数适度。在其它系统中，影响生长的许多因素能够连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统力求维持稳态的生长条件，并因而在发酵过程中由于培养基被取出而导致的细胞损失必须与细胞的生长率保持平衡。用于调节连续发酵工艺中的营养物质和生长因子的方法以及使产物形成速率保持最高水平的方法是工业微生物领域众所周知的，并且多种方法已由Brock详细描述。
预期可采用分批、分批补料或连续方法实行丁醇(包括异丁醇)的产生，并且任何已知的发酵模式将是合适的。此外，预期细胞可作为全细胞催化剂被固定在基质上，并经受发酵条件以生产异丁醇。
从发酵培养基分离丁醇的方法(回收)
可使用本领域已知的方法从发酵培养基回收生物产生的丁醇异构体。参见，例如，Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.49：639-648(1998)，Groot等人，Process.Biochem.27：61-75(1992)，以及本文参考。例如，可使用方法诸如蒸馏、液-液萃取、或基于膜的分离从或发酵培养基分离丁醇。美国专利申请公布20090305370、20110312043和20110312044(其以引用方式并入本文)描述了液-液萃取，其包括步骤有：使发酵液体培养基与水不混溶的萃取剂接触以形成包含水相和有机相的两相混合物。
也可利用原位产物移除(ISPR)将丁醇从发酵液体培养基中移出。在一些实施例中，ISPR包括液-液萃取。所述萃取剂通常可为有机萃取剂，其选自饱和的、单不饱和的、多不饱和的(以及它们的混合物)C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺、甘油三酯、以及它们的混合物，其与发酵液体培养基接触并形成包含水相和有机相的两相混合物。所述萃取剂也可为有机萃取剂，其选自饱和的、单不饱和的、多不饱和的(以及它们的混合物)C4-C22脂肪醇、C4-C28脂肪酸、C4-C28脂肪酸酯、C4-C22脂肪醛、C4-C22脂肪酰胺、以及它们的混合物，其与发酵液体培养基接触并形成包含水相和有机相的两相混合物。来自浆液的游离脂肪酸也可用作ISPR萃取剂。ISPR萃取剂(FFA)接触发酵液并形成包含水相和有机相的两相混合物。存在于发酵液体培养基中的产物醇优先分配到有机相中以形成包含醇的有机相。
因为丁醇异构体与水形成低沸点的共沸混合物，蒸馏仅能被用于分离混合物直至其共沸组成。蒸馏可结合其他分离方法被使用，以获得共沸物附近的分离。可结合蒸馏被用于分离和纯化丁醇的方法包括但不限于滗析、液-液萃取、吸附、和基于膜的技术。此外，可使用共沸蒸馏用夹带剂(参见例如Dohertv和Malone，Conceptual Design of Distillation Systems，McGraw Hill，New York，(2001))分离丁醇异构体。
当蒸馏与滗析联合使用以分离和纯化丁醇时，包含发酵液体培养基的丁醇被蒸馏至接近共沸组合物。然后，冷凝共沸混合物，通过滗析从发酵培养基分离丁醇。滗出的水相可作为回流返回至第一蒸馏塔。富含丁醇的滗析有机相可通过在第二蒸馏塔中蒸馏进一步被纯化。
当蒸馏与液-液萃取联合使用时，使用带有合适的溶剂的液-液萃取从发酵液体培养基萃取丁醇。然后蒸馏包含丁醇的有机相以从溶剂中分离丁醇。
当蒸馏与吸附联合使用时，蒸馏包含丁醇的发酵液使其接近共沸组成，然后使用吸附剂移除剩余的水，例如分子筛(Aden等人，Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover，Report NREL/TP-510-32438，National Renewable Energy Laboratory，2002年6月)。
当蒸馏与全蒸发联合使用时，蒸馏包含丁醇的发酵液使其接近共沸组合物，然后用全蒸发通过亲水性膜移除剩余的水(Guo等人，J.Membr.Sci.，245：199-210(2004))。
任何相中的丁醇滴度能够通过本领域中已知的方法被测定，例如通过高效液相色谱法(HPLC)或气相色谱法，如在例如美国专利申请公布US20090305370中所描述的，该专利以引用方式并入本文。
移除固体的方法
可使用本领域已知的方法移除可发酵碳底物发酵后在发酵培养基中剩余的无汁固体残余(或固体)。这些固体包含蛋白质、纤维和油脂，可以有三种类型：干酒糟(DDG)、酒糟干燥物(DDS)和干酒糟颗粒物(DDGS)。在这些固体中，仅DDGS能被用于动物饲料工业。DDGS具有高营养价值并因此适于作为动物饲料。
可通过离心、过滤、滗析等方法从发酵培养基中移除固体。移除所述固体之后，可使用诸如蒸馏、共沸蒸馏、液-液萃取、吸附、气提、膜蒸发、或全蒸发的方法从发酵培养基中分离丁醇。
实例
本发明将在下面的实例中得到进一步阐述。应该理解，尽管这些实例说明了本发明的实施例，但仅是以例证的方式给出的。从上述讨论和这些实例中，本领域的技术人员能够确定本发明的基本特性，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能够对本发明进行各种变化和修改以适应不同的用途和条件。
一般方法
适于细菌培养物维持和生长的材料和方法是本领域所熟知的。以下实例中适用的技术描述可在下列文献中查到：Manual of Methods for GeneralBacteriology(Phillipp等人编辑，American Society for Microbiology，Washington，DC.，1994)或Brock，Biotechnology：A Textbook of IndustrialMicrobiology，第二版，Sinauer Associates，Inc，Sunderland，MA(1989)。除非另外指明，用于细菌细胞生长和维持的所有试剂、限制性酶和材料得自Sigma-Aldrich Chemicals(St.Louis，MO)、BD Diagnostlc Svstems(Sparks，MD)、Invitrogen(Carlsbad，CA)、HiMedia(Mumbai，India)、SD Fine chemicals(India)、或Takara Bio Inc.(Shiga，Japan)。
测定培养基中异丁醇浓度的方法
在培养基中的异丁醇浓度可通过本领域已知的多种方法进行测定。例如，一种特异性的使用Shodex SH-1011柱和Shodex SH-G保护柱(二者均可购自Waters Corporation，Milford，Mass.)并联合折射率(RI)检测的高效液相色谱(HPLC)方法。用0.01M H2SO4作为流动相，以0.5mL/分钟流速和50℃的柱温实现色谱分离。在使用条件下异丁醇的保留时间为46.6分钟。作为另外一种选择，气相色谱法(GC)是可用的。例如，特异性的GC方法利用HP-INNOWax柱(30m×0.53mm id，1μm膜厚度，AgilentTechnologies，Wilmington，Del.)，配有火焰离子化检测器(FID)。载气为氦气，流速为4.5mL/分钟，在150℃用恒定顶压测量；注射分流比在200℃为1：25；炉温为45℃1分钟，以10℃/分钟从45℃升温至220℃，并在220℃保持5分钟；并且FID检测在240℃、26mL/分钟的氦气补气条件下使用。异丁醇的保留时间为4.5分钟。
缩写的含义如下：“sec”指秒，“min”指分钟，“h”指小时，“nm”指纳米，“uL”指微升，“mL”指毫升，“mg/mL”指毫克每毫升，“L”指升，“nm”指纳米，“mM”指毫摩尔，“M”指摩尔，“mmol”指毫摩尔，“μmole”指微摩尔，“kg”指千克，“g”指克，“μg”指微克，“ng”指纳克，“PCR”指聚合酶链反应，“OD”指光密度，“OD600”指在600nm波长下测量的光密度，“kDa”指千道尔顿，“g”也可指引力常数，“bp”指碱基对，“kbp”指千碱基对，“kb”指千碱基，“％”指百分比，“％w/v”指重量/体积百分比，“％v/v”指体积/体积百分比，“HPLC”指高效液相色谱，“g/L”指克每升，“μg/L”指微克每升，“ng/μL”指纳克每微升，“pmol/μL”指皮摩尔每微升，“RPM”指每分钟转数，“μmol/min/mg”指微摩尔每分钟每毫克，“w/v”指每单位体积重量，“v/v”指每单位体积体积。
除非另外指明，微生物菌株得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，Va。
表1提供了以下实例中使用的某些寡核苷酸引物。所有的寡核苷酸引物是由Sigma-Genosvs(Woodlands，Tex.)或Integrated DNA Technologies(IDT)(Coralville，Iowa)合成的。
表1：寡核苷酸引物
引物名称 SEQ ID NO
BK505 10
BK506 11
LA468 12
LA492 13
AK109-1 14
AK109-2 15
AK109-3 16
oBP452 17
oBP453 18
oBP454 19
oBP455 20
oBP456 21
oBP457 22
oBP458 23
oBP459 24
oBP460 25
LA135 26
oBP461 27
LA92 28
LA678 30
LA679 31
LA337 32
LA692 33
LA693 34
LA722 36
LA733 37
LA453 38
LA694 39
LA695 40
oBP594 41
oBP595 42
oBP596 43
oBP597 44
oBP598 45
oBP599 46
oBP600 47
oBP601 48
oBP602 49
oBP603 50
LA811 51
LA817 52
LA812 53
LA818 54
LA512 55
LA513 56
LA516 57
LA514 58
LA515 59
LA829 61
LA834 62
N1257 63
LA830 64
LA850 66
LA851 67
N1262 68
LA740 69
N1263 70
LA855 72
LA856 73
LA414 74
LA749 75
LA413 76
LA860 77
N1093 78
LA681 79
实例中所用菌株的构建
PNY2068的构建
啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株PNY0827被用作进一步基因操作的宿主细胞。PNY0827是指来源于啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)的一种菌株，其根据2011年9月22日的布达佩斯条约被保藏于ATCC，美国典型培养物保藏中心，Patent Depository 10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，并且具有专利保藏命名PTA-12105。
URA3的缺失和产孢成单倍体
为去除内源URA3编码区，缺失盒通过PCR扩增自pLA54(SEQ IDNO：9)，其包含PTEF1-kanMX4-TEF1t盒，盒侧接loxP位点允许体内同源重组以及后续移除KANMX4标记。使用Phusion High Fidelitv PCR MasterMix(New England BioLabs；Ipswich，MA)和引物BK505(SEQ ID NO：10)和BK506(SEQ ID NO：11)进行PCR。每种引物的URA3部分来源于URA3 ATG上游的5′区180bp和编码区下游的3′区78bp，使得kanMX4盒整合导致URA3编码区的置换。使用标准基因技术将所述PCR产物转化到PNY0827中(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页)并且在30℃补充了2％葡萄糖和100μg/mL遗传霉素的YEP培养基上选择转化子。通过菌落PCR筛选的转化子以验证所述整合盒的存在，所用引物为LA468(SEQ ID NO：12)和LA492(SEQ ID NO：13)。获得了杂合二倍体：NYLA98，其具有基因型MATa/αURA3/ura3：：loxP-kanMX4-loxP。为获得单倍体，使用标准方法形成NYLA98孢子(Codón AC，Gasent-Ramirez JM，Benitez T.Factors which affect the frequency of sporulation和tetrad formationin Saccharomyces cerevisiae baker′s yeast.Appl Environ Microbiol.1995PMID：7574601)。四分体用微操作器解剖并在补充了2％葡萄糖的丰富YPE培养基上生长。将含有四个活孢子的四分体接种至不含尿嘧啶补充了2％葡萄糖的合成完全培养基，并且通过多重菌落PCR验证交配型，所用引物为AK109-1(SEQ ID NO：14)、AK109-2(SEQ ID NO：15)、以及AK109-3(SEQ ID NO：16)。所得的经鉴定的单倍体菌株被称为NYLA103(其具有基因型：MATα ura3Δ：：loxP-kanMX4-loxP)和NYLA106(其具有基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxP)。
His3的缺失
为删除内源HIS3编码区，使用了无缝的缺失盒。使用Phusion HighFidelitv PCR Master Mix(New England BioLabs，Ipswich，MA)和用CEN.PK 113-7D基因组DNA作为模板，扩增用于无缝HIS3缺失的PCR盒的四个片段，用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen；Valencia，CA)制备。HIS3片段A的扩增使用引物oBP452(SEQ ID NO：17)和引物oBP453(SEQ ID NO：18)，其包含与HIS3片段B的5′端同源的5′尾。HIS3片段B的扩增使用引物oBP454(SEQ ID NO：19)，其包含与HIS3片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP455(SEQ ID NO：20)，其包含与HIS3片段U的5′端同源的5′尾。HIS3片段U的扩增使用引物oBP456(SEQ ID NO：21)，其包含与HIS3片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP457(SEQ IDNO：22)，其包含与HIS3片段C的5′端同源的5′尾。HIS3片段C的扩增使用引物oBP458(SEQ ID NO：23)，其包含与HIS3片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP459(SEQ ID NO：24)。PCR产物用PCR Purification kit(Qiagen)纯化。HIS3片段AB是通过重叠PCR生成的，通过混合HIS3片段A和片段HIS3B并用引物oBP452(SEQ ID NO：17)和oBP455(SEQID NO：20)扩增。HIS3片段UC通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段U和HIS3片段C并用引物oBP456(SEQ ID NO：21)和oBP459(SEQ IDNO：24)扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过GelExtraction kit(Qiagen)纯化。HIS3ABUC盒通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段AB和HIS3片段UC并用引物oBP452(SEQ ID NO：17)和oBP459(SEQ ID NO：24)扩增。用PCR Purification kit(Qiagen)纯化PCR产物。NYLA106的感受态细胞用HIS3ABUC PCR盒转化，并在30℃涂布至不含尿嘧啶补充了2％葡萄糖的合成完全培养基。通过在30℃复制涂布在不含组氨酸并补充了2％葡萄糖的合成完全培养基上验证正确整合来筛选转化子。制备基因组DNA以通过PCR验证所述整合，对于5′端所用引物为oBP460(SEQ ID NO：25)和LA135(SEQ ID NO：26)，对于3′端所用引物为oBP461(SEQ ID NO：27)和LA92(SEQ ID NO：28)。通过按照标准规程在30℃涂布于补充2％葡萄糖和5-FOA的合成完全培养基上，对URA3标记进行回收利用。通过将来自所述5-FOA平板的菌落接种到SD-URA培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得的经过鉴定的菌株PNY2003具有下列基因型：MATa ura3Δ：：loxP-kanMX4-loxP his3Δ。
PDC1的缺失
为去除内源PDC1编码区，缺失盒通过PCR扩增自pLA59(SEQ IDNO：29)，其包含URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点允许体内同源重组以及后续移除URA3标记。使用Phusion High Fidelitv PCRMaster Mix(New England BioLabs；Ipswich，MA)和引物LA678(SEQ IDNO：30)和LA679(SEQ ID NO：31)进行PCR。每种引物的PDC1部分来源于PDC1起始密码子的上游5′区50bp和终止密码子的下游3′区50bp使得URA3盒的整合导致PDC1编码区被置换，但保留了所述编码区的最初50bp和最后50bp。使用标准基因技术将PCR产物转化进PNY2003，在30℃不含尿嘧啶并且补充了2％葡萄糖的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确整合以筛选转化子，所用引物为LA337(SEQ ID NO：32)，其位于5′编码区的外部，和LA135(SEQ ID NO：26)，其为URA3内部引物。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为LA692(SEQID NO：33)和LA693(SEQ ID NO：34)，其位于PDC1编码区的内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQ ID NO：35)转化，并且在30℃涂布在不含组氨酸并补充了2％葡萄糖的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落涂布在不含尿嘧啶并补充了2％葡萄糖的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得的经过鉴定的菌株被称为PNY2008，具有下列基因型：MATa ura3Δ：：loxP-kanMX4-loxPhis3Δpdc1Δ：：loxP71/66。
PDC5的缺失
为去除内源PDC5编码区，缺失盒通过PCR扩增自pLA59(SEQ IDNO：29)，其包含URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点允许体内同源重组以及后续移除URA3标记。使用Phusion High Fidelitv PCRMaster Mix(New England BioLabs；Ipswich，MA)和引物LA722(SEQID NO：36)和LA733(SEQ ID NO：37)进行PCR。每种引物的PDC5部分来源于PDC5起始密码子上游的5′区50bp和终止密码子下游的3′区50bp，使得URA3盒整合导致整个PDC5编码区的置换。使用标准基因技术将所述PCR产物转化进PNY2008，在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确整合来筛选转化子，所用引物为LA453(SEQ ID NO：38)，其位于5′编码区的外部，和LA135(SEQ ID NO：26)，其为URA3内部引物。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为LA694(SEQ ID NO：39)和LA695(SEQ ID NO：40)，其位于PDC5编码区的内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQ ID NO：35)进行转化，并且在30℃涂布在不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富YEP培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得的经过鉴定的菌株被称为PNY2009，具有下列基因型：MATa ura3Δ：：loxP-kanMX4-loxP his3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66。
FRA2的缺失
FRA2缺失被设计为从编码序列3′端删除250个核苷酸，保留FRA2编码序列的最初113个核苷酸不动。一个阅读框终止密码子出现在去除下游7个核苷酸的位置。使用Phusion High Fidelitv PCR Master Mix(New EnglandBioLabs，Ipswich，MA)和CEN.PK 113-7D基因组DNA作为模板扩增用于无缝FRA2缺失的PCR盒的四个片段，用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen；Valencia，CA)制备。FRA2片段A的扩增使用引物oBP594(SEQ ID NO：41)和引物oBP595(SEQ ID NO：42)，其包含与FRA2片段B的5′端同源的5′尾。FRA2片段B的扩增使用引物oBP596(SEQ IDNO：43)，其包含与FRA2片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP597(SEQ ID NO：44)，其包含与FRA2片段U的5′端同源的5′尾。FRA2片段U的扩增使用引物oBP598(SEQ ID NO：45)，其包含与FRA2片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP599(SEQ ID NO：46)，其包含与FRA2片段C的5′端同源的5′尾。FRA2片段C的扩增使用引物oBP600(SEQ ID NO：47)，其包含与FRA2片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP601(SEQ IDNO：48)。PCR产物用PCR Purification kit(oiagen)纯化。FRA2片段AB是通过重叠PCR生成的，通过混合FRA2片段A和FRA2片段B并用引物oBP594(SEQ ID NO：41)和oBP597(SEQ ID NO：44)进行扩增。FRA2片段UC是通过重叠PCR生成的，通过混合FRA2片段U和FRA2片段C并用引物oBP598(SEQ ID NO：45)和oBP601(SEQ ID NO：48)进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction kit(Qiagen)纯化。所述FRA2ABUC盒是通过重叠PCR生成的，通过混合FRA2片段AB和FRA2片段UC并用引物oBP594(SEQ ID NO：41)和oBP601(SEQ ID NO：48)进行扩增。用PCR Purification kit(Qiagen)纯化PCR产物。
为删除内源FRA2编码区，使用标准技术将上述获得的无缝缺失盒转化进PNY2009并涂布在不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。制备基因组DNA以通过PCR验证整合，所用引物为oBP602(SEQ IDNO：49)和LA135(SEQ ID NO：26)用于5′端，和引物oBP602(SEQ IDNO：49)和oBP603(SEQ ID NO：50)来扩增整个基因座。通过按照标准规程在30℃涂布于补充1％乙醇和5-FOA(5-氟乳清酸)的合成完全培养基上，对URA3标记进行回收利用。通过将来自5-FOA平板的菌落接种到不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株PNY2037具有下列基因型：MATa ura3Δ：：loxP-kanMX4-loxP his3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ。
加入2μ质粒
使用Phusion DNA聚合酶(New England BioLabs；IpsWich，MA)从pLA59(SEQ ID NO：29)PCR扩增loxP71-URA3-loxP66标记，，并且在30℃SE-URA平板上与LA811×817(SEQ ID NO：51，52)和LA812x818(SEQ ID NO：53，54)2-μ质粒一起转化进菌株PNY2037。用pLA34(pRS423：：cre)(也称pLA34)(SEQ ID NO：35)转化所得的菌株PNY20372u：：loxP71-URA3-loxP66并且在30℃SE-HIS-URA平板上进行选择。将所述转化子接种至YP-1％半乳糖平板上，使其在30℃生长48小时以诱导Cre重组酶表达。然后将单个菌落接种至SE-URA、SE-HIS和YPE平板以确认URA3标记移除。所得经鉴定的菌株PNY2050具有下列基因型：MATa ura3Δ：：loxP-kanMX4-loxP，his3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μ。
GPD2的缺失
为去除内源GPD2编码区，缺失盒通过PCR扩增自pLA59(SEQ IDNO：29)，其包含URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点允许体内同源重组以及后续移除URA3标记。使用Phusion High Fidelitv PCRMaster Mix(New England BioLabs；Ipswich，MA)和引物LA512(SEQ IDNO：55)和LA513(SEQ ID NO：56)进行PCR。每种引物的GPD2部分来源于GPD2起始密码子上游的5′区50bp和终止密码子下游的3′区50bp，使得URA3盒整合导致整个GPD2编码区的置换。使用标准基因技术将所述PCR产物转化进PNY2050，在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确整合来筛选转化子，所用引物为LA516(SEQ ID NO：57)，其位于5′编码区的外部，和LA135(SEQ ID NO：26)，其位于URA3内部。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为LA514(SEQ ID NO：58)和LA515(SEQ ID NO：59)，其位于GPD2编码区的内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQ ID NO：35)进行转化，并且在30℃涂布在不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株PNY2056具有下列基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxPhis3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μgpd2Δ。
YMR226的缺失和AlsS的整合
为了删除内源YMR226C编码区，整合盒通过PCR扩增自pLA71(SEQ ID NO：60)，其包含来自菌种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的乙酰乳酸合酶基因，所述基因带有FBA1启动子和CYC1终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用来自Kapa Biosystems(Woburn，MA)的KAPA HiFi和引物LA829(SEQ ID NO：61)和LA834(SEQ ID NO：62)进行PCR。每种引物的YMR226C部分来源于所述编码序列的最初60bp和位于终止密码子上游409bp处的65bp。使用标准基因技术将所述PCR产物转化进PNY2056，在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确整合来筛选转化子，所用引物为N1257(SEQ ID NO：63)，其位于5′编码区的外部，和LA740(SEQ IDNO：69)，其位于FBA1启动子内部。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为N1257(SEQ ID NO：63)和LA830(SEQ ID NO：64)，其位于YMR226C编码区内部，和引物LA830(SEQ ID NO：64)，其位于3′编码区的外部，和LA92(SEQ ID NO：28)，其位于URA3标记内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQ ID NO：35)进行转化，并且在30℃涂布在不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株PNY2061具有下列基因型：MATa ura3Δ：：loxP-kanMX4-loxPhis3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μgpd2Δymr226cΔ：：PFBA1-alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66。
ALD6的缺失和KivD的整合
为了删除内源ALD6编码区，整合盒通过PCR扩增自pLA78(SEQ IDNO：65)，其包含来自菌种格氏李斯特菌(Listeria grayi)的kivD基因，所述基因带有杂合的FBA1启动子和TDH3终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用来自Kapa Biosystems(Woburn，MA)的KAPA HiFi和引物LA850(SEQ ID NO：66)和LA851(SEQ ID NO：67)进行PCR。每种引物的ALD6部分来源于所述编码序列的最初65bp和所述编码区的最后63bp。使用标准基因技术将所述PCR产物转化进PNY2061，在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确整合来筛选转化子，所用引物为N1262(SEQ ID NO：68)，其位于5′编码区的外部，和LA740(SEQ ID NO：69)，其位于FBA1启动子内部。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为N1263(SEQ ID NO：70)，其位于3′编码区的外部，和LA92(SEQ ID NO：28)，其位于URA3标记内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQ ID NO：35)进行转化，并且在30℃涂布在不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株PNY2065具有下列基因型：MATa ura3Δ：：loxP-kanMX4-loxP his3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μ gpd2Δymr226cΔ：：PFBA1-alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66ald6Δ：：(UAS)PGK1-PFBA1-kivD_Lg-TDH3t-loxP71。
ADH1的缺失和ADH的整合
ADH1是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevistae)中存在的内源醇脱氢酶。如下所述，用来自印度拜叶林克氏菌(Beijerinckii indica)的醇脱氢酶(ADH)置换内源ADH1。
为了删除内源ADH1编码区，整合盒通过PCR扩增自pLA65(SEQ IDNO：71)，其包含来自菌种印度拜叶林克氏菌(Beijerinckii indica)的醇脱氢酶，所述醇脱氢酶带有1LV5启动子和ADH1终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用来自Kapa Biosystems(Woburn，MA)的KAPA HiFi和引物LA855(SEQ ID NO：72)和LA856(SEQ ID NO：73)进行PCR。每种引物的ADH1部分来源于ADH1起始密码子上游的5′区50bp和所述编码区的最后50bp。使用标准基因技术将所述PCR产物转化进PNY2065，在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确整合来筛选转化子，所用引物为LA414(SEQ ID NO：74)，其位于5′编码区的外部，和LA749(SEQ ID NO：75)，其位于ILV5启动子内部。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为LA413(SEQ ID NO：76)，其位于3′编码区的外部，和LA92(SEQ ID NO：28)，其位于URA3标记内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQ ID NO：35)进行转化，并且在30℃涂布在不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得的经过鉴定的菌株PNY2066具有下列基因型：MATa ura3Δ：：loxP-kanMX4-loxPhis3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μ gpd2Δymr226cΔ：：PFBA1-alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66ald6Δ：：(UAS)PGK1-PFBA1-kivD_Lg-TDH3t-loxP71/66 adh1Δ：：PILV5-ADH_Bi(y)-ADH1t-loxP71/66。
将ADH整合至pdc1Δ基因座
为在pdc1Δ区整合另外的ADH拷贝，整合盒通过PCR扩增自pLA65(SEQ ID NO：71)，其包含来自菌种印度拜叶林克氏菌(Beiierinckiiindica)的醇脱氢酶，所述醇脱氢酶带有ADH1终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用来自Kapa Biosystems(Woburn，MA)的KAPA HiFi和引物LA860(SEQ ID NO：77)和LA679(SEQ ID NO：31)进行PCR。每种引物的PDC1部分来源于PDC1起始密码子的上游5′区60bp和位于终止密码子上游103bp处的50bp。使用了内源的PDC1启动子。使用标准基因技术将所述PCR产物转化进PNY2066，在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确整合来筛选转化子，所用引物为LA337(SEQ ID NO：32)，其位于5′编码区的外部，和N1093(SEQ ID NO：78)，其位于BiADH基因内部。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为LA681(SEQ ID NO：79)，其位于3′编码区的外部，和LA92(SEQ ID NO：28)，其位于URA3标记内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQID NO：35)进行转化，并且在30℃涂布在不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株，被称为PNY2068，具有以下基因型：MATa ura3Δ：：loxP-kanMX4-loxP his3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μ gpd2Δymr226cΔ：：PFBAI-alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66ald6Δ：：(UAS)PGK1-PFBA1-kivD_Lg-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：PILV5-ADH_Bi(y)-ADH1t-loxP71/66pdc1Δ：：PPDC1-ADH_Bi(y)-ADH1t-loxP71/66。
构建产异丁醇生物菌株PNY2270
使用两种质粒通过转化细胞从菌株PNY2068(如上所述)生成PNY2270，所述质粒为pHR81-ILV5p-K9SB2(SEQ ID NO：80)和pYZ067DkivDDhADH(SEQ ID NO：81)。通过乙酸锂转化方法(Methodsin Yeast Genetics，2005，第113页)导入质粒，并且在无组氨酸和尿嘧啶、带有1％乙醇作为碳源的合成完全培养基上选择转化子。然后将转化子转移至包含无组氨酸和尿嘧啶、带有2％葡萄糖作为碳源以及乙醇(0.05％)或乙酸盐(2mM)作为2碳补充物的合成完全培养基的平板上。
pHR81-ILV5p-K9SB2(SEQ ID NO：80)包含由ILV5启动子驱动的粪厌氧棒状菌(A.caccae)K9SB2KARI基因和pHR81质粒主链中的ILV5终止子。pYZ067DkivDDhADH(SEQ ID NO：81)包含由FBA1启动子驱动的变异链球菌(S.mutans)ilvD基因和pRS423质粒主链中的FBA1终止子。
构建产异丁醇生物菌株PNY2092
通过质粒转化基础菌株PNY2061(如上所述)构建菌株PNY2092，所述基础菌株PNY2061具有下述基因型：MATa ura3Δ：：loxP-kanMX4-loxPhis3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μgpd2Δymr226cΔ：：PFBA1-alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66，带有质粒pHR81-ILV5p-R8B2y2(SEQ ID NO：82)和pLA84(SEQ ID NO：83)。
pHR81-ILV5p-R8B2v2(SEQ ID NO：82)包含由ILV5启动子驱动的荧光假单胞菌(P.fluorescerns)R8B2KARI(针对酵母密码子优化的)和pHR81质粒主链中的ILV5终止子。pLA84(SEQ ID NO：83)包含由FBA1启动子驱动的来自变异链球菌(S.mutans)的IlvD和FBA1终止子，由GPM1启动子驱动的来自印度拜叶林克氏菌(Beijerinckii indica)的ADH和ADH1终止子以及由TDH3启动子驱动的来自格氏李斯特菌(Listeriagrayi)的KivD和pRS423质粒主链中的TDH3终止子。
构建产异丁醇生物菌株PNY2118、PNY2120和PNY2318
从PNY2050构建PNY2115
从PNY2050至PNY2115[MATa ura3Δ：：loxP his3Δpdc5Δ：：loxP66/71fra2Δ2-μ质粒(CEN.PK2)pdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66fra2Δ：：P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66gpd2Δ：：loxP71/66]的构建过程如下。
Pdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxp71/66
为将alsS整合进PNY2050的pdc1Δ：：loxP66/71基因座(使用内源PDC1启动子)，整合盒通过PCR扩增自pLA71(SEQ ID NO：60)，其包含来自菌种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的乙酰乳酸合酶基因，所述基因带有FBA1启动子和CYC1终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用KAPA HiFi和引物895(SEQ ID NO：84)和679(SEQ ID NO：31)进行PCR。每种引物的PDC1部分来源于所述编码序列的上游的60bp和位于终止密码子上游53bp的50bp。使用标准基因技术将所述PCR产物转化进PNY2050，并且在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确的整合来筛选转化子，所用引物为681(SEQ ID NO：79)，其位于3’编码区的外部，和LA92(SEQ ID NO：28)，其位于URA3基因内部。然后制备阳性转化子基因组DNA，并且通过PCR进行筛选，所用引物为N245(SEQ ID NO：85)和N246(SEQ IDNO：86)。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQ ID NO：35)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株，被称为PNY2090，具有下列基因型：MATa ura3Δ：：loxP，his3Δ，pdc1Δ：：loxP71/66，pdc5Δ：：loxP71/66 fra2Δ2-μ  pdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66。
Pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66
为了删除内源PDC6编码区，整合盒通过PCR扩增自pLA78(SEQ IDNO：65)，其包含来自菌种格氏李斯特菌(Listeria grayi)的kivD基因，所述基因带有杂合的FBA1启动子和TDH3终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用KAPA HiFi和引物896(SEQ ID NO：87)和897(SEQ IDNO：88)进行PCR。每种引物的PDC6部分来源于所述编码序列上游的60bp和所述编码区下游的59bp。使用标准基因技术将所述PCR产物转化进PNY2090，并且在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确的整合来筛选转化子，所用引物为365(SEQ ID NO：89)和366(SEQ ID NO：90)，其为PDC6基因的内部引物。然后通过菌落PCR筛选产物不存在的转化子，N638(SEQ ID NO：91)，其位于所述基因的5’端，和740(SEQ ID NO：69)，其位于FBA1启动子内部。制备阳性转化子的基因组DNA并使用PDC6编码序列的两个外部引物通过PCR进行筛选。阳性整合子会产生4720bp的产物，而PDC6野生型转化子会产生2130bp的产物。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34进行转化，并且在30℃涂布在不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株被称为PNY2093，具有基因型为：MATaura3Δ：：loxP his3Δpdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μpdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66
Adh 1Δ：：P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66
为了删除内源ADH1编码区并且使用内源ADH1启动子整合BiADH，整合盒通过PCR扩增自pLA65(SEQ ID NO：71)，其包含来自菌种印度拜叶林克氏菌(Beijerinckii)的醇脱氢酶，所述醇脱氢酶带有ILV5启动子和ADH1终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用KAPA HiFi和引物856(SEQ ID NO：73)和857(SEQ ID NO：110)进行PCR。每种引物的ADH1部分来源于ADH1起始密码子上游的5’区50bp和所述编码区的最后50bp。使用标准基因技术将所述PCR产物转化进PNY2093，并且在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确的整合来筛选转化子，所用引物为BK415(SEQ ID NO：92)，其位于5编码区’的外部，和N1092(SEQ ID NO：93)，其位于BiADH基因内部。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为413(SEQ ID NO：76)，其位于3′编码区的外部，和92(SEQ ID NO：28)，其位于URA3标记内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQ ID NO：35)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株被称为PNY2101，具有基因型为：MATaura3Δ：：loxP his3Δpdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μpdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66。
Fra2Δ：：P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP 71/66
为将BiADH整合至PNY2101的fra2Δ基因座，整合盒通过PCR扩增自pLA65(SEQ ID NO：71)，其包含来自菌种印度拜叶林克氏菌(Beijerinckii indica)的醇脱氢酶，所述醇脱氢酶带有ILV5启动子和ADH1终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用KAPA HiFi和引物906(SEQ ID NO：94)和907(SEQ ID NO：95)进行PCR。每种引物的FRA2部分来源于始于ATG处的编码序列的最初60bp和终止密码子下游的56bp。使用标准基因技术将所述PCR产物转化进PNY2101，并且在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确的整合来筛选转化子，所用引物为667(SEQ ID NO：96)，其位于5′编码区的外部，和749(SEQ ID NO：75)，其位于ILV5启动子内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQ ID NO：35)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株被称为PNY2110，具有基因型为：MATa ura3Δ：：loxP his3Δpdc5Δ：：loxP66/712-μpdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66fra2Δ：：P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66。
GPD2缺失
为去除内源GPD2编码区，缺失盒通过PCR扩增自pLA59(SEQ IDNO：29)，其包含URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点允许体内同源重组以及后续移除URA3标记。通过使用KAPA HiFi和引物LA512(SEQ ID NO：55)和LA513(SEQ ID NO：56)进行PCR。每种引物的GPD2部分来源于GPD2起始密码子上游的5’区50bp和终止密码子下游的3′区50bp，使得URA3’盒整合导致整个GPD2编码区的置换。使用标准基因技术将所述PCR产物转化进PNY2110，在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确的整合来筛选转化子，所用引物为LA516(SEQ ID NO：57)，其位于5’编码区的外部，和LA135(SEQ ID NO：26)，其位于URA3内部。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为LA514(SEQ ID NO：58)和LA515(SEQ IDNO：59)，其位于GPD2编码区的内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQ ID NO：35)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株被称为PNY2115，具有基因型为：MATa ura3Δ：：loxP his3Δpdc5Δ：：loxP66/71fra2Δ2-μpdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66fra2Δ：：P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66gpd2Δ：：loxP71/66。
从PNY2115构建PNY2145
通过在pdc5Δ基因座另外整合磷酸解酮酶基因盒，并且通过用来自CEN.PK的经过密码子优化的直向同源物版本置换原生的AMN1基因，从PNY2115构建PNY2145。下面进一步描述整合构建体。
pdc5Δ：：FBA(L8)-xPk1-CYC1t-loxP71/66
TEF(M4)-xpk1-CYC1t基因来自pRS423：：TEF(M4)-xpk1+ENO1-eutD(SEQ ID NO：111)是通过PCR扩增的，所用引物为N1341和N1338(SEQ ID NO：112和113)，生成3.1kb的产物。侧接loxP的URA3基因盒来自pLA59(SEQ ID NO：29)是用引物N1033c和N1342(SEQ ID NO：114和115)扩增的，生成1.6kb的产物。xpkl和URA3PCR产物的融合是通过将两者混合、不加引物、使用Phusion DNA聚合酶进行额外10个循环的PCR来实现的。然后将所得反应混合物用作模板，用KAPA Hi Fi和引物N1342和N1364(SEQ ID NO：115和116)进行PCR反应。从电泳琼脂糖凝胶(Zymo kit)纯化来回收4.2kb的PCR产物。扩增FBA启动子变体L8(SEQ ID NO：117)，所用引物为N1366和N1368(SEQ ID NO：118和119)。通过额外轮次的PCR将xpkl：：URA3PCR产物与FBA启动子组合。用多核苷酸激酶磷酸化所得的产物，并且连接进经过EcoRV消化和小牛肠磷酸酶处理的pBR322。将连接反应转化进大肠杆菌(E.coli)细胞(来自Invitrogen的Stb13感受态细胞)。通过测序确认所述整合盒。为制备用于整合的DNA，所述质粒被用作PCR反应的模板，使用了Kapa HiFi和引物N1371和N1372(SEQ ID NO：120和121)。通过苯酚-氯仿萃取和乙醇沉淀分离所述PCR产物(使用标准方法；例如Maniatas等人)。使用5微克DNA转化菌株PNY2115。在不含尿嘧啶的培养基(无尿嘧啶、带有1％乙醇作为碳源的合成完全培养基)上选择转化子。用PCR筛选菌落的整合事件(JumpStart)，所用引物为BK93和N1114(SEQ ID NO：122和123)。选取了两个克隆继续操作。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pJT254(SEQ ID NO：97)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。转化子生长在补充了1％乙醇的丰富培养基上以解除对重组酶的阻遏。对于分离的单个菌落，通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。通过将所述菌落接种至不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上来确认重组酶质粒pJT254的缺失。通过PCR确认正确的标记移除(引物N160SeqF5(SEQ ID NO：124)和BK380(SEQ ID NO：125))。一个所得的克隆被命名为PNY2293。
amn1Δ：：AMN1(y)-loxP71/66
为将内源的AMN1拷贝置换为来自CEN.PK2的经过密码子优化的AMN1基因版本，通过SOE PCR组装包含CEN.PK AMN1启动子、AMN1(y)基因(核酸SEQ ID NO：98；氨基酸SEQ ID NO：99翻译)、和CEN.PK AMNl终止子的整合盒，并且亚克隆至穿梭载体pLA59。AMNl(y)基因定制于DNA2.0，针对啤酒糖酵母(S.cerevisiae)优化了密码子。完整的pLA67质粒(SEQ ID NO：100)包含：1)pUC19载体主链序列，其包含大肠杆菌(E.coli)复制起点和氨苄青霉素抗性基因；2)URA3选择标记，其侧接loxP71和loxP66位点；和3)PAMN1(CEN.PK)-AMNl(y)-tennAMN1(CEN.PK)表达盒。
AMN1(y)-loxP71-URA3-loxP66盒的PCR扩增是通过使用来自KapaBiosvstems(Woburn，MA)的KAPA HiFi和引物LA712(SEQ ID NO：101)和LA746(SEQ ID NO：102)进行的。使用标准基因技术将所述PCR产物转化进PNY2293，在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。相对于对照(PNY2293)，在放大镜下观察到了转化子无结块的表型。使用如上所述的pJT254Cre重组酶质粒回收URA3标记。在标记回收后，在放大镜下再次观察克隆以确认无结块的表型。所得经鉴定的菌株PNY2145具有下列基因型：MATa ura3Δ：：loxP his3Δpdc5Δ：：P[FBA(L8)]-XPK|xpk1_Lp-CYCt-loxP66/71fra2Δ2-μ质粒(CEN.PK2)pdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66fra2Δ：：P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66gpd2Δ：：loxP71/66amn1Δ：：AMN1(y)。
通过将酵母-大肠杆菌(E.coli)穿梭载体转化进菌株PNY2115同时构建PNY2118和PNY2120。通过将细胞涂布在不含尿嘧啶或组氨酸、包含1％乙醇(v/v)作为唯一碳源的合成完全培养基上选择质粒转化子。PNY2118是接受了质粒pYZ067ΔkivDΔhADH(SEQ ID NO：103)(如PCT公布WO2012/129555所述)和pHR81-ILV5p-K9JB4P(SEQ ID NO：104)的克隆。PNY2120是接受了质粒pHR81-ILV5p-K9SB2-SH(SEQ ID NO：105)和pYZ067ΔkivDΔhADH的克隆。所述pHR81-ILV5p-K9JB4P和pHR81-ILV5p-K9SB2-SH质粒是基于pHR81(购自ATCC，#87541，Manassas，VA)，并且包含表达KARI的基因(分别为变体K9JB4P，SEQID NO：106核酸和SEQ ID NO：107蛋白质；和K9SB2-SH，SEQ ID NO：126)。质粒DYZ067ΔkivDΔhADH来源于DRS423(购自ATCC，#77104)并且包含表达DHAD的基因。
通过用质粒pLH689-L2V4(SEQ ID 108)和pRS413：：BiADH-kivD(SEQ ID 109)转化PNY2145来构建PNY2318。如上所述获得转化子PNY2118和PNY2120。质粒pLH689-L2V4是基于pHR81的，并且包含表达KARI(K9JB4P变体，氨基酸SEQ ID NO：107；在ILV5启动子的控制下)和DHAD(包含C-末端Lumio标记的L2V4变体，氨基酸SEQ ID NO：127；在TEF(M7)启动子的控制下)的基因。质粒pRS413：：BiADH-kivD是基于pRS413(ATCC#)的，并且包含表达BiADH(氨基酸SEQ ID NO：128；在PDC1启动子的控制下)和格雷氏李斯特菌(L.grayi)kivD(氨基酸SEQ ID NO：129，在PGK(UAS)-FBA1杂合启动子的控制下)的基因。
实例1
由PNY2270产生异丁醇
这个实例的目的是展示在包含乙醇或乙酸盐作为2碳补充物的生长培养基中菌株PNY2270的生长和异丁醇产生。
PNY2270是在30℃的平台摇动器中(220rpm)、在带有0.3％葡萄糖和2mM乙酸盐或0.3％(vol/vol)乙醇的合成完全培养基上有氧培养的(在125mL通气烧瓶中有10mL培养基)。在补充了乙酸盐的培养基中的对数生长速率比带有乙醇的高40％。在两种培养基中的培养物生长至大约光密度2(使用Eppendorf BioPhotometer(Eppendorf AG，Hamburg，Germany)进行测量)。然后将培养基接种至血清瓶(15mL小瓶含10mL培养基)中带有2％葡萄糖、BME维生素以及2mM乙酸盐或0.05％(vol/vol)乙醇的合成完全培养基上，起始OD为0.2。将小瓶加塞、压接，并且在30℃平台摇动器中(220rpm)温育。48小时后，移出压接和塞子，测量光密度，通过HPLC分析培养物滤液的异丁醇产生。
发现在包含乙酸盐的培养基中生长的菌株产生异丁醇的浓度高于在不含乙酸盐的培养基中生长的菌株(结果显示于表2，如下)。
表2：通过PNY2270产生异丁醇
实例2
由PNY2092产生异丁醇
这个实例的目的是展示在包含乙醇或乙酸盐作为2碳补充物的生长培养基中菌株PNY2092的生长和异丁醇产生。
PNY2092是在30℃的平台摇动器中(220rpm)、在带有0.3％葡萄糖和2mM乙酸盐或0.3％(vol/vol)乙醇的合成完全培养基上有氧培养的(在125mL通气烧瓶中有10mL培养基)。在补充了乙酸盐的培养基中的对数生长速率比带有乙醇的高。在两种培养基中的培养物生长至大约光密度2(使用Eppendorf BioPhotometer(Eppendorf AG，Hamburg，Germany)进行测量)。然后将培养基接种至血清瓶(15mL小瓶含10mL培养基)中带有2％葡萄糖、BME维生素以及2mM乙酸盐或0.05％(vol/vol)乙醇的合成完全培养基上，起始OD为0.2。将小瓶加塞、压接，并且在30℃平台摇动器中(220rpm)温育。48小时后，移出压接和塞子，测量光密度，通过HPLC分析培养物滤液。
发现在包含乙酸盐的培养基中生长的菌株产生异丁醇的浓度高于在不含乙酸盐的培养基中生长的菌株(结果显示于表3，如下)。
表3：通过PNY2092产生异丁醇
实例4
由菌株PNY2118和PNY2120产生异丁醇
这个实例的目的是展示在包含乙醇或乙酸盐作为2碳补充物的生长培养基中菌株PNY2118和PNY2120的生长和异丁醇产生。
如上述实例2中所述培养菌株，然后评估血清瓶中异丁醇产生，不同的是在47.3小时收集样品用于分析。
实例5
由PNY2318产生异丁醇
这个实例的目的是展示在包含乙醇或乙酸盐作为2碳补充物的生长培养基中菌株PNY2318的生长和异丁醇产生。
类似于上述实验(实例2和3)，培养菌株，然后评估血清瓶中异丁醇产生。在这种情况下，PNY2318的生长不需要2碳补充物。因此在含有和不含有2碳的情况下培养菌株，然后接种至含有和不含有2碳的血清瓶。在36小时收集样品用于分析。

Claims (32)

1.生产丁醇的方法，包括：
a)提供重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：
i)经工程化的丁醇生物合成途径；以及
b)使a)的宿主细胞与发酵培养基接触，所述发酵培养基包含：
i)可发酵的碳底物；和
ii)足以改善所述宿主细胞的生长或改善丁醇的产生中的至少一个的量的乙酸盐，其中将所述乙酸盐加入到所述发酵培养基；
其中所述重组宿主细胞已经经工程化以降低或消除丙酮酸脱羧酶(PDC)活性；并且
由此经由所述经工程化的丁醇生物合成途径来直接由所述可发酵的碳底物产生丁醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种编码丙酮酸脱羧酶的内源基因是灭活的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述内源基因是PDC1、PDC5、PDC6、或它们的组合。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞已经经工程化或进化以包含降低或消除的对于用于它们生长的外源二碳底物补充物的需求。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源多核苷酸和编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源多核苷酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组宿主细胞已经经工程化以降低或消除醛脱氢酶活性。
7.根据权利要求6所述的方法，其中编码醛脱氢酶的内源基因是灭活的。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述内源基因是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6、或它们的组合。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中丁醇的产生是改善的。
10.根据权利要求9所述的方法，其中丁酸的产生是下降的。
11.根据权利要求9所述的方法，其中丁醇的收率或有效滴度是提高的。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述丁醇是异丁醇或1-丁醇、或它们的组合。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至乙酰乳酸(途径步骤a)；
b)来自a)的乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸(途径步骤b)；
c)来自b)的2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸(途径步骤c)；
d)来自c)的α-酮异戊酸至异丁醛(途径步骤d)；以及
e)来自d)的异丁醛至异丁醇(途径步骤e)；
并且其中
i)步骤a)的底物至产物的转化是通过乙酰乳酸合酶进行的；
ii)步骤b)的底物至产物的转化是通过乙酰羟酸异构还原酶进行的；
iii)步骤c)的底物至产物的转化是通过二羟酸脱水酶进行的；
iv)步骤d)的底物至产物的转化是通过α-酮酸脱羧酶进行的；并且
v)步骤e)的底物至产物的转化是通过醇脱氢酶进行的；
由此经由所述经工程化的丁醇生物合成途径来直接由丙酮酸产生异丁醇。
14.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至乙酰乳酸(途径步骤a)；
b)来自a)的乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸(途径步骤b)；
c)来自b)的2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸(途径步骤c)；
d)来自c)的α-酮异戊酸至异丁酰-CoA(途径步骤f)；以及
e)来自d)的异丁酰-CoA至异丁醛(途径步骤g)；
f)来自e)的异丁醛至异丁醇(途径步骤e)；
并且其中
i)步骤a)的底物至产物的转化是通过乙酰乳酸合酶进行的；
ii)步骤b)的底物至产物的转化是通过乙酰羟酸异构还原酶进行的；
iii)步骤c)的底物至产物的转化是通过二羟酸脱水酶进行的；
iv)步骤d)的底物至产物的转化是通过支链酮酸脱氢酶进行的；
v)步骤e)的底物至产物的转化是通过乙酰化醛脱氢酶进行的；并且
vi)步骤f)的底物至产物的转化是通过醇脱氢酶进行的；
由此经由所述经工程化的生物合成途径来直接由丙酮酸产生异丁醇。
15.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞是细菌或酵母。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述重组宿主细胞是酵母，并且其中进行所述经工程化的丁醇生物合成途径的底物至产物的转化的两种或更多种酶并非定位于线粒体。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基还包含丁醇。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基与所述重组宿主细胞的接触的至少一部分是在厌氧或微氧条件下进行的。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基与所述重组宿主细胞的接触是以分批或连续发酵的方式进行的。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，还包括c)回收所述丁醇。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述回收是通过蒸馏、液-液萃取、吸附、滗析、全蒸发、或它们的组合。
22.由根据权利要求1-21中任一项所述的方法而产生的丁醇。
23.组合物，包含：
a)重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：
i)经工程化的丁醇生物合成途径；和
b)发酵培养基，所述发酵培养基包含：
i)可发酵的碳底物；和
ii)足以改善a)的宿主细胞的生长或改善丁醇的产生的量的乙酸
盐，其中将所述乙酸盐加入到所述发酵培养基；
其中所述重组宿主细胞已经经工程化以降低或消除丙酮酸脱羧酶(PDC)活性以及任选地醛脱氢酶活性。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中至少一种编码丙酮酸脱羧酶的内源基因是灭活的。
25.根据权利要求23所述的组合物，其中编码醛脱氢酶的内源基因是灭活的。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述内源基因是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6、或它们的组合。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述内源基因是PDC1、PDC5、PDC6、或它们的组合。
28.根据权利要求23-27中任一项所述的组合物，其中所述重组宿主细胞是细菌或酵母。
29.根据权利要求23-27中任一项所述的组合物，其中所述发酵培养基还包含丁醇。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述丁醇是异丁醇或1-丁醇、或它们的组合。
31.根据权利要求29或30所述的组合物，其中所述发酵培养基包含约0.01mM至约500mM范围内的丁醇。
32.根据权利要求23-31中任一项所述的组合物，其中所述发酵培养基包含约0.1mM至约50mM范围内的乙酸盐。
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