CN103917651A - 用于生产1,3-丁二醇的真核生物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了非天然存在的真核生物，其可以经工程改造成生产细胞溶质乙酰辅酶A和增加细胞溶质乙酰辅酶A的可用性。本文还提供了非天然存在的具有1,3-丁二醇(1,3-BDO)途径的真核生物和使用这样的生物生产1,3-BDO的方法。

Description

用于生产1,3-丁二醇的真核生物和方法
本申请要求2011年9月8日提交的美国系列号61/532,492、2011年9月30日提交的美国系列号61/541,951、2011年11月11日提交的美国系列号61/558,959、2012年5月18日提交的美国系列号61/649,039、和2012年6月4日提交的美国系列号61/655,355的权益，它们中的每一个特此通过引用整体并入。
1.背景技术
本文提供了通常与生物合成过程有关的方法和能够生产有机化合物的真核生物。更具体地，在某些实施方案中，本文提供了非天然存在的真核生物，其可以经工程改造成生产细胞溶质乙酰辅酶A和增加细胞溶质乙酰辅酶A的可用性。在许多真核生物中，乙酰辅酶A主要由线粒体中的丙酮酸脱氢酶合成(图1)。因而，存在开发这样的真核生物的需要：其可以生产细胞溶质乙酰辅酶A和增加细胞溶质乙酰辅酶A的可用性。将乙酰辅酶A从线粒体输出至细胞溶质的机制能够实现起源于乙酰辅酶A的细胞溶质生产途径的利用。这样的细胞溶质生产途径包括，例如，商品化学品诸如1,3-丁二醇(1,3-BDO)和/或其它目标化合物的生产。
本文还提供了可以经工程改造成生产1,3-BDO的非天然存在的真核生物。1,3-BDO生产对基于石油的原料的依赖，证明使用可再生原料生产1,3-BDO和丁二烯的替代途径的开发是正当的。因而，存在开发真核生物和使用它们生产1,3-BDO的方法的需要。
本文中提供的生物和方法满足了这些需要，并且还提供了有关的优点。
2.发明内容
本文提供了非天然存在的真核生物，其可以经工程改造成生产细胞溶质乙酰辅酶A和增加细胞溶质乙酰辅酶A的可用性。这样的生物有利地允许生产细胞溶质乙酰辅酶A，所述生物然后可以使用细胞溶质生产途径用所述细胞溶质乙酰辅酶A来生产目标化合物，诸如1,3-BDO。本文还提供了具有1,3-BDO途径的非天然存在的真核生物和使用这样的生物生产1,3-BDO的方法。
在第一方面，本文提供了包含乙酰辅酶A途径的非天然存在的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：(i)将乙酰辅酶A从所述生物的线粒体和/或过氧化物酶体运输至所述生物的细胞溶质，(ii)在所述生物的细胞质中生产乙酰辅酶A，和/或(iii)增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包括一种或多种选自以下的酶：柠檬酸合酶；柠檬酸转运蛋白；柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白；柠檬酸/苹果酸转运蛋白；ATP柠檬酸裂合酶；柠檬酸裂合酶；乙酰辅酶合成酶；草酰乙酸转运蛋白；细胞溶质苹果酸脱氢酶；苹果酸转运蛋白；线粒体苹果酸脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙酰辅酶连接酶或转移酶；乙酸激酶；磷酸转乙酰酶；丙酮酸脱羧酶；乙醛脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)；丙酮酸脱氢酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脱氢酶(酰化)；苏氨酸醛缩酶；线粒体乙酰肉碱转移酶；过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶；细胞溶质乙酰肉碱转移酶；线粒体乙酰肉碱移位酶；过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶；磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶；PEP羧基激酶；草酰乙酸脱羧酶；丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)；乙酰辅酶羧化酶；丙二酰辅酶脱羧酶；草酰乙酸脱氢酶；草酰乙酸氧化还原酶；丙二酰辅酶还原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脱氢酶；丙二酰辅酶合成酶；丙二酰辅酶转移酶；苹果酸酶；苹果酸脱氢酶；苹果酸氧化还原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶。
在另一个方面，本文提供了一种用于将乙酰辅酶A从线粒体和/或过氧化物酶体运输至非天然存在的真核生物的细胞溶质的方法，所述方法包括：在一定条件下培养非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物足够的时间段，以将乙酰辅酶A从线粒体和/或过氧化物酶体运输至非天然存在的真核生物的细胞溶质。在某些实施方案中，本文提供了一种用于将乙酰辅酶A从线粒体运输至所述非天然存在的真核生物的细胞溶质的方法。在其它实施方案中，本文提供了一种用于将乙酰辅酶A从过氧化物酶体运输至所述非天然存在的真核生物的细胞溶质的方法。在某些培养非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物的实施方案中，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：将乙酰辅酶A从所述生物的线粒体和/或过氧化物酶体运输至所述生物的细胞溶质。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包括一种或多种选自以下的酶：柠檬酸合酶；柠檬酸转运蛋白；柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白；柠檬酸/苹果酸转运蛋白；ATP柠檬酸裂合酶；柠檬酸裂合酶；乙酰辅酶A合成酶；草酰乙酸转运蛋白；细胞溶质苹果酸脱氢酶；苹果酸转运蛋白；线粒体苹果酸脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙酰辅酶A连接酶或转移酶；乙酸激酶；磷酸转乙酰酶；丙酮酸脱羧酶；乙醛脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)；丙酮酸脱氢酶，丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脱氢酶(酰化)；苏氨酸醛缩酶；线粒体乙酰肉碱转移酶；过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶；细胞溶质乙酰肉碱转移酶；线粒体乙酰肉碱移位酶；和过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草酰乙酸脱羧酶；丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)；乙酰辅酶A羧化酶；丙二酰辅酶A脱羧酶；草酰乙酸脱氢酶；草酰乙酸氧化还原酶；丙二酰辅酶A还原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脱氢酶；丙二酰辅酶A合成酶；丙二酰辅酶A转移酶；苹果酸酶；苹果酸脱氢酶；苹果酸氧化还原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶。
在另一个方面，本文提供了一种用于生产细胞溶质乙酰辅酶A的方法，所述方法包括：在一定条件下培养非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物足够的时间段，以生产细胞溶质乙酰辅酶A。在一个实施方案中，本文提供了一种生产细胞溶质乙酰辅酶A的方法，所述方法包括：培养非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：在所述生物中产生细胞溶质乙酰辅酶A。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包括一种或多种选自以下的酶：柠檬酸合酶；柠檬酸转运蛋白；柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白；柠檬酸/苹果酸转运蛋白；ATP柠檬酸裂合酶；柠檬酸裂合酶；乙酰辅酶A合成酶；草酰乙酸转运蛋白；细胞溶质苹果酸脱氢酶；苹果酸转运蛋白；线粒体苹果酸脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙酰辅酶A连接酶或转移酶；乙酸激酶；磷酸转乙酰酶；丙酮酸脱羧酶；乙醛脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)；丙酮酸脱氢酶，丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脱氢酶(酰化)；苏氨酸醛缩酶；线粒体乙酰肉碱转移酶；过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶；细胞溶质乙酰肉碱转移酶；线粒体乙酰肉碱移位酶；和过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草酰乙酸脱羧酶；丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)；乙酰辅酶A羧化酶；丙二酰辅酶A脱羧酶；草酰乙酸脱氢酶；草酰乙酸氧化还原酶；丙二酰辅酶A还原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脱氢酶；丙二酰辅酶A合成酶；丙二酰辅酶A转移酶；苹果酸酶；苹果酸脱氢酶；苹果酸氧化还原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶。
在另一个方面，本文提供了一种用于增加非天然存在的真核生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A的方法，所述方法包括：在一定条件下培养非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物足够的时间段，以增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A。在某些实施方案中，本文提供了一种用于增加非天然存在的真核生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A的方法，所述方法包括：培养非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：增加所述非天然存在的真核生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包括一种或多种选自以下的酶：柠檬酸合酶；柠檬酸转运蛋白；柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白；柠檬酸/苹果酸转运蛋白；ATP柠檬酸裂合酶；柠檬酸裂合酶；乙酰辅酶A合成酶；草酰乙酸转运蛋白；细胞溶质苹果酸脱氢酶；苹果酸转运蛋白；线粒体苹果酸脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙酰辅酶A连接酶或转移酶；乙酸激酶；磷酸转乙酰酶；丙酮酸脱羧酶；乙醛脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)；丙酮酸脱氢酶，丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脱氢酶(酰化)；苏氨酸醛缩酶；线粒体乙酰肉碱转移酶；过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶；细胞溶质乙酰肉碱转移酶；线粒体乙酰肉碱移位酶；和过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草酰乙酸脱羧酶；丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)；乙酰辅酶A羧化酶；丙二酰辅酶A脱羧酶；草酰乙酸脱氢酶；草酰乙酸氧化还原酶；丙二酰辅酶A还原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脱氢酶；丙二酰辅酶A合成酶；丙二酰辅酶A转移酶；苹果酸酶；苹果酸脱氢酶；苹果酸氧化还原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶。
本文提供了非天然存在的真核生物以及在所述真核生物中生产细胞溶质乙酰辅酶A和增加细胞溶质乙酰辅酶A的可用性的方法。本文还提供了非天然存在的真核生物及其生产某些商品化学品(诸如1,3-BDO)或其它目标化合物的最佳产率的方法。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)乙酰辅酶A途径，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：(i)将乙酰辅酶A从所述生物的线粒体和/或过氧化物酶体运输至所述生物的细胞溶质，(ii)在所述生物的细胞质中生产乙酰辅酶A，和/或(iii)增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A，和(2)1,3-BDO途径，其包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达。在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包括一种或多种选自以下的酶：柠檬酸合酶；柠檬酸转运蛋白；柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白；柠檬酸/苹果酸转运蛋白；ATP柠檬酸裂合酶；柠檬酸裂合酶；乙酰辅酶A合成酶；草酰乙酸转运蛋白；细胞溶质苹果酸脱氢酶；苹果酸转运蛋白；线粒体苹果酸脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙酰辅酶A连接酶或转移酶；乙酸激酶；磷酸转乙酰酶；丙酮酸脱羧酶；乙醛脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)；丙酮酸脱氢酶，丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脱氢酶(酰化)；苏氨酸醛缩酶；线粒体乙酰肉碱转移酶；过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶；细胞溶质乙酰肉碱转移酶；线粒体乙酰肉碱移位酶；过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草酰乙酸脱羧酶；丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)；乙酰辅酶A羧化酶；丙二酰辅酶A脱羧酶；草酰乙酸脱氢酶；草酰乙酸氧化还原酶；丙二酰辅酶A还原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脱氢酶；丙二酰辅酶A合成酶；丙二酰辅酶A转移酶；苹果酸酶；苹果酸脱氢酶；苹果酸氧化还原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶；和/或(2)所述1,3-BDO途径包括一种或多种选自以下的酶：乙酰乙酰辅酶A硫解酶；乙酰辅酶A羧化酶；乙酰乙酰辅酶A合酶；乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)；3-氧代丁醛还原酶(醛还原)；4-羟基,2-丁酮还原酶；乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)；3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；3-羟基丁醛还原酶；乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)；3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)；3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)；乙酰乙酰辅酶A转移酶、乙酰乙酰辅酶A水解酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶或磷酸转乙酰乙酰酶(phosphotransacetoacetylase)和乙酰乙酸激酶；乙酰乙酸还原酶；3-羟基丁酰辅酶A转移酶、水解酶或合成酶；3-羟基丁酸还原酶；和3-羟基丁酸脱氢酶。
在另一个方面，本文提供了一种用于生产1,3-BDO的方法，所述方法包括：在一定条件下培养非天然存在的真核生物足够的时间段以生产1,3-BDO，其中所述非天然存在的真核生物包含：(1)乙酰辅酶A途径，和(2)1,3-BDO途径。在某些实施方案中，本文提供了一种生产1,3-BDO的方法，所述方法包括，培养非天然存在的真核生物，所述真核生物包含：乙酰辅酶A途径，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：(i)将乙酰辅酶A从所述生物的线粒体和/或过氧化物酶体运输至所述生物的细胞溶质，(ii)在所述生物的细胞质中生产乙酰辅酶A，和/或(iii)增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A；和/或(2)1,3-BDO途径，其包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包括一种或多种选自以下的酶：柠檬酸合酶；柠檬酸转运蛋白；柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白；柠檬酸/苹果酸转运蛋白；ATP柠檬酸裂合酶；柠檬酸裂合酶；乙酰辅酶A合成酶；草酰乙酸转运蛋白；细胞溶质苹果酸脱氢酶；苹果酸转运蛋白；线粒体苹果酸脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙酰辅酶A连接酶或转移酶；乙酸激酶；磷酸转乙酰酶；丙酮酸脱羧酶；乙醛脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)；丙酮酸脱氢酶，丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脱氢酶(酰化)；苏氨酸醛缩酶；线粒体乙酰肉碱转移酶；过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶；细胞溶质乙酰肉碱转移酶；线粒体乙酰肉碱移位酶；过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草酰乙酸脱羧酶；丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)；乙酰辅酶A羧化酶；丙二酰辅酶A脱羧酶；草酰乙酸脱氢酶；草酰乙酸氧化还原酶；丙二酰辅酶A还原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脱氢酶；丙二酰辅酶A合成酶；丙二酰辅酶A转移酶；苹果酸酶；苹果酸脱氢酶；苹果酸氧化还原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶；和(2)所述1,3-BDO途径包括一种或多种选自以下的酶：乙酰乙酰辅酶A硫解酶；乙酰辅酶A羧化酶；乙酰乙酰辅酶A合酶；乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)；3-氧代丁醛还原酶(醛还原)；4-羟基、2-丁酮还原酶；乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)；3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；3-羟基丁醛还原酶；乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)；3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)；3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)；乙酰乙酰辅酶A转移酶、乙酰乙酰辅酶A水解酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶、或磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶；乙酰乙酸还原酶；3-羟基丁酰辅酶A转移酶、水解酶、或合成酶；3-羟基丁酸还原酶；和3-羟基丁酸脱氢酶。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，和(2)利用1,3-BDO途径的一种或多种前体和/或中间体的一种或多种酶或途径的缺失或减弱。在一个具体实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含利用乙酰辅酶A的竞争途径的缺失或减弱。在一个具体实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含1,3-BDO中间体副产物途径的缺失或减弱。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，和(2)利用1,3-BDO途径的一种或多种辅因子的一种或多种酶或途径的缺失或减弱。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含一种或多种内源和/或外源核酸，所述核酸编减弱的选自以下的1,3-BDO途径酶：乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)、3-氧代丁醛还原酶(醛还原)、4-羟基-2-丁酮还原酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)、3-氧代丁醛还原酶(酮还原)、3-羟基丁醛还原酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)、3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)、3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)、乙酰乙酸还原酶、3-羟基丁酸还原酶、3-羟基丁酸脱氢酶和3-羟基丁醛还原酶；且其中所述减弱的1,3-BDO途径酶是NAPDH依赖性的，且具有与由未改变的或野生型核酸编码的1,3-BDO途径酶相比降低的酶活性。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含一种或多种内源和/或外源核酸，所述核酸编码选自以下的1,3-BDO途径酶：乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)、3-氧代丁醛还原酶(醛还原)、4-羟基-2-丁酮还原酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)、3-氧代丁醛还原酶(酮还原)、3-羟基丁醛还原酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)、3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)、3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)、乙酰乙酸还原酶、3-羟基丁酸还原酶、3-羟基丁酸脱氢酶和3-羟基丁醛还原酶；其中至少一种核酸已经被改变，使得由所述核酸编码的1,3-BDO途径酶具有与由未改变的或野生型核酸编码的1,3-BDO途径酶相比更大的对NADH的亲和力。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含一种或多种内源和/或外源核酸，所述核酸编码选自以下的1,3-BDO途径酶：乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)、3-氧代丁醛还原酶(醛还原)、4-羟基-2-丁酮还原酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)、3-氧代丁醛还原酶(酮还原)、3-羟基丁醛还原酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)、3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)、3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)、乙酰乙酸还原酶、3-羟基丁酸还原酶、3-羟基丁酸脱氢酶和3-羟基丁醛还原酶，其中至少一种核酸已经被改变，使得由所述核酸编码的1,3-BDO途径酶具有与由未改变的或野生型核酸编码的1,3-BDO途径酶相比更小的对NADPH的亲和力。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和(2)乙酰辅酶A途径，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的内源和/或外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以增加所述生物中的NADH的量表达；其中所述乙酰辅酶A途径包含：(i.)NAD依赖性的丙酮酸脱氢酶；(ii.)丙酮酸甲酸裂合酶和NAD依赖性的甲酸脱氢酶；(iii.)丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和NADH:铁氧还蛋白氧化还原酶；(iv.)丙酮酸脱羧酶和NAD依赖性的酰化乙酰基醛脱氢酶；(v.)丙酮酸脱羧酶、NAD依赖性的酰化乙醛脱氢酶、乙酸激酶和磷酸转乙酰酶；或(vi.)丙酮酸脱羧酶、NAD依赖性的酰化乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和(2)戊糖磷酸途径，其中所述生物包含至少一种编码戊糖磷酸途径酶的内源和/或外源核酸，所述戊糖磷酸途径酶选自：6-磷酸葡萄糖脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶和6-磷酸葡糖酸脱氢酶(脱羧)。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和(2)恩特纳-杜德洛夫(Entner Doudoroff)途径，其中所述生物包含至少一种编码恩特纳-杜德洛夫途径酶的内源和/或外源核酸，所述恩特纳-杜德洛夫途径酶选自：6-磷酸葡萄糖脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、磷酸葡糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和(2)编码可溶性的或膜结合的转氢酶的内源和/或外源核酸，其中所述转氢酶以足以将NADH转化成NADPH的量表达。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和(2)内源和/或外源核酸，其编码NADP依赖性的磷酸化或非磷酸化3-磷酸甘油醛脱氢酶。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和(2)乙酰辅酶A途径，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的内源和/或外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以增加所述生物中的NADPH的量表达；其中所述乙酰辅酶A途径包含：(i)NADP依赖性的丙酮酸脱氢酶；(ii)丙酮酸甲酸裂合酶和NADP依赖性的甲酸脱氢酶；(iii)丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和NADPH:铁氧还蛋白氧化还原酶；(iv)丙酮酸脱羧酶和NADP依赖性的酰化乙酰基醛脱氢酶；(v)丙酮酸脱羧酶、NADP依赖性的酰化乙醛脱氢酶、乙酸激酶和磷酸转乙酰酶；或(vi)丙酮酸脱羧酶、NADP依赖性的酰化乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和(2)一种或多种编码NAD(P)H辅因子酶的内源和/或外源核酸，所述NAD(P)H辅因子酶选自磷酸化或非磷酸化3-磷酸甘油醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和酰化乙酰基醛脱氢酶；其中所述一种或多种编码NAD(P)H辅因子酶的核酸已经被改变，使得由所述核酸编码的NAD(P)H辅因子酶具有与由未改变的或野生型核酸编码的NAD(P)H辅因子酶相比更大的对NADPH的亲和力。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)1,3-BDO途径，其包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和(2)一种或多种编码NAD(P)H辅因子酶的内源和/或外源核酸，所述NAD(P)H辅因子酶选自磷酸化或非磷酸化3-磷酸甘油醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和酰化乙酰基醛脱氢酶；其中所述一种或多种编码NAD(P)H辅因子酶的核酸已经被改变，使得它编码的NAD(P)H辅因子酶具有与由未改变的或野生型核酸编码的NAD(P)H辅因子酶相比更小的对NADH的亲和力。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码NADH脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的NADH脱氢酶；和/或(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有NADH脱氢酶酶活性。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码细胞色素氧化酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的细胞色素氧化酶；和/或(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有细胞色素氧化酶酶活性。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码3-磷酸甘油(G3P)脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的G3P脱氢酶；(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P脱氢酶酶活性；和/或(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的甘油。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码G3P磷酸酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的G3P磷酸酶；(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P磷酸酶酶活性；和/或(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的甘油。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码丙酮酸脱羧酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的丙酮酸脱羧酶；(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有丙酮酸脱羧酶酶活性；和/或(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，从丙酮酸生产更低水平的乙醇。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码乙醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的乙醇脱氢酶；(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醇脱氢酶酶活性；和/或(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的乙醇。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码苹果酸脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的苹果酸脱氢酶；(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有苹果酸脱氢酶酶活性；和/或(iv)具有减弱的或阻断的苹果酸-天冬氨酸穿梭、苹果酸-草酰乙酸穿梭和/或苹果酸-丙酮酸穿梭。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶；和/或(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶酶活性。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码3-羟基丁酰辅酶A水解酶或转移酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的3-羟基丁酰辅酶A水解酶或转移酶；和/或(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-羟基丁酰辅酶A水解酶或转移酶酶活性。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；且其中所述生物：(i)包含在编码乙醛脱氢酶(酰化)的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的乙醛脱氢酶(酰化)；和/或(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醛脱氢酶(酰化)酶活性。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码3-羟基丁醛脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的3-羟基丁醛脱氢酶；和/或(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-羟基丁醛脱氢酶酶活性。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码3-氧代丁醛脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的3-氧代丁醛脱氢酶；和/或(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-氧代丁醛脱氢酶酶活性。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码1,3-丁二醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的1,3-丁二醇脱氢酶；和/或(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有1,3-丁二醇脱氢酶酶活性。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的乙酰乙酰辅酶A硫解酶；和/或(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙酰乙酰辅酶A硫解酶酶活性。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；且其中所述生物进一步包含编码1,3-BDO转运蛋白的内源和/或外源核酸，其中所述编码1,3-BDO转运蛋白的核酸以足以从所述真核生物输出1,3-BDO的量表达。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含组合的线粒体/细胞溶质1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码组合的线粒体/细胞溶质1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达。在某些实施方案中，所述组合的线粒体/细胞溶质1,3-BDO途径包括一种或多种选自以下的酶：线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶；乙酰辅酶A羧化酶；乙酰乙酰辅酶A合酶；线粒体乙酰乙酰辅酶A还原酶；线粒体乙酰乙酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；线粒体3-羟基丁酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；线粒体3-羟基丁酸脱氢酶；乙酰乙酸转运蛋白；3-羟基丁酸转运蛋白；3-羟基丁酰辅酶A转移酶或合成酶、细胞溶质乙酰乙酰辅酶A转移酶或合成酶；乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)；3-氧代丁醛还原酶(醛还原)；4-羟基-2-丁酮还原酶；乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)；3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；3-羟基丁醛还原酶；乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)；3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)；3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)；乙酰乙酸还原酶；3-羟基丁酰辅酶A转移酶、水解酶或合成酶；3-羟基丁酸还原酶；和3-羟基丁酸脱氢酶。
在另一个方面，本文提供了一种生产1,3-BDO的方法，所述方法包括：在一定条件下培养本文提供的任一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物足够的时间段以生产1,3-BDO。在某些实施方案中，在基本上厌氧的培养基中培养所述真核生物。在其它实施方案中，所述真核生物是Crabtree阳性的生物。
在另一个方面，本文提供了一种用于选择要引入非天然存在的真核生物中的外源性1,3-BDO途径酶的方法，其中所述外源性1,3-BDO途径酶在所述生物中以足以生产1,3-BDO的量表达，所述方法包括：(i.)测量至少一种1,3-BDO途径酶的活性，所述1,3-BDO途径酶使用NADH作为辅因子；(ii.)测量至少一种1,3-BDO途径酶的活性，所述1,3-BDO途径酶使用NADPH作为辅因子；和(iii.)向所述生物中引入至少一种1,3-BDO途径酶，所述1,3-BDO途径酶对NADH作为辅因子的偏好大于NADPH，如在步骤1和2中确定的。
3.附图说明
图1显示了在真核生物的细胞溶质中生产乙酰辅酶A的一种示例性途径。
图2显示了使用柠檬酸和草酰乙酸转运蛋白从线粒体乙酰辅酶A生产细胞溶质乙酰辅酶A的途径。酶是：A)柠檬酸合酶；B)柠檬酸转运蛋白；C)柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白；D)ATP柠檬酸裂合酶；E)柠檬酸裂合酶；F)乙酰辅酶A合成酶或转移酶、或乙酸激酶和磷酸转乙酰酶；G)草酰乙酸转运蛋白；K)乙酸激酶；和L)磷酸转乙酰酶。
图3显示了使用柠檬酸和苹果酸转运蛋白从线粒体乙酰辅酶A生产细胞溶质乙酰辅酶A的途径。酶是：A)柠檬酸合酶；B)柠檬酸转运蛋白；C)柠檬酸/苹果酸转运蛋白；D)ATP柠檬酸裂合酶；E)柠檬酸裂合酶；F)乙酰辅酶A合成酶或转移酶、或乙酸激酶和磷酸转乙酰酶；H)细胞溶质苹果酸脱氢酶；I)苹果酸转运蛋白；J)线粒体苹果酸脱氢酶；K)乙酸激酶；和L)磷酸转乙酰酶。
图4显示了从乙酰辅酶A生物合成1,3-BDO的途径。显示的酶促转化由下述酶进行：A)乙酰乙酰辅酶A硫解酶，B)乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)，C)3-氧代丁醛还原酶(醛还原)，D)4-羟基-2-丁酮还原酶，E)乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)，F)3-氧代丁醛还原酶(酮还原)，G)3-羟基丁醛还原酶，H)乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)，I)3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)，J)3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)，K)乙酰乙酰辅酶A转移酶、乙酰乙酰辅酶A水解酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶、或磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶，L)乙酰乙酸还原酶，M)3-羟基丁酰辅酶A转移酶、水解酶或合成酶，N)3-羟基丁酸还原酶，和O)3-羟基丁酸脱氢酶。在图4中描绘的在1,3-BDO途径中由乙酰乙酰辅酶A硫解酶将乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A(步骤A)的替代方案涉及：乙酰辅酶A羧化酶将乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A，和乙酰乙酰辅酶A合成酶将乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A(未显示；参见图7，步骤E和F，或图9)。
图5显示了从细胞溶质丙酮酸生产细胞溶质乙酰辅酶A的途径。酶是：A)丙酮酸氧化酶(乙酸形成)，B)乙酰辅酶A合成酶、连接酶或转移酶，C)乙酸激酶，D)磷酸转乙酰酶，E)丙酮酸脱羧酶，F)乙醛脱氢酶，G)丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)，H)丙酮酸脱氢酶，丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶，I)乙醛脱氢酶(酰化)，和J)苏氨酸醛缩酶。
图6显示了从线粒体或过氧化物酶体乙酰辅酶A生产细胞溶质乙酰辅酶A的途径。酶是：A)线粒体乙酰肉碱转移酶，B)过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶，C)细胞溶质乙酰肉碱转移酶，D)线粒体乙酰肉碱移位酶，E)过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶。
图7描绘了一个示例性的1,3-BDO途径。A)乙酰乙酰辅酶A硫解酶，B)乙酰乙酰辅酶A还原酶，C)3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)，D)3-羟基丁醛还原酶，E)乙酰辅酶A羧化酶，F)乙酰乙酰辅酶A合酶。G3P是3-磷酸甘油。在该途径中，乙酰乙酰辅酶A硫解酶将2当量的乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A。可替换地，乙酰辅酶A羧化酶将乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A，并由乙酰乙酰辅酶A合成酶从乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A。3-羟基丁酰辅酶A还原酶然后将乙酰乙酰辅酶A还原为3-羟基丁酰辅酶A。3-羟基丁酰辅酶A还原酶将3-羟基丁酰辅酶A中间体进一步还原为3-羟基丁醛，后者被3-羟基丁醛还原酶进一步还原为1,3-BDO。可以任选地进一步工程改造所述生物，以缺失一个或多个示例性的副产物途径(“X”)。
图8描绘了示例性的组合的线粒体/细胞溶质1,3-BDO途径。途径酶包括：A)乙酰乙酰辅酶A硫解酶，B)乙酰乙酰辅酶A还原酶，C)乙酰乙酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶，D)3-羟基丁酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶，E)3-羟基丁酸脱氢酶，F)乙酰乙酸转运蛋白，G)3-羟基丁酸转运蛋白，H)3-羟基丁酰辅酶A转移酶或合成酶，I)乙酰乙酰辅酶A转移酶或合成酶，J)乙酰辅酶A羧化酶，和K)乙酰乙酰辅酶A合酶。
图9描绘了乙酰乙酰辅酶A合酶将乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A的一种示例性途径。
图10描绘了从磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和丙酮酸至乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A的示例性途径。A)PEP羧化酶或PEP羧基激酶，B)草酰乙酸脱羧酶，C)丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)，D)乙酰辅酶A羧化酶或丙二酰辅酶A脱羧酶，E)乙酰乙酰辅酶A合酶，F)草酰乙酸脱氢酶或草酰乙酸氧化还原酶，G)丙二酰辅酶A还原酶，H)丙酮酸羧化酶，I)乙酰乙酰辅酶A硫解酶，J)丙二酸半醛脱氢酶，K)丙二酰辅酶A合成酶或转移酶，L)苹果酸酶，M)苹果酸脱氢酶或氧化还原酶，N)丙酮酸激酶或PEP磷酸酶。
4.具体实施方式
本文提供了非天然存在的真核生物以及在所述真核生物中生产细胞溶质乙酰辅酶A和增加细胞溶质乙酰辅酶A的可用性的方法。本文还提供了非天然存在的真核生物及其生产商品化学品(诸如1,3-BDO)和/或其它目标化合物的方法。
4.1定义
本文使用的术语“非天然存在的”，当用于指本文提供的真核生物时，意图表示，该真核生物具有至少一个在所述物种的天然存在的菌株(包括所述物种的野生型菌株)中通常未发现的遗传改变。遗传改变包括，例如，引入编码代谢多肽的可表达核酸的修饰、其它核酸添加、核酸缺失和/或真核生物的遗传物质的其它功能破坏。这些修饰包括，例如，所述物种的异源多肽、同源多肽或异源和同源多肽的编码区和其功能片段。另外的修饰包括，例如，非编码调节区，其中修饰会改变基因或操纵子的表达。示例性的代谢多肽包括：在乙酰辅酶A途径中的酶或蛋白。
代谢修饰是指从其天然存在的状态被改变的生物化学反应。因此，非天然存在的真核生物可以具有对编码代谢多肽或其功能片段的核酸的遗传修饰。本文公开了示例性的代谢修饰。
本文使用的术语“分离的”，当用于指真核生物时，意图表示，基本上不含至少一种当所述真核生物在自然界中发现时的组分的生物。该术语包括从在其自然环境中被发现时的一些或全部组分中移出的真核生物。该术语还包括从真核生物在其非天然存在环境中被发现时的一些或全部组分中移出的真核生物。因此，分离的真核生物部分或完全与其在自然界中发现时或其在非天然存在的环境中生长、保藏、生存时的其它物质分离。分离的真核生物的具体实例包括部分纯的微生物、基本上纯的微生物和在非天然存在的培养基中培养的微生物。
本文中使用的术语“真核的”、“真核生物体”或“真核生物”意图表示分类单位真核或真核域的任意单细胞或多细胞生物。具体地，该术语包括其细胞包含线粒体的那些生物。该术语也包括可以针对增加的细胞溶质乙酰辅酶A水平而进行培养的任意物种的细胞培养物。在本文提供的组合物和方法的某些实施方案中，所述真核生物是酵母。
本文中使用的术语“CoA”或“辅酶A”意图指有机辅因子或辅基(酶的非蛋白质部分)，其存在是许多酶(脱辅酶)的活性所必需的，以形成活性酶系统。辅酶A在某些缩合酶中起作用，在乙酰基或其它酰基转移中以及在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化中以及在其它乙酰化中产生起作用。
本文使用的术语“基本上厌氧的”，当用于指培养物或生长条件时，意图表示，氧的量小于在液体培养基中的溶解氧饱和度的约10％。该术语还拟包括液体或固体培养基的密封室被保持在小于约1％氧的气氛下。
本文所使用的“外源的”意图表示，相关分子或相关活性被引入宿主真核生物中。所述分子可以如下引入：例如，通过将编码核酸引入宿主遗传物质中，诸如通过整合进宿主染色体中，或作为非染色体遗传物质诸如质粒。因此，当用于指编码核酸的表达时，该术语指将编码核酸以可表达的形式引入真核生物中。当用于指生物合成活性时，该术语指被引入至宿主相关生物中的活性。来源可以是例如同源的或异源的编码核酸，其在引入至宿主真核生物中以后会表达相关的活性。因此，术语“内源的”指在宿主中存在的相关分子或活性。类似地，当用于指编码核酸的表达时，该术语指在真核生物中含有的编码核酸的表达。术语“异源的”指源自相关物种之外的来源的分子或活性，而“同源的”指源自宿主真核生物的分子或活性。因此，本文提供的编码核酸的外源表达可以利用异源的或同源的编码核酸中的任一种或两者。
应当理解，当真核生物中包括超过一种外源核酸时，超过一种外源核酸表示如上讨论的相关编码核酸或生化活性。进一步理解，如本文所公开的，这样的超过一种外源核酸可以在单独的核酸分子上、在多顺反子核酸分子上或以它们的组合引入宿主真核生物中，且仍然视作超过一种外源核酸。例如，如本文公开的，可以工程改造真核生物，以表达编码所需途径酶或蛋白的2种或更多种外源核酸。在将编码所需活性的2种外源核酸引入宿主真核生物中的情况下，应当理解，所述2种外源核酸可以作为单个核酸(例如，在单个质粒上、在分开的质粒上)引入，可以在单个位点或多个位点处整合进宿主染色体中，且仍然视作2种外源核酸。类似地，应当理解，超过2种外源核酸可以以任意所需的组合(例如，在单个质粒上、在分开的质粒上)引入宿主生物中，可以在单个位点或多个位点处整合进宿主染色体中，且仍然视作2种或更多种外源核酸，例如3种外源核酸。因而，所述的外源核酸或生物合成活性的数目是指编码核酸的数目或生化活性的数目，而不是指引入宿主生物中的单独核酸的数目。
本文提供的非天然存在的真核生物可包含稳定的遗传改变，其指可被培养五代以上而不失去所述改变的真核生物。一般而言，稳定的遗传改变包括持续10代以上的修饰，特别稳定的修饰将持续约25代以上，以及更特别稳定的遗传修饰将是50代以上，包括无限地。
本领域的技术人员应当理解，参考合适的宿主生物和它们的相应代谢反应或所需代谢途径的所需遗传物质(诸如基因)的合适源生物，描述包括本文示例的代谢修饰在内的遗传改变。然而，鉴于许多生物的完整基因组测序以及基因组学领域的高技能水平，本领域的技术人员可容易地将本文提供的教导和指导应用于基本上所有的其它生物。例如，通过掺入来自除所述物种之外的物种的相同或相似的编码核酸，可将本文示例的代谢改变容易地应用于其它物种。这些遗传改变一般而言包括例如物种同源物的遗传改变，以及具体而言，直系同源物、旁系同源物或非直系同源基因置换。
直系同源物是通过垂直传递(vertical descent)相关并且在不同生物中负责基本上相同或同一功能的一个基因或多个基因。例如，小鼠环氧化物水解酶和人环氧化物水解酶对于环氧化物的水解生物学功能而言可被认为是直系同源物。例如，当基因共享数量足以表明它们是同源的序列相似性时，所述基因通过垂直传递相关，或基因通过从共同的祖先进化而相关。如果基因共享三维结构，但不一定共享足以表明它们从共同的祖先进化而来的量--其程度为一级序列相似性不可鉴定--的序列相似性，则所述基因也可以被认为直系同源物。为直向同源的基因可以编码具有约25％序列相似性至100％氨基酸序列同源性的蛋白质。编码共享小于25％的氨基酸相似性的蛋白质的基因，如果它们的三维结构也显示相似性，也可以被认为通过垂直传递产生。酶的丝氨酸蛋白酶家族成员(包括组织纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶)被认为从共同的祖先通过垂直传递产生。
直系同源物包括基因或它们编码的基因产物，其通过例如进化在结构或总体活性方面已经偏离。例如，在一种物种编码显示两种功能的基因产物并且这些功能在第二种物种中已经被分成不同的基因的情况下，三个基因和它们的相应的产物被认为是直系同源物。就本文描述的代谢途径而言，本领域的技术人员应当理解，携带要引入或破坏的代谢活性的直向同源基因要进行选择用于构建非天然存在的真核生物。显示可分离活性的直系同源物的例子是其中不同的活性已经在两种或更多种物种之间或在单一物种内被分成不同的基因产物的情况。具体实例是将弹性蛋白酶蛋白酶解和纤维蛋白溶酶原蛋白酶解--两种类型的丝氨酸蛋白酶活性--作为纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶分成不同的分子。第二个实例是支原体5’-3’外切核酸酶和果蝇DNA聚合酶III活性的分离。来自第一物种的DNA聚合酶可以被认为是来自第二物种的外切核酸酶或聚合酶中任一种或两者的直系同源物，反之亦然。
相比而言，旁系同源物是通过例如进化趋异所伴随的复制相关的同源物，并且其具有类似或共同的但不是同样的功能。旁系同源物可以起源或源自例如相同的物种或不同的物种。例如，微粒体环氧化物水解酶(环氧化物水解酶I)和可溶性环氧化物水解酶(环氧化物水解酶II)可以被认为是旁系同源物，这是因为它们代表从共同的祖先共同进化而来的两种不同的酶，所述酶催化不同的反应并且在相同的物种中具有不同的功能。旁系同源物是来自相同物种的、彼此具有明显的序列相似性的蛋白质，这表明它们是同源的或通过从共同的祖先共同进化而相关。旁系同源蛋白质家族群包括Hip A同源物、荧光素酶基因、肽酶以及其它。
非直系同源基因置换是来自一种物种的非直系同源基因，其可以取代不同物种中的相关基因功能。取代包括，例如，与不同物种的相关功能相比，能够在起源的物种中完成基本上相同或类似的功能。尽管一般而言，非直系同源基因置换可以鉴定为结构上与编码相关功能的已知基因有关，但是结构上较不相关但功能上类似的基因和它们相应的基因产物，仍将落入本文所使用的术语的含义中。功能相似性要求，例如，与编码要求取代的功能的基因相比，在非直系同源基因产物的活性位点或结合区域中至少有一些结构相似性。因此，非直系同源基因包括例如旁系同源基因或不相关的基因。
因此，在鉴定和构建本文提供的具有细胞溶质乙酰辅酶A生物合成能力的非天然存在的真核生物中，本领域技术人员应当理解，通过将本文提供的教导和指导应用到具体的物种，代谢修饰的鉴定可以包括直系同源物的鉴定以及引入或失活。就旁系同源物和/或非直系同源基因置换存在于编码催化相似或基本上相似的代谢反应的酶的相关真核生物中而言，本领域的技术人员还可以利用这些进化相关的基因。
直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置换可以通过本领域的技术人员众所周知的方法确定。例如，检查两种多肽的核酸或氨基酸序列将揭示在所比较的序列之间的序列同源性和相似性。基于这些相似性，本领域技术人员可以确定相似性是否足够高，以表明蛋白质通过从共同的祖先进化而相关。本领域的技术人员众所周知的算法，诸如Align、BLAST、Clustal W以及其它算法，比较和测定未处理的序列相似性或同源性，并且还测定序列中空位(gap)的存在和显著性，所述空位可以被标记重量或分数。这些算法在本领域也是已知的并且可类似地应用于确定核苷酸序列相似性或同源性。确定相关性的足够相似性的参数基于众所周知的方法计算，所述方法用于计算统计学的相似性或在随机多肽中发现相似匹配的机会和所确定的匹配的显著性。如果期望，两个或更多个序列的计算机比较也可以由本领域技术人员进行视觉优化。相关的基因产物或蛋白质可以期望具有高度相似性，例如，25％至100％序列同源性。如果细察足够大小的数据库(约5％)，不相关的蛋自质可以具有一定同源性，所述同源性与期望偶然出现的基本相同。在5％和24％之间的序列可以或不可以代表足够的同源性，以推断所比较的序列是相关的。根据数据集的大小，可以实施确定这些匹配的显著性的另外的统计学分析，以确定这些序列的相关性。
使用BLAST算法确定两个或更多个序列的相关性的示例性参数例如可以是如下所示。简而言之，氨基酸序列比对可以使用BLASTP2.0.8版(1999年1月5日)和如下参数完成：Matrix：0BLOSUM62；gap open：11；gap extension：1；x_dropoff：50；expect：10.0；wordsize：3；filter：on。核酸序列比对可以使用BLASTN2.0.6版(1998年9月16日)和如下参数完成：Match：1；mismatch：-2；gap open：5；gap extension：2；x_dropoff：50；expect：10.0；wordsize：11；filter：off。本领域的技术人员了解对上述参数可以进行何种修改以增加或减少例如比较的严格性和测定两个或更多个序列的相关性。
4.2利用细胞溶质乙酰辅酶A的真核生物
在第一方面，本文提供了非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：(i)将乙酰辅酶A从所述生物的线粒体和/或过氧化物酶体运输至所述生物的细胞溶质，(ii)在所述生物的细胞质中生产乙酰辅酶A，和/或(iii)增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包括一种或多种选自以下的酶：柠檬酸合酶；柠檬酸转运蛋白；柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白；柠檬酸/苹果酸转运蛋白；ATP柠檬酸裂合酶；柠檬酸裂合酶；乙酰辅酶A合成酶；草酰乙酸转运蛋白；细胞溶质苹果酸脱氢酶；苹果酸转运蛋白；线粒体苹果酸脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙酰辅酶A连接酶或转移酶；乙酸激酶；磷酸转乙酰酶；丙酮酸脱羧酶；乙醛脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)；丙酮酸脱氢酶，丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脱氢酶(酰化)；苏氨酸醛缩酶；线粒体乙酰肉碱转移酶；过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶；细胞溶质乙酰肉碱转移酶；线粒体乙酰肉碱移位酶；过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草酰乙酸脱羧酶；丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)；乙酰辅酶A羧化酶；丙二酰辅酶A脱羧酶；草酰乙酸脱氢酶；草酰乙酸氧化还原酶；丙二酰辅酶A还原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脱氢酶；丙二酰辅酶A合成酶；丙二酰辅酶A转移酶；苹果酸酶；苹果酸脱氢酶；苹果酸氧化还原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶。这样的生物会有利地实现细胞溶质乙酰辅酶A的生产，所述生物然后可以使用细胞溶质生产途径利用所述细胞溶质乙酰辅酶A来生产目标化合物，例如，1,3-BDO。
在一个实施方案中，本文提供了非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：将乙酰辅酶A从所述生物的线粒体运输至所述生物的细胞溶质。在另一个实施方案中，本文提供了非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：将乙酰辅酶A从所述生物的过氧化物酶体运输至所述生物的细胞溶质。在一个实施方案中，本文提供了非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：在所述生物的细胞质中生产乙酰辅酶A。在另一个实施方案中，本文提供了非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A。在其它实施方案中，本文提供了非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：将乙酰辅酶A从线粒体运输至所述生物的细胞质并在所述生物的细胞质中生产乙酰辅酶A。在另一个实施方案中，本文提供了非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：将乙酰辅酶A从所述生物的过氧化物酶体运输至所述生物的细胞溶质并在所述生物的细胞质中生产乙酰辅酶A。在其它实施方案中，本文提供了非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：将乙酰辅酶A从线粒体运输至所述生物的细胞质并增加所述生物的细胞质中的乙酰辅酶A。在另一个实施方案中，本文提供了非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：增加来自过氧化物酶体的乙酰辅酶A并增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A。
在第二方面，本文提供了一种用于将乙酰辅酶A从线粒体和/或过氧化物酶体运输至非天然存在的真核生物的细胞溶质的方法，所述方法包括：在一定条件下培养非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物足够的时间段，以将乙酰辅酶A从线粒体和/或过氧化物酶体运输至非天然存在的真核生物的细胞溶质。在一个实施方案中，本文提供了一种用于将乙酰辅酶A从线粒体运输至非天然存在的真核生物的细胞溶质的方法，所述方法包括：在一定条件下培养非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物足够的时间段，以将乙酰辅酶A从线粒体运输至非天然存在的真核生物的细胞溶质。在另一个实施方案中，本文提供了一种用于将乙酰辅酶A从过氧化物酶体运输至非天然存在的真核生物的细胞溶质的方法，所述方法包括：在一定条件下培养非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物足够的时间段，以将乙酰辅酶A从过氧化物酶体运输至非天然存在的真核生物的细胞溶质。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包括一种或多种选自以下的酶：柠檬酸合酶；柠檬酸转运蛋白；柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白；柠檬酸/苹果酸转运蛋白；ATP柠檬酸裂合酶；柠檬酸裂合酶；乙酰辅酶A合成酶；草酰乙酸转运蛋白；细胞溶质苹果酸脱氢酶；苹果酸转运蛋白；线粒体苹果酸脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙酰辅酶A连接酶或转移酶；乙酸激酶；磷酸转乙酰酶；丙酮酸脱羧酶；乙醛脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)；丙酮酸脱氢酶，丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脱氢酶(酰化)；苏氨酸醛缩酶；线粒体乙酰肉碱转移酶；过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶；细胞溶质乙酰肉碱转移酶；线粒体乙酰肉碱移位酶；过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草酰乙酸脱羧酶；丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)；乙酰辅酶A羧化酶；丙二酰辅酶A脱羧酶；草酰乙酸脱氢酶；草酰乙酸氧化还原酶；丙二酰辅酶A还原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脱氢酶；丙二酰辅酶A合成酶；丙二酰辅酶A转移酶；苹果酸酶；苹果酸脱氢酶；苹果酸氧化还原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶。
在另一个实施方案中，本文提供了一种用于将乙酰辅酶A从线粒体运输至非天然存在的真核生物的细胞溶质的方法，所述方法包括：培养非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：将乙酰辅酶A从所述生物的线粒体运输至所述生物的细胞溶质。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包括一种或多种选自以下的酶：柠檬酸合酶；柠檬酸转运蛋白；柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白；柠檬酸/苹果酸转运蛋白；ATP柠檬酸裂合酶；柠檬酸裂合酶；乙酰辅酶A合成酶；草酰乙酸转运蛋白；细胞溶质苹果酸脱氢酶；苹果酸转运蛋白；线粒体苹果酸脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙酰辅酶A连接酶或转移酶；乙酸激酶；磷酸转乙酰酶；丙酮酸脱羧酶；乙醛脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)；丙酮酸脱氢酶，丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脱氢酶(酰化)；苏氨酸醛缩酶；线粒体乙酰肉碱转移酶；细胞溶质乙酰肉碱转移酶；和线粒体乙酰肉碱移位酶。
在某些实施方案中，本文提供了一种用于将乙酰辅酶A从过氧化物酶体运输至非天然存在的真核生物的细胞溶质的方法，所述方法包括：培养所述非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：将乙酰辅酶A从所述生物的过氧化物酶体运输至所述生物的细胞溶质。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包括一种或多种选自以下的酶：过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶和过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶。
在第三方面，本文提供了一种生产细胞溶质乙酰辅酶A的方法，所述方法包括：在一定条件下培养非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物足够的时间段，以生产细胞溶质乙酰辅酶A。在一个实施方案中，所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：在所述生物中产生细胞溶质乙酰辅酶A。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包括一种或多种选自以下的酶：柠檬酸合酶；柠檬酸转运蛋白；柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白；柠檬酸/苹果酸转运蛋白；ATP柠檬酸裂合酶；柠檬酸裂合酶；乙酰辅酶A合成酶；草酰乙酸转运蛋白；细胞溶质苹果酸脱氢酶；苹果酸转运蛋白；线粒体苹果酸脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙酰辅酶A连接酶或转移酶；乙酸激酶；磷酸转乙酰酶；丙酮酸脱羧酶；乙醛脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)；丙酮酸脱氢酶，丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脱氢酶(酰化)；苏氨酸醛缩酶；线粒体乙酰肉碱转移酶；过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶；细胞溶质乙酰肉碱转移酶；线粒体乙酰肉碱移位酶；过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草酰乙酸脱羧酶；丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)；乙酰辅酶A羧化酶；丙二酰辅酶A脱羧酶；草酰乙酸脱氢酶；草酰乙酸氧化还原酶；丙二酰辅酶A还原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脱氢酶；丙二酰辅酶A合成酶；丙二酰辅酶A转移酶；苹果酸酶；苹果酸脱氢酶；苹果酸氧化还原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶。
在第四方面，本文提供了一种用于增加非天然存在的真核生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A的方法，所述方法包括：在一定条件下培养非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物足够的时间段，以增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A。在某些实施方案中，所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：增加所述非天然存在的真核生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包括一种或多种选自以下的酶：柠檬酸合酶；柠檬酸转运蛋白；柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白；柠檬酸/苹果酸转运蛋白；ATP柠檬酸裂合酶；柠檬酸裂合酶；乙酰辅酶A合成酶；草酰乙酸转运蛋白；细胞溶质苹果酸脱氢酶；苹果酸转运蛋白；线粒体苹果酸脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙酰辅酶A连接酶或转移酶；乙酸激酶；磷酸转乙酰酶；丙酮酸脱羧酶；乙醛脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)；丙酮酸脱氢酶，丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脱氢酶(酰化)；苏氨酸醛缩酶；线粒体乙酰肉碱转移酶；过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶；细胞溶质乙酰肉碱转移酶；线粒体乙酰肉碱移位酶；过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草酰乙酸脱羧酶；丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)；乙酰辅酶A羧化酶；丙二酰辅酶A脱羧酶；草酰乙酸脱氢酶；草酰乙酸氧化还原酶；丙二酰辅酶A还原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脱氢酶；丙二酰辅酶A合成酶；丙二酰辅酶A转移酶；苹果酸酶；苹果酸脱氢酶；苹果酸氧化还原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶。
在许多真核生物中，乙酰辅酶A主要由线粒体中的丙酮酸脱氢酶合成(图1)。将乙酰辅酶A从线粒体输出至细胞溶质的机制，能够实现例如起源于乙酰辅酶A的细胞溶质1,3-BDO生产途径的利用。用于输出乙酰辅酶A的示例性机制包括在图2、3和8中描绘的那些，其可以涉及在线粒体中从乙酰辅酶A和草酰乙酸形成柠檬酸，将柠檬酸从线粒体输出至细胞溶质，和将柠檬酸转化成草酰乙酸和乙酸或乙酰辅酶A。在某些实施方案中，本文提供了工程改造真核生物以增加它的细胞溶质乙酰辅酶A的可用性的方法，其中引入能够实现图2、3和8中的任一个中描绘的转化的酶。本文中也公开了能够实现所需转化的示例性酶。
乙酰辅酶A集中在细胞的细胞器(诸如过氧化物酶体和线粒体)中，还可以借助于载体蛋白(诸如肉碱或其它乙酰基载体)而输出到细胞溶质中。在本文提供的组合物和方法的某些实施方案中，乙酰基单元跨细胞器膜(诸如线粒体或过氧化物酶体膜)的易位利用载体分子或酰基辅酶A转运蛋白。一种示例性的乙酰基载体分子是肉碱。其它示例性的乙酰基载体分子或转运蛋白包括谷氨酸、丙酮酸、咪唑和葡糖胺。
使用载体蛋白将集中在细胞的细胞器(诸如过氧化物酶体和线粒体)中的乙酰辅酶A输出至细胞溶质的机制可以实现例如起源于乙酰辅酶A的细胞溶质1,3-BDO生产途径的利用。在图6中描绘了示例性的乙酰肉碱易位途径。在一个途径中，线粒体乙酰辅酶A被线粒体乙酰肉碱转移酶转化成乙酰肉碱。线粒体乙酰肉碱然后可以被线粒体乙酰肉碱移位酶跨线粒体膜转移进细胞溶质中，然后被细胞溶质乙酰肉碱转移酶转化成细胞溶质乙酰辅酶A。在另一个途径中，过氧化物酶体乙酰辅酶A被过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶转化成乙酰肉碱。过氧化物酶体乙酰肉碱然后可以被过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶跨过氧化物酶体膜转移进细胞溶质中，然后被细胞溶质乙酰肉碱转移酶转化成细胞溶质乙酰辅酶A。
将细胞溶质丙酮酸和苏氨酸转化成细胞溶质乙酰辅酶A的途径，可以实现例如起源于乙酰辅酶A的细胞溶质1,3-BDO生产途径的利用。除了几种已知的途径以外，图5描绘了4种新颖的将细胞溶质丙酮酸转化成细胞溶质乙酰辅酶A的示例性途径。在一个途径中，丙酮酸被丙酮酸氧化酶转化成乙酸(乙酸形成)。乙酸随后被乙酰辅酶A合成酶、连接酶或转移酶直接地转化成乙酰辅酶A，或者经由乙酰磷酸中间体间接地转化成乙酰辅酶A。在一个替代途径中，丙酮酸被丙酮酸脱羧酶脱羧为乙醛。乙醛脱氢酶将乙醛氧化为乙酸。乙酸然后被乙酸激酶和磷酸转乙酰酶转化成乙酰辅酶A。在另一个途径中，丙酮酸被丙酮酸氧化酶氧化为乙酰磷酸(乙酰磷酸形成)。磷酸转乙酰酶然后将乙酰磷酸转化成乙酰辅酶A。本文中也公开了能够实现所需转化的示例性酶。
用于将细胞溶质磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和丙酮酸转化成细胞溶质乙酰辅酶A的途径，也可以实现例如起源于乙酰辅酶A的细胞溶质1,3-BDO生产途径的利用。图10描绘了12种用于将细胞溶质PEP和丙酮酸转化成细胞溶质乙酰辅酶A的示例性途径。在一个途径中，PEP羧化酶或PEP羧基激酶将PEP转化成草酰乙酸(步骤A)；草酰乙酸脱羧酶将草酰乙酸转化成丙二酸(步骤B)；丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)将丙二酸半醛转化成乙酰辅酶A(步骤C)。在另一个途径中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶将PEP转化成丙酮酸(步骤N)；丙酮酸羧化酶将丙酮酸转化成草酰乙酸(步骤H)；草酰乙酸脱羧酶将草酰乙酸转化成丙二酸(步骤B)；丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)将丙二酸半醛转化成乙酰辅酶A(步骤C)。在另一个途径中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶将PEP转化成丙酮酸(步骤N)；苹果酸酶将丙酮酸转化成苹果酸(步骤L)；苹果酸脱氢酶或氧化还原酶将苹果酸转化成草酰乙酸(步骤M)；草酰乙酸脱羧酶将草酰乙酸转化成丙二酸(步骤B)；丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)将丙二酸半醛转化成乙酰辅酶A(步骤C)。在另一个途径中，PEP羧化酶或PEP羧基激酶将PEP转化成草酰乙酸(步骤A)；草酰乙酸脱羧酶将草酰乙酸转化成丙二酸半醛(步骤B)；丙二酰辅酶A还原酶将丙二酸半醛转化成丙二酰辅酶A(步骤G)；丙二酰辅酶A脱羧酶将丙二酰辅酶A转化成乙酰辅酶A(步骤(D)。在另一个途径中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶将PEP转化成丙酮酸(步骤N)；丙酮酸羧化酶将丙酮酸转化成草酰乙酸(步骤H)；草酰乙酸脱羧酶将草酰乙酸转化成丙二酸半醛(步骤B)；丙二酰辅酶A还原酶将丙二酸半醛转化成丙二酰辅酶A(步骤G)；丙二酰辅酶A脱羧酶将丙二酰辅酶A转化成乙酰辅酶A(步骤(D)。在另一个途径中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶将PEP转化成丙酮酸(步骤N)；苹果酸酶将丙酮酸转化成苹果酸(步骤L)；苹果酸脱氢酶或氧化还原酶将苹果酸转化成草酰乙酸(步骤M)；草酰乙酸脱羧酶将草酰乙酸转化成丙二酸半醛(步骤B)；丙二酰辅酶A还原酶将丙二酸半醛转化成丙二酰辅酶A(步骤G)；丙二酰辅酶A脱羧酶将丙二酰辅酶A转化成乙酰辅酶A(步骤(D)。在另一个途径中，PEP羧化酶或PEP羧基激酶将PEP转化成草酰乙酸(步骤A)；草酰乙酸脱羧酶将草酰乙酸转化成丙二酸半醛(步骤B)；丙二酸半醛脱氢酶将丙二酸半醛转化成丙二酸(步骤J)；丙二酰辅酶A合成酶或转移酶将丙二酸转化成丙二酰辅酶A(步骤K)；丙二酰辅酶A脱羧酶将丙二酰辅酶A转化成乙酰辅酶A(步骤D)。在另一个途径中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶将PEP转化成丙酮酸(步骤N)；丙酮酸羧化酶将丙酮酸转化成草酰乙酸(步骤H)；草酰乙酸脱羧酶将草酰乙酸转化成丙二酸半醛(步骤B)；丙二酸半醛脱氢酶将丙二酸半醛转化成丙二酸(步骤J)；丙二酰辅酶A合成酶或转移酶将丙二酸转化成丙二酰辅酶A(步骤K)；丙二酰辅酶A脱羧酶将丙二酰辅酶A转化成乙酰辅酶A(步骤D)。在另一个途径中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶将PEP转化成丙酮酸(步骤N)；苹果酸酶将丙酮酸转化成苹果酸(步骤L)；苹果酸脱氢酶或氧化还原酶将苹果酸转化成草酰乙酸(步骤M)；草酰乙酸脱羧酶将草酰乙酸转化成丙二酸半醛(步骤B)；丙二酸半醛脱氢酶将丙二酸半醛转化成丙二酸(步骤J)；丙二酰辅酶A合成酶或转移酶将丙二酸转化成丙二酰辅酶A(步骤K)；丙二酰辅酶A脱羧酶将丙二酰辅酶A转化成乙酰辅酶A(步骤D)。在另一个途径中，PEP羧化酶或PEP羧基激酶将PEP转化成草酰乙酸(步骤A)；草酰乙酸脱氢酶或草酰乙酸氧化还原酶将草酰乙酸转化成丙二酰辅酶A(步骤F)；丙二酰辅酶A脱羧酶将丙二酰辅酶A转化成乙酰辅酶A(步骤D)。在另一个途径中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶将PEP转化成丙酮酸(步骤N)；丙酮酸羧化酶将丙酮酸转化成草酰乙酸(步骤H)；草酰乙酸脱氢酶或草酰乙酸氧化还原酶将草酰乙酸转化成丙二酰辅酶A(步骤F)；丙二酰辅酶A脱羧酶将丙二酰辅酶A转化成乙酰辅酶A(步骤D)。在另一个途径中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶将PEP转化成丙酮酸(步骤N)；苹果酸酶将丙酮酸转化成苹果酸(步骤L)；苹果酸脱氢酶或氧化还原酶将苹果酸转化成草酰乙酸(步骤M)；草酰乙酸脱氢酶或草酰乙酸氧化还原酶将草酰乙酸转化成丙二酰辅酶A(步骤F)；丙二酰辅酶A脱羧酶将丙二酰辅酶A转化成乙酰辅酶A(步骤D)。
在某些实施方案中，本文提供的任意途径(例如，乙酰辅酶A和/或1,3-BDO途径)进一步包括将乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A，例如，如在图4、7或10中所示。在某些实施方案中，所述途径包括乙酰乙酰辅酶A硫解酶，其将乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A(图4，步骤A；图7，步骤A；图10，步骤I)。在另一个实施方案中，所述途径包括：乙酰辅酶A羧化酶，其将乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A(图7，步骤E；图10，步骤D)；乙酰乙酰辅酶A合酶，其将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A(图7，步骤F；图10，步骤E)。
在某些实施方案中，本文中提供的非天然存在的真核生物表达编码乙酰辅酶A途径的基因，所述乙酰辅酶A途径用于生产细胞溶质乙酰辅酶A。在某些实施方案中，乙酰辅酶A途径的成功工程改造需要：鉴别具有足够活性和特异性的酶的适当集合，将它们的对应基因克隆进生产宿主中，优化用于将线粒体乙酰辅酶A转化成细胞溶质乙酰辅酶A的培养条件，和测定输出后细胞溶质乙酰辅酶A的产生或水平的增加。
从线粒体或过氧化物酶体乙酰辅酶A生产细胞溶质乙酰辅酶A可以通过许多途径来完成，例如，在约2-5个酶促步骤中。在一个示例性的途径中，柠檬酸合酶将线粒体乙酰辅酶A和草酰乙酸化合成柠檬酸，并由柠檬酸或柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白输出线粒体(参见，例如，图2)。细胞溶质中的柠檬酸的酶促转化会产生细胞溶质乙酰辅酶A和草酰乙酸。细胞溶质草酰乙酸然后可以任选地被草酰乙酸转运蛋白和/或柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白运回到线粒体中。在另一个示例性的途径中，细胞溶质草酰乙酸首先在细胞溶质中被酶转化成苹果酸，然后任选地被苹果酸转运蛋白和/或苹果酸/柠檬酸转运蛋白转移进线粒体中(参见，例如，图3)。线粒体苹果酸然后可以被线粒体苹果酸脱氢酶转化成草酰乙酸。在另一个示例性的途径中，线粒体乙酰辅酶A被线粒体乙酰肉碱转移酶转化成乙酰肉碱。线粒体乙酰肉碱然后可以被线粒体乙酰肉碱移位酶跨线粒体膜转移进细胞溶质中，然后被细胞溶质乙酰肉碱转移酶转化成细胞溶质乙酰辅酶A。在另一个示例性的途径中，过氧化物酶体乙酰辅酶A被过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶转化成乙酰肉碱。过氧化物酶体乙酰肉碱然后可以被过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶跨过氧化物酶体膜转移进细胞溶质中，然后被细胞溶质乙酰肉碱转移酶转化成细胞溶质乙酰辅酶A。
从细胞溶质丙酮酸生产细胞溶质乙酰辅酶A可以通过许多途径来完成，例如，在约2-4个酶促步骤中，并在图5中描绘了示例性途径。在一个途径中，丙酮酸氧化酶将丙酮酸转化成乙酸(乙酸形成)。乙酸随后被乙酰辅酶A合成酶、连接酶或转移酶直接地转化成乙酰辅酶A，或者经由乙酰磷酸中间体间接地转化成乙酰辅酶A。在一个替代途径中，丙酮酸脱羧酶将丙酮酸脱羧成乙醛。乙醛脱氢酶将乙醛氧化成乙酸。乙酸然后被乙酸激酶和磷酸转乙酰酶转化成乙酰辅酶A。在另一个途径中，丙酮酸氧化酶将丙酮酸氧化成乙酰磷酸(乙酰磷酸形成)。磷酸转乙酰酶然后将乙酰磷酸转化成乙酰辅酶A。在图10中描绘了用于将细胞溶质丙酮酸转化成乙酰辅酶A的其它示例性途径。
如以上所讨论的，用于将线粒体乙酰辅酶A转化成细胞溶质乙酰辅酶A和增加真核生物内的细胞溶质乙酰辅酶A的水平的方法，可以实现经由细胞溶质生产途径的几种工业上重要的化合物(包括1,3-BDO)的细胞溶质生产，所述途径利用细胞溶质乙酰辅酶A作为起始原料。在某些实施方案中，本文中提供的生物进一步包含使用细胞溶质乙酰辅酶A作为起始原料来生产化合物的生物合成途径。在某些实施方案中，所述化合物是1,3-BDO。
可以将微生物工程改造成使用乙酰辅酶A生产几种工业上重要的化合物，包括1,3-BDO。因而，本文提供了非天然存在的真核生物，其可以经工程改造成生产商品化学品，诸如1,3-丁二醇。1,3-BDO是一种4碳二醇，其在传统上从乙炔经由它的水合而生产。得到的乙醛然后被转化成3-羟基丁醛，后者随后被还原以形成1,3-BDO。近年来，已经用更偏移的乙烯替代乙炔作为乙醛来源。1,3-BDO经常被用作食品矫味剂的有机溶剂。它也被用作聚氨酯和聚酯树脂的共聚单体，并且被广泛地用作降血糖剂。光学活性的1,3-BDO是一种用于合成生物活性化合物和液晶的有用起始原料。1,3-BDO的大量商业应用是随后脱水以得到1,3-丁二烯(Ichikawa等人,J.ofMolecular Catalysis A-Chemical,256:106-112(2006)；Ichikawa等人,J.ofMolecular Catalysis A-Chemical,231:181-189(2005))，所述1,3-丁二烯每年有250亿磅用于生产合成橡胶(例如，轮胎)、胶乳和树脂的石化产品。1,3-BDO生产对基于石油的原料的依赖，证明使用可再生原料生产1,3-BDO和丁二烯的替代途径的开发是正当的。
图4描绘了使用乙酰辅酶A作为起始原料的多个示例性途径，其可以用于从乙酰辅酶A生产1,3-BDO。在某些实施方案中，在图4的1,3-BDO途径中描绘的乙酰乙酰辅酶A由乙酰乙酰辅酶A合成酶从乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成，例如，如在图7(步骤E和F)或图9中所示，其中乙酰辅酶A羧化酶将乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A，乙酰乙酰辅酶A合成酶从乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A。
细胞溶质中的1,3-BDO生产依赖于天然细胞机制来提供必要的前体。如在图4中所示，乙酰辅酶A可以提供用于生产1,3-BDO的碳前体。因而，能够生产高浓度的细胞溶质乙酰辅酶A的乙酰辅酶A途径是实现起源于乙酰辅酶A的细胞溶质1,3-BDO生产途径的利用所需要的。
在本文提供的某些乙酰辅酶A途径中，在细胞溶质中从丙酮酸或苏氨酸前体合成乙酰辅酶A(图5)。在本文提供的其它乙酰辅酶A途径中，在细胞溶质中从磷酸烯醇丙酮酸(PEP)或丙酮酸合成乙酰辅酶A(图10)。在本文提供的其它乙酰辅酶A途径中，在细胞隔室中合成乙酰辅酶A，并将其直接地或间接地运输至细胞溶质。将乙酰基单元从线粒体或过氧化物酶体运输至细胞溶质的一种示例性机制是肉碱穿梭(图6)。另一种示例性机制包括：将线粒体乙酰辅酶A转化成代谢中间体诸如柠檬酸或柠苹酸，将该中间体运输至细胞溶质，然后再生乙酰辅酶A(参见图2、3和8)。在下面和在实施例I-III中更详细地描述了示例性的乙酰辅酶A途径和对应的酶。
因而，在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)乙酰辅酶A途径，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：(i)将乙酰辅酶A从所述生物的线粒体和/或过氧化物酶体运输至所述生物的细胞溶质，(ii)在所述生物的细胞质中生产乙酰辅酶A，和/或(iii)增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A，和(2)1,3-BDO途径，其包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达。在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包括一种或多种选自以下的酶：柠檬酸合酶；柠檬酸转运蛋白；柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白；柠檬酸/苹果酸转运蛋白；ATP柠檬酸裂合酶；柠檬酸裂合酶；乙酰辅酶A合成酶；草酰乙酸转运蛋白；细胞溶质苹果酸脱氢酶；苹果酸转运蛋白；线粒体苹果酸脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙酰辅酶A连接酶或转移酶；乙酸激酶；磷酸转乙酰酶；丙酮酸脱羧酶；乙醛脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)；丙酮酸脱氢酶，丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脱氢酶(酰化)；苏氨酸醛缩酶；线粒体乙酰肉碱转移酶；过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶；细胞溶质乙酰肉碱转移酶；线粒体乙酰肉碱移位酶；过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草酰乙酸脱羧酶；丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)；乙酰辅酶A羧化酶；丙二酰辅酶A脱羧酶；草酰乙酸脱氢酶；草酰乙酸氧化还原酶；丙二酰辅酶A还原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脱氢酶；丙二酰辅酶A合成酶；丙二酰辅酶A转移酶；苹果酸酶；苹果酸脱氢酶；苹果酸氧化还原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶；和/或(2)所述1,3-BDO途径包括一种或多种选自以下的酶：乙酰乙酰辅酶A硫解酶；乙酰辅酶A羧化酶；乙酰乙酰辅酶A合酶；乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)；3-氧代丁醛还原酶(醛还原)；4-羟基,2-丁酮还原酶；乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)；3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；3-羟基丁醛还原酶；乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)；3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)；3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)；乙酰乙酰辅酶A转移酶、乙酰乙酰辅酶A水解酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶、或磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶；乙酰乙酸还原酶；3-羟基丁酰辅酶A转移酶、水解酶或合成酶；3-羟基丁酸还原酶；和3-羟基丁酸脱氢酶。
任何非天然存在的包含乙酰辅酶A途径且经工程改造成包含乙酰辅酶A途径酶(诸如本文提供的那些)的真核生物，可以经工程改造成进一步包含一种或多种1,3-BDO途径酶，诸如本文提供的那些。
本文还提供了一种用于生产1,3-BDO的方法，所述方法包括：在一定条件下培养本文提供的任一种包含1,3-BDO途径的生物足够的时间段以生产1,3-BDO。由本文描述的生物和方法生产的1,3-BDO的脱水会提供在小最终使用场所中生产可再生的丁二烯的机会，从而避免运输该可燃性的且反应性的化学品的需要。
在第六方面，本文提供了一种生产1,3-BDO的方法，所述方法包括：在一定条件下培养非天然存在的真核生物足够的时间段以生产1,3-BDO，其中所述非天然存在的真核生物包含：(1)乙酰辅酶A途径；和(2)1,3-BDO途径。在某些实施方案中，本文提供了一种生产1,3-BDO的方法，所述方法包括：培养非天然存在的真核生物，其包含：(1)乙酰辅酶A途径，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：(i)将乙酰辅酶A从所述生物的线粒体和/或过氧化物酶体运输至所述生物的细胞溶质，(ii)在所述生物的细胞质中生产乙酰辅酶A，和/或(iii)增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A；和(2)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达。在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包括一种或多种选自以下的酶：柠檬酸合酶；柠檬酸转运蛋白；柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白；柠檬酸/苹果酸转运蛋白；ATP柠檬酸裂合酶；柠檬酸裂合酶；乙酰辅酶A合成酶；草酰乙酸转运蛋白；细胞溶质苹果酸脱氢酶；苹果酸转运蛋白；线粒体苹果酸脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙酰辅酶A连接酶或转移酶；乙酸激酶；磷酸转乙酰酶；丙酮酸脱羧酶；乙醛脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)；丙酮酸脱氢酶，丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脱氢酶(酰化)；苏氨酸醛缩酶；线粒体乙酰肉碱转移酶；过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶；细胞溶质乙酰肉碱转移酶；线粒体乙酰肉碱移位酶；过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草酰乙酸脱羧酶；丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)；乙酰辅酶A羧化酶；丙二酰辅酶A脱羧酶；草酰乙酸脱氢酶；草酰乙酸氧化还原酶；丙二酰辅酶A还原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脱氢酶；丙二酰辅酶A合成酶；丙二酰辅酶A转移酶；苹果酸酶；苹果酸脱氢酶；苹果酸氧化还原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶；和(2)所述1,3-BDO途径包括一种或多种选自以下的酶：乙酰乙酰辅酶A硫解酶；乙酰辅酶A羧化酶；乙酰乙酰辅酶A合酶；乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)；3-氧代丁醛还原酶(醛还原)；4-羟基,2-丁酮还原酶；乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)；3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；3-羟基丁醛还原酶；乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)；3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)；3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)；乙酰乙酰辅酶A转移酶、乙酰乙酰辅酶A水解酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶、或磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶；乙酰乙酸还原酶；3-羟基丁酰辅酶A转移酶、水解酶或合成酶；和3-羟基丁酸还原酶；和3-羟基丁酸脱氢酶。
任何非天然存在的包含乙酰辅酶A途径且经工程改造成包含乙酰辅酶A途径酶(诸如本文提供的那些)的真核生物，可以经工程改造成进一步包含一种或多种1,3-BDO途径酶。在某些实施方案中，与1,3-BDO途径相组合的乙酰辅酶A途径的成功工程改造需要：鉴别具有足够活性和特异性的酶的适当集合，将它们的对应基因克隆进生产宿主中，优化用于生产细胞溶质乙酰辅酶A和生产1,3-BDO的培养条件，和测定1,3-BDO产物形成的产生或水平的增加。
例如，可以通过许多途径在约3-6个酶促步骤(如在图4中所示)中完成乙酰辅酶A至1,3-BDO的转化。图4描绘了从乙酰辅酶A生产1,3-BDO的多个途径。从乙酰辅酶A至1,3-BDO的这些途径中的每一个利用3个还原当量，并提供每消耗1摩尔葡萄糖得到1摩尔1,3-BDO的理论收率。其它碳底物(诸如合成气)也可以用于生产乙酰乙酰辅酶A。假定从葡萄糖得到6摩尔CO和6摩尔H2，使葡萄糖气化以形成合成气，会产生每消耗1摩尔葡萄糖得到1.09摩尔1,3-BDO的最大理论收率，
6CO+6H2→1.091C4H10O2+1.636CO2+0.545H2
本文提供的方法部分地涉及通过培养这些非天然存在的真核生物来生产1,3-BDO的方法。通过本文描述的生物和方法生产的1,3-BDO的脱水，会提供在小最终使用场所中生产可再生的丁二烯的机会，从而避免运输该可燃性的且反应性的化学品的需要。
在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含乙酰辅酶A途径，其中所述生物包含编码至少一种乙酰辅酶A途径酶的至少一种外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现以下目的的量表达：(i)将乙酰辅酶A从所述生物的线粒体和/或过氧化物酶体运输至所述生物的细胞溶质，(ii)在所述生物的细胞质中生产乙酰辅酶A，和/或(iii)增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A。在一个实施方案中，所述至少一种乙酰辅酶A途径酶以足以将乙酰辅酶A从所述生物的线粒体和/或过氧化物酶体运输至生物的细胞溶质的量表达。在一个实施方案中，所述至少一种乙酰辅酶A途径酶以足以在所述生物中产生细胞溶质乙酰辅酶A的量表达。在另一个实施方案中，所述至少一种乙酰辅酶A途径酶以足以增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A的量表达。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：2A，2B，2C，2D，2E，2F，2G，2K，2L，3H，3I或3J，或其中2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2K、2L、3H、3I和3J的任意组合；其中2A是柠檬酸合酶；2B是柠檬酸转运蛋白；2C是柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白或柠檬酸/苹果酸转运蛋白；2D是ATP柠檬酸裂合酶；2E是柠檬酸裂合酶；2F是乙酰辅酶A合成酶；2G是草酰乙酸转运蛋白；2K是乙酸激酶；2L是磷酸转乙酰酶；3H是细胞溶质苹果酸脱氢酶；3I是苹果酸转运蛋白；和3J是线粒体苹果酸脱氢酶。在某些实施方案中，2C是柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白。在其它实施方案中，2C是柠檬酸/苹果酸转运蛋白。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径是在图2中描绘的乙酰辅酶A途径。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径是在图3中描绘的乙酰辅酶A途径。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B和2D。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C和2D。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C和2D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E和2F。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E和2F。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E和2F。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E、2K和2L。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E、2K和2L。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3H。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3I。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G和3H。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G和3I。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G和3J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3H和3I。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3H和3J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3I和3J。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G、3H和3I。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G、3H和3J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G、3I和3J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3H、3I和3J。
在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2B。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2C。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2E。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2F。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2K。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2L。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含3H。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含3I。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含3J。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：2A和2B；2A和2C；2A和2D；2A和2E；2A和2F；2A和2G；2A和2K；2A和2L；2A和3H；2A和3I；2A和3J；2B和2C；2B和2D；2B和2E；2B和2F；2B和2G；2B和2K；2B和2L；2B和3H；2B和3I；2B和3J；2C和2D；2C和2E；2C和2F；2C和2G；2C和2K；2C和2L；2C和3H；2C和3I；2C和3J；2D和2E；2D和2F；2D和2G；2D和2E；2D和2F；2D和2G；2D和2K；2D和2L；2D和3H；2D和3I；2D和3J；2E和2F；2E和2G；2E和2K；2E和2L；2E和3H；2E和3I；2E和3J；2F和2G；2F和2K；2F和2L；2F和3H；2F和3I；2F和3J；2G和2K；2G和2L；2G和3H；2G和3I；2G和3J；2K和2L；2K和3H；2K和3I；2K和3J；2L和3H；2L和3I；2L和3J；3H和3I；3H和3J；或3I和3J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含2种或更多种外源核酸，其中所述2种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B和2C；2A、2B和2D；2A、2B和2E；2A、2B和2F；2A、2B和2G；2A、2B和2K；2A、2B和2L；2A、2B和3H；2A、2B和3I；2A、2B和3J；2A、2C和2D；2A、2C和2E；2A、2C和2F；2A、2C和2G；2A、2C和2K；2A、2C和2L；2A、2C和3H；2A、2C和3I；2A、2C和3J；2A、2D和2E；2A、2D和2F；2A、2D和2G；2A、2D和2K；2A、2D和2L；2A、2D和3H；2A、2D和3I；2A、2D和3J；2A、2E和2F；2A、2E和2G；2A、2E和2K；2A、2E和2L；2A、2E和3H；2A、2E和3I；2A、2E和3J；2A、2F和2G；2A、2F和2K；2A、2F和2L；2A、2F和3H；2A、2F和3I；2A、2F和3J；2B、2C和2D；2B、2C和2E；2B、2C和2F；2B、2C和2G；2B、2C和2K；2B、2C和2L；2B、2C和3H；2B、2C和3I；2B、2C和3J；2B、2D和2E；2B、2D和2F；2B、2D和2G；2B、2D和2K；2B、2D和2L；2B、2D和3H；2B、2D和3I；2B、2D和3J；2B、2E和2F；2B、2E和2G；2B、2E和2K；2B、2E和2L；2B、2E和3H；2B、2E和3I；2B、2E和3J；2B、2F和2G；2B、2F和2K；2B、2F和2L；2B、2F和3H；2B、2F和3I；2B、2F和3J；2B、2G和2K；2B、2G和2L；2B、2G和3H；2B、2G和3I；2B、2G和3J；2B、2K和2L；2B、2K和3H；2B、2K和3I；2B、2K和3J；2B、2L和3H；2B、2L和3I；2B、2L和3J；2C、2D和2E；2C、2D和2F；2C、2D和2G；2C、2D和2K；2C、2D和2L；2C、2D和3H；2C、2D和3I；2C、2D和3J；2C、2E和2F；2C、2E和2G；2C、2E和2K；2C、2E和2L；2C、2E和3H；2C、2E和3I；2C、2E和3J；2C、2F和2G；2C、2F和2K；2C、2F和2L；2C、2F和2G；2C、2F和2K；2C、2F和2L；2C、2F和3H；2C、2F和3I；2C、2F和3J；2D、2E和2F；2D、2E和2G；2D、2E和2K；2D、2E和2L；2D、2E和3H；2D、2E和3I；2D、2E和3J；2D、2F和2G；2D、2F和2K；2D、2F和2L；2D、2F和3H；2D、2F和3I；2D、2F和3J；2D、2G和2K；2D、2G和2L；2D、2G和3H；2D、2G和3I；2D、2G和3J；2D、2K和2L；2D、2K和3H；2D、2K和3I；2D、2K和3J；2D、2L和3H；2D、2L和3I；2D、2L和3J；2D、3H和3I；2D、3H和3J；2D、3I和3J；2E、2F和2G；2E、2F和2K；2E、2F和2L；2E、2F和3H；2E、2F和3I；2E、2F和3J；2E、2G和2K；2E、2G和2L；2E、2G和3H；2E、2G和3I；2E、2G和3J；2K、2L和3H；2K、2L和3I；2K、2L和3J；2K、3H和3I；2K、3H和3J；2K、3I和3J；2L、3H和3I；2L、3H和3J；2L、3I和3J；或3H、3I和3J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含3种或更多种外源核酸，其中所述3种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2C和2D；2A、2B、2C和2E；2A、2B、2C和2F；2A、2B、2C和2G；2A、2B、2C和2K；2A、2B、2C和2L；2A、2B、2C和3H；2A、2B、2C和3I；2A、2B、2C和3J；2A、2B、2D和2E；2A、2B、2D和2F；2A、2B、2D和2G；2A、2B、2D和2K；2A、2B、2D和2L；2A、2B、2D和3H；2A、2B、2D和3I；2A、2B、2D和3J；2A、2B、2E和2F；2A、2B、2E和2G；2A、2B、2E和2K；2A、2B、2E和2L；2A、2B、2E和3H；2A、2B、2E和3I；2A、2B、2E和3J；2A、2B、2F和2G；2A、2B、2F和2H；2A、2B、2F和2I；2A、2B、2F和3H；2A、2B、2F和3I；2A、2B、2F和3J；2A、2B、2G和2K；2A、2B、2G和2L；2A、2B、2G和3H；2A、2B、2G和3I；2A、2B、2G和3J；2A、2B、2K和2L；2A、2B、2K和3H；2A、2B、2K和3I；2A、2B、2K和3J；2A、2B、2L和3H；2A、2B、2L和3I；2A、2B、2L和3J；2A、2B、3H和3I；2A、2B、3H和3J；2A、2B、3I和3J；2A、2C、2D和2E；2A、2C、2D和2F；2A、2C、2D和2G；2A、2C、2D和2K；2A、2C、2D和2L；2A、2C、2D和3H；2A、2C、2D和3I；2A、2C、2D和3J；2A、2C、2E和2F；2A、2C、2E和2G；2A、2C、2E和2K；2A、2C、2E和2L；2A、2C、2E和3H；2A、2C、2E和3I；2A、2C、2E和3J；2A、2C、2F和2G；2A、2C、2F和2K；2A、2C、2F和2L；2A、2C、2F和3H；2A、2C、2F和3I；2A、2C、2F和3J；2A、2C、2G和2K；2A、2C、2G和2L；2A、2C、2G和3H；2A、2C、2G和3I；2A、2C、2G和3J；2A、2C、2K和2L；2A、2C、2K和3H；2A、2C、2K和3I；2A、2C、2K和3J；2A、2C、2L和3H；2A、2C、2L和3I；2A、2C、2L和3J；2A、2C、3H和3I；2A、2C、3H和3J；2A、2C、3I和3J；2A、2D、2E和2F；2A、2D、2E和2G；2A、2D、2E和2K；2A、2D、2E和2L；2A、2D、2E和3H；2A、2D、2E和3I；2A、2D、2E和3J；2A、2D、2F和2G；2A、2D、2F和2K；2A、2D、2F和2L；2A、2D、2F和3H；2A、2D、2F和3I；2A、2D、2F和3J；2A、2D、2G和2K；2A、2D、2G和2L；2A、2D、2G和3H；2A、2D、2G和3I；2A、2D、2G和3J；2A、2D、2K和2L；2A、2D、2K和3H；2A、2D、2K和3I；2A、2D、2K和3J；2A、2D、2L和3H；2A、2D、2L和3I；2A、2D、2L和3J；2A、2D、3H和3I；2A、2D、3H和3J；2A、2D、3I和3J；2A、2E、2F和2G；2A、2E、2F和2K；2A、2E、2F和2L；2A、2E、2F和3H；2A、2E、2F和3I；2A、2E、2F和3J；2A、2E、2G和2K；2A、2E、2G和2L；2A、2E、2G和3H；2A、2E、2G和3I；2A、2E、2G和3J；2A、2E、2K和2L；2A、2E、2K和3H；2A、2E、2K和3I；2A、2E、2K和3J；2A、2E、2L和3H；2A、2E、2L和3I；2A、2E、2L和3J；2A、2E、3H和3I；2A、2E、3H和3J；2A、2E、3I和3J；2A、2F、2G和2K；2A、2F、2G和2L；2A、2F、2G和3H；2A、2F、2G和3I；2A、2F、2G和3J；2A、2F、2K和2L；2A、2F、2K和3H；2A、2F、2K和3I；2A、2F、2K和3J；2A、2F、2L和3H；2A、2F、2L和3I；2A、2F、2L和3J；2A、2F、3H和3I；2A、2F、3H和3J；2A、2F、3I和3J；2A、2G、2K和2L；2A、2G、2K和3H；2A、2G、2K和3I；2A、2G、2K和3J；2A、2G、2L和3H；2A、2G、2L和3I；2A、2G、2L和3J；2A、2G、3H和3I；2A、2G、3H和3J；2A、2G、3I和3J；2A、3H、3I和3J；2B、2C、2D和2E；2B、2C、2D和2F；2B、2C、2D和2G；2B、2C、2D和2K；2B、2C、2D和2L；2B、2C、2D和3H；2B、2C、2D和3I；2B、2C、2D和3J；2B、2C、2E和2F；2B、2C、2E和2G；2B、2C、2E和2K；2B、2C、2E和2L；2B、2C、2E和3H；2B、2C、2E和3I；2B、2C、2E和3J；2B、2C、2F和2G；2B、2C、2F和2K；2B、2C、2F和2L；2B、2C、2F和3H；2B、2C、2F和3I；2B、2C、2F和3J；2B、2C、2G和2K；2B、2C、2G和2L；2B、2C、2G和3H；2B、2C、2G和3I；2B、2C、2G和3J；2B、2C、2K和2L；2B、2C、2K和3H；2B、2C、2K和3I；2B、2C、2K和3J；2B、2C、2L和3H；2B、2C、2L和3I；2B、2C、2L和3J；2B、2C、3H和3I；2B、2C、3H和3J；2B、2C、3I和3J；2B、2D、2E和2F；2B、2D、2E和2G；2B、2D、2E和2K；2B、2D、2E和2L；2B、2D、2E和3H；2B、2D、2E和3I；2B、2D、2E和3J；2B、2D、2F和2G；2B、2D、2F和2K；2B、2D、2F和2L；2B、2D、2F和3H；2B、2D、2F和3I；2B、2D、2F和3J；2B、2D、2G和2K；2B、2D、2G和2L；2B、2D、2G和3H；2B、2D、2G和3I；2B、2D、2G和3J；2B、2D、2K和2L；2B、2D、2K和3H；2B、2D、2K和3I；2B、2D、2K和3J；2B、2D、2L和3H；2B、2D、2L和3I；2B、2D、2L和3J；2B、2D、3H和3I；2B、2D、3H和3J；2B、2D、3I和3J；2B、2E、2F和2G；2B、2E、2F和2K；2B、2E、2F和2L；2B、2E、2F和3H；2B、2E、2F和3I；2B、2E、2F和3J；2B、2E、2G和2K；2B、2E、2G和2L；2B、2E、2G和3H；2B、2E、2G和3I；2B、2E、2G和3J；2B、2E、2K和2L；2B、2E、2K和3H；2B、2E、2K和3I；2B、2E、2K和3J；2B、2E、2L和3H；2B、2E、2L和3I；2B、2E、2L和3J；2B、2E、3H和3I；2B、2E、3H和3J；2B、2E、3I和3J；2B、2F、2G和2K；2B、2F、2G和2L；2B、2F、2G和3H；2B、2F、2G和3I；2B、2F、2G和3J；2B、2F、2K和2L；2B、2F、2K和3H；2B、2F、2K和3I；2B、2F、2K和3J；2B、2F、2L和3H；2B、2F、2L和3I；2B、2F、2L和3J；2B、2F、3H和3I；2B、2F、3H和3J；2B、2F、3I和3J；2B、2G、2K和2L；2B、2G、2K和3H；2B、2G、2K和3I；2B、2G、2K和3J；2B、2G、2L和3H；2B、2G、2L和3I；2B、2G、2L和3J；2B、2G、3H和3I；2B、2G、3H和3J；2B、3H、3I和3J；2B、2K、2L和3H；2B、2K、2L和3I；2B、2K、2L和3J；2B、2K、3H和3I；2B、2K、3H和3J；2B、2K、3I和3J；2B、2L、3H和3I；2B、2L、3H和3J；2B、2L、3I和3J；2B、3H、3I和3J；2C、2D、2E和2F；2C、2D、2E和2G；2C、2D、2E和2K；2C、2D、2E和2L；2C、2D、2E和3H；2C、2D、2E和3I；2C、2D、2E和3J；2C、2D、2F和2G；2C、2D、2F和2K；2C、2D、2F和2L；2C、2D、2F和3H；2C、2D、2F和3I；2C、2D、2F和3J；2C、2D、2G和2K；2C、2D、2G和2L；2C、2D、2G和3H；2C、2D、2G和3I；2C、2D、2G和3J；2C、2D、3H和3I；2C、2D、2K和2L；2C、2D、2K和3H；2C、2D、2K和3I；2C、2D、2K和3J；2C、2D、2L和3H；2C、2D、2L和3I；2C、2D、2L和3J；2C、2D、3H和3I；2C、2D、3H和3J；2C、2D、3I和3J；2C、2E、2F和2G；2C、2E、2F和2K；2C、2E、2F和2L；2C、2E、2F和3H；2C、2E、2F和3I；2C、2E、2F和3J；2C、2E、2G和2K；2C、2E、2G和2L；2C、2E、2G和3H；2C、2E、2G和3I；2C、2E、2G和3J；2C、2E、2K和2L；2C、2E、2K和3H；2C、2E、2K和3I；2C、2E、2K和3J；2C、2E、2L和3H；2C、2E、2L和3I；2C、2E、2L和3J；2C、2E、3H和3I；2C、2E、3H和3J；2C、2E、3I和3J；2C、2F、2G和2K；2C、2F、2G和2L；2C、2F、2G和3H；2C、2F、2G和3I；2C、2F、2G和3J；2C、2F、2K和2L；2C、2F、2K和3H；2C、2F、2K和3I；2C、2F、2K和3J；2C、2F、2L和3H；2C、2F、2L和3I；2C、2F、2L和3J；2C、2F、3H和3I；2C、2F、3H和3J；2C、2F、3I和3J；2C、2G、2K和2L；2C、2G、2K和3H；2C、2G、2K和3I；2C、2G、2K和3J；2C、2G、2L和3H；2C、2G、2L和3I；2C、2G、2L和3J；2C、2G、3H和3I；2C、2G、3H和3J；2C、2G、3I和3J；2C、2K、2L和3H；2C、2K、2L和3I；2C、2K、2L和3J；2C、2K、3H和3I；2C、2K、3H和3J；2C、2K、3I和3J；2C、2L、3H和3I；2C、2L、3H和3J；2C、2L、3I和3J；2C、3H、3I和3J；2D、2E、2F和2G；2D、2E、2F和2K；2D、2E、2F和2L；2D、2E、2F和3H；2D、2E、2F和3I；2D、2E、2F和3J；2D、2E、2G和2K；2D、2E、2G和2L；2D、2E、2G和3H；2D、2E。2G和3I；2D、2E、2G和3J；2D、2E、2K和2L；2D、2E、2K和3H；2D、2E。2K和3I；2D、2E、2K和3J；2D、2E、2L和3H；2D、2E。2L和3I；2D、2E、2L和3J；2D、2E、3H和3I；2D、2E、3H和3J；2D、2E、3I和3J；2D、2F、2G和2K；2D、2F、2G和2L；2D、2F、2G和3H；2D、2F、2G和3I；2D、2F、2G和3J；2D、2F、2K和2L；2D、2F、2K和3H；2D、2F、2K和3I；2D、2F、2K和3J；2D、2F、2L和3H；2D、2F、2L和3I；2D、2F、2L和3J；2D、2F、3H和3I；2D、2F、3H和3J；2D、2F、3I和3J；2E、2F、2G和3H；2E、2F、2G和3I；2E、2F、2G和3J；2E、2F、3H和3I；2E、2F、3H和3J；2E、2F、3I和3J；2F、2G、3H和3I；2F、2G、3H和3J；2F、2G、3I和3J；或2G、3H、3I和3J。2D、2G、2K和2L；2D、2G、2K和3H；2D、2G、2K和3I；2D、2G、2K和3J；2D、2G、2L和3H；2D、2G、2L和3I；2D、2G、2L和3J；2D、2G、2H和3I；2D、2G、2H和3J；2D、2G、3I和3J；2D、2K、2L和3H；2D、2K、2L和3I；2D、2K、2L和3J；2D、2K、3H和3I；2D、2K、3H和3J；2D、2K、3I和3J；2D、2L、3H和3I；2D、2L、3H和3J；2D、3H、3I和3J；2D、3H、3I和3J；2E、2F、2G和2K；2E、2F、2G和2L；2E、2F、2G和3H；2E、2F、2G和3I；2E、2F、2G和3J；2E、2F、2K和2L；2E、2F、2K和3H；2E、2F、2K和3I；2E、2F、2K和3J；2E、2F、2L和3H；2E、2F、2L和3I；2E、2F、2L和3J；2E、2F、3H和3I；2E、2F、3H和3J；2E、2F、3I和3J；2E、2G、2K和2L；2E、2G、2K和3H；2E、2G、2K和3I；2E、2G、2K和3J；2E、2G、2L和3H；2E、2G、2L和3I；2E、2G、2L和3J；2E、2G、3H和3I；2E、2G、3H和3J；2E、2G、3I和3J；2E、2K、2L和3H；2E、2K、2L和3I；2E、2K、2L和3J；2E、2K、3H和3I；2E、2K、3H和3J；2E、2K、3I和3J；2E、2L、3H和3I；2E、2L、3H和3J；2E、2L、3I和3J；2E、3H、3I和3J。2F、2G、2K和2L；2F、2G、2K和3H；2F、2G、2K和3I；2F、2G、2K和3J；2F、2G、2L和3H；2F、2G、2L和3I；2F、2G、2L和3J；2F、2G、3H和3I；2F、2G、3H和3J；2F、2G、3I和3J；2F、2K、2L和3H；2F、2K、2L和3I；2F、2K、2L和3J；2F、2K、3H和3I；2F、2K、3H和3J；2F、2K、3I和3J；2F、3H、3I和3J；2G、2K、2L和3H；2G、2K、2L和3I；2G、2K、2L和3J；2G、2K、3H和3I；2G、2K、3H和3J；2G、2K、3I和3J；2G、2L、3H和3I；2G、2L、3H和3J；2G、2L、3I和3J；2G、3H、3I和3J；2K、2L、3H和3I；2K、2L、3H和3J；2K、2L、3I和3J；或2L、3H、3I和3J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含4种或更多种外源核酸，其中所述4种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2C、2D和2E；2A、2B、2C、2D和2F；2A、2B、2C、2D和2G；2A、2B、2C、2D和3H；2A、2B、2C、2D和3I；2A、2B、2C、2D和3J；2A、2B、2C、2E和2F；2A、2B、2C、2E和2G；2A、2B、2C、2E和3H；2A、2B、2C、2E和3I；2A、2B、2C、2E和3J；2A、2B、2C、2F和2G；2A、2B、2C、2F和3H；2A、2B、2C、2F和3I；2A、2B、2C、2F和3J；2A、2B、2C、2G和3H；2A、2B、2C、2G和3I；2A、2B、2C、2G和3J；2A、2B、2C、3H和3I；2A、2B、2C、3H和3J；2A、2B、2C、3I和3J；2A、2B、2D、2E和3H；2A、2B、2D、2E和3I；2A、2B、2D、2E和3J；2A、2B、2D、2F和2G；2A、2B、2D、2F和3H；2A、2B、2D、2F和3I；2A、2B、2D、2F和3J；2A、2B、2D、2G和3H；2A、2B、2D、2G和3I；2A、2B、2D、2G和3J；2A、2B、2D、3H和3I；2A、2B、2D、3H和3J；2A、2B、2D、3I和3J；2A、2B、2E、2F和2G；2A、2B、2E、2F和3H；2A、2B、2E、2F和3I；2A、2B、2E、2F和3J；2A、2B、2E、2G和3H；2A、2B、2E、2G和3I；2A、2B、2E、2G和3J；2A、2B、2E、3H和3I；2A、2B、2E、3H和3J；2A、2B、2E、3I和3J；2A、2B、2F、2G和3H；2A、2B、2F、2G和3I；2A、2B、2F、2G和3J；2A、2B、2F、3H和3I；2A、2B、2F、3H和3J；2A、2B、2F、3I和3J；2A、2B、2G、3H和3I；2A、2B、2G、3H和3J；2A、2B、2G、3I和3J；2A、2B、3H、3I和3J；2A、2C、2D、2E和2F；2A、2C、2D、2E和2G；2A、2C、2D、2E和3H；2A、2C、2D、2E和3I；2A、2C、2D、2E和3J；2A、2C、2D、2F和2G；2A、2C、2D、2F和3H；2A、2C、2D、2F和3I；2A、2C、2D、2F和3J；2A、2C、2D、2G和3H；2A、2C、2D、2G和3I；2A、2C、2D、2G和3J；2A、2C、2D、3H和3I；2A、2C、2D、3H和3J；2A、2C、2D、3I和3J；2A、2C、2E、2F和2G；2A、2C、2E、2F和3H；2A、2C、2E、2F和3I；2A、2C、2E、2F和3J；2A、2C、2E、2G和3H；2A、2C、2E、2G和3I；2A、2C、2E、2G和3J；2A、2C、2E、3H和3I；2A、2C、2E、3H和3J；2A、2C、2E、3I和3J；2A、2C、2F、2G和3H；2A、2C、2F、2G和3I；2A、2C、2F、2G和3J；2A、2C、2F、3H和3I；2A、2C、2F、3H和3J；2A、2C、2F、3I和3J；2A、2C、2G、3H和3I；2A、2C、2G、3H和3J；2A、2C、2G、3I和3J；2A、2C、3H、3I和3J；2A、2D、2E、2F和2G；2A、2D、2E、2F和3H；2A、2D、2E、2F和3I；2A、2D、2E、2F和3J；2A、2D、2E、2G和3H；2A、2D、2E、2G和3I；2A、2D、2E、2G和3J；2A、2D、2E、3H和3I；2A、2D、2E、3H和3J；2A、2D、2E、3I和3J；2A、2D、2F、2G和3H；2A、2D、2F、2G和3I；2A、2D、2F、2G和3J；2A、2D、2F、3H和3I；2A、2D、2F、3H和3J；2A、2D、2F、3I和3J；2A、2D、2G、3H和3I；2A、2D、2G、3H和3J；2A、2D、2G、3I和3J；2A、2D、3H、3I和3J；2A、2E、2F、2G和3H；2A、2E、2F、2G和3I；2A、2E、2F、2G和3J；2A、2E、2F、3H和3I；2A、2E、2F、3H和3J；2A、2E、2F、3I和3J；2A、2E、2G、3H和3I；2A、2E、2G、3H和3J；2A、2E、2G、3I和3J；2A、2E、3H、3I和3J；2A、2F、2G、3H和3I；2A、2F、2G、3H和3J；2A、2F、2G、3I和3J；2A、2F、3H、3I和3J；2A、2G、3H、3I和3J；2B、2C、2D、2E和2F；2B、2C、2D、2E和2G；2B、2C、2D、2E和3H；2B、2C、2D、2E和3I；2B、2C、2D、2E和3J；2B、2C、2D、2F和2G；2B、2C、2D、2F和3H；2B、2C、2D、2F和3I；2B、2C、2D、2F和3J；2B、2C、2D、2G和3H；2B、2C、2D、2G和3I；2B、2C、2D、2G和3J；2B、2C、2D、3H和3I；2B、2C、2D、3H和3J；2B、2C、2D、3I和3J；2B、2C、2E、2F和2G；2B、2C、2E、2F和3H；2B、2C、2E、2F和3I；2B、2C、2E、2F和3J；2B、2C、2E、2G和3H；2B、2C、2E、2G和3I；2B、2C、2E、2G和3J；2B、2C、2E、3H和3I；2B、2C、2E、3H和3J；2B、2C、2E、3I和3J；2B、2C、2F、2G和3H；2B、2C、2F、2G和3I；2B、2C、2F、2G和3J；2B、2C、2F、3H和3I；2B、2C、2F、3H和3J；2B、2C、2F、3I和3J；2B、2C、2G、3H和3I；2B、2C、2G、3H和3J；2B、2C、2G、3I和3J；2B、2C、3H、3I和3J；2B、2D、2E、2F和2G；2B、2D、2E、2F和3H；2B、2D、2E、2F和3I；2B、2D、2E、2F和3J；2B、2D、2E、2G和3H；2B、2D、2E、2G和3I；2B、2D、2E、2G和3J；2B、2D、2E、3H和3I；2B、2D、2E、3H和3J；2B、2D、2E、3I和3J；2B、2D、2F、2G和3H；2B、2D、2F、2G和3I；2B、2D、2F、2G和3J；2B、2D、2F、3H和3I；2B、2D、2F、3H和3J；2B、2D、2F、3I和3J；2B、2E、2F、2G和3H；2B、2E、2F、2G和3I；2B、2E、2F、2G和3J；2B、2E、2F、3H和3I；2B、2E、2F、3H和3J；2B、2E、2F、3I和3J；2B、2E、2G、3H和3I；2B、2E、2G、3H和3J；2B、2E、2G、3I和3J；2B、2E、3H、3I和3J；2B、2F、2G、3H和3I；2B、2F、2G、3H和3J；2B、2F、2G、3I和3J；2B、2G、3H、3I和3J；2C、2D、2E、2F和3H；2C、2D、2E、2F和3I；2C、2D、2E、2F和3J；2C、2D、2E、2G和3H；2C、2D、2E、2G和3I；2C、2D、2E、2G和3J；2C、2D、2E、3H和3I；2C、2D、2E、3H和3J；2C、2D、2E、3I和3J；2C、2D、2F、2G和3H；2C、2D、2F、2G和3I；2C、2D、2F、2G和3J；2C、2D、2F、3H和3I；2C、2D、2F、3H和3J；2C、2D、2F、3I和3J；2C、2D、2G、3H和3I；2C、2D、2G、3H和3J；2C、2D、2G、3I和3J；2C、2D、3H、3I和3J；2D、2E、2F、2G和3H；2D、2E、2F、2G和3I；2D、2E、2F、2G和3J；2D、2E、2F、3H和3I；2D、2E、2F、3H和3J；2D、2E、2F、3I和3J；2D、2E、2G、3H和3I；2D、2E、2G、3H和3J；2D、2E。2G、3I和3J；2D、2E、3H、3I和3J；2E、2F、2G、3H和3I；2E、2F、2G、3H和3J；2E、2F、2G、3I和3J；2E、2F、3H、3I和3J；或2F、2G、3H、3I和3J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含5种或更多种外源核酸，其中所述5种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2C、2D、2E和2F；2A、2B、2C、2D、2E和2G；2A、2B、2C、2D、2E和3H；2A、2B、2C、2D、2E和3I；2A、2B、2C、2D、2E和3J；2A、2B、2C、2D、2F和2G；2A、2B、2C、2D、2F和3H；2A、2B、2C、2D、2F和3I；2A、2B、2C、2D、2F和3H；2A、2B、2C、2D、2G和3H；2A、2B、2C、2D、2G和3I；2A、2B、2C、2D、2G和3J；2A、2B、2C、2D、3H和3I；2A、2B、2C、2D、3H和3J；2A、2B、2C、2D、3I和3J；2A、2B、2C、2E、2F和2G；2A、2B、2C、2E、2F和3H；2A、2B、2C、2E、2F和3I；2A、2B、2C、2E、2F和3J；2A、2B、2C、2E、2G和3H；2A、2B、2C、2E、2G和3I；2A、2B、2C、2E、2G和3J；2A、2B、2C、2E、3H和3I；2A、2B、2C、2E、3H和3J；2A、2B、2C、2E、3I和3J；2A、2B、2C、2F、2G和3H；2A、2B、2C、2F、2G和3I；2A、2B、2C、2F、2G和3J；2A、2B、2C、2F、3H和3I；2A、2B、2C、2F、3H和3J；2A、2B、2C、2F、3I和3J；2A、2B、2C、2G、3H和3I；2A、2B、2C、2G、3H和3J；2A、2B、2C、2G、3I和3J；2A、2B、2C、3H、3I和3J；2A、2B、2D、2E、3H和3I；2A、2B、2D、2E、3H和3J；2A、2B、2D、2E、3I和3J；2A、2B、2D、2F、2G和3H；2A、2B、2D、2F、2G和3I；2A、2B、2D、2F、2G和3J；2A、2B、2D、2F、3H和3I；2A、2B、2D、2F、3H和3J；2A、2B、2D、2F、3I和3J；2A、2B、2D、2G、3H和3I；2A、2B、2D、2G、3H和3J；2A、2B、2D、2G、3I和3J；2A、2B、2D、3H、3I和3J；2A、2B、2E、2F、2G和3H；2A、2B、2E、2F、2G和3I；2A、2B、2E、2F、2G和3J；2A、2B、2E、2F、3H和3I；2A、2B、2E、2F、3H和3J；2A、2B、2E、2F、3I和3J；2A、2B、2E、2G、3H和3I；2A、2B、2E、2G、3H和3J；2A、2B、2E、2G、3I和3J；2A、2B、2E、3H、3I和3J；2A、2B、2F、2G、3H和3I；2A、2B、2F、2G、3H和3J；2A、2B、2F、2G、3I和3J；2A、2B、2F、3H、3I和3J；2A、2B、2G、3H、3I和3J；2A、2C、2D、2E、2F和2G；2A、2C、2D、2E、2F和3H；2A、2C、2D、2E、2F和3I；2A、2C、2D、2E、2F和3J；2A、2C、2D、2E、2G和3H；2A、2C、2D、2E、2G和3I；2A、2C、2D、2E、2G和3J；2A、2C、2D、2E、3H和3I；2A、2C、2D、2E、3H和3J；2A、2C、2D、2E、3I和3J；2A、2C、2D、2F、2G和3H；2A、2C、2D、2F、2G和3I；2A、2C、2D、2F、2G和3J；2A、2C、2D、2F、3H和3I；2A、2C、2D、2F、3H和3J；2A、2C、2D、2F、3I和3J；2A、2C、2D、2G、3H和3I；2A、2C、2D、2G、3H和3J；2A、2C、2D、2G、3I和3J；2A、2C、2D、3H、3I和3J；2A、2C、2E、2F、2G和3H；2A、2C、2E、2F、2G和3I；2A、2C、2E、2F、2G和3J；2A、2C、2E、2F、3H和3I；2A、2C、2E、2F、3H和3J；2A、2C、2E、2F、3I和3J；2A、2C、2E、2G、3H和3I；2A、2C、2E、2G、3H和3J；2A、2C、2E、2G、3I和3J；2A、2C、2E、3H、3I和3J；2A、2C、2F、2G、3H和3I；2A、2C、2F、2G、3H和3J；2A、2C、2F、2G、3I和3J；2A、2C、2F、3H、3I和3J；2A、2C、2G、3H、3I和3J；2A、2D、2E、2F、2G和3H；2A、2D、2E、2F、2G和3I；2A、2D、2E、2F、2G和3J；2A、2D、2E、2F、3H和3I；2A、2D、2E、2F、3H和3J；2A、2D、2E、2F、3I和3J；2A、2D、2E、2G、3H和3I；2A、2D、2E、2G、3H和3J；2A、2D、2E、2G、3I和3J；2A、2D、2E、3H、3I和3J；2A、2D、2F、2G、3H和3I；2A、2D、2F、2G、3H和3J；2A、2D、2F、2G、3I和3J；2A、2D、2F、3H、3I和3J；2A、2D、2G、3H、3I和3J；2A、2E、2F、2G、3H和3I；2A、2E、2F、2G、3H和3J；2A、2E、2F、2G、3I和3J；2A、2E、2F、3H、3I和3J；2A、2E、2G、3H、3I和3J；2A、2F、2G、3H、3I和3J；2B、2C、2D、2E、2F和2G；2B、2C、2D、2E、2F和3H；2B、2C、2D、2E、2F和3I；2B、2C、2D、2E、2F和3J；2B、2C、2D、2E、2G和3H；2B、2C、2D、2E、2G和3I；2B、2C、2D、2E、2G和3J；2B、2C、2D、2E、3H和3I；2B、2C、2D、2E、3H和3I；2B、2C、2D、2E、3I和3J；2B、2C、2D、2F、2G和3H；2B、2C、2D、2F、2G和3I；2B、2C、2D、2F、2G和3J；2B、2C、2D、2F、3H和3I；2B、2C、2D、2F、3H和3J；2B、2C、2D、2F、3I和3J；2B、2C、2D、2G、3H和3I；2B、2C、2D、2G、3H和3J；2B、2C、2D、2G、3I和3J；2B、2C、2D、3H.、3I和3J；2B、2C、2E、2F、2G和3H；2B、2C、2E、2F、2G和3I；2B、2C、2E、2F、2G和3J；2B、2C、2E、2F、3H和3I；2B、2C、2E、2F、3H和3J；2B、2C、2E、2F、3I和3J；2B、2C、2E、2G、3H和3I；2B、2C、2E、2G、3H和3J；2B、2C、2E、2G、3I和3J；2B、2C、2E、3H、3I和3J；2B、2C、2F、2G、3H和3I；2B、2C、2F、2G、3H和3J；2B、2C、2F、2G、3I和3J；2B、2C、2F、3H、3I和3J；2B、2C、2G、3H、3I和3J；2B、2D、2E、2F、2G和3H；2B、2D、2E、2F、2G和3I；2B、2D、2E、2F、2G和3J；2B、2D、2E、2F、3H和3I；2B、2D、2E、2F、3H和3J；2B、2D、2E、2F、3I和3J；2B、2D、2E、2G、3H和3I；2B、2D、2E、2G、3H和3J；2B、2D、2E、2G、3I和3J；2B、2D、2E、3H、3I和3J；2B、2D、2F、2G、3H和3I；2B、2D、2F、2G、3H和3J；2B、2D、2F、2G、3I和3J；2B、2D、2F、3H、3I和3J；2B、2E、2F、2G、3H和3I；2B、2E、2F、2G、3H和3J；2B、2E、2F、2G、3I和3J；2B、2E、2F、3H、3I和3J；2B、2E、2G、3H、3I和3J；2B、2F、2G、3H、3I和3J；2C、2D、2E、2F、3H和3I；2C、2D、2E、2F、3H和3J；2C、2D、2E、2F、3I和3J；2C、2D、2E、2G、3H和3I；2C、2D、2E、2G、3H和3J；2C、2D、2E、2G、3I和3J；2C、2D、2E、3H、3I和3J；2C、2D、2F、2G、3H和3I；2C、2D、2F、2G、3H和3J；2C、2D、2F、2G、3I和3J；2C、2D、2F、3H、3I和3J；2C、2D、2G、3H、3I和3J；2D、2E、2F、2G、3H和3I；2D、2E、2F、2G、3H和3J；2D、2E、2F、2G、3I和3J；2D、2E、2F、3H、3I和3J；2D、2E、2G、3H、3I和3J；或2E、2F、2G、3H、3I和3J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含6种或更多种外源核酸，其中所述6种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G；2A、2B、2C、2D、2E、2F和3H；2A、2B、2C、2D、2E、2F和3I；2A、2B、2C、2D、2E、2F和3J；2A、2B、2C、2D、2E、2G和3H；2A、2B、2C、2D、2E、2G和3I；2A、2B、2C、2D、2E、2G和3J；2A、2B、2C、2D、2E、3H和3I；2A、2B、2C、2D、2E、3H和3J；2A、2B、2C、2D、2E、3I和3J；2A、2B、2C、2D、2F、2G和3H；2A、2B、2C、2D、2F、2G和3I；2A、2B、2C、2D、2F、2G和3J；2A、2B、2C、2D、2F、3H和3I；2A、2B、2C、2D、2F、3H和3J；2A、2B、2C、2D、2F、3I和3J；2A、2B、2C、2D、2F、3H和3I；2A、2B、2C、2D、2F、3H和3J；2A、2B、2C、2D、2G、3H和3I；2A、2B、2C、2D、2G、3H和3J；2A、2B、2C、2D、2G、3I和3J；2A、2B、2C、2D、3H、3I和3J；2A、2B、2C、2E、2F、2G和3H；2A、2B、2C、2E、2F、2G和3I；2A、2B、2C、2E、2F、2G和3J；2A、2B、2C、2E、2F、3H和3I；2A、2B、2C、2E、2F、3H和3J；2A、2B、2C、2E、2F、3I和3J；2A、2B、2C、2E、2G、3H和3I；2A、2B、2C、2E、2G、3H和3J；2A、2B、2C、2E、2G、3I和3J；2A、2B、2C、2E、3H、3I和3J；2A、2B、2C、2F、2G、3H和3I；2A、2B、2C、2F、2G、3H和3J；2A、2B、2C、2F、2G、3I和3J；2A、2B、2C、2F、3H、3I和3J；2A、2B、2C、2G、3H、3I和3J；2A、2B、2D、2E、3H、3I和3J；2A、2B、2D、2F、2G、3H和3I；2A、2B、2D、2F、2G、3H和3J；2A、2B、2D、2F、2G、3I和3J；2A、2B、2D、2F、3H、3I和3J；2A、2B、2D、2G、3H、3I和3J；2A、2B、2E、2F、2G、3H和3I；2A、2B、2E、2F、2G、3H和3J；2A、2B、2E、2F、2G.、3I和3J；2A、2B、2E、2F、3H、3I和3J；2A、2B、2E、2G、3H、3I和3J；2A、2B、2F、2G、3H、3I和3J；2A、2C、2D、2E、2F、2G和3H；2A、2C、2D、2E、2F、2G和3I；2A、2C、2D、2E、2F、2G和3J；2A、2C、2D、2E、2F、3H和3I；2A、2C、2D、2E、2F、3H和3J；2A、2C、2D、2E、2F、3I和3J；2A、2C、2D、2E、2G、3H和3I；2A、2C、2D、2E、2G、3H和3J；2A、2C、2D、2E、2G、3I和3J；2A、2C、2D、2E、3H、3I和3J；2A、2C、2D、2F、2G、3H和3I；2A、2C、2D、2F、2G、3H和3J；2A、2C、2D、2F、2G、3I和3J；2A、2C、2D、2F、3H、3I和3J；2A、2C、2D、2G、3H、3I和3J；2A、2C、2E、2F、2G、3H和3I；2A、2C、2E、2F、2G、3H和3J；2A、2C、2E、2F、2G、3I和3J；2A、2C、2E、2F、3H、3I和3J；2A、2C、2E、2G、3H、3I和3J；2A、2C、2F、2G、3H、3I和3J；2A、2D、2E、2F、2G、3H和3I；2A、2D、2E、2F、2G、3H和3J；2A、2D、2E、2F、2G、3I和3J；2A、2D、2E、2F、3H、3I和3J；2A、2D、2E、2G、3H、3I和3J；2A、2D、2F、2G、3H、3I和3J；2A、2E、2F、2G、3H、3I和3J；2B、2C、2D、2E、2F、2G和3H；2B、2C、2D、2E、2F、2G和3I；2B、2C、2D、2E、2F、2G和3J；2B、2C、2D、2E、2F、3H和3I；2B、2C、2D、2E、2F、3H和3J；2B、2C、2D、2E、2F、3I和3J；2B、2C、2D、2E、2G、3H和3I；2B、2C、2D、2E、2G、3H和3J；2B、2C、2D、2E、2G、3I和3J；2B、2C、2D、2E、3H、3I和3J；2B、2C、2D、2F、2G、3H和3I；2B、2C、2D、2F、2G、3H和3J；2B、2C、2D、2F、2G、3I和3J；2B、2C、2D、2F、3H、3I和3J；2B、2C、2D、2G、3H、3I和3J；2B、2C、2E、2F、2G、3H和3I；2B、2C、2E、2F、2G、3H和3J；2B、2C、2E、2F、2G、3I和3J；2B、2C、2E、2F、3H、3I和3J；2B、2C、2E、2G、3H、3I和3J；2B、2C、2F、2G、3H、3I和3J；2B、2D、2E、2F、2G、3H和3I；2B、2D、2E、2F、2G、3H和3J；2B、2D、2E、2F、2G、3I和3J；2B、2D、2E、2F、3H、3I和3J；2B、2D、2E、2G、3H、3I和3J；2B、2D、2F、2G、3H、3I和3J；2B、2E、2F、2G、3H、3I和3J；2C、2D、2E、2F、3H、3I和3J；2C、2D、2E、2G、3H、3I和3J；2C、2D、2F、2G、3H、3I和3J；或2D、2E、2F、2G、3H、3I和3J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含7种或更多种外源核酸，其中所述7种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G和3H；2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G和3I；2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G和3J；2A、2B、2C、2D、2E、2F、3H和3I；2A、2B、2C、2D、2E、2F、3H和3J；2A、2B、2C、2D、2E、2F、3I和3J；2A、2B、2C、2D、2E、2G、3H和3I；2A、2B、2C、2D、2E、2G、3H和3J；2A、2B、2C、2D、2E、2G、3I和3J；2A、2B、2C、2D、2E、3H、3I和3J；2A、2B、2C、2D、2F、2G、3H和3I；2A、2B、2C、2D、2F、2G、3H和3J；2A、2B、2C、2D、2F、2G。3I和3J；2A、2B、2C、2D、2F、3H、3I和3J；2A、2B、2C、2D、2F、3H、3I和3J；2A、2B、2C、2D、2G、3H、3I和3J；2A、2B、2C、2E、2F、2G、3H和3I；2A、2B、2C、2E、2F、2G、3H和3J；2A、2B、2C、2E、2F、2G、3I和3J；2A、2B、2C、2E、2F、3H、3I和3J；2A、2B、2C、2E、2G、3H、3I和3J；2A、2B、2C、2F、2G、3H、3I和3J；2A、2B、2D、2F、2G、3H、3I和3J；2A、2B、2E、2F、2G、3H、3I和3J；2A、2C、2D、2E、2F、2G、3H和3I；2A、2C、2D、2E、2F、2G、3H和3J；2A、2C、2D、2E、2F、2G、3I和3J；2A、2C、2D、2E、2F、3H、3I和3J；2A、2C、2D、2E、2G、3H、3I和3J；2A、2C、2D、2F、2G、3H、3I和3J；2A、2C、2E、2F、2G、3H、3I和3J；2A、2D、2E、2F、2G、3H、3I和3J；2B、2C、2D、2E、2F、2G、3H和3I；2B、2C、2D、2E、2F、2G、3H和3J；2B、2C、2D、2E、2F、2G、3I和3J；2B、2C、2D、2E、2F、3H、3I和3J；2B、2C、2D、2E、2G、3H、3I和3J；2B、2C、2D、2F、2G、3H、3I和3J；2B、2C、2E、2F、2G、3H、3I和3J；或2B、2D、2E、2F、2G、3H、3I和3J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含8种或更多种外源核酸，其中所述8种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、3H和3I；2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、3H和3J；2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、3I和3J；2A、2B、2C、2D、2E、2F、3H、3I和3J；2A、2B、2C、2D、2E、2G、3H、3I和3J；2A、2B、2C、2D、2F、2G、3H、3I和3J；2A、2B、2C、2E、2F、2G、3H、3I和3J；2A、2C、2D、2E、2F、2G、3H、3I和3J；或2B、2C、2D、2E、2F、2G、3H、3I和3J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含9种或更多种外源核酸，其中所述9种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、3H、3I和3J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含10种或更多种外源核酸，其中所述10种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A，5B，5C，5D，5E，5F，5G，5H，5I，5J，或其中5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I或5J的任意组合，其中5A是丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；5B是乙酰辅酶A合成酶、连接酶或转移酶；5C是乙酸激酶；5D是磷酸转乙酰酶；5E是丙酮酸脱羧酶；5F是乙醛脱氢酶；5G是丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)；5H是丙酮酸脱氢酶，丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；5I乙醛脱氢酶(酰化)；和5J是苏氨酸醛缩酶。在某些实施方案中，5B是乙酰辅酶A合成酶。在另一个实施方案中，5B是乙酰辅酶A连接酶。在其它实施方案中，5B是乙酰辅酶A转移酶。在某些实施方案中，5H是丙酮酸脱氢酶。在其它实施方案中，5H是丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶。在其它实施方案中，5H是丙酮酸甲酸裂合酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径是在图5中描绘的乙酰辅酶A途径。在一个具体实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A和5B。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A、5C和5D。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5G和5D。在另一个具体实施方案、所述乙酰辅酶A途径包含：5E、5F、5C和5D。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J和5I。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J、5F和5B。在其它具体实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5H。
在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5B。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5C。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5E。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5F。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5H。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5I。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含一种或多种外源核酸，其中所述一种或多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：5A和5B；5A和5C；5A和5D；5A和5E；5A和5F；5A和5G；5A和5H；5A和5I；5A和5J；5B和5C；5B和5D；5B和5E；5B和5F；5B和5G；5B和5H；5B和5I；5B和5J；5C和5D；5C和5E；5C和5F；5C和5G；5C和5H；5C和5I；5C和5J；5D和5E；5D和5F；5D和5G；5D和5E；5D和5F；5D和5G；5D和5H；5D和5I；5D和5J；5E和5F；5E和5G；5E和5H；5E和5I；5E和5J；5F和5G；5F和5H；5F和5I；5F和5J；5G和5H；5G和5I；5G和5J；5H和5I；5H和5J；或5I和5J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含2种或更多种外源核酸，其中所述2种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：5A、5B和5C；5A、5B和5D；5A、5B和5E；5A、5B和5F；5A、5B和5G；5A、5B和5H；5A、5B和5I；5A、5B和5J；5A、5C和5D；5A、5C和5E；5A、5C和5F；5A、5C和5G；5A、5C和5H；5A、5C和5I；5A、5C和5J；5A、5D和5E；5A、5D和5F；5A、5D和5G；5A、5D和5H；5A、5D和5I；5A、5D和5J；5A、5E和5F；5A、5E和5G；5A、5E和5H；5A、5E和5I；5A、5E和5J；5A、5F和5G；5A、5F和5H；5A、5F和5I；5A、5F和5J；5B、5C和5D；5B、5C和5E；5B、5C和5F；5B、5C和5G；5B、5C和5H；5B、5C和5I；5B、5C和5J；5B、5D和5E；5B、5D和5F；5B、5D和5G；5B、5D和5H；5B、5D和5I；5B、5D和5J；5B、5E和5F；5B、5E和5G；5B、5E和5H；5B、5E和5I；5B、5E和5J；5B、5F和5G；5B、5F和5H；5B、5F和5I；5B、5F和5J；5C、5D和5E；5C、5D和5F；5C、5D和5G；5C、5D和5H；5C、5D和5I；5C、5D和5J；5C、5E和5F；5C、5E和5G；5C、5E和5H；5C、5E和5I；5C、5E和5J；5C、5F和5G；5C、5F和5H；5C、5F和5I；5C、5F和5J；5D、5E和5F；5D、5E和5G；5D、5E和5H；5D、5E和5I；5D、5E和5J；5D、5F和5G；5D、5F和5H；5D、5F和5I；5D、5F和5J；5D、5G和5H；5D、5G和5I；5D、5G和5J；5D、5E和5F；5D、5E和5G；5D、5E和5H；5D、5E和5I；5D、5E和5J；5D、5F和5G；5D、5F和5H；5D、5F和5I；5D、5F和5J；5D、5G和5H；5D、5G和5I；5D、5G和5J；5D、5H和5I；5D、5H和5J；5D、5I和5J；5E、5F和5G；5E、5F和5H；5E、5F和5I；5E、5F和5J；5F、5G和5H；5F、5G和5I；5F、5G和5J；5G、5H和5I；5G、5H和5J；或5H、5I和5J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含3种或更多种外源核酸，其中所述3种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：5A、5B、5C和5D；5A、5B、5C和5E；5A、5B、5C和5F；5A、5B、5C和5G；5A、5B、5C和5H；5A、5B、5C和5I；5A、5B、5C和5J；5A、5B、5D和5E；5A、5B、5D和5F；5A、5B、5D和5G；5A、5B、5D和5H；5A、5B、5D和5I；5A、5B、5D和5J；5A、5B、5E和5F；5A、5B、5E和5G；5A、5B、5E和5H；5A、5B、5E和5I；5A、5B、5E和5J；5A、5B、5F和5G；5A、5B、5F和5H；5A、5B、5F和5I；5A、5B、5F和5J；5A、5B、5G和5H；5A、5B、5G和5I；5A、5B、5G和5J；5A、5B、5H和5I；5A、5B、5H和5J；5A、5B、5I和5J；5A、5C、5D和5E；5A、5C、5D和5F；5A、5C、5D和5G；5A、5C、5D和5H；5A、5C、5D和5I；5A、5C、5D和5J；5A、5C、5E和5F；5A、5C、5E和5G；5A、5C、5E和5H；5A、5C、5E和5I；5A、5C、5E和5J；5A、5C、5F和5G；5A、5C、5F和5H；5A、5C、5F和5I；5A、5C、5F和5J；5A、5C、5G和5H；5A、5C、5G和5I；5A、5C、5G和5J；5A、5C、5H和5I；5A、5C、5H和5J；5A、5C、5I和5J；5A、5D、5E和5F；5A、5D、5E和5G；5A、5D、5E和5H；5A、5D、5E和5I；5A、5D、5E和5J；5A、5D、5F和5G；5A、5D、5F和5H；5A、5D、5F和5I；5A、5D、5F和5J；5A、5D、5G和5H；5A、5D、5G和5I；5A、5D、5G和5J；5A、5D、5H和5I；5A、5D、5H和5J；5A、5D、5I和5J；5A、5E、5F和5G；5A、5E、5F和5H；5A、5E、5F和5I；5A、5E、5F和5J；5A、5E、5G和5H；5A、5E、5G和5I；5A、5E、5G和5J；5A、5E、5H和5I；5A、5E、5H和5J；5A、5E、5I和5J；5A、5F、5G和5H；5A、5F、5G和5I；5A、5F、5G和5J；5A、5F、5H和5I；5A、5F、5H和5J；5A、5F、5I和5J；5A、5G、5H和5I；5A、5G、5H和5J；5A、5G、5I和5J；5A、5H、5I和5J；5B、5C、5D和5E；5B、5C、5D和5F；5B、5C、5D和5G；5B、5C、5D和5H；5B、5C、5D和5I；5B、5C、5D和5J；5B、5C、5E和5F；5B、5C、5E和5G；5B、5C、5E和5H；5B、5C、5E和5I；5B、5C、5E和5J；5B、5C、5F和5G；5B、5C、5F和5H；5B、5C、5F和5I；5B、5C、5F和5J；5B、5C、5G和5H；5B、5C、5G和5I；5B、5C、5G和5J；5B、5C、5H和5I；5B、5C、5H和5J；5B、5C、5I和5J；5B、5D、5E和5F；5B、5D、5E和5G；5B、5D、5E和5H；5B、5D、5E和5I；5B、5D、5E和5J；5B、5D、5F和5G；5B、5D、5F和5H；5B、5D、5F和5I；5B、5D、5F和5J；5B、5E、5F和5G；5B、5E、5F和5H；5B、5E、5F和5I；5B、5E、5F和5J；5B、5E、5G和5H；5B、5E、5G和5I；5B、5E、5G和5J；5B、5E、5H和5I；5B、5E、5H和5J；5B、5E、5I和5J；5B、5F、5G和5H；5B、5F、5G和5I；5B、5F、5G和5J；5B、5G、5H和5I；5B、5G、5H和5J；5B、5H、5I和5J；5C、5D、5E和5F；5C、5D、5E和5G；5C、5D、5E和5H；5C、5D、5E和5I；5C、5D、5E和5J；5C、5D、5F和5G；5C、5D、5F和5H；5C、5D、5F和5I；5C、5D、5F和5J；5C、5D、5G和5H；5C、5D、5G和5I；5C、5D、5G和5J；5C、5D、5H和5I；5C、5D、5H和5J；5C、5D、5I和5J；5D、5E、5F和5G；5D、5E、5F和5H；5D、5E、5F和5I；5D、5E、5F和5J；5D、5E、5G和5H；5D、5E。5G和5I；5D、5E、5G和5J；5D、5E、5H和5I；5D、5E、5H和5J；5D、5E、5I和5J；5E、5F、5G和5H；5E、5F、5G和5I；5E、5F、5G和5J；5E、5F、5H和5I；5E、5F、5H和5J；5E、5F、5I和5J；5F、5G、5H和5I；5F、5G、5H和5J；5F、5G、5I和5J；或5G、5H、5I和5J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含4种或更多种外源核酸，其中所述4种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：5A、5B、5C、5D和5E；5A、5B、5C、5D和5F；5A、5B、5C、5D和5G；5A、5B、5C、5D和5H；5A、5B、5C、5D和5I；5A、5B、5C、5D和5J；5A、5B、5C、5E和5F；5A、5B、5C、5E和5G；5A、5B、5C、5E和5H；5A、5B、5C、5E和5I；5A、5B、5C、5E和5J；5A、5B、5C、5F和5G；5A、5B、5C、5F和5H；5A、5B、5C、5F和5I；5A、5B、5C、5F和5J；5A、5B、5C、5G和5H；5A、5B、5C、5G和5I；5A、5B、5C、5G和5J；5A、5B、5C、5H和5I；5A、5B、5C、5H和5J；5A、5B、5C、5I和5J；5A、5B、5D、5E和5H；5A、5B、5D、5E和5I；5A、5B、5D、5E和5J；5A、5B、5D、5F和5G；5A、5B、5D、5F和5H；5A、5B、5D、5F和5I；5A、5B、5D、5F和5J；5A、5B、5D、5G和5H；5A、5B、5D、5G和5I；5A、5B、5D、5G和5J；5A、5B、5D、5H和5I；5A、5B、5D、5H和5J；5A、5B、5D、5I和5J；5A、5B、5E、5F和5G；5A、5B、5E、5F和5H；5A、5B、5E、5F和5I；5A、5B、5E、5F和5J；5A、5B、5E、5G和5H；5A、5B、5E、5G和5I；5A、5B、5E、5G和5J；5A、5B、5E、5H和5I；5A、5B、5E、5H和5J；5A、5B、5E、5I和5J；5A、5B、5F、5G和5H；5A、5B、5F、5G和5I；5A、5B、5F、5G和5J；5A、5B、5F、5H和5I；5A、5B、5F、5H和5J；5A、5B、5F、5I和5J；5A、5B、5G、5H和5I；5A、5B、5G、5H和5J；5A、5B、5G、5I和5J；5A、5B、5H、5I和5J；5A、5C、5D、5E和5F；5A、5C、5D、5E和5G；5A、5C、5D、5E和5H；5A、5C、5D、5E和5I；5A、5C、5D、5E和5J；5A、5C、5D、5F和5G；5A、5C、5D、5F和5H；5A、5C、5D、5F和5I；5A、5C、5D、5F和5J；5A、5C、5D、5G和5H；5A、5C、5D、5G和5I；5A、5C、5D、5G和5J；5A、5C、5D、5H和5I；5A、5C、5D、5H和5J；5A、5C、5D、5I和5J；5A、5C、5E、5F和5G；5A、5C、5E、5F和5H；5A、5C、5E、5F和5I；5A、5C、5E、5F和5J；5A、5C、5E、5G和5H；5A、5C、5E、5G和5I；5A、5C、5E、5G和5J；5A、5C、5E、5H和5I；5A、5C、5E、5H和5J；5A、5C、5E、5I和5J；5A、5C、5F、5G和5H；5A、5C、5F、5G和5I；5A、5C、5F、5G和5J；5A、5C、5F、5H和5I；5A、5C、5F、5H和5J；5A、5C、5F、5I和5J；5A、5C、5G、5H和5I；5A、5C、5G、5H和5J；5A、5C、5G、5I和5J；5A、5C、5H、5I和5J；5A、5D、5E、5F和5G；5A、5D、5E、5F和5H；5A、5D、5E、5F和5I；5A、5D、5E、5F和5J；5A、5D、5E、5G和5H；5A、5D、5E、5G和5I；5A、5D、5E、5G和5J；5A、5D、5E、5H和5I；5A、5D、5E、5H和5J；5A、5D、5E、5I和5J；5A、5D、5F、5G和5H；5A、5D、5F、5G和5I；5A、5D、5F、5G和5J；5A、5D、5F、5H和5I；5A、5D、5F、5H和5J；5A、5D、5F、5I和5J；5A、5D、5G、5H和5I；5A、5D、5G、5H和5J；5A、5D、5G、5I和5J；5A、5D、5H、5I和5J；5A、5E、5F、5G和5H；5A、5E、5F、5G和5I；5A、5E、5F、5G和5J；5A、5E、5F、5H和5I；5A、5E、5F、5H和5J；5A、5E、5F、5I和5J；5A、5E、5G、5H和5I；5A、5E、5G、5H和5J；5A、5E、5G、5I和5J；5A、5E、5H、5I和5J；5A、5F、5G、5H和5I；5A、5F、5G、5H和5J；5A、5F、5G、5I和5J；5A、5F、5H、5I和5J；5A、5G、5H、5I和5J；5B、5C、5D、5E和5F；5B、5C、5D、5E和5G；5B、5C、5D、5E和5H；5B、5C、5D、5E和5I；5B、5C、5D、5E和5J；5B、5C、5D、5F和5G；5B、5C、5D、5F和5H；5B、5C、5D、5F和5I；5B、5C、5D、5F和5J；5B、5C、5D、5G和5H；5B、5C、5D、5G和5I；5B、5C、5D、5G和5J；5B、5C、5D、5H和5I；5B、5C、5D、5H和5J；5B、5C、5D、5I和5J；5B、5C、5E、5F和5G；5B、5C、5E、5F和5H；5B、5C、5E、5F和5I；5B、5C、5E、5F和5J；5B、5C、5E、5G和5H；5B、5C、5E、5G和5I；5B、5C、5E、5G和5J；5B、5C、5E、5H和5I；5B、5C、5E、5H和5J；5B、5C、5E、5I和5J；5B、5C、5F、5G和5H；5B、5C、5F、5G和5I；5B、5C、5F、5G和5J；5B、5C、5F、5H和5I；5B、5C、5F、5H和5J；5B、5C、5F、5I和5J；5B、5C、5G、5H和5I；5B、5C、5G、5H和5J；5B、5C、5G、5I和5J；5B、5C、5H、5I和5J；5B、5D、5E、5F和5G；5B、5D、5E、5F和5H；5B、5D、5E、5F和5I；5B、5D、5E、5F和5J；5B、5D、5E、5G和5H；5B、5D、5E、5G和5I；5B、5D、5E、5G和5J；5B、5D、5E、5H和5I；5B、5D、5E、5H和5J；5B、5D、5E、5I和5J；5B、5D、5F、5G和5H；5B、5D、5F、5G和5I；5B、5D、5F、5G和5J；5B、5D、5F、5H和5I；5B、5D、5F、5H和5J；5B、5D、5F、5I和5J；5B、5E、5F、5G和5H；5B、5E、5F、5G和5I；5B、5E、5F、5G和5J；5B、5E、5F、5H和5I；5B、5E、5F、5H和5J；5B、5E、5F、5I和5J；5B、5E、5G、5H和5I；5B、5E、5G、5H和5J；5B、5E、5G、5I和5J；5B、5E、5H、5I和5J；5B、5F、5G、5H和5I；5B、5F、5G、5H和5J；5B、5F、5G、5I和5J；5B、5G、5H、5I和5J；5C、5D、5E、5F和5H；5C、5D、5E、5F和5I；5C、5D、5E、5F和5J；5C、5D、5E、5G和5H；5C、5D、5E、5G和5I；5C、5D、5E、5G和5J；5C、5D、5E、5H和5I；5C、5D、5E、5H和5J；5C、5D、5E、5I和5J；5C、5D、5F、5G和5H；5C、5D、5F、5G和5I；5C、5D、5F、5G和5J；5C、5D、5F、5H和5I；5C、5D、5F、5H和5J；5C、5D、5F、5I和5J；5C、5D、5G、5H和5I；5C、5D、5G、5H和5J；5C、5D、5G、5I和5J；5C、5D、5H、5I和5J；5D、5E、5F、5G和5H；5D、5E、5F、5G和5I；5D、5E、5F、5G和5J；5D、5E、5F、5H和5I；5D、5E、5F、5H和5J；5D、5E、5F、5I和5J；5D、5E、5G、5H和5I；5D、5E、5G、5H和5J；5D、5E。5G、5I和5J；5D、5E、5H、5I和5J；5E、5F、5G、5H和5I；5E、5F、5G、5H和5J；5E、5F、5G、5I和5J；5E、5F、5H、5I和5J；或5F、5G、5H、5I和5J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含5种或更多种外源核酸，其中所述5种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：5A、5B、5C、5D、5E和5F；5A、5B、5C、5D、5E和5G；5A、5B、5C、5D、5E和5H；5A、5B、5C、5D、5E和5I；5A、5B、5C、5D、5E和5J；5A、5B、5C、5D、5F和5G；5A、5B、5C、5D、5F和5H；5A、5B、5C、5D、5F和5I；5A、5B、5C、5D、5F和5H；5A、5B、5C、5D、5G和5H；5A、5B、5C、5D、5G和5I；5A、5B、5C、5D、5G和5J；5A、5B、5C、5D、5H和5I；5A、5B、5C、5D、5H和5J；5A、5B、5C、5D、5I和5J；5A、5B、5C、5E、5F和5G；5A、5B、5C、5E、5F和5H；5A、5B、5C、5E、5F和5I；5A、5B、5C、5E、5F和5J；5A、5B、5C、5E、5G和5H；5A、5B、5C、5E、5G和5I；5A、5B、5C、5E、5G和5J；5A、5B、5C、5E、5H和5I；5A、5B、5C、5E、5H和5J；5A、5B、5C、5E、5I和5J；5A、5B、5C、5F、5G和5H；5A、5B、5C、5F、5G和5I；5A、5B、5C、5F、5G和5J；5A、5B、5C、5F、5H和5I；5A、5B、5C、5F、5H和5J；5A、5B、5C、5F、5I和5J；5A、5B、5C、5G、5H和5I；5A、5B、5C、5G、5H和5J；5A、5B、5C、5G、5I和5J；5A、5B、5C、5H、5I和5J；5A、5B、5D、5E、5H和5I；5A、5B、5D、5E、5H和5J；5A、5B、5D、5E、5I和5J；5A、5B、5D、5F、5G和5H；5A、5B、5D、5F、5G和5I；5A、5B、5D、5F、5G和5J；5A、5B、5D、5F、5H和5I；5A、5B、5D、5F、5H和5J；5A、5B、5D、5F、5I和5J；5A、5B、5D、5G、5H和5I；5A、5B、5D、5G、5H和5J；5A、5B、5D、5G、5I和5J；5A、5B、5D、5H、5I和5J；5A、5B、5E、5F、5G和5H；5A、5B、5E、5F、5G和5I；5A、5B、5E、5F、5G和5J；5A、5B、5E、5F、5H和5I；5A、5B、5E、5F、5H和5J；5A、5B、5E、5F、5I和5J；5A、5B、5E、5G、5H和5I；5A、5B、5E、5G、5H和5J；5A、5B、5E、5G、5I和5J；5A、5B、5E、5H、5I和5J；5A、5B、5F、5G、5H和5I；5A、5B、5F、5G、5H和5J；5A、5B、5F、5G、5I和5J；5A、5B、5F、5H、5I和5J；5A、5B、5G、5H、5I和5J；5A、5C、5D、5E、5F和5G；5A、5C、5D、5E、5F和5H；5A、5C、5D、5E、5F和5I；5A、5C、5D、5E、5F和5J；5A、5C、5D、5E、5G和5H；5A、5C、5D、5E、5G和5I；5A、5C、5D、5E、5G和5J；5A、5C、5D、5E、5H和5I；5A、5C、5D、5E、5H和5J；5A、5C、5D、5E、5I和5J；5A、5C、5D、5F、5G和5H；5A、5C、5D、5F、5G和5I；5A、5C、5D、5F、5G和5J；5A、5C、5D、5F、5H和5I；5A、5C、5D、5F、5H和5J；5A、5C、5D、5F、5I和5J；5A、5C、5D、5G、5H和5I；5A、5C、5D、5G、5H和5J；5A、5C、5D、5G、5I和5J；5A、5C、5D、5H、5I和5J；5A、5C、5E、5F、5G和5H；5A、5C、5E、5F、5G和5I；5A、5C、5E、5F、5G和5J；5A、5C、5E、5F、5H和5I；5A、5C、5E、5F、5H和5J；5A、5C、5E、5F、5I和5J；5A、5C、5E、5G、5H和5I；5A、5C、5E、5G、5H和5J；5A、5C、5E、5G、5I和5J；5A、5C、5E、5H、5I和5J；5A、5C、5F、5G、5H和5I；5A、5C、5F、5G、5H和5J；5A、5C、5F、5G、5I和5J；5A、5C、5F、5H、5I和5J；5A、5C、5G、5H、5I和5J；5A、5D、5E、5F、5G和5H；5A、5D、5E、5F、5G和5I；5A、5D、5E、5F、5G和5J；5A、5D、5E、5F、5H和5I；5A、5D、5E、5F、5H和5J；5A、5D、5E、5F、5I和5J；5A、5D、5E、5G、5H和5I；5A、5D、5E、5G、5H和5J；5A、5D、5E、5G、5I和5J；5A、5D、5E、5H、5I和5J；5A、5D、5F、5G、5H和5I；5A、5D、5F、5G、5H和5J；5A、5D、5F、5G、5I和5J；5A、5D、5F、5H、5I和5J；5A、5D、5G、5H、5I和5J；5A、5E、5F、5G、5H和5I；5A、5E、5F、5G、5H和5J；5A、5E、5F、5G、5I和5J；5A、5E、5F、5H、5I和5J；5A、5E、5G、5H、5I和5J；5A、5F、5G、5H、5I和5J；5B、5C、5D、5E、5F和5G；5B、5C、5D、5E、5F和5H；5B、5C、5D、5E、5F和5I；5B、5C、5D、5E、5F和5J；5B、5C、5D、5E、5G和5H；5B、5C、5D、5E、5G和5I；5B、5C、5D、5E、5G和5J；5B、5C、5D、5E、5H和5I；5B、5C、5D、5E、5H和5I；5B、5C、5D、5E、5I和5J；5B、5C、5D、5F、5G和5H；5B、5C、5D、5F、5G和5I；5B、5C、5D、5F、5G和5J；5B、5C、5D、5F、5H和5I；5B、5C、5D、5F、5H和5J；5B、5C、5D、5F、5I和5J；5B、5C、5D、5G、5H和5I；5B、5C、5D、5G、5H和5J；5B、5C、5D、5G、5I和5J；5B、5C、5D、5H.、5I和5J；5B、5C、5E、5F、5G和5H；5B、5C、5E、5F、5G和5I；5B、5C、5E、5F、5G和5J；5B、5C、5E、5F、5H和5I；5B、5C、5E、5F、5H和5J；5B、5C、5E、5F、5I和5J；5B、5C、5E、5G、5H和5I；5B、5C、5E、5G、5H和5J；5B、5C、5E、5G、5I和5J；5B、5C、5E、5H、5I和5J；5B、5C、5F、5G、5H和5I；5B、5C、5F、5G、5H和5J；5B、5C、5F、5G、5I和5J；5B、5C、5F、5H、5I和5J；5B、5C、5G、5H、5I和5J；5B、5D、5E、5F、5G和5H；5B、5D、5E、5F、5G和5I；5B、5D、5E、5F、5G和5J；5B、5D、5E、5F、5H和5I；5B、5D、5E、5F、5H和5J；5B、5D、5E、5F、5I和5J；5B、5D、5E、5G、5H和5I；5B、5D、5E、5G、5H和5J；5B、5D、5E、5G、5I和5J；5B、5D、5E、5H、5I和5J；5B、5D、5F、5G、5H和5I；5B、5D、5F、5G、5H和5J；5B、5D、5F、5G、5I和5J；5B、5D、5F、5H、5I和5J；5B、5E、5F、5G、5H和5I；5B、5E、5F、5G、5H和5J；5B、5E、5F、5G、5I和5J；5B、5E、5F、5H、5I和5J；5B、5E、5G、5H、5I和5J；5B、5F、5G、5H、5I和5J；5C、5D、5E、5F、5H和5I；5C、5D、5E、5F、5H和5J；5C、5D、5E、5F、5I和5J；5C、5D、5E、5G、5H和5I；5C、5D、5E、5G、5H和5J；5C、5D、5E、5G、5I和5J；5C、5D、5E、5H、5I和5J；5C、5D、5F、5G、5H和5I；5C、5D、5F、5G、5H和5J；5C、5D、5F、5G、5I和5J；5C、5D、5F、5H、5I和5J；5C、5D、5G、5H、5I和5J；5D、5E、5F、5G、5H和5I；5D、5E、5F、5G、5H和5J；5D、5E、5F、5G、5I和5J；5D、5E、5F、5H、5I和5J；5D、5E、5G、5H、5I和5J；或5E、5F、5G、5H、5I和5J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含6种或更多种外源核酸，其中所述6种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：5A、5B、5C、5D、5E、5F和5G；5A、5B、5C、5D、5E、5F和5H；5A、5B、5C、5D、5E、5F和5I；5A、5B、5C、5D、5E、5F和5J；5A、5B、5C、5D、5E、5G和5H；5A、5B、5C、5D、5E、5G和5I；5A、5B、5C、5D、5E、5G和5J；5A、5B、5C、5D、5E、5H和5I；5A、5B、5C、5D、5E、5H和5J；5A、5B、5C、5D、5E、5I和5J；5A、5B、5C、5D、5F、5G和5H；5A、5B、5C、5D、5F、5G和5I；5A、5B、5C、5D、5F、5G和5J；5A、5B、5C、5D、5F、5H和5I；5A、5B、5C、5D、5F、5H和5J；5A、5B、5C、5D、5F、5I和5J；5A、5B、5C、5D、5F、5H和5I；5A、5B、5C、5D、5F、5H和5J；5A、5B、5C、5D、5G、5H和5I；5A、5B、5C、5D、5G、5H和5J；5A、5B、5C、5D、5G、5I和5J；5A、5B、5C、5D、5H、5I和5J；5A、5B、5C、5E、5F、5G和5H；5A、5B、5C、5E、5F、5G和5I；5A、5B、5C、5E、5F、5G和5J；5A、5B、5C、5E、5F、5H和5I；5A、5B、5C、5E、5F、5H和5J；5A、5B、5C、5E、5F、5I和5J；5A、5B、5C、5E、5G、5H和5I；5A、5B、5C、5E、5G、5H和5J；5A、5B、5C、5E、5G、5I和5J；5A、5B、5C、5E、5H、5I和5J；5A、5B、5C、5F、5G、5H和5I；5A、5B、5C、5F、5G、5H和5J；5A、5B、5C、5F、5G、5I和5J；5A、5B、5C、5F、5H、5I和5J；5A、5B、5C、5G、5H、5I和5J；5A、5B、5D、5E、5H、5I和5J；5A、5B、5D、5F、5G、5H和5I；5A、5B、5D、5F、5G、5H和5J；5A、5B、5D、5F、5G、5I和5J；5A、5B、5D、5F、5H、5I和5J；5A、5B、5D、5G、5H、5I和5J；5A、5B、5E、5F、5G、5H和5I；5A、5B、5E、5F、5G、5H和5J；5A、5B、5E、5F、5G.、5I和5J；5A、5B、5E、5F、5H、5I和5J；5A、5B、5E、5G、5H、5I和5J；5A、5B、5F、5G、5H、5I和5J；5A、5C、5D、5E、5F、5G和5H；5A、5C、5D、5E、5F、5G和5I；5A、5C、5D、5E、5F、5G和5J；5A、5C、5D、5E、5F、5H和5I；5A、5C、5D、5E、5F、5H和5J；5A、5C、5D、5E、5F、5I和5J；5A、5C、5D、5E、5G、5H和5I；5A、5C、5D、5E、5G、5H和5J；5A、5C、5D、5E、5G、5I和5J；5A、5C、5D、5E、5H、5I和5J；5A、5C、5D、5F、5G、5H和5I；5A、5C、5D、5F、5G、5H和5J；5A、5C、5D、5F、5G、5I和5J；5A、5C、5D、5F、5H、5I和5J；5A、5C、5D、5G、5H、5I和5J；5A、5C、5E、5F、5G、5H和5I；5A、5C、5E、5F、5G、5H和5J；5A、5C、5E、5F、5G、5I和5J；5A、5C、5E、5F、5H、5I和5J；5A、5C、5E、5G、5H、5I和5J；5A、5C、5F、5G、5H、5I和5J；5A、5D、5E、5F、5G、5H和5I；5A、5D、5E、5F、5G、5H和5J；5A、5D、5E、5F、5G、5I和5J；5A、5D、5E、5F、5H、5I和5J；5A、5D、5E、5G、5H、5I和5J；5A、5D、5F、5G、5H、5I和5J；5A、5E、5F、5G、5H、5I和5J；5B、5C、5D、5E、5F、5G和5H；5B、5C、5D、5E、5F、5G和5I；5B、5C、5D、5E、5F、5G和5J；5B、5C、5D、5E、5F、5H和5I；5B、5C、5D、5E、5F、5H和5J；5B、5C、5D、5E、5F、5I和5J；5B、5C、5D、5E、5G、5H和5I；5B、5C、5D、5E、5G、5H和5J；5B、5C、5D、5E、5G、5I和5J；5B、5C、5D、5E、5H、5I和5J；5B、5C、5D、5F、5G、5H和5I；5B、5C、5D、5F、5G、5H和5J；5B、5C、5D、5F、5G、5I和5J；5B、5C、5D、5F、5H、5I和5J；5B、5C、5D、5G、5H、5I和5J；5B、5C、5E、5F、5G、5H和5I；5B、5C、5E、5F、5G、5H和5J；5B、5C、5E、5F、5G、5I和5J；5B、5C、5E、5F、5H、5I和5J；5B、5C、5E、5G、5H、5I和5J；5B、5C、5F、5G、5H、5I和5J；5B、5D、5E、5F、5G、5H和5I；5B、5D、5E、5F、5G、5H和5J；5B、5D、5E、5F、5G、5I和5J；5B、5D、5E、5F、5H、5I和5J；5B、5D、5E、5G、5H、5I和5J；5B、5D、5F、5G、5H、5I和5J；5B、5E、5F、5G、5H、5I和5J；5C、5D、5E、5F、5H、5I和5J；5C、5D、5E、5G、5H、5I和5J；5C、5D、5F、5G、5H、5I和5J；或5D、5E、5F、5G、5H、5I和5J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含7种或更多种外源核酸，其中所述7种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G和5H；5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G和5I；5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G和5J；5A、5B、5C、5D、5E、5F、5H和5I；5A、5B、5C、5D、5E、5F、5H和5J；5A、5B、5C、5D、5E、5F、5I和5J；5A、5B、5C、5D、5E、5G、5H和5I；5A、5B、5C、5D、5E、5G、5H和5J；5A、5B、5C、5D、5E、5G、5I和5J；5A、5B、5C、5D、5E、5H、5I和5J；5A、5B、5C、5D、5F、5G、5H和5I；5A、5B、5C、5D、5F、5G、5H和5J；5A、5B、5C、5D、5F、5G。5I和5J；5A、5B、5C、5D、5F、5H、5I和5J；5A、5B、5C、5D、5F、5H、5I和5J；5A、5B、5C、5D、5G、5H、5I和5J；5A、5B、5C、5E、5F、5G、5H和5I；5A、5B、5C、5E、5F、5G、5H和5J；5A、5B、5C、5E、5F、5G、5I和5J；5A、5B、5C、5E、5F、5H、5I和5J；5A、5B、5C、5E、5G、5H、5I和5J；5A、5B、5C、5F、5G、5H、5I和5J；5A、5B、5D、5F、5G、5H、5I和5J；5A、5B、5E、5F、5G、5H、5I和5J；5A、5C、5D、5E、5F、5G、5H和5I；5A、5C、5D、5E、5F、5G、5H和5J；5A、5C、5D、5E、5F、5G、5I和5J；5A、5C、5D、5E、5F、5H、5I和5J；5A、5C、5D、5E、5G、5H、5I和5J；5A、5C、5D、5F、5G、5H、5I和5J；5A、5C、5E、5F、5G、5H、5I和5J；5A、5D、5E、5F、5G、5H、5I和5J；5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H和5I；5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H和5J；5B、5C、5D、5E、5F、5G、5I和5J；5B、5C、5D、5E、5F、5H、5I和5J；5B、5C、5D、5E、5G、5H、5I和5J；5B、5C、5D、5F、5G、5H、5I和5J；5B、5C、5E、5F、5G、5H、5I和5J；或5B、5D、5E、5F、5G、5H、5I和5J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含8种或更多种外源核酸，其中所述8种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H和5I；5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H和5J；5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5I和5J；5A、5B、5C、5D、5E、5F、5H、5I和5J；5A、5B、5C、5D、5E、5G、5H、5I和5J；5A、5B、5C、5D、5F、5G、5H、5I和5J；5A、5B、5C、5E、5F、5G、5H、5I和5J；5A、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I和5J；或5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I和5J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含9种或更多种外源核酸，其中所述9种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I和5J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含10种或更多种外源核酸，其中所述10种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6A，6B，6C，6D，或6E，或其中6A、6B、6C、6D和6E的任意组合，其中6A是线粒体乙酰肉碱转移酶；6B是过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶；6C是细胞溶质乙酰肉碱转移酶；6D是线粒体乙酰肉碱移位酶；和6E是过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径是在图6中描绘的乙酰辅酶A途径。在一个具体实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：6A、6D和6C。在另一个具体实施方案、所述乙酰辅酶A途径包含：6B、6E和6C。
在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6A。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6B。在某些实施方案中，包含6C。在其它实施方案中，包含6D。在其它实施方案中，包含6E。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含一种或多种外源核酸，其中所述一种或多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：6A和6B；6A和6C；6A和6D；6A和6E；6B和6C；6B和6D；6B和6E；6C和6D；6C和6E；或6D和6E。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含2种或更多种外源核酸，其中所述2种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：6A、6B和6C；6A、6B和6D；6A、6B和6E；6A、6C和6D；6A、6C和6E；6A、6D和6E；6B、6C和6D；6B、6C和6E；或6C、6D和6E。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含3种或更多种外源核酸，其中所述3种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：6A、6B、6C和6D；6A、6B、6C和6E；或6B、6C、6D和6E。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含4种或更多种外源核酸，其中所述4种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6A、6B、6C、6D和6E。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含5种或更多种外源核酸，其中所述5种或更多种外源核酸中的每一种编码不同的乙酰辅酶A途径酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A，10B，10C，10D，10F，10G，10H。10J，10K，10L，10M，10N，或其中10A、10B、10C、10D、10F、10G、10H.10J、10K、10L、10M、10N的任意组合，其中10A是PEP羧化酶或PEP羧基激酶；10B是草酰乙酸脱羧酶；10C是丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)；10D是丙二酰辅酶A脱羧酶；10F是草酰乙酸脱氢酶或草酰乙酸氧化还原酶；10G是丙二酰辅酶A还原酶；10H是丙酮酸羧化酶；10J是丙二酸半醛脱氢酶；10K是丙二酰辅酶A合成酶或转移酶；10L是苹果酸酶；10M是苹果酸脱氢酶或氧化还原酶；和10N是丙酮酸激酶或PEP磷酸酶。在一个实施方案中，10A是PEP羧化酶。在另一个实施方案中，10A是PEP羧基激酶。在一个实施方案中，10F是草酰乙酸脱氢酶。在其它实施方案中，10F是草酰乙酸氧化还原酶。在一个实施方案中，10K是丙二酰辅酶A合成酶。在另一个实施方案中，10K是丙二酰辅酶A转移酶。在一个实施方案中，10M是苹果酸脱氢酶。在另一个实施方案中，10M是苹果酸氧化还原酶。在其它实施方案中，10N是丙酮酸激酶。在某些实施方案中，10N是PEP磷酸酶。
在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10B。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10C。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10F。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10H。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10K。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10L。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10M。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含7A，7E，或7F，或其中7A、7E和7F的任意组合，其中7A是乙酰乙酰辅酶A硫解酶(图10，步骤I)，7E是乙酰辅酶A羧化酶(图10，步骤D)；7F是乙酰乙酰辅酶A合酶(图10，步骤E)。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径是在图10中描绘的乙酰辅酶A途径。在一个具体实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B和10C。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B和10C。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B和10C。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10G和10D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10G和10D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10G和10D。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10J、10K和10D。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10J、10K和10D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10F和10D。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10F和10D。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10F和10D。
尽管在本文中通常描述为含有乙酰辅酶A途径的真核生物，应当理解，本文还提供了包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸的非天然存在的真核生物，所述乙酰辅酶A途径酶以足以生产乙酰辅酶A途径的中间体的量表达。例如，如在本文中公开的，在图2、3、5、6、7、8和10中举例说明了乙酰辅酶A途径。因此，除了含有乙酰辅酶A途径(其能够在所述生物中生产细胞溶质乙酰辅酶A，将乙酰辅酶A从所述生物的线粒体或过氧化物酶体运输至所述生物的细胞溶质，和/或增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A)的真核生物以外，本文还提供了包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸的非天然存在的真核生物，其中所述真核生物生产乙酰辅酶A途径中间体，例如，柠檬酸、柠苹酸、草酰乙酸、乙酸、苹果酸、乙醛、乙酰磷酸或乙酰肉碱。
应当理解，本文中公开的任意途径(如在实施例中所述和在附图中举例说明的，包括图2、3、4、5、6、7、8、9或10的途径)可以用于产生非天然存在的真核生物，其根据需要生产任意途径中间体或产物。如在本文中公开的，这样的生产中间体的真核生物可以与表达下游途径酶的另一种真核生物联合使用，以生产期望的产物。但是，应当理解，非天然存在的生产乙酰辅酶A途径中间体的真核生物可以用于生产所述中间体作为期望的产物。
任何非天然存在的包含乙酰辅酶A途径且经工程改造成包含乙酰辅酶A途径酶(诸如本文提供的那些)的真核生物，可以经工程改造成进一步包含一种或多种1,3-BDO途径酶。在某些实施方案中，所述非天然存在的具有1,3-BDO途径的真核生物包括一组1,3-BDO途径酶。一组1,3-BDO途径酶代表可以将乙酰辅酶A转化成1,3-BDO的酶的集合，例如，如在图4或图7中所示。
在某些实施方案中，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)乙酰辅酶A途径，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：(i)将乙酰辅酶A从所述生物的线粒体和/或过氧化物酶体运输至所述生物的细胞溶质，(ii)在所述生物的细胞质中生产乙酰辅酶A，和/或(iii)增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A；和(2)1,3-BDO途径，其包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达。在一个实施方案中，所述至少一种乙酰辅酶A途径酶以足以将乙酰辅酶A从所述生物的线粒体和/或过氧化物酶体运输至生物的细胞溶质的量表达。在一个实施方案中，所述至少一种乙酰辅酶A途径酶以足以在所述生物中产生细胞溶质乙酰辅酶A的量表达。在另一个实施方案中，所述至少一种乙酰辅酶A途径酶以足以增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A的量表达。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含在上面或在本文别处描述的乙酰辅酶A途径酶的不同组合中的任一种。在某些实施方案中，缺失了1,3-BDO副产物途径。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A，2B，2C，2D，2E，2F，2G，2K，2L，3H，3I，或3J，或其中2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、3H、3I和3J的任意组合；其中2A是柠檬酸合酶；2B是柠檬酸转运蛋白；2C是柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白或柠檬酸/苹果酸转运蛋白；2D是ATP柠檬酸裂合酶；2E是柠檬酸裂合酶；2F是乙酰辅酶A合成酶；2G是草酰乙酸转运蛋白；2K是乙酸激酶；2L是磷酸转乙酰酶；3H是细胞溶质苹果酸脱氢酶；3I是苹果酸转运蛋白；和3J是线粒体苹果酸脱氢酶；且(2)1,3-BDO途径包含4A，4B，4C，4D，4E，4F，4G，4H，4I，4J，4K，4L，4M，4N，或4O，或其中4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I、4J、4K、4L、4M、4N和4O的任意组合；其中4A是乙酰乙酰辅酶A硫解酶；其中4B是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)；其中4C是3-氧代丁醛还原酶(醛还原)；其中4D是4-羟基、2-丁酮还原酶；其中4E是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)；其中4F是3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；其中4G是3-羟基丁醛还原酶；其中4H是乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)；其中4I是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)；其中4J是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)；其中4K是乙酰乙酰辅酶A转移酶、乙酰乙酰辅酶A水解酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶或磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶；其中4L是乙酰乙酸还原酶；其中4M是3-羟基丁酰辅酶A转移酶、水解酶或合成酶；其中4N是3-羟基丁酸还原酶；且其中4O是3-羟基丁酸脱氢酶。在某些实施方案中，2C是柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白。在其它实施方案中，2C是柠檬酸/苹果酸转运蛋白。在某些实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A转移酶。在其它实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A水解酶。在某些实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A合成酶。在其它实施方案中，4K是磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶。在某些实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A转移酶。在某些实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A水解酶。在其它实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A合成酶。
在一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4B。在一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4C。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4D。在一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4E。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4F。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4G。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4H。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4I。在一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4J。在一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4K。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4L。在一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4M。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4N。在一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4O。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径是在图2中描绘的乙酰辅酶A途径，且所述1,3-BDO途径是在图4中描绘的1,3-BDO途径。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径是在图3中描绘的乙酰辅酶A途径，且所述1,3-BDO途径是在图4中描绘的1,3-BDO途径。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径是在图7中描绘的乙酰辅酶A途径，且所述1,3-BDO途径是在图4或图7中描绘的1,3-BDO途径。根据图4，将乙酰辅酶A转化成1,3-BDO的1,3-BDO途径酶的示例性集合包括：4A、4E、4F和4G；4A、4B和4D；4A、4E、4C和4D；4A、4H和4J；4A、4H、4I和4G；4A、4H、4M、4N和4G；4A、4K、4O、4N和4G；或4A、4K、4L、4F和4G。
在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B和2D。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C和2D。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C和2D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E和2F。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E和2F。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E和2F。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E、2K和2L。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E、2K和2L。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3H。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3I。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G和3H。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G和3I。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G和3J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3H和3I。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3H和3J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3I和3J。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G、3H和3I。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G、3H和3J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G、3I和3J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3H、3I和3J。
本文提供的任意乙酰辅酶A途径酶可以与本文提供的任意1,3-BDO途径酶相组合。
在一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：(i)2A、2B和2D；(ii)2A、2C和2D；(iii)2A、2B、2C和2D；(iv)2A、2B、2E和2F；(v)2A、2C、2E和2F；(vi)2A、2B、2C、2E和2F；(vii)2A、2B、2E、2K和2L；(viii)2A、2C、2E、2K和2L或(ix)2A、2B、2C、2E、2K和2L，且其中所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)4A、4E、4F和4G；(ii)4A、4B和4D；(iii)4A、4E、4C和4D；(iv)4A、4H和4J；(v)4A、4H、4I和4G；(vi)4A、4H、4M、4N和4G；(vii)4A、4K、4O、4N和4G；或(viii)4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B和2D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)4A、4E、4F和4G；(ii)4A、4B和4D；(iii)4A、4E、4C和4D；(iv)4A、4H和4J；(v)4A、4H、4I和4G；(vi)4A、4H、4M、4N和4G；(vii)4A、4K、4O、4N和4G；或(viii)4A、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含外源核酸，其中每种外源核酸编码不同的乙酰辅酶A途径或1,3-BDO途径酶。
在其它实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C和2D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)4A、4E、4F和4G；(ii)4A、4B和4D；(iii)4A、4E、4C和4D；(iv)4A、4H和4J；(v)4A、4H、4I和4G；(vi)4A、4H、4M、4N和4G；(vii)4A、4K、4O、4N和4G；或(viii)4A、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含外源核酸，其中每种外源核酸编码不同的乙酰辅酶A途径或1,3-BDO途径酶。
在其它实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2C和2D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)4A、4E、4F和4G；(ii)4A、4B和4D；(iii)4A、4E、4C和4D；(iv)4A、4H和4J；(v)4A、4H、4I和4G；(vi)4A、4H、4M、4N和4G；(vii)4A、4K、4O、4N和4G；或(viii)4A、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含外源核酸，其中每种外源核酸编码不同的乙酰辅酶A途径或1,3-BDO途径酶。
在其它实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E和2F；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)4A、4E、4F和4G；(ii)4A、4B和4D；(iii)4A、4E、4C和4D；(iv)4A、4H和4J；(v)4A、4H、4I和4G；(vi)4A、4H、4M、4N和4G；(vii)4A、4K、4O、4N和4G；或(viii)4A、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含外源核酸，其中每种外源核酸编码不同的乙酰辅酶A途径或1,3-BDO途径酶。
在其它实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C、2E和2F；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)4A、4E、4F和4G；(ii)4A、4B和4D；(iii)4A、4E、4C和4D；(iv)4A、4H和4J；(v)4A、4H、4I和4G；(vi)4A、4H、4M、4N和4G；(vii)4A、4K、4O、4N和4G；或(viii)4A、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含外源核酸，其中每种外源核酸编码不同的乙酰辅酶A途径或1,3-BDO途径酶。
在其它实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2C、2E和2F；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)4A、4E、4F和4G；(ii)4A、4B和4D；(iii)4A、4E、4C和4D；(iv)4A、4H和4J；(v)4A、4H、4I和4G；(vi)4A、4H、4M、4N和4G；(vii)4A、4K、4O、4N和4G；或(viii)4A、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含外源核酸，其中每种外源核酸编码不同的乙酰辅酶A途径或1,3-BDO途径酶。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E、2K和2L；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)4A、4E、4F和4G；(ii)4A、4B和4D；(iii)4A、4E、4C和4D；(iv)4A、4H和4J；(v)4A、4H、4I和4G；(vi)4A、4H、4M、4N和4G；(vii)4A、4K、4O、4N和4G；或(viii)4A、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含外源核酸，其中每种外源核酸编码不同的乙酰辅酶A途径或1,3-BDO途径酶。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C、2E、2K和2L；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)4A、4E、4F和4G；(ii)4A、4B和4D；(iii)4A、4E、4C和4D；(iv)4A、4H和4J；(v)4A、4H、4I和4G；(vi)4A、4H、4M、4N和4G；(vii)4A、4K、4O、4N和4G；或(viii)4A、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3H。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3I。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G和3H。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G和3I。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G和3J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3H和3I。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3H和3J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3I和3J。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G、3H和3I。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G、3H和3J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G、3I和3J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含3H、3I和3J。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含外源核酸，其中每种外源核酸编码不同的乙酰辅酶A途径或1,3-BDO途径酶。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2C、2E、2K和2L；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)4A、4E、4F和4G；(ii)4A、4B和4D；(iii)4A、4E、4C和4D；(iv)4A、4H和4J；(v)4A、4H、4I和4G；(vi)4A、4H、4M、4N和4G；(vii)4A、4K、4O、4N和4G；或(viii)4A、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含外源核酸，其中每种外源核酸编码不同的乙酰辅酶A途径或1,3-BDO途径酶。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5A，5B，5C，5D5E，5F，5G，5H，5I，5J，或其中5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I和5J的任意组合，其中5A是丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；5B是乙酰辅酶A合成酶、连接酶或转移酶；5C是乙酸激酶；5D是磷酸转乙酰酶；5E是丙酮酸脱羧酶；5F是乙醛脱氢酶；5G是丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)；5H是丙酮酸脱氢酶，丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；5I乙醛脱氢酶(酰化)；5J是苏氨酸醛缩酶；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A，4B，4C，4D，4E，4F，4G，4H，4I，4J，4K，4L，4M，4N，或4O，或其中4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I、4J、4K、4L、4M、4N和4O的任意组合；其中4A是乙酰乙酰辅酶A硫解酶；其中4B是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)；其中4C是3-氧代丁醛还原酶(醛还原)；其中4D是4-羟基，2-丁酮还原酶；其中4E是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)；其中4F是3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；其中4G是3-羟基丁醛还原酶；其中4H是乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)；其中4I是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)；其中4J是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)；其中4K是乙酰乙酰辅酶A转移酶、乙酰乙酰辅酶A水解酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶、或磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶；其中4L是乙酰乙酸还原酶；其中4M是3-羟基丁酰辅酶A转移酶、水解酶或合成酶；其中4N是3-羟基丁酸还原酶；且其中4O是3-羟基丁酸脱氢酶。在某些实施方案中，5B是乙酰辅酶A合成酶。在另一个实施方案中，5B是乙酰辅酶A连接酶。在其它实施方案中，5B是乙酰辅酶A转移酶。在某些实施方案中，5H是丙酮酸脱氢酶。在其它实施方案中，5H是丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶。在其它实施方案中，5H是丙酮酸甲酸裂合酶。在某些实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A转移酶。在其它实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A水解酶。在某些实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A合成酶。在其它实施方案中，4K是磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶。在某些实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A转移酶。在某些实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A水解酶。在其它实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A合成酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径是在图5中描绘的乙酰辅酶A途径，且所述1,3-BDO途径是在图4中描绘的1,3-BDO途径。根据图5，乙酰辅酶A途径酶的示例性集合是：5A和5B；5A、5C和5D；5G和5D；5E、5F、5C和5D；5J和5I；5J、5F和5B；和5H。根据图4，将乙酰辅酶A转化成1，3-BDO的1，3-BDO途径酶的示例性集合包括：4A、4E、4F和4G；4A、4B和4D；4A、4E、4C和4D；4A、4H和4J；4A、4H、4I和4G；4A、4H、4M、4N和4G；4A、4K、4O、4N和4G；或4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：(i)5A和5B；(ii)5A、5C和5D；(iii)5E、5F、5C和5D；(iv)5G和5D；(v)5J和5I；(vi)5J、5F和5B；或(vii)5H；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)4A、4E、4F和4G；(ii)4A、4B和4D；(iii)4A、4E、4C和4D；(iv)4A、4H和4J；(v)4A、4H、4I和4G；(vi)4A、4H、4M、4N和4G；(vii)4A、4K、4O、4N和4G；或(viii)4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A和5B；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A和5B；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A和5B；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A和5B；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A和5B；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A和5B；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A和5B；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A和5B；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5E、5F、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5E、5F、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5E、5F、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5E、5F、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5E、5F、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5E、5F、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5E、5F、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5E、5F、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5G和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5G和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5G和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5G和5D，且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5G和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5G和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5G和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5G和5D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J和5I；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J和5I；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J和5I；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J和5I；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J和5I；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J和5I；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J和5I；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J和5I；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J、5F和5B；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J、5F和5B；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J、5F和5B；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J、5F和5B；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J、5F和5B；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J、5F和5B；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J、5F和5B；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J、5F和5B；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5H；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5H；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5H；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5H；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5H；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5H；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5H；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5H；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：6A，6B，6C，6D，或6E，或其中6A、6B、6C、6D和6E的任意组合，其中6A是线粒体乙酰肉碱转移酶；6B是过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶；6C是细胞溶质乙酰肉碱转移酶；6D是线粒体乙酰肉碱移位酶；且6E是过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A，4B，4C，4D，4E，4F，4G，4H，4I，4J，4K，4L，4M，4N，或4O，或其中4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I、4J、4K、4L、4M、4N和4O的任意组合；其中4A是乙酰乙酰辅酶A硫解酶；其中4B是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)；其中4C是3-氧代丁醛还原酶(醛还原)；其中4D是4-羟基,2-丁酮还原酶；其中4E是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)；其中4F是3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；其中4G是3-羟基丁醛还原酶；其中4H是乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)；其中4I是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)；其中4J是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)；其中4K是乙酰乙酰辅酶A转移酶、乙酰乙酰辅酶A水解酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶、或磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶；其中4L是乙酰乙酸还原酶；其中4M是3-羟基丁酰辅酶A转移酶、水解酶或合成酶；其中4N是3-羟基丁酸还原酶；且其中4O是3-羟基丁酸脱氢酶。在某些实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A转移酶。在其它实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A水解酶。在某些实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A合成酶。在其它实施方案中，4K是磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶。在某些实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A转移酶。在某些实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A水解酶。在其它实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A合成酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径是在图6中描绘的乙酰辅酶A途径，且所述1,3-BDO途径是在图4中描绘的1,3-BDO途径。根据图6，乙酰辅酶A途径酶的示例性集合是6A、6D和6C；和6B、6E和6C。根据图4，将乙酰辅酶A转化成1,3-BDO的1,3-BDO途径酶的示例性集合包括：4A、4E、4F和4G；4A、4B和4D；4A、4E、4C和4D；4A、4H和4J；4A、4H、4I和4G；4A、4H、4M、4N和4G；4A、4K、4O、4N和4G；或4A、4K、4L、4F和4G。
在一个实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：(i)6A、6D和6C；或(ii)6B、6E和6C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)4A、4E、4F和4G；(ii)4A、4B和4D；(iii)4A、4E、4C和4D；(iv)4A、4H和4J；(v)4A、4H、4I和4G；(vi)4A、4H、4M、4N和4G；(vii)4A、4K、4O、4N和4G；或(viii)4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6A、6D和6C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6A、6D和6C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6A、6D和6C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6A、6D和6C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6A、6D和6C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6A、6D和6C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6A、6D和6C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6A、6D和6C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6B、6E和6C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6B、6E和6C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6B、6E和6C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6B、6E和6C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6B、6E和6C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6B、6E和6C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6B、6E和6C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6B、6E和6C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A，10B，10C，10D，10F，10G，10H。10J，10K，10L，10M，10N，或其中10A、10B、10C、10D、10F、10G、10H.10J、10K、10L、10M、10N的任意组合；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A(也参见图10,步骤I)，4B，4C，4D，4E，4F，4G，4H，4I，4J，4K，4L，4M，4N，或4O，或其中4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I、4J、4K、4L、4M、4N和4O的任意组合。在一个实施方案中，10A是PEP羧化酶。在另一个实施方案中，10A是PEP羧基激酶。在一个实施方案中，10F是草酰乙酸脱氢酶。在其它实施方案中，10F是草酰乙酸氧化还原酶。在一个实施方案中，10K是丙二酰辅酶A合成酶。在另一个实施方案中，10K是丙二酰辅酶A转移酶。在一个实施方案中，10M是苹果酸脱氢酶。在另一个实施方案中，10M是苹果酸氧化还原酶。在其它实施方案中，10N是丙酮酸激酶。在某些实施方案中，10N是PEP磷酸酶。在某些实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A转移酶。在其它实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A水解酶。在某些实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A合成酶。在其它实施方案中，4K是磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶。在某些实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A转移酶。在某些实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A水解酶。在其它实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A合成酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径是在图10中描绘的乙酰辅酶A途径，且所述1,3-BDO途径是在图4中描绘的1,3-BDO途径。根据图10，乙酰辅酶A途径酶的示例性集合是10A、10B和10C；10N、10H、10B和10C；10N、10L、10M、10B和10C；10A、10B、10G和10D；10N、10H、10B、10G和10D；10N、10L、10M、10B、10G和10D；10A、10B、10J、10K和10D；10N、10H、10B、10J、10K和10D；10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；10A、10F和10D；10N、10H、10F和10D；和10N、10L、10M、10F和10D。根据图4，将乙酰辅酶A转化成1,3-BDO的1,3-BDO途径酶的示例性集合包括：4A、4E、4F和4G；4A、4B和4D；4A、4E、4C和4D；4A、4H和4J；4A、4H、4I和4G；4A、4H、4M、4N和4G；4A、4K、4O、4N和4G；或4A、4K、4L、4F和4G。
在一个实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：(i)10A、10B和10C；(ii)10N、10H、10B和10C；(iii)10N、10L、10M、10B和10C；(iv)10A、10B、10G和10D；(v)10N、10H、10B、10G和10D；(vi)10N、10L、10M、10B、10G和10D；(vii)10A、10B、10J、10K和10D；(viii)10N、10H、10B、10J、10K和10D；(ix)10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；(x)10A、10F和10D；(xi)10N、10H、10F和10D；或(xii)10N、10L、10M、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)4A、4E、4F和4G；(ii)4A、4B和4D；(iii)4A、4E、4C和4D；(iv)4A、4H和4J；(v)4A、4H、4I和4G；(vi)4A、4H、4M、4N和4G；(vii)4A、4K、4O、4N和4G；或(viii)4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L.10M、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L.10M、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L.10M、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L.10M、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L.10M、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L.10M、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L.10M、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L.10M、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。
在一个另外的实施方案中，本文提供了一种非天然存在的具有1,3-BDO途径的真核生物，其中所述非天然存在的真核生物包含至少一种编码酶或蛋白的外源核酸，所述酶或蛋白以选自以下的方式将底物转化成产物：乙酰辅酶A至乙酰乙酰辅酶A(例如，4A)；乙酰乙酰辅酶A至4-羟基-2-丁酮(例如，4B)；3-氧代丁醛至4-羟基-2-丁酮(例如，4C)；4-羟基-2-丁酮至1,3-BDO(例如，4D)；乙酰乙酰辅酶A至3-氧代丁醛(例如，4E)；3-氧代丁醛至3-羟基丁醛(例如，4F)；3-羟基丁醛至1,3-BDO(例如，4G)；乙酰乙酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A(例如，4H)；3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁醛(例如，4I)，3-羟基丁酰辅酶A至1,3-BDO(例如，4J)；乙酰乙酰辅酶A至乙酰乙酸(例如，4K)；乙酰乙酸至3-氧代丁醛(例如，4L)；3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸(例如，4M)；3-羟基丁酸至3-羟基丁醛(例如，4N)；乙酰乙酸至3-羟基丁酸(例如，4O)。本领域技术人员会理解，这些仅仅是示例性的，并且本领域技术人员基于本文中的教导可以容易地确定本文中公开的任意底物-产物对，其适合于产生期望的产物且可得到用于将所述底物转化成所述产物的适当活性。因而，本文提供了非天然存在的真核生物，其包含至少一种编码酶或蛋白的外源核酸，其中所述酶或蛋白转化1,3-BDO途径的底物和产物，诸如图4所示的那些。
本文还提供了非天然存在的真核生物，其包含至少一种编码乙酰辅酶A羧化酶(7E)、乙酰乙酰辅酶A合酶(7B)或它们的组合的外源核酸。在本文提供的1,3-BDO途径(包括在图4中举例说明的那些)的某些实施方案中，乙酰辅酶A被乙酰辅酶A羧化酶转化成丙二酰辅酶A，且乙酰乙酰辅酶A是由乙酰乙酰辅酶A合成酶从乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成(参见图7(步骤E和F)和图9)。本文还提供了非天然存在的真核生物，其包含至少一种编码酶或蛋白的外源核酸，其中所述酶或蛋白转化1,3-BDO途径的底物和产物，诸如图7中所示的那些。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A，2B，2C，2D，2E，2F，2G，2K，2L，3H，3I，或3J，或其中2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、3H、3I和3J的任意组合；且(2)所述1,3-BDO途径包含：7E，7F，4B，4C，4D，4E，4F，4G，4H，4I，4J，4K，4L，4M，4N，或4O，或其中7E、7F、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I、4J、4K、4L、4M、4N和4O的任意组合；其中7E是乙酰辅酶A羧化酶；其中7F是乙酰乙酰辅酶A合酶。在一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E。在一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7B。
根据图4和7，将乙酰辅酶A转化成1,3-BDO的1,3-BDO途径酶的示例性集合包括：7E、7F、4E、4F和4G；7E、7F、4B和4D；7E、7F、4E、4C和4D；7E、7F、4H和4J；7E、7F、4H、4I和4G；7E、7F、4H、4M、4N和4G；7E、7F、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：(i)2A、2B和2D；(ii)2A、2C和2D；(iii)2A、2B、2C和2D；(iv)2A、2B、2E和2F；(v)2A、2C、2E和2F；(vi)2A、2B、2C、2E和2F；(vii)2A、2B、2E、2K和2L；(viii)2A、2C、2E、2K和2L或(ix)2A、2B、2C、2E、2K和2L，且其中所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)7E、7F、4E、4F和4G；(ii)7E、7F、4B和4D；(iii)7E、7F、4E、4C和4D；(iv)7E、7F、4H和4J；(v)7E、7F、4H、4I和4G；(vi)7E、7F、4H、4M、4N和4G；(vii)7E、7F、4K、4O、4N和4G；或(viii)7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B和2D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)7E、7F、4E、4F和4G；(ii)7E、7F、4B和4D；(iii)7E、7F、4E、4C和4D；(iv)7E、7F、4H和4J；(v)7E、7F、4H、4I和4G；(vi)7E、7F、4H、4M、4N和4G；(vii)7E、7F、4K、4O、4N和4G；或(viii)7E、7F、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含外源核酸，其中每种外源核酸编码不同的乙酰辅酶A途径或1,3-BDO途径酶。
在其它实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C和2D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)7E、7F、4E、4F和4G；(ii)7E、7F、4B和4D；(iii)7E、7F、4E、4C和4D；(iv)7E、7F、4H和4J；(v)7E、7F、4H、4I和4G；(vi)7E、7F、4H、4M、4N和4G；(vii)7E、7F、4K、4O、4N和4G；或(viii)7E、7F、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含外源核酸，其中每种外源核酸编码不同的乙酰辅酶A途径或1,3-BDO途径酶。
在其它实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2C和2D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)7E、7F、4E、4F和4G；(ii)7E、7F、4B和4D；(iii)7E、7F、4E、4C和4D；(iv)7E、7F、4H和4J；(v)7E、7F、4H、4I和4G；(vi)7E、7F、4H、4M、4N和4G；(vii)7E、7F、4K、4O、4N和4G；或(viii)7E、7F、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C和2D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含外源核酸，其中每种外源核酸编码不同的乙酰辅酶A途径或1,3-BDO途径酶。
在其它实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E和2F；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)7E、7F、4E、4F和4G；(ii)7E、7F、4B和4D；(iii)7E、7F、4E、4C和4D；(iv)7E、7F、4H和4J；(v)7E、7F、4H、4I和4G；(vi)7E、7F、4H、4M、4N和4G；(vii)7E、7F、4K、4O、4N和4G；或(viii)7E、7F、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含外源核酸，其中每种外源核酸编码不同的乙酰辅酶A途径或1,3-BDO途径酶。
在其它实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C、2E和2F；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)7E、7F、4E、4F和4G；(ii)7E、7F、4B和4D；(iii)7E、7F、4E、4C和4D；(iv)7E、7F、4H和4J；(v)7E、7F、4H、4I和4G；(vi)7E、7F、4H、4M、4N和4G；(vii)7E、7F、4K、4O、4N和4G；或(viii)7E、7F、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含外源核酸，其中每种外源核酸编码不同的乙酰辅酶A途径或1,3-BDO途径酶。
在其它实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2C、2E和2F；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)7E、7F、4E、4F和4G；(ii)7E、7F、4B和4D；(iii)7E、7F、4E、4C和4D；(iv)7E、7F、4H和4J；(v)7E、7F、4H、4I和4G；(vi)7E、7F、4H、4M、4N和4G；(vii)7E、7F、4K、4O、4N和4G；或(viii)7E、7F、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E和2F，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含外源核酸，其中每种外源核酸编码不同的乙酰辅酶A途径或1,3-BDO途径酶。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E、2K和2L；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)7E、7F、4E、4F和4G；(ii)7E、7F、4B和4D；(iii)7E、7F、4E、4C和4D；(iv)7E、7F、4H和4J；(v)7E、7F、4H、4I和4G；(vi)7E、7F、4H、4M、4N和4G；(vii)7E、7F、4K、4O、4N和4G；或(viii)7E、7F、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含外源核酸，其中每种外源核酸编码不同的乙酰辅酶A途径或1,3-BDO途径酶。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C、2E、2K和2L；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)7E、7F、4E、4F和4G；(ii)7E、7F、4B和4D；(iii)7E、7F、4E、4C和4D；(iv)7E、7F、4H和4J；(v)7E、7F、4H、4I和4G；(vi)7E、7F、4H、4M、4N和4G；(vii)7E、7F、4K、4O、4N和4G；或(viii)7E、7F、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含外源核酸，其中每种外源核酸编码不同的乙酰辅酶A途径或1,3-BDO途径酶。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2C、2E、2K和2L；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)7E、7F、4E、4F和4G；(ii)7E、7F、4B和4D；(iii)7E、7F、4E、4C和4D；(iv)7E、7F、4H和4J；(v)7E、7F、4H、4I和4G；(vi)7E、7F、4H、4M、4N和4G；(vii)7E、7F、4K、4O、4N和4G；或(viii)7E、7F、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含2A、2B、2C、2E、2K和2L，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径任选地进一步包含2G、3H、3I、3J或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物包含外源核酸，其中每种外源核酸编码不同的乙酰辅酶A途径或1,3-BDO途径酶。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5A，5B，5C，5D5E，5F，5G，5H，5I，5J，或其中5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I和5J的任意组合，其中5A是丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；5B是乙酰辅酶A合成酶、连接酶或转移酶；5C是乙酸激酶；5D是磷酸转乙酰酶；5E是丙酮酸脱羧酶；5F是乙醛脱氢酶；5G是丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)；5H是丙酮酸脱氢酶，丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；5I乙醛脱氢酶(酰化)；5J是苏氨酸醛缩酶；且(2)所述1,3-BDO途径包含：7E，7F，4B，4C，4D，4E，4F，4G，4H，4I，4J，4K，4L，4M，4N，或4O，或其中7E、7F、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I、4J、4K、4L、4M、4N和4O的任意组合；其中7E、7F是乙酰乙酰辅酶A硫解酶；其中4B是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)；其中4C是3-氧代丁醛还原酶(醛还原)；其中4D是4-羟基,2-丁酮还原酶；其中4E是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)；其中4F是3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；其中4G是3-羟基丁醛还原酶；其中4H是乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)；其中4I是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)；其中4J是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)；其中4K是乙酰乙酰辅酶A转移酶、乙酰乙酰辅酶A水解酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶、或磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶；其中4L是乙酰乙酸还原酶；其中4M是3-羟基丁酰辅酶A转移酶、水解酶或合成酶；其中4N是3-羟基丁酸还原酶；且其中4O是3-羟基丁酸脱氢酶。在某些实施方案中，5B是乙酰辅酶A合成酶。在另一个实施方案中，5B是乙酰辅酶A连接酶。在其它实施方案中，5B是乙酰辅酶A转移酶。在某些实施方案中，5H是丙酮酸脱氢酶。在其它实施方案中，5H是丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶。在其它实施方案中，5H是丙酮酸甲酸裂合酶。在某些实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A转移酶。在其它实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A水解酶。在某些实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A合成酶。在其它实施方案中，4K是磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶。在某些实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A转移酶。在某些实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A水解酶。在其它实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A合成酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径是在图5中描绘的乙酰辅酶A途径，且所述1,3-BDO途径是在图4和/或7中描绘的1,3-BDO途径。根据图5，乙酰辅酶A途径酶的示例性集合是：5A和5B；5A、5C和5D；5G和5D；5E、5F、5C和5D；5J和5I；5J、5F和5B；和5H。根据图4和7，将乙酰辅酶A转化成1,3-BDO的1,3-BDO途径酶的示例性集合包括：7E、7F、4E、4F和4G；7E、7F、4B和4D；7E、7F、4E、4C和4D；7E、7F、4H和4J；7E、7F、4H、4I和4G；7E、7F、4H、4M、4N和4G；7E、7F、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：(i)5A和5B；(ii)5A、5C和5D；(iii)5E、5F、5C和5D；(iv)5G和5D；(v)5J和5I；(vi)5J、5F和5B；或(vii)5H；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)7E、7F、4E、4F和4G；(ii)7E、7F、4B和4D；(iii)7E、7F、4E、4C和4D；(iv)7E、7F、4H和4J；(v)7E、7F、4H、4I和4G；(vi)7E、7F、4H、4M、4N和4G；(vii)7E、7F、4K、4O、4N和4G；或(viii)7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A和5B；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A和5B；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A和5B；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A和5B；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A和5B；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A和5B；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A和5B；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A和5B；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5A、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5E、5F、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5E、5F、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5E、5F、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5E、5F、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5E、5F、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5E、5F、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5E、5F、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5E、5F、5C和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5G和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5G和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5G和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5G和5D，且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5G和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5G和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5G和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5G和5D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J和5I；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J和5I；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J和5I；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J和5I；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J和5I；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J和5I；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J和5I；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J和5I；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J、5F和5B；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J、5F和5B；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J、5F和5B；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J、5F和5B；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J、5F和5B；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J、5F和5B；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J、5F和5B；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5J、5F和5B；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5H；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5H；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5H；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5H；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5H；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5H；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5H；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含5H；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：6A，6B，6C，6D，或6E，或其中6A、6B、6C、6D和6E的任意组合，其中6A是线粒体乙酰肉碱转移酶；6B是过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶；6C是细胞溶质乙酰肉碱转移酶；6D是线粒体乙酰肉碱移位酶；且6E是过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶；且(2)所述1,3-BDO途径包含：7E，7F，4B，4C，4D，4E，4F，4G，4H，4I，4J，4K，4L，4M，4N，或4O，或其中7E、7F、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I、4J、4K、4L、4M、4N和4O的任意组合；其中7E、7F是乙酰乙酰辅酶A硫解酶；其中4B是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)；其中4C是3-氧代丁醛还原酶(醛还原)；其中4D是4-羟基,2-丁酮还原酶；其中4E是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)；其中4F是3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；其中4G是3-羟基丁醛还原酶；其中4H是乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)；其中4I是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)；其中4J是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)；其中4K是乙酰乙酰辅酶A转移酶、乙酰乙酰辅酶A水解酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶、或磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶；其中4L是乙酰乙酸还原酶；其中4M是3-羟基丁酰辅酶A转移酶、水解酶或合成酶；其中4N是3-羟基丁酸还原酶；且其中4O是3-羟基丁酸脱氢酶。在某些实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A转移酶。在其它实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A水解酶。在某些实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A合成酶。在其它实施方案中，4K是磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶。在某些实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A转移酶。在某些实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A水解酶。在其它实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A合成酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径是在图6中描绘的乙酰辅酶A途径，且所述1,3-BDO途径是在图4和/或7中描绘的1,3-BDO途径。根据图6，乙酰辅酶A途径酶的示例性集合是6A、6D和6C；和6B、6E和6C。根据图4和7，将乙酰辅酶A转化成1,3-BDO的1,3-BDO途径酶的示例性集合包括：7E、7F、4E、4F和4G；7E、7F、4B和4D；7E、7F、4E、4C和4D；7E、7F、4H和4J；7E、7F、4H、4I和4G；7E、7F、4H、4M、4N和4G；7E、7F、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在一个实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：(i)6A、6D和6C；或(ii)6B、6E和6C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)7E、7F、4E、4F和4G；(ii)7E、7F、4B和4D；(iii)7E、7F、4E、4C和4D；(iv)7E、7F、4H和4J；(v)7E、7F、4H、4I和4G；(vi)7E、7F、4H、4M、4N和4G；(vii)7E、7F、4K、4O、4N和4G；或(viii)7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6A、6D和6C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6A、6D和6C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6A、6D和6C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6A、6D和6C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6A、6D和6C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6A、6D和6C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6A、6D和6C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6A、6D和6C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6B、6E和6C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6B、6E和6C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6B、6E和6C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6B、6E和6C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6B、6E和6C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6B、6E和6C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6B、6E和6C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含6B、6E和6C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A，10B，10C，10D，10F，10G，10H。10J，10K，10L，10M，10N，或其中10A、10B、10C、10D、10F、10G、10H.10J、10K、10L、10M、10N的任意组合；且(2)所述1,3-BDO途径包含：7E(也参见FIG10,步骤D),7F(也参见图10，步骤E)，4B，4C，4D，4E，4F，4G，4H，4I，4J，4K，4L，4M，4N，或4O，或其中7E、7F、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I、4J、4K、4L、4M、4N和4O的任意组合。在某些实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A转移酶。在一个实施方案中，10A是PEP羧化酶。在另一个实施方案中，10A是PEP羧基激酶。在一个实施方案中，10F是草酰乙酸脱氢酶。在其它实施方案中，10F是草酰乙酸氧化还原酶。在一个实施方案中，10K是丙二酰辅酶A合成酶。在另一个实施方案中，10K是丙二酰辅酶A转移酶。在一个实施方案中，10M是苹果酸脱氢酶。在另一个实施方案中，10M是苹果酸氧化还原酶。在其它实施方案中，10N是丙酮酸激酶。在某些实施方案中，10N是PEP磷酸酶。在其它实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A水解酶。在某些实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A合成酶。在其它实施方案中，4K是磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶。在某些实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A转移酶。在某些实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A水解酶。在其它实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A合成酶。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径是在图10中描绘的乙酰辅酶A途径，且所述1,3-BDO途径是在图4和/或7中描绘的1,3-BDO途径。根据图10，乙酰辅酶A途径酶的示例性集合是10A、10B和10C；10N、10H、10B和10C；10N、10L、10M、10B和10C；10A、10B、10G和10D；10N、10H、10B、10G和10D；10N、10L、10M、10B、10G和10D；10A、10B、10J、10K和10D；10N、10H、10B、10J、10K和10D；10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；10A、10F和10D；10N、10H、10F和10D；和10N、10L、10M、10F和10D。根据图4和7，将乙酰辅酶A转化成1,3-BDO的1,3-BDO途径酶的示例性集合包括：7E、7F、4E、4F和4G；7E、7F、4B和4D；7E、7F、4E、4C和4D；7E、7F、4H和4J；7E、7F、4H、4I和4G；7E、7F、4H、4M、4N和4G；7E、7F、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在一个实施方案中，(1)所述乙酰辅酶A途径包含：(i)10A、10B和10C；(ii)10N、10H、10B和10C；(iii)10N、10L、10M、10B和10C；(iv)10A、10B、10G和10D；(v)10N、10H、10B、10G和10D；(vi)10N、10L、10M、10B、10G和10D；(vii)10A、10B、10J、10K和10D；(viii)10N、10H、10B、10J、10K和10D；(ix)10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；(x)10A、10F和10D；(xi)10N、10H、10F和10D；或(xii)10N、10L、10M、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：(i)7E、7F、4E、4F和4G；(ii)7E、7F、4B和4D；(iii)7E、7F、4E、4C和4D；(iv)7E、7F、4H和4J；(v)7E、7F、4H、4I和4G；(vi)7E、7F、4H、4M、4N和4G；(vii)7E、7F、4K、4O、4N和4G；或(viii)7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B和10C；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10G和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10A、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10H、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L.10M、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L.10M、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L.10M、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L.10M、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L.10M、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L.10M、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L.10M、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含10N、10L.10M、10F和10D；且所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。
在一个另外的实施方案中，本文提供了一种非天然存在的具有1,3-BDO途径的真核生物，其中所述非天然存在的真核生物包含至少一种编码酶或蛋白的外源核酸，所述酶或蛋白以选自以下的方式将底物转化成产物：乙酰辅酶A至乙酰乙酰辅酶A(例如，7E、7F)；乙酰乙酰辅酶A至4-羟基-2-丁酮(例如，4B)；3-氧代丁醛至4-羟基-2-丁酮(例如，4C)；4-羟基-2-丁酮至1,3-BDO(例如，4D)；乙酰乙酰辅酶A至3-氧代丁醛(例如，4E)；3-氧代丁醛至3-羟基丁醛(例如，4F)；3-羟基丁醛至1,3-BDO(例如，4G)；乙酰乙酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A(例如，4H)；3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁醛(例如，4I)，3-羟基丁酰辅酶A至1,3-BDO(例如，4J)；乙酰乙酰辅酶A至乙酰乙酸(例如，4K)；乙酰乙酸至3-氧代丁醛(例如，4L)；3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸(例如，4M)；3-羟基丁酸至3-羟基丁醛(例如，4N)；乙酰乙酸至3-羟基丁酸(例如，4O)。本领域技术人员会理解，这些仅仅是示例性的，并且本领域技术人员基于本文中的教导可以容易地确定本文中公开的任意底物-产物对，其适合于产生期望的产物且可得到用于将所述底物转化成所述产物的适当活性。因而，本文提供了非天然存在的真核生物，其包含至少一种编码酶或蛋白的外源核酸，其中所述酶或蛋白转化1,3-BDO途径的底物和产物，诸如图4或7所示的那些。
可以将任意组合和任意数目的前述酶和/或编码所述酶的核酸引入宿主真核生物中以完成如图4或7举例说明的1,3-BDO途径。例如，所述非天然存在的真核生物可以包括1,3-BDO途径中的1种、2种、3种、4种、5种、至多所有核酸，每种核酸编码1,3-BDO途径酶。这样的核酸可以包括异源核酸、现有基因的额外拷贝、和基因调节元件，这在下面进一步解释。本文提供的非天然存在的真核生物的途径也适当地经工程改造以在基本上厌氧的培养基中培养。
在某些实施方案中，本文提供的用于增加细胞溶质乙酰辅酶A的方法包括：缺失或减弱利用乙酰辅酶A的竞争途径。通过本领域技术人员已知的任意方法，可以实现利用乙酰辅酶A的竞争性副产物途径的缺失或减弱。例如，可以如下实现这样的竞争途径的减弱：用编码酶变体的核酸的突变形式替换编码所述途径的酶的内源核酸，所述酶变体具有与野生型相比降低的酶活性。例如，可以如下实现这样的途径的缺失：缺失编码所述途径的一种或多种酶的一种或多种内源核酸，或用无效等位基因变体替换内源性的一种或多种核酸。在下面和在实施例X中描述了在宿主真核生物(包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中遗传操作内源核酸的示例性方法。
例如，在利用乙酰辅酶A的竞争途径中的一种这样的酶是线粒体丙酮酸脱氢酶复合物。在厌氧条件下和在培养基中的葡萄糖浓度较高的条件下，该线粒体酶的能力非常有限，并且没有经过它的显著通量。但是，在某些实施方案中，本文描述的任意非天然存在的真核生物可以经工程改造成表达减弱的线粒体丙酮酸脱氢酶或无效表型以增加1,3-BDO生产。示例性的丙酮酸脱氢酶基因包括PDB1、PDA1、LAT1和LPD1。其减弱或缺失可以提高1,3-BDO生产的示例性的竞争性乙酰辅酶A消耗途径包括、但不限于线粒体TCA循环和代谢途径，诸如脂肪酸生物合成和氨基酸生物合成。
在某些实施方案中，任选地进一步工程改造本文提供的任意真核生物，以减弱或缺失一个或多个副产物途径，诸如在图7中用“X”标记的那些示例性副产物途径中的一个或多个，或3-氧代丁醛脱氢酶实现的3-氧代丁醛至乙酰乙酸的转化。例如，在一个实施方案中，所述副产物途径包含：将G3P转化成甘油的G3P磷酸酶。在另一个实施方案中，所述副产物途径包含：将二羟基丙酮转化成G3P的G3P脱氢酶，和将G3P转化成甘油的G3P磷酸酶。在其它实施方案中，所述副产物途径包含：将丙酮酸转化成乙醛的丙酮酸脱羧酶。在另一个实施方案中，所述副产物途径包含：将乙醛转化成乙醇的乙醇脱氢酶。在其它实施方案中，所述副产物途径包含：将乙酰辅酶A转化成乙醛的乙醛脱氢酶(酰化)，和将乙醛转化成乙醇的乙醇脱氢酶。在其它实施方案中，所述副产物途径包含：将丙酮酸转化成乙醛的丙酮酸脱羧酶；和将乙醛转化成乙醇的乙醇脱氢酶。在其它实施方案中，所述副产物途径包含：将乙酰辅酶A转化成乙醛的乙醛脱氢酶(酰化)，和将乙醛转化成乙醇的乙醇脱氢酶。在某些实施方案中，所述副产物途径包含：将乙酰乙酰辅酶A转化成乙酰乙酸的乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶。在另一个实施方案中，所述副产物途径包含：将3-羟基丁酰辅酶A(3-HB辅酶A)转化成3-羟基丁酸的3-羟基丁酰辅酶A-水解酶。在另一个实施方案中，所述副产物途径包含：将3-羟基丁醛转化成3-羟基丁酸的3-羟基丁醛脱氢酶。在另一个实施方案中，所述副产物途径包含：将1,3-丁二醇转化成3-氧代丁醇的1,3-丁二醇脱氢酶。在另一个实施方案中，所述副产物途径包含：将3-氧代丁醛转化成乙酰乙酸的3-氧代丁醛脱氢酶。在另一个实施方案中，所述副产物途径包含线粒体丙酮酸脱氢酶。在另一个实施方案中，所述副产物途径包含乙酰乙酰辅酶A硫解酶。
在一个另外的实施方案中，本文提供了一种非天然存在的具有1,3-BDO途径的真核生物，其中所述非天然存在的真核生物包含至少一种编码酶或蛋白的外源核酸，所述酶或蛋白将底物转化成选自4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I、4J、4L、4N和4O的产物。在某些实施方案中，所述生物包含含有4A、4H、4I和4G的1,3-BDO途径。在其它实施方案中，所述生物包含含有7E、7F、4H、4I和4G的1,3-BDO途径。在某些实施方案中，进一步工程改造所述真核生物以缺失如本文所述的副产物途径中的一个或多个。
本领域技术人员会理解，这些仅仅是示例性的，并且本领域技术人员基于本文中的教导可以容易地确定本文中公开的任意底物-产物对，其适合于产生期望的产物且可得到用于将所述底物转化成所述产物的适当活性。因而，本文提供了非天然存在的真核生物，其包含至少一种编码酶或蛋白的外源核酸，其中所述酶或蛋白转化1,3-BDO途径的底物和产物，诸如在图4和图7中显示的那些。
可以将任意组合和任意数目的前述酶和/或编码所述酶的核酸引入宿主真核生物中以完成如图4或7举例说明的1,3-BDO途径。例如，所述非天然存在的真核生物可以包括1,3-BDO途径中的1种、2种、3种、4种、5种、至多所有核酸，每种核酸编码1,3-BDO途径酶。这样的核酸可以包括异源核酸、现有基因的额外拷贝、和基因调节元件，这在下面进一步解释。本文提供的非天然存在的真核生物的途径也适当地经工程改造以在基本上厌氧的培养基中培养。
可以将任意组合和任意数目的前述酶引入宿主真核生物中以完成如图4或7举例说明的1,3-BDO途径。例如，所述非天然存在的真核生物可以包括1,3-BDO途径中的1种、2种、3种、4种、至多所有核酸，每种核酸编码1,3-BDO途径酶。这样的核酸可以包括异源核酸、现有基因的额外拷贝、和基因调节元件，这在下面进一步解释。本文提供的非天然存在的真核生物的途径也适当地经工程改造以在基本上厌氧的培养基中培养。
尽管在某些实施方案中将真核生物说成进一步包含1,3-BDO途径，但是应当理解，本文还提供了非天然存在的真核生物，其包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO途径的中间体的量表达。例如，如在本文中公开的，在图4或7中举例说明了1,3-BDO途径。因此，除了含有生产1,3-BDO的1,3-BDO途径的真核生物以外，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，其中所述真核生物生产1,3-BDO途径中间体，例如，乙酰乙酰辅酶A、乙酰乙酸、3-氧代丁醛、3-羟基丁醛、4-羟基-2-丁酮、3-羟基丁酰辅酶A或3-羟基丁酸。
应当理解，如在实施例中描述的和在附图中举例说明的本文中公开的任意途径(包括图4或7的途径)可以用于产生非天然存在的真核生物，其生产期望的任意途径中间体或产物。如在本文中公开的，这样的生产中间体的真核生物可以与另一种表达下游途径酶的真核生物联合使用，以生产期望的产物。但是，应当理解，非天然存在的生产1,3-BDO途径中间体的真核生物可以用于生产中间体作为期望的产物。
乙酰辅酶A至1,3-BDO的转化可以通过许多途径来完成，所述途径包含约3-5个酶促步骤，如在图4中所示。在所有途径的第一个步骤(步骤A)中，乙酰辅酶A被酶4A转化成乙酰乙酰辅酶A。可替换地，乙酰辅酶A被乙酰辅酶A羧化酶转化成丙二酰辅酶A(图7，步骤E)，乙酰乙酰辅酶A合酶从乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A(图7，步骤F)。
在一个途径中，4A将乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A；4E将乙酰乙酰辅酶A转化成3-氧代丁醛；4F将3-氧代丁醛转化成3-羟基丁醛，且4G将3-羟基丁醛转化成1,3-BDO。在另一个途径中，4A将乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A；4B将乙酰乙酰辅酶A转化成4-羟基-2-丁酮；且4D将4-羟基-2-丁酮转化成1,3-BDO。在一个途径中，4A将乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A；4E将乙酰乙酰辅酶A转化成3-氧代丁醛；4C将3-氧代丁醛转化成4-羟基-2-丁酮；且4D将4-羟基-2-丁酮转化成1,3-BDO。在另一个途径中，4A将乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A；4H将乙酰乙酰辅酶A转化成3-羟基丁酰辅酶A；且4J将3-羟基丁酰辅酶A转化成1,3-BDO。在另一个途径中，4A将乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A；4H将乙酰乙酰辅酶A转化成3-羟基丁酰辅酶A；4I将3-羟基丁酰辅酶A转化成3-羟基丁醛；且4G将3-羟基丁醛转化成1,3-BDO。在另一个途径中，4A将乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A；4H将乙酰乙酰辅酶A转化成3-羟基丁酰辅酶A；4M将3-羟基丁酰辅酶A转化成3-羟基丁酸；4N将3-羟基丁酸转化成3-羟基丁醛；且4G将3-羟基丁醛转化成1,3-BDO。在一个途径中，4A将乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A；4K将乙酰乙酰辅酶A转化成乙酰乙酸；4O将乙酰乙酸转化成3-羟基丁酸；4N将3-羟基丁酸转化成3-羟基丁醛；且4G将3-羟基丁醛转化成1,3-BDO。在另一个途径中，4A将乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A；4K将乙酰乙酰辅酶A转化成乙酰乙酸；4L将乙酰乙酸转化成3-氧代丁醛；4F将3-氧代丁醛转化成3-羟基丁醛；且4G将3-羟基丁醛转化成1,3-BDO。
基于上述的从乙酰辅酶A生产1,3-BDO的途径，在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物具有一组1,3-BDO途径酶，所述酶包括：4A、4E、4F和4G；4A、4B和4D；4A、4E、4C和4D；4A、4H和4J；4A、4H、4I和4G；4A、4H、4M、4N和4G；4A、4K、4O、4N和4G；或4A、4K、4L、4F和4G。可以将任意数目的编码这些酶的核酸引入宿主生物中，所述宿主生物包括1种、2种、3种、4种或至多所有5种编码这些酶的核酸。例如，在引入1种、2种、3种或4种外源核酸的情况下，这样的核酸可以是5种核酸的任意排列。对于小于编码的酶的数目的外源核酸的任意其它数目，同样如此。
在另一个途径中，7E将乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A，且7F将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A；4E将乙酰乙酰辅酶A转化成3-氧代丁醛；4F将3-氧代丁醛转化成3-羟基丁醛，且4G将3-羟基丁醛转化成1,3-BDO。在另一个途径中，7E将乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A，且7F将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A；4B将乙酰乙酰辅酶A转化成4-羟基-2-丁酮；且4D将4-羟基-2-丁酮转化成1,3-BDO。在一个途径中，7E将乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A，且7F将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A；4E将乙酰乙酰辅酶A转化成3-氧代丁醛；4C将3-氧代丁醛转化成4-羟基-2-丁酮；且4D将4-羟基-2-丁酮转化成1,3-BDO。在另一个途径中，7E将乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A，且7F将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A；4H将乙酰乙酰辅酶A转化成3-羟基丁酰辅酶A；且4J将3-羟基丁酰辅酶A转化成1,3-BDO。在另一个途径中，7E将乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A，且7F将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A；4H将乙酰乙酰辅酶A转化成3-羟基丁酰辅酶A；4I将3-羟基丁酰辅酶A转化成3-羟基丁醛；且4G将3-羟基丁醛转化成1,3-BDO。在另一个途径中，7E将乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A，且7F将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A；4H将乙酰乙酰辅酶A转化成3-羟基丁酰辅酶A；4M将3-羟基丁酰辅酶A转化成3-羟基丁酸；4N将3-羟基丁酸转化成3-羟基丁醛；且4G将3-羟基丁醛转化成1,3-BDO。在一个途径中，7E将乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A，且7F将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A；4K将乙酰乙酰辅酶A转化成乙酰乙酸；4O将乙酰乙酸转化成3-羟基丁酸；4N将3-羟基丁酸转化成3-羟基丁醛；且4G将3-羟基丁醛转化成1,3-BDO。在另一个途径中，7E将乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A，且7F将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A；4K将乙酰乙酰辅酶A转化成乙酰乙酸；4L将乙酰乙酸转化成3-氧代丁醛；4F将3-氧代丁醛转化成3-羟基丁醛；且4G将3-羟基丁醛转化成1,3-BDO。
基于上述的从乙酰辅酶A生产1,3-BDO的途径，在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物具有一组1,3-BDO途径酶，所述酶包括：7E、7F、4E、4F和4G；7E、7F、4B和4D；7E、7F、4E、4C和4D；7E、7F、4H和4J；7E、7F、4H、4I和4G；7E、7F、4H、4M、4N和4G；7E、7F、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G。可以将任意数目的编码这些酶的核酸引入宿主生物中，所述宿主生物包括1种、2种、3种、4种或至多所有5种编码这些酶的核酸。例如，在引入1种、2种、3种或4种外源核酸的情况下，这样的核酸可以是5种核酸的任意排列。对于小于编码的酶的数目的外源核酸的任意其它数目，同样如此。
可以任选地进一步工程改造生物以缺失如本文别处所述的示例性副产物途径(“X”)中的一个或多个。基于这些从乙酰辅酶A生产1,3-BDO的途径，在某些实施方案中，所述非天然存在的真核生物具有一组1,3-BDO途径酶，所述酶包括：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G。可以将任意数目的编码这些酶的核酸引入宿主生物中，所述宿主生物包括1种、2种、3种、4种或至多所有5种编码这些酶的核酸。例如，在引入1种、2种或3种外源核酸的情况下，这样的核酸可以是4种或5种核酸的任意排列。对于小于编码的酶的数目的外源核酸的任意其它数目，同样如此。
4.3组合的细胞溶质//线粒体1,3-BDO途径
还可以工程改造如本文中提供的真核生物，以将碳和还原当量有效地导入组合的线粒体/细胞溶质1,3-BDO途径中。这样的途径将需要：线粒体中合成单羧酸1,3-BDO途径中间体诸如乙酰乙酸或3-羟基丁酸，将所述途径中间体输出至细胞溶质，和随后在细胞溶质中将该中间体转化成1,3-BDO。在图8中描绘了示例性的组合的线粒体/细胞溶质1,3-BDO途径。
使用组合的线粒体/细胞溶质1,3-BDO生产途径来生产1,3-BDO，存在几个优点。一个优点是，乙酰辅酶A(关键1,3-BDO途径前体)的天然丰富的线粒体库。如果1,3-BDO途径酶对于它们的底物没有足够的选择性，所述1,3-BDO途径跨多个隔室也可以是有利的。例如，3-羟基丁酰辅酶A还原酶和3-羟基丁醛酶也可以将乙酰辅酶A还原为乙醇。因此，线粒体中的乙酰辅酶A库的隔离可以减少从乙酰辅酶A衍生出的副产物的形成。组合的线粒体/细胞溶质1,3-BDO途径可以受益于消耗线粒体乙酰辅酶A的酶或途径(诸如TCA循环)的减弱。
丙酮酸和/或单羧酸转运蛋白会容易地将乙酰乙酸和3-羟基丁酸运输出线粒体。在分离的线粒体中证实了用于丙酮酸摄取以及用于乙酰乙酸的质子共输送体的存在(Briquet,Biochem Biophys Acta459:290-99(1977))。但是，迄今为止尚未鉴别出编码该转运蛋白的基因。酿酒酵母编码5种假定的单羧酸转运蛋白(MCH1-5)，其中的几种可以集中至线粒体膜(Makuc等人,Yeast18:1131-43(2001))。NDT1是另一种假定的丙酮酸转运蛋白，尽管该蛋白的作用在文献中存在争议(Todisco等人,J Biol Chem20:1524-31(2006))。下表显示了示例性的单羧酸转运蛋白：
表1
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
MCH1 NP_010229.1 6320149 酿酒酵母
MCH2 NP_012701.2 330443640 酿酒酵母
MCH3 NP_014274.1 6324204 酿酒酵母
MCH5 NP_014951.2 330443742 酿酒酵母
NDT1 NP_012260.1 6322185 酿酒酵母
ANI_1_1592184 XP_001401484.2 317038471 黑曲霉
CaJ7_0216 XP_888808.1 77022728 白色假丝酵母
YALI0E16478g XP_504023.1 50553226 解脂耶氏酵母
KLLA0D14036g XP_453688.1 50307419 乳酸克鲁维酵母
在某些实施方案中，所述组合的线粒体/细胞溶质1,3-BDO途径包含：8A，8B，8C，8D，8E，8F，8G，8H，8I，8J，8K，7E，7F，4A，4B，4C，4D，4E，4F，4G，4H，4I，4J，4K，4L，4M，4N，和4O，或其中8A、8B、8C、8D、8E、8F、8G、8H、8I、8J、8K、7E、7F、4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I、4J、4K、4L、4M、4N和4O的任意组合，其中8A是线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶；8B是线粒体乙酰乙酰辅酶A还原酶；8C是线粒体乙酰乙酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；8D是线粒体3-羟基丁酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；8E是线粒体3-羟基丁酸脱氢酶；8F是乙酰乙酸转运蛋白；8G是3-羟基丁酸转运蛋白；8H是3-羟基丁酰辅酶A转移酶或合成酶，8I是细胞溶质乙酰乙酰辅酶A转移酶或合成酶，8J是线粒体乙酰辅酶A羧化酶；8K是线粒体乙酰乙酰辅酶A合酶；7E是乙酰辅酶A羧化酶，7F是乙酰乙酰辅酶A合酶，4A是乙酰乙酰辅酶A硫解酶；4B是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)；4C是3-氧代丁醛还原酶(醛还原)；4D是4-羟基，2-丁酮还原酶；4E是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)；4F是3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；4G是3-羟基丁醛还原酶；4H是乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)；4I是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)；4J是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)；4K是乙酰乙酰辅酶A转移酶、乙酰乙酰辅酶A水解酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶、或磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶；4L是乙酰乙酸还原酶；4M是3-羟基丁酰辅酶A转移酶、水解酶或合成酶；4N是3-羟基丁酸还原酶；且其中4O是3-羟基丁酸脱氢酶。在某些实施方案中，8C是线粒体乙酰乙酰辅酶A水解酶。在其它实施方案中，8C是线粒体乙酰乙酰辅酶A转移酶。在某些实施方案中，8C是线粒体乙酰乙酰辅酶A合成酶。在某些实施方案中8D是线粒体3-羟基丁酰辅酶A水解酶。在其它实施方案中，8D是线粒体3-羟基丁酰辅酶A转移酶。在某些实施方案中8D是线粒体3-羟基丁酰辅酶A合成酶。在某些实施方案中，8H是3-羟基丁酰辅酶A转移酶。在其它实施方案中，8H是3-羟基丁酰辅酶A合成酶。在某些实施方案中，8I是细胞溶质乙酰乙酰辅酶A转移酶。在其它实施方案中，8I是细胞溶质乙酰乙酰辅酶A合成酶。在某些实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A转移酶。在其它实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A水解酶。在某些实施方案中，4K是乙酰乙酰辅酶A合成酶。在其它实施方案中，4K是磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶。在某些实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A转移酶。在某些实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A水解酶。在其它实施方案中，4M是3-羟基丁酰辅酶A合成酶。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)乙酰乙酸途径，其中所述生物包含至少一种编码乙酰乙酸途径酶的外源核酸，所述乙酰乙酸途径酶以足以增加所述生物的细胞溶质中的乙酰乙酸的量表达，其中所述乙酰乙酸途径包含8A、8C和8F，其中8A是线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶；8C是线粒体乙酰乙酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；且8F是乙酰乙酸转运蛋白；和(2)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以在所述生物的细胞溶质中生产1,3-BDO的量表达，且其中所述1,3-BDO途径包含选自以下的途径：(i)4O、4N和4G；和(ii)4L、4F和4G；其中4F是3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；4G是3-羟基丁醛还原酶；4L是乙酰乙酸还原酶；4N是3-羟基丁酸还原酶；和4O是3-羟基丁酸脱氢酶。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4O、4N和4G。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4L、4F和4G。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)乙酰乙酸途径，其中所述生物包含至少一种编码乙酰乙酸途径酶的外源核酸，所述乙酰乙酸途径酶以足以增加所述生物的细胞溶质中的乙酰乙酸的量表达，其中所述乙酰乙酸途径包含：8J、8K、8C和8F，其中8J是线粒体乙酰辅酶A羧化酶；8K是线粒体乙酰乙酰辅酶A合酶；8C是线粒体乙酰乙酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；且8F是乙酰乙酸转运蛋白；和(2)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以在所述生物的细胞溶质中生产1,3-BDO的量表达，且其中所述1,3-BDO途径包含选自以下的途径：(i)4O、4N和4G；和(ii)4L、4F和4G；其中4F是3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；4G是3-羟基丁醛还原酶；4L是乙酰乙酸还原酶；4N是3-羟基丁酸还原酶；且4O是3-羟基丁酸脱氢酶。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4O、4N和4G。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4L、4F和4G。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)乙酰乙酰辅酶A途径，其中所述生物包含至少一种编码乙酰乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰乙酰辅酶A途径酶以足以增加所述生物的细胞溶质中的乙酰乙酰辅酶A的量表达，其中所述乙酰乙酰辅酶A途径包含8A、8C、8F和8I，其中8A是线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶；8C是线粒体乙酰乙酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；8F是乙酰乙酸转运蛋白；且8I是细胞溶质乙酰乙酰辅酶A转移酶或合成酶；和(2)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以在所述生物的细胞溶质中生产1,3-BDO的量表达，且其中所述1,3-BDO途径包含选自以下的途径：(i)4E、4F和4G；(ii)4B和4D；(iii)4E、4C和4D；(iv)4H和4J；(v)4H、4I和4G；和(vi)4H、4M、4N和4G；其中4B是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)；4C是3-氧代丁醛还原酶(醛还原)；4D是4-羟基,2-丁酮还原酶；4E是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)；4F是3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；4G是3-羟基丁醛还原酶；4H是乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)；4I是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)；4J是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)；4L是乙酰乙酸还原酶；4M是3-羟基丁酰辅酶A转移酶、水解酶或合成酶；且4N是3-羟基丁酸还原酶。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4E、4F和4G。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4B和4D。在其它实施方案中，1,3-BDO途径包含4E、4C和4D。在另一个实施方案中，1,3-BDO途径包含4H和4J。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4H、4I和4G。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4H、4M、4N和4G。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)乙酰乙酰辅酶A途径，其中所述生物包含至少一种编码乙酰乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰乙酰辅酶A途径酶以足以增加所述生物的细胞溶质中的乙酰乙酰辅酶A的量表达，其中所述乙酰乙酰辅酶A途径包含8J、8K、8C、8F和8I，其中8J是线粒体乙酰辅酶A羧化酶；8K是线粒体乙酰乙酰辅酶A合酶；8C是线粒体乙酰乙酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；8F是乙酰乙酸转运蛋白；且8I是细胞溶质乙酰乙酰辅酶A转移酶或合成酶；和(2)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以在所述生物的细胞溶质中生产1,3-BDO的量表达，且其中所述1,3-BDO途径包含选自以下的途径：(i)4E、4F和4G；(ii)4B和4D；(iii)4E、4C和4D；(iv)4H和4J；(v)4H、4I和4G；和(vi)4H、4M、4N和4G；其中4B是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)；4C是3-氧代丁醛还原酶(醛还原)；4D是4-羟基,2-丁酮还原酶；4E是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)；4F是3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；4G是3-羟基丁醛还原酶；4H是乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)；4I是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)；4J是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)；4L是乙酰乙酸还原酶；4M是3-羟基丁酰辅酶A转移酶、水解酶或合成酶；且4N是3-羟基丁酸还原酶。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4E、4F和4G。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4B和4D。在其它实施方案中，1,3-BDO途径包含4E、4C和4D。在另一个实施方案中，1,3-BDO途径包含4H和4J。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4H、4I和4G。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4H、4M、4N和4G。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)3-羟基丁酸途径，其中所述生物包含至少一种编码3-羟基丁酸途径酶的外源核酸，所述3-羟基丁酸途径酶以足以增加所述生物的细胞溶质中的3-羟基丁酸的量表达，其中所述3-羟基丁酸途径包含选自以下的途径：(i)8A、8B、8D和8G；和(ii)8A、8C、8E和8G；其中8A是线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶；8B是线粒体乙酰乙酰辅酶A还原酶；8C是线粒体乙酰乙酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；8D是线粒体3-羟基丁酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；8E是线粒体3-羟基丁酸脱氢酶；且8G是3-羟基丁酸转运蛋白；和(2)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以在所述生物的细胞溶质中生产1,3-BDO的量表达，且其中所述1,3-BDO途径包含4N和4G，其中4G是3-羟基丁醛还原酶；且4N是3-羟基丁酸还原酶。在一个实施方案中，所述3-羟基丁酸途径包含：8A、8B、8D和8G。在另一个实施方案中，所述3-羟基丁酸途径包含：8A、8C、8E和8G。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)3-羟基丁酸途径，其中所述生物包含至少一种编码3-羟基丁酸途径酶的外源核酸，所述3-羟基丁酸途径酶以足以增加所述生物的细胞溶质中的3-羟基丁酸的量表达，其中所述3-羟基丁酸途径包含选自以下的途径：(i)8J、8K、8B、8D和8G；和(ii)8J、8K、8C、8E和8G；其中8J是线粒体乙酰辅酶A羧化酶；8K是线粒体乙酰乙酰辅酶A合酶；8B是线粒体乙酰乙酰辅酶A还原酶；8C是线粒体乙酰乙酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；8D是线粒体3-羟基丁酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；8E是线粒体3-羟基丁酸脱氢酶；且8G是3-羟基丁酸转运蛋白；和(2)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以在所述生物的细胞溶质中生产1,3-BDO的量表达，且其中所述1,3-BDO途径包含4N和4G，其中4G是3-羟基丁醛还原酶；且4N是3-羟基丁酸还原酶。在一个实施方案中，所述3-羟基丁酸途径包含：8J、8K、8B、8D和8G。在另一个实施方案中，所述3-羟基丁酸途径包含：8J、8K、8C、8E和8G。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)3-羟基丁酰辅酶A途径，其中所述生物包含至少一种编码3-羟基丁酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述3-羟基丁酰辅酶A途径酶以足以增加所述生物的细胞溶质中的3-羟基丁酰辅酶A的量表达，其中所述3-羟基丁酰辅酶A途径包含选自以下的途径：(i)8A、8B、8D、8G和8H；和(ii)8A、8C、8E、8G和8H；其中8A是线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶；8B是线粒体乙酰乙酰辅酶A还原酶；8C是线粒体乙酰乙酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；8D是线粒体3-羟基丁酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；8E是线粒体3-羟基丁酸脱氢酶；8G是3-羟基丁酸转运蛋白；且8H是3-羟基丁酰辅酶A转移酶或合成酶，和(2)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以在所述生物的细胞溶质中生产1,3-BDO的量表达，且其中所述1,3-BDO途径包含选自以下的途径：(i)4I和4G；和(ii)4J；其中4I是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)；其中4G是3-羟基丁醛还原酶；且4J是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)。在某些实施方案中，所述3-羟基丁酰辅酶A途径包含：8A、8B、8D、8G、和8H，且所述1,3-BDO途径包含4I和4G。在其它实施方案中，所述3-羟基丁酰辅酶A途径包含：8A、8B、8D、8G和8H，且所述1,3-BDO途径包含4J。在另一个实施方案中，所述3-羟基丁酰辅酶A途径包含：8A、8C、8E、8G和8H，且所述1,3-BDO途径包含4I和4G。在另一个实施方案中，所述3-羟基丁酰辅酶A途径包含：8A、8C、8E、8G和8H，且所述1,3-BDO途径包含4J。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)3-羟基丁酰辅酶A途径，其中所述生物包含至少一种编码3-羟基丁酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述3-羟基丁酰辅酶A途径酶以足以增加所述生物的细胞溶质中的3-羟基丁酰辅酶A的量表达，其中所述3-羟基丁酰辅酶A途径包含选自以下的途径：(i)8J、8K、8B、8D、8G和8H；和(ii)8J、8K、8C、8E、8G和8H；其中8J是线粒体乙酰辅酶A羧化酶；8K是线粒体乙酰乙酰辅酶A合酶；8B是线粒体乙酰乙酰辅酶A还原酶；8C是线粒体乙酰乙酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；8D是线粒体3-羟基丁酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；8E是线粒体3-羟基丁酸脱氢酶；8G是3-羟基丁酸转运蛋白；且8H是3-羟基丁酰辅酶A转移酶或合成酶，和(2)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以在所述生物的细胞溶质中生产1,3-BDO的量表达，且其中所述1,3-BDO途径包含选自以下的途径：(i)4I和4G；和(ii)4J；其中4I是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)；其中4G是3-羟基丁醛还原酶；且4J是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)。在某些实施方案中，所述3-羟基丁酰辅酶A途径包含：8A、8B、8D、8G和8H，且所述1,3-BDO途径包含4I和4G。在其它实施方案中，所述3-羟基丁酰辅酶A途径包含：8A、8B、8D、8G和8H，且所述1,3-BDO途径包含4J。在另一个实施方案中，所述3-羟基丁酰辅酶A途径包含：8J、8K、8C、8E、8G和8H，且所述1,3-BDO途径包含4I和4G。在另一个实施方案中，所述3-羟基丁酰辅酶A途径包含：8J、8K、8C、8E、8G和8H，且所述1,3-BDO途径包含4J。
本领域技术人员会理解，这些仅仅是示例性的，并且本领域技术人员基于本文中的教导可以容易地确定本文中公开的任意底物-产物对，其适合于产生期望的产物且可得到用于将所述底物转化成所述产物的适当活性。因而，本文提供了非天然存在的真核生物，其包含至少一种编码酶或蛋白的外源核酸，其中所述酶或蛋白转化组合的线粒体/细胞溶质1,3-BDO途径的底物和产物，诸如图8所示的那些。
可以将任意组合和任意数目的前述酶引入宿主真核生物中以完成如在图8中举例说明的组合的线粒体/细胞溶质1,3-BDO途径。例如，非天然存在的真核生物可以包括组合的线粒体/细胞溶质1,3-BDO途径中的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、至多所有核酸，每种核酸编码组合的线粒体/细胞溶质1,3-BDO途径酶。这样的核酸可以包括异源核酸、现有基因的额外拷贝、和基因调节元件，这在下面进一步解释。本文提供的非天然存在的真核生物的途径也适当地经工程改造以在基本上厌氧的培养基中培养。
4.4平衡辅因子使用
1,3-BDO生产途径(诸如图4中描绘的那些)需要还原的辅因子诸如NAD(P)H。因此，通过将本文描述的任意非天然存在的真核生物工程改造成包含供给在1,3-BDO生产途径中使用的NAD(P)H辅因子的途径，可以部分地实现增加的1,3-BDO生产。在几种生物(包括真核生物，诸如几个酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、曲霉菌属(Aspergillus)和子囊菌酵母属(Yarrowia)物种)中，NADH比NADPH在细胞溶质中更丰富，因为NADH通过糖酵解大量产生。通过下述酶或酶集合中的任一种将丙酮酸转化成乙酰辅酶A，可以增加这些真核生物中的NADH水平：1)NAD依赖性的丙酮酸脱氢酶；2)丙酮酸甲酸裂合酶和NAD依赖性的甲酸脱氢酶；3)丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和NADH:铁氧还蛋白氧化还原酶；4)丙酮酸脱羧酶和NAD依赖性的酰化乙酰基醛脱氢酶；5)丙酮酸脱羧酶、NAD依赖性的酰化乙醛脱氢酶、乙酸激酶和磷酸转乙酰酶；和6)丙酮酸脱羧酶、NAD依赖性的酰化乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶。
如在图4中所示，乙酰辅酶A至1,3-BDO的转化可以部分地通过3个还原步骤来实现。这3个还原步骤中的每一个都利用NADPH或NADH作为还原剂，所述还原剂又分别被转化成NADP或NAD分子。鉴于有些生物的细胞溶质中的NADH的丰度，在某些实施方案中可能有益的是，1,3-BDO途径的所有还原步骤接受NADH作为还原剂。因此，可以如下实现1,3-BDO的高收率：1)鉴别和实现对NADH的偏好强于其它还原当量诸如NADPH的内源性或外源性1,3-BDO途径酶；2)减弱一种或多种促进NADPH依赖性的还原活性的内源性1,3-BDO途径酶；3)改变内源性或外源性1,3-BDO途径酶的辅因子特异性，使得它们对NADH的偏好强于它们的天然形式，和/或4)改变内源性或外源性1,3-BDO途径酶的辅因子特异性，使得它们对NADPH的偏好弱于它们的天然形式。
在另一个方面，本文提供了一种用于选择要引入非天然存在的真核生物中的外源性1,3-BDO途径酶的方法，其中所述外源性1,3-BDO途径酶在所述生物中以足以生产1,3-BDO的量表达，所述方法包括：(i)测量至少一种1,3-BDO途径酶的活性，所述1,3-BDO途径酶使用NADH作为辅因子；(ii)测量至少一种1,3-BDO途径酶的活性，所述1,3-BDO途径酶使用NADPH作为辅因子；和(iii)向所述生物中引入至少一种1,3-BDO途径酶，所述1,3-BDO途径酶对NADH作为辅因子的偏好大于NADPH，如在步骤(i)和(ii)中所确定的。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物进一步包含：(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和(2)乙酰辅酶A途径，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的内源和/或外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以增加所述生物中的NADH的量表达；其中所述乙酰辅酶A途径包含：(i.)NAD依赖性的丙酮酸脱氢酶；(ii.)丙酮酸甲酸裂合酶和NAD依赖性的甲酸脱氢酶；(iii.)丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和NADH:铁氧还蛋白氧化还原酶；(iv.)丙酮酸脱羧酶和NAD依赖性的酰化乙酰基醛脱氢酶；(v.)丙酮酸脱羧酶、NAD依赖性的酰化乙醛脱氢酶、乙酸激酶和磷酸转乙酰酶；或(vi.)丙酮酸脱羧酶、NAD依赖性的酰化乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶。在某些实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含NAD依赖性的丙酮酸脱氢酶。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含丙酮酸甲酸裂合酶和NAD依赖性的甲酸脱氢酶。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A包含丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和NADH:铁氧还蛋白氧化还原酶。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A包含丙酮酸脱羧酶和NAD依赖性的酰化乙酰基醛脱氢酶。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A包含丙酮酸脱羧酶、NAD依赖性的酰化乙醛脱氢酶、乙酸激酶和磷酸转乙酰酶。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A包含丙酮酸脱羧酶、NAD依赖性的酰化乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物进一步包含一种或多种内源和/或外源核酸，所述核酸编码选自以下的1,3-BDO途径酶：4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I、4J、4L、4N和4O；其中至少一种核酸已经被改变，使得由所述核酸编码的1,3-BDO途径酶具有与由未改变的或野生型核酸编码的1,3-BDO途径酶相比更大的对NADH的亲和力。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4B的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4C的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4D的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4E的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4F的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4G的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4H的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4I的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4J的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4L的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4N的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4O的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4B和4D的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4E、4C和4D的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4E、4F和4G的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4L、4F和4G的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4H、4N和4G的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4H和4J的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4H的核酸、4I和4G。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4L、4F和4G的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4O、4N和4G的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4A、4N和4G的核酸。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物进一步包含一种或多种内源和/或外源核酸，所述核酸编码减弱的选自以下的1,3-BDO途径酶：4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I、4J、4L、4N和4O；其中所述减弱的1,3-BDO途径酶是NAPDH依赖性的，且具有与由未改变的或野生型核酸编码的1,3-BDO途径酶相比降低的酶活性。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4B的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4C的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4D的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4E的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4F的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4G的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4H的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4I的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4J的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4N的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4O的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4B和4D的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4E、4C和4D的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4E、4F和4G的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4L、4F和4G的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4H、4N和4G的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4H和4J的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4H的核酸、4I和4G。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4L、4F和4G的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4O、4N和4G的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4A、4N和4G的核酸。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物进一步包含一种或多种内源和/或外源核酸，所述核酸编码选自以下的1,3-BDO途径酶：4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I、4J、4L、4N和4O；其中至少一种核酸已经被改变，使得由所述核酸编码的1,3-BDO途径酶具有与由未改变的或野生型核酸编码的1,3-BDO途径酶相比更小的对NADPH的亲和力。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4B的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4C的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4D的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4E的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4F的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4G的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4H的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4I的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4J的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4N的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4O的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4B和4D的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4E、4C和4D的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4E、4F和4G的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4L、4F和4G的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4H、4N和4G的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4H和4J的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4H的核酸、4I和4G。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4L、4F和4G的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4O、4N和4G的核酸。在某些实施方案中，所述真核生物包含编码4A、4N和4G的核酸。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物进一步包含一种或多种内源和/或外源核酸，所述核酸编码选自以下的1,3-BDO途径酶：4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I、4J、4L、4N和4O；其中所述真核生物包含一种或多种基因破坏，所述基因破坏会减弱内源性NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的活性。
可替换地，在某些实施方案中，所述真核生物包含1,3-BDO途径，其中一种或多种1,3-BDO途径酶利用NADPH作为辅因子。因此，可以有益的是，增加这些真核生物中的NADPH的生产，以实现更大的1,3-BDO收率。可以实现几个用于增加NADPH的细胞溶质生产的方案，包括：与野生型相比将增加量的通量引导穿过戊糖磷酸途径的氧化支路，与野生型相比将增加量的通量引导穿过恩特纳-杜德洛夫途径，引导可溶性的或膜结合的转氢酶以将NADH转化成NADPH，或采用下述酶的NADP依赖性的形式：磷酸化或非磷酸化3-磷酸甘油醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、甲酸脱氢酶或酰化乙酰基醛脱氢酶。通过消除或减弱天然的NAD依赖性的酶(包括3-磷酸甘油醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、甲酸脱氢酶或酰化乙酰基醛脱氢酶)，可以增强用于增加NADPH的细胞溶质生产的方法。在实施例IX中描述了用于工程改造增加的NADPH可用性的方法。
在本文提供的另一个方面，是非天然存在的真核生物，其包含：(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和(2)戊糖磷酸途径，其中所述生物包含至少一种编码戊糖磷酸途径酶的内源和/或外源核酸，所述戊糖磷酸途径酶选自：6-磷酸葡萄糖脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶和6磷酸葡萄糖酸脱氢酶(脱羧)。在某些实施方案中，所述生物进一步包含遗传改变，所述遗传改变增加进入戊糖磷酸途径的代谢通量。
在本文提供的另一个方面，是非天然存在的真核生物，其包含：(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和(2)恩特纳-杜德洛夫途径，其中所述生物包含至少一种编码恩特纳-杜德洛夫途径酶的内源和/或外源核酸，所述恩特纳-杜德洛夫途径酶选自：6-磷酸葡萄糖脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、磷酸葡糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶。在某些实施方案中，所述生物进一步包含遗传改变，所述遗传改变增加进入恩特纳-杜德洛夫途径的代谢通量。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物进一步包含：(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和(2)编码可溶性的或膜结合的转氢酶的内源和/或外源核酸，其中所述转氢酶以足以将NADH转化成NADPH的水平表达。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和(2)内源和/或外源核酸，其编码NADP依赖性的磷酸化或非磷酸化3-磷酸甘油醛脱氢酶。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和(2)乙酰辅酶A途径，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的内源和/或外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以增加所述生物中的NADPH的量表达；其中所述乙酰辅酶A途径包含：(i)NADP依赖性的丙酮酸脱氢酶；(ii)丙酮酸甲酸裂合酶和NADP依赖性的甲酸脱氢酶；(iii)丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和NADPH:铁氧还蛋白氧化还原酶；(iv)丙酮酸脱羧酶和NADP依赖性的酰化乙酰基醛脱氢酶；(v)丙酮酸脱羧酶、NADP依赖性的酰化乙醛脱氢酶、乙酸激酶和磷酸转乙酰酶；或(vi)丙酮酸脱羧酶、NADP依赖性的酰化乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶。在一个实施方案中，所述乙酰辅酶A途径包含NADP依赖性的丙酮酸脱氢酶。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A包含丙酮酸甲酸裂合酶和NADP依赖性的甲酸脱氢酶。在其它实施方案中，所述乙酰辅酶A包含丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和NADPH:铁氧还蛋白氧化还原酶。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A包含丙酮酸脱羧酶和NADP依赖性的酰化乙酰基醛脱氢酶。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A包含丙酮酸脱羧酶、NADP依赖性的酰化乙醛脱氢酶、乙酸激酶和磷酸转乙酰酶。在另一个实施方案中，所述乙酰辅酶A包含丙酮酸脱羧酶、NADP依赖性的酰化乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶。在另一个实施方案中，所述生物进一步包含一种或多种基因破坏，所述基因破坏会减弱内源性的NAD依赖性的丙酮酸脱氢酶、NAD依赖性的甲酸脱氢酶、NADH:铁氧还蛋白氧化还原酶、NAD依赖性的酰化乙酰基醛脱氢酶或NAD依赖性的酰化乙醛脱氢酶的活性。在某些实施方案中，所述生物进一步包含一种或多种基因破坏，所述基因破坏会减弱内源性的NAD依赖性的丙酮酸脱氢酶、NAD依赖性的甲酸脱氢酶、NADH:铁氧还蛋白氧化还原酶、NAD依赖性的酰化乙酰基醛脱氢酶或NAD依赖性的酰化乙醛脱氢酶的活性。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其包含：(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和(2)一种或多种编码NAD(P)H辅因子酶的内源和/或外源核酸，所述NAD(P)H辅因子酶选自磷酸化或非磷酸化3-磷酸甘油醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和酰化乙酰基醛脱氢酶；其中所述一种或多种编码NAD(P)H辅因子酶的核酸已经被改变，使得由所述核酸编码的NAD(P)H辅因子酶具有与由未改变的或野生型核酸编码的NAD(P)H辅因子酶相比更大的对NADPH的亲和力。在一个实施方案中，所述NAD(P)H辅因子酶是磷酸化或非磷酸化3-磷酸甘油醛脱氢酶。在另一个实施方案中，所述NAD(P)H辅因子酶是丙酮酸脱氢酶。在另一个实施方案中，所述NAD(P)H辅因子酶是甲酸脱氢酶。在另一个实施方案中，所述NAD(P)H辅因子酶是酰化乙酰基醛脱氢酶。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物进一步包含：(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和(2)一种或多种编码NAD(P)H辅因子酶的内源和/或外源核酸，所述NAD(P)H辅因子酶选自磷酸化或非磷酸化3-磷酸甘油醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和酰化乙酰基醛脱氢酶；其中所述一种或多种编码NAD(P)H辅因子酶的核酸已经被改变，使得它编码的NAD(P)H辅因子酶具有与由未改变的或野生型核酸编码的NAD(P)H辅因子酶相比更小的对NADH的亲和力。在一个实施方案中，所述NAD(P)H辅因子酶是磷酸化或非磷酸化3-磷酸甘油醛脱氢酶。在另一个实施方案中，所述NAD(P)H辅因子酶是丙酮酸脱氢酶。在另一个实施方案中，所述NAD(P)H辅因子酶是甲酸脱氢酶。在另一个实施方案中，所述NAD(P)H辅因子酶是酰化乙酰基醛脱氢酶。
在上面提供的真核生物的一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。在另一个实施方案中，所述真核生物进一步包含选自以下的乙酰辅酶A途径：(i)2A、2B和2D；(ii)2A、2C和2D；(iii)2A、2B、2E和2F；(iv)2A、2C、2E和2F；(v)2A、2B、2E、2K和2L；(vi.)2A、2C、2E、2K和2L；(vii)5A和5B；(viii)5A、5C和5D；(ix)5E、5F、5C和5D；(x)5G和5D；(xi)6A、6D和6C；(xii)6B、6E和6C；(xiii)10A、10B和10C；(xiv)10N、10H、10B和10C；(xv)10N、10L、10M、10B和10C；(xvi)10A、10B、10G和10D；(xvii)10N、10H、10B、10G和10D；(xviii)10N、10L、10M、10B、10G和10D；(xix)10A、10B、10J、10K和10D；(xx)10N、10H、10B、10J、10K和10D；(xxi)10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；(xxii)10A、10F和10D；(xxiii)10N、10H、10F和10D；和(xxiv)10N、10L、10M、10F和10D。
在上面提供的真核生物的另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。在另一个实施方案中，所述真核生物进一步包含选自以下的乙酰辅酶A途径：(i)2A、2B和2D；(ii)2A、2C和2D；(iii)2A、2B、2E和2F；(iv)2A、2C、2E和2F；(v)2A、2B、2E、2K和2L；(vi.)2A、2C、2E、2K和2L；(vii)5A和5B；(viii)5A、5C和5D；(ix)5E、5F、5C和5D；(x)5G和5D；(xi)6A、6D和6C；(xii)6B、6E和6C；(xiii)10A、10B和10C；(xiv)10N、10H、10B和10C；(xv)10N、10L、10M、10B和10C；(xvi)10A、10B、10G和10D；(xvii)10N、10H、10B、10G和10D；(xviii)10N、10L、10M、10B、10G和10D；(xix)10A、10B、10J、10K和10D；(xx)10N、10H、10B、10J、10K和10D；(xxi)10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；(xxii)10A、10F和10D；(xxiii)10N、10H、10F和10D；和(xxiv)10N、10L、10M、10F和10D。
4.5氧化还原比率的增加
真核生物的细胞溶质中的1,3-BDO的合成需要足够的碳和还原当量的可用性。因此，不受限于任何特定工作理论，增加NAD(P)H与NAD(P)的氧化还原比率可以帮助在正向方向驱动1,3-BDO途径。用于增加NAD(P)H与NAD(P)的氧化还原比率的方法包括：限制呼吸，减弱或消除产生还原的副产物的竞争途径，减弱或消除NADH脱氢酶对NADH的使用，和减弱或消除隔室之间的氧化还原穿梭。
一种示例性的提供增加数目的用于实现1,3-BDO形成的还原当量(诸如NAD(P)H)的方法是，限制这样的还原当量在呼吸过程中的使用。可以如下限制呼吸：减少氧的可用性，减弱NADH脱氢酶和/或细胞色素氧化酶活性，减弱G3P脱氢酶，和/或给Crabtree阳性的生物提供过量的葡萄糖。
通过在发酵罐中培养非天然存在的真核生物来限制氧可用性，是一个用于限制呼吸并由此增加NAD(P)H与NAD(P)的比率的方案。NAD(P)H/NAD(P)的比率随着培养条件变得更厌氧而增加，完全厌氧的条件会提供最高的还原态辅因子与氧化态辅因子的比率。例如，已经报道，在大肠杆菌中，NADH/NAD的比率在好氧条件下为0.02，在厌氧条件下为0.75(de Graes等人,J Bacteriol181:2351-57(1999))。
通过在好氧条件下减少细胞中的NADH脱氢酶和/或细胞色素氧化酶的表达或活性，也可以限制呼吸。在该情况下，呼吸将受电子传递链的能力限制。这样的方案已经用于在完全好氧条件下实现大肠杆菌的厌氧代谢(Portnoy等人,AEM74:7561-9(2008))。酿酒酵母可以使用由NDE1和NDE2编码的外部NADH脱氢酶直接氧化细胞溶质NADH。在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中的一种这样的NADH脱氢酶由NDH2编码(Kerscher等人,J Cell Sci112:2347-54(1999))。在下表中列出了这些和其它NADH脱氢酶。
表2
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
NDE1 NP_013865.1 6323794 酿酒酵母s288c
NDE2 NP_010198.1 6320118 酿酒酵母s288c
NDH2 AJ006852.1 3718004 解脂耶氏酵母
ANI_1_610074 XP_001392541.2 317030427 黑曲霉
ANI_1_2462094 XP_001394893.2 317033119 黑曲霉
KLLA0E21891g XP_454942.1 50309857 乳酸克鲁维酵母
KLLA0C06336g XP_452480.1 50305045 乳酸克鲁维酵母
NDE1 XP_720034.1 68471982 白色假丝酵母
NDE2 XP_717986.1 68475826 白色假丝酵母
酿酒酵母的细胞色素氧化酶包括COX基因产物。COX1-3是由线粒体基因组编码的3核心亚基，而COX4-13由核基因编码。任意细胞色素基因的减弱或缺失会导致呼吸生长的减少或阻断(Hermann和Funes,Gene354:43-52(2005))。通过序列同源性可以推断出其它生物中的细胞色素氧化酶基因。
表3
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
COX1 CAA09824.1 4160366 酿酒酵母s288c
COX2 CAA09845.1 4160387 酿酒酵母s288c
COX3 CAA09846.1 4160389 酿酒酵母s288c
COX4 NP_011328.1 6321251 酿酒酵母s288c
COX5A NP_014346.1 6324276 酿酒酵母s288c
COX5B NP_012155.1 6322080 酿酒酵母s288c
COX6 NP_011918.1 6321842 酿酒酵母s288c
COX7 NP_013983.1 6323912 酿酒酵母s288c
COX8 NP_013499.1 6323427 酿酒酵母s288c
COX9 NP_010216.1 6320136 酿酒酵母s288c
COX12 NP_013139.1 6323067 酿酒酵母s288c
COX13 NP_011324.1 6321247 酿酒酵母s288c
在本文提供的一个方面，是一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码NADH脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的NADH脱氢酶；和/或(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有NADH脱氢酶酶活性。在一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码NADH脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(ii)表达减弱的NADH脱氢酶。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码NADH脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有NADH脱氢酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的NADH脱氢酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有NADH脱氢酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码NADH脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的NADH脱氢酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有NADH脱氢酶酶活性。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码细胞色素氧化酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的细胞色素氧化酶；和/或(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有细胞色素氧化酶酶活性。在一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码细胞色素氧化酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(ii)表达减弱的细胞色素氧化酶。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码细胞色素氧化酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有细胞色素氧化酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的细胞色素氧化酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有细胞色素氧化酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码细胞色素氧化酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的细胞色素氧化酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有细胞色素氧化酶酶活性。
在某些实施方案中，细胞溶质NADH还可以经由G3P脱氢酶穿梭被呼吸链氧化，所述G3P脱氢酶穿梭由细胞溶质NADH-连接的G3P脱氢酶和膜结合的G3P:泛醌氧化还原酶组成。G3P脱氢酶的缺失或减弱也会阻止用于呼吸的NADH的氧化。酿酒酵母具有3种G3P脱氢酶，它们由在细胞溶质中的GPD1和GDP2和在线粒体中的GUT2编码。已知GPD2编码这样的酶：其负责大多数甘油形成，且负责在厌氧条件下维持氧化还原平衡。GPD1主要负责酿酒酵母对渗透胁迫的适应(Bakker等人,FEMSMicrobiol Rev24:15-37(2001))。GPD1、GPD2和/或GUT2的减弱会减少甘油形成。GPD1和GUT2在解脂耶氏酵母中编码G3P脱氢酶(Beopoulos等人,AEM74:7779-89(2008))。GPD1和GPD2在粟酒裂殖酵母中编码G3P脱氢酶。类似地，G3P脱氢酶在热带假丝酵母(Candida tropicalis)中由CTRG_02011编码，且在白色假丝酵母(Candida albicans)中由GI:20522022代表的基因编码。
表4
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
GPD1 CAA98582.1 1430995 酿酒酵母
GPD2 NP_014582.1 6324513 酿酒酵母
GUT2 NP_012111.1 6322036 酿酒酵母
GPD1 CAA22119.1 6066826 解脂耶氏酵母
GUT2 CAG83113.1 49646728 解脂耶氏酵母
GPD1 CAA22119.1 3873542 粟酒裂殖酵母
GPD2 CAA91239.1 1039342 粟酒裂殖酵母
ANI_1_786014 XP_001389035.2 317025419 黑曲霉
ANI_1_1768134 XP_001397265.1 145251503 黑曲霉
KLLA0C04004g XP_452375.1 50304839 乳酸克鲁维酵母
CTRG_02011 XP_002547704.1 255725550 热带假丝酵母
GPD1 XP_714362.1 68483412 白色假丝酵母
GPD2 XP_713824.1 68484586 白色假丝酵母
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，其中所述非天然存在的真核生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码G3P脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的G3P脱氢酶；(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P脱氢酶酶活性；和/或(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的甘油。在一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码G3P脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(ii)表达减弱的G3P脱氢酶。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码G3P脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P脱氢酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码G3P脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏和(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的甘油。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的G3P脱氢酶和(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P脱氢酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的G3P脱氢酶；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的甘油。在另一个实施方案中，所述生物(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P脱氢酶酶活性；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的甘油。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码G3P脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的G3P脱氢酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P脱氢酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码G3P脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的G3P脱氢酶；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的甘油。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码G3P脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的G3P脱氢酶；(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P脱氢酶酶活性；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的甘油。
另外，在Crabtree阳性的生物中，在有过量的葡萄糖存在下可以实现发酵代谢。例如，酿酒酵母甚至在好氧条件下利用乙醇。通过将过量的葡萄糖饲喂给Crabtree阳性的生物，可以在Crabtree阳性的生物中减少/消除乙醇和甘油的形成，和用1,3-BDO的生产来替换乙醇和甘油的形成。在另一个方面，本文提供了一种生产1,3-BDO的方法，所述方法包括：在一定条件下培养非天然存在的真核生物足够的时间段以生产1,3-BDO，其中所述真核生物是Crabtree阳性的生物，其包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，且其中真核生物是在包含过量的葡萄糖的培养基中。
阻止还原的发酵副产物的形成还可以增加用于1,3-BDO的碳和还原当量的可用性。在厌氧和微好氧条件下的2种关节的还原副产物是乙醇和甘油。在由丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶催化的2个酶促步骤中，可以从丙酮酸形成乙醇。通过酶G3P脱氢酶和G3P磷酸酶，可以从糖酵解中间体二羟基丙酮磷酸酯形成甘油。本文提供的真核生物中的这些酶活性中的一种或多种的减弱可以增加1,3-BDO的收率。在本文别处更详细地描述了用于减少或消除乙醇和甘油形成的菌株工程改造方法。
乙酰辅酶A向乙醇的转化对于1,3-BDO的生产可以是有害的，因为所述转化过程可以从1,3-BDO途径抽走碳和还原当量。在由丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶催化的2个酶促步骤中，可以从丙酮酸形成乙醇。酿酒酵母具有3种丙酮酸脱羧酶(PDC1、PDC5和PDC6)，其中的2种(PDC1、PDC5)强烈地表达。缺失这些PDC中的2种可以显著减少乙醇产生。缺失所有3种会完全消除乙醇形成，但是也可以造成生长缺陷，因为细胞不能形成用于生物质形成的乙酰辅酶A。但是，这可以通过在有减少量的C2碳源(乙醇或乙酸)存在下使细胞进化来克服(van Maris等人,AEM69:2094-9(2003))。还已经报道，丙酮酸脱羧酶PDC1和PDC5的正调节剂PDC2的缺失会使乙醇形成减少至由野生型产生的量的约10％(Hohmann等人,Mol GenGenet241:657-66(1993))。PDC酶的蛋白序列和标识符列出在实施例II中。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码丙酮酸脱羧酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的丙酮酸脱羧酶；(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有丙酮酸脱羧酶酶活性；和/或(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，从丙酮酸生产更低水平的乙醇。在一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码丙酮酸脱羧酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(ii)表达减弱的丙酮酸脱羧酶。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码丙酮酸脱羧酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有丙酮酸脱羧酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的丙酮酸脱羧酶；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，从丙酮酸生产更低水平的乙醇。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的丙酮酸脱羧酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有丙酮酸脱羧酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的丙酮酸脱羧酶；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，从丙酮酸生产更低水平的乙醇。在另一个实施方案中，所述生物(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有丙酮酸脱羧酶酶活性；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，从丙酮酸生产更低水平的乙醇。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码丙酮酸脱羧酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的丙酮酸脱羧酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有丙酮酸脱羧酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码丙酮酸脱羧酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有丙酮酸脱羧酶酶活性；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，从丙酮酸生产更低水平的乙醇。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的丙酮酸脱羧酶；(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有丙酮酸脱羧酶酶活性；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，从丙酮酸生产更低水平的乙醇。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码丙酮酸脱羧酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的丙酮酸脱羧酶；(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有丙酮酸脱羧酶酶活性；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，从丙酮酸生产更低水平的乙醇。
可替换地，可以缺失或减弱将乙醛转化成乙醇的乙醇脱氢酶，以提供用于1,3-BDO途径的碳和还原当量。迄今为止，已经在酿酒酵母中报道了7种醇脱氢酶ADHI-ADHVII(de Smidt等人,FEMS Yeast Res8:967-78(2008))。ADH1(GI:1419926)是负责在厌氧条件下在细胞溶质中将乙醛还原为乙醇的关键酶。已经报道，具有ADH1缺陷的酵母菌株不能厌氧性地生长，因为活性的呼吸链是再生NADH并导致ATP的净获得的唯一替代路径(Drewke等人,J Bacteriol172:3909-17(1990))。该酶是用于减量调节以限制乙醇产生的理想候选物。ADH2在有葡萄糖存在下受到严重抑制。在乳酸克鲁维酵母中，已经鉴别和表征了2种NAD依赖性的细胞溶质醇脱氢酶。这些基因也表现出对其它脂族醇的活性。基因ADH1(GI:113358)和ADHII(GI:51704293)优先在葡萄糖培养的细胞中表达(Bozzi等人,BiochimBiophys Acta1339:133-142(1997))。细胞溶质醇脱氢酶在白色假丝酵母中由ADH1(GI:608690)编码，在粟酒裂殖酵母中由ADH1(GI:3810864)编码，在解脂耶氏酵母中由ADH1(GI:5802617)编码，在树干毕赤酵母(Pichiastipitis)或木糖发酵酵母(Scheffersomyces stipitis)中由ADH1(GI:2114038)和ADHII(GI:2143328)编码(Passoth等人,Yeast14:1311-23(1998))。下表显示了候选醇脱氢酶。
表5
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
SADH BAA24528.1 2815409 近平滑假丝酵母
ADH1 NP_014555.1 6324486 酿酒酵母s288c
ADH2 NP_014032.1 6323961 酿酒酵母s288c
ADH3 NP_013800.1 6323729 酿酒酵母s288c
ADH4 NP_011258.2 269970305 酿酒酵母s288c
ADH5(SFA1) NP_010113.1 6320033 酿酒酵母s288c
ADH6 NP_014051.1 6323980 酿酒酵母s288c
ADH7 NP_010030.1 6319949 酿酒酵母s288c
adhP CAA44614.1 2810 乳酸克鲁维酵母
ADH1 P20369.1 113358 乳酸克鲁维酵母
ADH2 CAA45739.1 2833 乳酸克鲁维酵母
ADH3 P49384.2 51704294 乳酸克鲁维酵母
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码乙醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的乙醇脱氢酶；(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醇脱氢酶酶活性；和/或(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的乙醇。在一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码乙醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(ii)表达减弱的乙醇脱氢酶。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码乙醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醇脱氢酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码乙醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的乙醇。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的乙醇脱氢酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醇脱氢酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的乙醇脱氢酶；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的乙醇。在另一个实施方案中，所述生物(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醇脱氢酶酶活性；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的乙醇。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码乙醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的乙醇脱氢酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醇脱氢酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码乙醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的乙醇脱氢酶；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的乙醇。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码乙醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醇脱氢酶酶活性；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的乙醇。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码乙醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的乙醇脱氢酶；(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醇脱氢酶酶活性；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的乙醇。
诸如酿酒酵母等酵母可以生产甘油以允许在厌氧条件下再生NAD(P)。酶G3P脱氢酶和G3P磷酸酶从糖酵解中间体二羟基丙酮磷酸酯形成甘油。不受特定工作理论约束，据信，这些酶中的一种或多种的减弱或缺失可以消除或减少甘油的形成，并由此转化用于1,3-BDO生产的还原当量。上面描述了示例性的G3P脱氢酶。G3P磷酸酶催化G3P水解为甘油。具有该活性的酶包括酿酒酵母(GPP1和GPP2)、白色假丝酵母和巴夫杜氏藻(Dunaleilla parva)的甘油-1-磷酸酶(EC3.1.3.21)酶(Popp等人,BiotechnolBioeng100:497-505(2008)；Fan等人,FEMS Microbiol Lett245:107-16(2005))。迄今为止尚未鉴别出巴夫杜氏藻基因。这些和其它G3P磷酸酶显示在下表中。
表6
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
GPP1 DAA08494.1 285812595 酿酒酵母
GPP2 NP_010984.1 6320905 酿酒酵母
GPP1 XP_717809.1 68476319 白色假丝酵母
KLLA0C08217g XP_452565.1 50305213 乳酸克鲁维酵母
KLLA0C11143g XP_452697.1 50305475 乳酸克鲁维酵母
ANI_1_380074 XP_001392369.1 145239445 黑曲霉
ANI_1_444054 XP_001390913.2 317029125 黑曲霉
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，其中所述非天然存在的真核生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码G3P脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的G3P脱氢酶；(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P脱氢酶酶活性；和/或(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的甘油。在一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码G3P磷酸酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(ii)表达减弱的G3P磷酸酶。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码G3P磷酸酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P磷酸酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码G3P磷酸酶的内源和/或外源核酸中的破坏和(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的甘油。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的G3P磷酸酶，且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P磷酸酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的G3P磷酸酶；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的甘油。在另一个实施方案中，所述生物(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P磷酸酶酶活性；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的甘油。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码G3P磷酸酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的G3P磷酸酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P磷酸酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码G3P磷酸酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的G3P磷酸酶；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的甘油。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码G3P磷酸酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的G3P磷酸酶；(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P磷酸酶酶活性；且(iv)与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的甘油。
消除甘油生产的另一种途径是通过氧限制培养(Bakker等人,出处同上)。仅在细胞的具体氧摄取速率下降至低于再氧化在生物合成中形成的NADH所需的速率时，才开始甘油形成。
除了上面列出的氧化还原汇点(sinks)以外，苹果酸脱氢酶当在还原方向起作用时可以潜在地抽走还原当量。据信在酿酒酵母中起作用的几种氧化还原穿梭利用该酶来在细胞溶质和线粒体之间转移还原当量。通过消除苹果酸脱氢酶和/或苹果酸酶活性，可以阻止这种氧化还原转移。通过消除mdh可以阻断的氧化还原穿梭包括：(i)苹果酸-天冬氨酸穿梭，(ii)苹果酸-草酰乙酸穿梭，和(iii)苹果酸-丙酮酸穿梭。编码苹果酸脱氢酶和苹果酸酶的基因列出在下表中：
表7
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
MDH1 NP_012838.1 6322765 酿酒酵母
MDH2 NP_014515.2 116006499 酿酒酵母
MDH3 NP_010205.1 6320125 酿酒酵母
MAE1 NP_012896.1 6322823 酿酒酵母
MDH1 XP_722674.1 68466384 白色假丝酵母
MDH2 XP_718638.1 68474530 白色假丝酵母
MAE1 XP_716669.1 68478574 白色假丝酵母
KLLA0F25960g XP_456236.1 50312405 乳酸克鲁维酵母
KLLA0E18635g XP_454793.1 50309563 乳酸克鲁维酵母
KLLA0E07525g XP_454288.1 50308571 乳酸克鲁维酵母
YALI0D16753p XP_502909.1 50550873 解脂耶氏酵母
YALI0E18634p XP_504112.1 50553402 解脂耶氏酵母
ANI_1_268064 XP_001391302.1 145237310 黑曲霉
ANI_1_12134 XP_001396546.1 145250065 黑曲霉
ANI_1_22104 XP_001395105.2 317033225 黑曲霉
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码苹果酸脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的苹果酸脱氢酶；(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有苹果酸脱氢酶酶活性；和/或(iv)具有减弱的或阻断的苹果酸-天冬氨酸穿梭、苹果酸-草酰乙酸穿梭和/或苹果酸-丙酮酸穿梭。在一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码苹果酸脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(ii)表达减弱的苹果酸脱氢酶。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码苹果酸脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有苹果酸脱氢酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码苹果酸脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(iv)具有减弱的或阻断的苹果酸-天冬氨酸穿梭、苹果酸-草酰乙酸穿梭和/或苹果酸-丙酮酸穿梭。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的苹果酸脱氢酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有苹果酸脱氢酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的苹果酸脱氢酶；且(iv)具有减弱的或阻断的苹果酸-天冬氨酸穿梭、苹果酸-草酰乙酸穿梭和/或苹果酸-丙酮酸穿梭。在另一个实施方案中，所述生物(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有苹果酸脱氢酶酶活性；且(iv)具有减弱的或阻断的苹果酸-天冬氨酸穿梭、苹果酸-草酰乙酸穿梭和/或苹果酸-丙酮酸穿梭。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码苹果酸脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的苹果酸脱氢酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有苹果酸脱氢酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码苹果酸脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的苹果酸脱氢酶；且(iv)具有减弱的或阻断的苹果酸-天冬氨酸穿梭、苹果酸-草酰乙酸穿梭和/或苹果酸-丙酮酸穿梭。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码苹果酸脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有苹果酸脱氢酶酶活性；且(iv)具有减弱的或阻断的苹果酸-天冬氨酸穿梭、苹果酸-草酰乙酸穿梭和/或苹果酸-丙酮酸穿梭。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码苹果酸脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的苹果酸脱氢酶；(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有苹果酸脱氢酶酶活性；且(iv)具有减弱的或阻断的苹果酸-天冬氨酸穿梭、苹果酸-草酰乙酸穿梭和/或苹果酸-丙酮酸穿梭。
总之，用于氧化还原的前述汇点的缺失(个别地或与其它氧化还原汇点相组合)会消除用于呼吸或副产物形成的还原力的使用。已经报道，外部NADH脱氢酶(NDE1和NDE2)和线粒体G3P脱氢酶(GUT2)的缺失几乎完全消除酿酒酵母中的细胞溶质NAD+再生(Overkamp等人,J Bacteriol182:2823-30(2000))。
在上面提供的真核生物的一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。在另一个实施方案中，所述真核生物进一步包含选自以下的乙酰辅酶A途径：(i)2A、2B和2D；(ii)2A、2C和2D；(iii)2A、2B、2E和2F；(iv)2A、2C、2E和2F；(v)2A、2B、2E、2K和2L；(vi.)2A、2C、2E、2K和2L；(vii)5A和5B；(viii)5A、5C和5D；(ix)5E、5F、5C和5D；(x)5G和5D；(xi)6A、6D和6C；(xii)6B、6E和6C；(xiii)10A、10B和10C；(xiv)10N、10H、10B和10C；(xv)10N、10L、10M、10B和10C；(xvi)10A、10B、10G和10D；(xvii)10N、10H、10B、10G和10D；(xviii)10N、10L、10M、10B、10G和10D；(xix)10A、10B、10J、10K和10D；(xx)10N、10H、10B、10J、10K和10D；(xxi)10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；(xxii)10A、10F和10D；(xxiii)10N、10H、10F和10D；和(xxiv)10N、10L、10M、10F和10D。
在上面提供的真核生物的一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。在另一个实施方案中，所述真核生物进一步包含选自以下的乙酰辅酶A途径：(i)2A、2B和2D；(ii)2A、2C和2D；(iii)2A、2B、2E和2F；(iv)2A、2C、2E和2F；(v)2A、2B、2E、2K和2L；(vi.)2A、2C、2E、2K和2L；(vii)5A和5B；(viii)5A、5C和5D；(ix)5E、5F、5C和5D；(x)5G和5D；(xi)6A、6D和6C；(xii)6B、6E和6C；(xiii)10A、10B和10C；(xiv)10N、10H、10B和10C；(xv)10N、10L、10M、10B和10C；(xvi)10A、10B、10G和10D；(xvii)10N、10H、10B、10G和10D；(xviii)10N、10L、10M、10B、10G和10D；(xix)10A、10B、10J、10K和10D；(xx)10N、10H、10B、10J、10K和10D；(xxi)10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；(xxii)10A、10F和10D；(xxiii)10N、10H、10F和10D；和(xxiv)10N、10L、10M、10F和10D。
4.6竞争性副产物生产途径的减弱
在某些实施方案中，通过缺失或减弱竞争途径来提高通向1,3-BDO形成的碳通量。酵母的典型发酵产物包括乙醇和甘油。通过上述方案可以实现这些副产物的缺失或减弱。
另外，在1,3-BDO途径中，有些副产物可以因为作用于途径中间体的非特异性酶而形成。例如，辅酶A水解酶和辅酶A转移酶可以分别作用于乙酰乙酰辅酶A和3-羟基丁酰辅酶A以形成乙酰乙酸和3-羟基丁酸。因此，在某些实施方案中，作用于本文提供的任意非天然存在的真核生物内的1,3-BDO途径中间体的途径的缺失或减弱，可以帮助增加这些生物中的1,3-BDO的生产。
具有3-羟基丁酰辅酶A转移酶或水解酶活性的酶可以催化3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化。类似地，具有乙酰乙酰辅酶A转移酶或水解酶活性的酶可以催化乙酰乙酰辅酶A至乙酰乙酸的转化。通过缺失或减弱具有这些活性的酶，可以阻止使1,3-BDO途径中间体从1,3-BDO生产转移的这些副反应。示例性的辅酶A水解酶和辅酶A转移酶显示在下表中。
表8
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
Tes1 NP_012553.1 6322480 酿酒酵母s288c
ACH1 NP_009538.1 6319456 酿酒酵母s288c
YALI0F14729p XP_505426.1 50556036 解脂耶氏酵母
YALI0E30965p XP_504613.1 50554409 解脂耶氏酵母
KLLA0E16523g XP_454694.1 50309373 乳酸克鲁维酵母
KLLA0E10561g XP_454427.1 50308845 乳酸克鲁维酵母
ACH1 P83773.2 229462795 白色假丝酵母
CaO19.10681 XP_714720.1 68482646 白色假丝酵母
ANI_1_318184 XP_001401512.1 145256774 黑曲霉
ANI_1_1594124 XP_001401252.2 317035188 黑曲霉
tesB NP_414986.1 16128437 大肠杆菌
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶；和/或(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶酶活性。在一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(ii)表达减弱的乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶。在另一个实施方案中，所述生物i)包含在编码乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物i)包含在编码乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶酶活性。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码3-羟基丁酰辅酶A水解酶或转移酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的3-羟基丁酰辅酶A水解酶或转移酶；和/或(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-羟基丁酰辅酶A水解酶或转移酶酶活性。在一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码3-羟基丁酰辅酶A水解酶或转移酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(ii)表达减弱的3-羟基丁酰辅酶A水解酶或转移酶。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码3-羟基丁酰辅酶A水解酶或转移酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-羟基丁酰辅酶A水解酶或转移酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的3-羟基丁酰辅酶A水解酶或转移酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-羟基丁酰辅酶A水解酶或转移酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码3-羟基丁酰辅酶A水解酶或转移酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的3-羟基丁酰辅酶A水解酶或转移酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-羟基丁酰辅酶A水解酶或转移酶酶活性。
非特异性的天然醛脱氢酶是作用于1,3-BDO途径中间体的酶的另一个例子。这样的酶可以，例如，将乙酰辅酶A转化成乙醛，或将3-羟基丁醛转化成3-羟基丁酸，或将3-氧代丁醛转化成乙酰乙酸。在实施例II中描述了酰化乙醛脱氢酶。几种酿酒酵母酶催化醛至酸的氧化，包括ALD1(ALD6)、ALD2和ALD3(Navarro-Avino等人,Yeast15:829-42(1999)；Quash等人,Biochem Pharmacol64:1279-92(2002))。线粒体蛋白ALD4和ALD5催化类似的转化(Wang等人,J Bacteriol180:822-30(1998)；Boubekeur等人,Eur J Biochem268:5057-65(2001))。大肠杆菌中催化乙醛至乙酸的转化的醛脱氢酶包括YdcW、BetB、FeaB和AldA(Gruez等人,J Mol Biol343:29-41(2004)；Yilmaz等人,Biotechnol Prog18:1176-82(2002)；Rodriguez-Zavala等人,Protein Sci15:1387-96(2006))。形成酸的醛脱氢酶列出在下表中。
表9
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
ALD2 NP_013893.1 6323822 酿酒酵母s288c
ALD3 NP_013892.1 6323821 酿酒酵母s288c
ALD4 NP_015019.1 6324950 酿酒酵母s288c
ALD5 NP_010996.2 330443526 酿酒酵母s288c
ALD6 NP_015264.1 6325196 酿酒酵母s288c
HFD1 NP_013828.1 6323757 酿酒酵母s288c
CaO19.8361 XP_710976.1 68490403 白色假丝酵母
CaO19.742 XP_710989.1 68490378 白色假丝酵母
YALI0C03025 CAG81682.1 49647250 解脂耶氏酵母
ANI_1_1334164 XP_001398871.1 145255133 黑曲霉
ANI_1_2234074 XP_001392964.2 317031176 黑曲霉
ANI_1_226174 XP_001402476.1 145256256 黑曲霉
ALDH P41751.1 1169291 黑曲霉
KLLA0D09999 CAH00602.1 49642640 乳酸克鲁维酵母
ydcW NP_415961.1 16129403 大肠杆菌
betB NP_414846.1 16128297 大肠杆菌
feaB AAC74467.2 87081896 大肠杆菌
aldA NP_415933.1 16129376 大肠杆菌
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码乙醛脱氢酶(酰化)的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的乙醛脱氢酶(酰化)；和/或(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醛脱氢酶(酰化)酶活性。在一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码乙醛脱氢酶(酰化)的内源和/或外源核酸中的破坏；且(ii)表达减弱的乙醛脱氢酶(酰化)。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码乙醛脱氢酶(酰化)的内源和/或外源核酸中的破坏；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醛脱氢酶(酰化)酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的乙醛脱氢酶(酰化)；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醛脱氢酶(酰化)酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码乙醛脱氢酶(酰化)的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的乙醛脱氢酶(酰化)；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醛脱氢酶(酰化)酶活性。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码3-羟基丁醛脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的3-羟基丁醛脱氢酶；和/或(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-羟基丁醛脱氢酶酶活性。在一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码3-羟基丁醛脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(ii)表达减弱的3-羟基丁醛脱氢酶。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码3-羟基丁醛脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-羟基丁醛脱氢酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的3-羟基丁醛脱氢酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-羟基丁醛脱氢酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码3-羟基丁醛脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的3-羟基丁醛脱氢酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-羟基丁醛脱氢酶酶活性。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码3-氧代丁醛脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的3-氧代丁醛脱氢酶；和/或(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-氧代丁醛脱氢酶酶活性。在一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码3-氧代丁醛脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(ii)表达减弱的3-氧代丁醛脱氢酶。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码3-氧代丁醛脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-氧代丁醛脱氢酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的3-氧代丁醛脱氢酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-氧代丁醛脱氢酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码3-氧代丁醛脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的3-氧代丁醛脱氢酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-氧代丁醛脱氢酶酶活性。
作用于1,3-BDO途径中间体的其它酶包括将乙醛转化成乙醇(如上讨论的)和将1,3-丁二醇转化成3-氧代丁醇的乙醇脱氢酶。许多生物编码催化3-氧代丁醇和1,3-丁二醇的互变的基因，包括属于芽孢杆菌属、短杆菌属、假丝酵母属和克雷伯菌属的那些，如Matsuyama等人.J Mol Cat B Enz,11:513-521(2001)所述。在大肠杆菌中克隆和表征了这些酶中的一种，即得自近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的SADH。还已经证实，突变的红球菌属(Rhodococcus)苯基乙醛还原酶(Sar268)和Leifonia醇脱氢酶会催化该转化(Itoh等人,Appl.Microbiol Biotechnol.75:1249-1256(2007))。这些酶和以前关于乙醛至乙醇的转化所描述的那些，是缺失和/或减弱的合适候选物。上面列出了基因候选物。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码乙醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的乙醇脱氢酶；和/或(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醇脱氢酶酶活性。在一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码乙醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(ii)表达减弱的乙醇脱氢酶。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码乙醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醇脱氢酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的乙醇脱氢酶；和(iiii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醇脱氢酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码乙醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的乙醇脱氢酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醇脱氢酶酶活性。在某些实施方案中，使用一种或多种其它醇脱氢酶替代乙醇脱氢酶。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码1,3-丁二醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的1,3-丁二醇脱氢酶；和/或(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有1,3-丁二醇脱氢酶酶活性。在一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码1,3-丁二醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(ii)表达减弱的1,3-丁二醇脱氢酶。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码1,3-丁二醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有1,3-丁二醇脱氢酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的1,3-丁二醇脱氢酶；和(iiii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有1,3-丁二醇脱氢酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码1,3-丁二醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的1,3-丁二醇脱氢酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有1,3-丁二醇脱氢酶酶活性。
在某些实施方案中，在表达包含乙酰辅酶A羧化酶和乙酰乙酰辅酶A合酶(7E/7F)的1,3-BDO途径的生物中，可能有利的是，缺失或减弱内源性的乙酰乙酰辅酶A硫解酶活性。乙酰乙酰辅酶A硫解酶通常是可逆的，而乙酰乙酰辅酶A合酶催化不可逆的反应。因此，乙酰乙酰辅酶A硫解酶的缺失会减少乙酰乙酰辅酶A至乙酰辅酶A的回流，并由此提高通向1,3-BDO产物的通量。
在另一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述生物：(i)包含在编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的乙酰乙酰辅酶A硫解酶；和/或(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙酰乙酰辅酶A硫解酶酶活性。在一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(ii)表达减弱的1乙酰乙酰辅酶A硫解酶。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的内源和/或外源核酸中的破坏；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙酰乙酰辅酶A硫解酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(ii)表达减弱的乙酰乙酰辅酶A硫解酶；和(iiii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙酰乙酰辅酶A硫解酶酶活性。在另一个实施方案中，所述生物(i)包含在编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的内源和/或外源核酸中的破坏；(ii)表达减弱的乙酰乙酰辅酶A硫解酶；且(iii)与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙酰乙酰辅酶A硫解酶酶活性。
在上面提供的真核生物的一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。在另一个实施方案中，所述真核生物进一步包含选自以下的乙酰辅酶A途径：(i)2A、2B和2D；(ii)2A、2C和2D；(iii)2A、2B、2E和2F；(iv)2A、2C、2E和2F；(v)2A、2B、2E、2K和2L；(vi.)2A、2C、2E、2K和2L；(vii)5A和5B；(viii)5A、5C和5D；(ix)5E、5F、5C和5D；(x)5G和5D；(xi)6A、6D和6C；(xii)6B、6E和6C；(xiii)10A、10B和10C；(xiv)10N、10H、10B和10C；(xv)10N、10L、10M、10B和10C；(xvi)10A、10B、10G和10D；(xvii)10N、10H、10B、10G和10D；(xviii)10N、10L、10M、10B、10G和10D；(xix)10A、10B、10J、10K和10D；(xx)10N、10H、10B、10J、10K和10D；(xxi)10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；(xxii)10A、10F和10D；(xxiii)10N、10H、10F和10D；和(xxiv)10N、10L、10M、10F和10D。
在上面提供的真核生物的另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。在另一个实施方案中，所述真核生物进一步包含选自以下的乙酰辅酶A途径：(i)2A、2B和2D；(ii)2A、2C和2D；(iii)2A、2B、2E和2F；(iv)2A、2C、2E和2F；(v)2A、2B、2E、2K和2L；(vi.)2A、2C、2E、2K和2L；(vii)5A和5B；(viii)5A、5C和5D；(ix)5E、5F、5C和5D；(x)5G和5D；(xi)6A、6D和6C；(xii)6B、6E和6C；(xiii)10A、10B和10C；(xiv)10N、10H、10B和10C；(xv)10N、10L、10M、10B和10C；(xvi)10A、10B、10G和10D；(xvii)10N、10H、10B、10G和10D；(xviii)10N、10L、10M、10B、10G和10D；(xix)10A、10B、10J、10K和10D；(xx)10N、10H、10B、10J、10K和10D；(xxi)10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；(xxii)10A、10F和10D；(xxiii)10N、10H、10F和10D；和(xxiv)10N、10L、10M、10F和10D。
4.71,3-BDO输出
在某些实施方案中，1,3-丁二醇离开本文提供的生产生物，以便回收和/或脱水成丁二烯。编码可促进1,3-丁二醇的运输的酶的基因的例子包括在实施例XI中提供的甘油易化蛋白同系物。
在一个方面，本文提供了一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；且其中所述生物进一步包含编码1,3-BDO转运蛋白的内源和/或外源核酸，其中所述编码1,3-BDO转运蛋白的核酸以足以从所述真核生物输出1,3-BDO的量表达。
在上面提供的真核生物的一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4F和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4B和4D。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4H和4J。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含4A、4K、4L、4F和4G。在另一个实施方案中，所述真核生物进一步包含选自以下的乙酰辅酶A途径：(i)2A、2B和2D；(ii)2A、2C和2D；(iii)2A、2B、2E和2F；(iv)2A、2C、2E和2F；(v)2A、2B、2E、2K和2L；(vi.)2A、2C、2E、2K和2L；(vii)5A和5B；(viii)5A、5C和5D；(ix)5E、5F、5C和5D；(x)5G和5D；(xi)6A、6D和6C；(xii)6B、6E和6C；(xiii)10A、10B和10C；(xiv)10N、10H、10B和10C；(xv)10N、10L、10M、10B和10C；(xvi)10A、10B、10G和10D；(xvii)10N、10H、10B、10G和10D；(xviii)10N、10L、10M、10B、10G和10D；(xix)10A、10B、10J、10K和10D；(xx)10N、10H、10B、10J、10K和10D；(xxi)10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；(xxii)10A、10F和10D；(xxiii)10N、10H、10F和10D；和(xxiv)10N、10L、10M、10F和10D。
在上面提供的真核生物的另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4F和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4B和4D。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4E、4C和4D。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H和4J。在其它实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4I和4G。在某些实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4H、4M、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4O、4N和4G。在另一个实施方案中，所述1,3-BDO途径包含7E、7F、4K、4L、4F和4G。在另一个实施方案中，所述真核生物进一步包含选自以下的乙酰辅酶A途径：(i)2A、2B和2D；(ii)2A、2C和2D；(iii)2A、2B、2E和2F；(iv)2A、2C、2E和2F；(v)2A、2B、2E、2K和2L；(vi.)2A、2C、2E、2K和2L；(vii)5A和5B；(viii)5A、5C和5D；(ix)5E、5F、5C和5D；(x)5G和5D；(xi)6A、6D和6C；(xii)6B、6E和6C；(xiii)10A、10B和10C；(xiv)10N、10H、10B和10C；(xv)10N、10L、10M、10B和10C；(xvi)10A、10B、10G和10D；(xvii)10N、10H、10B、10G和10D；(xviii)10N、10L、10M、10B、10G和10D；(xix)10A、10B、10J、10K和10D；(xx)10N、10H、10B、10J、10K和10D；(xxi)10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；(xxii)10A、10F和10D；(xxiii)10N、10H、10F和10D；和(xxiv)10N、10L、10M、10F和10D。
4.81,3-BDO的线粒体生产
在某些实施方案中，工程改造本文提供的真核生物，以将碳和还原当量有效地引入线粒体1,3-BDO生产途径。在线粒体中生产1,3-BDO的一个优点是，乙酰辅酶A(关键1,3-BDO途径前体)的天然丰富的线粒体库。线粒体中乙酰辅酶A至1,3-BDO的有效转化需要在线粒体中表达1,3-BDO途径酶。它也需要过量的还原当量来向前驱动该途径。用于增加线粒体中的还原NAD(P)H的量的示例性方法类似于在细胞溶质中采用的那些方法，且在下面更详细地描述。为了进一步增加乙酰辅酶A前体的可用性，可以根据需要减弱在线粒体和细胞溶质中消耗乙酰辅酶A的途径。如果1,3-BDO产物没有被天然酶或通过扩散输出线粒体，那么异源1,3-BDO转运蛋白(诸如甘油易化蛋白)的表达也可以改善1,3-BDO生产。
在某些实施方案中，通过向1,3-BDO途径酶添加线粒体靶向序列，实现基因向线粒体的靶向。线粒体靶向序列是本领域众所周知的。例如，得自酵母COX4基因的靶向线粒体的信号肽与瓦伦烯生产途径酶的融合会产生这样的线粒体瓦伦烯生产途径：与在细胞溶质中表达的相同途径相比，其产生增加的滴度(Farhi等人,Met Eng13:474-81(2011))。在一个实施方案中，所述真核生物包含1,3-BDO途径，其中所述生物由集中在真核生物的线粒体中的1,3-BDO途径酶组成。
在其它实施方案中，操作线粒体中的代谢辅因子的水平，以增加穿过1,3-BDO途径的通量，这可以进一步提高1,3-BDO的线粒体生产。例如，增加还原NAD(P)H的可用性可以帮助向前驱动1,3-BDO途径。这可以如下实现，例如，通过增加线粒体中的NAD(P)H的供给和/或减弱NAD(P)H汇点。
在真核细胞中，大部分的细胞NAD库被包含在线粒体中(Di Lisa等人,FEBS Lett492:4-8(2001))。可以以不同的方式增加线粒体NAD(P)H的供给。嘧啶核苷酸是在细胞溶质中合成，且必须以NAD+的形式被载体蛋白运输至线粒体。酿酒酵母的NAD载体蛋白由NDT1(GI:6322185)和NDT2(GI:6320831)编码(Todisco等人,J Biol Chem281:1524-31(2006))。还原态辅因子诸如NAD(P)H不会跨内线粒体膜运输(von Jagow等人,Eur J Biochem12:583-92(1970)；Lee等人,J Membr Biol161:173-181(1998))。线粒体中的NADH通常由TCA循环和丙酮酸脱氢酶复合物产生。NADPH由TCA循环产生，并且如果生物表达内源性或外源性的线粒体NADH转氢酶，则也可以从NADH产生。下面描述了NADH转氢酶酶候选物。
表10
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
NDT1 NP_012260.1 6322185 酿酒酵母
ANI_1_1592184 XP_001401484.2 317038471 黑曲霉
CaJ7_0216 XP_888808.1 77022728 白色假丝酵母
YALI0E16478g XP_504023.1 50553226 解脂耶氏酵母
KLLA0D14036g XP_453688.1 50307419 乳酸克鲁维酵母
增加线粒体的氧化还原电位(NAD(P)H/NAD(P)比率)，可以用于在正向驱动1,3-BDO途径。线粒体氧化还原汇点的减弱会增加氧化还原电位和因此增加1,3-BDO可利用的还原当量。用于减弱的示例性的消耗NAD(P)H的酶或途径包括TCA循环、NADH脱氢酶或氧化酶、醇脱氢酶和醛脱氢酶。
在某些实施方案中，可以如下生产本文提供的非天然存在的真核生物：引入可表达的核酸，其编码参与一个或多个1,3-BDO或乙酰辅酶A途径的一种或多种酶或蛋白。在某些实施方案中，可以如下生产本文中提供的非天然存在的真核生物：引入可表达的核酸，其编码参与一个或多个乙酰辅酶A途径和一个或多个1,3-BDO途径的一种或多种酶或蛋白。取决于选择的宿主真核生物，可以表达一些或所有特定乙酰辅酶A途径和/或1,3-BDO的核酸。在某些实施方案中，表达一些或所有特定乙酰辅酶A途径的核酸。在其它实施方案中，所述真核生物进一步包含表达一些或所有特定1,3-BDO途径的核酸。例如，如果选择的宿主具有期望途径的一种或多种酶或蛋白的缺陷，那么将所述缺陷酶或蛋白的可表达核酸引入宿主中用于随后外源表达。可替换地，如果选择的宿主表现出有些途径基因的内源表达，但是具有其它基因的缺陷，那么需要所述缺陷酶或蛋白的编码核酸才能实现细胞溶质乙酰辅酶A生产、或与1,3-BDO生产相组合的乙酰辅酶A生产。因而，在某些实施方案中，可以如下生产本文中提供的非天然存在的真核生物：引入外源性的酶或蛋白活性，以得到期望的乙酰辅酶A途径和/或1,3-BDO途径。可替换地，可以如下得到期望的乙酰辅酶A途径：引入一种或多种外源性的酶或蛋白活性，其与一种或多种内源性的酶或蛋白一起，实现乙酰辅酶A从生物的线粒体至生物的细胞溶质的运输、细胞溶质乙酰辅酶A的生产。在其它实施方案中，所述生物进一步包含1,3-BDO途径，其可以如下得到：引入一种或多种外源性的酶或蛋白活性，其与一种或多种内源性的酶或蛋白一起，实现1,3-BDO在生物中的生产。
通过本领域技术人员已知的和例如在实施例X中提供的任意方法，可以执行本文描述的用于促进和/或优化1,3-BDO生产的其它遗传修饰，例如，操作宿主细胞中的特定目标内源核酸，以减弱或缺失竞争性的副产物途径和酶。
宿主真核生物可以选自以下生物，并在以下生物中制备非天然存在的真核生物：例如，酵母、真菌或可用于发酵过程的多种其它真核生物中的任一种。示例性的酵母或真菌包括选自以下的物种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、无根根霉(Rhizopus arrhizus)、米根霉(Rhizobus oryzae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)等。应当理解，任意合适的真核宿主生物可以用于引入代谢和/或遗传修饰以产生期望的产物。在某些实施方案中，所述真核生物是酵母，诸如酿酒酵母。在某些实施方案中，所述真核生物是真菌。
本文一般地参考代谢反应、反应物或其产物或具体地参考一个或多个核酸或基因对生物和方法进行描述，所述核酸或基因编码与所述代谢反应、反应物或产物相关或进行催化的酶，或与所述代谢反应、反应物或产物相关的蛋白。除非本文另外明确说明，本领域的技术人员应当理解，对反应的提及也构成对反应物和反应产物的提及。类似地，除非本文另外明确说明，对反应物或产物的提及也提及反应，并且对这些代谢组分中的任一种的提及也提及这样的一个基因或多个基因：所述基因编码催化所提及的反应、反应物或产物的酶，或参与所提及的反应、反应物或产物的蛋白。同样地，鉴于众所周知的代谢生物化学、酶学和基因组学领域，本文对基因或编码核酸的提及也构成对对应的编码酶和其催化的反应或与所述反应有关的蛋白以及所述反应的反应物和产物的提及。
如在本文中公开的，通向1,3-BDO的中间途径可以是羧酸或其辅酶A酯，诸如4-羟基丁酸、3-羟基丁酸、它们的辅酶A酯、以及巴豆酰辅酶A。任意羧酸中间体可以以不同的离子化形式存在，包括完全质子化的、部分地质子化的和完全去质子化的形式。因此，后缀“-酸盐”或酸形式可以可互换地用于描述游离酸形式以及任何去质子化形式，具体地，因为已知离子化形式依赖于所述化合物所存在的pH。应当理解，羧酸酯中间体包括羧酸酯产物或途径中间体的酯形式，诸如O-羧酸酯和S-羧酸酯。O-和S-羧酸酯可以包括低级烷基，即C1至C6支链或直链羧酸酯。一些这样的O-或S-羧酸酯包括、但不限于：甲基、乙基、正丙基、正丁基、异丙基、仲丁基和叔丁基、戊基、己基的O-或S-羧酸酯，它们中的任一种可以进一步具有不饱和键，从而形成例如丙烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基的O-或S-羧酸酯。O-羧酸酯可以是生物合成途径的产物。通过生物合成途径得到的示例性的O-羧酸酯可以包括、但不限于：4-羟基丁酸甲酯、3-羟基丁酸甲酯、4-羟基丁酸乙酯、3-羟基丁酸乙酯、4-羟基丁酸正丙酯和3-羟基丁酸正丙酯。其它通过生物合成可得到的O-羧酸酯可以包括中链至长链基团，即从脂肪醇衍生出的C7-C22的O-羧酸酯，所述脂肪醇诸如庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一醇、月桂醇、十三醇、肉豆蔻醇、十五醇、鲸蜡醇、棕榈油醇(palmitolyl alcohol)、十七醇、硬脂醇、十九醇、花生醇、二十一醇和山嵛醇，它们中的任一种可以任选地是支链的，和/或含有不饱和键。O-羧酸酯还可以通过生化或化学方法得到，诸如游离羧酸产物的酯化或O-或S-羧酸酯的酯交换。S-羧酸酯的实例是辅酶A S-酯、半胱氨酰基S-酯、烷基硫代酸酯和各种芳基和杂芳基硫代酸酯。
取决于选择的包含1,3-BDO途径的宿主真核生物的1,3-BDO生物合成途径组分，本文提供的非天然存在的包含1,3-BDO途径的生物可以包括至少一种外源地表达的1,3-BDO途径的编码核酸和针对一个或多个1,3-BDO生物合成途径的至多所有的编码核酸。例如，通过相应编码核酸的外源表达，可以在缺乏途径酶或蛋白的宿主中建立1,3-BDO生物合成。在缺乏1,3-BDO途径的所有酶或蛋白的宿主中，可包括所述途径中所有酶或蛋白的外源表达，虽然可以理解，即使所述宿主包含至少一种途径酶或蛋白，也可以表达该途径的所有酶或蛋白。例如，可以包括1,3-BDO的生产途径中的所有酶或蛋白的外源表达。
另外，取决于选择的宿主真核生物的乙酰辅酶A途径组分，本文提供的非天然存在的真核生物可以包括至少一种外源地表达的乙酰辅酶A途径的编码核酸和针对一个或多个乙酰辅酶A途径的至多所有的编码核酸。例如，通过相应编码核酸的外源表达，可以在缺乏途径酶或蛋白的宿主中建立线粒体和/或过氧化物酶体乙酰辅酶A向宿主的细胞溶质中的输出和/或宿主中的细胞溶质乙酰辅酶A的增加。在缺乏乙酰辅酶A途径的所有酶或蛋白的宿主中，可包括所述途径中所有酶或蛋白的外源表达，虽然可以理解，即使所述宿主包含至少一种途径酶或蛋白，也可以表达该途径的所有酶或蛋白。例如，可以包括细胞溶质乙酰辅酶A的生产途径中的所有酶或蛋白的外源表达，所述酶或蛋白诸如柠檬酸合酶、柠檬酸转运蛋白、柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白、柠檬酸/苹果酸转运蛋白、ATP柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶，乙酰辅酶A合成酶，乙酸激酶和磷酸转乙酰酶，草酰乙酸转运蛋白、细胞溶质苹果酸脱氢酶、苹果酸转运蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙酰辅酶A连接酶或转移酶；乙酸激酶；磷酸转乙酰酶；丙酮酸脱羧酶；乙醛脱氢酶；丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)；丙酮酸脱氢酶，丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脱氢酶(酰化)；苏氨酸醛缩酶；线粒体乙酰肉碱转移酶；过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶；细胞溶质乙酰肉碱转移酶；线粒体乙酰肉碱移位酶；过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草酰乙酸脱羧酶；丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)；乙酰辅酶A羧化酶；丙二酰辅酶A脱羧酶；草酰乙酸脱氢酶；草酰乙酸氧化还原酶；丙二酰辅酶A还原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脱氢酶；丙二酰辅酶A合成酶；丙二酰辅酶A转移酶；苹果酸酶；苹果酸脱氢酶；苹果酸氧化还原酶；丙酮酸激酶；或PEP磷酸酶。
在本文提供的教导和指导下，本领域技术人员会理解，以可表达形式引入的编码核酸的数量至少与选择的宿主真核生物的乙酰辅酶A途径缺乏相对应。因此，本文中提供的非天然存在的真核生物可以具有1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、最多至编码构成本文公开的乙酰辅酶A途径的酶或蛋白的所有核酸。在某些实施方案中，非天然存在的真核生物还可以包括其它遗传修饰，所述遗传修饰会促进或优化所述生物中的细胞溶质乙酰辅酶A的生产，或对宿主真核生物赋予其它有用的功能。另外，本领域技术人员进一步理解，在涉及包含乙酰辅酶A途径和1,3-BDO途径的真核生物的实施方案中，以可表达形式引入的编码核酸的数量至少与选择的宿主真核生物的1,3-BDO途径缺乏相对应。因此，本文中提供的非天然存在的真核生物可以具有1种、2种、3种、4种、5种、最多至编码构成本文公开的1,3-BDO生物合成途径的酶或蛋白的所有核酸。在某些实施方案中，非天然存在的真核生物还可以包括其它遗传修饰，所述遗传修饰会促进或优化1,3-BDO生物合成，或对宿主真核生物赋予其它有用的功能。一种这样的其它功能可以包括，例如，增加一种或多种1,3-BDO途径前体(诸如乙酰辅酶A)的合成。
通常，选择宿主真核生物，使得其生产乙酰辅酶A途径的前体，无论是作为天然地产生的分子，还是作为工程改造的产物，其会提供所需前体的从头生产或增加由宿主真核生物天然地产生的前体的产量。例如，在宿主生物(诸如酿酒酵母)中天然地产生线粒体乙酰辅酶A。如本文公开的，可以工程改造宿主生物以提高前体产量。另外，已经工程改造以生产所需前体的真核生物可用作宿主生物，并且进一步工程改造以表达乙酰辅酶A途径和任选的1,3-BDO途径的酶或蛋白。
在某些实施方案中，本文提供的非天然存在的真核生物从这样的宿主产生：所述宿主包含合成细胞溶质乙酰辅酶A的酶能力。在该具体的实施方案中，可以有用的是，增加乙酰辅酶A途径产物的合成或积累，以便例如向着细胞溶质乙酰辅酶A生产方向推动乙酰辅酶A途径反应。增加的合成或积累可以如下实现：例如，过量表达编码一种或多种上述的乙酰辅酶A途径酶或蛋白的核酸。乙酰辅酶A途径的一种或多种酶和/或一种或多种蛋白质的过量表达可以如下实现：例如，外源表达一个或多个内源基因，或外源表达一个或多个异源基因。因此，通过过量表达1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种核酸，也就是说，最多至编码乙酰辅酶A途径酶或蛋白的所有核酸，可以容易地将天然存在的生物制成本文提供的非天然存在的真核生物，例如，其生产细胞溶质乙酰辅酶A。另外，非天然存在的生物可以通过内源基因的诱变产生，所述诱变会导致乙酰辅酶A途径中的酶的活性增加。
在某些其中所述真核生物包含乙酰辅酶A途径和1,3-BDO途径的实施方案中，所述生物从这样的宿主产生：所述宿主包含合成乙酰辅酶A和1,3-BDO的酶能力。在该具体的实施方案中，可以有用的是，增加细胞溶质乙酰辅酶A和/或1,3-BDO途径产物的合成或积累，以便例如向着1,3-BDO生产方向推动1,3-BDO途径反应。增加的合成或积累可以如下实现：例如，过量表达编码一种或多种上述的乙酰辅酶A和/或1,3-BDO途径酶或蛋白的核酸。乙酰辅酶A和/或1,3-BDO途径的一种或多种酶和/或一种或多种蛋白质的过量表达可以如下实现：例如，外源表达一个或多个内源基因，或外源表达一个或多个异源基因。因此，通过过量表达1种、2种、3种、4种、5种核酸，也就是说，最多至编码1,3-BDO生物合成途径酶或蛋白的所有核酸，可以容易地将天然存在的生物制成本文中提供的非天然存在的真核生物，例如，其生产1,3-BDO。另外，非天然存在的生物可以通过内源基因的诱变产生，所述诱变会导致乙酰辅酶A和/或1,3-BDO生物合成途径中的酶的活性增加。
在特别有用的实施方案中，采用编码核酸的外源表达。外源表达赋予宿主定制表达和/或调节元件的能力和实现由使用者控制的期望的表达水平的应用。然而，在其它实施方案中，也可以利用内源表达，诸如当连接到诱导型启动子或其它调节元件时，通过除去负调控效应物或诱导基因的启动子。因此，通过提供适当的诱导剂可以增量调节具有天然存在的诱导型启动子的内源基因，或可以工程构造内源基因的调节区以掺入诱导型调节元件，从而允许在期望的时间调控内源基因的增加的表达。类似地，可以包括诱导型启动子作为引入非天然存在的真核生物中的外源基因的调节元件。
应当理解，在某些实施方案中，可以将任意一种或多种外源核酸引入真核生物中，以产生本文提供的非天然存在的真核生物。可以引入核酸，以便对所述生物赋予例如乙酰辅酶A途径，例如，通过表达由所述核酸编码的、具有给定活性的多肽。还可以引入核酸，以便进一步给所述生物赋予1,3-BDO生物合成途径。可替换地，可以引入编码核酸以产生具有生物合成能力的中间生物，从而催化一些所需的反应，以赋予乙酰辅酶A生产或运输或其它1,3-BDO生物合成能力。例如，具有乙酰辅酶A途径(单独的，或与1,3-BDO生物合成途径相组合)的非天然存在的生物可以包含至少两种外源核酸，所述外源核酸编码期望的酶或蛋白。例如，所述非天然存在的真核生物可以包含至少2种编码丙酮酸氧化酶(乙酸形成)和乙酰辅酶A合成酶的外源核酸(图5，步骤A和B)。因而，应当理解，在本文提供的非天然存在的生物中可以包括生物合成途径的2种或更多种酶或蛋白的任意组合。类似地，应当理解，根据需要，在本文提供的非天然存在的生物中可以包括生物合成途径的3种或更多种酶或蛋白的任意组合，诸如此类，只要期望的生物合成途径的酶和/或蛋白的组合会导致对应的期望的产物的生产。例如，所述非天然存在的真核生物可以包含至少3种外源核酸，所述外源核酸编码：丙酮酸氧化酶(乙酸形成)、乙酸激酶和磷酸转乙酰酶(图5，步骤A、C和D)；或乙酰乙酰辅酶A硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)和3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)(图4，步骤A、H和J)。类似地，根据需要，在本文中提供的非天然存在的真核生物中可以包括本文中公开的生物合成途径的4种或更多种酶或蛋白的任意组合，只要期望的生物合成途径的酶和/或蛋白的组合会导致对应的期望的产物的生产。例如，所述非天然存在的真核生物可以包含至少4种外源核酸，所述外源核酸编码：柠檬酸合酶、柠檬酸转运蛋白、柠檬酸裂合酶和乙酰辅酶A合成酶(图2，步骤A、B、E和F)；或乙酰乙酰辅酶A硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)、3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)和3-羟基丁醛还原酶(图4，步骤A、H、I和G)。本文提供的组合物和方法的实施方案也预见到在附图中描绘的其它各个途径。类似地，应当理解，非天然存在的真核生物可以例如包含至少6种外源核酸，其中3种外源核酸编码3种乙酰辅酶A途径酶，且3种外源核酸编码3种1,3-BDO途径酶。在本文中同样预见到核酸和途径酶的其它数目和/或组合。
在某些实施方案中，所述真核生物包含外源核酸，所述外源核酸编码本文提供的乙酰辅酶A途径的每种酶。在其它实施方案中，所述真核生物包含外源核酸，所述外源核酸编码本文提供的1,3-BDO途径的每种酶。在其它实施方案中，所述真核生物包含编码本文提供的乙酰辅酶A途径的每种酶的外源核酸，且所述真核生物进一步包含编码本文提供的1,3-BDO途径的每种酶的外源核酸。
除了本文所述的细胞溶质乙酰辅酶A(单独的或与1,3-BDO相组合)的生物合成以外，本文提供的非天然存在的真核生物和方法也可以用于彼此的各种组合中，和与本领域众所周知的其它真核生物和方法的各种组合中，以实现通过其它途径的产物生物合成。例如，除了使用细胞溶质乙酰辅酶A生产菌株以外，生产细胞溶质乙酰辅酶A的一种替代方案是，通过添加另一种真核生物，所述真核生物能够将乙酰辅酶A途径中间体转化成乙酰辅酶A。一种这样的方法包括，例如，培养或发酵生产乙酰辅酶A途径中间体的真核生物。然后可以使用乙酰辅酶A途径中间体作为第二种真核生物的底物，所述第二种真核生物将乙酰辅酶A途径中间体转化成细胞溶质乙酰辅酶A。所述乙酰辅酶A途径中间体可以直接加入第二种生物的其它培养物中，或可以从乙酰辅酶A途径中间体生产菌株的原始培养物中除去这些真核生物(例如，通过细胞分离)，然后将第二种生物加入发酵液中，以没有中间纯化步骤地生产终产物。
在其它实施方案中，其中所述非天然存在的真核生物进一步包含1,3-BDO途径，除了使用1,3-BDO生产菌株以外生产生产1,3-BDO的一种潜在替代方案是，通过添加另一种真核生物，所述真核生物能够将1,3-BDO途径中间体转化成1,3-BDO。一种这样的方法包括，例如，发酵生产1,3-BDO途径中间体的真核生物。然后可以使用1,3-BDO途径中间体作为第二种真核生物的底物，所述第二种真核生物将1,3-BDO途径中间体转化成1,3-BDO。所述1,3-BDO途径中间体可以直接加入第二种生物的其它培养物中，或可以从1,3-BDO途径中间体生产菌株的原始培养物中除去这些真核生物(例如，通过细胞分离)，然后将第二种生物加入发酵液中，以没有中间纯化步骤地生产终产物。
在其它实施方案中，可以在多种亚途径中装配本文提供的非天然存在的真核生物和方法，以实现例如细胞溶质乙酰辅酶A的生物合成。在这些实施方案中，期望产物的生物合成途径可以分离到不同的真核生物中，并且不同的真核生物可以共同培养以产生终产物。在这种生物合成方案中，一种真核生物的产物是第二种真核生物的底物，直至合成终产物。例如，细胞溶质乙酰辅酶A的生物合成可以如下实现：构建真核生物，该真核生物包含将一种途径中间体转化成另一种途径中间体或产物的生物合成途径。可替换地，也可以在同一容器中使用两种生物通过共同培养或共同发酵由真核生物生物合成地生产细胞溶质乙酰辅酶A，其中第一种真核生物生产细胞溶质乙酰辅酶A中间体，第二种真核生物将所述中间体转化成乙酰辅酶A。
在某些其中所述非天然存在的真核生物进一步包含1,3-BDO途径的实施方案中，可以在多种亚途径中装配本文提供的生物和方法，以实现乙酰辅酶A和/或1,3-BDO的生物合成。在这些实施方案中，本文提供的期望产物的生物合成途径可以分离到不同的真核生物中，并且不同的真核生物可以共同培养以产生终产物。在这种生物合成方案中，一种真核生物的产物是第二种真核生物的底物，直至合成终产物。例如，1,3-BDO的生物合成可以如下实现：构建真核生物，该真核生物包含将一种途径中间体转化成另一种途径中间体或产物的生物合成途径。可替换地，也可以在同一容器中使用两种生物通过共同培养或共同发酵由真核生物生物合成地生产1,3-BDO，其中第一种真核生物生产1,3-BDO中间体，第二种真核生物将所述中间体转化成1,3-BDO。某些实施方案包括乙酰辅酶A和1,3-BDO途径组分的任意组合。
在本文提供的教导和指导下，本领域的技术人员应当理解，对于本文提供的非天然存在的真核生物和方法以及其它真核生物、其它具有亚途径的非天然存在的真核生物的共同培养物、及本领域中众所周知的其它化学和/或生物化学方法的组合，存在许多种组合和变换，以生产细胞溶质乙酰辅酶A，无论是单独的还是与1,3-BDO相组合。
乙酰辅酶A途径酶或蛋白的编码核酸的来源可以包括，例如，其中编码的基因产物能够催化所述反应的任意物种。类似地，1,3-BDO途径酶或蛋白或如本文中所述的影响1,3-BDO生产的有关蛋白或酶(例如，1,3-BDO副产物途径酶)的编码核酸的来源可以包括，例如，其中编码的基因产物能够催化所述反应的任意物种。这样的物种包括：原核和真核生物，包括但不限于，细菌(包括古细菌和真细菌属)，和真核生物，包括酵母、植物、昆虫、动物和包括人在内的哺乳动物。这些来源的示例性物种包括，例如，大肠杆菌(Escherichia coli)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcusfermentans)、Acinetobacter baylyi、醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、风产液菌(Aquifex aeolicus)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、闪烁古球菌(Archaeoglobus fulgidus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillus terreus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、欧洲牛(BosTaurus)、白色假丝酵母(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、微温绿菌(Chlorobiumtepidum)、柯氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)、香橙(Citrus junos)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、克鲁佛梭菌(Clostridiumkluyveri)、糖丁酸梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、蓝菌属(Cyanobium)PCC7001、食烯烃脱硫杆菌(Desulfatibacillumalkenivorans)、盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、死海嗜盐古细菌(Haloarcula marismortui)、智人(Homo sapiens)、嗜热氢杆菌(Hydrogenobacter thermophilus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、勤奋生金球菌(Metallosphaera sedula)、Methanothermobacter thermautotrophicus、小家鼠(Mus musculus)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)、烟草(Nicotiana tabacum)、Nocardia iowensis、穴兔(Oryctolaguscuniculus)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginos)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、嗜气热棒菌(Pyrobaculumaerophilum)、富养产碱菌(Ralstonia eutropha)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、肠道沙门氏菌(Salmonella enteric)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)、硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、Sulfolobus tokodaii、Thermoanaerobacter tengcongensis、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、布鲁斯锥虫(Trypanosoma brucei)、微变冢村氏菌(Tsukamurella paurometabola)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、生枝动胶菌(Zoogloea ramigera)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、以及本文公开的或可作为对应基因的源生物的其它示例性种属。但是，由于目前可获得550个物种以上的全基因组序列(这些中一半以上可在诸如NCBI等公共数据库上获得)，包括395种真核生物基因组以及多种酵母、真菌、植物和哺乳动物基因组，对于在相关或远缘物种中的一个或多个基因(包括例如已知基因的同系物、直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置换，以及生物间遗传改变的互换)而言，对编码必要的细胞溶质乙酰辅酶A和/或1,3-BDO生物合成的活性的基因的鉴定，在本领域中是常规的和众所周知的。因此，本文参考具体生物描述的能够生物合成细胞溶质乙酰辅酶A和/或1,3-BDO的代谢改变可以容易地应用于其它类似的真核生物。在本文提供的教导和指导下，本领域技术人员将知道，在一种生物中示例的代谢改变可以同样应用于其它生物。
在某些情况下，诸如当可选的细胞溶质乙酰辅酶A和/或1,3-BDO生物合成途径存在于不相关的物种中时，可以将细胞溶质乙酰辅酶A和/或1,3-BDO生物合成赋予给宿主物种，例如，通过外源表达来自不相关物种的一个或多个旁系同源物，所述旁系同源物催化类似的但不相同的代谢反应，以替换相关的反应。因为不同的生物之间存在某些代谢网络差异，所以本领域技术人员应当理解，在不同的生物之间实际的基因应用可以不同。然而，在本文提供的教导和指导下，本领域的技术人员也应当理解，本文提供的教导和方法可以应用于使用与本文示例的那些同源的代谢改变的所有真核生物，以在目标物种中构建真核生物，所述真核生物将合成细胞溶质乙酰辅酶A，无论是单独的还是与1,3-BDO相组合。
用于构建和试验非天然存在的细胞溶质乙酰辅酶A生产宿主的表达水平的方法，可以通过例如本领域中众所周知的重组和检测方法完成。用于构建和试验非天然存在的1,3-BDO生产宿主的表达水平的方法，也可以通过例如本领域中众所周知的重组和检测方法完成。可以发现这些方法描述在，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)。
利用本领域众所周知的技术，可以将参与生产细胞溶质乙酰辅酶A的途径的外源核酸序列稳定地或瞬时地导入宿主细胞中，所述技术包括、但不限于，接合、电穿孔、化学转化、转导、转染和超声转化。在其中所述真核生物进一步包含1,3-BDO途径的实施方案中，使用这些相同的技术，也可以将参与生产1,3-BDO的途径的外源核酸序列稳定地或瞬时地导入宿主细胞中。对于在酵母或其它真核细胞中的外源表达而言，一些基因中的核酸序列或真核核酸的cDNA可编码靶向信号诸如N-末端线粒体或其它靶向信号，如果需要，所述靶向信号可以在转化进原核宿主细胞之前除去。例如，线粒体前导序列的除去会导致在大肠杆菌中增加的表达(Hoffmeister等人,J.Biol.Chem.280:4329-4338(2005))。对于酵母或其它真核细胞中的外源表达而言，基因可在不添加前导序列的情况下在胞质溶胶中表达，或通过添加合适的靶向序列(诸如适合宿主细胞的线粒体靶向信号或分泌信号)而靶向线粒体或其它细胞器，或靶向分泌。因此，应当理解，用于除去或包含靶向序列的对核酸序列的适当修饰，可以掺入外源核酸序列中，以赋予合乎需要的特性。此外，可用本领域众所周知的技术对基因进行密码子优化，以实现蛋白质的优化表达。
可以构建一个或多个表达载体，以包括本文所示例的一种或多种细胞溶质乙酰辅酶A生物合成途径编码核酸，所述编码核酸与在宿主生物中起作用的表达控制序列可操作地连接。还可以构建一个或多个表达载体，以包括本文所示例的一种或多种1,3-BDO生物合成途径编码核酸，所述编码核酸与在宿主生物中起作用的表达控制序列可操作地连接。适用于本文提供的真核宿主生物的表达载体包括，例如，质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，包括可操作地稳定整合进宿主染色体中的载体和选择序列或标记。另外，所述表达载体可包含一个或多个选择标记基因和合适的表达控制序列。也可以包括选择标记基因，其例如提供对抗生素或毒素的抗性、补充营养缺陷型缺乏或供给培养基中没有的关键营养物。表达控制序列可以包括本领域众所周知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当要共同表达两种或更多种外源编码核酸时，可以将所述核酸插入例如单一表达载体中或分离的表达载体中。对于单一载体表达，编码核酸可以可操作地连接到一个共同的表达控制序列或连接到不同的表达控制序列，诸如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。使用本领域中众所周知的方法，可以证实参与代谢或合成途径的外源核酸序列的转化。这样的方法包括例如，核酸分析诸如RNA印迹或mRNA的聚合酶链反应(PCR)扩增，或用于基因产物表达的免疫印迹，或用于检测导入的核酸序列或其相应基因产物的表达的其它合适的分析方法。本领域的技术人员应当理解，外源核酸以足以生产期望的产物的量表达，且进一步理解，利用本领域众所周知的和本文公开的方法，可以优化表达水平以获得足够的表达。
在某些实施方案中，本文提供了一种在非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物中生产细胞溶质乙酰辅酶A的方法，所述方法包括：将本文描述的任意非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物在足以生产细胞溶质乙酰辅酶A的条件下培养足够的时间段。在其它实施方案中，本文提供了一种在非天然存在的包含乙酰辅酶A途径和1,3-BDO途径的真核生物中生产1,3-BDO的方法，所述方法包括：将本文描述的任意非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物在足以生产细胞溶质乙酰辅酶A和1,3-BDO的条件下培养足够的时间段。
利用众所周知的方法，可以完成合适的纯化和/或测定，以测试细胞溶质乙酰辅酶A和/或1,3-BDO的生产。可对每种待测的工程改造的菌株培养合适的重复，诸如一式三份培养物。例如，可监测在工程改造的生产宿主中的产物和副产物形成。使用本领域众所周知的常规操作，通过诸如HPLC(高效液相色谱法)、GC-MS(气相色谱法-质谱法)和LC-MS(液相色谱法-质谱法)等方法或其它合适的分析方法，可以分析最终产物和中间体以及其它有机化合物。还可以用培养物上清液检测发酵液中的产物的释放。通过HPLC，其中使用例如用于葡萄糖和醇的折射率检测器和用于有机酸的紫外检测器(Lin等人,Biotechnol.Bioeng.90:775-779(2005))，或本领域众所周知的其它合适的测定法和检测方法，可以定量副产物和残留的葡萄糖。利用本领域众所周知的方法，还可测定来自外源DNA序列的单一酶或蛋白活性。通过从细胞溶质乙酰辅酶A形成的代谢物(例如，1-3-丁二醇)的生产的增加，可以证实细胞溶质乙酰辅酶A的可用性的增加。可替换地，使用经工程改造使得它不能合成足够的细胞溶质乙酰辅酶A以支持在基本培养基上生长的生物(例如，酿酒酵母)，可以筛选功能性的细胞溶质乙酰辅酶A途径。参见WO/2009/013159。通过将功能性的非天然机制引入用于细胞溶质乙酰辅酶A生产的生物中，恢复在基本培养基上的生长。
利用本领域众所周知的多种方法，可以将细胞溶质乙酰辅酶A和/或1,3-BDO与培养物中的其它组分分离。这样的分离方法包括，例如，萃取操作以及包括连续液-液萃取、渗透蒸发、膜式过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取过滤、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、吸附色谱法和超滤在内的方法。所有上述方法是本领域众所周知的。
可以培养本文描述的任意非天然存在的真核生物，以生产和/或分泌本文提供的生物合成产物。例如，可以培养细胞溶质乙酰辅酶A生产菌株，用于细胞溶质乙酰辅酶A和/或1,3-BDO的生物合成生产。
为了生产细胞溶质乙酰辅酶A和/或1,3-BDO，在具有碳源以及其它必需营养物的培养基中培养重组菌株。有时希望且可以非常希望在发酵罐中维持厌氧条件，以降低全过程的成本。这样的条件可以如下得到：例如，首先用氮气喷射培养基，然后用隔膜和螺旋盖密封烧瓶。对于在厌氧条件下未观察到生长的菌株，通过在隔膜上打出用于有限通气的小孔，可以施加微氧或基本上厌氧的条件。示例性的厌氧条件先前已有描述，且是本领域众所周知的。例如，在2007年8月10日提交的美国公开2009/0047719中描述了示例性需氧和厌氧条件。如本文公开的，发酵可以以分批、补料分批或连续方式进行。
如果需要的话，通过根据需要添加碱(例如NaOH或其它碱)或酸，可以使培养基的pH维持在所需pH，尤其是中性pH，例如约7的pH，以将培养基维持在期望的pH。通过使用分光光度计(600nm)测量光密度，可以测定生长速率，并通过监测碳源随时间的消耗来测定葡萄糖摄取速率。
除了可再生原料(诸如上面举例说明的那些)以外，也可以改进本文提供的真核生物用于在作为它的碳源的合成气上生长。在该具体实施方案中，在所述真核生物中表达一种或多种蛋白或酶，以提供利用合成气或其它气态碳源的代谢途径。
本文提供的生物可以利用，并且所述生长培养基可以包括，例如，可以向非天然存在的真核生物提供碳源的任意碳水化合物来源。这类来源包括，例如，糖，诸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉。其它碳水化合物来源包括，例如，可再生的原料和生物质。在本文提供的方法中可以用作原料的生物质的示例性种类包括纤维素生物质、半纤维素生物质和木质素原料或部分原料。这样的生物质原料含有，例如，用作碳源的碳水化合物底物，诸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。在本文提供的教导和指导下，本领域技术人员将理解，除上述示例的那些之外的可再生原料和生物质也可以用于培养本文提供的真核生物，以生产细胞溶质乙酰辅酶A和/或1,3-BDO。
除了可再生原料(诸如上面举例说明的那些)以外，也可以改进本文提供的真核生物用于在作为它的碳源的合成气上生长。在该具体实施方案中，在细胞溶质乙酰辅酶A生产生物中表达一种或多种蛋白或酶，以提供利用合成气或其它气态碳源的代谢途径。
合成气体，亦称合成气或炉煤气，为煤和含碳材料(诸如生物质材料，包括农作物和残渣)的主要气化产物。合成气是主要由H2和CO组成的混合物，可经由气化任何有机原料(包括、但不限于：煤、煤油、天然气、生物质或有机废物)来获得。气化通常在高的燃料和氧气比率下进行。虽然合成气主要是H2和CO，但也可包含少量的CO2和其它气体。因此合成气会提供一种节省成本的气态碳源，例如CO和另外如CO2。
因此，在本文提供的教导和指导下，本领域技术人员将理解，当在诸如碳水化合物等碳源上生长时，可以产生非天然存在的真核生物，其分泌本文提供的生物合成的化合物。这样的化合物包括，例如，细胞溶质乙酰辅酶A和在乙酰辅酶A途径中的任何中间代谢物。这样的化合物包括例如1,3-BDO和在1,3-BDO途径中的任何中间代谢物。仅需要工程改造一种或多种所需要的酶或蛋白活性，即可实现期望化合物或中间体的生物合成，这包括，例如，引入细胞溶质乙酰辅酶A和/或1,3-BDO生物合成途径的一些或全部。因此，在某些实施方案中，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其当在碳水化合物或其它碳源上生长时产生和/或分泌细胞溶质乙酰辅酶A，当在碳水化合物或其它碳源上生长时产生和/或分泌在乙酰辅酶A途径中呈现的任意中间代谢物。本文提供的生产细胞溶质乙酰辅酶A的真核生物可以从中间体(例如，柠檬酸和乙酸)开始合成。在其它实施方案中，本文提供了一种非天然存在的真核生物，其当在碳水化合物或其它碳源上生长时产生和/或分泌1,3-BDO，当在碳水化合物或其它碳源上生长时产生和/或分泌在1,3-BDO途径中呈现的任意中间代谢物。生产1,3-BDO的生物可以从乙酰辅酶A开始合成1,3-BDO，并且这样，途径的组合是可能的。
使用本文例证的本领域众所周知的方法，构建本文提供的非天然存在的真核生物，以外源地表达至少一种核酸，所述核酸编码乙酰辅酶A途径酶或蛋白，所述酶或蛋白的量足以生产细胞溶质乙酰辅酶A。应当理解，在足以生产细胞溶质乙酰辅酶A的条件下，培养本文提供的真核生物。按照本文提供的教导和指导，本文提供的非天然存在的真核生物可以实现细胞溶质乙酰辅酶A的生物合成，从而达到约0.1-200mM或更高的细胞内浓度。通常，细胞溶质乙酰辅酶A的细胞内浓度是在约3-150mM之间，特别是在约5-125mM之间，更特别地在约8-100mM之间，包括约10mM、20mM、50mM、80mM或更高。从本文提供的非天然存在的生物，也可以达到在这些示例范围中的每种之间和以上的细胞内浓度。
在某些其中所述非天然存在的真核生物包含乙酰辅酶A途径和1,3-BDO途径的实施方案中，使用本文举例说明的本领域众所周知的方法，可以构建所述生物，以外源地表达至少一种编码乙酰辅酶A途径和/或1,3-BDO途径酶或蛋白的核酸，所述酶或蛋白的量足以生产乙酰辅酶A和/或1,3-BDO。应当理解，可以在足以生产细胞溶质乙酰辅酶A和/或1,3-BDO的条件下培养本文提供的生物。按照本文提供的教导和指导，本文提供的非天然存在的生物可以实现1,3-BDO的生物合成，产生在约0.1-2000mM之间或更高的细胞内浓度。通常，1,3-BDO的细胞内浓度是在约3-1800mM之间，特别是在约5-1700mM之间，更特别是在约8-1600mM之间，包括约100mM、200mM、500mM、800mM或更高。从本文提供的非天然存在的生物也可以实现在这些示例性范围中的每一个之间和以上的细胞内浓度。
在某些实施方案中，培养条件包括厌氧的或基本上厌氧的生长或维持条件。示例性的厌氧条件已经在前面有所描述，且是本领域众所周知的。发酵过程的示例性的厌氧条件在本文中有所描述，且描述在例如2007年8月10日提交的美国公开2009/0047719中。这些条件中的任一种可以与所述非天然存在的真核生物以及本领域众所周知的其它厌氧条件一起使用。在这样的厌氧的或基本上厌氧的条件下，所述细胞溶质乙酰辅酶A生产菌株可以以0.005-1000mM或更高的细胞内浓度以及在本文中例证的所有其它浓度合成细胞溶质乙酰辅酶A。应当理解，尽管上面的描述提及细胞内浓度，生产细胞溶质乙酰辅酶A的真核生物可以在细胞内生产细胞溶质乙酰辅酶A和/或将产物分泌进培养基中。在其中所述非天然存在的真核生物进一步包含1,3-BDO途径的实施方案中，在这样的厌氧条件下，1,3-BDO生产菌株可以以5-10mM或更高的细胞内浓度以及在本文中例证的所有其它浓度合成1,3-BDO。应当理解，尽管上面的描述提及细胞内浓度，生产1,3-BDO的真核生物可以在细胞内生产1,3-BDO和/或将产物分泌进培养基中。
除了本文公开的培养和发酵条件以外，用于实现细胞溶质乙酰辅酶A和/或1,3-BDO的生物合成的生长条件可以包括：将渗透保护剂加入培养条件中。在某些实施方案中，可以在有渗透保护剂存在下，如本文所述地维持、培养或发酵本文提供的非天然存在的真核生物。简而言之，渗透保护剂是指这样的化合物：其起渗透物的作用，并帮助本文所述的真核生物度过渗透胁迫。渗透保护剂包括、但不限于：甜菜碱、氨基酸和糖海藻糖.它们的非限制性实例是：甘氨酸甜菜碱(glycine betaine)、脯氨酸甜菜碱(pralinebetaine)、二甲基噻亭、二甲基磺基丙酸盐(dimethylslfonioproprionate)、3-二甲基磺基-2-甲基丙酸盐、2-哌啶甲酸、二甲基磺基乙酸盐、胆碱、L-肉碱和ectoine。在一个方面，所述渗透保护剂是甘氨酸甜菜碱。本领域普通技术人员应当理解，适用于保护本文所述的真核生物免于渗透胁迫的渗透保护剂的量和类型将取决于使用的真核生物。在培养条件中的渗透保护剂的量可以是，例如，不超过约0.1mM、不超过约0.5mM、不超过约1.0mM、不超过约1.5mM、不超过约2.0mM、不超过约2.5mM、不超过约3.0mM、不超过约5.0mM、不超过约7.0mM、不超过约10mM、不超过约50mM、不超过约100mM或不超过约500mM。
在某些实施方案中，可以选择碳原料和其它细胞摄取来源诸如磷酸盐、氨、硫酸盐、氯化物和其它卤素，以改变在细胞溶质乙酰辅酶A或任何乙酰辅酶A途径中间体中存在的原子的同位素分布。上面列举的各种碳原料和其它摄取来源将在本文中统称为“摄取来源”。摄取来源可以提供存在于下述物质中的任何原子的同位素富集：产物细胞溶质乙酰辅酶A或乙酰辅酶A途径中间体，包括在任意点从所述途径分叉而产生的任何细胞溶质乙酰辅酶A杂质。摄取来源还可以提供存在于下述物质中的任何原子的同位素富集：产物1,3-BDO或1,3-BDO途径中间体，包括在任意点从所述途径分叉而产生的任何1,3-BDO杂质。同位素富集可以针对任意靶原子实现，所述靶原子包括、例如，碳、氢、氧、氮、硫、磷、氯化物或其它卤素。
在某些实施方案中，可以选择摄取来源，以改变碳-12、碳-13和碳-14比率。在某些实施方案中，可以选择摄取来源，以改变氧-16、氧-17和氧-18比率。在某些实施方案中，可以选择摄取来源，以改变氢、氘和氚比率。在某些实施方案中，可以选择摄取来源，以改变氮-14和氮-15比率。在某些实施方案中，可以选择摄取来源，以改变硫-32、硫-33、硫-34和硫-35比率。在某些实施方案中，可以选择摄取来源，以改变磷-31、磷-32和磷-33比率。在某些实施方案中，可以选择摄取来源，以改变氯-35、氯-36和氯-37比率。
在某些实施方案中，通过摄取来源的合成化学富集，可以得到摄取来源的靶同位素比率。这样的同位素富集的摄取来源可以商业购得或在实验室中制备。在某些实施方案中，通过摄取来源在自然界中的起源的选择，可以得到摄取来源的靶同位素比率。在某些实施方案中，通过选择一种或多种摄取来源，可以将靶原子的同位素比率改变至期望的比率。摄取来源可以衍生自天然来源(如在自然界中发现的)，或衍生自人造来源，且本领域技术人员可以选择天然来源、人造来源或它们的组合，以达到靶原子的期望同位素比率。人造摄取来源的一个例子包括，例如，至少部分地从化学合成反应衍生出的摄取来源。这样的同位素富集的摄取来源可以商业购得或在实验室中制备，和/或任选地与摄取来源的天然来源混合，以达到期望的同位素比率。在某些实施方案中，通过选择摄取来源的期望源(如在自然界中发现的)，可以达到摄取来源的靶原子同位素比率。例如，如本文所讨论的，天然来源可以是从生物的生物体衍生出的或合成的基于生物的来源，或者诸如基于石油的产物或大气等来源。在某些这样的实施方案中，例如，碳源可以选自化石燃料衍生的碳源(其碳-14可以是相对贫化的)；或环境碳源，如CO2，其与其衍生自石油的对应物相比，可以具有更大量的碳-14。
不稳定的碳同位素碳-14或放射性碳占地球大气中的碳原子的大约1/1012，且具有约5700年的半衰期。上层大气中的碳储备物通过涉及宇宙射线和普通氮(14N)的核反应得以补充。化石燃料不含碳-14，因为其在很久以前腐烂。燃烧化石燃料会降低大气碳-14组分，即所谓的“苏斯效应”。
确定化合物中的原子的同位素比率的方法是本领域技术人员众所周知的。使用本领域已知的技术诸如加速质谱法(AMS)、稳定同位素比率质谱法(SIRMS)和位点特异性的天然同位素分级分离核磁共振(SNIF-NMR)，通过质谱法很容易对同位素富集进行评估。这种质谱技术可以结合分离技术，诸如液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)和/或气相色谱法等。
就碳而言，美国开发了ASTM D6866作为用于使用放射性碳测年法(美国试验与材料学会(American Society for Testing and Materials，ASTM)国际部)确定固体、液体和气体样品的生物基含量的标准化分析方法。该标准是基于放射性碳测年法用于确定产物的生物基含量的用途。ASTM D6866首次公开于2004年，该标准的当前有效版本是ASTM D6866-11(2011年4月1日生效)。放射性碳测年技术是本领域技术人员众所周知的，包括本文描述的那些。
通过碳-14(14C)与碳-12(12C)的比率估算化合物的生物基含量。具体而言，从如下表达式计算现代分数(Fm)：Fm＝(S-B)/(M-B)，其中B、S和M分别代表空白对照、样品和现代参考物的14C/12C比率。现代分数是样品相对于“现代”的14C/12C比率偏差的量度。现代被定义为被归一化为δ13CVPDB＝-19‰的国家标准局(National Bureau of Standards，NBS)草酸I(即，标准参照物料(SRM)4990b)的放射性碳浓度(在公元1950年)的95％(Olsson,The use of Oxalic acid as a Standard.见,Radiocarbon Variations and Absolute Chronology,Nobel Symposium,12th Proc.,John Wiley&Sons,NewYork(1970))。使用国际上通用的关于被归一化为δ13CVPDB＝-19‰的NBS草酸I(SRM4990b)的比活度的0.95倍的定义，计算质谱法结果，例如，通过ASM测得。这相当于1.176±0.010x10-12的绝对(公元1950年)14C/12C比率(Karlen等人,Arkiv Geofysik,4:465-471(1968))。标准的计算考虑了同位素相对于彼此的差异摄取，例如，生物系统的优先摄取为：C12优于C13优于C14，并且这些校正反映为针对δ13校正的Fm。
从1955年的甜菜作物制得草酸标准品(SRM4990b或HOx1)。虽然当时制有1000磅，但是这种草酸标准品不再商购可得。从1977年法国甜菜糖蜜作物制得草酸II标准品(HOx2；N.I.S.T命名SRM4990C)。在20世纪80年代初，一组12个实验室测量了这两种标准品的比率。草酸II与1的活性比率为1.2933±0.001(加权平均值)。HOx II的同位素比率是-17.8‰。ASTM D6866-11建议将可得到的草酸II标准品SRM4990C(Hox2)用作现代标准品(参见在Mann,Radiocarbon,25(2):519-527(1983)中最初草酸标准品相对于目前可得到的草酸标准品的讨论)。Fm＝0％表示材料中完全没有碳-14原子，从而表明是化石(例如石油基)碳源。Fm＝100％(针对1950年后核弹试验向大气中注入碳-14的现象校正之后)同样表明完全现代的碳源。如本文中所述的，这样的“现代”来源包括生物基来源。
如在ASTM D6866中所述，现代碳百分数(pMC)可以大于100％，这是由于20世纪50年代核试验方案的持续但递减的效果，这导致如在ASTMD6866-11中所述的大气中有相当大量的碳-14富集。因为所有样品碳-14活性是参考“炸弹前”(pre-bomb)标准，并且因为几乎所有新的生物基产品在炸弹后环境(post-bomb environment)中生产，所以所有的pMC值(同位素分数校正后)必须乘以0.95(自2010年起)，以更好地反映样品的真实生物基含量。大于103％的生物基含量表明，要么已经发生了分析错误，要么生物基碳的来源有些年头。
ASTM D6866相对于材料的总有机物含量对生物基含量进行量化，并且不考虑存在的含有无机碳和其它非碳的物质。例如，基于ASTM D6866，作为50％基于淀粉的材料和50％水的产物被认为具有生物基含量＝100％(50％有机物含量是100％生物基的)。在另一个实施例中，作为50％基于淀粉的材料、25％基于石油的材料和25％水的产物具有生物基含量＝66.7％(75％有机物含量，但是所述产物中仅50％是生物基的)。在另一个实施例中，作为50％有机碳且为基于石油产物的产物被认为具有生物基含量＝0％(50％有机碳，但是来自化石来源)。因而，基于众所周知的方法和已知的用于确定化合物或材料的生物基含量的标准品，本领域技术人员可以容易地确定生物基含量和/或利用本发明制备具有期望的生物基含量的下游产物。
碳-14测年技术在量化材料的生物基含量方面的应用是本领域已知的(Currie等人,Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B,172:281-287(2000))。例如，碳-14测年法已被用来量化含对苯二甲酸酯的材料的生物基含量(Colonna等人,Green Chemistry,13:2543-2548(2011))。值得注意的是，衍生自可再生的1,3-丙二醇和石油-衍生的对酞酸的聚对苯二甲酸亚丙基酯(PPT)聚合物产生了接近30％的Fm值(即，由于3/11的聚合物碳衍生自可再生的1,3-丙二醇以及8/11衍生自化石端元(end member)对苯二甲酸)(Currie等人,出处同上，2000)。与此相反，衍生自可再生的1,4-丁二醇和可再生的对酞酸的聚对苯二甲酸丁二醇酯聚合物产生了超过90％的生物基含量(Colonna等人,出处同上，2011)。
因此，在某些实施方案中，本文提供了细胞溶质乙酰辅酶A或细胞溶质乙酰辅酶A中间体，其具有反映大气碳摄取来源的碳-12、碳-13和碳-14比率。例如，在某些方面，所述细胞溶质乙酰辅酶A或细胞溶质乙酰辅酶A中间体可以具有至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或高达100％的Fm值。在某些实施方案中，所述摄取来源是CO2。在某些实施方案中，所述细胞溶质乙酰辅酶A或细胞溶质乙酰辅酶A中间体具有反映基于石油的碳摄取来源的碳-12、碳-13和碳-14比率。在某些实施方案中，通过大气碳摄取来源与基于石油的摄取来源的组合，得到具有碳-12、碳-13和碳-14比率的细胞溶质乙酰辅酶A或细胞溶质乙酰辅酶A中间体。在该方面，所述细胞溶质乙酰辅酶A或细胞溶质乙酰辅酶A中间体可以具有小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于2％或小于1％的Fm值。在某些实施方案中，本文提供了具有通过大气碳摄取来源与基于石油的摄取来源的组合得到的碳-12、碳-13和碳-14比率的细胞溶质乙酰辅酶A或细胞溶质乙酰辅酶A中间体。使用这样的摄取来源组合，是可以改变碳-12、碳-13和碳-14比率的一种方式，且各个比率会反映摄取来源的比例。
在其中所述真核生物进一步包含1,3-BDO途径的其它实施方案中，本文提供了1,3-BDO或1,3-BDO中间体，其具有反映大气碳摄取来源的碳-12、碳-13和碳-14比率。例如，在某些方面，所述1,3-BDO或1,3-BDO中间体可以具有至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或高达100％的Fm值。在某些实施方案中，所述摄取来源是CO2。在某些实施方案中，所述1,3-BDO或1,3-BDO中间体具有反映基于石油的碳摄取来源的碳-12、碳-13和碳-14比率。在某些实施方案中，所述1,3-BDO或1,3-BDO中间体具有通过大气碳摄取来源与基于石油的摄取来源的组合得到的碳-12、碳-13和碳-14比率。在该方面，所述1,3-BDO或1,3-BDO中间体可以具有小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于2％或小于1％的Fm值。在某些实施方案中，本文提供了具有通过大气碳摄取来源与基于石油的摄取来源的组合得到的碳-12、碳-13和碳-14比率的1,3-BDO或1,3-BDO中间体。使用这样的摄取来源组合，是可以改变碳-12、碳-13和碳-14比率的一种方式，且各个比率会反映摄取来源的比例。
进一步，本发明涉及如在本文中公开的生物生产的1,3-BDO或1,3-BDO中间体，并涉及从其衍生出的产物，其中所述1,3-BDO或1,3-BDO中间体具有与在环境中存在的CO2大约相同值的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。例如，在某些方面，本发明提供了生物衍生的1,3-BDO或生物衍生的1,3-BDO中间体，其具有与在环境中存在的CO2大约相同值的碳-12相对于碳-13相对于碳-14同位素比率，或者本文中公开的任意其它比率。如在本文中公开的，应当理解，产物可以具有与在环境中存在的CO2大约相同值的碳-12相对于碳-13相对于碳-14同位素比率，或者本文中公开的任意其它比率，其中所述产物从如在本文中公开的生物衍生的1，3-BDO或生物衍生的1，3-BDO中间体产生，其中所述生物衍生的产物经过化学修饰以产生终产物。化学修饰生物衍生的1，3-BDO产物或其中间体以制备期望产物的方法是本领域技术人员众所周知的，如本文中所述。本发明另外提供了有机溶剂、聚氨酯树脂、聚酯树脂、降血糖剂、丁二烯和/或基于丁二烯的产物，其具有与在环境中存在的CO2大约相同值的碳-12相对于碳-13相对于碳-14同位素比率，其中所述有机溶剂、聚氨酯树脂、聚酯树脂、降血糖剂、丁二烯和/或基于丁二烯的产物从本文中公开的生物衍生的1，3-BDO或生物衍生的1，3-BDO中间体直接产生或联合产生。
1，3-BDO是在许多商业和工业应用中常用的化学试剂，且也在多种产品的生产中用作原料。这样的应用和产品的非限制性例子包括有机溶剂、聚氨酯树脂、聚酯树脂、降血糖剂、丁二烯和/或基于丁二烯的产品。因此，在某些实施方案中，本发明提供了在多种产品的生产中用作原料的生物基的有机溶剂、聚氨酯树脂、聚酯树脂、降血糖剂、丁二烯和/或基于丁二烯的产品，其包含一种或多种由本发明的非天然存在的微生物生产的或使用本文中公开的方法生产的生物衍生的1，3-BDO或生物衍生的1，3-BDO中间体。
本文中使用的术语“生物衍生的”是指，从生物的生物体衍生出或合成，且可以认为是可再生资源，因为它可以由生物的生物体产生。这样的生物的生物体，尤其是本文中公开的本发明的真核生物体，可以利用原料或生物质，例如，从农业、植物、细菌或动物来源得到的糖或碳水化合物。可替换地，所述生物的生物体可以利用大气碳。本文中使用的术语“生物基的”是指如上所述的完全地或部分地由本发明的生物衍生的化合物组成的产物。生物基的或生物衍生的产物不同于石油衍生的产物，其中这样的产物从石油或石化原料衍生出或合成。
在某些实施方案中，本发明提供了包含生物衍生的1，3-BDO或生物衍生的1，3-BDO中间体的有机溶剂、聚氨酯树脂、聚酯树脂、降血糖剂、丁二烯和/或基于丁二烯的产品，其中所述生物衍生的1,3-BDO或生物衍生的1,3-BDO中间体包括在所述有机溶剂、聚氨酯树脂、聚酯树脂、降血糖剂、丁二烯和/或基于丁二烯的产品的生产中使用的全部或部分的1,3-BDO或1,3-BDO中间体。因而，在某些方面，本发明提供了生物基的有机溶剂、聚氨酯树脂、聚酯树脂、降血糖剂、丁二烯和/或基于丁二烯的产品，其包含至少2％、至少3％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的本文中公开的生物衍生的1,3-BDO或生物衍生的1,3-BDO中间体。另外，在某些方面，本发明提供了生物基的有机溶剂、聚氨酯树脂、聚酯树脂、降血糖剂、丁二烯和/或基于丁二烯的产品，其中在它的生产中使用的1,3-BDO或1,3-BDO中间体是生物衍生的和石油衍生的1,3-BDO或1,3-BDO中间体的组合。例如，使用使用50％的生物衍生的1,3-BDO和50％的石油衍生的1,3-BDO或其它期望的比率诸如60％/40％、70％/30％、80％/20％、90％/10％、95％/5％、100％/0％、40％/60％、30％/70％、20％/80％、10％/90％的生物衍生的/石油衍生的前体，可以生产生物基的有机溶剂、聚氨酯树脂、聚酯树脂、降血糖剂、丁二烯和/或基于丁二烯的产品，只要所述产品的至少一部分包含由本文公开的真核生物生产的生物衍生的产物。应当理解，使用本发明的生物衍生的1,3-BDO或生物衍生的1,3-BDO中间体生产有机溶剂、聚氨酯树脂、聚酯树脂、降血糖剂、丁二烯和/或基于丁二烯的产品的方法是本领域众所周知的。
所述培养条件可以包括，例如，液体培养操作以及发酵和其它大规模培养操作。如本文所述，在厌氧的或基本上厌氧的培养条件下，可以得到细胞溶质乙酰辅酶A和/或生物合成产物(诸如1,3-BDO和其它)的特别有用的收率。
如本文所述，用于实现细胞溶质乙酰辅酶A和/或1,3-BDO的生物合成的一种示例性生长条件包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施方案中，可以在厌氧的或基本上厌氧的条件下，维持、培养或发酵本文中提供的非天然存在的真核生物。简而言之，厌氧条件是指缺乏氧的环境。基本上厌氧的条件包括，例如，培养、分批发酵或连续发酵，使得培养基中的溶解氧浓度保持在饱和度的0-10％之间。基本上厌氧的条件也包括在密封室内的液体培养基中或固体琼脂上培养或休眠细胞，所述密封室维持小于1％氧的气氛。例如，通过用N2/CO2混合物或其它合适的一种或多种无氧气体给培养物鼓泡，可以维持所述氧百分比。
本文所述的培养条件可以放大，并连续培养，用于生产细胞溶质乙酰辅酶A。示例性的培养方法包括，例如，补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离，或连续发酵和连续分离。所有这些方法是本领域众所周知的。发酵方法特别适用于细胞溶质乙酰辅酶A的生物合成生产。一般而言，且象非连续培养方法一样，细胞溶质乙酰辅酶A的连续的和/或接近连续的生产将包括：在足够的营养物和培养基中培养本文提供的非天然存在的生产细胞溶质乙酰辅酶A的生物，以维持和/或近似地维持生长处于指数期，所述生物进一步包含用于生产用细胞溶质乙酰辅酶A可以合成的化合物的生物合成途径。本文所述的培养条件同样可以使用、放大并连续培养，用于生产1,3-BDO。发酵方法特别适用于商业量的1,3-BDO的生物合成生产。一般而言，且象非连续培养方法一样，1,3-BDO的连续的和/或接近连续的生产将包括：在足够的营养物和培养基中培养非天然存在的生产1,3-BDO的生物，以维持和/或近似地维持生长处于指数期。
在这样的条件下的连续培养可以包括，例如，培养1、2、3、4、5、6或7天或更久。另外，连续培养可以包括1、2、3、4或5或更多周的更长时间段，且最多达几个月。可替换地，如果适合具体应用，本文提供的生物可以培养数小时。应当理解，连续的和/或接近连续的培养条件还可以包括，在这些示例性时期之间的所有时间间隔。进一步理解，培养本文提供的真核生物的时间为生产足够量期望目的的产物的足够时间段。
发酵方法是本领域众所周知的。简而言之，用于生物合成生产细胞溶质乙酰辅酶A的发酵可以用于，例如，补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离，或连续发酵和连续分离。分批和连续发酵方法的实例是本领域众所周知的。
除了使用本文提供的细胞溶质乙酰辅酶A生产菌株来连续生产大量细胞溶质乙酰辅酶A的上述发酵方法之外，例如，细胞溶质乙酰辅酶A生产菌株也可以同时进行化学合成操作，以将所述产物转化成其它化合物，或者可以从发酵培养物中分离产物，并在必要时顺序地进行化学或酶转化，以将所述产物转化成其它化合物。同样地，例如，1,3-BDO生产菌株也可以同时进行化学合成操作，以将所述产物转化成其它化合物，或者可以从发酵培养物中分离产物，并在必要时顺序地进行化学转化，以将所述产物转化成其它化合物。例如，可以将1,3-BDO脱水以提供1,3-BDO。在某些实施方案中，非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物进一步包含用于生产用细胞溶质乙酰辅酶A作为前体的化合物的生物合成途径，所述生物合成途径包含至少一种编码酶的外源核酸，所述酶以足以生产所述化合物的量表达。使用细胞溶质乙酰辅酶A作为前体可以生产的目标化合物包括1,3-BDO和其它。
在某些实施方案中，合成气可以用作碳原料。合成气发酵的重要工艺考虑是高生物质浓度和良好的气-液质量传递(Bredwell等人,BiotechnolProg.,15:834-844(1999)。CO在水中的溶解度稍微小于氧的溶解度。连续地气体鼓泡发酵可以在受控制的发酵罐里进行，同时不断地用质谱法分析废气以及定期对液体取样并用GC和HPLC进行分析。液相可以在分批模式中起作用。发酵产物(诸如醇、有机酸)和残留葡萄糖连同残留甲醇一起用HPLC(Shimadzu,Columbia MD)来定量，例如，使用系列的HPLC柱(例如，HPX-87系列)(BioRad,Hercules CA)，对于葡萄糖和醇使用折射率检测器，而对于有机酸使用紫外检测器。通过使用分光光度计(600nm)测量光密度来确定生长速率。这些系统中的所用配管是玻璃或金属以维持厌氧条件。用烧结玻璃进行气体鼓泡，以减小气泡尺寸并改善质量转移。测试了不同的鼓泡速率，范围从约0.1至1vvm(每分钟的气体体积)。为了获得气体摄取速率的准确测量结果，进行定期检查，其中暂时停止气流，并且检测气相组分随时间的变化。
为了达到总体目标生产力，采用细胞保留或再循环的方法。一种增加微生物浓度的方法是，从侧流经由切向流膜再循环细胞。也可以使用重复的分批培养，如以前关于Moorella生产乙酸所述(Sakai等人,J Biosci.Bioeng,99:252-258(2005))。也可以使用各种其它的方法(Bredwell等人,Biotechnol Prog.,15:834-844(1999)；Datar等人,Biotechnol Bioeng,86:587-594(2004))。可以试验另外的优化，例如1.5大气压的超压，以改善质量转移(Najafpour等人,Enzyme and Microbial Technology,38[1-2],223-228(2006))。
一旦使用纯的H2/CO作为进料达到满意的表现，会产生合成气混合物，其包含市售合成气中可能存在的抑制剂。例如，典型的杂质分布是4.5％的CH4、0.1％的C2H2、0.35％的C2H6、1.4％的C2H4和150ppm的一氧化氮(Datar等人,Biotechnol Bioeng,86:587-594(2004))。以ppm水平加入以诸如苯、甲苯、乙苯、对-二甲苯、邻-二甲苯和萘等化合物为代表的焦油，以测试对生产的任何影响。例如，已经证实，40ppm的NO对食一氧化碳梭菌(C.carboxidivorans)是抑制性的(Ahmed等人,Biotechnol Bioeng,97:1080-1086(2007))。在移至发酵罐之前，在摇瓶培养中试验培养物。并且，可以试验这些潜在抑制化合物的不同水平，从而定量它们对细胞生长的影响。该知识用于开发合成气纯度的规格，其用于放大研究和生产。如果发现任何特定组分难以从用于放大的合成气减少或移除，则利用适应进化操作使细胞适应以耐受一种或多种杂质。
在蛋白质工程领域中的进展使得可能改变本文中公开的任意酶，以有效地作用于它们的非天然底物。下面是来自不同目标种类的广特异性酶的几个例子，和已经用于进化这样的酶以作用于非天然底物的方法。
为了产生更好的生产菌株，可利用代谢模型优化生长条件。还可以使用模型来设计基因敲除体，其另外优化途径的应用(参见，例如，美国专利公开US2002/0012939、US2003/0224363、US2004/0029149、US2004/0072723、US2003/0059792、US2002/0168654和US2004/0009466,和美国专利号7,127,379)。建模分析允许可靠地预测使代谢向细胞溶质乙酰辅酶A的更有效生产转移对细胞生长的影响。
一种用于鉴定和设计有助于产物生物合成的代谢改变的计算方法是OptKnock计算框架(Burgard等人,Biotechnol.Bioeng.84:647-657(2003))。OptKnock是一种提出基因缺失或破坏方法的代谢建模和模拟程序，该基因缺失策略产生遗传稳定的真核生物，所述真核生物大量产生目标产物。具体而言，该框架检查真核生物的完整代谢和/或生物化学网络，以提出迫使期望的生物化学变成细胞生长的专性副产物的基因操作。通过将生物化学生产与细胞生长经由策略性设置的基因缺失或其它功能性基因破坏偶联，在生物反应器中经历长时间之后，施加给改造菌株的生长选择压力，作为强迫性生长相关的生物化学生产的结果，引起性能的改进。最后，当构建基因缺失时，设计的菌株恢复到它们的野生型状态的可能性很微小，这是因为通过OptKnock选择的基因被完全从基因组除去。因此，该计算方法可以用于鉴定引起期望产物生物合成的可选途径，或与非天然存在的真核生物结合使用，用于进一步优化期望产物的生物合成。
简而言之，OptKnock是在本文用于指模拟细胞代谢的计算方法和系统的术语。OptKnock程序涉及模型框架和方法，所述方法将具体的约束引入通量平衡分析(FBA)模型中。这些约束包括，例如，定性动力学信息、定性调控信息和/或DNA微阵列实验数据。OptKnock也计算各种代谢问题的解，其通过例如紧缩(tightening)由通量平衡模型产生的通量边界(flux boundary)以及随后在存在基因添加或缺失的情况下探究代谢网络的性能极限。OptKnock计算框架允许构建模型公式，该公式能够有效查询代谢网络的性能极限并且提供解决所产生的混合整数线性规划问题的方法。本文称为OptKnock的代谢建模和模拟方法描述在例如2002年1月10日提交的美国公开2002/0168654，2002年1月10日提交的国际专利号PCT/US02/00660和2007年8月10日提交的美国公开2009/0047719中。
鉴定和设计促成产物的生物合成产生的代谢改变的另一计算方法是称为的代谢建模和模拟系统。该计算方法和系统描述在例如2002年6月14日提交的美国公开2003/0233218和2003年6月13日提交的国际专利申请号PCT/US03/18838中。是一种计算系统，其可以用于产生在计算机芯片上的网络模型和模拟经过生物系统的化学反应的质量、能量或电荷通量，以限定包含该系统中化学反应的任意和全部可能功能性的解空间，从而确定该生物系统的允许活性范围。该方法被称为基于约束的建模，这是因为解空间由约束限定，所述约束诸如所包含反应的已知化学计量学以及与通过反应的最大通量相关的反应热力学和容量约束。由这些约束限定的空间可以被询问以确定生物系统或其生物化学组分的表型性能和行为。
这些计算方法与生物事实一致，这是因为生物系统是灵活的并且可以以许多不同的方式达到相同的结果。通过进化机理设计生物生物系统，该进化机理受所有生命系统必须面对的基础约束制约。因此，基于约束的建模策略包含这些一般事实。进一步，通过紧缩约束对网络模型连续施加更多限制的能力引起解空间大小减小，从而提高用于预测生理学性能或表型的精确性。
在本文提供的教导和指导下，本领域技术人员能够应用代谢建模和模拟的各种计算框架，以设计和实施宿主生物中所需化合物的生物合成。这些代谢建模和模拟方法包括，例如，上述示例的和OptKnock计算系统。为了例证，本文参考OptKnock建模和模拟计算框架描述了一些方法。本领域技术人员知道如何使用OptKnock将代谢改变的鉴定、设计和实施应用于本领域中众所周知的任何此类其它的代谢建模和模拟计算框架和方法。
上述方法将提供一组破坏的代谢反应。在该组中的每个反应或代谢修饰的消除可以在生物的生长期产生期望产物作为专性产物。因为反应是已知的，双层OptKnock问题的解也会提供编码一种或多种酶的相关基因或多种基因，所述酶催化该组反应中的每个反应。对该组反应和其相应编码参与每个反应的酶的基因鉴定通常是一个自动的过程，通过关联反应与具有酶和编码基因之间关系的反应数据库来完成。
一旦鉴定，待被破坏以实现期望产物生产的反应组在目标细胞或者生物中通过至少一种编码该组中的每一代谢反应的基因的功能破坏来实施。一种实现反应组功能破坏的特别有用的方法是通过每个编码基因的缺失。然而，在一些情况下，通过其它遗传畸变--例如包括诸如启动子或者调节因子的顺式结合部位的调节区的突变、缺失，或者通过在多个位置的任一处截短编码序列可以有利于破坏反应。例如当期望快速评估琥珀酸连接时，或者当遗传回复突变(genetic reversion)较不可能出现时，这些后面的畸变(产生小于基因组全部缺失)可以是有用的。
为了确定上述双层OptKnock问题的另外多产的解--其导致了更多破坏反应组或者代谢修饰，所述反应组或代谢修饰可引起包括期望产物的生长相关生物合成在内的生物合成，可以实施被称为整数切割(integer cuts)的最优化方法。通过迭代求解上面示例的OptKnock问题，在每一次迭代引入被称为整数切割的另外约束，进行该方法。整数切割约束有效地防止求解过程选择在任意先前迭代所鉴定(确定)的完全相同的反应组，该反应组专性连接产物生物合成与生长。例如，如果先前确定的生长相关的代谢修饰指定反应1、2和3用于破坏，那么随后的约束防止相同的反应同时在随后的解中被考虑。整数切割方法在本领域是众所周知的，并且可以发现描述于例如Burgard等，Biotechnol Prog，17:791-797(2001)中。如同本文描述的所有方法参考其与OptKnock代谢建模和模拟的计算框架结合使用，在迭代计算分析中减少冗余的整数切割方法也可以与本领域众所周知的其它计算框架一起应用，所述计算框架包括，例如，
以上示例的方法使得能够构建进行生物合成生产的细胞和生物，包括目标生物化学产物与被改造以含有已鉴定遗传改变的细胞或生物生长的专性偶联生产。因此，本文描述的计算方法能够进行代谢修饰的鉴定和实施，该代谢修饰通过选自OptKnock或的计算机环境方法来鉴定。代谢修饰组可以包括，例如，一种或者多种生物合成途径酶的添加和/或一种或者多种代谢反应的功能破坏，其包括，例如，通过基因缺失的破坏。
如上文所讨论，OptKnock方法的开发是基于突变型微生物网络当经历长期生长选择时可朝向其以计算机预测的最大生长表型进化这一前提。换句话说，所述方法调节生物在选择性压力下自我优化的能力。OptKnock框架允许对基于网络化学计量迫使生物化学生产与细胞生长偶联的基因缺失组合进行穷举。对于最佳基因/反应剔除的鉴别需要对二层优化问题求解，所述问题选择活性反应组，使得所得网络的最佳生长答案过量产生目的生物化学物(Burgard等人,Biotechnol.Bioeng.84:647-657(2003))。
大肠杆菌代谢的计算机环境化学计量模型可用于鉴别先前示例的代谢途径的必需基因，且描述于例如美国专利公开US2002/0012939、US2003/0224363、US2004/0029149、US2004/0072723、US2003/0059792、US2002/0168654和US2004/0009466、以及美国专利号7,127,379中。如本文所公开，OptKnock数学框架可用于定位导致期望产物的生长偶联型生产的基因缺失。此外，双层OptKnock问题的解决方案仅提供一组缺失。为了列举所有有意义的解决方案、即导致生长偶联型生产形成的所有剔除集合，可实施被称作整数分割的优化技术。这要求对OptKnock问题迭代求解，其中在每次迭代时引入被称为整数切割的另外约束，如上文所讨论。
如本文所公开的，可以向宿主生物中引入核酸，所述核酸编码乙酰辅酶A途径和/或1,3-BDO途径的所需活性。在某些情况下，可以希望修改乙酰辅酶A途径酶或蛋白和/或1,3-BDO途径酶或蛋白的活性，以分别增加细胞溶质乙酰辅酶A或1,3-BDO的生产。例如，可以向编码核酸分子中引入会增加蛋白或酶的活性的已知突变。另外，可以应用优化方法来增加酶或蛋白的活性和/或降低抑制活性，例如，降低负调节物的活性。
一种这样的优化方法是定向进化。定向进化方法已经使得对酶进行修饰以对大量的非天然底物起作用成为可能。通过将活性位点附近的氨基酸残基随机化，扩大铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)中的脂肪酶的底物特异性。这允许该酶接受α-取代的羧酸酯(Reetz等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.44:4192-4196(2005))。在另一成功的尝试中，采用DNA改组以产生大肠杆菌氨基转移酶，所述酶接受野生型酶难以接受的β-支链底物(Yano等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:5511-5515(1998))。具体而言，在四轮改组结束时，天冬氨酸氨基转移酶对于缬氨酸和2-氧代缬氨酸的活性增加了至多五个数量级，而对于天然底物天冬氨酸的活性降低了至多30倍。近年来，一种算法被用于设计逆醛缩酶(retro-aldolase)，所述酶可用于催化非天然的和非生物的底物4-羟基-4-(6-甲氧基-2-萘基)-2-丁酮中的碳-碳键断裂。这些算法利用四种不同催化基序的不同组合来设计新酶，用于实验表征的选定设计中的20个具有比未催化的反应高四倍的改善率(Jiang等人,Science319:1387-1391(2008))。因此，这些工程方法不仅能够扩展酶可以起作用的底物阵列，而且允许设计和构建非常有效的酶。例如，据报道，DNA改组方法(临时模板上的随机嵌合体生成作用或RACHITT)会产生经工程改造的单加氧酶，所述酶对复杂底物具有改善的脱硫率以及快20倍的非天然底物转化(Coco等人.Nat.Biotechnol.19:354-359(2001))。类似地，迟缓突变型磷酸丙糖异构酶的比活性从1.3倍提高了至多19倍(Hermes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:696-700(1990))。通过利用在蛋白质的整体长度上的随机诱变，完成了比活性的增加，并且所述改善可以追溯至六个氨基酸残基中的突变。
也已经证实了蛋白质工程方法用于改变酶对期望底物的底物特异性方面的有效性。通过改变靠近活性位点的残基，修饰得自嗜热栖热菌的异丙基苹果酸脱氢酶，使得它现在可以对作为底物的苹果酸和D-乳酸起作用(Fujita等人,Biosci.Biotechnol Biochem.65:2695-2700(2001))。在该研究中以及在其它研究中指出，可以修饰一个或几个残基以改变底物特异性。一个相关的例子是可以优先还原二氢山柰酚的二氢黄酮醇4-还原酶，在其假定的底物结合区域中改变了单个氨基酸(Johnson等人,Plant J.25:325-333(2001))。通过改变活性位点中的一个残基，使得自大肠杆菌的非常特异性的异柠檬酸脱氢酶的底物特异性从异柠檬酸改变为异丙基苹果酸(Doyle等人,Biochemistry40:4234-4241(2001))。以类似的方式，通过改变N-末端附近的几个残基，使NAD+依赖性的1,5-羟基前列腺素脱氢酶的辅因子特异性改变为NADP+(Cho等人,Arch.Biochem.Biophys.419:139-146(2003))。使用序列分析和分子建模分析来识别用于修饰的关键残基，其进一步通过定位诱变进行研究。
通过DNA改组和筛选，从大肠杆菌中的半乳糖苷酶进化得到岩藻糖苷酶(Zhang等人,Proc Natl Acad Sci U S.A。94:4504-4509(1997))。类似地，利用同源性建模和定位诱变，将得自大肠杆菌的天冬氨酸氨基转移酶转化为酪氨酸氨基转移酶(Onuffer等人,Protein Sci.4:1750-1757(1995))。有报告称，得自恶臭假单胞菌的苯甲酰基甲酸脱羧酶的活性位点中两个残基的定位诱变会改变对天然和非天然底物的亲和力(Km)(Siegert等人,Protein EngDes Sel18:345-357(2005))。对得自酿酒酵母的细胞色素c过氧化物酶(CCP)进行定向分子进化，以生成对经典过氧化物酶底物愈创木酚具有增加的活性的突变体，从而将CCP的底物特异性从蛋白质细胞色素c改变为小有机分子。三轮DNA改组和筛选后，分离出这样的突变体：其具有对愈创木酚增加了300倍的活性，且其对该底物的特异性与天然底物相比增加了至多1000倍(Iffland等人,Biochemistry39:10790-10798(2000))。
在某些情况下，已经获得具有不同于两种亲本酶的底物偏好的酶。例如，通过改组得自两种细菌类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligens)和洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)的基因，改善联苯-加双氧酶-介导的多氯联苯的降解(Kumamaru等人,Nat.Biotechnol.16,663-666(1998))。所得的嵌合联苯加氧酶显示出不同于两种亲本酶的底物偏好，并增强对最初是该酶的不良底物的相关联苯化合物和单环芳烃(如甲苯和苯)的降解活性。
不仅可能改变酶特异性，而且可能增强对所述酶天然地具有低活性的那些底物的活性。一项研究证实，通过随机诱变可以显著地改善得自恶臭假单胞菌的氨基酸消旋酶，所述氨基酸消旋酶具有宽底物特异性(尤其对赖氨酸、精氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、亮氨酸和组氨酸)，但是对色氨酸具有低活性(Kino等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.73:1299-1305(2007))。类似地，牛BCKAD的活性位点经工程改造以偏好替代性底物乙酰辅酶A(Meng等人,Biochemistry33:12879-12885(1994))。这些方法的一个有趣的方面是，即使当已经用随机方法生成这些具有有效活性的突变酶时，可以鉴别赋予活性改善的确切突变或结构改变。例如，在前述的研究中，促进对色氨酸的活性改善的突变可以追溯到两个不同的位置。
定向进化也已被用于表达难以表达的蛋白质。例如，通过使辣根过氧化物酶经受随机诱变和基因重组，可以提取其活性是野生型的14倍以上的突变体(Lin等人,Biotechnol.Prog.15:467-471(1999))。
定向进化的最后一个例子显示了可以对酶进行广泛修饰以实现一系列的期望的功能。对酶(即得自嗜热脂肪芽孢杆菌的乳酸脱氢酶)进行定位诱变，并在被指出以确定对于不同的羟基酸的特异性的位点进行三个氨基酸置换(Clarke等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.148:15-23(1987))。这些突变之后，与对丙酮酸超过草酰乙酸的催化特异性为1000的野生型酶相比，对草酰乙酸超过丙酮酸的特异性增加到500。利用定位诱变进一步工程改造该酶，以具有对支链取代的丙酮酸的活性(Wilks等人,Biochemistry29:8587-8591(1990))。具体而言，该酶具有对α-酮异己酸的Kcat的55倍提高。在相同酶中进行三种结构修饰，以将其底物特异性从乳酸改至苹果酸。该酶对苹果酸具有高活性和特异性(Wilks等人,Science242:1541-1544(1988))。随后工程改造得自嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的相同酶，以具有对含有带正电荷侧链的α-酮酸(如包含铵基的那些)的高催化活性(Hogan等人,Biochemistry34:4225-4230(1995))。在酶的102位置处引入的酸性氨基酸的突变体有利于这种侧链铵基的结合。所得的结果证明，该突变体显示出对ω-氨基-α-酮酸底物的kcat/Km值的至多25倍改善。还在结构上修饰该酶，以作为苯基乳酸脱氢酶而不是乳酸脱氢酶起作用(Wilks等人,Biochemistry31:7802-7806(1992))。将限制位点引入该酶的基因，这允许基因区域的切除。该区域编码多肽的移动表面环(残基98-110)，其通常密封得自大量溶剂的活性位点液泡，而且是底物特异性的主要决定簇。将可变的长度和序列环插入切割的基因中，并用于合成具有改变的底物特异性的羟基酸脱氢酶。在构建一个更长的环的情况下，对丙酮酸的活性降低了一百万倍，但是对苯基丙酮酸的活性在很大程度上没有改变。达到了390,000倍的特异性(Kcat/Km)转变。该酶对苯基丙酮酸超过丙酮酸的1700:1选择性正是苯基乳酸脱氢酶所需要的。
如上面指出的，定向进化是一种有效的方案，其包括引入靶向特定基因的突变，以便提高和/或改变酶的性质。通过灵敏的高处理量筛选测定的开发和实现，可以鉴别提高的和/或改变的酶，所述测定允许许多酶变体(例如，>104)的自动化筛选。通常进行诱变和筛选的反复循环，以得到具有优化的性质的酶。还已经开发了可以帮助鉴别用于诱变的基因区域的计算算法，且可以显著减少需要制备和筛选的酶变体的数目。
已经开发出众多定向进化技术(关于综述，参见Hibbert等人,Biomol.Eng22:11-19(2005)；Huisman和Lalonde,Biocatalysis in the Pharmaceuticaland Biotechnology Industries第717-742页(2007),Patel(编),CRC Press；Otten和Quax.Biomol.Eng22:1-9(2005).；和Sen等人,Appl Biochem.Biotechnol143:212-223(2007))，以有效地建立多种变体文库，且这些方法已经成功地用于提高许多酶类别的广范围的性质。
通过定向进化技术已经改善和/或改变的酶特征包括，例如：选择性/特异性，用于非天然底物的转化；温度稳定性，用于稳健的高温处理；pH稳定性，用于在较低或较高pH条件下的生物处理；底物或产物耐受性，从而可以实现高产物滴度；结合(Km)，包括拓宽底物结合，以包括非天然的底物；抑制(Ki)，以除去产物、底物或关键中间体的抑制；活性(kcat)，以增加酶反应速率，从而实现所需的通量；表达水平，以增加蛋白收率和总途径通量；氧稳定性，用于在好氧条件下处理空气敏感的酶；和厌氧活性，用于在没有氧存在下处理需氧酶。
已经开发了许多示例性方法用于基因的诱变和多样化，以靶向特定酶的所需性质。这样的方法是本领域技术人员众所周知的。这些方法中的任一种可以用于改变和/或优化乙酰辅酶A途径酶或蛋白的活性。这样的方法包括，但不限于：EpPCR，其通过降低PCR反应中的DNA聚合酶的保真度而引入随机点突变(Pritchard等人,J.Theor.Biol.234:497-509(2005))；易出错的滚环扩增(epRCA)，其类似于epPCR，但是使用整个环形质粒作为模板，并使用随机6-聚体(其具有在最后2个核苷酸上的外切核酸酶抗性的硫代磷酸酯键)来扩增质粒，随后转化进细胞中，在所述细胞中，所述质粒在串联重复序列处重新环化(Fujii等人,Nucleic Acids Res.32:e145(2004)；和Fujii等人,Nat.Protoc.1:2493-2497(2006))；DNA或家族改组，其通常包括用核酸酶(诸如DNA酶I或EndoV)消化2种或更多种变体基因，以产生随机片段集合，所述片段通过在有DNA聚合酶存在下的退火和延伸循环而重新装配，以建立嵌合基因文库(Stemmer,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751(1994)；和Stemmer,Nature370:389-391(1994))；交错的延伸(StEP)，其需要模板引发，继之以变性和非常短持续时间(短至5秒)的退火/延伸的2步PCR的重复循环(Zhao等人,Nat.Biotechnol.16:258-261(1998))；随机引发重组(RPR)，其中使用随机序列引物来产生许多与模板的不同区段互补的短DNA片段(Shao等人,Nucleic Acids Res26:681-683(1998))。
其它方法包括异源双链体重组，其中使用线性化的质粒DNA来形成异源双链体，后者通过错配修复进行修复(Volkov等人,Nucleic Acids Res.27:e18(1999)；和Volkov等人,Methods Enzymol.328:456-463(2000))；临时模板随机嵌合生长(RACHITT)，其采用DNA酶I片段化和单链DNA(ssDNA)的尺寸分级分离(Coco等人,Nat.Biotechnol.19:354-359(2001))；截短模板重组延伸(RETT)，其在有用作模板集合的单向ssDNA片段存在下，需要从引物开始的单向生长链的模板转换(Lee等人,J.Molec.Catalysis26:119-129(2003))；简并寡核苷酸基因改组(DOGS)，其中使用简并引物来控制分子之间的重组；(Bergquist和Gibbs,Methods Mol.Biol.352:191-204(2007)；Bergquist等人,Biomol.Eng.22:63-72(2005)；Gibbs等人,Gene271:13-20(2001))；渐增切割法产生杂合酶(ITCHY)，其用目标基因或基因片段的1碱基对缺失来建立组合文库(Ostermeier等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:3562-3567(1999)；和Ostermeier等人,Nat.Biotechnol.17:1205-1209(1999))；硫代-渐增切割法产生杂合酶(THIO-ITCHY)，其类似于ITCHY，但是使用硫代磷酸酯dNTPs来产生截短(Lutz等人,NucleicAcids Res.29:E16(2001))；SCRATCHY，其组合了用于重组基因的2种方法ITCHY和DNA改组(Lutz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:11248-11253(2001))；,随机漂移诱变(RNDM)，其中在通过epPCR产生突变以后，对保留可用活性的那些进行筛选/选择(Bergquist等人,Biomol.Eng.22:63-72(2005))；序列饱和诱变(SeSaM)，这是一种随机诱变方法，其使用硫代磷酸酯核苷酸的随机掺入和切割来产生随机长度片段集合，所述集合用作模板，以在有“通用”碱基诸如肌苷存在下进行延伸，并且含有肌苷的补体的复制会导致随机碱基掺入，并从而导致诱变(Wong等人,Biotechnol.J.3:74-82(2008)；Wong等人,Nucleic Acids Res.32:e26(2004)；和Wong等人,Anal.Biochem.341:187-189(2005))；合成改组，其使用设计成编码“靶物中的所有遗传多样性”的重叠寡核苷酸，并实现改组的后代的非常高的多样性(Ness等人,Nat.Biotechnol.20:1251-1255(2002))；核苷酸交换和切除技术(NexT)，其利用dUTP掺入和随后用尿嘧啶DNA糖基化酶处理和再用哌啶处理(以进行端点DNA片段化)的组合(Muller等人,Nucleic Acids Res.33:e117(2005))。
其它方法包括不依赖序列同源性的蛋白质重组(SHIPREC)，其中使用接头来促进2个远相关的或无关的基因的融合，并在2个基因之间产生多种嵌合体，从而产生单杂交杂合体的文库(Sieber等人,Nat.Biotechnol.19:456-460(2001))；基因位点饱和诱变TM(Gene Site SaturationMutagenesisTM，GSSMTM)，其中原料包括超螺旋的双链DNA(dsDNA)质粒，所述质粒含有1个插入片段和2个引物，所述引物在期望的突变位点处简并(Kretz等人,Methods Enzymol.388:3-11(2004))；组合的盒诱变(CCM)，其包括，使用短寡核苷酸盒来替代具有大量可能的氨基酸序列改变的有限区域(Reidhaar-Olson等人Methods Enzymol.208:564-586(1991)；和Reidhaar-Olson等人Science241:53-57(1988))；组合的多盒诱变(CMCM)，其基本上类似于CCM，并以高突变率使用epPCR，以鉴别热点和热区，然后通过CMCM进行延伸，以覆盖给定的蛋白序列空间区域(Reetz等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.40:3589-3591(2001))；增变株技术，其中假定的ts增变株质粒，利用mutD5基因(其编码DNA聚合酶III的突变亚基)，以允许在选择过程中使随机和天然突变频率增加20至4000倍，并在不需要选择时阻断有害突变的积累(Selifonova等人,Appl.Environ.Microbiol.67:3645-3649(2001))；Low等人,J.Mol.Biol.260:359-3680(1996))。
其它示例性的方法包括：透视诱变(LTM)，这是一种多维诱变方法，其评估和优化选择的氨基酸的组合突变(Rajpal等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:8466-8471(2005))；基因重新装配，这是一种DNA改组方法，其可以同时应用于多个基因，或用于建立单个基因的大嵌合体文库(多种突变)(由Verenium Corporation提供的可调基因重新装配TM(TunableGeneReassemblyTM，TGRTM)技术)，计算机环境蛋白设计自动化(PDA)，这是一种优化算法，其锚定结构上确定的具有特定折叠的蛋白主链，并检索用于氨基酸置换(其可以稳定化所述折叠和总蛋白能学)的序列空间，且通常最有效地作用于具有已知三维结构的蛋白(Hayes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:15926-15931(2002))；和迭代饱和诱变(ISM)，其包括：使用结构/功能知识来选择用于酶改善的可能位点，使用诱变方法诸如Stratagene QuikChange(Stratagene；San Diego CA)在选择的位点处执行饱和诱变，筛选/选择希望的性质，和，使用改善的克隆，从另一个位点开始，并继续重复直到得到所需活性(Reetz等人,Nat.Protoc.2:891-903(2007)；和Reetz等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.45:7745-7751(2006))。
任意前述诱变方法可以单独使用，或以任意组合使用。另外，任意一种定向进化方法或它们的组合，可以与本文所述的适应进化技术结合使用。
应当理解，基本上不影响本文提供的各种实施方案的活性的修改也被提供在本文提供的定义中。因此，以下实施例意图举例说明而不是限制。
实施例I
从线粒体乙酰辅酶A生产细胞溶质乙酰辅酶A的途径
从线粒体乙酰辅酶A生产细胞溶质乙酰辅酶A，可以通过许多途径来完成，例如，在3-5个酶促步骤中。在一个示例性的途径中，柠檬酸合酶将线粒体乙酰辅酶A和草酰乙酸化合成柠檬酸，并由柠檬酸或柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白将柠檬酸输出线粒体。细胞溶质中的柠檬酸的酶促转化会产生细胞溶质乙酰辅酶A和草酰乙酸。细胞溶质草酰乙酸然后可以任选地被草酰乙酸转运蛋白和/或柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白运回到线粒体中。在另一个示例性的途径中，细胞溶质草酰乙酸首先在细胞溶质中被酶转化成苹果酸，然后任选地被苹果酸转运蛋白和/或苹果酸/柠檬酸转运蛋白转移进线粒体中。线粒体苹果酸然后可以被线粒体苹果酸脱氢酶转化成草酰乙酸。
在另一个示例性的途径中，线粒体乙酰辅酶A可以经由柠苹酸中间体转化成细胞溶质乙酰辅酶A。例如，线粒体乙酰辅酶A和丙酮酸被柠苹酸合酶转化成柠苹酸。柠苹酸或二羧酸转运蛋白然后可以将柠苹酸运输进细胞溶质中。细胞溶质乙酰辅酶A和丙酮酸然后直接地或间接地从柠苹酸再生，并且丙酮酸可以重新进入线粒体中。
与这些内容一起，在图2、3和8中显示了从线粒体乙酰辅酶A生产细胞溶质乙酰辅酶A的几种示例性乙酰辅酶A途径。在一个实施方案中，柠檬酸合酶将线粒体草酰乙酸与线粒体乙酰辅酶A化合以形成柠檬酸(图2、3和8，A)。柠檬酸转运蛋白(图2、3和8，B)、柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白(图2C)或柠檬酸/苹果酸转运蛋白(图3C)将柠檬酸运输到线粒体外面。ATP柠檬酸裂合酶将细胞溶质柠檬酸转化成细胞溶质乙酰辅酶A和草酰乙酸(图2、3，D)。在另一个途径中，柠檬酸裂合酶将细胞溶质柠檬酸转化成乙酸和草酰乙酸(图2和3，E)。乙酸然后可以被乙酰辅酶A合成酶或转移酶转化成细胞溶质乙酰辅酶A(图2和3，F)。可替换地，乙酸可以被乙酸激酶(图2和3，K)转化成乙酰磷酸，且乙酰磷酸可以被磷酸转乙酰酶转化成细胞溶质乙酰辅酶A(图2和3,L)。下面描述了乙酰辅酶A途径酶的示例性酶候选物。
柠檬酸合酶催化草酰乙酸和线粒体乙酰辅酶A的转化(图2、3和8，A)。在某些实施方案中，在本文中提供的非天然存在的真核生物的线粒体中表达柠檬酸合酶。
表11
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
CIT1 NP_014398.1 6324328 酿酒酵母S288c
CIT2 NP_009931.1 6319850 酿酒酵母S288c
CIT3 NP_015325.1 6325257 酿酒酵母S288c
YALI0E02684p XP_503469.1 50551989 解脂耶氏酵母
YALI0E00638p XP_503380.1 50551811 解脂耶氏酵母
ANI_1_876084 XP_001393983.1 145242820 黑曲霉CBS513.88
ANI_1_1474074 XP_001393195.2 317030721 黑曲霉CBS513.88
ANI_1_2950014 XP_001389414.2 317026339 黑曲霉CBS513.88
ANI_1_1226134 XP_001396731.1 145250435 黑曲霉CBS513.88
gltA NP_415248.1 16128695 大肠杆菌K-12MG1655
几种运输蛋白可以实现柠檬酸从线粒体至细胞溶质的运输。这样的蛋白要么将柠檬酸直接输出(即，柠檬酸转运蛋白，图2、3和8，B)至细胞溶质，要么在将诸如苹果酸(即，柠檬酸/苹果酸转运蛋白，图3C)或草酰乙酸(即，柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白，图2C)等分子从细胞溶质运输进线粒体中的同时将柠檬酸输出至细胞溶质，如在图2、3和8中所示。在下表中提供了实现这些转化的示例性运输酶。
表12
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
CTP1 NP_009850.1 6319768 酿酒酵母S288c
YALI0F26323p XP_505902.1 50556988 解脂耶氏酵母
ATEG_09970 EAU29419.1 114187719 土曲霉NIH2624
KLLA0E18723g XP_454797.1 50309571 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
CTRG_02320 XP_002548023.1 255726194 热带假丝酵母MYA-3404
ANI_1_1474094 XP_001395080.1 145245625 黑曲霉CBS513.88
YHM2 NP_013968.1 6323897 酿酒酵母S288c
DTC CAC84549.1 19913113 拟南芥
DTC1 CAC84545.1 19913105 烟草
DTC2 CAC84546.1 19913107 烟草
DTC3 CAC84547.1 19913109 烟草
DTC4 CAC84548.1 19913111 烟草
DTC AAR06239.1 37964368 香橙
ATP柠檬酸裂合酶(ACL，EC2.3.3.8，图2和3，D)也称作ATP柠檬酸合酶，其催化柠檬酸至草酰乙酸和乙酰辅酶A的ATP依赖性的裂解。在某些实施方案中，在真核生物的细胞溶质中表达ATP柠檬酸裂合酶。ACL是已经在绿硫细菌泥生绿菌(Chlorobium limicola)和微温绿菌(Chlorobiumtepidum)中研究的RTCA循环酶。在大肠杆菌中克隆和表征了得自泥生绿菌的α(4)β(4)异聚体酶(Kanao等人,Eur.J.Biochem.269:3409-3416(2002)。由aclAB编码的泥生绿菌酶是不可逆的，该酶的活性受ADP/ATP的比率调节。还在阐明α和β亚基在催化机制中的作用的研究中，在大肠杆菌中表达了得自微温绿菌的重组ACL，并在体外重构了全酶(Kim和Tabita,J.Bacteriol.188:6544-6552(2006)。还已经在Balnearium lithotrophicum、Sulfurihydrogenibium subterraneum和细菌产水菌门的其它成员中鉴别了ACL酶(Hugler等人,Environ.Microbiol.9:81-92(2007))。还已经在一些真菌中报道了该活性。示例性生物包括：Sordaria macrospora(Nowrousian等人,Curr.Genet.37:189-93(2000)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和解脂耶氏酵母(Hynes和Murray,Eukaryotic Cell,July:1039-1048,(2010)和黑曲霉(Meijer等人J.Ind.Microbiol.Biotechnol.36:1275-1280(2009)。基于序列同源性，可以发现其它候选物。关于这些酶的信息列在下表中。
表13
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
aclA BAB21376.1 12407237 泥生绿菌
aclB BAB21375.1 12407235 泥生绿菌
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
aclA AAM72321.1 21647054 微温绿菌
aclB AAM72322.1 21647055 微温绿菌
aclB ABI50084.1 114055039 Sulfurihydrogenibium subterraneum
aclA AAX76834.1 62199504 Sulfurimonas denitrificans
aclB AAX76835.1 62199506 Sulfurimonas denitrificans
acl1 XP_504787.1 50554757 解脂耶氏酵母
acl2 XP_503231.1 50551515 解脂耶氏酵母
SPBC1703.07 NP_596202.1 19112994 粟酒裂殖酵母
SPAC22A12.16 NP_593246.1 19114158 粟酒裂殖酵母
acl1 CAB76165.1 7160185 Sordaria macrospora
acl2 CAB76164.1 7160184 Sordaria macrospora
aclA CBF86850.1 259487849 构巢曲霉
aclB CBF86848 259487848 构巢曲霉
在有些生物中，柠檬酸至草酰乙酸和乙酰辅酶A的转化通过柠檬酰辅酶A中间体进行，且由2种单独的酶催化：柠檬酰辅酶A合成酶(EC6.2.1.18)和柠檬酰辅酶A裂合酶(EC4.1.3.34)(Aoshima,M.,Appl.Microbiol.Biotechnol.75:249-255(2007)。柠檬酰辅酶A合成酶催化柠檬酸活化为柠檬酰辅酶A。所述嗜热氢杆菌酶是由大和小亚基组成，所述亚基分别由ccsA和ccsB编码(Aoshima等人,Mol.Micrbiol.52:751-761(2004))。Aquifexaeolicus的柠檬酰辅酶A合成酶是由α和β亚基组成，所述亚基由sucC1和sucD1编码(Hugler等人,Environ.Microbiol.9:81-92(2007))。柠檬酰辅酶A裂合酶会将柠檬酰辅酶A裂解成草酰乙酸和乙酰辅酶A。该酶是由下述基因编码的同源三聚体：在嗜热氢杆菌中的ccl(Aoshima等人,Mol.Microbiol.52:763-770(2004))，和在Aquifex aeolicus中的aq_150(Hugler等人,出处同上(2007))。最近，已经在微温绿菌中报道了将柠檬酸转化成草酰乙酸和柠檬酰辅酶A的该机制的基因(Eisen等人,PNAS99(14):9509-14(2002))。
表14
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
ccsA BAD17844.1 46849514 嗜热氢杆菌
ccsB BAD17846.1 46849517 嗜热氢杆菌
sucC1 AAC07285 2983723 风产液菌
sucD1 AAC07686 2984152 风产液菌
ccl BAD17841.1 46849510 嗜热氢杆菌
aq_150 AAC06486 2982866 风产液菌
CT0380 NP_661284 21673219 微温绿菌
CT0269 NP_661173.1 21673108 微温绿菌
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
CT1834 AAM73055.1 21647851 微温绿菌
柠檬酸裂合酶(EC4.1.3.6，图2和3，E)催化一系列反应，从而导致柠檬酸裂解为乙酸和草酰乙酸。在某些实施方案中，在真核生物的细胞溶质中表达柠檬酸裂合酶。该酶在厌氧条件下是有活性的，且是由3个亚基组成：酰基-载体蛋白(ACP,γ)、ACP转移酶(α)和酰基裂合酶(β)。酶活化使用罕见辅基2’-(5”-磷酸核糖基)-3-‘-脱磷酸-CoA的共价结合和乙酰化，后者的结构与乙酰辅酶A类似。酰化是由CitC(一种柠檬酸裂合酶合成酶)催化。使用2种额外的蛋白CitG和CitX，将脱辅酶转化成有活性的全酶(Schneider等人,Biochemistry39:9438-9450(2000))。野生型大肠杆菌不具有柠檬酸裂合酶活性；但是，具有钼辅因子合成缺陷的突变体具有有活性的柠檬酸裂合酶(Clark,FEMS Microbiol.Lett.55:245-249(1990))。所述大肠杆菌酶是由citEFD编码，且所述柠檬酸裂合酶合成酶是由citC编码(Nilekani和SivaRaman,Biochemistry22:4657-4663(1983))。已经在大肠杆菌中克隆、表征和表达了肠膜明串珠菌柠檬酸裂合酶(Bekal等人,J.Bacteriol.180:647-654(1998))。还在使用柠檬酸作为碳源和能源的肠道菌中鉴别出了柠檬酸裂合酶，所述肠道菌包括鼠伤寒沙门菌和肺炎克雷伯菌(Bott,Arch.Microbiol.167:78-88(1997)；Bott和Dimroth,Mol.Microbiol.14:347-356(1994))。前述蛋白列在下表中。
表15
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
citF AAC73716.1 1786832 大肠杆菌
cite AAC73717.2 87081764 大肠杆菌
citD AAC73718.1 1786834 大肠杆菌
citC AAC73719.2 87081765 大肠杆菌
citG AAC73714.1 1786830 大肠杆菌
citX AAC73715.1 1786831 大肠杆菌
citF CAA71633.1 2842397 肠膜明串珠菌
citE CAA71632.1 2842396 肠膜明串珠菌
citD CAA71635.1 2842395 肠膜明串珠菌
citC CAA71636.1 3413797 肠膜明串珠菌
citG CAA71634.1 2842398 肠膜明串珠菌
citX CAA71634.1 2842398 肠膜明串珠菌
citF NP_459613.1 16763998 鼠伤寒沙门菌
citE AAL19573.1 16419133 鼠伤寒沙门菌
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
citD NP_459064.1 16763449 鼠伤寒沙门菌
citC NP_459616.1 16764001 鼠伤寒沙门菌
citG NP_459611.1 16763996 鼠伤寒沙门菌
citX NP_459612.1 16763997 鼠伤寒沙门菌
citF CAA56217.1 565619 肺炎克雷伯菌
citE CAA56216.1 565618 肺炎克雷伯菌
citD CAA56215.1 565617 肺炎克雷伯菌
citC BAH66541.1 238774045 肺炎克雷伯菌
citG CAA56218.1 565620 肺炎克雷伯菌
citX AAL60463.1 18140907 肺炎克雷伯菌
乙酸酰化为乙酰辅酶A，是由具有乙酰辅酶A合成酶活性的酶催化(图2和3，F)。在某些实施方案中，在真核生物的细胞溶质中表达乙酰辅酶A合成酶。2种催化该反应的酶是：形成AMP的乙酰辅酶A合成酶(EC6.2.1.1)和形成ADP的乙酰辅酶A合成酶(EC6.2.1.13)。形成AMP的乙酰辅酶A合成酶(ACS)是乙酸活化为乙酰辅酶A的主要酶。示例性的ACS酶存在于大肠杆菌(Brown等人,J.Gen.Microbiol.102:327-336(1977))、富养产碱菌(Priefert和Steinbuchel,J.Bacteriol.174:6590-6599(1992))、Methanothermobacter thermautotrophicus(Ingram-Smith和Smith,Archaea2:95-107(2007))、肠道沙门氏菌(Gulick等人,Biochemistry42:2866-2873(2003))和酿酒酵母(Jogl和Tong,Biochemistry43:1425-1431(2004))中。
表16
形成ADP的乙酰辅酶A合成酶(ACD，EC6.2.1.13)是将酰基辅酶A酯至它们的对应酸的转化与ATP的并行合成相偶联的另一种候选酶。已经在文献中描述了几种具有宽底物特异性的酶。经证实，得自闪烁古球菌的ACD I(由AF1211编码)作用于多种直链和支链底物，包括乙酰辅酶A、丙酰辅酶A、丁酰辅酶A、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、琥珀酸、富马酸、苯基乙酸、吲哚乙酸(Musfeldt等人,J.Bacteriol.184:636-644(2002))。得自死海嗜盐古细菌的酶(注解为琥珀酰辅酶A合成酶)接受丙酸、丁酸和支链酸(异戊酸和异丁酸)作为底物，并经证实会在正向和反向工作(Brasen等人,Arch.Microbiol.182:277-287(2004))。由得自超嗜热的crenarchaeon嗜气热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)的PAE3250编码的ACD表现出所有表征的ACD的最宽底物范围，其与乙酰辅酶A、异丁酰辅酶A(优选的底物)和苯基乙酰辅酶A反应(Brasen等人,出处同上(2004))。得自闪烁古球菌、死海嗜盐古细菌和嗜气热棒菌的酶都已经在大肠杆菌中克隆、功能性地表达和表征(Musfeldt等人,出处同上；Brasen等人,出处同上(2004))。其它候选物包括：在大肠杆菌中由sucCD编码的琥珀酰辅酶A合成酶(Buck等人,Biochemistry24:6245-6252(1985))和得自恶臭假单胞菌的酰辅酶A连接酶(Fernandez-Valverde等人,Appl.Environ.Microbiol.59:1149-1154(1993))。与这些蛋白和基因有关的信息显示在下面。
表17
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
AF1211 NP_070039.1 11498810 闪烁古球菌DSM4304
AF1983 NP_070807.1 11499565 闪烁古球菌DSM4304
scs YP_135572.1 55377722 死海嗜盐古细菌ATCC43049
PAE3250 NP_560604.1 18313937 嗜气热棒菌IM2菌株
sucC NP_415256.1 16128703 大肠杆菌
sucD AAC73823.1 1786949 大肠杆菌
paaF AAC24333.2 22711873 恶臭假单胞菌
用于给乙酸添加辅酶A部分的一种替代方法是，使用一对酶诸如转移磷酸的酰基转移酶和乙酸激酶(图2和3，F，图8E和8F)。该活性能够在消耗ATP的同时实现乙酰辅酶A的净形成。在某些实施方案中，在真核生物的细胞溶质中表达磷酸转乙酰酶。一种示例性的转移磷酸的酰基转移酶是由pta编码的磷酸转乙酰酶。得自大肠杆菌的pta基因编码可以将乙酰辅酶A转化成乙酰磷酸的酶，反之亦然(Suzuki,T.Biochim.Biophys.Acta191:559-569(1969))。该酶在该过程中也可以利用丙酰辅酶A替代乙酰辅酶A来形成丙酸(Hesslinger等人.Mol.Microbiol27:477-492(1998))。在包括肠道沙门氏菌和莱茵衣藻在内的几种其它生物中存在同系物。
表18
一种示例性的乙酸激酶是由ackA编码的大肠杆菌乙酸激酶(Skarstedt和Silverstein J.Biol.Chem.251:6775-6783(1976))。在包括肠道沙门氏菌和莱茵衣藻在内的几种其它生物中存在同系物。与这些蛋白和基因有关的信息显示在下面：
表19
在某些实施方案中，草酰乙酸转运蛋白将细胞溶质草酰乙酸运回线粒体中。运回线粒体中的草酰乙酸然后可以用在本文描述的乙酰辅酶A途径中。
几种运输蛋白可以实现草酰乙酸从细胞溶质至线粒体的运输。这样的蛋白要么将草酰乙酸(即，草酰乙酸转运蛋白，图2G和8H)直接输入至线粒体，要么在将诸如柠檬酸(即，柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白，图2C和8H)等分子从线粒体运输进细胞溶质中的同时将草酰乙酸输入至细胞溶质，如在图2和3中所示。在下表中提供了实现这些转化的示例性运输酶。
表20
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
OAC1 NP_012802.1 6322729 酿酒酵母S288c
KLLA0B12826g XP_452102.1 50304305 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
YALI0E04048g XP_503525.1 50552101 解脂耶氏酵母
CTRG_02239 XP_002547942.1 255726032 热带假丝酵母MYA-3404
DIC1 NP_013452.1 6323381 酿酒酵母S288c
YALI0B03344g XP_500457.1 50545838 解脂耶氏酵母
CTRG_02122 XP_002547815.1 255725772 热带假丝酵母MYA-3404
PAS_chr4_0877 XP_002494326.1 254574434 巴斯德毕赤酵母GS115
DTC CAC84549.1 19913113 拟南芥
DTC1 CAC84545.1 19913105 烟草
DTC2 CAC84546.1 19913107 烟草
DTC3 CAC84547.1 19913109 烟草
DTC4 CAC84548.1 19913111 烟草
DTC AAR06239.1 37964368 香橙
在某些实施方案中，细胞溶质草酰乙酸首先被细胞溶质苹果酸脱氢酶转化成苹果酸(图3H和8J)。苹果酸转运蛋白或柠檬酸/苹果酸转运蛋白将细胞溶质苹果酸运输进线粒体(图3和8，I)。线粒体苹果酸然后被线粒体苹果酸脱氢酶转化成草酰乙酸(图3J和8K)。线粒体草酰乙酸然后可以用在本文描述的乙酰辅酶A途径中。下面提供了这些酶中的每一种的示例性例子。
苹果酸脱氢酶(EC1.1.1.37，图3H和8J)将草酰乙酸转化成苹果酸。当苹果酸是从细胞溶质运输至线粒体的二羧酸酯时，可以使用细胞溶质和线粒体形式的苹果酸脱氢酶的表达，例如，如在图3中所示。酿酒酵母具有苹果酸脱氢酶的3个拷贝：MDH1(McAlister-Henn和Thompson,J.Bacteriol.169:5157-5166(1987)，MDH2(Minard和McAlister-Henn,Mol.Cell.Biol.11:370-380(1991)；Gibson和McAlister-Henn,J.Biol.Chem.278:25628-25636(2003))，和MDH3(Steffan和McAlister-Henn,J.Biol.Chem.267:24708-24715(1992))，它们分别定位至线粒体、细胞溶质和过氧化物酶体。在包括乳酸克鲁维酵母和热带假丝酵母在内的几种生物中，发现了得自酿酒酵母的细胞溶质苹果酸脱氢酶MDH2的近似同系物。还已知大肠杆菌具有由mdh编码的活性苹果酸脱氢酶。
表21
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
MDH1 NP_012838 6322765 酿酒酵母
MDH2 NP_014515 116006499 酿酒酵母
MDH3 NP_010205 6320125 酿酒酵母
Mdh NP_417703.1 16131126 大肠杆菌
KLLA0E07525p XP_454288.1 50308571 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
YALI0D16753g XP_502909.1 50550873 解脂耶氏酵母
CTRG_01021 XP_002546239.1 255722609 热带假丝酵母MYA-3404
几种运输蛋白可以实现苹果酸从细胞溶质至线粒体的运输。这样的蛋白要么将苹果酸(即，苹果酸转运蛋白)直接输入至线粒体，要么在将诸如柠檬酸(即，柠檬酸/苹果酸转运蛋白)等分子从线粒体运输进细胞溶质中的同时将苹果酸输入细胞溶质，如在图2、3和8中所示。在下表中提供了实现这些转化的示例性运输酶。
表22
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
OAC1 NP_012802.1 6322729 酿酒酵母S288c
KLLA0B12826g XP_452102.1 50304305 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
YALI0E04048g XP_503525.1 50552101 解脂耶氏酵母
CTRG_02239 XP_002547942.1 255726032 热带假丝酵母MYA-3404
DIC1 NP_013452.1 6323381 酿酒酵母S288c
YALI0B03344g XP_500457.1 50545838 解脂耶氏酵母
CTRG_02122 XP_002547815.1 255725772 热带假丝酵母MYA-3404
PAS_chr4_0877 XP_002494326.1 254574434 巴斯德毕赤酵母GS115
DTC CAC84549.1 19913113 拟南芥
DTC1 CAC84545.1 19913105 烟草
DTC2 CAC84546.1 19913107 烟草
DTC3 CAC84547.1 19913109 烟草
DTC4 CAC84548.1 19913111 烟草
DTC AAR06239.1 37964368 香橙
苹果酸脱氢酶(EC1.1.1.37,图3,J)可以将苹果酸转化成草酰乙酸。在某些实施方案中，当苹果酸是从细胞溶质运输至线粒体的二羧酸酯时，表达细胞溶质和线粒体形式的苹果酸脱氢酶，如在图3中所示。酿酒酵母具有苹果酸脱氢酶的3个拷贝：MDH1(McAlister-Henn和Thompson,J.Bacteriol.169:5157-5166(1987)，MDH2(Minard和McAlister-Henn,Mol.Cell.Biol.11:370-380(1991)；Gibson和McAlister-Henn,J.Biol.Chem.278:25628-25636(2003))，和MDH3(Steffan和McAlister-Henn,J.Biol.Chem.267:24708-24715(1992))，它们分别定位至线粒体、细胞溶质和过氧化物酶体。在包括乳酸克鲁维酵母、解脂耶氏酵母、热带假丝酵母在内的几种生物中，发现了得自酿酒酵母的线粒体苹果酸脱氢酶MDH1的近似同系物。还已知大肠杆菌具有由mdh编码的活性苹果酸脱氢酶。
表23
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
MDH1 NP_012838 6322765 酿酒酵母
MDH2 NP_014515 116006499 酿酒酵母
MDH3 NP_010205 6320125 酿酒酵母
Mdh NP_417703.1 16131126 大肠杆菌
KLLA0F25960g XP_456236.1 50312405 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
YALI0D16753g XP_502909.1 50550873 解脂耶氏酵母
CTRG_00226 XP_002545445.1 255721021 热带假丝酵母MYA-3404
实施例II
从细胞溶质丙酮酸生产细胞溶质乙酰辅酶A的途径
下述实施例描述了用于将细胞溶质丙酮酸和苏氨酸转化成细胞溶质乙酰辅酶A的示例性途径，如在图5中所示。
丙酮酸脱氢酶、丙酮酸甲酸裂合酶、丙酮酸:NAD(P)氧化还原酶或丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶可以催化丙酮酸至乙酰辅酶A的直接转化(图5H)。
丙酮酸至乙酰辅酶A的间接转化可以通过几个替代途径来进行。丙酮酸脱羧酶可以将丙酮酸转化成乙醛。酰化(辅酶A依赖性的)乙醛脱氢酶然后可以将乙醛转化成乙酰辅酶A。可替代地，由丙酮酸脱羧酶产生的乙醛可以通过“PDH旁路”途径转化成乙酰辅酶A。在该途径中，乙醛被乙醛脱氢酶氧化成乙酸，所述乙酸然后被辅酶A连接酶、合成酶或转移酶转化成乙酰辅酶A。在另一个实施方案中，乙酸中间体被乙酸激酶转化成乙酰磷酸，后者然后被磷酸转乙酰酶转化成乙酰辅酶A。在另一个实施方案中，丙酮酸氧化酶将丙酮酸直接转化成乙酰磷酸(乙酰磷酸形成)。形成乙酸的丙酮酸氧化酶也可以催化丙酮酸至乙酸中间体的转化。
图5描绘了细胞溶质丙酮酸至细胞溶质乙酰辅酶A的间接转化的几个途径(5A/5B、5A/5C/5D、5E/5F/5C/5D、5G/1D)。在第一个途径中，丙酮酸氧化酶将丙酮酸转化成乙酸(乙酸形成)(步骤A)。乙酸然后可以被乙酰辅酶A合成酶、连接酶或转移酶直接转化成乙酰辅酶A(步骤B)，或经由乙酰磷酸中间体间接转化成乙酰辅酶A(步骤C、D)。在一个替代途径中，丙酮酸脱羧酶将丙酮酸脱羧成乙醛(步骤E)。乙醛脱氢酶将乙醛氧化以形成乙酸(步骤F)。乙酸然后可以被乙酸激酶和磷酸转乙酰酶转化成乙酰辅酶A(步骤C和D)。在另一个途径中，丙酮酸氧化酶可以将丙酮酸氧化成乙酰磷酸(乙酰磷酸形成)(步骤G)。磷酸转乙酰酶然后可以将乙酰磷酸转化成乙酰辅酶A(步骤D)。
通过表达天然的或异源的苏氨酸醛缩酶，也可以从苏氨酸合成细胞溶质乙酰辅酶A(图5J)(van Maris等人,AEM69:2094-9(2003))。苏氨酸醛缩酶可以将苏氨酸转化成乙醛和甘氨酸。乙醛产物然后可以通过上述的多个途径转化成乙酰辅酶A。
下面描述了在图5中显示的乙酰辅酶A形成酶的基因候选物。
丙酮酸氧化酶(乙酸形成)(图5A)或丙酮酸:醌氧化还原酶(PQO)可以催化丙酮酸氧化脱羧为乙酸，其中使用泛醌(EC1.2.5.1)或醌(EC1.2.2.1)作为电子受体。大肠杆菌酶PoxB集中在内膜上(Abdel-Hamid等人,Microbiol147:1483-98(2001))。该酶具有硫胺焦磷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅因子(Koland和Gennis,Biochemistry21:4438-4442(1982))；O'Brien等人,Biochemistry16:3105-3109(1977)；O'Brien和Gennis,J.Biol.Chem.255:3302-3307(1980))。PoxB与酿酒酵母和运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶具有相似性。谷氨酸棒杆菌的pqo转录物编码醌依赖性的和形成乙酸的丙酮酸氧化还原酶(Schreiner等人,J Bacteriol188:1341-50(2006))。通过序列同源性可以推知类似的酶。
表24
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
poxB NP_415392.1 16128839 大肠杆菌
pqo YP_226851.1 62391449 谷氨酸棒杆菌
poxB YP_309835.1 74311416 宋氏志贺菌
poxB ZP_03065403.1 194433121 痢疾志贺菌
乙酸酰化为乙酰辅酶A(图5B)，可以由具有乙酰辅酶A合成酶、连接酶或转移酶活性的酶催化。2种可以催化该反应的酶是：形成AMP的乙酰辅酶A合成酶或连接酶(EC6.2.1.1)和形成ADP的乙酰辅酶A合成酶(EC6.2.1.13)。形成AMP的乙酰辅酶A合成酶(ACS)是乙酸活化为乙酰辅酶A的主要酶。示例性的ACS酶存在于大肠杆菌(Brown等人,J.Gen.Microbiol.102:327-336(1977))、富养产碱菌(Priefert和Steinbuchel,J.Bacteriol.174:6590-6599(1992))、Methanothermobacterthermautotrophicus(Ingram-Smith和Smith,Archaea2:95-107(2007))、肠道沙门氏菌(Gulick等人,Biochemistry42:2866-2873(2003))和酿酒酵母(Jogl和Tong,Biochemistry43:1425-1431(2004))中。形成ADP的乙酰辅酶A合成酶是具有通常宽底物范围的可逆酶(Musfeldt和Schonheit,J.Bacteriol.184:636-644(2002))。形成ADP的乙酰辅酶A合成酶的2种同工酶是由闪烁古球菌基因组中的AF1211和AF1983编码(Musfeldt和Schonheit,出处同上(2002))。得自死海嗜盐古细菌的酶(注解为琥珀酰辅酶A合成酶)也接受乙酸作为底物，且证实了该酶的可逆性(Brasen和Schonheit,Arch.Microbiol.182:277-287(2004))。由得自超嗜热的crenarchaeon Pyrobaculumaerophilum的PAE3250编码的ACD表现出所有表征的ACD的最宽底物范围，其与乙酸、异丁酰辅酶A(优选的底物)和苯基乙酰辅酶A反应(Brasen和Schonheit,出处同上(2004))。定向进化或工程改造可以用于修饰该酶，以在宿主生物的生理温度工作。得自闪烁古球菌、死海嗜盐古细菌和嗜气热棒菌的酶都已经在大肠杆菌中克隆、功能性地表达和表征(Brasen和Schonheit,出处同上(2004)；Musfeldt和Schonheit,出处同上(2002))。其它候选物包括：由大肠杆菌中的sucCD编码的琥珀酰辅酶A合成酶(Buck等人,Biochemistry24:6245-6252(1985))，和得自恶臭假单胞菌的酰基-CoA连接酶(Fernandez-Valverde等人,Appl.Environ.Microbiol.59:1149-1154(1993))。前述蛋白列在下表中。
表25
辅酶A转移酶也可以催化乙酸酰化为乙酰辅酶A(图5B)。众多酶采用乙酸作为辅酶A受体，从而导致乙酰辅酶A的形成。一种示例性的辅酶A转移酶是由大肠杆菌atoA(α亚基)和atoD(β亚基)基因编码的乙酰乙酰辅酶A转移酶(Korolev等人,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.58:2116-2121(2002)；Vanderwinkel等人,33:902-908(1968))。该酶具有宽底物范围(Sramek等人,Arch Biochem Biophys171:14-26(1975))，且已经被证实会将辅酶A部分从多种支链和直链酰辅酶A底物转移至乙酸，所述底物包括异丁酸(Matthies等人,Appl Environ.Microbiol58:1435-1439(1992))、戊酸(Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968))和丁酸(Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968))。类似的酶存在于谷氨酸棒杆菌ATCC13032(Duncan等人,68:5186-5190(2002))、丙酮丁醇梭菌(Cary等人,Appl Environ Microbiol56:1576-1583(1990)；Wiesenborn等人,Appl Environ Microbiol55:323-329(1989))和糖丁酸梭菌(Kosaka等人,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58-68(2007))中。
表26
基因 GI# 登记号 生物
atoA 2492994 P76459.1 大肠杆菌
atoD 2492990 P76458.1 大肠杆菌
actA 62391407 YP_226809.1 谷氨酸棒杆菌
cg0592 62389399 YP_224801.1 谷氨酸棒杆菌
ctfA 15004866 NP_149326.1 丙酮丁醇梭菌
ctfB 15004867 NP_149327.1 丙酮丁醇梭菌
ctfA 31075384 AAP42564.1 糖丁酸梭菌
ctfB 31075385 AAP42565.1 糖丁酸梭菌
乙酸激酶(EC2.7.2.1)可以催化乙酸至乙酰磷酸的可逆的ATP依赖性的磷酸化(图5C)。已经在许多生物中表征了示例性的乙酸激酶，所述生物包括大肠杆菌、丙酮丁醇梭菌和嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcinathermophila)(Ingram-Smith等人,J.Bacteriol.187:2386-2394(2005)；Fox和Roseman,J.Biol.Chem.261:13487-13497(1986)；Winzer等人,Microbioloy143(Pt10):3279-3286(1997))。还已经在大肠杆菌purT的基因产物中证实了乙酸激酶活性(Marolewski等人,Biochemistry33:2531-2537(1994)。有些丁酸激酶(EC2.7.2.7)，例如得自丙酮丁醇梭菌的buk1和buk2，也接受乙酸作为底物(Hartmanis,M.G.,J.Biol.Chem.262:617-621(1987))。在包括肠道沙门氏菌和莱茵衣藻在内的几种其它生物中存在同系物。
表27
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
ackA NP_416799.1 16130231 大肠杆菌
Ack AAB18301.1 1491790 丙酮丁醇梭菌
Ack AAA72042.1 349834 嗜热甲烷八叠球菌
purT AAC74919.1 1788155 大肠杆菌
buk1 NP_349675 15896326 丙酮丁醇梭菌
buk2 Q97II1 20137415 丙酮丁醇梭菌
ackA NP_461279.1 16765664 鼠伤寒沙门菌
ACK1 XP_001694505.1 159472745 莱茵衣藻
ACK2 XP_001691682.1 159466992 莱茵衣藻
磷酸转乙酰酶(EC2.3.1.8)可以催化从乙酰磷酸形成乙酰辅酶A(图5D)。得自大肠杆菌的pta基因编码将乙酰辅酶A可逆地转化成乙酰磷酸的酶(Suzuki,T.,Biochim.Biophys.Acta191:559-569(969))。已经在枯草芽孢杆菌(Rado和Hoch,Biochim.Biophys.Acta321:114-125(1973)、克鲁佛梭菌(Stadtman,E.,Methods Enzymol.1:5896-599(1955)和海栖热袍菌(Bock等人,J.Bacteriol.181:1861-1867(1999))中表征了其它乙酰基转移酶。该反应还可以由一些磷酸丁酰基转移酶(EC2.3.1.19)催化，包括得自丙酮丁醇梭菌的ptb基因产物(Wiesenborn等人,App.Environ.Microbiol.55:317-322(1989)；Walter等人,Gene134:107-111(1993))。在生产丁酸的细菌L2-50(Louis等人,J.Bacteriol.186:2099-2106(2004)和巨大芽孢杆菌(Vazquez等人,Curr.Microbiol.42:345-349(2001)中发现了其它ptb基因。在包括肠道沙门氏菌和莱茵衣藻在内的几种其它生物中存在大肠杆菌pta基因的同系物。
表28
丙酮酸脱羧酶(PDC)是醇发酵中的一种关键酶，其催化丙酮酸脱羧为乙醛。已经广泛地研究了得自酿酒酵母的PDC1酶(Killenberg-Jabs等人,Eur.J.Biochem.268:1698-1704(2001)；Li等人,Biochemistry.38:10004-10012(1999)；ter Schure等人,Appl.Environ.Microbiol.64:1303-1307(1998))。其它充分表征的PDC酶存在于运动发酵单胞菌(Siegert等人, Protein Eng Des Sel18:345-357(2005))、巴斯德氏醋杆菌(Chandra等人,176:443-451(2001))和乳酸克鲁维酵母(Krieger等人,269:3256-3263(2002))中。酿酒酵母的PDC1和PDC5酶受PDC2的正转录调节(Hohmann等人,Mol Gen Genet241:657-66 (1993))。由热带假丝酵母中的CTRG_03826 (GI:255729208)、乳酸克鲁维酵母中的PDC1(GI编号:1226007)、解脂耶氏酵母中的YALI0D10131g(GI:50550349)、巴斯德毕赤酵母中的PAS_chr3_0188(GI:254570575)、粟酒裂殖酵母中的丙酮酸脱羧酶(GI:GI:159883897)、黑曲霉中的ANI_1_1024084(GI:145241548)、ANI_1_796114(GI:317034487)、ANI_1_936024(GI:317026934)和ANI_1_2276014(GI:317025935)编码的蛋白也具有丙酮酸脱羧酶活性。
表29
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
pdc P06672.1 118391 运动发酵单胞菌
pdc1 P06169 30923172 酿酒酵母
Pdc2 NP_010366.1 6320286 酿酒酵母
Pdc5 NP_013235.1 6323163 酿酒酵母
CTRG_03826 XP_002549529 255729208 热带假丝酵母,
CU329670.1:585597.587312 CAA90807 159883897 粟酒裂殖酵母
YALI0D10131g XP_502647 50550349 解脂耶氏酵母
PAS_chr3_0188 XP_002492397 254570575 巴斯德毕赤酵母
pdc Q8L388 20385191 巴斯德氏醋杆菌
pdc1 Q12629 52788279 乳酸克鲁维酵母
ANI_1_1024084 XP_001393420 145241548 黑曲霉
ANI_1_796114 XP_001399817 317026934 黑曲霉
ANI_1_936024 XP_001396467 317034487 黑曲霉
ANI_1_2276014 XP_001388598 317025935 黑曲霉
EC类别1.2.1中的醛脱氢酶催化乙醛氧化为乙酸(图5F)。上面描述了编码该活性的示例性基因。具有乙醛氧化酶活性的醛氧化酶也可以催化乙醛至乙酸的氧化。这样的酶可以将乙醛、水和O2转化成乙酸和过氧化氢。在欧洲牛和小家鼠中可以发现已经证实会催化该转化的示例性醛氧化酶(Garattini等人,Cell Mol Life Sci65:1019-48(2008)；Cabre等人,BiochemSoc Trans15:882-3(1987))。其它醛氧化酶基因候选物包括由zmAO-1和zmAO-2编码的2种含有黄素和钼的玉米醛氧化酶(Sekimoto等人,J BiolChem272:15280-85(1997))。
表30
基因 GenBank登记号 GI No. 生物
zmAO-1 NP_001105308.1 162458742 玉米
zmAO-2 BAA23227.1 2589164 玉米
Aox1 O54754.2 20978408 小家鼠
XDH DAA24801.1 296482686 欧洲牛
丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)可以催化丙酮酸、氧和磷酸酯转化成乙酰磷酸和过氧化氢(图5G)。这类丙酮酸氧化酶是可溶性的，且需要辅因子硫胺二磷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。在乳酸细菌德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中可以发现形成乙酰磷酸的丙酮酸氧化酶(Lorquet等人,J Bacteriol186:3749-3759(2004)；Hager等人,Fed Proc13:734-38(1954))。已经揭示了植物乳杆菌酶的晶体结构(Muller等人，(1994))。在血链球菌(Streptococcussanguinis)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)中，形成乙酰磷酸的丙酮酸氧化酶是由spxB基因编码(Spellerberg等人,Mol Micro19:803-13(1996)；Ramos-Montanez等人,Mol Micro67:729-46(2008))。证实了SpxR在肺炎链球菌中正调节spxB的转录(Ramos-Montanez等人,出处同上)。通过序列同源性识别血链球菌中的类似调节剂。过氧化氢酶活性的引入或修饰可以减少过氧化氢产物的积累。
表31
基因 GenBank登记号 GI No. 生物
poxB NP_786788.1 28379896 植物乳杆菌
spxB L39074.1 1161269 肺炎链球菌
Spd_0969(spxR) YP_816445.1 116517139 肺炎链球菌
spxB ZP_07887723.1 315612812 血链球菌
spxR ZP_07887944.1GI: 315613033 血链球菌
丙酮酸脱氢酶(PDH)复合物可以催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A(图5H)。大肠杆菌PDH复合物由基因aceEF和lpdA编码。酶工程努力已经在厌氧条件下提高了大肠杆菌PDH酶活性(Kim等人,J.Bacteriol.190:3851-3858(2008)；Kim等人,Appl.Environ.Microbiol.73:1766-1771(2007)；Zhou等人,Biotechnol.Lett.30:335-342(2008))。与大肠杆菌PDH不同，枯草芽孢杆菌复合物是有活性的，且是在厌氧条件下的生长所必需的(Nakano等人,179:6749-6755(1997))。在甘油上生长过程中表征的肺炎克雷伯菌PDH在厌氧条件下也是有活性的(Menzel等人,56:135-142(1997))。得自牛肾的酶复合物(Zhou等人,98:14802-14807(2001))和得自维涅兰德固氮菌的E2催化域(Mattevi等人,Science.255:1544-1550(1992))的晶体结构是可得到的。有些哺乳动物PDH酶复合物可以与替代性底物诸如2-氧代丁酸反应。褐家鼠PDH和BCKAD的比较动力学指示，BCKAD对作为底物的2-氧代丁酸具有较高活性(Paxton等人,Biochem.J.234:295-303(1986))。酿酒酵母复合物可以由E2(LAT1)核心组成，所述核心结合E1(PDA1、PDB1)、E3(LPD1)和蛋白X(PDX1)组分(Pronk等人,Yeast12:1607-1633(1996))。
表32
基因 登记号 GI编号 生物
aceE NP_414656.1 16128107 大肠杆菌
aceF NP_414657.1 16128108 大肠杆菌
lpd NP_414658.1 16128109 大肠杆菌
pdhA P21881.1 3123238 枯草芽孢杆菌
pdhB P21882.1 129068 枯草芽孢杆菌
pdhC P21883.2 129054 枯草芽孢杆菌
pdhD P21880.1 118672 枯草芽孢杆菌
aceE YP_001333808.1 152968699 肺炎克雷伯菌
aceF YP_001333809.1 152968700 肺炎克雷伯菌
lpdA YP_001333810.1 152968701 肺炎克雷伯菌
Pdha1 NP_001004072.2 124430510 褐家鼠
Pdha2 NP_446446.1 16758900 褐家鼠
Dlat NP_112287.1 78365255 褐家鼠
Dld NP_955417.1 40786469 褐家鼠
LAT1 NP_014328 6324258 酿酒酵母
PDA1 NP_011105 37362644 酿酒酵母
PDB1 NP_009780 6319698 酿酒酵母
LPD1 NP_116635 14318501 酿酒酵母
PDX1 NP_011709 6321632 酿酒酵母
作为上述的大型多酶PDH复合物的替代方案，有些生物利用2-酮酸氧化还原酶家族(OFOR)中的酶来催化2-酮酸的酰化氧化脱羧。不同于脱氢酶复合物，这些酶含有铁-硫簇，利用不同的辅因子，并使用铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白作为电子受体来替代NAD(P)H。丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)可以催化丙酮酸的氧化以形成乙酰辅酶A(图5H)。已经在大肠杆菌中克隆和表达了得自非洲脱硫弧菌(Desulfovibrio africanus)的PFOR，从而产生在有氧存在下稳定数天的活性重组酶(Pieulle等人,J Bacteriol.179:5684-5692(1997))。氧稳定性在PFOR中是相对罕见的，且据信由非洲脱硫弧菌酶的多肽链中的60残基延伸赋予。也确定地表征了热醋穆尔氏菌(M.thermoacetica)PFOR(Menon等人,Biochemistry36:8484-8494(1997))，且甚至被证实在自养生长过程中在丙酮酸合成方向具有高活性(Furdui等人,J Biol Chem.275:28494-28499(2000))。此外，大肠杆菌具有未表征的开放读码框ydbK，其编码与热醋穆尔氏菌PFOR具有51％同一性的蛋白。已经描述了大肠杆菌中的丙酮酸氧化还原酶活性的证据(Blaschkowski等人,Eur.J Biochem.123:563-569(1982))。几种额外的PFOR酶描述在Ragsdale,Chem.Rev.103:2333-2346(2003)中。最后，黄素氧还蛋白还原酶(例如，得自幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)或空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的fqrB(St Maurice等人,J.Bacteriol.189:4764-4773(2007)))或Rnf-型蛋白(Seedorf等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U S.A.105:2128-2133(2008)；Herrmann等人,J.Bacteriol.190:784-791(2008))会提供从由PFOR产生的还原型铁氧还蛋白产生NADH或NADPH的方式。下面鉴别了这些蛋白。
表33
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
Por CAA70873.1 1770208 非洲脱硫弧菌
Por YP_428946.1 83588937 热醋穆尔氏菌
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
ydbK NP_415896.1 16129339 大肠杆菌
fqrB NP_207955.1 15645778 幽门螺杆菌
fqrB YP_001482096.1 157414840 空肠弯曲杆菌
RnfC EDK33306.1 146346770 克鲁佛梭菌
RnfD EDK33307.1 146346771 克鲁佛梭菌
RnfG EDK33308.1 146346772 克鲁佛梭菌
RnfE EDK33309.1 146346773 克鲁佛梭菌
RnfA EDK33310.1 146346774 克鲁佛梭菌
RnfB EDK33311.1 146346775 克鲁佛梭菌
丙酮酸甲酸裂合酶(PFL,EC2.3.1.54)(图5H)(在大肠杆菌中由pflB编码)可以将丙酮酸转化成乙酰辅酶A和甲酸。通过活化由pflA编码的酶，可以增强PFL的活性(Knappe等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A81:1332-1335(1984)；Wong等人,Biochemistry32:14102-14110(1993))。酮-酸甲酸裂合酶(EC2.3.1.-)也被称作2-酮丁酸甲酸裂合酶(KFL)和丙酮酸甲酸裂合酶4，是大肠杆菌中的tdcE的基因产物。该酶在厌氧性苏氨酸降解过程中催化2-酮丁酸转化成丙酰辅酶A和甲酸，并且也可以在厌氧性分解代谢中替换丙酮酸甲酸裂合酶(Simanshu等人,J Biosci.32:1195-1206(2007))。该酶是氧敏感的，且象PflB一样，可以需要PFL-AE的翻译后修饰，以活化活性位点中的甘氨酰残基(Hesslinger等人,Mol.Microbiol27:477-492(1998))。得自得自闪烁古球菌(Archaeglubus fulgidus)的丙酮酸甲酸裂合酶(由pflD编码)已经在大肠杆菌中进行了克隆、表达，并进行了表征(Lehtio等人,Protein Eng Des Sel17:545-552(2004))。已经揭示了闪烁古球菌和大肠杆菌酶的晶体结构(Lehtio等人,J Mol.Biol.357:221-235(2006)；Leppanen等人,Structure.7:733-744(1999))。在乳酸乳球菌(Melchiorsen等人,ApplMicrobiol Biotechnol58:338-344(2002))和变异链球菌(Takahashi-Abbe等人,Oral.Microbiol Immunol.18:293-297(2003))、莱茵衣藻(Hemschemeier等人,Eukaryot.细胞7:518-526(2008b)；Atteia等人,J.Biol.Chem.281:9909-9918(2006))和巴斯德梭菌(Weidner等人,J Bacteriol.178:2440-2444(1996))中发现了其它PFL和PFL-AE候选物。
表34
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
pflB NP_415423 16128870 大肠杆菌
pflA NP_415422.1 16128869 大肠杆菌
tdcE AAT48170.1 48994926 大肠杆菌
pflD NP_070278.1 11499044 闪烁古球菌
pfl CAA03993 2407931 乳酸乳球菌
pfl BAA09085 1129082 变异链球菌
PFL1 XP_001689719.1 159462978 莱茵衣藻
pflA1 XP_001700657.1 159485246 莱茵衣藻
pfl Q46266.1 2500058 巴斯德梭菌
act CAA63749.1 1072362 巴斯德梭菌
酰化乙醛脱氢酶(EC1.2.1.10)可以催化NAD(P)+依赖性的乙醛至乙酰辅酶A的氧化(图5I)。大肠杆菌的酰化乙醛脱氢酶是由adhE、eutE和mhpF编码(Ferrandez等人,J Bacteriol179:2573-81(1997))。假单胞菌属CF600酶(由dmpF编码)参与间位裂解途径，并与4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶形成复合物(Shingler等人,J Bacteriol174:711-24(1992))。产溶剂性生物诸如丙酮丁醇梭菌编码具有醇脱氢酶和乙醛脱氢酶活性的双功能酶。双功能的丙酮丁醇梭菌酶由bdh I和adhE2编码(Walter,等人,J.Bacteriol.174:7149-7158(1992)；Fontaine等人,J.Bacteriol.184:821-830(2002))。酰化乙醛脱氢酶的另一种候选物是得自拜氏梭菌的ald基因(Toth,Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980(1999)。该基因非常类似于鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌的eutE乙醛脱氢酶基因(Toth,Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980(1999)。
表35
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
adhE NP_415757.1 16129202 大肠杆菌
mhpF NP_414885.1 16128336 大肠杆菌
dmpF CAA43226.1 45683 假单胞菌属CF600
adhE2 AAK09379.1 12958626 丙酮丁醇梭菌
bdh I NP_349892.1 15896543 丙酮丁醇梭菌
Ald AAT66436 49473535 拜氏梭菌
eutE NP_416950 16130380 大肠杆菌
eutE AAA80209 687645 鼠伤寒沙门菌
苏氨酸醛缩酶(EC4.1.2.5)催化苏氨酸裂解为甘氨酸和乙醛(图5J)。酿酒酵母和白色假丝酵母酶是由GLY1编码(Liu等人,Eur J Biochem245:289-93(1997)；McNeil等人,Yeast16:167-75(2000))。大肠杆菌的ltaE和glyA基因产物也编码具有该活性的酶(Liu等人,Eur J Biochem255:220-6(1998))。
表36
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
GLY1 NP_010868.1 6320789 酿酒酵母
GLY1 AAB64198.1 2282060 白色假丝酵母
ltaE AAC73957.1 1787095 大肠杆菌
glyA AAC75604.1 1788902 大肠杆菌
实施例III
肉碱介导的增加从线粒体和过氧化物酶体乙酰辅酶A至细胞溶质乙酰 辅酶A的易位途径
本实施例描述了肉碱介导的乙酰辅酶A从真核细胞的线粒体和过氧化物酶体至细胞溶质的易位途径。
乙酰辅酶A是在不同的细胞隔室中发生的生物合成和降解途径的关键代谢中间体。例如，在糖上生长的过程中，大多数乙酰辅酶A是在线粒体中产生，在此处它供料进TCA循环。在脂肪酸底物(诸如油酸)上生长过程中，乙酰辅酶A是在过氧化物酶体中形成，在此处发生β-氧化降解反应。在双碳底物(诸如乙醇或乙酸)上生长过程中，在细胞溶质中产生大多数乙酰辅酶A。乙酰辅酶A或乙酰基单元在细胞隔室之间的运输是实现在不同底物上的生长所必需的。
一种增加细胞溶质乙酰辅酶A的方案是，改变乙酰辅酶A或乙酰基单元在细胞隔室之间的运输。几种在细胞隔室之间运输乙酰辅酶A或乙酰基单元的机制是本领域已知的。例如，许多真核生物使用载体分子肉碱运输乙酰基单元(van Roermund等人,EMBO J14:3480-86(1995))。已经在诸如白色假丝酵母等酵母中表征了在细胞隔室之间的乙酰肉碱穿梭(Strijbis等人,J Biol Chem285:24335-46(2010))。在这些穿梭中，乙酰辅酶A的乙酰基部分被乙酰肉碱转移酶可逆地转移至肉碱。乙酰肉碱/肉碱移位酶然后可以跨膜运输乙酰肉碱。在易位以后，乙酰肉碱转移酶可以再生乙酰辅酶A。
在图6中描绘了示例性的乙酰肉碱易位途径。在一个途径中，线粒体乙酰辅酶A被线粒体肉碱乙酰基转移酶转化成乙酰肉碱(步骤A)。线粒体乙酰肉碱然后可以被线粒体乙酰肉碱移位酶跨线粒体膜转移进细胞溶质中(步骤D)。细胞溶质乙酰肉碱转移酶再生乙酰辅酶A(步骤C)。过氧化物酶体乙酰辅酶A被过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶转化成乙酰肉碱(步骤B)。过氧化物酶体乙酰肉碱然后可以被过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶跨过氧化物酶体膜转移进细胞溶质中(步骤E)，然后被细胞溶质乙酰肉碱转移酶转化成细胞溶质乙酰辅酶A(步骤C)。
尽管有些酵母生物(诸如白色假丝酵母)从头合成肉碱，其它生物(诸如酿酒酵母)不会(van Roermund等人,EMBO J18:5843-52(1999))。不能从头合成肉碱的生物可以从外源获得肉碱，或者可以经工程改造成表达一种或多种肉碱生物合成途径酶以及乙酰辅酶A从细胞隔室穿梭至细胞质所需的乙酰基转移酶和移位酶。肉碱生物合成途径是本领域已知的。例如，在白色假丝酵母中，在4个酶促步骤中从三甲基-L-赖氨酸合成肉碱(Strijbis等人,FASEB J23:2349-59(2009))。
在下面更详细地描述了肉碱穿梭蛋白的酶候选物和肉碱生物合成途径。
肉碱乙酰基转移酶(CAT,EC2.3.1.7)将来自乙酰辅酶A的乙酰基单元可逆地连接至载体分子肉碱。白色假丝酵母编码3种CAT同工酶：Cat2、Yat1和Yat2(Strijbis等人,J Biol Chem285:24335-46(2010))。Cat2在线粒体和过氧化物酶体中表达，而Yat1和Yat2是细胞溶质的。Cat2转录物含有2个在不同的碳源条件下受调节的起始密码子。较长的转录物含有线粒体靶向序列，而较短的转录物被靶向过氧化物酶体。酿酒酵母的Cat2和构巢曲霉的AcuJ采用双重定位的类似机制(Elgersma等人,EMBO J14:3472-9(1995)；Hynes等人,Euk Cell10:547-55(2011))。构巢曲霉的细胞溶质CAT由facC编码。在褐家鼠和智人中发现了其它示例性的CAT酶(Cordente等人,Biochem45:6133-41(2006))。示例性的肉碱酰基转移酶(EC2.3.1.21)是褐家鼠的Cpt1和Cpt2基因产物(de Vries等人,Biochem36:5285-92(1997))。
表37
蛋白 登记号 GI编号 生物
Cat2 AAN31660.1 23394954 白色假丝酵母
Yat1 AAN31659.1 23394952 白色假丝酵母
Yat2 XP_711005.1 68490355 白色假丝酵母
Cat2 CAA88327.1 683665 酿酒酵母
Yat1 AAC09495.1 456138 酿酒酵母
Yat2 NP_010941.1 6320862 酿酒酵母
AcuJ CBF69795.1 259479509 构巢曲霉
FacC AAC82487.1 2511761 构巢曲霉
Crat AAH83616.1 53733439 褐家鼠
Crat P43155.5 215274265 智人
Cpt1 AAB48046.1 1850590 褐家鼠
Cpt2 AAB02339.1 1374784 褐家鼠
肉碱-乙酰肉碱移位酶可以催化肉碱和肉碱-脂肪酸复合物的双向运输。Cact基因产物会提供跨线粒体膜的运输机制(Ramsay等人BiochimBiophys Acta1546:21-42(2001))。已经在人类中研究了一种类似的蛋白(Sekoguchi等人,J Biol Chem278:38796-38802(2003))。酿酒酵母线粒体肉碱载体是Crc1(van Roermund等人,出处同上；Palmieri等人,Biochimica etBiophys Acta1757:1249-62(2006))。人肉碱移位酶能够补足酿酒酵母的Crc1-缺陷型菌株(van Roermund等人,出处同上)。在黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)和漂亮新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)中发现的2种额外肉碱移位酶也能够补足Crc1-缺陷型酵母(Oey等人,Mol Genet Metab85:121-24(2005))。基于与酵母和人转运蛋白的序列同源性，在布鲁斯锥虫中鉴别出4种线粒体肉碱/乙酰肉碱载体(Colasante等人,Mol BiochemParasit167:104-117(2009))。通过序列同源性，也鉴别出了白色假丝酵母的肉碱转运蛋白。一种额外的线粒体肉碱转运蛋白是构巢曲霉的acuH基因产物，其排它地集中至线粒体膜(Lucas等人,FEMS Microbiol Lett201:193-8(2006))。
表38
蛋白 登记号 GI编号 生物
Cact P97521.1 2497984 褐家鼠
Cacl NP_001034444.1 86198310 智人
CaO19.2851 XP_715782.1 68480576 白色假丝酵母
Crc1p NP_014743.1 6324674 酿酒酵母
Dif-1 CAA88283.1 829102 漂亮新小杆线虫
colt CAA73099.1 1944534 黑腹果蝇
Tb11.02.2960 EAN79492.1 70833990 布鲁斯锥虫
Tb11.03.0870 EAN79007.1 70833505 布鲁斯锥虫
Tb11.01.5040 EAN80288.1 70834786 布鲁斯锥虫
Tb927.8.5810 AAX69329.1 62175181 布鲁斯锥虫
acuH CAB44434.1 5019305 构巢曲霉
尚未充分表征肉碱和乙酰肉碱跨过氧化物酶体膜的运输。迄今为止尚未鉴别酵母中的具体过氧化物酶体乙酰肉碱载体蛋白。线粒体肉碱移位酶也可能在肉碱和乙酰肉碱的过氧化物酶体运输中起作用。可替代地，过氧化物酶体膜可以透过肉碱和乙酰肉碱。实验证据提示，小家鼠的OCTN3蛋白是过氧化物酶体肉碱/酰基肉碱转移酶。
另一种可能性是，诸如酿酒酵母的Pxa1和Pxa2ABC转运蛋白或智人的ALDP ABC转运蛋白等乙酰辅酶A转运蛋白跨过氧化物酶体或线粒体膜运输乙酰辅酶A或乙酰肉碱(van Roermund等人,FASEB J22:4201-8(2008))。Pxa1和Pxa2在过氧化物酶体膜中形成异源二聚体复合物并运输长链酰基辅酶A酯(Verleur等人,Eur J Biochem249:657-61(1997))。通过ALDP的异源表达，可以挽救pxa1/pxa2缺陷型酵母的突变体表型，其经证实会运输多种酰辅酶A底物(van Roermund等人,FASEB J22:4201-8(2008))。
表39
蛋白 登记号 GI编号 生物
OCTN3 BAA78343.1 4996131 小家鼠
Pxa1 AAC49009.1 619668 酿酒酵母
Pxa2 AAB51597.1 1931633 酿酒酵母
ALDP NP_000024.2 7262393 智人
最近表征了白色假丝酵母的4步肉碱生物合成途径。在蛋白降解过程中产生途径前体三甲基赖氨酸(TML)。TML双加氧酶(CaO13.4316)将TML羟基化以形成3-羟基-6-N-三甲基赖氨酸。吡哆醛-5’-磷酸依赖性的醛缩酶(CaO19.6305)然后将HTML切割成4-三甲基氨基丁醛。4-三甲基氨基丁醛随后被脱氢酶(CaO19.6306)氧化成4-三甲基氨基丁酸。在最后一步中，4-三甲基氨基丁酸被CaO19.7131的基因产物羟基化以形成肉碱。穿过肉碱生物合成途径的通量受限于途径底物的可用性，且非常低水平的肉碱似乎对于正常的肉碱穿梭活性而言是足够的(Strejbis等人,IUBMB Life62:357-62(2010))。
表40
蛋白 登记号 GI编号 生物
CaO19.4316 XP_720623.1 68470755 白色假丝酵母
CaO19.6305 XP_711090.1 68490151 白色假丝酵母
CaO19.6306 XP_711091.1 68490153 白色假丝酵母
CaO19.7131 XP_715182.1 68481628 白色假丝酵母
不能从头合成肉碱的生物可以从生长培养基摄取肉碱。通过肉碱转运蛋白(诸如酿酒酵母的Agp2)的表达，可以实现肉碱的摄取(van Roermund等人,出处同上)。
表41
蛋白 登记号 GI编号 生物
Agp2 NP_009690.1 6319608 酿酒酵母
实施例IV
用于从乙酰辅酶A生产1,3-丁二醇的途径
通过如图4中所述的几种替代途径，可以实现1,3-BDO生产。所有途径首先采用硫解酶将2个乙酰辅酶A分子转化成1个乙酰乙酰辅酶A分子。乙酰乙酰辅酶A硫解酶将2个乙酰辅酶A分子转化成乙酰乙酰辅酶A和辅酶A各自的1个分子(步骤A,图4)。示例性的乙酰乙酰辅酶A硫解酶包括：得自大肠杆菌的atoB(Martin等人,Nat.Biotechnol.21:796-802(2003)、得自丙酮丁醇梭菌的thlA和thlB(Hanai等人,Appl.Environ.Microbiol.73:7814-7818(2007)；Winzer等人,J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2:531-541(2000)和得自酿酒酵母的ERG10(Hiser等人,J.Biol.Chem.269:31383-31389(1994)的基因产物。得自生枝动胶菌的乙酰乙酰辅酶A硫解酶在生物合成方向是不可逆的，且晶体结构是可得到的(Merilainen等人,Biochem48:11011-25(2009))。
表42
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
AtoB NP_416728 16130161 大肠杆菌
ThlA NP_349476.1 15896127 丙酮丁醇梭菌
ThlB NP_149242.1 15004782 丙酮丁醇梭菌
ERG10 NP_015297 6325229 酿酒酵母
phbA P07097.4 135759 生枝动胶菌
催化乙酰乙酰辅酶A还原为3-羟基丁酰辅酶A的乙酰乙酰辅酶A还原酶(步骤H，图4)参与梭菌科(Clostridia)的几个种中的通向丁酸的乙酰辅酶A发酵途径，并且已经进行了详细研究(Jones和Woods,Microbiol.Rev.50:484-524(1986))。已经在大肠杆菌中克隆并在功能上表达了得自丙酮丁醇梭菌的酶，其由hbd编码(Youngleson等人,J.Bacteriol.171:6800-6807(1989))。另外，大肠杆菌中的2种脂肪酸氧化复合物的亚基(由fadB和fadJ编码)作为3-羟基酰辅酶A脱氢酶起作用(Binstockand Schulz,MethodsEnzymol.71Pt C:403-411(1981))。经证实会将乙酰乙酰辅酶A还原为3-羟基丁酰辅酶A的其它基因候选物是：得自生枝动胶菌的phbB(Ploux等人,Eur.J.Biochem.174:177-182(1988)和得自球形红杆菌的phaB(Alber等人,Mol.Microbiol.61:297-309(2006)。前一种基因候选物是NADPH依赖性的，已经确定了它的核苷酸序列(Peoples和Sinskey,Mol.Microbiol.3:349-357(1989)，并已经在大肠杆菌中表达了该基因。对所述基因的底物特异性研究导致以下结论：除了乙酰乙酰辅酶A以外，它可以接受3-氧代丙酰辅酶A作为底物(Ploux等人,Eur.J.Biochem.174:177-182(1988))。其它基因候选物包括克鲁佛梭菌中的Hbd1(C-端结构域)和Hbd2(N-端结构域)(Hillmer和Gottschalk,Biochim.Biophys.Acta3334:12-23(1974))和欧洲牛中的HSD17B10(Wakil等人,J.Biol.Chem.207:631-638(1954))。
表43
蛋白 Genbank ID GI编号 生物
fadB P21177.2 119811 大肠杆菌
fadJ P77399.1 3334437 大肠杆菌
Hbd2 EDK34807.1 146348271 克鲁佛梭菌
Hbd1 EDK32512.1 146345976 克鲁佛梭菌
Hbd P52041.2 丙酮丁醇梭菌
HSD17B10 O02691.3 3183024 欧洲牛
phbB P23238.1 130017 生枝动胶菌
phaB YP_353825.1 77464321 球形红杆菌
已经在梭菌属的其它物种中和在勤奋生金球菌中发现了许多类似酶(Berg等人,Science318:1782-1786(2007)。
表44
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
Hbd NP_349314.1 NP_349314.1 丙酮丁醇梭菌
Hbd AAM14586.1 AAM14586.1 拜氏梭菌
Msed_1423 YP_001191505 YP_001191505 勤奋生金球菌
Msed_0399 YP_001190500 YP_001190500 勤奋生金球菌
Msed_0389 YP_001190490 YP_001190490 勤奋生金球菌
Msed_1993 YP_001192057 YP_001192057 勤奋生金球菌
几种酰辅酶A脱氢酶能够将酰辅酶A还原成它的对应醛(步骤E、I，图4)。编码这类酶的示例性基因包括：编码脂肪酰辅酶A还原酶的醋酸钙不动杆菌acr1(Reiser和Somerville,J.Bacteriol.179:2969-2975(1997)，不动杆菌属M-1脂肪酰辅酶A还原酶(Ishige等人,Appl.Environ.Microbiol.68:1192-1195(2002)，和由克鲁佛梭菌中的sucD基因编码的辅酶A-和NADP-依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶(Sohling和Gottschalk,J.Bacteriol.178:871-880(1996)；Sohling和Gottschalk,J.Bacteriol.1778:871-880(1996))。牙龈卟啉单胞菌的SucD是另一种琥珀酸半醛脱氢酶(Takahashi等人,J.Bacteriol.182:4704-4710(2000)。假单胞菌属中的酶酰化乙醛脱氢酶(由bphG编码)是另一种候选物，因为已经证实它会氧化和酰化乙醛、丙醛、丁醛、异丁醛和甲醛(Powlowski等人,J.Bacteriol.175:377-385(1993))。除了将乙酰辅酶A还原为乙醇以外，已经证实由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶会将支链化合物异丁醛氧化为异丁酰辅酶A(Kazahaya等人,J.Gen.Appl.Microbiol.18:45-55(1972)；Koo等人,Biotechnol.Lett.27:505-510(2005))。丁醛脱氢酶会在产溶剂性生物(诸如糖丁酸梭菌)中催化类似的反应：丁酰辅酶A至丁醛的转化(Kosaka等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.71:58-68(2007))。在食烯烃脱硫杆菌(Desulfatibacillumalkenivorans)、柯氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)和硒还原芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)中发现了其它醛脱氢酶酶候选物。
表45
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
acr1 YP_047869.1 50086355 醋酸钙不动杆菌
acr1 AAC45217 1684886 Acinetobacter baylyi
acr1 BAB85476.1 18857901 不动杆菌属菌株M-1
sucD P38947.1 172046062 克鲁佛梭菌
sucD NP_904963.1 34540484 牙龈卟啉单胞菌
bphG BAA03892.1 425213 假单胞菌属
adhE AAV66076.1 55818563 肠膜明串珠菌
Bld AAP42563.1 31075383 糖丁酸梭菌
Ald ACL06658.1 218764192 食烯烃脱硫杆菌AK-01
Ald YP_001452373 157145054 柯氏柠檬酸杆菌ATCC BAA-895
pduP NP_460996.1 16765381 鼠伤寒肠道沙门氏菌
pduP ABJ64680.1 116099531 短乳杆菌ATCC367
BselDRAFT_1651 ZP_02169447 163762382 硒还原芽孢杆菌MLS10
将酰基辅酶A转化成它的对应醛的其它酶类型是丙二酰辅酶A还原酶，该酶将丙二酰辅酶A转化成丙二酸半醛。丙二酰辅酶A还原酶是在嗜热嗜酸古细菌中通过3-羟基丙酸循环进行自养碳固定的一种关键酶(Berg等人,Science318:1782-1786(2007)；Thauer,Science318:1732-1733(2007))。该酶利用NADPH作为辅因子，且已经在生金球形菌属和硫化叶菌属中表征(Alber等人,J.Bacteriol.188:8551-8559(2006)；Hugler等人,J.Bacteriol.184:2404-2410(2002))。该酶是由勤奋生金球菌中的Msed_0709编码(Alber等人,出处同上(2006)；Berg等人,Science318:1782-1786(2007))。在大肠杆菌中克隆和异源地表达了得自Sulfolobus tokodaii的编码丙二酰辅酶A还原酶的基因(Alber等人,J.Bacteriol.188:8551-8559(2006))。还已经证实，该酶催化甲基丙二酰辅酶A转化成它的对应醛(WO2007/141208(2007))。尽管这些酶的醛脱氢酶功能性与得自橙色绿屈挠菌(Chloroflexusaurantiacus)的双功能脱氢酶类似，但是基本上没有序列相似性。两种丙二酰辅酶A还原酶候选物与天冬氨酸-半醛脱氢酶具有高序列相似性，所述天冬氨酸-半醛脱氢酶是催化天冬氨酰基-4-磷酸至天冬氨酸半醛的还原和同时去磷酸化的酶。通过与蛋白的序列同源性，可以在其它生物(包括硫矿硫化叶菌和酸热硫化叶菌)中发现其它基因候选物，且已经列出在下面。酰化辅酶A的醛脱氢酶的另一种候选物是，得自拜氏梭菌的ald基因(Toth等人,Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980(1999)。已经报道，该酶会将乙酰辅酶A和丁酰辅酶A还原为它们的对应醛。该基因非常类似于eutE，后者编码鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌的乙醛脱氢酶(Toth等人,出处同上)。
表46
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
Msed_0709 YP_001190808.1 146303492 勤奋生金球菌
Mcr NP_378167.1 15922498 Sulfolobus tokodaii
asd-2 NP_343563.1 15898958 硫矿硫化叶菌
Saci_2370 YP_256941.1 70608071 酸热硫化叶菌
Ald AAT66436 9473535 拜氏梭菌
eutE AAA80209 687645 鼠伤寒沙门菌
eutE P77445 2498347 大肠杆菌
编码催化醛转化为醇(图4的步骤C和G)的酶(即，醇脱氢酶或等效的醛还原酶)的示例性基因包括：编码C2-C14的中链醇脱氢酶的alrA(Tani等人,Appl.Environ.Microbiol.,66:5231-5235(2000))，得自酿酒酵母的ADH2(Atsumi等人,Nature,451:86-89(2008))，对长于C3的分子具有偏好的得自大肠杆菌的yqhD(Sulzenbacher等人,J.of Molecular Biology,342:489-502(2004))，和将丁醛转化成丁醇的得自丙酮丁醇梭菌的bdh I和bdh II(Walter等人,J.of Bacteriology,174:7149-7158(1992))。yqhD的基因产物催化乙醛、丙二醛、丙醛、丁醛和丙烯醛的还原，其中使用NADPH作为辅因子(Perez等人,J.Biol.Chem.,283:7346-7353(2008))。已经证实，得自运动发酵单胞菌的adhA基因产物对许多醛具有活性，所述醛包括甲醛、乙醛、丙醛、丁醛和丙烯醛(Kinoshita等人,Appl.Microbiol.Biotechnol,22:249-254(1985))。其它醛还原酶候选物由糖丁酸梭菌中的bdh和拜氏梭菌中的Cbei_1722、Cbei_2181和Cbei_2421编码。
表47
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
alrA BAB12273.1 9967138 不动杆菌属菌株M-1
ADH2 NP_014032.1 6323961 酿酒酵母
yqhD NP_417484.1 16130909 大肠杆菌
bdh I NP_349892.1 15896543 丙酮丁醇梭菌
bdh II NP_349891.1 15896542 丙酮丁醇梭菌
adhA YP_162971.1 56552132 运动发酵单胞菌
bdh BAF45463.1 124221917 糖丁酸梭菌
Cbei_1722 YP_001308850 150016596 拜氏梭菌
Cbei_2181 YP_001309304 150017050 拜氏梭菌
Cbei_2421 YP_001309535 150017281 拜氏梭菌
表现出4-羟基丁醛还原酶活性的酶(EC1.1.1.61)也落入该类别中。已经在富养产碱菌(Bravo等人,J.Forensic Sci.,49:379-387(2004))、克鲁佛梭菌(Wolff等人,Protein Expr.Purif.,6:206-212(1995))和拟南芥(Breitkreuz等人,J.Biol.Chem.,278:41552-41556(2003))中表征了这样的酶。另一种基因是醇脱氢酶；得自热葡糖苷酶土芽孢杆菌的adhI(Jeon等人,J.Biotechnol.,135:127-133(2008))。
表48
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
4hbd YP_726053.1 113867564 富养产碱菌H16
4hbd L21902.1 146348486 克鲁佛梭菌DSM555
4hbd Q94B07 75249805 拟南芥
adhI AAR91477.1 40795502 热葡糖苷酶土芽孢杆菌M10EXG
另一种示例性的酶是3-羟基异丁酸脱氢酶，其催化3-羟基异丁酸至甲基丙二酸半醛的可逆氧化。该酶参与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解，且已经在细菌、真核生物和哺乳动物中鉴别。已经在结构上表征了由得自嗜热栖热菌HB8的P84067编码的酶(Lokanath等人,J.Mol.Biol.,352:905-917(2005))。使用同位素标记的底物证实了人3-羟基异丁酸脱氢酶的可逆性(Manning等人,Biochem J.,231:481-484(1985))。编码该酶的其它基因包括：在智人(Hawes等人,Methods Enzymol,324:218-228(2000))和穴兔(Hawes等人,出处同上；Chowdhury等人,Biosci.Biotechnol Biochem.,60:2043-2047(1996))中的3hidh，在铜绿假单孢菌和恶臭假单胞菌中的mmsB(Liao等人,美国专利20050221466)，和在恶臭假单胞菌中的dhat(Aberhart等人,J.Chem.Soc.,6:1404-1406(1979)；Chowdhury等人,出处同上；Chowdhury等人,Biosci.Biotechnol Biochem.,67:438-441(2003))。
表49
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
P84067 P84067 75345323 嗜热栖热菌
3hidh P31937.2 12643395 智人
3hidh P32185.1 416872 穴兔
mmsB P28811.1 127211 铜绿假单孢菌
mmsB NP_746775.1 26991350 恶臭假单胞菌
dhat Q59477.1 2842618 恶臭假单胞菌
将酰基辅酶A转化成醇(例如，图4的步骤B和J)的示例性两步氧化还原酶包括：将底物诸如乙酰辅酶A转化成乙醇(例如，得自大肠杆菌的adhE(Kessler等人,FEBS Lett.281:59-63(1991))和将丁酰辅酶A转化成丁醇(例如得自丙酮丁醇梭菌的adhE2(Fontaine等人,J.Bacteriol.184:821-830(2002))的那些酶。除了将乙酰辅酶A还原为乙醇以外，已经证实由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶会将支链化合物异丁醛氧化成异丁酰辅酶A(Kazahaya等人,J.Gen.Appl.Microbiol.18:43-55(1972)；Koo等人,Biotechnol.Lett.27:505-510(2005))。
表50
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
adhE NP_415757.1 16129202 大肠杆菌
adhE2 AAK09379.1 12958626 丙酮丁醇梭菌
adhE AAV66076.1 55818563 肠膜明串珠菌
另一种示例性酶可以将丙二酰辅酶A转化成3-HP。已经在橙色绿屈挠菌中表征了具有此活性的NADPH依赖性的酶，其中所述酶参与3-羟基丙酸循环(Hugler等人,J.Bacteriol.184:2404-2410(2002)；Strauss和Fuchs,Eur.J.Biochem.215:633-643(1993)。该酶的质量为300kDa，其具有高度的底物特异性，且与其它已知的氧化还原酶几乎没有序列相似性(Hugler,出处同上(2002))。没有证实在其它生物中的酶可催化该特异性反应；然而，有生物信息学证据证明，其它生物可能具有类似的途径(Klatt等人,Environ.Microbiol.9:2067-2078(2007))。通过序列相似性，可以推断出在其它生物中的酶候选物，所述生物包括卡氏玫瑰弯菌(Roseiflexuscastenholzii)、赤杆菌属NAP1和和海洋γ变形杆菌HTCC2080。
表51
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
Rcas_2929 YP_001433009.1 156742880 卡氏玫瑰弯菌
NAP1_02720 ZP_01039179.1 85708113 赤杆菌属NAP1
MGP2080_00535 ZP_01626393.1 119504313 海洋γ变形杆菌HTCC2080
更长链的酰基辅酶A分子可被诸如希蒙得木(加州希蒙得木)FAR等酶还原，所述FAR编码形成醇的脂肪酰辅酶A还原酶。其在大肠杆菌中的过表达会导致FAR活性和脂肪醇的积累(Metz等人,Plant Physiol.122:635-644(2000))。
表52
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
FAR AAD38039.1 5020215 霍霍巴
存在几种将酮转化成羟基官能团(例如，图4的步骤D、F和O)的示例性醇脱氢酶。得自大肠杆菌的2种这样的酶由苹果酸脱氢酶(mdh)和乳酸脱氢酶(ldhA)编码。另外，已经证实，得自富养产碱菌的乳酸脱氢酶会表现出对不同链长度的底物(诸如乳酸、2-氧代丁酸、2-氧代戊酸和2-氧代戊二酸)的高活性(Steinbuchel和Schlegel,Eur.J.Biochem.130:329-334(1983))。氧代官能团至羟基的转化，也可以由2-酮1,3-BDO还原酶催化，据报道，该酶存在于大鼠和人胎盘中(Suda等人,Arch.Biochem.Biophys.176:610-620(1976)；Suda等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.77:586-591(1977))。这些步骤的另一种候选物是得自人心脏的线粒体3-羟基丁酸脱氢酶(bdh)，其已经被克隆并表征(Marks等人,J.Biol.Chem.267:15459-15463(1992))。
表53
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
Mdh AAC76268.1 1789632 大肠杆菌
ldhA NP_415898.1 16129341 大肠杆菌
Ldh YP_725182.1 113866693 富养产碱菌
Bdh AAA58352.1 177198 智人
在赤红球菌(Rhodococcus ruber)(Kosjek等人,Biotechnol Bioeng.86:55-62(2004))和强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(van der等人,Eur.J.Biochem.268:3062-3068(2001))中可以发现其它示例性酶。例如，能够实现该转化的第二种醇脱氢酶包括：得自拜氏梭菌的adh(Hanai等人,Appl Environ Microbiol73:7814-7818(2007)；Jojima等人,Appl MicrobiolBiotechnol77:1219-1224(2008))，和得自布氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)的adh(Hanai等人,Appl Environ Microbiol73:7814-7818(2007)；Peretz等人,Anaerobe3:259-270(1997))。将bdhA基因从苜蓿根瘤菌(苜蓿中华根瘤菌)克隆进大肠杆菌中会赋予利用3-羟基丁酸作为碳源的能力(Aneja和Charles,J.Bacteriol.181(3):849-857(1999))。可以在莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)(Ito等人,J.Mol.Biol.355(4)722-733(2006))和皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)(Takanashi等人,Antonie van Leeuwenoek,95(3):249-262(2009))中发现其它候选物。与这些蛋白和基因有关的信息显示在下面。
表54
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
Sadh CAD36475 21615553 赤红球菌
AdhA AAC25556 3288810 强烈火球菌
Adh P14941.1 113443 布氏热厌氧杆菌
Adh AAA23199.2 60592974 拜氏梭菌
BdhA NP_437676.1 16264884 苜蓿根瘤菌(苜蓿中华根瘤菌)
PRK13394 BAD86668.1 57506672 莓实假单胞菌
Bdh1 BAE72684.1 84570594 皮氏罗尔斯顿菌
Bdh2 BAE72685.1 84570596 皮氏罗尔斯顿菌
Bdh3 BAF91602.1 158937170 皮氏罗尔斯顿菌
乙酰乙酰辅酶A:乙酰辅酶A转移酶(即，步骤K，图4)天然地将乙酰乙酰辅酶A和乙酸转化成乙酰乙酸和乙酰辅酶A。该酶也可以接受3-羟基丁酰辅酶A作为底物，或可以为此目的进行工程改造(即，步骤M，图4)。示例性的酶包括：得自大肠杆菌的atoAD(Hanai等人,Appl EnvironMicrobiol73:7814-7818(2007))、得自丙酮丁醇梭菌的ctfAB(Jojima等人,Appl Microbiol Biotechnol77:1219-1224(2008)),和得自糖丁酸梭菌的ctfAB(Kosaka等人,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58-68(2007))的基因产物。与这些蛋白和基因有关的信息显示在下面。
表55
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
AtoA P76459.1 2492994 大肠杆菌
AtoD P76458.1 2492990 大肠杆菌
CtfA NP_149326.1 15004866 丙酮丁醇梭菌
CtfB NP_149327.1 15004867 丙酮丁醇梭菌
CtfA AAP42564.1 31075384 糖丁酸梭菌
CtfB AAP42565.1 31075385 糖丁酸梭菌
琥珀酰辅酶A:3-酮酸-辅酶A转移酶天然地将琥珀酸盐转化成琥珀酰辅酶A，同时将3-酮酰辅酶A转化成3-酮酸。示例性的琥珀酰辅酶A:3:酮酸-辅酶A转移酶存在于幽门螺杆菌(Corthesy-Theulaz等人,J.Biol.Chem.272:25659-25667(1997))、枯草芽孢杆菌(Stols等人,Protein.Expr.Purif.53:396-403(2007))和智人(Fukao等人,Genomics68:144-151(2000)；Tanaka等人,Mol.Hum.Reprod.8:16-23(2002))中。与这些蛋白和基因有关的信息显示在下面。
表56
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
HPAG1_0676 YP_627417 108563101 幽门螺杆菌
HPAG1_0677 YP_627418 108563102 幽门螺杆菌
S辅酶A NP_391778 16080950 枯草芽孢杆菌
ScoB NP_391777 16080949 枯草芽孢杆菌
OXCT1 NP_000427 4557817 智人
OXCT2 NP_071403 11545841 智人
其它合适的乙酰乙酰辅酶A和3-羟基丁酰辅酶A转移酶是由克鲁佛梭菌的cat1、cat2和cat3的基因产物编码。已经证实这些酶分别表现出琥珀酰辅酶A、4-羟基丁酰辅酶A和丁酰辅酶A乙酰基转移酶活性(Seedorf等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA105:2128-2133(2008)；Sohling和Gottschalk,J Bacteriol178:871-880(1996))。类似的辅酶A转移酶活性也存在于阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)(van Grinsven等人,J.Biol.Chem.283:1411-1418(2008))和布鲁斯锥虫(Trypanosoma brucei)(Riviere等人,J.Biol.Chem.279:45337-45346(2004))中。另一种能够实现期望的转化的转移酶是丁酰辅酶A:乙酰乙酸辅酶A-转移酶。在具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)(Barker等人,J.Bacteriol.152(1):201-7(1982))、梭菌属SB4(Barker等人,J.Biol.Chem.253(4):1219-25(1978))和丙酮丁醇梭菌(Wiesenborn等人,Appl.Environ.Microbiol.55(2):323-9(1989))中可以发现示例性酶。尽管在这些参考文献中没有提供丁酰辅酶A:乙酰乙酸辅酶A-转移酶的具体基因序列，但是已经将基因FN0272和FN0273注解为丁酸-乙酰乙酸辅酶A-转移酶(Kapatral等人,J.Bact.184(7)2005-2018(2002))。在具核梭杆菌中的同系物诸如FN1857和FN1856也可能具有期望的乙酰乙酰辅酶A转移酶活性。FN1857和FN1856位于许多涉入赖氨酸发酵的其它基因附近，且因而非常可能编码乙酰乙酸:丁酸辅酶A转移酶(Kreimeyer,等人,J.Biol.Chem.282(10)7191-7197(2007))。以类似的方式可以鉴别得自牙龈卟啉单胞菌(Porphyrmonas gingivalis)和Thermoanaerobactertengcongensis的其它候选物(Kreimeyer,等人,J.Biol.Chem.282(10)7191-7197(2007))。与这些蛋白和基因有关的信息显示在下面。
表57
乙酰乙酰辅酶A可以被乙酰乙酰辅酶A水解酶水解成乙酰乙酸(步骤K，图4)。类似地，3-羟基丁酰辅酶A可以被3-羟基丁酰辅酶A水解酶水解成3-羟丁酸(步骤M，图4)。许多辅酶A水解酶(EC3.1.2.1)具有宽底物特异性，并且是用于这些天然地或酶工程的转化的合适酶。尽管没有报道序列，但是在大鼠肝脏的细胞溶质和线粒体中鉴定出了几种乙酰乙酰辅酶A水解酶(Aragon和Lowenstein,J.Biol.Chem.258(8):4725-4733(1983))。另外，得自褐家鼠(Rattus norvegicus)脑的酶(Robinson等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.71:959-965(1976))可以与丁酰辅酶A、己酰辅酶A和丙二酰辅酶A反应。得自大鼠肝脏的acot12酶被证实会水解C2至C6酰基辅酶A分子(Suematsu等人,Eur.J.Biochem.268:2700-2709(2001))。尽管还没有报道它的序列，但是得自豌豆叶的线粒体的酶显示出对乙酰辅酶A、丙酰辅酶A、丁酰辅酶A、棕榈酰辅酶A、油酰辅酶A、琥珀酰辅酶A和巴豆酰辅酶A的活性(Zeiher和Randall,Plant.Physiol.94:20-27(1990))。此外，通过定位诱变将得自发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)的戊稀二酸辅酶A-转移酶转化成酰基辅酶A水解酶，其具有对戊二酰辅酶A、乙酰辅酶A和3-丁烯酰辅酶A的活性(Mack和Buckel,FEBS Lett.405:209-212(1997))。这指示，编码琥珀酰辅酶A:3-酮酸-辅酶A转移酶和乙酰乙酰辅酶A:乙酰辅酶A转移酶的酶还可以用作具有某些突变以改变它们的功能的水解酶。得自酿酒酵母的乙酰辅酶A水解酶ACH1代表另一种候选水解酶(Buu等人,J.Biol.Chem.278:17203-17209(2003))。与这些蛋白和基因有关的信息显示在下面。
表58
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
Acot12 NP_570103.1 18543355 褐家鼠
GctA CAA57199 559392 发酵氨基酸球菌
GctB CAA57200 559393 发酵氨基酸球菌
ACH1 NP_009538 6319456 酿酒酵母
另一种水解酶是人二羧酸硫酯酶acot8，其显示出对戊二酰辅酶A、己二酰辅酶A、环庚基辅酶A、癸二酰辅酶A和十二烷二酰基辅酶A的活性(Westin等人,J.Biol.Chem.280:38125-38132(2005))，以及最接近大肠杆菌同系物tesB，其也可以水解宽范围的辅酶A硫代酸酯(Naggert等人,J.Biol.Chem.266:11044-11050(1991))，包括3-羟基丁酰辅酶A(Tseng等人,Appl.Environ.Microbiol.75(10):3137-3145(2009))。还已经在大鼠肝中表征了类似的酶(Deana,Biochem。Int.26:767-773(1992))。其它潜在的大肠杆菌硫代酸酯水解酶包括tesA(Bonner和Bloch,J.Biol.Chem.247:3123-3133(1972))、ybgC(Kuznetsova等人,FEMS Microbiol.Rev.29:263-279(2005)；Zhuang等人,FEBS Lett.516:161-163(2002))、paaI(Song等人,J.Biol.Chem.281:11028-11038(2006))和ybdB(Leduc等人,J.Bacteriol.189:7112-7126(2007))的基因产物。与这些蛋白和基因有关的信息显示在下面。
表59
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
Acot8 CAA15502 3191970 智人
TesB NP_414986 16128437 大肠杆菌
Acot8 NP_570112 51036669 褐家鼠
TesA NP_415027 16128478 大肠杆菌
YbgC NP_415264 16128711 大肠杆菌
PaaI NP_415914 16129357 大肠杆菌
YbdB NP_415129 16128580 大肠杆菌
另外的水解酶包括3-羟基异丁酰辅酶A水解酶，其已被描述成在缬氨酸降解过程中有效地催化3-羟基异丁酰辅酶A转化成3-羟基异丁酸(Shimomura等人,J.Biol.Chem.269:14248-14253(1994))。编码该酶的基因包括褐家鼠(Shimomura等人,出处同上(1994)；Shimomura等人,MethodsEnzymol.324:229-240(2000))和智人(Shimomura等人,出处同上(1994)的hibch。通过序列同源性得出的候选基因包括酿酒酵母的hibch和蜡状芽孢杆菌的BC_2292。当经工程改造进大肠杆菌中时，证实了BC_2292会表现出3-羟基丁酰辅酶A水解酶活性和作为3-羟基丁酸合成的途径的一部分起作用(Lee等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.79:633-641(2008))。与这些蛋白和基因有关的信息显示在下面。
表60
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
Hibch Q5XIE6.2 146324906 褐家鼠
Hibch Q6NVY1.2 146324905 智人
Hibch P28817.2 2506374 酿酒酵母
BC_2292 AP09256 29895975 蜡状芽孢杆菌ATCC14579
一种从乙酰乙酰辅酶A或3-羟基丁酰辅酶A除去辅酶A部分(图4的步骤K和M)的替代方法是应用一对酶，诸如转移磷酸的酰基转移酶和激酶，以赋予乙酰乙酰辅酶A或3-羟基丁酰辅酶A合成酶活性。这种活性允许任一分子的辅酶A-酯的净水解，同时产生ATP。例如，当充当3-羟基丁酸合成途径的一部分时，得自丙酮丁醇梭菌的丁酸激酶(buk)/磷酸转丁酰酶(ptb)系统已被成功地用于从3-羟基丁酰辅酶A除去辅酶A基团(Tseng等人,Appl.Environ.Microbiol.75(10):3137-3145(2009))。具体地，得自丙酮丁醇梭菌的ptb基因编码这样的酶，所述酶可以将酰基辅酶A转化成酰基-磷酸(Walter等人.Gene134(1):第107-11页(1993))；Huang等人.J MolMicrobiol Biotechnol2(1):第33-38页(2000)。可以在生产丁酸的细菌L2-50(Louis等人.J.Bacteriol.186:2099-2106(2004))和巨大芽孢杆菌(Vazquez等人.Curr.Microbiol42:345-349(2001))中找到另外的ptb基因。另外的示例性转移磷酸的酰基转移酶包括由pta编码的磷酸转乙酰酶。得自大肠杆菌的pta基因编码这样的酶，所述酶可以将乙酰辅酶A转化成乙酰磷酸，反之亦然(Suzuki,T.Biochim.Biophys.Acta191:559-569(1969))。该酶还可以在该过程中利用丙酰辅酶A代替乙酰辅酶A形成丙酸(Hesslinger等人.Mol.Microbiol27:477-492(1998))。与这些蛋白和基因有关的信息显示在下面。
表61
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
Pta NP_416800.1 16130232 大肠杆菌
Ptb NP_349676 15896327 丙酮丁醇梭菌
Ptb AAR19757.1 38425288 生产丁酸的细菌L2-50
Ptb CAC07932.1 10046659 巨大芽孢杆菌
示例性的激酶包括由ackA编码的大肠杆菌乙酸激酶(Skarstedt和Silverstein J.Biol.Chem.251:6775-6783(1976))，由buk1和buk2编码的丙酮丁醇梭菌丁酸激酶((Walter等人.Gene134(1):107-111(1993)；Huang等人.JMol Microbiol Biotechnol2(1):33-38(2000))，和由proB编码的大肠杆菌γ-谷氨酰基激酶(Smith等人.J.Bacteriol.157:545-551(1984))。这些酶分别磷酸化乙酸、丁酸和谷氨酸。得自大肠杆菌的ackA基因产物还磷酸化丙酸(Hesslinger等人.Mol.Microbiol27:477-492(1998))。与这些蛋白和基因有关的信息显示在下面。
表62
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
AckA NP_416799.1 16130231 大肠杆菌
Buk1 NP_349675 15896326 丙酮丁醇梭菌
Buk2 Q97II1 20137415 丙酮丁醇梭菌
ProB NP_414777.1 16128228 大肠杆菌
可替换地，通过表现出乙酰乙酰辅酶A或3-羟基丁酰辅酶A合成酶活性的单一酶或酶复合物，可以实现乙酰乙酰辅酶A或3-羟基丁酰辅酶A的水解(步骤K和M，图4)。该活性允许任一分子的辅酶A-酯的净水解，且在一些情况下，同时产生ATP。例如，酿酒酵母的LSC1和LSC2基因以及大肠杆菌的sucC和sucD基因的产物天然地形成琥珀酰辅酶A合成酶复合物，其催化从琥珀酸中形成琥珀酰辅酶A，并伴随地消耗一个ATP，即在体内可逆的反应(Gruys等人,美国专利号5,958,745,1999年9月28日提交的)。与这些蛋白和基因有关的信息显示在下面。
表63
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
SucC NP_415256.1 16128703 大肠杆菌
SucD AAC73823.1 1786949 大肠杆菌
LSC1 NP_014785 6324716 酿酒酵母
LSC2 NP_011760 6321683 酿酒酵母
另外的示例性辅酶A-连接酶包括还没有表征其序列的大鼠二羧酸酯-辅酶A连接酶(Vamecq等人,Biochemical J.230:683-693(1985))，得自产黄青霉(P.chrysogenum)的两种已表征的苯乙酸-辅酶A连接酶中的任一种(Lamas-Maceiras等人,Biochem.J.395:147-155(2005)；Wang等人,BiochemBiophy Res Commun 360(2):453-458 (2007))，得自恶臭假单胞菌的苯乙酸-辅酶A连接酶(Martinez-Blanco等人,J.Biol.Chem.265:7084-7090(1990))，和得自枯草芽孢杆菌的6-羧基己酸-辅酶A连接酶(Bower等人,J.Bacteriol.178(14):4122-4130(1996))。另外的候选酶是得自小家鼠(Hasegawa等人,Biochim.Biophys.Acta1779:414-419(2008))和智人(Ohgami等人,Biochem.Pharmacol.65:989-994(2003))的乙酰乙酰辅酶A合成酶，其天然地催化ATP依赖性的乙酰乙酸至乙酰乙酰辅酶A的转化。已在勤奋生金球菌中证实了4-羟基丁酰辅酶A合成酶活性(Berg等人,Science318:1782-1786 (2007))。该功能已经暂时归属于Msed_1422基因。与这些蛋白和基因有关的信息显示在下面。
表64
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
Phl CAJ15517.1 77019264 产黄青霉
PhlB ABS19624.1 152002983 产黄青霉
PaaF AAC24333.2 22711873 恶臭假单胞菌
BioW NP_390902.2 50812281 枯草芽孢杆菌
AACS NP_084486.1 21313520 小家鼠
AACS NP_076417.2 31982927 智人
Msed1422 YP001191504 146304188 勤奋生金球菌
形成ADP的乙酰辅酶A合成酶(ACD，EC6.2.1.13)是可以将酰基辅酶A酯至它们的对应酸的转化与ATP的并行合成相偶联的另一种候选酶(步骤K和M，图4)。已经在文献中描述了几种具有宽底物特异性的酶。经证实，得自闪烁古球菌的ACD I(由AF1211编码)作用于多种直链和支链底物，包括乙酰辅酶A、丙酰辅酶A、丁酰辅酶A、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、琥珀酸、富马酸、苯基乙酸、吲哚乙酸(Musfeldt等人,J.Bacteriol.184:636-644(2002))。得自死海嗜盐古细菌的酶(注解为琥珀酰辅酶A合成酶)接受丙酸、丁酸和支链酸(异戊酸和异丁酸)作为底物，并经证实会在正向和反向工作Brasen等人,Arch.Microbiol.182:277-287(2004))。由得自超嗜热的crenarchaeon嗜气热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)的PAE3250编码的ACD表现出所有表征的ACD的最宽底物范围，其与乙酰辅酶A、异丁酰辅酶A(优选的底物)和苯基乙酰辅酶A反应(Brasen等人,出处同上(2004))。得自闪烁古球菌、死海嗜盐古细菌和嗜气热棒菌的酶都已经在大肠杆菌中克隆、功能性地表达和表征(Musfeldt等人,出处同上；Brasen等人,出处同上(2004))。与这些蛋白和基因有关的信息显示在下面。
表65
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
AF1211 NP_070039.1 11498810 闪烁古球菌DSM4304
scs YP_135572.1 55377722 死海嗜盐古细菌ATCC43049
PAE3250 NP_560604.1 18313937 嗜气热棒菌IM2菌株
3-羟基丁酸还原酶可以实现3-羟基丁酸至3-羟基丁醛的转化(步骤N，图4)。类似地，乙酰乙酸还原酶可以实现乙酰乙酸至乙酰乙醛的转化(步骤L，图4)。适合用于这些转化的酶是得自Nocardia iowensis的芳基-醛脱氢酶或等效的羧酸还原酶。羧酸还原酶催化镁、ATP和NADPH依赖性的羧酸至它们的对应醛的还原(Venkitasubramanian等人,J.Biol.Chem.282:478-485(2007))。在大肠杆菌中克隆和功能性表达了由car编码的该酶(Venkitasubramanian等人,J.Biol.Chem.282:478-485(2007))。npt基因产物的表达经由转录后修饰提高酶的活性。npt基因编码特异性的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase)，该转移酶将无活性的脱辅酶转化为有活性的全酶。该酶的天然底物是香草酸，并且该酶表现出对芳香族和脂肪族底物的宽接受(Venkitasubramanian等人,见Biocatalysis in the Pharmaceutical andBiotechnology Industires,R.N.Patel编,第15章,第425-440页,CRC PressLLC,Boca Raton,FL.(2006))。与这些蛋白和基因有关的信息显示在下面。
表66
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
Car AAR91681.1 40796035 Nocardia iowensis(sp.NRRL5646)
Npt ABI83656.1 114848891 Nocardia iowensis(sp.NRRL5646)
基于序列同源性，可以鉴别其它car和npt基因。
表67
在灰色链霉菌中发现的其它酶候选物是由griC和griD基因编码。认为该酶会将3-氨基-4-羟基苯甲酸转化成3-氨基-4-羟基苯甲醛，因为griC或griD的缺失会导致细胞外的3-乙酰基氨基-4-羟基苯甲酸的积累，后者是3-氨基-4-羟基苯甲酸代谢的支路产物(Suzuki,等人,J.Antibiot.60(6):380-387(2007))。griC和griD与SGR_665(在序列上与Nocardiaiowensis npt基因类似的酶)的共表达可以是有益的。与这些蛋白和基因有关的信息显示在下面。
表68
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
griC YP_001825755.1 182438036 灰色链霉菌灰色亚种NBRC13350
grid YP_001825756.1 182438037 灰色链霉菌灰色亚种NBRC13350
在一些真菌物种中，具有类似特征的酶α-氨基己二酸还原酶(AAR,EC1.2.1.31)参与赖氨酸生物合成途径。该酶天然地将α-氨基己二酸还原为α-氨基己二酸半醛。首先，通过ATP依赖性的腺苷酸形成，活化羧基，然后通过NAD(P)H的还原，得到醛和AMP。象CAR一样，该酶利用镁，且需要PPTase的活化。用于AAR的酶候选物和它的对应PPTase存在于酿酒酵母(Morris等人,Gene98:141-145(1991))、白色假丝酵母(Guo等人,Mol.Genet.Genomics269:271-279(2003))和粟酒裂殖酵母(Ford等人,Curr.Genet.28:131-137(1995))中。当在大肠杆菌中表达时，得自粟酒裂殖酵母的AAR表现出显著的活性(Guo等人,Yeast21:1279-1288(2004))。得自产黄青霉的AAR接受S-羧甲基-L-半胱氨酸作为替代底物，但是不会与己二酸、L-谷氨酸或二氨基庚二酸反应(Hijarrubia等人,J.Biol.Chem.278:8250-8256(2003))。迄今为止尚未鉴别出编码产黄青霉PPTase的基因。与这些蛋白和基因有关的信息显示在下面。
表69
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
LYS2 AAA34747.1 171867 酿酒酵母
LYS5 P50113.1 1708896 酿酒酵母
LYS2 AAC02241.1 2853226 白色假丝酵母
LYS5 AAO26020.1 28136195 白色假丝酵母
Lys1p P40976.3 13124791 粟酒裂殖酵母
Lys7p Q10474.1 1723561 粟酒裂殖酵母
Lys2 CAA74300.1 3282044 产黄青霉
这些CAR或CAR-样酶中的任一种可以表现出3-羟基丁酸或乙酰乙酸还原酶活性，或者为此目的进行工程改造。
可替换地，乙酰乙酰辅酶A合酶可以从乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成在图4的1,3-BDO途径中描绘的乙酰乙酰辅酶A，例如，如在图7(步骤E和F)或图9中所示，其中乙酰辅酶A被乙酰辅酶A羧化酶转化成丙二酰辅酶A，且乙酰乙酰辅酶A合酶从乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A。
乙酰乙酰辅酶A合酶(EC2.3.1.194)也可以从乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A。已经在土壤细菌链霉菌属CL190中表征了该酶(FhsA)，其中它参与甲羟戊酸生物合成(Okamura等人,PNAS USA107:11265-70(2010))。由于该酶催化基本上不可逆的反应，它对于用于过量生产从乙酰乙酰辅酶A衍生出的代谢物、燃料或化学试剂的代谢工程应用而言是特别有用的。例如，已经在生物合成丁醇(Lan等人,PNAS USA(2012))和聚-(3-羟基丁酸)(Matsumoto等人,Biosci Biotech Biochem,75:364-366(2011)的生物中异源地表达了该酶。其它有关的目标产物包括1,4-丁二醇和异丙醇。通过与fhsA的序列同源性，可以鉴别其它乙酰乙酰辅酶A合酶基因。
表70
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
fhsA BAJ83474.1 325302227 链霉菌属CL190
AB183750.1:11991..12971 BAD86806.1 57753876 链霉菌属KO-3988
epzT ADQ43379.1 312190954 肉桂地链霉菌
ppzT CAX48662.1 238623523 环圈链霉菌
O3I_22085 ZP_09840373.1 378817444 巴西诺卡菌
实施例V
在酿酒酵母中插入核酸序列和基因
本实施例描述了将核酸序列插入酿酒酵母中的方法。通过插入编码在实施例I中描述的基因的核酸序列，可以实现增加的细胞溶质乙酰辅酶A的生产。通过插入编码在实施例II中描述的基因的核酸序列，可以实现细胞溶质乙酰辅酶A至1,3-BDO的转化。
使用几种方法，可以将核酸序列和基因插入酿酒酵母中并在其中表达。一些插入方法是基于质粒的，而其它方法允许所述基因整合进染色体中(Guthrie和Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology,第B部分,第350卷,Academic Press(2002)；Guthrie和Fink,Guide to YeastGenetics and Molecular and Cell Biology,第C部分,第351卷,AcademicPress(2002))。可以使用采用营养缺陷型(例如，URA3、TRP1、HIS3、LEU2)或抗生素选择标记(例如，ZeoR或KanR)的高拷贝数质粒，其经常具有强组成型启动子(诸如PGK1或ACT1)和转录终止子-聚腺苷酰化区域(诸如得自CYC1或AOX的那些)。许多例子是可得到的，包括pVV214(具有URA3选择标记的2微米质粒)和pVV200(具有TRP1选择标记的2微米质粒)(Van等人,Yeast20:739-746(2003))。可替换地，可以使用相对较低拷贝的质粒，包括pRS313和pRS315(Sikorski和Hieter,Genetics122:19-27(1989)，它们二者要求添加启动子(例如，PGK1或ACT1)和终止子(例如，CYC1、AOX)。
基因向染色体中的整合要求整合性的基于启动子的表达载体，例如，包括启动子、目标基因、终止子和含有启动子的选择标记的构建体，所述选择标记侧接FRT位点、loxP位点或直接重复序列，它们使得能够除去和重复利用抗性标志物。所述方法能够用合适的引物合成和扩增目标基因，随后在独特限制位点(诸如由EcoRI和XhoI酶产生的限制位点)处消化所述基因(Vellanki等人,Biotechnol Lett.29:313-318(2007))。将目标基因在EcoRI和XhoI位点处插入合适的表达载体，位于启动子的下游。通过PCR和DNA序列分析，验证基因插入。然后将重组质粒线性化，并使用适当的转化方法在期望的位点处整合进酿酒酵母的染色体DNA中。将细胞铺板在含有适当的选择标志物(例如，卡那霉素)的YPD培养基上，并温育2-3天。通过菌落PCR，分析必要的基因插入物的转化体。
为了从侧接loxP位点的构建体除去抗生素标志物，引入含有Cre重组酶的质粒。Cre重组酶会促进侧接loxP位点的序列的切除(Gueldener等人,Nucleic Acids Res.30:e23(2002))。通过在不含任何抗生素的培养基上连续培养，治愈得到的菌株的Cre质粒。最终的菌株具有无标志物的基因缺失，因而相同的方法可以用于在相同菌株中引入多个插入。可替换地，可以以类似的方式使用FLP-FRT系统。该系统涉及由翻转酶重组酶(FLP)实现的短翻转酶识别靶标(Flipase Recognition Target，FRT)位点之间的序列的重组，所述翻转酶重组酶源自酵母酿酒酵母的2μ质粒(Sadowski,P.D.,Prog.Nucleic.Acid.Res.Mol.Biol.51:53-91(1995)；Zhu和SadowskiJ.Biol.Chem.270:23044-23054(1995))。类似地，可以如在参考文献中所述进行基因缺失方法。Baudin等人,Nucleic.Acids Res.21:3329-3330(1993)；Brachmann等人,Yeast14:115-132(1998)；Giaever等人,Nature418:387-391(2002)；Longtine等人,Yeast14:953-961(1998)Winzeler等人,Science285:901-906(1999)。
实施例VI
在酿酒酵母中插入核酸序列和基因
本实施例描述了将基因插入酿酒酵母中用于生产1,3-BDO。
菌株构建：通过使用同源重组来用URA3替代TRP1基因，可以通过双交换事件进一步操作酿酒酵母单倍体菌株BY4741(MATa his3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)，其中pdc5被得自酵母属基因组缺失计划(GenomeDeletion Project)的卡那霉素抗性基因替代，pdc5::kanr(克隆ID4091)。可以在5-FOA平板上培养得到的菌株以将所述菌株“URA爆炸”，由此选择具有ura3突变的克隆。可以繁殖得自该平板的克隆。具有最终基因型BY4741的菌株(MATa his3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0trp1::ura3pdc5::kanr)可以用于1,3-BDO异源途径表达。可以在合成的确定成分培养基上培养所述菌株，所述培养基含有酵母氨基酸氮源(Yeast Nitrogen Base)(1.7g/L)、硫酸铵(5g/L)，并且还可以添加不含-His、-Leu、-Trp、-Ura、-右旋糖的氨基酸的完全补充混合物(CSM)(Sunrise Science Products,Inc.San Diego,CA目录号1788-100)。适当的碳源是0.2％葡萄糖或0.2％蔗糖+2％半乳糖。
为了在酿酒酵母中构建1,3-BDO途径，可以将基因鉴别、克隆、测序，并从表达载体表达。在实施例I中描述了基因和登录号。可以将1,3-BDO途径基因克隆进pESC载体pESC-HIS、pESC-LEU、pESC-TRP和pESC-URA(Stratagene,目录号217455)。这些是可以在大肠杆菌或酿酒酵母中复制的穿梭载体。它们具有双半乳糖(GAL1,GAL10)分叉启动子，其在有右旋糖(葡萄糖)存在下受到抑制，但是会提供在有半乳糖存在下的可诱导的表达。可以将乙酰乙酰辅酶A硫解酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶克隆进pESC-His中；可以将3-羟基丁酰辅酶A还原酶和3-羟基丁醛还原酶克隆进pESC-Leu中，且可以将丙酮酸甲酸裂合酶亚基A和B克隆进pESC-Ura中。
可以从首先表达适当基因的细胞进行所有酶测定。可以将细胞离心，在含有玻璃珠的珠子破碎机中裂解，并通过离心除去细胞碎片以产生粗提取物。
可以将底物加入到细胞提取物中并测定活性。通过将乙酰辅酶A加入到提取物中，可以确定乙酰乙酰辅酶A硫解酶活性。如果所述反应会缩合乙酰辅酶A组分，将释放出游离的辅酶A-SH。游离的辅酶A-SH与DTNB形成复合物以形成DTNB-辅酶A，其可以通过在410nm的吸光度来检测。为了测定乙酰乙酰辅酶A还原酶活性，可以将乙酰乙酰辅酶A和NADH加入到提取物中。乙酰乙酰辅酶A在304nm吸收，且使用它的下降来监测乙酰乙酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化。通过将适当的底物与NADH一起加入到细胞提取物中，可以测定3-羟基丁酰辅酶A还原酶和3-羟基丁醛还原酶。然后可以通过荧光来测定NADH的下降，因为NADH吸收具有340nm波长的光并放射出具有450nm波长的次级(荧光)光子。
为了检测酵母中的丙酮酸甲酸裂合酶活性，可以厌氧性地制备细胞、提取物和试剂，因为已知该酶受氧抑制。因为厌氧性提取物的制备所需的还原剂会抑制DTNB-辅酶A反应，不可以用DNTB测定辅酶A-SH的释放。因此，当用丙酮酸提供提取物时，通过质谱法可以直接分析反应的产物(乙酰辅酶A)。
可以将酵母培养物接种进不含His、Leu、Trp、Ura的合成的确定成分培养基中。通过在微量离心机中在室温在17,000rpm离心5分钟来除去大多数细胞，可以从1,3-BDO生产培养物收集样品。可以将上清液穿过0.22μm过滤器过滤以除去痕量的细胞，且可以直接用于GC-MS分析。
通过测量生长速率、底物摄取速率和产物/副产物分泌速率，表征经工程改造的菌株。将培养物培养过夜，并用作接种物用于新鲜分批培养，在指数生长期间进行测量。通过使用分光光度计(A600)测量光密度，可以确定生长速率。通过分析方法(包括使用HPX-87H柱(BioRad)的HPLC或GC-MS)，可以确定培养物上清液中的葡萄糖、1,3-BDO、醇和其它有机酸副产物的浓度，并用于计算摄取和分泌速率。然后可以通过传代培养使培养物达到稳态指数生长用于酶测定。用一式三份培养物进行所有实验。
实施例VII
偏好NADH的途径酶的利用
从葡萄糖生产乙酰辅酶A可以产生至多4个NADH形式的还原当量。使还原当量的产率最大化的直接且节省能量的模式是采用Embden-Meyerhof-Parnas糖酵解途径(EMP途径)。在许多利用碳水化合物的生物中，借助于3-磷酸甘油醛脱氢酶每氧化1个3-磷酸甘油醛分子产生1个NADH分子。考虑到经由EMP途径代谢的每个葡萄糖分子产生2个3-磷酸甘油醛分子，从葡萄糖至丙酮酸的转化可以得到2个NADH分子。考虑到经由EMP途径代谢的每个葡萄糖分子产生2个丙酮酸分子，从丙酮酸至乙酰辅酶A的转化可以产生2个额外的NADH分子。这需要采用下述酶或酶集合中的任一种来将丙酮酸转化成乙酰辅酶A：
1)NAD依赖性的丙酮酸脱氢酶；
2)丙酮酸甲酸裂合酶和NAD依赖性的甲酸脱氢酶；
3)丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和NADH:铁氧还蛋白氧化还原酶；
4)丙酮酸脱羧酶和NAD依赖性的酰化乙酰基醛脱氢酶；
5)丙酮酸脱羧酶、NAD依赖性的酰化乙醛脱氢酶、乙酸激酶和磷酸转乙酰酶；和
6)丙酮酸脱羧酶、NAD依赖性的酰化乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶。
总之，每个代谢的葡萄糖分子可以得到4个NADH分子。1,3-BDO途径从乙酰辅酶A开始需要3个还原步骤。因此，这3个还原步骤中的每一个可能利用NADPH或NADH作为还原剂，从而将这些分子分别转化成NADP或NAD。因此，希望所有还原步骤都是NADH-依赖性的，以便使1,3-BDO的产率最大化。因而可以如下实现1,3-BDO的高产率：
1)鉴别和实现内源性或外源性1,3-BDO途径酶，所述酶对NADH的偏好强于其它还原当量诸如NADPH，
2)减弱一种或多种内源性1,3-BDO途径酶，所述酶会促进NADPH-依赖性的还原活性，
3)改变内源性或外源性1,3-BDO途径酶的辅因子特异性，使得它们对NADH的偏好强于它们的天然形式，或
4)改变内源性或外源性1,3-BDO途径酶的辅因子特异性，使得它们对NADPH的偏好弱于它们的天然形式。
使用本领域众所周知的方法，可以测定得自内源性或外源性的DNA序列的各种酶或蛋白活性。例如，可以在大肠杆菌中表达基因，并可以使用如在实施例V中所述的细胞提取物测量它们的编码的蛋白的活性。可替换地，使用本领域众所周知的标准操作，可以纯化酶，并测定活性。基于分光光度测量的测定是特别有效的。
改变酶的辅因子特异性的几个例子和方法是本领域已知的。例如，Khoury等人(Protein Sci.2009年10月；18(10):2125-2138)制备了几种木糖还原酶，其具有增加的对NADH的亲和力和降低的对NADPH的亲和力。Ehsani等人(Biotechnology and Bioengineering,第104卷,第2期,第381-389页,2009年10月1日)急剧降低了2,3-丁二醇脱氢酶对NADH的活性，同时增加了对NADPH的活性。Machielsen等人(Engineering in LifeSciences,第9卷,第1期,第38-44页,2009年2月)急剧增加了醇脱氢酶对NADH的活性。Khoury等人(Protein Sci.2009年10月；18(10):2125-2138)在表I中列出了几个以前的成功改变超过25种其它酶的辅因子偏好的例子。在以下文献中可以找到其它描述：Lutz等人,Protein EngineeringHandbook,第1卷和第2卷,2009,Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA，尤其是第31章:Altering Enzyme Substrate and Cofactor Specificity viaProtein Engineering。
实施例VIII：
确定途径酶的辅因子偏好
本实施例描述了用于确定酶的辅因子偏好的实验方法。
如下确定每个途径步骤的酶的辅因子偏好：将各个基因克隆到质粒上在组成型或诱导型启动子的后面，并转化进宿主生物(诸如大肠杆菌)中。例如，可以如下所述将编码酶的基因装配到基于pZ的表达载体上，所述酶催化以下途径步骤：1)从乙酰乙酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A，2)从3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁醛，3)从3-羟基丁醛至1,3-丁二醇，或4)从3-羟基丁酸至3-羟基丁醛。
基于pZ的表达载体中的填充片段的替换.从Expressys的Rolf Lutz博士(http://www.expressys.de/)获得载体主链。载体和菌株是基于由Lutz和Bujard开发的pZ表达系统(Nucleic Acids Res25,1203-1210(1997))。pZE13luc、pZA33luc、pZS*13luc和pZE22luc含有萤光素酶基因作为填充片段。为了用侧接适当限制性酶位点的lacZ-α片段替代萤光素酶填充片段，通过用EcoRI和XbaI消化，从每个载体除去萤光素酶填充片段。用以下引物，通过PCR法从pUC19扩增lacZ-α片段：
lacZα-RI
5’GACGAATTCGCTAGCAAGAGGAGAAGTCGACATGTCCAATTCACTGGCCGTCGTTTTAC3’(SEQ ID NO:1)
lacZα3'BB
5’-GACCCTAGGAAGCTTTCTAGAGTCGACCTATGCGGCATCAGAGCAGA-3’(SEQ ID NO:2)
这产生带有EcoRI位点、NheI位点、核糖体结合位点、SalI位点和起始密码子的5’端的片段。在该片段的3’端上是终止密码子、XbaI、HindIII和AvrII位点。用EcoRI和AvrII消化PCR产物，并连接进用EcoRI和XbaI消化的基载体中(XbaI和AvrII具有相容的末端并产生非位点)。因为NheI和XbaI限制性酶位点产生可以连接在一起的相容末端(但是产生在连接后任一种酶都不消化的位点)，克隆到载体中的基因可以被“生物砖砌”(“Biobricked”)在一起(http://openwetware.org/wiki/Synthetic_Biology:BioBricks)。简而言之，该方法能够使用相同的2个限制位点将无限数量的基因连接到载体中(只要所述位点没有出现在所述基因内部)，因为在每次添加之后，在基因之间的位点被破坏。随后可以使用定位诱变试剂盒(NEB,Ipswich,MA,USA)来修饰这些载体，以在EcoRI和NheI位点之间插入间隔序列AATTAA。这会消除结合RBS和起始密码子的RNA中的假定茎环结构。
所有载体具有pZ设计，其后面的字母和数字指示复制起点、抗生素抗性标志物和启动子/调节单元。复制起点是第二个字母，并且用E表示ColE1、用A表示p15A和用S表示基于pSC101(以及用S*表示的pSC101的较低拷贝数形式)的来源。第一个数字代表抗生素抗性标志物(1代表氨苄西林、2代表卡那霉素、3代表氯霉素)。最后的数字定义调节目标基因的启动子(1代表PLtetO-1，2代表PLlacO-1，和3代表PA1lacO-1)。对于这里所讨论的工作，我们使用了3种pZS*13S、pZA33S和pZE13S，其被修饰用于以上所讨论的生物砖块插入。
然后可以将含有编码途径酶的基因的质粒转化到含有lacIQ的宿主菌株中，其允许通过异丙基β-D-l-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的添加来实现诱导型表达。使用菌株大肠杆菌MG1655lacIQ作为含有途径基因的质粒构建体的宿主，在体外测定中试验了异源酶的活性。细胞可以在含有每种构建体的适当抗生素的LB培养基(Difco)中好氧性地生长，并且当光密度(OD600)达到大约0.5时，通过加入1mM的IPTG进行诱导。可以在6个小时后收获细胞，并且如下讨论地进行酶测定。
体外酶测定.为了获得用于活性测定的粗提取物，可以通过在4,500rpm离心10min(Beckman-Coulter,Allegera X-15R)来收获细胞。将沉淀物再悬浮于0.3mL含有Benzonase和溶菌酶的BugBuster(Novagen)试剂中，并在室温轻摇下裂解约15分钟。通过在4℃在14,000rpm离心30min(Eppendorf离心机5402)，得到没有细胞的裂解物。使用Bradford等人,Anal.Biochem.72:248-254(1976)的方法，确定样品中的细胞蛋白，并如下所述进行具体酶测定。以单位/mg蛋白来报告活性，其中将活性单位定义为在室温在1分钟内转化1微摩尔底物所需的酶的量。
使用改编自数个文献来源的方法(Durre等人,FEMS Microbiol.Rev.17:251-262(1995)；Palosaari和Rogers,Bacteriol.170:2971-2976(1988)和Welch等人,Arch.Biochem.Biophys.273:309-318(1989)，可以测定在还原方向的途径步骤。通过在室温每4秒(总计240秒)读取在340nM的吸光度，可以跟踪NADH或NADPH的氧化。可以在100mM MOPS(用KOH调节至pH7.5)、0.4mM NADH或0.4mM NADPH和1-50μmol的细胞提取物中进行还原测定。对于羧酸还原酶-样酶，还可以加入饱和浓度的ATP。可以通过加入下述试剂来开始反应：100μmol的100mM乙酰乙酰辅酶A、3-羟基丁酰辅酶A、3-羟基丁酸、或3-羟基丁醛。使分光光度计快速成为空白，随后开始动态读数。在340nM处每分钟的吸光度减小所形成的斜率以及NAD(P)H在340nM(6000)的摩尔消光系数和提取物的蛋白质浓度，可以用于确定比活性。
实施例IX
用于增加NADPH可用性的方法
在某些情况下，可能有利的是采用这样的途径酶：其具有使用NADPH作为还原剂的活性。例如，NADPH依赖性的途径酶可以是对途径中间体(诸如乙酰乙酰辅酶A、3-羟基丁酰辅酶A、3-羟基丁酸或3-羟基丁醛)高度特异性的，或者使用NADPH作为底物可以具有有利的动力学性能。如果一个或多个途径步骤是NADPH依赖性的，可以采用几种增加NADPH可用性的替代方案。这些包括：
1)与野生型相比，增加穿过包含6-磷酸葡萄糖脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶和6-磷酸葡糖酸脱氢酶(脱羧)的戊糖磷酸途径的氧化支路的通量。这会每代谢1个葡萄糖-6-磷酸产生2个NADPH分子。但是，所述脱羧步骤会降低1,3-丁二醇的最大理论收率。
2)与野生型相比，增加穿过包含6-磷酸葡萄糖脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、磷酸葡糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶的恩特纳-杜德洛夫途径的通量。
3)引入可溶性的转氢酶，以将NADH转化成NADPH。
4)引入膜结合的转氢酶，以将NADH转化成NADPH。
5)采用NADP依赖性的3-磷酸甘油醛脱氢酶。
6)采用下述酶或酶集合中的任一种，以将丙酮酸转化成乙酰辅酶A
a)NADP依赖性的丙酮酸脱氢酶；
b)丙酮酸甲酸裂合酶和NADP依赖性的甲酸脱氢酶；
c)丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和NADPH:铁氧还蛋白氧化还原酶；
d)丙酮酸脱羧酶和NADP依赖性的酰化乙酰基醛脱氢酶；
e)丙酮酸脱羧酶、NADP依赖性的乙醛脱氢酶、乙酸激酶和磷酸转乙酰酶；和
f)丙酮酸脱羧酶、NADP依赖性的乙醛脱氢酶、和乙酰辅酶A合成酶；和，任选地减弱这些酶的NAD依赖性形式。
7)改变天然的3-磷酸甘油醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、甲酸脱氢酶或酰化乙酰基醛脱氢酶的辅因子特异性，以使对NADPH的偏好强于它们的天然形式。
8)改变天然的3-磷酸甘油醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、甲酸脱氢酶或酰化乙酰基醛脱氢酶的辅因子特异性，以使对NADH的偏好弱于它们的天然形式。
使用本领域众所周知的方法，可以测定得自内源性或外源性的DNA序列的各种酶或蛋白活性。例如，可以在大肠杆菌中表达基因，并可以使用如在以前的实施例中所述的细胞提取物测量它们的编码的蛋白的活性。可替换地，使用本领域众所周知的标准操作，可以纯化酶，并测定活性。基于分光光度测量的测定是特别有效的。
改变酶的辅因子特异性的几个例子和方法是本领域已知的。例如，Khoury等人(Protein Sci.2009年10月；18(10):2125-2138)制备了几种木糖还原酶，其具有增加的对NADH的亲和力和降低的对NADPH的亲和力。Ehsani等人(Biotechnology and Bioengineering,第104卷,第2期,第381-389页,2009年10月1日)急剧降低了2,3-丁二醇脱氢酶对NADH的活性，同时增加了对NADPH的活性。Machielsen等人(Engineering in LifeSciences,第9卷,第1期,第38-44页,2009年2月)急剧增加了醇脱氢酶对NADH的活性。Khoury等人(Protein Sci.2009年10月；18(10):2125-2138)在表I中列出了几个以前的成功改变超过25种其它酶的辅因子偏好的例子。在以下文献中可以找到其它描述：Lutz等人,Protein EngineeringHandbook,第1卷和第2卷,2009,Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA，尤其是第31章:Altering Enzyme Substrate and Cofactor Specificity viaProtein Engineering。
下面提供了这些步骤的酶候选物。
表70
6-磷酸葡萄糖脱氢酶
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
ZWF1 NP_014158.1 6324088 酿酒酵母S288c
ZWF1 XP_504275.1 50553728 解脂耶氏酵母
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
Zwf XP_002548953.1 255728055 热带假丝酵母MYA-3404
Zwf XP_001400342.1 145233939 黑曲霉CBS513.88
KLLA0D19855g XP_453944.1 50307901 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
表71
6-磷酸葡糖酸内酯酶
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
SOL3 NP_012033.2 82795254 酿酒酵母S288c
SOL4 NP_011764.1 6321687 酿酒酵母S288c
YALI0E11671g XP_503830.1 50552840 解脂耶氏酵母
YALI0C19085g XP_501998.1 50549055 解脂耶氏酵母
ANI_1_656014 XP_001388941.1 145229265 黑曲霉CBS513.88
CTRG_00665 XP_002545884.1 255721899 热带假丝酵母MYA-3404
CTRG_02095 XP_002547788.1 255725718 热带假丝酵母MYA-3404
KLLA0A05390g XP_451238.1 50302605 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
KLLA0C08415g XP_452574.1 50305231 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
表72
6-磷酸葡糖酸脱氢酶(脱羧)
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
GND1 NP_012053.1 6321977 酿酒酵母S288c
GND2 NP_011772.1 6321695 酿酒酵母S288c
ANI_1_282094 XP_001394208.2 317032184 黑曲霉CBS513.88
ANI_1_2126094 XP_001394596.2 317032939 黑曲霉CBS513.88
YALI0B15598g XP_500938.1 50546937 解脂耶氏酵母
CTRG_03660 XP_002549363.1 255728875 热带假丝酵母MYA-3404
KLLA0A09339g XP_451408.1 50302941 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
表73
磷酸葡糖酸脱水酶
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
Edd AAC74921.1 1788157 大肠杆菌K-12MG1655
Edd AAG29866.1 11095426 运动发酵单胞菌运动亚种ZM4
Edd YP_350103.1 77460596 荧光假单胞菌Pf0-1
ANI_1_2126094 XP_001394596.2 317032939 黑曲霉CBS513.88
YALI0B15598g XP_500938.1 50546937 解脂耶氏酵母
CTRG_03660 XP_002549363.1 255728875 热带假丝酵母MYA-3404
KLLA0A09339g XP_451408.1 50302941 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
表74
2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
Eda NP_416364.1 16129803 大肠杆菌K-12MG1655
Eda Q00384.2 59802878 运动发酵单胞菌运动亚种ZM4
Eda ABA76098.1 77384585 荧光假单胞菌Pf0-1
表75
可溶性的转氢酶
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
SthA NP_418397.2 90111670 大肠杆菌K-12MG1655
SthA YP_002798658.1 226943585 维涅兰德固氮菌DJ
SthA O05139.3 11135075 荧光假单胞菌
表76
膜结合的转氢酶
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
ANI_1_29100 XP_001400109.2 317027842 黑曲霉CBS513.88
Pc21g18800 XP_002568871.1 226943585 255956237产黄青霉威斯康辛州54-1255
SthA O05139.3 11135075 荧光假单胞菌
NCU01140 XP_961047.2 164426165 粗糙链孢霉OR74A
表77
NADP依赖性的3-磷酸甘油醛脱氢酶
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
gapN AAA91091.1 642667 变异链球菌
NP-GAPDH AEC07555.1 330252461 拟南芥
GAPN AAM77679.2 82469904 小麦
gapN CAI56300.1 87298962 丙酮丁醇梭菌
NADP-GAPDH 2D2I_A 112490271 细长聚球蓝细菌PCC7942
NADP-GAPDH CAA62619.1 4741714 细长聚球蓝细菌PCC7942
GDP1 XP_455496.1 50310947 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
HP1346 NP_208138.1 15645959 幽门螺杆菌26695
表78
NAD依赖性的3-磷酸甘油醛脱氢酶
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
TDH1 NP_012483.1 6322409 酿酒酵母s288c
TDH2 NP_012542.1 6322468 酿酒酵母s288c
TDH3 NP_011708.1 632163 酿酒酵母s288c
KLLA0A11858g XP_451516.1 50303157 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
KLLA0F20988g XP_456022.1 50311981 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
ANI_1_256144 XP_001397496.1 145251966 黑曲霉CBS513.88
YALI0C06369g XP_501515.1 50548091 解脂耶氏酵母
CTRG_05666 XP_002551368.1 255732890 热带假丝酵母MYA-3404
表79
NADP依赖性的丙酮酸脱氢酶
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
PNO Q94IN5.1 33112418 细小裸藻
cgd4_690 XP_625673.1 66356990 小隐孢子虫爱荷华州II
TPP_PFOR_PNO XP_002765111.11 294867463 海洋伯金斯虫ATCC50983
aceE NP_414656.1 50303157 大肠杆菌K-12MG1655
aceF NP_414657.1 6128108 大肠杆菌K-12MG1655
在Biochemistry,1993,32(11),第2737-2740页中描述的得自大肠杆菌K-12MG1655的突变LpdA：
MSTEIKTQVVVLGAGPAGYSAAFRCADLGLETVIVERYNTLGGVCLNVGCIPSKALLHVAKVIEEAKALAEHGIVFGEPKTDIDKIRTWKEKVINQLTGGLAGMAKGRKVKVVNGLGKFTGANTLEVEGENGKTVINFDNAIIAAGSRPIQLPFIPHEDPRIWDSTDALELKEVPERLLVMGGGIIGLEMGTVYHALGSQIDVVVRKHQVIRAADKDIVKVFTKRISKKFNLMLETKVTAVEAKEDGIYVTMEGKKAPAEPQRYDAVLVAIGRVPNGKNLDAGKAGVEVDDRGFIRVDKQLRTNVPHIFAIGDIVGQPMLAHKGVHEGHVAAEVIAGKKHYFDPKVIPSIAYTEPEVAWVGLTEKEAKEKGISYETATFPWAASGRAIASDCADGMTKLIFDKESHRVIGGAIVGTNGGELLGEIGLAIEMGCDAEDIALTIHAHPTLHESVGLAAEVFEGSITDLPNPKAKKK(SEQ ID NO:3)
在Biochemistry,1993,32(11),第2737-2740页中描述的得自大肠杆菌K-12MG1655的突变LpdA：
MSTEIKTQVVVLGAGPAGYSAAFRCADLGLETVIVERYNTLGGVCLNVGCIPSKALLHVAKVIEEAKALAEHGIVFGEPKTDIDKIRTWKEKVINQLTGGLAGMAKGRKVKVVNGLGKFTGANTLEVEGENGKTVINFDNAIIAAGSRPIQLPFIPHEDPRIWDSTDALELKEVPERLLVMGGGIIALEMATVYHALGSQIDVVVRKHQVIRAADKDIVKVFTKRISKKFNLMLETKVTAVEAKEDGIYVTMEGKKAPAEPQRYDAVLVAIGRVPNGKNLDAGKAGVEVDDRGFIRVDKQLRTNVPHIFAIGDIVGQPMLAHKGVHEGHVAAEVIAGKKHYFDPKVIPSIAYTEPEVAWVGLTEKEAKEKGISYETATFPWAASGRAIASDCADGMTKLIFDKESHRVIGGAIVGTNGGELLGEIGLAIEMGCDAEDIALTIHAHPTLHESVGLAAEVFEGSITDLPNPKAKKK(SEQ ID NO:4)
表80
NADP依赖性的甲酸脱氢酶
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
fdh ACF35003. 194220249 稳定伯克霍尔德氏菌
fdh ABC20599.2 146386149 热醋穆尔氏菌ATCC39073
在Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,第61卷,第3-4期,2009年12月,第157-161页中描述的突变体Candida bodinii酶：
MKIVLVLYDAGKHAADEEKLYGCTENKLGIANWLKDQGHELITTSDKEGETSELDKHIPDADIIITTPFHPAYITKERLDKAKNLKLVVVAGVGSDHIDLDYINQTGKKISVLEVTGSNVVSVAEHVVMTMLVLVRNFVPAHEQIINHDWEVAAIAKDAYDIEGKTIATIGAGRIGYRVLERLLPFNPKELLYYQRQALPKEAEEKVGARRVENIEELVAQADIVTVNAPLHAGTKGLINKELLSKFKKGAWLVNTARGAICVAEDVAAALESGQLRGYGGDVWFPQPAPKDHPWRDMRNKYGAGNAMTPHYSGTTLDAQTRYAEGTKNILESFFTGKFDYRPQDIILLNGEYVTKAYGKHDKK(SEQ ID NO:5)
在Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,第61卷,第3-4期,2009年12月,第157-161页中描述的突变体Candida bodinii酶
MKIVLVLYDAGKHAADEEKLYGCTENKLGIANWLKDQGHELITTSDKEGETSELDKHIPDADIIITTPFHPAYITKERLDKAKNLKLVVVAGVGSDHIDLDYINQTGKKISVLEVTGSNVVSVAEHVVMTMLVLVRNFVPAHEQIINHDWEVAAIAKDAYDIEGKTIATIGAGRIGYRVLERLLPFNPKELLYYSPQALPKEAEEKVGARRVENIEELVAQADIVTVNAPLHAGTKGLINKELLSKFKKGAWLVNTARGAICVAEDVAAALESGQLRGYGGDVWFPQPAPKDHPWRDMRNKYGAGNAMTPHYSGTTLDAQTRYAEGTKNILESFFTGKFDYRPQDIILLNGEYVTKAYGKHDKK(SEQ ID NO:6)
在Biochem J.2002年11月1:367(Pt.3):841-847中描述的突变体酿酒酵母酶：
MSKGKVLLVLYEGGKHAEEQEKLLGCIENELGIRNFIEEQGYELVTTIDKDPEPTSTVDRELKDAEIVITTPFFPAYISRNRIAEAPNLKLCVTAGVGSDHVDLEAANERKITVTEVTGSNVVSVAEHVMATILVLIRNYNGGHQQAINGEWDIAGVAKNEYDLEDKIISTVGAGRIGYRVLERLVAFNPKKLLYYARQELPAEAINRLNEASKLFNGRGDIVQRVEKLEDMVAQSDVVTINCPLHKDSRGLFNKKLISHMKDGAYLVNTARGAICVAEDVAEAVKSGKLAGYGGDVWDKQPAPKDHPWRTMDNKDHVGNAMTVHISGTSLDAQKRYAQGVKNILNSYFSKKFDYRPQDIIVQNGSYATRAYGQKK(SEQ IDNO:7)。
表81
NADPH:铁氧还蛋白氧化还原酶
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
petH YP_171276.1 56750575 细长聚球蓝细菌PCC6301
fpr NP_457968.1 16762351 肠道沙门氏菌
fnr1 XP_001697352.1 159478523 莱茵衣藻
rfnr1 NP_567293.1 18412939 拟南芥
aceF NP_414657.1 6128108 大肠杆菌K-12MG1655
表82
NADP依赖性的酰化乙酰基醛脱氢酶
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
adhB AAB06720.1 1513071 假产乙醇热厌氧杆菌ATCC33223
TheetDRAFT_0840 ZP_08211603. 326390041 产乙醇热厌氧杆菌JW200
Cbei_3832 YP_001310903.1 150018649 拜氏梭菌NCIMB8052
Cbei_4054 YP_001311120.1 150018866 拜氏梭菌NCIMB8052
Cbei_4045 YP_001311111.1 150018857 拜氏梭菌NCIMB8052
在上面在实施例II中描述了编码丙酮酸脱氢酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、丙酮酸甲酸裂合酶、丙酮酸脱羧酶、乙酸激酶、磷酸转乙酰酶和乙酰辅酶A合成酶的示例性基因。
编码可以促进1,3-丁二醇的运输的酶的基因包括甘油易化蛋白同系物，诸如下面提供的那些。
实施例X
工程改造酿酒酵母用于化学品生产
真核宿主具有几个胜过原核系统的优点。它们能够支持翻译后修饰和宿主膜锚定的和细胞器特异性的酶。在真核生物中的基因通常具有内含子，所述内含子可以影响基因表达的定时和蛋白结构。
非常适合用于工业化学品生产的一种示例性真核生物是酿酒酵母。该生物被适当地表征，在遗传上是可追踪的，且在工业上是稳健的。使用本领域已知的方法，可以容易地插入、缺失、替换、过表达或低表达基因。一些方法是基于质粒的，而其它方法允许基因整合进染色体中(Guthrie和Fink.Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology,第B部分,第350卷,Academic Press(2002)；Guthrie和Fink,Guide to Yeast Genetics andMolecular and Cell Biology,第C部分,第351卷,Academic Press(2002))。
酵母附加型质粒(YEp)会实现质粒介导的基因表达。YEp允许高水平表达；但是，它们不是非常稳定的，且它们需要在选择性培养基中培养。它们也具有宿主代谢的高维持成本。可以使用采用营养缺陷型(例如，URA3、TRP1、HIS3、LEU2)或抗生素选择标记(例如，ZeoR或KanR)的高拷贝数质粒，其经常具有强组成型启动子(诸如PGK1或ACT1)和转录终止子-聚腺苷酰化区域(诸如得自CYC1或AOX的那些)。本领域技术人员可得到许多例子。这些包括pVV214(具有URA3选择标记的2微米质粒)和pVV200(具有TRP1选择标记的2微米质粒)(Van等人,Yeast20:739-746(2003))。可替换地，可以使用相对较低拷贝的质粒。本领域技术人员仍然可得到许多例子。这些包括pRS313和pRS315(Sikorski和Hieter,Genetics122:19-27(1989)，它们二者要求添加启动子(例如，PGK1或ACT1)和终止子(例如，CYC1、AOX)。
对于工业应用，基因的染色体过表达是质粒介导的过表达所优选的。用于将基因插入真核生物(诸如酿酒酵母)中的工具是本领域已知的。特别有用的工具包括酵母整合型质粒(YIp)、酵母人工染色体(YACS)和基因打靶/同源重组。应当指出，这些工具还可以用于插入、缺失、替换、低表达或以其它方式改变宿主的基因组。
酵母整合型质粒(YIp)利用天然酵母同源重组系统来将DNA有效地整合进染色体中。这些质粒不含有复制起点，且因此仅可以在染色体整合以后得到维持。一种示例性的构建体包括启动子、目标基因、终止子和具有启动子的选择标记，所述选择标记侧接FRT位点、loxP位点或直接重复序列，它们使得能够除去和重复利用抗性标志物。所述方法能够用合适的引物合成和扩增目标基因，随后在独特限制位点(诸如由EcoRI和XhoI酶产生的限制位点)处消化所述基因(Vellanki等人,Biotechnol Lett.29:313-318(2007))。将目标基因在EcoRI和XhoI位点处插入合适的表达载体，位于启动子的下游。通过PCR和DNA序列分析，验证基因插入。然后将重组质粒线性化，并使用适当的转化方法在期望的位点处整合进酿酒酵母的染色体DNA中。将细胞铺板在含有适当的选择标志物的YPD培养基上，并温育2-3天。通过菌落PCR，分析必要的基因插入物的转化体。为了从侧接loxP位点的构建体除去抗生素标志物，引入含有Cre重组酶的质粒。Cre重组酶会促进侧接loxP位点的序列的切除(Gueldener等人,Nucleic AcidsRes30:e23(2002))。通过在不含任何抗生素的培养基上连续培养，治愈得到的菌株的Cre质粒。最终的菌株具有无标志物的基因缺失，因而相同的方法可以用于在相同菌株中引入多个插入。可替换地，可以以类似的方式使用FLP-FRT系统。该系统涉及由翻转酶重组酶(FLP)实现的短翻转酶识别靶标(Flipase Recognition Target，FRT)位点之间的序列的重组，所述翻转酶重组酶源自酵母酿酒酵母的2μ质粒(Sadowski,P.D.,Prog.Nucleic.Acid.Res.Mol.Biol.51:53-91(1995)；Zhu和SadowskiJ.Biol.Chem.270:23044-23054(1995))。类似地，可以如在参考文献中所述进行基因缺失方法。Baudin等人,Nucleic.Acids Res.21:3329-3330(1993)；Brachmann等人,Yeast14:115-132(1998)；Giaever等人,Nature418:387-391(2002)；Longtine等人,Yeast14:953-961(1998)Winzeler等人,Science285:901-906(1999)。
另一种用于操作酵母染色体的有效方案是基因打靶。该方案利用以下事实：同源重组会修复酵母中的双链DNA断裂。因而，使用天然同源重组机制，可以将侧接靶向序列的线性DNA片段有效地整合进酵母基因组中。除了插入基因的应用以外，基因打靶方案可用于基因组DNA操作，诸如缺失基因，在基因、它的启动子或其它调节元件中引入突变，或给基因添加标签。
酵母人工染色体(YAC)是可用于途径构建和装配的人工染色体。YAC能够表达含有多个基因的大型DNA序列(100-3000kB)。最近，将YAC的使用应用于工程构建酵母中的类黄酮(flavenoid)生物合成(Naesby等人,Microb Cell Fact8:49-56(2009))。在该方案中，使用YAC来快速地试验随机装配的途径基因，以发现最佳组合。
通过改变基因和/或它的调节区的序列，可以调控基因的表达水平。这样的基因调节区包括，例如，启动子、增强子、内含子和终止子。也可以采用负调节元件(诸如阻遏物和/或沉默子)的功能破坏来增强基因表达。也可以采用基于RNA的工具来调节基因表达。这样的工具包括RNA适体、核糖开关、反义RNA、核酶和核糖开关。
就用基因的启动子改变所述基因的表达而言，可得到不同强度的组成型和诱导型启动子的文库。强组成型启动子包括pTEF1、pADH1和源自糖酵解途径基因的启动子。pGAL启动子是经过充分研究的诱导型启动子，其被半乳糖活化和被葡萄糖抑制。另一种常用的诱导型启动子是铜诱导型启动子pCUP1(Farhi等人,Met Eng13:474-81(2011))。通过诱变或改组方法，可以引入启动子强度的其它变异。例如，可以应用易错PCR来产生合成的启动子文库，如Alper和同事所证实的(Alper等人,PNAS102:12678-83(2005))。通过报道蛋白(诸如β-半乳糖苷酶、荧光蛋白和萤光素酶)可以表征启动子强度。
插入的基因在基因组中的布局可以改变它的表达水平。例如，通过将基因整合进重复DNA元件(诸如核糖体DNA或长末端重复序列)中，可以实现整合的基因的过表达。
就酵母或其它真核细胞中的外源表达而言，可以在不添加前导序列的情况下在细胞溶质中表达基因，或者可以通过添加合适的靶向序列(诸如适合宿主细胞的线粒体靶向或分泌信号)而靶向线粒体或其它细胞器，或者靶向分泌。因而，应当理解，可以将核酸序列的适当修饰(用于除去或包括靶向序列)掺入外源核酸序列中以赋予合乎需要的性能。还可以做出遗传修饰以增强多肽合成。例如，通过用最佳或共有序列置换核糖体结合位点和/或改变基因的序列以添加或除去二级结构，增强翻译效率。通过用另一个编码序列置换一个编码序列以更好地匹配宿主的密码子偏好，也可以增加翻译速率。
实施例XI
用于1,3-BDO输出的示例性基因
1,3-丁二醇必须离开生产生物才能回收和/或脱水成丁二烯。编码可以促进1,3-丁二醇运输的酶的基因包括甘油易化蛋白同系物，诸如下面提供的那些。输出丁醇的多药抗药性转运蛋白，包括OmrA、LmrA和同系物(参见，例如，Burd和Bhattacharyya,美国专利申请20090176288)，也是1,3-丁二醇的合适转运蛋白。
表83
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
glpF NP_418362.1 16131765 大肠杆菌
YFL054C NP_116601.1 14318465 酿酒酵母
YLL043W NP_013057.1 6322985 酿酒酵母
KLLA0E00617g XP_453974.1 50307951 乳酸克鲁维酵母
ANI_1_1314144 XP_001397337.2 317036426 黑曲霉
ANI_1_3222024 XP_001400456.1 145234170 黑曲霉
ANI_1_710114 XP_001396373.2 317034445 黑曲霉
YALI0E05665p XP_503595.1 50552370 解脂耶氏酵母
YALI0F00462p XP_504820.1 50554823 解脂耶氏酵母
OmrA ZP_01543718 118586261 酒酒球菌
LmrA AAB49750 1890649 乳酸乳球菌
实施例XII
用于从PEP和丙酮酸生产乙酰辅酶A的途径
图10显示了用于将PEP和丙酮酸转化成乙酰辅酶A、乙酰乙酰辅酶A和进一步转化成源自乙酰乙酰辅酶A的产物(诸如1,3-丁二醇)的众多途径。下面描述了图10所示的反应的酶候选物。
表84
1.1.n.a 氧化还原酶(醇至氧代) M
1.1.1.d 苹果酸酶 L
1.2.1.a 氧化还原酶(醛至酸) J
1.2.1.b 氧化还原酶(酰基辅酶A至醛) G
1.2.1.f 氧化还原酶(将酰基辅酶A脱羧为醛) C
2.7.2.a 激酶 N
2.8.3.a 辅酶A转移酶 K
3.1.3.a 磷酸酶 N
4.1.1.a 脱羧酶 A,B,D
6.2.1.a 辅酶A合成酶 K
6.4.1.a 羧化酶 D,H
在本文别处已经描述了图10的几种酶的酶候选物。这些包括乙酰乙酰辅酶A合酶(表70)、乙酰乙酰辅酶A硫解酶(表42)、丙二酰辅酶A还原酶(也称为丙二酸半醛脱氢酶(酰化)(表35、46)、苹果酸脱氢酶(表7和23)。
1.1.n.a
苹果酸脱氢酶或氧化还原酶催化苹果酸氧化为草酰乙酸。不同的载体可以充当这类酶的电子受体。苹果酸脱氢酶利用NADP或NAD作为电子受体。上面在实施例1(表7、23)中描述了苹果酸脱氢酶(步骤M)酶候选物。苹果酸:醌氧化还原酶(EC1.1.5.4)是膜结合的，并利用醌、黄素蛋白或维生素K作为电子受体。大肠杆菌、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)和丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的苹果酸:醌氧化还原酶由mqo编码(Kather等人,J Bacteriol182:3204-9(2000)；Mellgren等人,J Bacteriol191:3132-42(2009))。谷氨酸棒杆菌(C.gluamicum)的Cgl2001基因也编码MQO酶(Mitsuhashi等人,Biosci Biotechnol Biochem70:2803-6(2006))。
表85
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
mqo NP_416714.1 16130147 大肠杆菌
mqo NP_206886.1 15644716 幽门螺杆菌
mqo NP_790970.1 28868351 丁香假单胞菌
Cgl2001 NP_601207.1 19553205 谷氨酸棒杆菌
1.1.1.d
苹果酸酶(苹果酸脱氢酶)催化丙酮酸至苹果酸的可逆氧化性羧基化。大肠杆菌编码2种苹果酸酶MaeA和MaeB(Takeo,J.Biochem.66:379-387(1969))。尽管通常假定苹果酸酶在从苹果酸形成丙酮酸的方向工作，已经证实由maeA编码的NAD依赖性的酶在碳固定方向工作(Stols和Donnelly,Appl.Environ.Microbiol.63(7)2695-2701(1997))。在大肠杆菌中过表达得自猪蛔虫(Ascaris suum)的苹果酸酶以后，得到了类似的观察结果(Stols等人,Appl.Biochem.Biotechnol.63-65(1),153-158(1997))。由maeB编码的第二种大肠杆菌苹果酸酶是NADP依赖性的，且也会将草酰乙酸和其它α-酮酸脱羧(Iwakura等人,J.Biochem.85(5):1355-65(1979))。另一种合适的酶候选物是得自玉米的me1(Furumoto等人,Plant Cell Physiol41:1200-1209(2000))。
表86
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
maeA NP_415996 90111281 大肠杆菌
maeB NP_416958 16130388 大肠杆菌
NAD-ME P27443 126732 猪蛔虫
Me1 P16243.1 126737 玉米
1.2.1.a
丙二酸半醛脱氢酶(EC1.2.1.15)催化丙二酸半醛氧化为丙二酸。在铜绿假单孢菌中表征了该酶(Nakamura等人,Biochim Biophys Acta50:147-52(1961))。
小眼虫(小眼虫)的NADP和NAD依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶接受丙二酸半醛作为底物(Tokunaga等人,Biochem Biophys Act429:55-62(1976))。迄今为止尚未鉴别出编码这些酶的基因。得自真核生物(诸如酿酒酵母、白色假丝酵母、解脂耶氏酵母和黑曲霉)的醛脱氢酶通常具有宽底物特异性，且是合适的候选物。这些酶和其它形成酸的醛脱氢酶和醛氧化酶在以前有所描述，并列在表9和30中。其它MSA脱氢酶酶候选物包括NAD(P)+依赖性的醛脱氢酶(EC1.2.1.3)。在人肝脏中发现的2种醛脱氢酶ALDH-1和ALDH-2具有针对多种脂族、芳族和多环醛的宽底物范围(Klyosov,Biochemistry35:4457-4467(1996a))。使用GroEL蛋白作为伴侣素，已经在大肠杆菌中有效地表达了有活性的ALDH-2(Lee等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.298:216-224(2002))。大鼠线粒体醛脱氢酶也具有宽底物范围(Siew等人,Arch.Biochem.Biophys.176:638-649(1976))。大肠杆菌基因astD和aldH编码NAD+依赖性的醛脱氢酶。AstD对琥珀半醛有活性(Kuznetsova等人,FEMS Microbiol Rev29:263-279(2005))，且aldH对宽范围的芳族和脂族底物有活性(Jo等人,Appl Microbiol Biotechnol81:51-60(2008))。
表87
基因 GenBank登记号 GI No. 生物
astD P76217.1 3913108 大肠杆菌
aldH AAC74382.1 1787558 大肠杆菌
ALDH-2 P05091.2 118504 智人
ALDH-2 NP_115792.1 14192933 褐家鼠
1.2.1.f
丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)(EC1.2.1.18)催化丙二酸半醛至乙酰辅酶A的氧化脱羧。示例性酶是由嗜盐菌属HTNK1的ddcC(Todd等人,EnvironMicrobiol12:237-43(2010))和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的IolA(Yebra等人,AEM73:3850-8(2007))编码。DdcC酶在黑曲霉和白色假丝酵母中具有下表所示的同系物。褐家鼠中的丙二酸半醛脱氢酶Mmsdh也会将丙二酸半醛转化成乙酰辅酶A(US8048624)。还已经在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中表征了丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)，尽管迄今为止尚未鉴别出基因(Hayaishi等人,J Biol Chem236:781-90(1961))。甲基丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)(EC1.2.1.27)也是合适的候选物，因为该类中的几种酶接受丙二酸半醛作为底物，包括枯草芽孢杆菌的Msdh(Stines-Chaumeil等人,Biochem J395:107-15(2006))和褐家鼠的甲基丙二酸半醛脱氢酶(Kedishvii等人,Methods Enzymol324:207-18(2000))。
表88
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
ddcC ACV84070.1 258618587 嗜盐菌属HTNK1
ANI_1_1120014 XP_001389265.1 145229913 黑曲霉
ALD6 XP_710976.1 68490403 白色假丝酵母
YALI0C01859g XP_501343.1 50547747 解脂耶氏酵母
mmsA_1 YP_257876.1 70734236 荧光假单胞菌
mmsA_2 YP_257884.1 70734244 荧光假单胞菌
PA0130 NP_248820.1 15595328 铜绿假单孢菌
Mmsdh Q02253.1 400269 褐家鼠
msdh NP_391855.1 16081027 枯草芽孢杆菌
IolA ABP57762.1 145309085 干酪乳杆菌
2.7.2.a
丙酮酸激酶(步骤10N)也被称作磷酸烯醇丙酮酸(EC2.7.9.2)，会将丙酮酸和ATP转化成PEP和AMP。该酶由酿酒酵母中的PYK1(Burke等人,J.Biol.Chem.258:2193-2201(1983))和PYK2(Boles等人,J.Bacteriol.179:2987-2993(1997))基因编码。在大肠杆菌中，该活性由pykF和pykA的基因产物催化。也在下表中显示了酿酒酵母酶的选定同系物。
表89
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
PYK1 NP_009362 6319279 酿酒酵母
PYK2 NP_014992 6324923 酿酒酵母
pykF NP_416191.1 16129632 大肠杆菌
pykA NP_416368.1 16129807 大肠杆菌
KLLA0F23397g XP_456122.1 50312181 乳酸克鲁维酵母
CaO19.3575 XP_714934.1 68482353 白色假丝酵母
CaO19.11059 XP_714997.1 68482226 白色假丝酵母
YALI0F09185p XP_505195 210075987 解脂耶氏酵母
ANI_1_1126064 XP_001391973 145238652 黑曲霉
2.8.3.a
EC类别2.8.3.a中的辅酶A转移酶催化丙二酸活化为丙二酰辅酶A。已经在假单胞菌属(包括荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌)中表征了丙二酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.3)(Takamura等人,Biochem Int3:483-91(1981)；Hayaishi等人,J Biol Chem215:125-36(1955))。迄今为止尚未鉴别出与这些酶有关的基因。在褐家鼠肝脏中发现的线粒体辅酶A转移酶也催化该反应，且能够利用许多辅酶A供体和受体(Deana等人,Biochem Int26:767-73(1992))。也可以应用上述的几种辅酶A转移酶来催化图10的步骤K。这些酶包括乙酰辅酶A转移酶(表26)、3-HB辅酶A转移酶(表8)、乙酰乙酰辅酶A转移酶(表55)、SCOT(表56)和其它辅酶A转移酶(表57)。
3.1.3.a
磷酸烯醇丙酮酸磷酸酶(EC3.1.3.60,步骤10N)催化PEP水解为丙酮酸和磷酸。众多磷酸酶催化该活性，包括碱性磷酸酶(EC3.1.3.1)、酸性磷酸酶(EC3.1.3.2)、磷酸甘油酸磷酸酶(EC3.1.3.20)和PEP磷酸酶(EC3.1.3.60)。已经在植物(诸如绿豆(Vignia radiate)、海莲(Bruguiera sexangula)和黑芥(Brassica nigra))中表征了PEP磷酸酶。得自烟曲霉(Aspergillusfumigates)的植酸酶、得自智人的酸性磷酸酶和大肠杆菌的碱性磷酸酶也会催化PEP水解为丙酮酸(Brugger等人,Appl Microbiol Biotech63:383-9(2004)；Hayman等人,Biochem J261:601-9(1989)；等人,The Enzymes第3版4:373-415(1971)))。已经在空肠弯曲杆菌(van Mourik等人,Microbiol.154:584-92(2008))、酿酒酵母(Oshima等人,Gene179:171-7(1996))和金黄色葡萄球菌(Shah和Blobel,J.Bacteriol.94:780-1(1967))中表征了类似酶。碱性磷酸酶可能需要酶工程和/或靶向序列的除去才能在细胞质中起作用。
表90
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
phyA O00092.1 41017447 烟曲霉
Acp5 P13686.3 56757583 智人
phoA NP_414917.2 49176017 大肠杆菌
phoX ZP_01072054.1 86153851 空肠弯曲杆菌
PHO8 AAA34871.1 172164 酿酒酵母
SaurJH1_2706 YP_001317815.1 150395140 金黄色葡萄球菌
4.1.1.a
EC类别4.1.1中的脱羧酶催化图10中的几种反应，所述脱羧酶包括草酰乙酸脱羧酶(步骤B)、丙二酰辅酶A脱羧酶(步骤D)和丙酮酸羧化酶或羧基激酶(步骤A)。
磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(EC4.1.1.31)催化磷酸烯醇丙酮酸羧基化为草酰乙酸。示例性的PEP羧化酶是由下述基因编码：大肠杆菌中的ppc(Kai等人,Arch.Biochem.Biophys.414:170-179(2003)，扭脱甲基杆菌AM1中的ppcA(Arps等人,J.Bacteriol.175:3776-3783(1993)，和谷氨酸棒杆菌中的ppc(Eikmanns等人,Mol.Gen.Genet.218:330-339(1989)。
表91
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
Ppc NP_418391 16131794 大肠杆菌
ppcA AAB58883 28572162 扭脱甲基杆菌
Ppc ABB53270 80973080 谷氨酸棒杆菌
将磷酸烯醇丙酮酸羧基化为草酰乙酸的一种替代酶是PEP羧基激酶(EC4.1.1.32,4.1.1.49)，其同时形成ATP或GTP。在大多数生物中，PEP羧基激酶发挥糖原异生功能，并以1摩尔ATP为代价将草酰乙酸转化成PEP。酿酒酵母是一种这样的生物，它的天然PEP羧基激酶PCK1发挥糖原异生作用(Valdes-Hevia等人,FEBS Lett.258:313-316(1989)。大肠杆菌是另一种这样的生物，因为认为与PEP羧化酶相比，PEP羧基激酶在生产草酰乙酸中的作用是次要的(Kim等人,Appl.Environ.Microbiol.70:1238-1241(2004))。尽管如此，最近已经在大肠杆菌K-12的ppc突变体中证实了天然的大肠杆菌PEP羧基激酶从PEP向草酰乙酸的活性(Kwon等人,J.Microbiol.Biotechnol.16:1448-1452(2006))。这些菌株没有表现出生长缺陷，且在高NaHCO3浓度具有增加的琥珀酸生产。大肠杆菌的突变株可以采用Pck作为适应进化以后的优势CO2固定酶(Zhang等人2009)。在有些生物、特别是瘤胃细菌中，PEP羧基激酶可非常有效地从PEP生成草酰乙酸，并产生ATP。已经克隆进大肠杆菌中的PEP羧基激酶基因的实例包括：得自产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens)(Lee等人,Biotechnol.Bioprocess Eng.7:95-99(2002))、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)(Laivenieks等人,Appl.Environ.Microbiol.63:2273-2280(1997)和产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)(Kim等人出处同上)的那些。由流感嗜血杆菌编码的PEP羧基激酶可有效地从PEP形成草酰乙酸。另一种合适的候选物是得自Megathyrsus maximus的PEPCK酶，其对CO2具有低Km，所述CO2被视作大肠杆菌酶的限速底物(Chen等人,Plant Physiol128:160-164(2002)；Cotelesage等人,Int.J Biochem.Cell Biol.39:1204-1210(2007))。得自钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的GTP依赖性的pepck基因产物的动力学有利于草酰乙酸形成(US8048624和Lea等人,Amino Acids20:225-41(2001))。
表92
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
PCK1 NP_013023 6322950 酿酒酵母
pck NP_417862.1 16131280 大肠杆菌
pckA YP_089485.1 52426348 产琥珀酸曼氏杆菌
pckA O09460.1 3122621 产琥珀酸厌氧螺菌
pckA Q6W6X5 75440571 产琥珀酸放线杆菌
pckA P43923.1 1172573 流感嗜血菌
AF532733.1:1..1929 AAQ10076.1 33329363 Megathyrsus maximus
pepck YP_728135.1 113869646 钩虫贪铜菌
草酰乙酸脱羧酶催化草酰乙酸脱羧为丙二酸半醛。催化该反应的酶包括结核分枝杆菌的kgd(GenBank ID:O50463.4,GI:160395583)。还已经描述了从kgd进化的、具有提高的活性和/或对草酰乙酸的底物特异性的酶(美国专利8048624)。可用于催化该反应的其它酶包括下表所示的酮-酸脱羧酶。
表93
EC编号 名称
4.1.1.1 丙酮酸脱羧酶
4.1.1.7 苯甲酰基甲酸脱羧酶
4.1.1.40 羟基丙酮酸脱羧酶
4.1.1.43 酮苯基丙酮酸脱羧酶
4.1.1.71 α-酮戊二酸脱羧酶
4.1.1.72 支链酮-酸脱羧酶
4.1.1.74 吲哚丙酮酸脱羧酶
4.1.1.75 2-酮精氨酸脱羧酶
4.1.1.79 硫化丙酮酸脱羧酶
4.1.1.80 羟基苯基丙酮酸脱羧酶
4.1.1.82 膦酰基丙酮酸脱羧酶
酮-酸的脱羧由多种具有不同底物特异性的酶催化，包括丙酮酸脱羧酶(EC4.1.1.1)、苯甲酰基甲酸脱羧酶(EC4.1.1.7)、α-酮戊二酸脱羧酶和支链α-酮酸脱羧酶。丙酮酸脱羧酶(PDC)也被称作酮-酸脱羧酶，是醇发酵中的一种关键酶，其催化丙酮酸脱羧为乙醛。得自酿酒酵母的PDC1酶具有脂族2-酮酸的宽底物范围，包括2-酮丁酸、2-酮戊酸、3-羟基丙酮酸和2-苯基丙酮酸(22)。该酶已经经过广泛研究，经工程改造以改变活性，并在大肠杆菌中进行功能表达(Killenberg-Jabs等人,Eur.J.Biochem.268:1698-1704(2001)；Li等人,Biochemistry.38:10004-10012(1999)；ter Schure等人,Appl.Environ.Microbiol.64:1303-1307(1998))。得自运动发酵单胞菌的PDC(由pdc编码)也具有宽底物范围，并且已经成为定向工程改造研究以改变对不同底物的亲和力的主题(Siegert等人,Protein Eng Des Sel18:345-357(2005))。可得到该酶的晶体结构(Killenberg-Jabs等人,Eur.J.Biochem.268:1698-1704(2001))。其它充分表征的PDC候选物包括得自巴斯德氏醋杆菌(Chandra等人,176:443-451(2001))和乳酸克鲁维酵母(Krieger等人,269:3256-3263(2002))的酶。
表94
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
pdc P06672.1 118391 运动发酵单胞菌
pdc1 P06169 30923172 酿酒酵母
pdc Q8L388 20385191 巴斯德氏醋杆菌
pdc1 Q12629 52788279 乳酸克鲁维酵母
如PDC一样，苯甲酰基甲酸脱羧酶(EC4.1.1.7)具有宽底物范围，并且已成为酶工程研究的靶标。得自恶臭假单胞菌的该酶已经被广泛研究，并且可得到此酶的晶体结构(Polovnikova等人,42:1820-1830(2003)；Hasson等人,37:9918-9930(1998))。在恶臭假单胞菌酶的活性部位中的两个残基的定位诱变改变了天然和非天然存在的底物的亲和力(Km)(Siegert等人,Protein Eng Des Sel18:345-357(2005))。此酶的性质已经通过定向工程改造进一步修饰(Lingen等人,Chembiochem.4:721-726(2003)；Lingen等人,Protein Eng15:585-593(2002))。还已经实验表征了得自铜绿假单孢菌的该酶(由mdlC编码)(Barrowman等人,34:57-60(1986))。可以通过序列同源性推断出得自施氏假单胞菌、荧光假单胞菌和其它生物的其它基因候选物，或者使用在恶臭假单胞菌中开发的生长选择系统进行鉴定(Henning等人,Appl.Environ.Microbiol.72:7510-7517(2006))。
表95
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
mdlC P20906.2 3915757 恶臭假单胞菌
mdlC Q9HUR2.1 81539678 铜绿假单孢菌
dpgB ABN80423.1 126202187 施氏假单胞菌
ilvB-1 YP_260581.1 70730840 荧光假单胞菌
能使2-酮酸脱羧的第三种酶是α-酮戊二酸脱羧酶(KGD,EC4.1.1.71)。迄今为止还没有研究此类酶的底物范围。一种示例性的KDC由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中的kad编码(Tian等人,PNAS102:10670-10675(2005))。还已经在几个根瘤菌物种(包括大豆慢生根瘤菌和百脉根中慢生根瘤菌)中检测出KDC酶活性(Green等人,J Bacteriol182:2838-2844(2000))。尽管还没有在这些生物中分离出KDC-编码基因，但可获得基因组序列，并且每个基因组中的数个基因被注解为假定的KDC。也已经表征了得自细小裸藻(Euglena gracilis)的KDC，但是迄今为止尚未鉴定出与此活性相关的基因(Shigeoka等人,Arch.Biochem.Biophys.288:22-28(1991))。从N端开始的前20个氨基酸序列为MTYKAPVKDVKFLLDKVFKV(SEQ ID NO:8)(Shigeoka和Nakano,Arch.Biochem.Biophys.288:22-28(1991))。通过试验含有KDC活性的该N-端的侯选基因来鉴定该基因。最近已经在蓝细菌(诸如聚球蓝细菌属(Synechococcus sp.)PCC7002和同系物)中鉴别出一类新的AKG脱羧酶(Zhang和Bryant,Science334:1551-3(2011))。
表96
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
kgd O50463.4 160395583 结核分枝杆菌
kgd NP_767092.1 27375563 大豆慢生根瘤菌USDA110
kgd NP_105204.1 13473636 百脉根中慢生根瘤菌
ilvB ACB00744.1 169887030 聚球蓝细菌属PCC7002
用于催化该反应的第四种候选酶是支链α-酮酸脱羧酶(BCKA)。已经证实这类酶作用于链长度在3-6个碳之间变化的多种化合物(Oku等人,J BiolChem.263:18386-18396(1988)；Smit等人,Appl Environ Microbiol71:303-311(2005))。已经在多种支链和直链底物上表征了乳酸乳球菌中的该酶，所述底物包括包括2-氧代丁酸、2-氧代己酸、2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代丁酸、4-甲基-2-氧代丁酸和异己酸(Smit等人,Appl Environ Microbiol71:303-311(2005))。已经从结构上表征了该酶(Berg等人,Science.318:1782-1786(2007))。乳酸乳球菌酶和运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶之间的序列比对表明，催化和底物识别残基几乎相同(Siegert等人,ProteinEng Des Sel18:345-357(2005))，所以该酶将是一种有前途的定向工程候选酶。酿酒酵母的几种酮酸脱羧酶催化支链底物的脱羧，包括ARO10、PDC6、PDC5、PDC1和THI3(Dickenson等人,J Biol Chem275:10937-42(2000))。另一种BCKAD酶由结核分枝杆菌的rv0853c编码(Werther等人,J BiolChem283:5344-54(2008))。α-酮酸底物会对该酶进行变构活化。在枯草芽孢杆菌中检测出由BCKA实现的α-酮戊二酸的脱羧；但是，该活性相对于对其它支链底物的活性较低(5％)(Oku和Kaneda,J Biol Chem.263:18386-18396(1988))，并且迄今为止还没有鉴定出编码该酶的基因。通过与乳酸乳球菌蛋白质序列的同源性，可以鉴定其它BCKA基因候选物。对该酶的很多高分BLASTp命中被注解为吲哚丙酮酸脱羧酶(EC4.1.1.74)。吲哚丙酮酸脱羧酶(IPDA)是在植物和植物细菌中催化吲哚丙酮酸脱羧为吲哚乙醛的酶。已经在大肠杆菌中克隆和功能表达了重组支链α-酮酸脱羧酶，其源自得自智人和欧洲牛的线粒体支链酮酸脱氢酶复合物的E1亚基(Davie等人,J.Biol.Chem.267:16601-16606(1992)；Wynn等人,J.Biol.Chem.267:12400-12403(1992)；Wynn等人,J.Biol.Chem.267:1881-1887(1992))。在这些研究中，作者发现，伴侣素GroEL和GroES的共表达会使该脱羧酶的比活性增强500倍(Wynn等人,J.Biol.Chem.267:12400-12403(1992))。这些酶由两个α亚基和两个β亚基组成。
表97
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
kdcA AAS49166.1 44921617 乳酸乳球菌
PDC6 NP_010366.1 6320286 酿酒酵母
PDC5 NP_013235.1 6323163 酿酒酵母
PDC1 P06169 30923172 酿酒酵母
ARO10 NP_010668.1 6320588 酿酒酵母
THI3 NP_010203.1 6320123 酿酒酵母
rv0853c O53865.1 81343167 结核分枝杆菌
BCKDHB NP_898871.1 34101272 智人
BCKDHA NP_000700.1 11386135 智人
BCKDHB P21839 115502434 欧洲牛
BCKDHA P11178 129030 欧洲牛
3-膦酰基丙酮酸脱羧酶(EC4.1.1.82)催化3-膦酰基丙酮酸脱羧为2-膦酰基乙醛。示例性的膦酰基丙酮酸脱羧酶由苍黄链霉菌(Streptomycesluridus)的dhpF、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的ppd、Streptomyces wedmorensis的fom2和吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopius)的bcpC编码(Circello等人,Chem Biol17:402-11(2010)；Blodgett等人,FEMS Microbiol Lett163:149-57(2005)；Hidaka等人,Mol GenGenet249:274-80(1995)；Nakashita等人,Biochim Biophys Acta1490:159-62(2000))。由aepY编码的脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)酶也将丙酮酸和硫化丙酮酸脱羧(Zhang等人,J Biol Chem278:41302-8(2003))。
表98
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
dhpF ACZ13457.1 268628095 苍黄链霉菌
Ppd CAJ14045.1 68697716 绿色产色链霉菌
Fom2 BAA32496.1 1061008 Streptomyces wedmorensis
aepY AAG26466.1 11023509 脆弱拟杆菌
许多草酰乙酸脱羧酶诸如大肠杆菌中的eda基因产物(EC4.1.1.3)作用于草酰乙酸的末端酸以形成丙酮酸。因为在3-酮酸位置处的脱羧与在2-酮-酸位置处形成丙二酸半醛的脱羧竞争，在具有穿过丙二酸半醛中间体前进的途径的宿主菌株中可以敲除该酶活性。
丙二酰辅酶A脱羧酶(EC4.1.1.9)催化丙二酰辅酶A脱羧为乙酰辅酶A。已经在豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)和醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)中表征了酶(An等人,Eur J Biochem257:395-402(1998)；Koo等人,Eur J Biochem266:683-90(1999))。已经在红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus)中表征了类似酶(Hunaiti等人,ArchBiochem Biophys229:426-39(1984))。在大肠杆菌中过表达了重组人丙二酰辅酶A脱羧酶(Zhou等人,Prot Expr Pur34:261-9(2004))。将丙二酰辅酶A脱羧的甲基丙二酰辅酶A脱羧酶也是合适的候选物。例如，小韦荣球菌(Veillonella parvula)酶接受丙二酰辅酶A作为底物(Hilpert等人,Nature296:584-5(1982))。大肠杆菌酶是由ygfG编码(Benning等人,Biochemistry.39:4630-4639(2000)；Haller等人,Biochemistry.39:4622-4629(2000))。没有报道大肠杆菌酶的立体特异性，但是在中度产丙酸菌(Propionigeniummodestum)(Bott等人,Eur.J.Biochem.250:590-599(1997))和小韦荣球菌(Huder等人,J.Biol.Chem.268:24564-24571(1993))中的酶催化甲基丙二酰辅酶A的(S)-立体异构体的脱羧(Hoffmann等人,FEBS.Lett.220:121-125(1987))。得自中度产丙酸菌和小韦荣球菌的酶包含多个亚基，所述亚基不仅将(S)-甲基丙二酰辅酶A脱羧，而且产生跨细胞膜运输钠离子的泵作为产生能量的方式。
表99
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
YgfG NP_417394 90111512 大肠杆菌
matA Q9ZIP6 75424899 豌豆根瘤菌
mdcD AAB97628.1 2804622 醋酸钙不动杆菌
mdcE AAF20287.1 6642782 醋酸钙不动杆菌
mdcA AAB97627.1 2804621 醋酸钙不动杆菌
mdcC AAB97630.1 2804624 醋酸钙不动杆菌
mcd NP_036345.2 110349750 智人
mmdA CAA05137 2706398 中度产丙酸菌
mmdD CAA05138 2706399 中度产丙酸菌
mmdC CAA05139 2706400 中度产丙酸菌
mmdB CAA05140 2706401 中度产丙酸菌
mmdA CAA80872 415915 小韦荣球菌
mmdC CAA80873 415916 小韦荣球菌
mmdE CAA80874 415917 小韦荣球菌
mmdD CAA80875 415918 小韦荣球菌
mmdB CAA80876 415919 小韦荣球菌
6.2.1.a
EC类别6.2.1.a中的辅酶A合成酶催化丙二酸活化为丙二酰辅酶A。迄今为止在文献中尚未描述催化该反应的辅酶A合成酶。还可以应用上面描述的几种辅酶A合成酶来催化图10的步骤K。这些酶包括乙酰辅酶A合成酶(表16、25)和形成ADP的辅酶A合成酶(表17)。
6.4.1.a
以1个ATP为代价，丙酮酸羧化酶(EC6.4.1.1)将丙酮酸转化为草酰乙酸(步骤H)。示例性的丙酮酸羧化酶是由下述基因编码：在酿酒酵母中的PYC1(Walker等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.176:1210-1217(1991)和PYC2(Walker等人,出处同上)，和在耻垢分枝杆菌中的pyc(Mukhopadhyay和Purwantini,Biochim.Biophys.Acta1475:191-206(2000))。
表100
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
PYC1 NP_011453 6321376 酿酒酵母
PYC2 NP_009777 6319695 酿酒酵母
Pyc YP_890857.1 118470447 耻垢分枝杆菌
乙酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.2)催化ATP依赖性的乙酰辅酶A羧基化为丙二酰辅酶A。该酶是生物素依赖性的，且是几种生物中脂肪酸生物合成起始的第一个反应。示例性酶是由大肠杆菌的accABCD(Davis等人,JBiol Chem275:28593-8(2000))、酿酒酵母的ACC1和同系物(Sumper等人,Methods Enzym71:34-7(1981))编码。
表101
蛋白 GenBank ID GI编号 生物
ACC1 CAA96294.1 1302498 酿酒酵母
KLLA0F06072g XP_455355.1 50310667 乳酸克鲁维酵母
ACC1 XP_718624.1 68474502 白色假丝酵母
YALI0C11407p XP_501721.1 50548503 解脂耶氏酵母
ANI_1_1724104 XP_001395476.1 145246454 黑曲霉
accA AAC73296.1 1786382 大肠杆菌
accB AAC76287.1 1789653 大肠杆菌
accC AAC76288.1 1789654 大肠杆菌
accD AAC75376.1 1788655 大肠杆菌
5.序列表
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Claims (45)

1.一种非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：将乙酰辅酶A从所述生物的线粒体运输至所述生物的细胞溶质和/或增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A，其中所述乙酰辅酶A途径包含选自以下的途径：
i.2A、2B和2D；
ii.2A、2C和2D；
iii.2A、2B、2E和2F；
iv.2A、2C、2E和2F；
v.2A、2B、2E、2K和2L；和
vi.2A、2C、2E、2K和2L；
其中，2A是柠檬酸合酶；2B是柠檬酸转运蛋白；2C是柠檬酸/草酰乙酸转运蛋白或柠檬酸/苹果酸转运蛋白；2D是ATP柠檬酸裂合酶；2E是柠檬酸裂合酶；2F是乙酰辅酶A合成酶；2K是乙酸激酶；且2L是磷酸转乙酰酶。
2.根据权利要求1所述的生物，其中，所述乙酰辅酶A途径进一步包含2G、3I和/或3J，其中2G是草酰乙酸转运蛋白，3H是细胞溶质苹果酸脱氢酶，3I是苹果酸转运蛋白，且3J是线粒体苹果酸脱氢酶。
3.一种非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物，其中，所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A，其中，所述乙酰辅酶A途径包含选自以下的途径：
i.5A和5B；
ii.5A、5C和5D；
iii.5E、5F、5C和5D；和
iv.5G和5D；
其中，5A是丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；5B是乙酰辅酶A合成酶、连接酶或转移酶；5C是乙酸激酶；5D是磷酸转乙酰酶；5E是丙酮酸脱羧酶，5F是乙醛脱氢酶；且5G是丙酮酸氧化酶(乙酰磷酸形成)。
4.一种非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物，其中，所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：将乙酰辅酶A从所述生物的线粒体和/或过氧化物酶体运输至所述生物的细胞溶质和/或增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A，其中，所述乙酰辅酶A途径包含选自以下的途径：
i.6A、6D和6C；和
ii.6B、6E和6C；
其中，6A是线粒体乙酰肉碱转移酶；6B是过氧化物酶体乙酰肉碱转移酶；6C是细胞溶质乙酰肉碱转移酶；6D是线粒体乙酰肉碱移位酶；且6E是过氧化物酶体乙酰肉碱移位酶。
5.一种非天然存在的包含乙酰辅酶A途径的真核生物，其中，所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A，其中，所述乙酰辅酶A途径包含选自以下的途径：
i.10A、10B和10C；
ii.10N、10H、10B和10C；
iii.10N、10L、10M、10B和10C；
iv.10A、10B、10G和10D；
v.10N、10H、10B、10G和10D；
vi.10N、10L、10M、10B、10G和10D；
vii.10A、10B、10J、10K和10D；
viii.10N、10H、10B、10J、10K和10D；
ix.10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；
x.10A、10F和10D；
xi.10N、10H、10F和10D；和
xii.10N、10L、10M、10F和10D；
其中，10A是PEP羧化酶或PEP羧基激酶；10B是草酰乙酸脱羧酶；10C是丙二酸半醛脱氢酶(乙酰化)；10D是丙二酰辅酶A脱羧酶；10F是草酰乙酸脱氢酶或草酰乙酸氧化还原酶；10G是丙二酰辅酶A还原酶；10H是丙酮酸羧化酶；10J是丙二酸半醛脱氢酶；10K是丙二酰辅酶A合成酶或转移酶；10L是苹果酸酶；10M是苹果酸脱氢酶或氧化还原酶；且10N是丙酮酸激酶或PEP磷酸酶。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的生物，其中，所述真核生物包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种各自编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的生物，所述生物进一步包含1,3-丁二醇(1,3-BDO)途径，其中，所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述1,3-BDO途径包含选自以下的途径：
i.4A、4E、4F和4G；
ii.4A、4B和4D；
iii.4A、4E、4C和4D；
iv.4A、4H和4J；
v.4A、4H、4I和4G；
vi.4A、4H、4M、4N和4G；
vii.4A、4K、4O、4N和4G；
viii.4A、4K、4L、4F和4G；
ix.7E、7F、4E、4F和4G；
x.7E、7F、4B和4D；
xi.7E、7F、4E、4C和4D；
xii.7E、7F、4H和4J；
xiii.7E、7F、4H、4I和4G；
xiv.7E、7F、4H、4M、4N和4G；
xv.7E、7F、4K、4O、4N和4G；和
xvi.7E、7F、4K、4L、4F和4G；
其中4A是乙酰乙酰辅酶A硫解酶；4B是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)；4C是3-氧代丁醛还原酶(醛还原)；4D是4-羟基,2-丁酮还原酶；4E是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)；4F是3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；4G是3-羟基丁醛还原酶；4H是乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)；4I是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)；4J是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)；4K是乙酰乙酰辅酶A转移酶、乙酰乙酰辅酶A水解酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶、或磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶；4L是乙酰乙酸还原酶；4M是3-羟基丁酰辅酶A转移酶、水解酶或合成酶；4N是3-羟基丁酸还原酶；4O是3-羟基丁酸脱氢酶；7E是乙酰辅酶A羧化酶；且7F是乙酰乙酰辅酶A合酶。
8.根据权利要求7所述的生物，其中：
i.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B和2D，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
ii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B和2D，和(2)所述1,3-BDO途径包含：(ii)4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
iii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B和2D，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
iv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B和2D，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
v.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B和2D，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
vi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B和2D，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
vii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B和2D，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
viii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B和2D，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
ix.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C和2D，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
x.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C和2D，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
xi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C和2D，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
xii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C和2D，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
xiii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C和2D，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
xiv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C和2D，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
xv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C和2D，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
xvi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C和2D，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
xvii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E和2F，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
xviii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E和2F，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
xix.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E和2F，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
xx.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E和2F，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
xxi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E和2F，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
xxii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E和2F，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
xxiii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E和2F，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N或4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
xxiv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E和2F，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
xxv.(1)2A、2C、2E和2F，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
xxvi.(1)2A、2C、2E和2F，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
xxvii.(1)2A、2C、2E和2F，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
xxviii.(1)2A、2C、2E和2F，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
xxix.(1)2A、2C、2E和2F，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
xxx.(1)2A、2C、2E和2F，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
xxxi.(1)2A、2C、2E和2F，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
xxxii.(1)2A、2C、2E和2F，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
xxxiii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E、2K和2L，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
xxxiv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E、2K和2L，且(2)所述1,3-BDO途径包含：(ii)4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
xxxv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E、2K和2L，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
xxxvi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E、2K和2L，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
xxxvii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E、2K和2L，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
xxxviii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E、2K和2L，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
xxxix.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E、2K和2L，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
xl.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2B、2E、2K和2L，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
xli.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C、2E、2K和2L，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
xlii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C、2E、2K和2L，和(2)所述1,3-BDO途径包含：(ii)4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
xliii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C、2E、2K和2L，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
xliv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C、2E、2K和2L，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
xlv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C、2E、2K和2L，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
xlvi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C、2E、2K和2L，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
xlvii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C、2E、2K和2L，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
xlviii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：2A、2C、2E、2K和2L，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
xlix.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5A和5B；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
l.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5A和5B；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
li.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5A和5B；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
lii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5A和5B；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
liii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5A和5B；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
liv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5A和5B；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
lv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5A和5B；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
lvi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5A和5B；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
lvii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5A、5C和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
lviii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5A、5C和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
lix.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5A、5C和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
lx.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5A、5C和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
lxi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5A、5C和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
lxii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5A、5C和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
lxiii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5A、5C和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
lxiv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5A、5C和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
lxv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5E、5F、5C和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
lxvi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5E、5F、5C和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
lxvii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5E、5F、5C和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
lxviii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5E、5F、5C和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
lxix.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5E、5F、5C和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
lxx.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5E、5F、5C和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
lxxi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5E、5F、5C和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
lxxii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5E、5F、5C和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
lxxiii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5G和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
lxxiv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5G和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
lxxv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5G和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
lxxvi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5G和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
lxxvii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5G和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
lxxviii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5G和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
lxxix.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5G和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；或者
lxxx.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5G和5D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
lxxxi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：6A、6D和6C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
lxxxii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：6A、6D和6C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
lxxxiii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：6A、6D和6C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
lxxxiv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：6A、6D和6C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
lxxxv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：6A、6D和6C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
lxxxvi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：6A、6D和6C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
lxxxvii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：6A、6D和6C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
lxxxviii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：6A、6D和6C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
lxxxix.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：6B、6E和6C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
xc.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：6B、6E和6C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
xci.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：6B、6E和6C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
xcii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：6B、6E和6C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
xciii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：6B、6E和6C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
xciv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：6B、6E和6C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
xcv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：6B、6E和6C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
xcvi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：6B、6E和6C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
xcvii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
xcviii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
xcix.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
c.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
ci.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
cii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
ciii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
civ.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
cv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
cvi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
cvii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
cviii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
cix.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
cx.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
cxi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
cxii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
cxiii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
cxiv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
cxv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
cxvi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
cxvii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
cxviii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
cxix.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
cxx.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B和10C；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
cxxi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
cxxii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
cxxiii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
cxxiv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
cxxv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
cxxvi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
cxxvii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
cxxviii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
cxxix.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
cxxx.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
cxxxi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
cxxxii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
cxxxiii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
cxxxiv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
cxxxv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
cxxxvi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
cxxxvii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
cxxxviii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
cxxxix.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
cxl.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
cxli.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
cxlii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
cxliii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
cxliv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B、10G和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
cxlv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
cxlvi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
cxlvii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
cxlviii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
cxlix.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
cl.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
cli.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
clii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
cliii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
cliv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
clv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
clvi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
clvii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
clviii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
clix.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
clx.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
clxi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
clxii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
clxiii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
clxiv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
clxv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
clxvi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
clxvii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
clxviii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
clxix.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
clxx.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
clxxi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
clxxii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
clxxiii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
clxxiv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
clxxv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
clxxvi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10A、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
clxxvii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
clxxviii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
clxxix.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
clxxx.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
clxxxi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
clxxxii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
clxxxiii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
clxxxiv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10H、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
clxxxv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
clxxxvi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
clxxxvii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
clxxxviii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
clxxxix.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
cxc.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
cxci.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；或者
cxcii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：10N、10L、10M、10F和10D；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G。
9.一种非天然存在的真核生物，其包含：
(1)乙酰辅酶A途径，其中，所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以实现下述的量表达：增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A，其中所述乙酰辅酶A途径包含选自以下的途径：
i.5J和5I；
ii.5J、5F和5B；和
iii.5H；
其中，5B是乙酰辅酶A合成酶、连接酶或转移酶；5F是乙醛脱氢酶；5H是丙酮酸脱氢酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；5I是乙醛脱氢酶(酰化)；且5J是苏氨酸醛缩酶；和
(2)1,3-BDO途径，其中，所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且其中所述1,3-BDO途径包含选自以下的途径：
i.4A、4E、4F和4G；
ii.4A、4B和4D；
iii.4A、4E、4C和4D；
iv.4A、4H和4J；
v.4A、4H、4I和4G；
vi.4A、4H、4M、4N和4G；
vii.4A、4K、4O、4N和4G；
viii.4A、4K、4L、4F和4G；
ix.7E、7F、4E、4F和4G；
x.7E、7F、4B和4D；
xi.7E、7F、4E、4C和4D；
xii.7E、7F、4H和4J；
xiii.7E、7F、4H、4I和4G；
xiv.7E、7F、4H、4M、4N和4G；
xv.7E、7F、4K、4O、4N和4G；和
xvi.7E、7F、4K、4L、4F和4G；
其中，4A是乙酰乙酰辅酶A硫解酶；4B是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)；4C是3-氧代丁醛还原酶(醛还原)，其中，4D是4-羟基,2-丁酮还原酶；4E是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)；4F是3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；4G是3-羟基丁醛还原酶或3-羟基丁醛还原酶；4H是乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)；4I是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)；4J是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)；4K是乙酰乙酰辅酶A转移酶、乙酰乙酰辅酶A水解酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶、或磷酸转乙酰乙酰酶和乙酰乙酸激酶；4L是乙酰乙酸还原酶；4M是3-羟基丁酰辅酶A转移酶、水解酶或合成酶；4N是3-羟基丁酸还原酶；4O是3-羟基丁酸脱氢酶；7E是乙酰辅酶A羧化酶；且7F是乙酰乙酰辅酶A合酶。
10.根据权利要求9所述的生物，其中
i.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：(1)5J和5I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
ii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5J和5I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
iii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5J和5I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
iv.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5J和5I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
v.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5J和5I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
vi.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5J和5I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
vii.(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5J和5I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
viii.其中所述乙酰辅酶A途径包含：(1)5J和5I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
ix.其中所述乙酰辅酶A途径包含：(1)5J、5F和5B；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
x.其中(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5J、5F和5B；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
xi.其中(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5J、5F和5B；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
xii.其中(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5J、5F和5B；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
xiii.其中(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5J、5F和5B；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
xiv.其中(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5J、5F和5B；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
xv.其中(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5J、5F和5B；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；
xvi.其中(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5J、5F和5B；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G；
xvii.其中(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5H；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4F和4G；或7E、7F、4E、4F和4G；
xviii.其中(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5H；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4B和4D；或7E、7F、4B和4D；
xix.其中(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5H；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4E、4C和4D；或7E、7F、4E、4C和4D；
xx.其中(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5H；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H和4J；或7E、7F、4H和4J；
xxi.其中(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5H；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4I和4G；或7E、7F、4H、4I和4G；
xxii.其中(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5H；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4H、4M、4N和4G；或7E、7F、4H、4M、4N和4G；
xxiii.其中(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5H；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4O、4N和4G；或7E、7F、4K、4O、4N和4G；或者
xxiv.其中(1)所述乙酰辅酶A途径包含：5H；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4A、4K、4L、4F和4G；或7E、7F、4K、4L、4F和4G。
11.一种非天然存在的真核生物，其包含：
(1)乙酰乙酰辅酶A途径，其中所述生物包含至少一种编码乙酰乙酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述乙酰乙酰辅酶A途径酶以足以增加所述生物的细胞溶质中的乙酰乙酰辅酶A的量表达，其中所述乙酰乙酰辅酶A途径包含：
i.8A、8C、8F和8I，其中8A是线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶；8C是线粒体乙酰乙酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；8F是乙酰乙酸转运蛋白；且8I是细胞溶质乙酰乙酰辅酶A转移酶或合成酶；或者
ii.8J、8K、8C、8F和8I；其中8J是线粒体乙酰辅酶A羧化酶；8K是线粒体乙酰乙酰辅酶A合酶；8C是线粒体乙酰乙酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；8F是乙酰乙酸转运蛋白；且8I是细胞溶质乙酰乙酰辅酶A转移酶或合成酶；和
(2)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以在所述生物的细胞溶质中生产1,3-BDO的量表达，且其中所述1,3-BDO途径包含选自以下的途径：
i.4E、4F和4G；
ii.4B和4D；
iii.4E、4C和4D；
iv.4H和4J；
v.4H、4I和4G；和
vi.4H、4M、4N和4G；
其中4B是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醇形成)；4C是3-氧代丁醛还原酶(醛还原)；4D是4-羟基,2-丁酮还原酶；4E是乙酰乙酰辅酶A还原酶(辅酶A依赖性的，醛形成)；4F是3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；4G是3-羟基丁醛还原酶；4H是乙酰乙酰辅酶A还原酶(酮还原)；4I是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)；4J是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)；4L是乙酰乙酸还原酶；4M是3-羟基丁酰辅酶A转移酶、水解酶或合成酶；且4N是3-羟基丁酸还原酶。
12.根据权利要求11所述的生物，其中
i.(1)所述乙酰乙酰辅酶A途径包含：8A、8C、8F和8I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4E、4F和4G；
ii.(1)所述乙酰乙酰辅酶A途径包含：8A、8C、8F和8I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4B和4D；
iii.(1)所述乙酰乙酰辅酶A途径包含：8A、8C、8F和8I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4E、4C和4D；
iv.(1)所述乙酰乙酰辅酶A途径包含：8A、8C、8F和8I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4H和4J；
v.(1)所述乙酰乙酰辅酶A途径包含：8A、8C、8F和8I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4H、4I和4G；
vi.(1)所述乙酰乙酰辅酶A途径包含：8A、8C、8F和8I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4H、4M、4N和4G；
vii.(1)所述乙酰乙酰辅酶A途径包含：8J、8K、8C、8F和8I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4E、4F和4G；
viii.(1)所述乙酰乙酰辅酶A途径包含：8J、8K、8C、8F和8I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4B和4D；
ix.(1)所述乙酰乙酰辅酶A途径包含：8J、8K、8C、8F和8I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4E、4C和4D；
x.(1)所述乙酰乙酰辅酶A途径包含：8J、8K、8C、8F和8I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4H和4J；
xi.(1)所述乙酰乙酰辅酶A途径包含：8J、8K、8C、8F和8I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4H、4I和4G；或者
xii.(1)所述乙酰乙酰辅酶A途径包含：8J、8K、8C、8F和8I；且(2)所述1,3-BDO途径包含：4H、4M、4N和4G。
13.根据权利要求1-12中的任一项所述的生物，其中，所述生物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种各自编码1,3-BDO途径酶的外源核酸。
14.根据权利要求1-13中的任一项所述的生物，其中，所述至少一种外源核酸是异源核酸。
15.根据权利要求1-14中的任一项所述的生物，其中，所述生物是在基本上厌氧的培养基中。
16.根据权利要求1-15中的任一项所述的生物，所述生物进一步包含一个或多个副产物途径的减弱或缺失。
17.根据权利要求16所述的生物，其中，所述一个或多个副产物途径是在图7中描绘的一个或多个副产物途径，3-氧代丁醛脱氢酶或乙酰乙酰辅酶A硫解酶。
18.根据权利要求16或19所述的生物，其中所述副产物途径包含：
i.3-磷酸甘油(G3P)脱氢酶，其将二羟基丙酮转化成G3P；
ii.将G3P转化成甘油的G3P磷酸酶；
iii.将丙酮酸转化成乙醛的丙酮酸脱羧酶；
iv.将乙醛转化成乙醇的乙醇脱氢酶；
v.乙醛脱氢酶(酰化)，其将乙酰辅酶A转化成乙醛；
vi.乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶，其将乙酰乙酰辅酶A转化成乙酰乙酸；
vii.3-羟基丁酰辅酶A水解酶或转移酶，其将3-羟基丁酰辅酶A(3-HB辅酶A)转化成3-羟基丁酸；
viii.3-羟基丁醛脱氢酶，其将3-羟基丁醛转化成3-羟基丁酸；
ix.1,3-丁二醇脱氢酶，其将1,3-丁二醇转化成3-氧代丁醇；
x.线粒体丙酮酸脱氢酶，其将丙酮酸转化成乙酰辅酶A；
xi.3-氧代丁醛脱氢酶，其将3-氧代丁醛转化成乙酰乙酸；和/或
xii.乙酰乙酰辅酶A硫解酶，其将乙酰乙酰辅酶A转化成乙酰辅酶A。
19.一种用于将乙酰辅酶A从线粒体运输至非天然存在的真核生物的细胞溶质的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据权利要求1-18中的任一项所述的生物足够的时间段，以将乙酰辅酶A从所述非天然存在的真核生物的线粒体运输至细胞溶质。
20.一种用于增加非天然存在的真核生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据权利要求1-18中的任一项所述的生物足够的时间段，以增加所述生物的细胞溶质中的乙酰辅酶A。
21.一种用于将乙酰辅酶A从过氧化物酶体运输至非天然存在的真核生物的细胞溶质的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据权利要求4或6-19中的任一项所述的生物足够的时间段，以将乙酰辅酶A从非天然存在的真核生物的过氧化物酶体运输至细胞溶质。
22.一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物进一步包含一种或多种内源和/或外源核酸，所述核酸编码：
i.1,3-BDO途径酶，所述1,3-BDO途径酶选自：4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I、4J、4L、4N、4O、7E和7F；其中至少一种核酸已经被改变，使得由所述核酸编码的1,3-BDO途径酶具有与由未改变的或野生型核酸编码的1,3-BDO途径酶相比更大的对NADH的亲和力；
ii.减弱的1,3-BDO途径酶，所述减弱的1,3-BDO途径酶选自：4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I、4J、4L、4N、4O、7E和7F；其中所述减弱的1,3-BDO途径酶是NAPDH依赖性的，且具有与由未改变的或野生型核酸编码的1,3-BDO途径酶相比降低的酶活性；
iii.1,3-BDO途径酶，所述1,3-BDO途径酶选自：4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I、4J、4L、4N、4O、7E和7F；其中所述真核生物包含一种或多种基因破坏，所述一种或多种基因破坏会减弱内源性NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的活性；或者
iv.1,3-BDO途径酶，所述1,3-BDO途径酶选自：4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I、4J、4L、4N、4O、7E和7F；其中至少一种核酸已经被改变，使得由所述核酸编码的1,3-BDO途径酶具有与由未改变的或野生型核酸编码的1,3-BDO途径酶相比更小的对NADPH的亲和力。
23.一种非天然存在的真核生物，其包含：
(1)(a)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和
(b)乙酰辅酶A途径，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的内源和/或外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以增加所述生物中的NADH的量表达；其中所述乙酰辅酶A途径包含：
i.NAD依赖性的丙酮酸脱氢酶；
ii.丙酮酸甲酸裂合酶和NAD依赖性的甲酸脱氢酶；
iii.丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和NADH:铁氧还蛋白氧化还原酶；
iv.丙酮酸脱羧酶和NAD依赖性的酰化乙酰基醛脱氢酶；
v.丙酮酸脱羧酶、NAD依赖性的酰化乙醛脱氢酶、乙酸激酶和磷酸转乙酰酶；或
vi.丙酮酸脱羧酶、NAD依赖性的酰化乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶；
(2)(a)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和
(b)编码可溶性的或膜结合的转氢酶的内源和/或外源核酸，其中所述转氢酶以足以将NADH转化成NADPH的量表达；
(3)(a)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和
(b)内源和/或外源核酸，所述核酸编码NADP依赖性的磷酸化或非磷酸化3-磷酸甘油醛脱氢酶；
(4)(a)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和
(b)一种或多种编码NAD(P)H辅因子酶的内源和/或外源核酸，所述NAD(P)H辅因子酶选自磷酸化或非磷酸化3-磷酸甘油醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和酰化乙酰基醛脱氢酶；其中所述一种或多种编码NAD(P)H辅因子酶的核酸已经被改变，使得由所述核酸编码的NAD(P)H辅因子酶具有与由未改变的或野生型核酸编码的NAD(P)H辅因子酶相比更大的对NADPH的亲和力；或者
(5)(a)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和
(b)一种或多种编码NAD(P)H辅因子酶的内源和/或外源核酸，所述NAD(P)H辅因子酶选自磷酸化或非磷酸化3-磷酸甘油醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和酰化乙酰基醛脱氢酶；其中所述一种或多种编码NAD(P)H辅因子酶的核酸已经被改变，使得它编码的NAD(P)H辅因子酶具有与由未改变的或野生型核酸编码的NAD(P)H辅因子酶相比更小的对NADH的亲和力。
24.一种非天然存在的真核生物，其包含：
(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和
(2)戊糖磷酸途径，其中所述生物包含至少一种编码戊糖磷酸途径酶的内源和/或外源核酸，所述戊糖磷酸途径酶选自：6-磷酸葡萄糖脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶和6-磷酸葡糖酸脱氢酶(脱羧)。
25.根据权利要求24所述的真核生物，所述真核生物进一步包含增加进入戊糖磷酸途径的代谢通量的遗传改变。
26.一种非天然存在的真核生物，其包含：
(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和
(2)恩特纳-杜德洛夫途径，其中所述生物包含至少一种编码恩特纳-杜德洛夫途径酶的内源和/或外源核酸，所述恩特纳-杜德洛夫途径酶选自：6-磷酸葡萄糖脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、磷酸葡糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶。
27.根据权利要求26所述的真核生物，所述真核生物进一步包含增加进入恩特纳-杜德洛夫途径的代谢通量的遗传改变。
28.一种非天然存在的真核生物，其包含：
(1)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述NADPH依赖性的1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；和
(2)乙酰辅酶A途径，其中所述生物包含至少一种编码乙酰辅酶A途径酶的内源和/或外源核酸，所述乙酰辅酶A途径酶以足以增加所述生物中的NADPH的量表达；其中所述乙酰辅酶A途径包含：
i.NADP依赖性的丙酮酸脱氢酶；
ii.丙酮酸甲酸裂合酶和NADP依赖性的甲酸脱氢酶；
iii.丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和NADPH:铁氧还蛋白氧化还原酶；
iv.丙酮酸脱羧酶和NADP依赖性的酰化乙酰基醛脱氢酶；
v.丙酮酸脱羧酶、NADP依赖性的酰化乙醛脱氢酶、乙酸激酶和磷酸转乙酰酶；或者
vi.丙酮酸脱羧酶、NADP依赖性的酰化乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶。
29.根据权利要求28所述的非天然存在的真核生物，所述真核生物进一步包含一种或多种基因破坏，所述一种或多种基因破坏会减弱内源性的NAD依赖性的丙酮酸脱氢酶、NAD依赖性的甲酸脱氢酶、NADH:铁氧还蛋白氧化还原酶、NAD依赖性的酰化乙酰基醛脱氢酶或NAD依赖性的酰化乙醛脱氢酶的活性。
30.一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，且：
(1)其中所述生物：
i.包含在编码NADH脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；
ii.表达减弱的NADH脱氢酶；
iii.与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有NADH脱氢酶酶活性；
iv.(i.)和(ii.)；
v.(i.)和(iii.)；
vi.(ii.)和(iii.)；或者
vii.(i.)、(ii.)和(iii.)；
(2)其中所述生物：
i.包含在编码细胞色素氧化酶的内源和/或外源核酸中的破坏；
ii.表达减弱的细胞色素氧化酶；
iii.与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有细胞色素氧化酶酶活性；
iv.(i.)和(ii.)；
v.(i.)和(iii.)；
vi.(ii.)和(iii.)；或者
vii.(i.)、(ii.)和(iii.)；
(3)其中所述生物：
i.包含在编码丙酮酸脱羧酶的内源和/或外源核酸中的破坏；
ii.表达减弱的丙酮酸脱羧酶；
iii.与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有丙酮酸脱羧酶酶活性；
iv.与所述真核生物的野生型形式相比，从丙酮酸生产更低水平的乙醇；
v.(i.)和(ii.)；
vi.(i.)和(iii.)；
vii.(i.)和(iv.)；
viii.(ii.)和(iii.)；
ix.(ii.)和(iv.)；
x.(iii.)和(iv.)；
xi.(i.)、(ii.)和(iii.)；
xii.(i.)、(iii.)和(iv.)；
xiii.(ii.)、(iii.)和(iv.)；或者
xiv.(i.)、(ii.)、(iii.)和(iv.)；
(4)其中所述生物：
i.包含在编码乙醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；
ii.表达减弱的乙醇脱氢酶；
iii.与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醇脱氢酶酶活性；
iv.与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的乙醇；
v.(i.)和(ii.)；
vi.(i.)和(iii.)；
vii.(i.)和(iv.)；
viii.(ii.)和(iii.)；
ix.(ii.)和(iv.)；
x.(iii.)和(iv.)；
xi.(i.)、(ii.)和(iii.)；
xii.(i.)、(iii.)和(iv.)；
xiii.(ii.)、(iii.)和(iv.)；或者
xiv.(i.)、(ii.)、(iii.)和(iv.)；
(5)其中所述生物：
i.包含在编码苹果酸脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；
ii.表达减弱的苹果酸脱氢酶；
iii.与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有苹果酸脱氢酶酶活性；
iv.具有减弱的或阻断的苹果酸-天冬氨酸穿梭、苹果酸-草酰乙酸穿梭和/或苹果酸-丙酮酸穿梭；
v.(i.)和(ii.)；
vi.(i.)和(iii.)；
vii.(i.)和(iv.)；
viii.(ii.)和(iii.)；
ix.(ii.)和(iv.)；
x.(iii.)和(iv.)；
xi.(i.)、(ii.)和(iii.)；
xii.(i.)、(iii.)和(iv.)；
xiii.(ii.)、(iii.)和(iv.)；或者
xiv.(i.)、(ii.)、(iii.)和(iv.)；
(6)其中所述生物：
i.包含在编码乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶的内源和/或外源核酸中的破坏；
ii.表达减弱的乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶；
iii.与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙酰乙酰辅酶A水解酶或转移酶酶活性；
iv.(i.)和(ii.)；
v.(i.)和(iii.)；
vi.(ii.)和(iii.)；或者
vii.(i.)、(ii.)和(iii.)；
(7)其中所述生物：
i.包含在编码3-羟基丁酰辅酶A水解酶或转移酶的内源和/或外源核酸中的破坏；
ii.表达减弱的3-羟基丁酰辅酶A水解酶或转移酶；
iii.与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-羟基丁酰辅酶A水解酶或转移酶酶活性。；
iv.(i.)和(ii.)；
v.(i.)和(iii.)；
vi.(ii.)和(iii.)；或者
vii.(i.)、(ii.)和(iii.)；
(8)其中所述生物：
i.包含在编码乙醛脱氢酶(酰化)的内源和/或外源核酸中的破坏；
ii.表达减弱的乙醛脱氢酶(酰化)；
iii.与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醛脱氢酶(酰化)酶活性；
iv.(i.)和(ii.)；
v.(i.)和(iii.)；
vi.(ii.)和(iii.)；或者
vii.(i.)、(ii.)和(iii.)；
(9)其中所述生物：
i.包含在编码3-羟基丁醛脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；
ii.表达减弱的3-羟基丁醛脱氢酶；
iii.与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-羟基丁醛脱氢酶酶活性；
iv.(i.)和(ii.)；
v.(i.)和(iii.)；
vi.(ii.)和(iii.)；或者
vii.(i.)、(ii.)和(iii.)；
(10)其中所述生物：
i.包含在编码3-氧代丁醛脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；
ii.表达减弱的3-氧代丁醛脱氢酶；
iii.与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-氧代丁醛脱氢酶酶活性；
iv.(i.)和(ii.)；
v.(i.)和(iii.)；
vi.(ii.)和(iii.)；或者
vii.(i.)、(ii.)和(iii.)；
(11)其中所述生物：
i.包含在编码1,3-丁二醇脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；
ii.表达减弱的1,3-丁二醇脱氢酶；
iii.与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有1,3-丁二醇脱氢酶酶活性。；
iv.(i.)和(ii.)；
v.(i.)和(iii.)；
vi.(ii.)和(iii.)；或者
vii.(i.)、(ii.)和(iii.)；或者
(12)其中所述生物：
i.包含在编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的内源和/或外源核酸中的破坏；
ii.表达减弱的乙酰乙酰辅酶A硫解酶；
iii.与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙酰乙酰辅酶A硫解酶酶活性；
iv.(i.)和(ii.)；
v.(i.)和(iii.)；
vi.(ii.)和(iii.)；或者
vii.(i.)、(ii.)和(iii)。
31.根据权利要求1-6中的任一项所述的生物，其中所述生物进一步包含1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达，和
(1)其中所述生物：
i.包含在编码G3P脱氢酶的内源和/或外源核酸中的破坏；
ii.表达减弱的G3P脱氢酶；
iii.与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P脱氢酶酶活性；
iv.与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的甘油；
v.(i.)和(ii.)；
vi.(i.)和(iii.)；
vii.(i.)和(iv.)；
viii.(ii.)和(iii.)；
ix.(ii.)和(iv.)；
x.(iii.)和(iv.)；
xi.(i.)、(ii.)和(iii.)；
xii.(i.)、(iii.)和(iv.)；
xiii.(ii.)、(iii.)和(iv.)；或者
xiv.(i.)、(ii.)、(iii.)和(iv.)；或者
(2)其中所述生物：
i.包含在编码G3P磷酸酶的内源和/或外源核酸中的破坏；
ii.表达减弱的G3P磷酸酶；
iii.与所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P磷酸酶酶活性；
iv.与所述真核生物的野生型形式相比，生产更低水平的甘油；
v.(i.)和(ii.)；
vi.(i.)和(iii.)；
vii.(i.)和(iv.)；
viii.(ii.)和(iii.)；
ix.(ii.)和(iv.)；
x.(iii.)和(iv.)；
xi.(i.)、(ii.)和(iii.)；
xii.(i.)、(iii.)和(iv.)；
xiii.(ii.)、(iii.)和(iv.)；或者
xiv.(i.)、(ii.)、(iii.)和(iv.)。
32.一种非天然存在的包含1,3-BDO途径的真核生物，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的内源和/或外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以生产1,3-BDO的量表达；且其中所述生物进一步包含编码1,3-BDO转运蛋白的内源和/或外源核酸，其中所述编码1,3-BDO转运蛋白的核酸以足以从所述真核生物输出1,3-BDO的量表达。
33.根据权利要求24-32中的任一项所述的生物，其中所述1,3-BDO途径酶选自：4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I、4J、4L、4N和4O。
34.根据权利要求23-33中的任一项所述的生物，其中所述1,3-BDO途径包含选自以下的途径：
i.4A、4E、4F和4G；
ii.4A、4B和4D；
iii.4A、4E、4C和4D；
iv.4A、4H和4J；
v.4A、4H、4I和4G；
vi.4A、4H、4M、4N和4G；
vii.4A、4K、4O、4N和4G；
viii.4A、4K、4L、4F和4G
ix.7E、7F、4E、4F和4G；
x.7E、7F、4B和4D；
xi.7E、7F、4E、4C和4D；
xii.7E、7F、4H和4J；
xiii.7E、7F、4H、4I和4G；
xiv.7E、7F、4H、4M、4N和4G；
xv.7E、7F、4K、4O、4N和4G；和
xvi.7E、7F、4K、4L、4F和4G。
35.根据权利要求34所述的生物，其中所述生物包含选自以下的乙酰辅酶A途径：
i.2A、2B和2D；
ii.2A、2C和2D；
iii.2A、2B、2E和2F；
iv.2A、2C、2E和2F；
v.2A、2B、2E、2K和2L；
vi.2A、2C、2E、2K和2L；
vii.5A和5B；
viii.5A、5C和5D；
ix.5E、5F、5C和5D；
x.5G和5D；
xi.6A、6D和6C；
xii.6B、6E和6C；
xiii.10A、10B和10C；
xiv.10N、10H、10B和10C；
xv.10N、10L、10M、10B和10C；
xvi.10A、10B、10G和10D；
xvii.10N、10H、10B、10G和10D；
xviii.10N、10L、10M、10B、10G和10D；
xix.10A、10B、10J、10K和10D；
xx.10N、10H、10B、10J、10K和10D；
xxi.10N、10L、10M、10B、10J、10K和10D；
xxii.10A、10F和10D；
xxiii.10N、10H、10F和10D；和
xxiv.10N、10L、10M、10F和10D。
36.根据权利要求22-35中的任一项所述的生物，其中所述内源和/或外源核酸是内源核酸。
37.根据权利要求22-35中的任一项所述的生物，其中所述内源和/或外源核酸是外源核酸。
38.一种非天然存在的真核生物，其包含：
(1)乙酰乙酸途径，其中所述生物包含至少一种编码乙酰乙酸途径酶的外源核酸，所述乙酰乙酸途径酶以足以增加所述生物的细胞溶质中的乙酰乙酸的量表达，其中所述乙酰乙酸途径包含：8A、8C和8F，其中8A是线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶；8C是线粒体乙酰乙酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；且8F是乙酰乙酸转运蛋白；和
(2)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以在所述生物的细胞溶质中生产1,3-BDO的量表达，且其中所述1,3-BDO途径包含选自以下的途径：
i.4O、4N和4G；和
ii.4L、4F和4G；
其中4F是3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；4G是3-羟基丁醛还原酶；4L是乙酰乙酸还原酶；4N是3-羟基丁酸还原酶；且4O是3-羟基丁酸脱氢酶。
39.一种非天然存在的真核生物，其包含：
(1)3-羟基丁酸途径，其中所述生物包含至少一种编码3-羟基丁酸途径酶的外源核酸，所述3-羟基丁酸途径酶以足以增加所述生物的细胞溶质中的3-羟基丁酸的量表达，其中所述3-羟基丁酸途径包含选自以下的途径：
i.8A、8B、8D和8G；
ii.8A、8C、8E和8G；
iii.8J、8K、8D和8G；和
iv.8J、8K、8E和8G；
其中8A是线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶；8B是线粒体乙酰乙酰辅酶A还原酶；8C是线粒体乙酰乙酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；8D是线粒体3-羟基丁酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；8E是线粒体3-羟基丁酸脱氢酶；且8G是3-羟基丁酸转运蛋白；8J是线粒体乙酰辅酶A羧化酶；8K是线粒体乙酰乙酰辅酶A合酶；和
(2)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以在所述生物的细胞溶质中生产1,3-BDO的量表达，且其中所述1,3-BDO途径包含4N和4G，其中4G是3-羟基丁醛还原酶；且4N是3-羟基丁酸还原酶。
40.一种非天然存在的真核生物，其包含：
(1)3-羟基丁酰辅酶A途径，其中所述生物包含至少一种编码3-羟基丁酰辅酶A途径酶的外源核酸，所述3-羟基丁酰辅酶A途径酶以足以增加所述生物的细胞溶质中的3-羟基丁酰辅酶A的量表达，其中所述3-羟基丁酰辅酶A途径包含选自以下的途径：
i.8A、8B、8D、8G和8H；
ii.8A、8C、8E、8G和8H；
iii.8J、8K、8B、8D、8G、8H；和
iv.8J、8K、8C、8E、8G、8H；
其中8A是线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶；8B是线粒体乙酰乙酰辅酶A还原酶；8C是线粒体乙酰乙酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；8D是线粒体3-羟基丁酰辅酶A水解酶、转移酶或合成酶；8E是线粒体3-羟基丁酸脱氢酶；8G是3-羟基丁酸转运蛋白；且8H是3-羟基丁酰辅酶A转移酶或合成酶；8J是线粒体乙酰辅酶A羧化酶；8K是线粒体乙酰乙酰辅酶A合酶；和
(2)1,3-BDO途径，其中所述生物包含至少一种编码1,3-BDO途径酶的外源核酸，所述1,3-BDO途径酶以足以在所述生物的细胞溶质中生产1,3-BDO的量表达，且其中所述1,3-BDO途径包含选自以下的途径：
i.4I和4G；和
ii.4J；
其中4I是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醛形成)；其中4G是3-羟基丁醛还原酶；且4J是3-羟基丁酰辅酶A还原酶(醇形成)。
41.根据权利要求40所述的生物，其中
i.(1)所述3-羟基丁酰辅酶A途径包含：8A、8B、8D、8G和8H，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4I和4G；
ii.(1)所述3-羟基丁酰辅酶A途径包含：8A、8C、8E、8G和8H，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4I和4G；
iii.(1)所述3-羟基丁酰辅酶A途径包含：8J、8K、8B、8D、8G和8H，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4I和4G；
iv.(1)3-羟基丁酰辅酶A途径包含：8J、8K、8C、8E、8G和8H，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4I和4G；
v.(1)所述3-羟基丁酰辅酶A途径包含：8A、8B、8D、8G和8H，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4J；
vi.(1)所述3-羟基丁酰辅酶A途径包含：8A、8C、8E、8G和8H，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4J；
vii.(1)所述3-羟基丁酰辅酶A途径包含：8J、8K、8B、8D、8G和8H，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4J；或者
viii.(1)3-羟基丁酰辅酶A途径包含：8J、8K、8C、8E、8G和8H，且(2)所述1,3-BDO途径包含：4J。
42.根据权利要求22-41中的任一项所述的生物；其中所述生物是在基本上厌氧的培养基中。
43.一种用于生产1,3-BDO的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据权利要求7-17或21-42中的任一项所述的生物足够的时间段以生产1,3-BDO。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述生物是Crabtree阳性的生物，且其中真核生物是在包含过量的葡萄糖的培养基中。
45.一种用于选择要引入非天然存在的真核生物中的外源性1,3-BDO途径酶的方法，其中所述外源性1,3-BDO途径酶在所述生物中以足以生产1,3-BDO的量表达，所述方法包括下述步骤：
(i)测量至少一种1,3-BDO途径酶的活性，所述至少一种1,3-BDO途径酶使用NADH作为辅因子；
(ii)测量至少一种1,3-BDO途径酶的活性，所述至少一种1,3-BDO途径酶使用NADPH作为辅因子；和
(iii)向所述生物中引入至少一种1,3-BDO途径酶，所述至少一种1,3-BDO途径酶对NADH作为辅因子的偏好大于NADPH，如在步骤(i)和(ii)中所确定的。
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