CN104988168A - 乙酰辅酶a增强模块在增强7-脱氢胆甾醇在微生物中合成的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，公开了乙酰辅酶A增强模块在增强7-脱氢胆甾醇在微生物中合成的应用。本发明提供的应用中所用的乙酰辅酶A增强模块包括表达乙醇脱氢酶的基因、表达乙醛脱氢酶的基因、表达乙酰辅酶A合酶的基因和表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因。在微生物中导入了乙酰辅酶A增强模块之后，显著提高了其中7-脱氢胆甾醇的合成量，为7-脱氢胆甾醇的合成提供了新的方法，更有利于7-脱氢胆甾醇的大量生产。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及乙酰辅酶A增强模块在增强7-脱氢胆甾醇在微生物中合成的应用。
背景技术
维生素D是一种脂溶性维生素，也被看作是一种作用于钙、磷代谢的激素前体，是人体必需的维生素之一。据报道，目前已知的维生素D至少有十种，但最重要的是维生素D2和维生素D3。其中，维生素D3是维生素D中生物代谢率最高的一种活性形式。维生素D3主要是由人体自身合成的：人体皮肤中的7-脱氢胆甾醇吸收太阳光中的UVB可以转化为前维生素D3，进而通过分子内重排生成热力学更稳定的结构——维生素D3。所以，7-脱氢胆甾醇是合成维生素D3的重要前体，合成7-脱氢胆甾醇是生产维生素D3的关键步骤。
目前，7-脱氢胆甾醇可以通过化学方法或生物转化的方法合成。但是，化学合成方法步骤较多、污染严重、副产物所占比例大；生物转化则多通过动物组织催化底物，所得产物与转化体系难于分离，这些都成为了限制工业化生产的关键因素。合成生物学是生产大规模且性能稳定的天然化合物的新学科，这种方式主要是通过基因工程手段将天然化合物合成途径相关酶基因导入到酵母、大肠杆菌或者植物等一些常用的模式底盘细胞中，在底盘细胞中重新构建可以生产天然化合物的途径，进而表达天然化合物。现已有利用酿酒酵母这一生产平台从廉价的碳源出发合成7-脱氢胆甾醇的报道。
通过采用合成生物学技术，荷兰的Hohmann Hans-Peter等人通过过表达截断的HMG1基因、敲除ERG5和ERG6基因、引入脊椎动物来源的固醇C-24还原酶基因，实现了在酵母中生产7-脱氢胆甾醇。德国的Christine Lang等人在敲除ERG5和ERG6基因的酿酒酵母菌株中过表达ERG1基因、ERG11基因、tHMGR基因和Δ-24还原酶(D24R)基因，构建了一株生产7-脱氢胆甾醇的酵母菌株。但是，现有的重组酿酒酵母菌株7-脱氢胆甾醇的产量较低，还需要继续研发。
发明内容
有鉴于此，本发明的发明目的在于提供一种乙酰辅酶A增强模块在增强7-脱氢胆甾醇在微生物中合成的应用。本发明发现当在酵母菌中导入乙酰辅酶A增强模块之后，次级代谢产物7-脱氢胆甾醇的产量得到显著提高，说明在微生物中导入乙酰辅酶A增强模块能够增强7-脱氢胆甾醇在微生物中的合成量，更有利于7-脱氢胆甾醇的大量生产。
为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种乙酰辅酶A增强模块在增强7-脱氢胆甾醇在微生物中合成的应用；
其中，乙酰辅酶A增强模块包括表达乙醇脱氢酶的基因、表达乙醛脱氢酶的基因、表达乙酰辅酶A合酶的基因和表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因。
在本发明中，表达乙醇脱氢酶的基因是指该基因的表达产物具有乙醇脱氢酶的活性，能够催化乙醇转化为乙醛。
在本发明中，表达乙醛脱氢酶的基因是指该基因的表达产物具有乙醛脱氢酶的活性，能够催化乙醛转化为乙酸。
在本发明中，表达乙酰辅酶A合酶的基因是指该基因的表达产物具有乙酰辅酶A合酶的活性，能够乙酸转化为乙酰辅酶A。
在本发明中，表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因是指该基因的表达产物具有ATP-柠檬酸裂解酶的活性，能够柠檬酸分解为乙酰辅酶A。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的应用中所用的表达乙酰辅酶A合酶的基因具有如I、II或III所示的核苷酸序列：
I具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
II具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列30％同源性的序列；
III具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的应用中所用的表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因具有如(I)、(II)或(III)所示的核苷酸序列：
(I)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(II)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列30％同源性的序列；
(III)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的应用中所用到的表达乙酰辅酶A合酶的基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，标记为acs。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的应用中所用到的表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，标记为acl。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的应用中所用的表达乙醇脱氢酶的基因具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，标记为adh2。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的应用中所用的表达乙醛脱氢酶的基因具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，标记为ald6。
本发明还提供了一种乙酰辅酶A增强模块，其包括表达乙醇脱氢酶的基因、表达乙醛脱氢酶的基因、表达乙酰辅酶A合酶的基因和表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因；
其中，表达乙酰辅酶A合酶的基因具有如I、II或III所示的核苷酸序列：
I具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
II具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列30％同源性的序列；
III具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列；
表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因具有如(I)、(II)或(III)所示的核苷酸序列：
(I)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(II)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列30％同源性的序列；
(III)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的乙酰辅酶A增强模块中的表达乙酰辅酶A合酶的基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，标记为acs。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的乙酰辅酶A增强模块中的表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，标记为acl。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的乙酰辅酶A增强模块中的表达乙醇脱氢酶的基因具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，标记为adh2。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的乙酰辅酶A增强模块中的表达乙醛脱氢酶的基因具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，标记为ald6。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的乙酰辅酶A增强模块中表达乙醇脱氢酶的基因、表达乙醛脱氢酶的基因、表达乙酰辅酶A合酶的基因和表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因中至少一个以基因表达盒的形式存在于该乙酰辅酶A增强模块中。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的乙酰辅酶A增强模块中表达乙醇脱氢酶的基因以基因表达盒的形式存在于该乙酰辅酶A增强模块，该表达乙醇脱氢酶的基因表达盒包括启动子、表达乙醇脱氢酶的基因和终止子。在本发明的另外一些实施例中，表达乙醇脱氢酶的基因表达盒中的启动子为PGI1。在本发明的另外一些实施例中，表达乙醇脱氢酶的基因表达盒中的终止子为GPM1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的乙酰辅酶A增强模块中表达乙醛脱氢酶的基因以基因表达盒的形式存在于该乙酰辅酶A增强模块，该表达乙醛脱氢酶的基因表达盒包括启动子、表达乙醛脱氢酶的基因和终止子。在本发明的另外一些实施例中，表达乙醛脱氢酶的基因表达盒中的启动子为PGK1。在本发明的另外一些实施例中，表达乙醛脱氢酶的基因表达盒中的终止子为GPD。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的乙酰辅酶A增强模块中表达乙酰辅酶A合酶的基因以基因表达盒的形式存在于该乙酰辅酶A增强模块，该表达乙酰辅酶A合酶的基因表达盒包括启动子、表达乙酰辅酶A合酶的基因和终止子。在本发明的另外一些实施例中，表达乙酰辅酶A合酶的基因表达盒中的启动子为PDC1。在本发明的另外一些实施例中，表达乙酰辅酶A合酶的基因表达盒中的终止子为FBA1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的乙酰辅酶A增强模块中表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因以基因表达盒的形式存在于该乙酰辅酶A增强模块，该表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因表达盒包括启动子、表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因和终止子。在本发明的另外一些实施例中，表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因表达盒中的启动子为TPI1。在本发明的另外一些实施例中，表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因表达盒中的终止子为PGK1。
在本发明中，表达乙醇脱氢酶的基因、表达乙醛脱氢酶的基因、表达乙酰辅酶A合酶的基因和表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因在乙酰辅酶A增强模块中的存在方式、排列顺序不受本发明的限制，本领域技术人员可以根据实际情况选择合适的存在方式和排列顺序。
本发明还提供了一种利用乙酰辅酶A增强模块增强7-脱氢胆甾醇在微生物中合成的方法，其包括：
获得乙酰辅酶A增强模块，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因和表达固醇C-24还原酶的基因；
将所得乙酰辅酶A增强模块、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因和表达固醇C-24还原酶的基因导入微生物中，获得含乙酰辅酶A增强模块、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因和表达固醇C-24还原酶的基因的重组微生物；
其中，乙酰辅酶A增强模块包括表达乙醇脱氢酶的基因、表达乙醛脱氢酶的基因、表达乙酰辅酶A合酶的基因和表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因。
在本发明中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因指该基因的表达产物具有3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性，能够催化其催化甲羟戊酸(Mevalonate,MVA)途径中的中间产物HMG-CoA(hydroxyl-methyl-glutaryl-CoA)生成甲羟戊酸(mevalonate)。
在本发明中，表达固醇C-24还原酶的基因指该基因的表达产物具有固醇C-24还原酶的活性，能够催化固醇C-24位双键的还原。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，所用的表达乙酰辅酶A合酶的基因具有如I、II或III所示的核苷酸序列：
I具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
II具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列30％同源性的序列；
III具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列；
表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因具有如(I)、(II)或(III)所示的核苷酸序列：
(I)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(II)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列30％同源性的序列；
(III)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，表达乙醇脱氢酶的基因具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，标记为adh2。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，表达乙醛脱氢酶的基因具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，标记为ald6。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，标记为thmg1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，表达固醇C-24还原酶的基因具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，标记为dhcr24。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，所使用的微生物为真核菌株。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，所使用的真核菌株为酿酒酵母。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，所使用的酿酒酵母具体为BY4742单基因缺失株ΔERG5。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，表达乙醇脱氢酶的基因、表达乙醛脱氢酶的基因、表达乙酰辅酶A合酶的基因、表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因和表达固醇C-24还原酶的基因中至少一个以基因表达盒的形式导入微生物中。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，表达乙醇脱氢酶的基因以基因表达盒的形式导入微生物中，该表达乙醇脱氢酶的基因表达盒包括启动子、表达乙醇脱氢酶的基因和终止子。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，表达乙醇脱氢酶的基因表达盒中的启动子为PGI1。在本发明的另外一些实施例中，表达乙醇脱氢酶的基因表达盒中的终止子为GPM1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，表达乙醛脱氢酶的基因以基因表达盒的形式导入微生物中，该表达乙醛脱氢酶的基因表达盒包括启动子、表达乙醛脱氢酶的基因和终止子。在本发明的另外一些实施例中，表达乙醛脱氢酶的基因表达盒中的启动子为PGK1。在本发明的另外一些实施例中，表达乙醛脱氢酶的基因表达盒中的终止子为GPD。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，表达乙酰辅酶A合酶的基因以基因表达盒的形式导入微生物中，该表达乙酰辅酶A合酶的基因表达盒包括启动子、表达乙酰辅酶A合酶的基因和终止子。在本发明的另外一些实施例中，表达乙酰辅酶A合酶的基因表达盒中的启动子为PDC1。在本发明的另外一些实施例中，表达乙酰辅酶A合酶的基因表达盒中的终止子为FBA1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因以基因表达盒的形式导入微生物中，该表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因表达盒包括启动子、表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因和终止子。在本发明的另外一些实施例中，表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因表达盒中的启动子为TPI1。在本发明的另外一些实施例中，表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因表达盒中的终止子为PGK1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因以基因表达盒的形式导入微生物中，该表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒包括启动子、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因和终止子。在本发明的另外一些实施例中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒中的启动子为FBA1。在本发明的另外一些实施例中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒中的终止子为HXT7。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，表达固醇C-24还原酶的基因以基因表达盒的形式导入微生物中，该表达固醇C-24还原酶的基因表达盒包括启动子、表达固醇C-24还原酶的基因和终止子。在本发明的另外一些实施例中，表达固醇C-24还原酶的基因表达盒中的启动子为ENO2。在本发明的另外一些实施例中，表达固醇C-24还原酶的基因表达盒中的终止子为ADH1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，乙酰辅酶A增强模块的导入方式为整合在游离型的载体上导入微生物中，稳定地存在于微生物基因组之外。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，导入乙酰辅酶A增强模块所用的游离型的载体为pRS413。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因的导入方式为整合在游离型的载体上导入微生物中，稳定地存在于微生物基因组之外。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，导入表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因所用的游离型的载体为pRS425。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，表达固醇C-24还原酶的基因的导入方式为整合在游离型的载体上导入微生物中，稳定地存在于微生物基因组之外。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，导入表达固醇C-24还原酶的基因所用的游离型的载体为pRS425。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，表达乙酰辅酶A增强模块、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因和表达固醇C-24还原酶的基因的导入方式可以为整合在游离型的载体上导入微生物中，稳定地存在于微生物基因组之外；也可以以整合在微生物基因组上的形式导入微生物中，其导入方式、导入所采用的技术手段不受本发明的限制。
本发明还提供了一种高产7-脱氢酶胆甾醇的重组微生物，其中导入了乙酰辅酶A增强模块、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因和表达固醇C-24还原酶的基因；
乙酰辅酶A增强模块包括表达乙醇脱氢酶的基因、表达乙醛脱氢酶的基因、表达乙酰辅酶A合酶的基因和表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因。
优选地，本发明提供的重组微生物中，所用的微生物为真核菌株。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，所用的真核菌株为酿酒酵母。在本发明的另外一些实施例中，所用的酿酒酵母具体为BY4742单基因缺失株ΔERG5。
优选地，本发明提供的重组微生物中，所用表达乙醇脱氢酶的基因、表达乙醛脱氢酶的基因、表达乙酰辅酶A合酶的基因、表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因和表达固醇C-24还原酶的基因中至少一个以基因表达盒的形式导入微生物中。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，所用表达乙醇脱氢酶的基因以基因表达盒的形式导入微生物中。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达乙醇脱氢酶的基因表达盒包括启动子、表达乙醇脱氢酶的基因和终止子。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达乙醇脱氢酶的基因表达盒的启动子为PGI1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达乙醇脱氢酶的基因表达盒中表达乙醇脱氢酶的基因具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，标记为adh2。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达乙醇脱氢酶的基因表达盒的终止子为GPM1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，所用表达乙醛脱氢酶的基因以基因表达盒的形式导入微生物中。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达乙醛脱氢酶的基因表达盒的启动子为PGK1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达乙醛脱氢酶的基因表达盒中的表达乙醛脱氢酶的基因具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，标记为ald6。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达乙醛脱氢酶的基因表达盒的终止子为GPD。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，所用表达乙酰辅酶A合酶的基因以基因表达盒的形式导入微生物中。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达乙酰辅酶A合酶的基因表达盒的启动子为PDC1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达乙酰辅酶A合酶的基因表达盒的表达乙酰辅酶A合酶的基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，标记为acs。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达乙酰辅酶A合酶的基因表达盒的终止子为FBA1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，所用表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因以基因表达盒的形式导入微生物中。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因表达盒的启动子为TPI1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因表达盒中的表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因具有如SEQID NO:2所示的核苷酸序列，标记为acl。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因表达盒的终止子为PGK1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因以基因表达盒的形式导入微生物中。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒的启动子为FBA1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒中表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，标记为thmg1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒的终止子为HXT7。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达固醇C-24还原酶的基因以基因表达盒的形式导入微生物中。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达固醇C-24还原酶的基因表达盒的启动子为ENO2。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达固醇C-24还原酶的基因表达盒中的表达固醇C-24还原酶的基因具有如SEQ IDNO:6所示的核苷酸序列，标记为dhcr24。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达固醇C-24还原酶的基因表达盒的终止子为ADH1。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，所用表达乙醇脱氢酶的基因、所述表达乙醛脱氢酶的基因、所述表达乙酰辅酶A合酶的基因、所述表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因和表达固醇C-24还原酶的基因均以基因表达盒的形式导入所述微生物中。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，乙酰辅酶A增强模块的导入方式为整合在游离型的载体上导入微生物中，稳定地存在于微生物基因组之外。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，导入乙酰辅酶A增强模块所用的游离型的载体为pRS413。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因的导入方式为整合在游离型的载体上导入微生物中，稳定地存在于微生物基因组之外。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，导入表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因所用的游离型的载体为pRS425。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达固醇C-24还原酶的基因的导入方式为整合在游离型的载体上导入微生物中，稳定地存在于微生物基因组之外。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，导入表达固醇C-24还原酶的基因所用的游离型的载体为pRS425。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达乙酰辅酶A增强模块、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因和表达固醇C-24还原酶的基因的导入方式可以为整合在游离型的载体上导入微生物中，稳定地存在于微生物基因组之外；也可以以整合在微生物基因组上的形式导入微生物中，其导入方式、导入所采用的技术手段不受本发明的限制。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组微生物的保藏编号为CGMCC No.10501。
本发明提供了乙酰辅酶A增强模块在增强7-脱氢胆甾醇在微生物中合成的应用。本发明提供的应用中所用的乙酰辅酶A增强模块包括表达乙醇脱氢酶的基因、表达乙醛脱氢酶的基因、表达乙酰辅酶A合酶的基因和表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因。乙酰辅酶A是碳代谢和能量代谢的重要中间产物。在微生物中，乙酰辅酶A是甲羟戊酸途径的前体，为次级代谢产物的合成提供了基本骨架，提高细胞质内乙酰辅酶A的供给有利于次级代谢物的生物合成。本发明将乙酰辅酶A增强模块导入酿酒酵母之后，显著提高了其中7-脱氢胆甾醇的合成量，所以乙酰辅酶A增强模块能够增强次级代谢产物7-脱氢胆甾醇在微生物中的合成，更有利于7-脱氢胆甾醇的大量生产。
附图说明
图1示实施例1中各个质粒的构建图谱；
其中，图1-A示pSW01质粒的构建图谱；图1-B示pSW02质粒的构建图谱；
图2示实施例1中构建的三个重组质粒pSW01和pSW02的酶切验证结果；
其中，图2-A示pSW01的验证结果，左边图示为插入的片段的大小，右边图示酶切结果；图2-B的验证结果，左边图示为插入的片段的大小，右边图示酶切结果；
图3示实施例2中由测定7-脱氢胆甾醇标准品所得的标准曲线；
图4示实施例2中各个菌株的生长曲线；
其中，◆为曲线1，代表ΔERG5的生长曲线；为曲线2，代表SyBE_Sc01100002的生长曲线；为曲线3，代表SyBE_Sc01100011的生长曲线；
图5示实施例2中各个菌株的发酵产物的GC-MS检测结果：
其中，5-A为SyBE_Sc01100002的产物分析GC谱图，其中保留时间为20.83min的峰为7-脱氢胆甾醇；
5-B为SyBE_Sc01100002的7-脱氢胆甾醇的质谱谱图；
5-C为SyBE_Sc01100011的产物分析GC谱图，其中保留时间为20.81min的峰为7-脱氢胆甾醇；
5-D为SyBE_Sc01100011的7-脱氢胆甾醇的质谱谱图。
生物保藏说明
重组酿酒酵母菌株SyBE_Sc01100011：分类命名：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2015年02月02日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：CGMCCNo.10501。
具体实施方式
本发明公开了乙酰辅酶A增强模块在增强7-脱氢胆甾醇在微生物中合成的应用。本领域技术人员可以参考本文内容，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的乙酰辅酶A增强模块在增强7-脱氢胆甾醇在微生物中合成的应用中的试剂和原料均可由市场购得。
为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1生产7-脱氢胆甾醇的重组酿酒酵母菌株的构建与7-脱氢胆甾醇产量的对比
材料来源：
pRS425质粒：购买于Addgene(American)；
pRS413质粒：购买于Addgene(American)；
酿酒酵母BY4742单基因缺失株ΔERG5(MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0erg5Δ::KanMX)：购买于Thermo Fisher Scientific。
启动子、终止子和内源、外源基因的获得
所有启动子(FBA1p,ENO2p,PGI1p,PGK1p,PDC1p)、终止子(HXT7t,ADH1t,GPM1t,GPDt,FBA1t,PGK1t)和内源基因(乙醇脱氢酶基因adh2,乙醛脱氢酶基因ald6,截短HMG-CoA还原酶基因thmg1)：设计合适的带有启动子、终止子或基因同源序列的引物，以酿酒酵母BY4742基因组为模板，通过PCR反应扩增得到。
外源基因为人工合成：Salmonella enterica源的乙酰辅酶A合酶突变体基因acsL641P和鼠源的ATP-柠檬酸裂解酶基因acl经过密码子优化并适当规避常用的限制性酶切位点后通过人工合成得到，在本实施例中将acsL641P基因标记为acs。外源基因人源C-24还原酶基因dhcr24也通过人工合成得到。各个基因所对应的核苷酸序列信息见表1。
表1各个基因所对应的核苷酸序列信息
| 基因名称 | 核苷酸序列信息 |
| 乙酰辅酶A合酶基因acsL641P | 具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列 |
| ATP-柠檬酸裂解酶基因acl | 具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列 |
| 乙醇脱氢酶基因adh2 | 具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列 |
| 乙醛脱氢酶基因ald6 | 具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列 |
| 截短HMG-CoA还原酶基因thmg1 | 具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列 |
| 人源C-24还原酶基因dhcr24 | 具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列 |
单基因表达盒的构建与多基因模块的组装
将启动子FBA1p，基因thmg1和终止子HXT7t通过OE-PCR方法拼接起来，得基因片段FBA1p-thmg1-HXT7t；将启动子ENO2p，基因dhcr24和终止子ADH1t通过OE-PCR方法拼接起来，得基因片段ENO2p-dhcr24-ADH1t。用限制性内切酶EcoRI和BamHI将酿酒酵母多拷贝质粒pRS425线性化。通过PCR为基因片段FBA1p-thmg1-HXT7t添加同源区，上游有40bp与pRS425同源，下游有40bp与ENO2p同源。通过PCR为基因片段ENO2p-dhcr24-ADH1t添加同源区，上游有40bp与HXT7t同源，下游有40bp与pRS425同源。用醋酸锂法将添加同源区后的两个基因片段与线性化的质粒pRS425进行酵母转化，利用酵母自身的同源重组原理将上述片段通过片段间的同源序列连接起来，转化后酵母采用SD-drop固体培养基(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，混合氨基酸粉末2g/L，固体补加2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯后转移至液体培养基中培养24h，提取酵母质粒作为模板，进行PCR和酶切验证。初步筛选正确的重组酵母质粒回转大肠杆菌，提质粒，进行测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
按照相同的方法分别构建了两个质粒，各个质粒的构建图谱如图1所示。将所得重组质粒分别标记为pSW01和pSW02；各个重组质粒酶切验证结果见图2。各个重组质粒所带有的核苷酸序列信息如下所示：
pSW01:FBA1p-thmg1-HXT7t-ENO2p-dhcr24-ADH1t-pRS425
pSW02:PGI1p-adh2-GPM1t-PGK1p-ald6-GPDt-PDC1p-acs-FBA1t-TPI1p-acl-PGK1t-pRS413
各个重组质粒中所整合的基因模块的核苷酸序列信息见表2。
表2各个基因模块所对应的核苷酸序列信息
含有不同质粒的重组酵母菌株的获得
用醋酸锂法将不同的质粒分别导入酿酒酵母BY4742单基因缺失株ΔERG5(MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0erg5Δ::KanMX)中，得到如下菌株：
将质粒pSW01导入酿酒酵母BY4742单基因缺失株ΔERG5中得重组子，命名为SyBE_Sc01100002。将质粒pSW01和质粒pSW02导入酿酒酵母BY4742单基因缺失株ΔERG5中得重组子，命名为SyBE_Sc01100011。采用提取酵母质粒，对质粒上所含全部基因进行PCR的方法验证重组菌株的正确性，检测结果正确。
本实施例成功获得了如下菌株：
SyBE_Sc01100002：含有pSW01质粒的ΔERG5；
SyBE_Sc01100011：含有pSW01和pSW02质粒的ΔERG5。
实施例2各个重组菌株产7-脱氢胆甾醇性能的研究
在摇瓶上比较实施例1制备获得的重组菌株SyBE_Sc01100002、SyBE_Sc01100011的发酵性能。
1、试验材料：
实施例1制备获得的菌株SyBE_Sc01100002，SyBE_Sc01100011。
2、试验方法：
种子培养基：培养SyBE_Sc01100011的种子培养基配方为合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，混合氨基酸粉末2g/L(具体配方参考[美]D.C.安伯格等酵母遗传学方法试验指南)，色氨酸20mg/L，尿嘧啶20mg/L。培养SyBE_Sc01100002的种子培养基配方在培养SyBE_Sc01100011的种子培养基配方的基础上再添加20mg/L组氨酸。115℃灭菌15min。
发酵培养基A：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，121℃灭菌20min。
将上述重组菌株分别接种于4mL对应的种子培养基中，在30℃、220rpm培养24h，以初始菌体浓度OD600＝0.2转接于新鲜的50mL种子培养基中，于30℃、220rpm条件下培养12h，以初始菌体浓度OD600＝0.2分别接种于50mL发酵培养基A中，于30℃、220rpm条件下培养36h，测定菌体生长曲线。用50mL离心管收集发酵液，5000rpm离心2min获得细胞，用蒸馏水清洗细胞后用液氮冷冻并研磨细胞。向研磨后的细胞中加入4mL 1.5M的KOH-甲醇溶液，80℃皂化90min。加入2mL正己烷，涡旋混合10min，5000rpm离心2min，将上清转移至10mL离心管中，冷冻干燥30min。加入400μL正己烷，过夜冻干。加入200μLN-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)，30℃衍生化1h。
3、分析方法：
以722型分光光度计在600nm处测定的菌体吸光值(OD600)表征菌体浓度。对发酵液中的葡萄糖、甘油和乙醇用HPLC进行分析：柱子为Aminex HPX-87H离子交换柱，检测器为Waters 2414示差检测器，柱温65℃，流动相为5mM硫酸，流速为0.5mL/min。
对提取的产物进行气相色谱-飞行时间质谱(GC-TOF/MS)分析检测。
分析条件如下：仪器为Waters公司的GC-TOF/MS(Waters Corp.，USA)；硅胶毛细管柱为30m长×0.25mm内径×0.25μm膜厚DB-5MS，J&W Scientific，Folsom。电离方式为电子轰击电离EI+，电子束能量70eV，离子化电流40μA。质谱扫描范围在50～800m/z，离子源温度为250℃，进样口温度为260℃，氦气(99.9995％)用作载气，91KPa恒压模式下操作。柱温在70℃保持2min，以30℃/min的速度升至250℃，然后以10℃/min的速度升到280℃，在280℃维持15min；再以5℃/min的速度升到290℃，在290℃维持5min。
通过与7-脱氢胆甾醇标准品测定的标准曲线拟合出的公式计算产量，标准曲线见图3，拟合方程为y＝16.165x-105.34，R2＝0.9989。
4、试验结果：
各个菌株的生长曲线见图4，其中，曲线1为ΔERG5的生长曲线；曲线2为SyBE_Sc01100002的生长曲线；曲线3为SyBE_Sc01100011的生长曲线。从生长曲线可知，菌株ΔERG5，SyBE_Sc01100002和SyBE_Sc01100011在发酵培养基A中生长趋势一致，生长状况无明显差别，36h发酵结束时菌体最终OD600达到10左右。
各个菌株的发酵产物的GC-MS检测结果见图5；其中，图5-A为SyBE_Sc01100002的产物分析GC谱图，其中保留时间为20.83min的峰为7-脱氢胆甾醇；该组分的质谱谱图为图5-B。图5-C为SyBE_Sc01100011的产物分析GC谱图，其中保留时间为20.81min的峰为7-脱氢胆甾醇；该组分的质谱谱图为图5-D。各个菌株的7-脱氢胆甾醇的产量见表3。
表3各个菌株的7-脱氢胆甾醇的产量
| 菌株名称 | 7-脱氢胆甾醇的产量(mg/L) |
| ΔERG5 | -- |
| SyBE_Sc01100002 | 2.61 |
| SyBE_Sc01100011 | 4.84 |
分别在对数中期(8h)和平台初期(16h)测量SyBE_Sc01100002和SyBE_Sc01100011中乙酰辅酶A的含量(使用BioVision公司的PicoProbeAcetyl-CoA定量试剂盒测定)。这两个重组菌株在不同时期的乙酰辅酶A的含量见表4。
表4不同时期的重组菌株的乙酰辅酶A的生成量
在24h测定所有菌株中NADH/NAD+的比值(使用ATT Bioquest公司的AmpliteNADH/NAD+比例荧光试剂盒测定)和发酵液中的甘油、乙醇含量。
检测结果见表5。
表5发酵24h时所有菌株中各个指标的检测结果
由表3、表4和表5可知，相比SyBE_Sc01100002，SyBE_Sc01100011的7-脱氢胆甾醇的产量有显著的提高，7-脱氢胆甾醇的产量提高了85.4％，差异显著(P＜0.05)。这说明提高乙酰辅酶A的合成有利于7-脱氢胆甾醇前体的供应，促使碳代谢流向目标产物。相比SyBE_Sc01100002、SyBE_Sc01100011中胞内NADH/NAD+的比值下降了8.9％；由氧化还原不平衡引起的副产物甘油积累量下降了64.6％；乙醇的积累量分别下降了7.3％，进一步说明了在酿酒酵母中导入乙酰辅酶A增强模块增强了甲羟戊酸途径前体的供应，更有利于次级代谢产物的生物合成，进而提高了次级代谢产物7-脱氢胆甾醇的产量。
实验结果说明乙酰辅酶A增强模块能够增强次级代谢产物7-脱氢胆甾醇在微生物中的合成，更有利于7-脱氢胆甾醇的大量生产。
将重组酿酒酵母菌株SyBE_Sc01100011进行生物保藏，其所对应的生物保藏信息为：分类命名：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2015年02月02日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.10501。
上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.乙酰辅酶A增强模块在增强7-脱氢胆甾醇在微生物中合成的应用；
其中，所述乙酰辅酶A增强模块包括表达乙醇脱氢酶的基因、表达乙醛脱氢酶的基因、表达乙酰辅酶A合酶的基因和表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述表达乙酰辅酶A合酶的基因具有如I、II或III所示的核苷酸序列：
I具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
II具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列30％同源性的序列；
III具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因具有如(I)、(II)或(III)所示的核苷酸序列：
(I)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(II)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列30％同源性的序列；
(III)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列。
4.一种乙酰辅酶A增强模块，其特征在于，其包括表达乙醇脱氢酶的基因、表达乙醛脱氢酶的基因、表达乙酰辅酶A合酶的基因和表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因；
其中，所述表达乙酰辅酶A合酶的基因具有如I、II或III所示的核苷酸序列：
I具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
II具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列30％同源性的序列；
III具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列；
所述表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因具有如(I)、(II)或(III)所示的核苷酸序列：
(I)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(II)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列30％同源性的序列；
(III)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列。
5.一种利用乙酰辅酶A增强模块增强7-脱氢胆甾醇在微生物中合成的方法，其特征在于，包括：
获得乙酰辅酶A增强模块、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因和表达固醇C-24还原酶的基因；
将所述乙酰辅酶A增强模块、所述表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因和所述表达固醇C-24还原酶的基因导入所述微生物中，获得含所述乙酰辅酶A增强模块、所述表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因和所述表达固醇C-24还原酶的基因的重组微生物；
其中，所述乙酰辅酶A增强模块包括表达乙醇脱氢酶的基因、表达乙醛脱氢酶的基因、表达乙酰辅酶A合酶的基因和表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述表达乙酰辅酶A合酶的基因具有如I、II或III所示的核苷酸序列：
I具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
II具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列30％同源性的序列；
III具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列；
所述表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因具有如(I)、(II)或(III)所示的核苷酸序列：
(I)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(II)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列30％同源性的序列；
(III)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列。
7.一种高产7-脱氢胆甾醇的重组微生物，其特征在于，其中导入了乙酰辅酶A增强模块、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因和表达固醇C-24还原酶的基因；
所述乙酰辅酶A增强模块包括表达乙醇脱氢酶的基因、表达乙醛脱氢酶的基因、表达乙酰辅酶A合酶的基因和表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因。
8.根据权利要求7所述的重组微生物，其特征在于，所述微生物为真核菌株。
9.根据权利要求7或8所述的重组微生物，其特征在于，所述表达乙醇脱氢酶的基因、所述表达乙醛脱氢酶的基因、所述表达乙酰辅酶A合酶的基因、所述表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因和表达固醇C-24还原酶的基因中至少一个以基因表达盒的形式导入所述微生物中。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的重组微生物，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.10501。
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