KR20140058691A - 1,3-부탄디올을 생산하기 위한 진핵 유기체 및 방법 - Google Patents

1,3-부탄디올을 생산하기 위한 진핵 유기체 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20140058691A
KR20140058691A KR1020147009246A KR20147009246A KR20140058691A KR 20140058691 A KR20140058691 A KR 20140058691A KR 1020147009246 A KR1020147009246 A KR 1020147009246A KR 20147009246 A KR20147009246 A KR 20147009246A KR 20140058691 A KR20140058691 A KR 20140058691A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
coa
acetyl
bdo
pathway
pathway comprises
Prior art date
Application number
KR1020147009246A
Other languages
English (en)
Inventor
안쏘니 피. 버가드
마크 제이. 버크
로빈 이. 오스터아웃
프리티 파르크야
징이 리
Original Assignee
게노마티카 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 게노마티카 인코포레이티드 filed Critical 게노마티카 인코포레이티드
Publication of KR20140058691A publication Critical patent/KR20140058691A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/02—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
    • C08G63/12—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds derived from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
    • C08G63/16—Dicarboxylic acids and dihydroxy compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

세포질 아세틸-CoA를 생산하고 그의 이용가능성을 증가시키기 위해 조작될 수 있는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다. 1,3-부탄디올 (1,3-BDO) 경로를 갖는 비-자연 발생 진핵 유기체, 및 1,3-BDO를 생산하기 위한 그와 같은 유기체를 사용하는 방법이 또한 본원에서 제공된다.

Description

1,3-부탄디올을 생산하기 위한 진핵 유기체 및 방법 {EUKARYOTIC ORGANISMS AND METHODS FOR PRODUCING 1,3-BUTANEDIOL}
본원은 미국 시리즈 번호 61/532,492 (2011년 9월 8일 출원); 61/541,951 (2011년 9월 30일 출원); 61/558,959 (2011년 11월 11일 출원); 61/649,039 (2012년 5월 18일 출원); 및 61/655,355 (2012년 6월 4일 출원)을 우선권으로 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
1. 배경
생체합성 과정에 관한 방법 및 유기 화합물을 생산할 수 있는 진핵 유기체이 일반적으로 본원에서 제공된다. 더 구체적으로, 어떤 구현예에서, 세포질 아세틸-CoA를 생산하고 그의 이용가능성을 증가시키기 위해 조작될 수 있는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다. 많은 진핵 유기체에서, 아세틸-CoA는 미토콘드리아에서 피루베이트 탈수소효소에 의해 주로 합성된다 (도 1). 따라서, 세포질 아세틸-CoA를 생산하고 그의 이용가능성을 증가시킬 수 있는 진핵 유기체를 개발할 필요가 있다. 미토콘드리아로부터 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는 기전은 아세틸-CoA 에서 기원하는 세포질 생산 경로의 배치를 가능하게 한다. 그와 같은 세포질 생산 경로는, 예를 들면, 상품 화학물질, 예컨대 1,3-부탄디올 (1,3-BDO) 및/또는 관심 있는 다른 화합물의 생산을 포함한다.
1,3-BDO를 생산하기 위해 조작될 수 있는 비-자연 발생 진핵 유기체가 또한 본원에서 제공된다. 1,3-BDO의 생산을 위한 석유계 공급원료에 대한 신뢰는 재생가능한 공급원료를 사용하여 1,3-BDO 및 부타디엔을 생산하는 것에 대한 대안적인 경로의 개발을 보장한다. 따라서, 1,3-BDO를 생산하도록 진핵 유기체 및 그의 사용 방법을 개발할 필요가 있다.
본원에서 제공된 유기체 및 방법은 이들 필요성을 만족시키고 또한 관련된 이을 제공한다.
2. 요약
세포질 아세틸-CoA를 생산하고 그의 이용가능성을 증가시킬 수 있는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다. 그와 같은 유기체는 유익하게는 세포질 아세틸-CoA의 생산을 허용하고, 그 다음 이것은 세포질 생산 경로를 사용하여 관심 화합물, 예컨대 1,3-BDO을 생산하기 위해 유기체에 의해 사용될 수 있다. 1,3-BDO 경로를 갖는 비-자연 발생 진핵 유기체, 및 1,3-BDO를 생산하기 위한 그와 같은 유기체의 사용 방법이 또한 본원에서 제공된다.
제 1 측면에서, 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 하기를 위한 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다: (i) 상기 유기체의 미토콘드리아 및/또는 페록시솜으로부터 상기 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하고, (ⅱ) 상기 유기체의 세포질에서 아세틸-CoA를 생산하고/거나 (ⅲ) 상기 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시킨다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다: 시트레이트 합성효소; 시트레이트 수송체; 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체; 시트레이트/말레이트 수송체; ATP 시트레이트 분해효소; 시트레이트 분해효소; 아세틸-CoA 합성효소; 옥살로아세테이트 수송체; 세포질 말레이트 탈수소효소; 말레이트 수송체; 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성); 아세틸-CoA 리가제 또는 전이효소; 아세테이트 키나아제; 포스포트랜스아세틸라제; 피루베이트 탈탄산효소; 아세트알데하이드 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성); 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 또는 피루베이트 포르메이트 분해효소; 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화); 트레오닌 알돌라아제; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소; 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소; 세포질 아세틸카르니틴 전이효소; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제; 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제; 포스포에놀피루베이트 (PEP) 카복실라제; PEP 카복시키나아제; 옥살로아세테이트 탈탄산효소; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소 (아세틸화); 아세틸-CoA 카복실라제; 말로닐-CoA 탈탄산효소; 옥살로아세테이트 탈수소효소; 옥살로아세테이트 산화환원효소; 말로닐-CoA 환원효소; 피루베이트 카복실라제; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소; 말로닐-CoA 합성효소; 말로닐-CoA 전이효소; 말산 효소; 말레이트 탈수소효소; 말레이트 산화환원효소; 피루베이트 키나아제; PEP 포스파타제.
또 하나의 측면에서, 비-자연 발생 진핵 유기체의 미토콘드리아 및/또는 페록시솜으로부터 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는 방법이 제공되고, 이 방법은 비-자연 발생 진핵 유기체의 미토콘드리아 및/또는 페록시솜으로부터 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는 조건 하에서 및 충분한 기간 동안 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 미토콘드리아으로부터 상기 비-자연 발생 진핵 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는 방법이 본원에서 제공된다. 다른 구현예에서, 페록시솜으로부터 상기 비-자연 발생 진핵 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA을 수송하는 방법이 본원에서 제공된다. 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 일부 구현예에서, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 미토콘드리아 및/또는 페록시솜으로부터 상기 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다: 시트레이트 합성효소; 시트레이트 수송체; 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체; 시트레이트/말레이트 수송체; ATP 시트레이트 분해효소; 시트레이트 분해효소; 아세틸-CoA 합성효소; 옥살로아세테이트 수송체; 세포질 말레이트 탈수소효소; 말레이트 수송체; 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성); 아세틸-CoA 리가제 또는 전이효소; 아세테이트 키나아제; 포스포트랜스아세틸라제; 피루베이트 탈탄산효소; 아세트알데하이드 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성); 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 또는 피루베이트 포르메이트 분해효소; 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화); 트레오닌 알돌라아제; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소; 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소; 세포질 아세틸카르니틴 전이효소; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제; 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제; PEP 카복실라제; PEP 카복시키나아제; 옥살로아세테이트 탈탄산효소; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소 (아세틸화); 아세틸-CoA 카복실라제; 말로닐-CoA 탈탄산효소; 옥살로아세테이트 탈수소효소; 옥살로아세테이트 산화환원효소; 말로닐-CoA 환원효소; 피루베이트 카복실라제; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소; 말로닐-CoA 합성효소; 말로닐-CoA 전이효소; 말산 효소; 말레이트 탈수소효소; 말레이트 산화환원효소; 피루베이트 키나아제; PEP 포스파타제.
또 하나의 측면에서, 세포질 아세틸-CoA를 생산하는 방법이 본원에서 제공되고, 이 방법은 세포질 아세틸-CoA를 생산하는 조건 하에서 및 충분한 기간 동안 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 세포질 아세틸-CoA를 생산하는 방법이 본원에서 제공되고, 이 방법은 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 것을 포함하고, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체에서 세포질 아세틸-CoA를 생산하기에 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다: 시트레이트 합성효소; 시트레이트 수송체; 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체; 시트레이트/말레이트 수송체; ATP 시트레이트 분해효소; 시트레이트 분해효소; 아세틸-CoA 합성효소; 옥살로아세테이트 수송체; 세포질 말레이트 탈수소효소; 말레이트 수송체; 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성); 아세틸-CoA 리가제 또는 전이효소; 아세테이트 키나아제; 포스포트랜스아세틸라제; 피루베이트 탈탄산효소; 아세트알데하이드 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성); 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 또는 피루베이트 포르메이트 분해효소; 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화); 트레오닌 알돌라아제; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소; 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소; 세포질 아세틸카르니틴 전이효소; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제; 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제; PEP 카복실라제; PEP 카복시키나아제; 옥살로아세테이트 탈탄산효소; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소 (아세틸화); 아세틸-CoA 카복실라제; 말로닐-CoA 탈탄산효소; 옥살로아세테이트 탈수소효소; 옥살로아세테이트 산화환원효소; 말로닐-CoA 환원효소; 피루베이트 카복실라제; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소; 말로닐-CoA 합성효소; 말로닐-CoA 전이효소; 말산 효소; 말레이트 탈수소효소; 말레이트 산화환원효소; 피루베이트 키나아제; PEP 포스파타제.
또 하나의 측면에서, 비-자연 발생 진핵 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는 방법이 본원에서 제공되고, 이 방법은 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는 조건 하에서 및 충분한 기간 동안 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는 방법이 본원에서 제공되고, 이 방법은 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 것을 포함하고, 여기서 상기 유기체는 상기 비-자연 발생 진핵 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키기에 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다: 시트레이트 합성효소; 시트레이트 수송체; 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체; 시트레이트/말레이트 수송체; ATP 시트레이트 분해효소; 시트레이트 분해효소; 아세틸-CoA 합성효소; 옥살로아세테이트 수송체; 세포질 말레이트 탈수소효소; 말레이트 수송체; 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성); 아세틸-CoA 리가제 또는 전이효소; 아세테이트 키나아제; 포스포트랜스아세틸라제; 피루베이트 탈탄산효소; 아세트알데하이드 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성); 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 또는 피루베이트 포르메이트 분해효소; 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화); 트레오닌 알돌라아제; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소; 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소; 세포질 아세틸카르니틴 전이효소; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제; 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제; PEP 카복실라제; PEP 카복시키나아제; 옥살로아세테이트 탈탄산효소; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소 (아세틸화); 아세틸-CoA 카복실라제; 말로닐-CoA 탈탄산효소; 옥살로아세테이트 탈수소효소; 옥살로아세테이트 산화환원효소; 말로닐-CoA 환원효소; 피루베이트 카복실라제; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소; 말로닐-CoA 합성효소; 말로닐-CoA 전이효소; 말산 효소; 말레이트 탈수소효소; 말레이트 산화환원효소; 피루베이트 키나아제; PEP 포스파타제.
비-자연 발생 진핵 유기체 및 그의 진핵 유기체에서 세포질 아세틸-CoA를 생산하고 그의 이용가능성을 증가시키는 방법이 본원에서 제공된다. 비-자연 발생 진핵 유기체 및 최적 수율의 어떤 상품 화학물질, 예컨대 1,3-BDO, 또는 다른 관심 화합물을 생산하는 방법이 또한 본원에서 제공된다.
또 하나의 측면에서, 하기 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 상기 유기체가 (i) 상기 유기체의 미토콘드리아 및/또는 페록시솜으로부터 상기 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하고, (ⅱ) 상기 유기체의 세포질에서 아세틸-CoA를 생산하고/거나 (ⅲ) 상기 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 아세틸-CoA 경로, 및 (2) 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로. 어떤 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다: 시트레이트 합성효소; 시트레이트 수송체; 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체; 시트레이트/말레이트 수송체; ATP 시트레이트 분해효소; 시트레이트 분해효소; 아세틸-CoA 합성효소; 옥살로아세테이트 수송체; 세포질 말레이트 탈수소효소; 말레이트 수송체; 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성); 아세틸-CoA 리가제 또는 전이효소; 아세테이트 키나아제; 포스포트랜스아세틸라제; 피루베이트 탈탄산효소; 아세트알데하이드 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성); 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 또는 피루베이트 포르메이트 분해효소; 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화); 트레오닌 알돌라아제; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소; 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소; 세포질 아세틸카르니틴 전이효소; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제; 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제; PEP 카복실라제; PEP 카복시키나아제; 옥살로아세테이트 탈탄산효소; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소 (아세틸화); 아세틸-CoA 카복실라제; 말로닐-CoA 탈탄산효소; 옥살로아세테이트 탈수소효소; 옥살로아세테이트 산화환원효소; 말로닐-CoA 환원효소; 피루베이트 카복실라제; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소; 말로닐-CoA 합성효소; 말로닐-CoA 전이효소; 말산 효소; 말레이트 탈수소효소; 말레이트 산화환원효소; 피루베이트 키나아제; PEP 포스파타제; 및/또는 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다: 아세토아세틸-CoA 티올라제; 아세틸-CoA 카복실라제; 아세토아세틸-CoA 합성효소; 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성); 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원); 4-하이드록시,2-부타논 환원효소; 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성); 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원); 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소; 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원); 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성); 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성); 아세토아세틸-CoA 전이효소, 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 아세토아세틸-CoA 합성효소, 또는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제; 아세토아세테이트 환원효소; 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소, 가수분해효소, 또는 합성효소; 3-하이드록시부티레이트 환원효소; 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO를 생산하는 방법이 본원에서 제공되고, 이 방법은 1,3-BDO를 생산하는 조건 하에서 및 충분한 기간 동안 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 것을 포함하고, 여기서 상기 비-자연 발생 진핵 유기체는 (1) 아세틸-CoA 경로, 및 (2) 1,3-BDO 경로를 포함한다. 어떤 구현예에서, 1,3-BDO를 생산하는 방법이 본원에서 제공되고, 이 방법은 하기 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 것을 포함한다: 상기 유기체는 (i) 상기 유기체의 미토콘드리아 및/또는 페록시솜으로부터 상기 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하고, (ⅱ) 상기 유기체의 세포질에서 아세틸-CoA를 생산하고/거나 (ⅲ) 상기 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 아세틸-CoA 경로 및/또는 (2) 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다: 시트레이트 합성효소; 시트레이트 수송체; 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체; 시트레이트/말레이트 수송체; ATP 시트레이트 분해효소; 시트레이트 분해효소; 아세틸-CoA 합성효소; 옥살로아세테이트 수송체; 세포질 말레이트 탈수소효소; 말레이트 수송체; 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성); 아세틸-CoA 리가제 또는 전이효소; 아세테이트 키나아제; 포스포트랜스아세틸라제; 피루베이트 탈탄산효소; 아세트알데하이드 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성); 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 또는 피루베이트 포르메이트 분해효소; 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화); 트레오닌 알돌라아제; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소; 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소; 세포질 아세틸카르니틴 전이효소; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제; 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제; PEP 카복실라제; PEP 카복시키나아제; 옥살로아세테이트 탈탄산효소; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소 (아세틸화); 아세틸-CoA 카복실라제; 말로닐-CoA 탈탄산효소; 옥살로아세테이트 탈수소효소; 옥살로아세테이트 산화환원효소; 말로닐-CoA 환원효소; 피루베이트 카복실라제; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소; 말로닐-CoA 합성효소; 말로닐-CoA 전이효소; 말산 효소; 말레이트 탈수소효소; 말레이트 산화환원효소; 피루베이트 키나아제; PEP 포스파타제; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다: 아세토아세틸-CoA 티올라제; 아세틸-CoA 카복실라제; 아세토아세틸-CoA 합성효소; 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성); 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원); 4-하이드록시,2-부타논 환원효소; 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성); 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원); 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소; 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원); 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성); 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성); 아세토아세틸-CoA 전이효소, 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 아세토아세틸-CoA 합성효소, 또는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제; 아세토아세테이트 환원효소; 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소, 가수분해효소, 또는 합성효소; 3-하이드록시부티레이트 환원효소; 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 상기 유기체가 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로 및 (2) 1,3-BDO 경로의 하나 이상의 전구체 및/또는 중간체를 이용하는 하나 이상의 효소 또는 경로의 결실 또는 약화. 특이한 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 아세틸-CoA를 이용하는 경쟁 경로의 결실 또는 약화를 포함한다. 특이한 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 1,3-BDO 중간체 부산물 경로의 결실 또는 약화를 포함한다.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 상기 유기체가 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로 및 (2) 1,3-BDO 경로의 하나 이상의 보조인자를 이용하는 하나 이상의 효소 또는 경로의 결실 또는 약화.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 약화된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 하나 이상의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함한다: 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성), 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원), 4-하이드록시-2-부타논 환원효소, 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성), 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원), 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소, 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원), 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성), 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성), 아세토아세테이트 환원효소, 3-하이드록시부티레이트 환원효소, 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소 및 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소; 여기서 상기 약화된 1,3-BDO 경로 효소는 NAPDH-의존적이고 비변경된 또는 야생형 핵산에 인코딩된 1,3-BDO 경로 효소와 비교할 때 더 낮은 효소 활성을 갖는다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 하나 이상의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함한다: 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성), 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원), 4-하이드록시-2-부타논 환원효소, 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성), 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원), 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소, 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원), 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성), 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성), 아세토아세테이트 환원효소, 3-하이드록시부티레이트 환원효소, 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소 및 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소; 여기서 적어도 하나의 핵산은 변경되었고 이로써 핵산에 의해 인코딩된 1,3-BDO 경로 효소는 미변경된 또는 야생형 핵산에 인코딩된 1,3-BDO 경로 효소보다 NADH에 대해 더 큰 친화도를 갖는다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 하나 이상의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함한다: 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성), 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원), 4-하이드록시-2-부타논 환원효소, 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성), 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원), 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소, 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원), 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성), 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성), 아세토아세테이트 환원효소, 3-하이드록시부티레이트 환원효소, 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소 및 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소, 여기서 적어도 하나의 핵산은 변경되었고 이로써 핵산에 의해 인코딩된 1,3-BDO 경로 효소는 미변경된 또는 야생형 핵산에 인코딩된 1,3-BDO 경로 효소보다 NADPH에 대해 더 낮은 친화도를 갖는다.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 상기 유기체가 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로; (2) 상기 유기체가 유기체에서 NADH를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 아세틸-CoA 경로; 여기서 상기 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다: (i.) NAD-의존적 피루베이트 탈수소효소; (ⅱ.) 피루베이트 포르메이트 분해효소 및 NAD-의존적 포르메이트 탈수소효소; (ⅲ.) 피루베이트:페레독신 산화환원효소 및 NADH:페레독신 산화환원효소; (ⅳ.) 피루베이트 탈탄산효소 및 NAD-의존적 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소; (v.) 피루베이트 탈탄산효소, NAD-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 아세테이트 키나아제, 및 포스포트랜스아세틸라제; 또는 (ⅵ.) 피루베이트 탈탄산효소, NAD-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 및 아세틸-CoA 합성효소.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 상기 유기체가 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로; 및 (2) 상기 유기체가 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 6-포스포글루코노락토나제, 및 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 (탈카복실화)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펜토스 포스페이트 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 펜토스 포스페이트 경로.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 상기 유기체가 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로; 및 (2) 상기 유기체가 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 6-포스포글루코노락토나제, 포스포글루코네이트 탈수효소, 및 2-케토-3-데옥시글루코네이트 6-포스페이트 알돌라아제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 엔트너 듀도르프 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 엔트너 듀도르프 경로.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 상기 유기체가 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로; 및 (2) 수소전달효소가 NADH를 NADPH로 전환하는데 충분한 양으로 발현되는, 가용성 또는 막-결합 수소전달효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 상기 유기체가 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로; 및 (2) NADP-의존적 인산화 또는 비-인산화 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 상기 유기체가 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로; 및 (2) 상기 유기체가 유기체에서 NADPH를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소 을 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 아세틸-CoA 경로; 여기서 상기 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다: (i) NADP-의존적 피루베이트 탈수소효소; (ⅱ) 피루베이트 포르메이트 분해효소 및 NADP-의존적 포르메이트 탈수소효소; (ⅲ) 피루베이트:페레독신 산화환원효소 및 NADPH:페레독신 산화환원효소; (ⅳ) 피루베이트 탈탄산효소 및 NADP-의존적 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소; (v) 피루베이트 탈탄산효소, NADP-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 아세테이트 키나아제, 및 포스포트랜스아세틸라제; 또는 (ⅵ) 피루베이트 탈탄산효소, NADP-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 및 아세틸-CoA 합성효소.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 상기 유기체가 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로; 및 (2) 인산화 또는 비-인산화 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소; 피루베이트 탈수소효소; 포르메이트 탈수소효소; 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소로 이루어진 그룹으로부터 선택된 NAD(P)H 보조인자 효소를 인코딩하는 하나 이상의 내인성 및/또는 외인성 핵산; 여기서 NAD(P)H 보조인자 효소를 인코딩하는 하나 이상의 핵산은 변경되었고 이로써 핵산에 의해 인코딩된 NAD(P)H 보조인자 효소는 미변경된 또는 야생형 핵산에 의해 인코딩된 NAD(P)H 보조인자 효소보다 NADPH에 대해 더 큰 친화도를 갖는다.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) NADPH 의존적 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로; 및 (2) 인산화 또는 비-인산화 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소; 피루베이트 탈수소효소; 포르메이트 탈수소효소; 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소로 이루어진 그룹으로부터 선택된 NAD(P)H 보조인자 효소를 인코딩하는 하나 이상의 내인성 및/또는 외인성 핵산; 여기서 NAD(P)H 보조인자 효소 핵산을 인코딩하는 하나 이상의 핵산은 변경되었고 이로써 그 핵산이 인코딩하는 NAD(P)H 보조인자 효소는 미변경된 또는 야생형 핵산에 의해 인코딩된 NAD(P)H 보조인자 효소보다 NADH에 대해 더 작은 친화도를 갖는다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체, 및 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 NADH 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 NADH 탈수소효소를 발현시키고/거나; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 NADH 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 사이토크롬 산화효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 사이토크롬 산화효소를 발현시키고/거나; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 사이토크롬 산화효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 글리세롤-3-포스페이트 (G3P) 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 G3P 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 G3P 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않고/거나 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 글리세롤을 생산한다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 G3P 포스파타제를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 G3P 포스파타제를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 G3P 포스파타제 효소 활성을 갖거나 갖지 않고/거나 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 글리세롤을 생산한다.
하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 피루베이트 탈탄산효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 피루베이트 탈탄산효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 피루베이트 탈탄산효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않고/거나 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 피루베이트로부터 더 낮은 수준의 에탄올을 생산한다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 에탄올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 에탄올 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 에탄올 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않고/거나 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 에탄올을 생산한다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 말레이트 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 말레이트 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 말레이트 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않고/거나 (ⅳ)은 말레이트-아스파르테이트 셔틀, 말레이트 옥살로아세테이트 셔틀, 및/또는 말레이트-피루베이트 셔틀의 약화 또는 차단을 갖는다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 아세토아세틸-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 아세토아세틸-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 발현시키고/거나; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 아세토아세틸-CoA 가수분해효소 또는 전이효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 발현시키고/거나; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 또는 전이효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고; 여기서 상기 유기체 (i)는 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화)를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화)를 발현시키고;/또는 (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화) 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소를 발현시키고/거나; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소를 발현시키고/거나; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 1,3-부탄디올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 1,3-부탄디올 탈수소효소를 발현시키고/거나; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 1,3-부탄디올 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 아세토아세틸-CoA 티올라제를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 아세토아세틸-CoA 티올라제를 발현시키고;/또는 (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 아세토아세틸-CoA 티올라제 효소 활성을 가지거나 갖지 않는다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고; 여기서 상기 유기체는 추가로, 1,3-BDO 수송체를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 1,3-BDO 수송체를 인코딩하는 핵산은 진핵 유기체로부터 1,3-BDO의 방출에 충분한 양으로 발현된다.
또 하나의 측면에서, 조합된 미토콘드리아/세포질 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 조합된 미토콘드리아/세포질 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함한다. 어떤 구현예에서, 조합된 미토콘드리아/세포질 1,3-BDO 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다: 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 티올라제; 아세틸-CoA 카복실라제; 아세토아세틸-CoA 합성효소; 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 환원효소; 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소; 미토콘드리아 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소; 미토콘드리아. 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소; 아세토아세테이트 수송체; 3-하이드록시부티레이트 수송체; 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소 또는 합성효소, 세포질 아세토아세틸-CoA 전이효소 또는 합성효소; 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성); 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원); 4-하이드록시-2-부타논 환원효소; 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성); 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원); 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소; 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원); 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성); 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성); 아세토아세테이트 환원효소; 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소, 가수분해효소, 또는 합성효소; 3-하이드록시부티레이트 환원효소; 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO를 생산하는 방법이 본원에서 제공되고, 이 방법은 본원에서 제공된 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체의 어떤 것을 배양하는 것을 포함한다 1,3-BDO를 생산하는 조건 하에서 및 충분한 기간 동안. 어떤 구현예에서, 진핵 유기체는 배양된 실질적으로 혐기성 배양 배지에 있다. 다른 구현예에서, 진핵 유기체는 크랩트리 양성 유기체이다.
또 하나의 측면에서, 비-자연 발생 진핵 유기체에 도입될 외인성 1,3-BDO 경로 효소를 선택하는 방법이 본원에서 제공되고, 여기서 상기 외인성 1,3-BDO 경로 효소는 유기체에서 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현되고, 상기 방법은 하기를 포함한다: (i.) 보조인자로서 NADH를 사용하는 적어도 하나의 1,3-BDO 경로 효소의 활성을 측정하는 단계; (ⅱ.) 보조인자로서 NADPH를 사용하는 적어도 1,3-BDO 경로 효소의 활성을 측정하는 단계; 및 (ⅲ.) 단계 1 및 2에서 측정된 바와 같이 보조인자로서 NADPH보다 NADH에 대해 더 큰 선호도를 갖는 적어도 하나의 1,3-BDO 경로 효소를 상기 유기체에 도입하는 단계.
3. 도면의 간단한 설명
도 1은 진핵 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA의 생산을 위한 예시적인 경로를 보여준다.
도 2는 시트레이트 및 옥살로아세테이트 수송체를 사용하여 미토콘드리아 아세틸-CoA로부터 세포질 아세틸-CoA의 생산을 위한 경로를 보여준다. 효소는 하기이다: A) 시트레이트 합성효소; B) 시트레이트 수송체; C) 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체; D) ATP 시트레이트 분해효소; E) 시트레이트 분해효소; F) 아세틸-CoA 합성효소 또는 전이효소, 또는 아세테이트 키나아제 및 포스포트랜스아세틸라제; G) 옥살로아세테이트 수송체; K) 아세테이트 키나아제; L) 포스포트랜스아세틸라제.
도 3은 시트레이트 및 말레이트 수송체를 사용하여 미토콘드리아 아세틸-CoA로부터 세포질 아세틸-CoA의 생산을 위한 경로를 보여준다. 효소는 하기이다: A) 시트레이트 합성효소; B) 시트레이트 수송체; C) 시트레이트/말레이트 수송체; D) ATP 시트레이트 분해효소; E) 시트레이트 분해효소; F) 아세틸-CoA 합성효소 또는 전이효소, 또는 아세테이트 키나아제 및 포스포트랜스아세틸라제; H) 세포질 말레이트 탈수소효소; I) 말레이트 수송체; J) 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소; K) 아세테이트 키나아제; L) 포스포트랜스아세틸라제.
도 4는 아세틸-CoA로부터1,3-BDO의 생합성을 위한 경로를 보여준다. 보여준 효소 변환은 하기 효소에 의해 수행된다: A) 아세토아세틸-CoA 티올라제, B) 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성), C) 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원), D) 4-하이드록시-2-부타논 환원효소, E) 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성), F) 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원), G) 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소, H) 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원), I) 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성), J) 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성), K) 아세토아세틸-CoA 전이효소, 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 아세토아세틸-CoA 합성효소, 또는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제, L) 아세토아세테이트 환원효소, M) 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소, 가수분해효소, 또는 합성효소, N) 3-하이드록시부티레이트 환원효소, 및 O) 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소. 도 4에서 묘사된 1,3-BDO 경로에서 아세틸-CoA의 아세토아세틸-CoA by 아세토아세틸-CoA 티올라제 (단계 A)로의 대안적인 것은 아세틸-CoA 카복실라제에 의한 아세틸-CoA의 말로닐-CoA로의 전환, 및 아세토아세틸-CoA 합성효소에 의한 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA의 아세토아세틸-CoA로의 전환을 수반한다 (도시되지 않음; 도 7, 단계 E 및 F, 또는 도 9 참조).
도 5는 세포질 피루베이트로부터 세포질 아세틸-CoA의 생산을 위한 경로를 보여준다. 효소는 하기이다: A) 피루베이트 산화효소 (아세테이트-형성), B) 아세틸-CoA 합성효소, 리가제 또는 전이효소, C) 아세테이트 키나아제, D) 포스포트랜스아세틸라제, E) 피루베이트 탈탄산효소, F) 아세트알데하이드 탈수소효소, G) 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성), H) 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 또는 피루베이트 포르메이트 분해효소, I) 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화), 및 J) 트레오닌 알돌라아제.
도 6 은 미토콘드리아 또는 페록시솜 아세틸-CoA 로부터 세포질 아세틸-CoA의 생산을 위한 경로를 보여준다. 효소는 하기이다: A) 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소, B) 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소, C) 세포질 아세틸카르니틴 전이효소, D) 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제, E) 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제.
도 7은 예시적인 1,3-BDO 경로를 도시한다. A) 아세토아세틸-CoA 티올라제, B) 아세토아세틸-CoA 환원효소, C) 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성), D) 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소, E) 아세틸-CoA 카복실라제, F) 아세토아세틸-CoA 합성효소. G3P는 글리세롤-3-포스페이트이다. 이 경로에서, 아세틸-CoA의 2개의 동등물은 아세토아세틸-CoA 티올라제에 의해 아세토아세틸-CoA로 전환된다. 대안적으로, 아세틸-CoA는 아세틸-CoA 카복실라제에 의해, 아세토아세틸-CoA는 아세토아세틸-CoA 합성효소에 의해 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA로부터 합성된다. 그 다음 아세토아세틸-CoA는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소에 의해 3-하이드록시부티릴-CoA로 환원된다. 3-하이드록시부티릴-CoA 중간체는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 및 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소에 의해 3-하이드록시부티르알데하이드로 추가로 환원되고, 1,3-BDO로 추가로 환원된다. 유기체는 예시적인 부산물 경로 ("X")의 하나 이상을 삭제하도록 선택적으로 추가로 조작될 수 있다.
도 8은 예시적인 조합된 미토콘드리아/세포질 1,3-BDO 경로를 도시한다. 경로 효소는 하기를 포함한다: A) 아세토아세틸-CoA 티올라제, B) 아세토아세틸-CoA 환원효소, C) 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소, D) 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소, E) 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소, F) 아세토아세테이트 수송체, G) 3-하이드록시부티레이트 수송체, H) 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소 또는 합성효소, I) 아세토아세틸-CoA 전이효소 또는 합성효소, J) 아세틸-CoA 카복실라제, 및 K). 아세토아세틸-CoA 합성효소.
도 9는 아세토아세틸-CoA 합성효소에 의해 아세틸 CoA 및 말로닐-CoA의 아세토아세틸-CoA로의 전환을 위한 예시적인 경로를 도시한다.
도 10은 포스포에놀피루베이트 (PEP) 및 피루베이트로부터 아세틸-CoA 및 아세토아세틸-CoA로의 예시적인 경도를 도시한다. A) PEP 카복실라제 또는 PEP 카복시키나아제, B) 옥살로아세테이트 탈탄산효소, C) 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소 (아세틸화), D) 아세틸-CoA 카복실라제 또는 말로닐-CoA 탈탄산효소, E) 아세토아세틸-CoA 합성효소, F) 옥살로아세테이트 탈수소효소 또는 옥살로아세테이트 산화환원효소, G) 말로닐-CoA 환원효소, H) 피루베이트 카복실라제, I) 아세토아세틸-CoA 티올라제, J) 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소, K) 말로닐-CoA 합성효소 또는 전이효소, L) 말산 효소, M) 말레이트 탈수소효소 또는 산화환원효소, N) 피루베이트 키나아제 또는 PEP 포스파타제.
4. 상세한 설명
비-천연 진핵 유기체 및 이의 진핵 유기체에서 세포질 아세틸-CoA의 이용가능성을 생산하고 증가시키는 이의 방법이 본원에 제공된다. 또한 비-천연 진핵 유기체 및 1.3-BDO와 같은 상품 화학물질, 및/또는 기타 관심있는 화합물을 생산하는 이의 방법이 본원에 제공된다.
4.1 정의
본원에 사용된 바와 같이, 본원에 제공된 진핵 유기체와 관련하여 사용될 때 용어 "비-천연"은 진핵 유기체가, 참조된 종들의 야생형 균주들을 포함하는, 참조된 종들의 천연 균주에서 정상적으로 발견되지 않는 적어도 하나의 유전적 변이를 갖는다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 유전적 변이는, 예를 들면, 대사 폴리펩타이드를 코딩하는 발현가능한 핵산을 도입하는 변형, 다른 핵산 부가, 핵산 결실 및/또는 진핵 유기체의 유전적 물질의 다른 기능적 파괴를 포함한다. 그러한 변형은, 예를 들면, 참조된 종들에게 이종기원이거나 상동인 폴리펩타이드 또는 이종기원이고 상동인 폴리펩타이드에 대한, 코딩 영역 및 이의 기능적 단편을 포함한다. 부가적 변형은, 예를 들면, 변형이 유전자 또는 오페론의 발현을 변화시키는 비-코딩 조절 영역을 포함한다. 예시적인 대사 폴리펩타이드는 아세틸-CoA 경로 내의 효소 또는 단백질을 포함한다.
대사 변형은 그 천연 상태로부터 변화된 생화학적 반응을 지칭한다. 따라서, 비-천연 진핵 유기체는 대사 폴리펩타이드, 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산에 대해 유전적 변형을 가질 수 있다. 예시적인 대사 변형이 본원에 개시되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 진핵 유기체에 관련하여 사용될 때 용어 "단리된"은 참조된 진핵 유기체가 자연계에서 발견될 때의 적어도 하나의 요소가 실질적으로 없는 유기체를 의미하는 것으로 의도된다. 상기 용어는 진핵 유기체가 그 천연 환경에서 발견될 때의 일부 또는 모든 요소들로부터 떨어져 있는 진핵 유기체를 포함한다. 상기 용어는 또한 진핵 유기체가 비-천연 환경에서 발견될 때의 일부 또는 모든 요소들로부터 떨어져 있는 진핵 유기체를 포함한다. 따라서, 단리된 진핵 유기체는 그것이 자연계에서 발견될 때의 또는 그것이 비-천연 환경에서 성장되거나 보관되거나 생존을 유지하는 때의 기타 물질들로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된다. 단리된 진핵 유기체의 구체적인 예는 부분적으로 순수한 미생물, 실질적으로 순수한 미생물 및 비-천연 배지에서 배양된 미생물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어들 "진핵," "진핵 유기체," 또는 "진핵생물"은 분류군 진핵생물류(taxon Eukarya) 또는 진핵생물(Eukaryota) 중 임의의 단일 세포 또는 다-세포 유기체를 지칭하는 것으로 의도된다. 특히, 상기 용어들은 세포가 미토콘드리아를 포함하는 유기체들을 포함한다. 상기 용어는 또한 세포질 아세틸-CoA의 수준 증가를 위해 배양될 수 있는 임의의 종의 세포 배양물을 포함한다. 본원에 제공된 조성물 및 방법의 특정 구현예에서, 진핵 유기체는 효모이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CoA" 또는 "보조효소 A"는 그의 존재가 활성 효소 시스템을 형성하는 많은 효소들(아포효소)의 활성에 요구되는 유기 보조인자 또는 보결 그룹(효소의 비단백질 부분)을 의미하는 것으로 의도된다. 보조효소 A는 소정의 축합 효소들에서 기능하고, 아세틸 또는 기타 아실기 수송 및 지방산 합성 및 산화 피루베이트 산화 및 기타 아세틸화에서 작용한다.
본원에 사용된 바와 같이, 배양 또는 성장 조건과 관련하여 사용될 때 용어 "실질적으로 혐기성"은 산소의 양이 액체 배지 중 용존 산소에 대해 약 10% 미만의 포화도임을 의미하는 것으로 의도된다. 상기 용어는 또한 약 1% 미만의 산소의 대기로 유지된 액체 또는 고체 배지의 밀봉된 챔버를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이 "외인성"은 참조된 분자 또는 참조된 활성이 숙주 진핵 유기체 내로 도입되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 상기 분자는, 예를 들면, 숙주 염색체 내로의 통합에 의해서와 같이 숙주 유전적 물질 내로 코딩 핵산의 도입에 의해, 또는 플라스미드와 같은 비-염색체성 유전적 물질로서 도입될 수 있다. 따라서, 코딩 핵산의 발현과 관련하여 사용될 때 상기 용어는 진핵 유기체 내로 발현가능한 형태로 코딩 핵산을 도입하는 것을 지칭한다. 생합성 활성와 관련하여 사용될 때, 상기 용어는 숙주 참조 유기체 내로 도입되는 활성을 지칭한다. 상기 공급원은, 예를 들면, 숙주 진핵 유기체 내로 도입된 후 참조된 활성을 발현하는 상동이거나 이종기원인 코딩 핵산일 수 있다. 따라서, 용어 "내인성"은 숙주 내에 존재하는 참조된 분자 또는 활성을 지칭한다. 마찬가지로, 코딩 핵산의 발현과 관련하여 사용될 때 상기 용어는 진핵 유기체 내에 함유된 코딩 핵산의 발현을 지칭한다. 용어 "이종기원"은 참조된 종 이외의 공급원으로부터 유래된 분자 또는 활성을 지칭하는 반면, "상동"은 숙주 진핵 유기체로부터 유래된 분자 또는 활성을 지칭한다. 따라서, 본원에 제공된 코딩 핵산의 외인성 발현은 이종기원이거나 상동인 코딩 핵산 또는 두 가지 코딩 핵산을 이용할 수 있다.
하나를 초과하는 외인성 핵산이 진핵 유기체에 포함되는 경우 상기에서 논의된 바와 같이 하나를 초과하는 외인성 핵산은 참조된 코딩 핵산 또는 생화학적 활성을 지칭하는 것으로 이해된다. 본원에 개시된 바와 같이, 그러한 하나를 초과하는 외인성 핵산은 별개의 핵산 분자로, 폴리시트론성 핵산 분자로, 또는 이들의 조합으로 숙주 진핵 유기체 내로 도입될 수 있고, 여전히 하나를 초과하는 외인성 핵산으로서 간주될 수 있는 것으로 더 이해된다. 예를 들면, 본원에 개시된 바와 같이 진핵 유기체는 원하는 경로 효소 또는 단백질을 코딩하는 둘 이상의 외인성 핵산들을 발현하도록 조작될 수 있다. 원하는 활성을 코딩하는 두 개의 외인성 핵산들이 숙주 진핵 유기체 내로 도입되는 경우, 두 개의 외인성 핵산들은 단일 핵산으로서, 예를 들면, 단일 플라스미드로, 별개의 플라스미드로 도입될 수 있고, 단일 부위 또는 다중 부위로 숙주 염색체 내로 통합될 수 있고, 여전히 두 개의 외인성 핵산들로 간주될 수 있는 것으로 이해된다. 마찬가지로, 둘을 초과하는 외인성 핵산은 임의의 원하는 조합으로, 예를 들면 단일 플라스미드로, 플라스미드로 숙주 유기체 내로 도입될 수 있고, 단일 부위 또는 다중 부위로 염색체 내로 통합될 수 있고, 둘 이상의 외인성 핵산들, 예를 들면 3개의 외인성 핵산들로서 여전히 간주될 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 참조된 외인성 핵산 또는 생합성 활성의 수는 숙주 유기체 내로 도입된 별개의 핵산의 수가 아니라, 코딩 핵산의 수 또는 생화학적 활성의 수를 지칭한다.
본원에 제공된 비-천연 진핵 유기체는 안정적인 유전적 변이를 함유할 수 있으며, 이는 변이의 손실 없이 5세대 넘게 배양될 수 있는 진핵 유기체를 지칭한다. 일반적으로, 안정적인 유전적 변이는 10세대 넘게 지속되는 변형을 포함하며, 특히 안정적인 변형은 약 25세대 넘게 지속될 것이고, 더욱 특히, 안정적인 유전적 변형은 무제한을 포함하는, 50세대를 넘을 것이다.
당해분야의 숙련가는, 본원에 예시된 대사 변형을 포함하는 유전적 변이가 적합한 숙주 유기체 및 이들의 상응하는 대사 반응 또는 원하는 대사 경로를 위한 유전자와 같이 원하는 유전적 물질을 위한 적합한 공급원 유기체와 관련하여 기술된다는 것을 이해할 것이다. 그러나, 다양한 유기체의 전체 게놈 서열분석 및 유전체학 분야에서의 높은 수준의 기술을 고려할 때, 당해분야의 숙련가는 본원에서 제공된 교시 및 지침을 본질적으로 모든 다른 유기체에 쉽게 적용할 수 있을 것이다. 예를 들면, 본원에 예시된 대사 변경은 참조된 종 이외의 종에서 유래한 동일하거나 유사한 코딩 핵산을 도입함으로써 다른 종에 쉽게 적용될 수 있다. 그러한 유전적 변이는, 예를 들면, 종 동족체의 유전적 변이, 일반적으로, 그리고 특히, 오쏘로그, 파라로그 또는 비오쏘로그 유전자 치환을 포함한다.
오쏘로그는 수직 하강에 의해 관련되며, 상이한 유기체에서 실질적으로 동일한 또는 동일한 기능을 담당하는 유전자 또는 유전자들이다. 예를 들면, 마우스 에폭사이드 가수분해효소 및 인간 에폭사이드 가수분해효소는 에폭사이드의 가수분해의 생물학적 기능에 대해 오쏘로그로 간주될 수 있다. 유전자들은, 예를 들면, 이들이 상동이거나, 공통된 조상으로부터의 진화에 의해 관련된다는 것을 보여주는 충분한 양의 서열 유사성을 공유할 때, 수직 하강에 의해 관련된다. 유전자들이 3차원 구조를 공유하지만 일차 서열 유사성이 확인될 수 없는 정도까지 이들이 공통된 조상으로부터 진화되었다는 것을 보여주는 충분한 양의 서열 유사성을 반드시 공유하지는 않더라도 유전자들은 또한 오쏘로그로 간주될 수 있다. 오쏘로그인 유전자들은 약 25% 내지 100% 아미노산 서열 동일성의 서열 유사성을 갖는 단백질들을 코딩한다. 25% 미만의 아미노산 유사성을 공유하는 단백질들을 코딩하는 유전자들은 만약 이들의 3차원 구조가 또한 유사성을 나타내면 수직 하강에 의해 발생한 것으로 간주될 수 있다. 조직 플라스미노겐 활성제 및 엘라스타제를 포함하는, 세린 프로테아제 패밀리 효소의 멤버는, 공통된 조상으로부터 수직 하강에 의해 발생한 것으로 간주된다.
오쏘로그는, 예를 들면, 진화를 통해, 구조 또는 전체 활성이 나뉜, 유전자 또는 이들의 코딩된 유전자 생성물을 포함한다. 예를 들면, 하나의 종이 두 가지 기능을 나타내는 유전자 생성물을 코딩하는 경우, 그리고 그러한 기능들이 두 번째 종 내에서 별개의 유전자들로 분리되는 경우, 세 유전자들과 이들의 상응하는 생성물들은 오쏘로그로 간주된다. 본원에 기재된 대사 경로와 관련하여, 당해분야의 숙련가는, 도입되거나 파괴될 대사 활성을 갖는 오쏘로그 유전자가 비-천연 진핵 유기체의 구축을 위해 선택될 것임을 이해할 것이다. 분리될 수 있는 활성을 나타내는 오쏘로그의 예는 둘 이상의 종 사이에 또는 단일 종 내에서 별개의 활성들이 별개의 유전자 생성물들로 분리된 경우이다. 구체적인 예는 두 가지 유형의 세린 프로테아제 활성인 엘라스타제 단백질분해 및 플라스미노겐 단백질분해가 플라스미노겐 활성제 및 엘라스타제로서 별개의 분자들로 분리되는 것이다. 두 번째 예는 마이코플라스마 5'-3' 엑소뉴클레아제 및 드로소필라 DNA 폴리머라제 Ⅲ 활성의 분리이다. 첫 번째 종 유래의 DNA 폴리머라제는 두 번째 종 유래의 엑소뉴클레아제 또는 폴리머라제 중 하나 또는 둘 모두에 대해 오쏘로그로 간주될 수 있고 반대도 마찬가지다.
그에 반해서, 파라로그는, 예를 들면, 복제 후 진화론적 발산에 의해 관련된 동족체이고, 유사하거나 공통되지만 동일하지 않은 기능을 갖는다. 파라로그는, 예를 들면, 동일한 종 또는 상이한 종으로부터 기원되거나 유래될 수 있다. 예를 들면, 마이크로솜 에폭사이드 가수분해효소(에폭사이드 가수분해효소 I) 및 가용성 에폭사이드 가수분해효소(에폭사이드 가수분해효소 Ⅱ)는 이들이 별개의 반응을 촉매하고 동일한 종에서 별개의 기능을 하는, 공통된 조상으로부터 공-진화된, 2개의 별개의 효소들을 대표하기 때문에, 파라로그로 간주될 수 있다. 파라로그는 서로 상당한 서열 유사성을 갖는 동일한 종 유래의 단백질이며, 이는 이들이 상동이거나, 공통된 조상으로부터 공-진화를 통해 관련된다는 것을 제시한다. 파라로그 단백질 패밀리의 그룹은 HipA 동족체, 루시퍼라아제 유전자, 펩티다아제 등을 포함한다.
비오쏘로그 유전자 치환(nonorthologous gene displacement)은 상이한 종에서의 참조된 유전자 기능을 치환할 수 있는 하나의 종 유래의 비오쏘로그 유전자이다. 치환은, 예를 들면, 상이한 종에서의 참조된 기능과 비교하여 원래의 종에서 실질적으로 동일하거나 유사한 기능을 수행할 수 있는 것을 포함한다. 일반적으로, 비오쏘로그 유전자 치환이 참조된 기능을 코딩하는 공지된 유전자와 구조적으로 관련된 것으로서 확인될 수 있을 것임에도 불구하고, 구조적으로 관련성이 덜하지만 기능적으로 유사한 유전자들 및 이들의 상응하는 유전자 생성물들은 그럼에도 불구하고 본원에 사용된 바와 같은 용어의 의미 내에 여전히 속할 것이다. 기능적 유사성은, 예를 들면, 치환되고자 하는 기능을 코딩하는 유전자와 비교하여 비오쏘로그 유전자 생성물의 활성 부위 또는 결합 영역에서 적어도 일부 구조적 유사성을 요구한다. 따라서, 비오쏘로그 유전자는, 예를 들면, 파라로그 또는 관련성 없는 유전자를 포함한다.
따라서, 세포질 아세틸-CoA 생합성 능력을 갖는 본원에서 제공된 비-천연 진핵 유기체를 확인하고 구축할 때, 당해분야의 숙련가는 본원에서 제공된 교시 및 지침을 특정한 종에 적용하여, 대사 변형의 확인이 오쏘로그의 확인 및 포함 또는 불활성화를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 파라로그 및/또는 비오쏘로그 유전자 치환이 비슷하거나 실질적으로 비슷한 대사 반응을 촉매하는 효소를 코딩하는 참조된 진핵 유기체 내에 존재하는 정도까지, 당해분야의 숙련가는 또한 이들 진화적으로 관련된 유전자들을 이용할 수 있다.
오쏘로그, 파라로그 및 비오쏘로그 유전자 치환은 당해분야의 숙련가에게 잘 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 두 개의 폴리펩타이드에 대한 핵산 또는 아미노산 서열의 조사는 비교된 서열 간의 서열 동일성 및 유사성을 밝힐 것이다. 그러한 유사성에 기초하여, 당해분야의 숙련가는 상기 단백질들이 공통된 조상으로부터의 진화를 통해 관련된다고 보여주기에 상기 유사성이 충분히 높은지 여부를 결정할 수 있다. Align, BLAST, Clustal W 등과 같이 당해분야의 숙련가에게 잘 알려진 알고리즘은 미가공 서열 유사성 또는 동일성을 비교 및 결정하며, 또한 가중치(weight) 또는 스코어로 할당될 수 있는 서열 내의 갭(gap)의 존재 또는 중요성을 결정한다. 그러한 알고리즘은 또한 당해분야에 공지되어 있고, 마찬가지로 뉴클레오타이드 서열 유사성 또는 동일성을 결정하는데 이용가능하다. 관련성을 결정하는 충분한 유사성을 위한 파라미터들은, 통계적 유사성, 또는 랜덤 폴리펩타이드 내 유사한 일치를 찾아낼 가능성, 및 결정된 일치의 중요성을 계산하는 잘 알려진 방법에 기초하여 계산된다. 둘 이상의 서열의 컴퓨터 비교는, 원하는 경우, 또한 당해분야의 숙련가에 의해 시각적으로 최적화될 수 있다. 관련된 유전자 생성물 또는 단백질들은 높은 유사성, 예를 들면, 25% 내지 100% 서열 동일성을 갖는 것으로 예상될 수 있다. 관련없는 단백질들은, 만약 충분한 크기의 데이터베이스가 스캔되면(약 5%), 우연히 발생하는 것으로 예상될 것과 본질적으로 동일한 동일성을 가질 수 있다. 5% 내지 24% 사이의 서열은 비교된 서열들이 관련된다고 결론짓기에 충분한 상동성에 해당하거나 해당하지 않을 수 있다. 데이타 세트의 크기를 고려할 때 그러한 일치의 중요성을 결정하는 부가적인 통계 분석이 이들 서열들의 관련성을 결정하기 위해 수행될 수 있다.
예를 들면, BLAST 알고리즘을 이용한 둘 이상의 서열들의 관련성을 결정하기 위한 예시적인 파라미터들은 하기에 제시된 바와 같을 수 있다. 요약하면, 아미노산 서열 정렬은 BLASTP 버전 2.0.8(Jan-05-1999) 및 하기 파라미터를 이용하여 수행될 수 있다: 매트릭스: 0 BLOSUM62; 갭 오픈(gap open): 11; 갭 확대(gap extension): 1; x_드롭오프(x_dropoff): 50; 예상(expect): 10.0; 단어크기: 3; 필터: on. 핵산 서열 정렬은 BLASTN 버전 2.0.6(Sept-16-1998) 및 하기 파라미터를 이용하여 수행될 수 있다: 일치: 1; 불일치: -2; 갭 오픈: 5; 갭 확대: 2; x_드롭오프: 50; 예상: 10.0; 단어크기: 11; 필터: off. 당해분야의 숙련가는 비교의 엄격함을 증가시키거나 감소시키고, 둘 이상의 서열의 관련성을 결정하기 위해, 상기 파라미터에 변형이 이뤄질 수 있다는 것을 알 것이다.
4.2 세포질 아세틸- CoA 를 이용하는 진핵 유기체
제 1 측면에서, 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 하기를 위한 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다: (i) 상기 유기체의 미토콘드리아 및/또는 페록시솜으로부터 상기 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하고, (ⅱ) 상기 유기체의 세포질에서 아세틸-CoA를 생산하고/거나 (ⅲ) 상기 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시킨다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다: 시트레이트 합성효소; 시트레이트 수송체; 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체; 시트레이트/말레이트 수송체; ATP 시트레이트 분해효소; 시트레이트 분해효소; 아세틸-CoA 합성효소; 옥살로아세테이트 수송체; 세포질 말레이트 탈수소효소; 말레이트 수송체; 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성); 아세틸-CoA 리가제 또는 전이효소; 아세테이트 키나아제; 포스포트랜스아세틸라제; 피루베이트 탈탄산효소; 아세트알데하이드 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성); 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 또는 피루베이트 포르메이트 분해효소; 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화); 트레오닌 알돌라아제; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소; 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소; 세포질 아세틸카르니틴 전이효소; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제; 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제; PEP 카복실라제; PEP 카복시키나아제; 옥살로아세테이트 탈탄산효소; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소 (아세틸화); 아세틸-CoA 카복실라제; 말로닐-CoA 탈탄산효소; 옥살로아세테이트 탈수소효소; 옥살로아세테이트 산화환원효소; 말로닐-CoA 환원효소; 피루베이트 카복실라제; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소; 말로닐-CoA 합성효소; 말로닐-CoA 전이효소; 말산 효소; 말레이트 탈수소효소; 말레이트 산화환원효소; 피루베이트 키나아제; PEP 포스파타제. 그와 같은 유기체는 유익하게는 세포질 아세틸-CoA의 생산를 허용하고, 그 다음, 이것은 세포질 생산 경로를 사용하여 관심 화합물, 예를 들면, 1,3-BDO를 생산하기 위해 유기체에 의해 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 미토콘드리아로부터 상기 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 페록시솜으로부터 상기 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 세포질에서 아세틸-CoA를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 미토콘드리아로부터 아세틸-CoA를 수송하고 상기 유기체의 세포질에서 아세틸-CoA를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 페록시솜으로부터 상기 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하고 상기 유기체의 세포질에서 아세틸-CoA를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 미토콘드리아로부터 아세틸-CoA를 수송하고 상기 유기체의 세포질에서 아세틸-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 페록시솜으로부터 아세틸-CoA를 증가시키고 상기 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다.
제 2 측면에서, 비-자연 발생 진핵 유기체의 미토콘드리아 및/또는 페록시솜으로부터 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는 방법이 제공되고, 이 방법은 비-자연 발생 진핵 유기체의 미토콘드리아 및/또는 페록시솜으로부터 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는 조건 하에서 및 충분한 기간 동안 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체의 미토콘드리아로부터 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는 방법이 본원에서 제공되고, 상기 방법은 비-자연 발생 진핵 유기체의 미토콘드리아로부터 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는 조건 하에서 및 충분한 기간 동안 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 것을 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체의 페록시솜으로부터 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는 방법이 본원에서 제공되고, 이 방법은 비-자연 발생 진핵 유기체의 페록시솜으로부터 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는 조건 하에서 및 충분한 기간 동안 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 것을 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다: 시트레이트 합성효소; 시트레이트 수송체; 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체; 시트레이트/말레이트 수송체; ATP 시트레이트 분해효소; 시트레이트 분해효소; 아세틸-CoA 합성효소; 옥살로아세테이트 수송체; 세포질 말레이트 탈수소효소; 말레이트 수송체; 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성); 아세틸-CoA 리가제 또는 전이효소; 아세테이트 키나아제; 포스포트랜스아세틸라제; 피루베이트 탈탄산효소; 아세트알데하이드 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성); 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 또는 피루베이트 포르메이트 분해효소; 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화); 트레오닌 알돌라아제; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소; 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소이고; 세포질 아세틸카르니틴 전이효소이고; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제이고; 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제이고; PEP 카복실라제이고; PEP 카복시키나아제이고; 옥살로아세테이트 탈탄산효소이고; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소 (아세틸화)이고; 아세틸-CoA 카복실라제이고; 말로닐-CoA 탈탄산효소; 옥살로아세테이트 탈수소효소; 옥살로아세테이트 산화환원효소; 말로닐-CoA 환원효소; 피루베이트 카복실라제; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소; 말로닐-CoA 합성효소; 말로닐-CoA 전이효소; 말산 효소; 말레이트 탈수소효소; 말레이트 산화환원효소; 피루베이트 키나아제; PEP 포스파타제.
또 하나의 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체의 미토콘드리아로부터 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 것을 포함하고, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 미토콘드리아로부터 상기 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다: 시트레이트 합성효소; 시트레이트 수송체; 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체; 시트레이트/말레이트 수송체; ATP 시트레이트 분해효소; 시트레이트 분해효소; 아세틸-CoA 합성효소; 옥살로아세테이트 수송체; 세포질 말레이트 탈수소효소; 말레이트 수송체; 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성); 아세틸-CoA 리가제 또는 전이효소; 아세테이트 키나아제; 포스포트랜스아세틸라제; 피루베이트 탈탄산효소; 아세트알데하이드 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성); 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 또는 피루베이트 포르메이트 분해효소; 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화); 트레오닌 알돌라아제; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소; 세포질 아세틸카르니틴 전이효소; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제.
일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체의 페록시솜으로부터 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는 방법이 본원에세 제공되고, 이 방법은 상기 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 것을 포함하고, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 페록시솜으로부터 상기 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소 및 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다.
제 3 측면에서, 세포질 아세틸-CoA를 생산하는 방법이 본원에서 제공되고, 이 방법은 세포질 아세틸-CoA를 생산하는 조건 하에서 및 충분한 기간 동안 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 유기체는 상기 유기체에서 세포질 아세틸-CoA를 생산하기에 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다: 시트레이트 합성효소; 시트레이트 수송체; 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체; 시트레이트/말레이트 수송체; ATP 시트레이트 분해효소; 시트레이트 분해효소; 아세틸-CoA 합성효소; 옥살로아세테이트 수송체; 세포질 말레이트 탈수소효소; 말레이트 수송체; 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성); 아세틸-CoA 리가제 또는 전이효소; 아세테이트 키나아제; 포스포트랜스아세틸라제; 피루베이트 탈탄산효소; 아세트알데하이드 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성); 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 또는 피루베이트 포르메이트 분해효소; 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화); 트레오닌 알돌라아제; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소; 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소; 세포질 아세틸카르니틴 전이효소; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제; 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제; PEP 카복실라제; PEP 카복시키나아제; 옥살로아세테이트 탈탄산효소; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소 (아세틸화); 아세틸-CoA 카복실라제; 말로닐-CoA 탈탄산효소; 옥살로아세테이트 탈수소효소; 옥살로아세테이트 산화환원효소; 말로닐-CoA 환원효소; 피루베이트 카복실라제; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소; 말로닐-CoA 합성효소; 말로닐-CoA 전이효소; 말산 효소; 말레이트 탈수소효소; 말레이트 산화환원효소; 피루베이트 키나아제; PEP 포스파타제.
제4 측면에서, 비-자연 발생 진핵 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는 방법이 본원에서 제공되고, 이 방법은 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는 조건 하에서 및 충분한 기간 동안 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 유기체는 상기 비-자연 발생 진핵 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키기에 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다: 시트레이트 합성효소; 시트레이트 수송체; 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체; 시트레이트/말레이트 수송체; ATP 시트레이트 분해효소; 시트레이트 분해효소; 아세틸-CoA 합성효소; 옥살로아세테이트 수송체; 세포질 말레이트 탈수소효소; 말레이트 수송체; 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성); 아세틸-CoA 리가제 또는 전이효소; 아세테이트 키나아제; 포스포트랜스아세틸라제; 피루베이트 탈탄산효소; 아세트알데하이드 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성); 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 또는 피루베이트 포르메이트 분해효소; 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화); 트레오닌 알돌라아제; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소; 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소; 세포질 아세틸카르니틴 전이효소; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제; 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제; PEP 카복실라제; PEP 카복시키나아제; 옥살로아세테이트 탈탄산효소; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소 (아세틸화); 아세틸-CoA 카복실라제; 말로닐-CoA 탈탄산효소; 옥살로아세테이트 탈수소효소; 옥살로아세테이트 산화환원효소; 말로닐-CoA 환원효소; 피루베이트 카복실라제; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소; 말로닐-CoA 합성효소; 말로닐-CoA 전이효소; 말산 효소; 말레이트 탈수소효소; 말레이트 산화환원효소; 피루베이트 키나아제; PEP 포스파타제.
많은 진핵 유기체에서, 아세틸-CoA는 미토콘드리아에서 피루베이트 탈수소효소에 의해 주로 합성된다 (도 1). 미토콘드리아로부터 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는 기전은, 예를 들면, 아세틸-CoA에서 유래하는 세포질 1,3-BDO 생산 경로의 배치를 가능하게 할 수 있다. 아세틸-CoA를 수송하는 예시적인 기전은 도 2, 3 및 8에서 묘사된 것을 포함하고, 이것은 미토콘드리아에서 아세틸-CoA 및 옥살로아세테이트로부터 시트레이트를 형성하고, 미토콘드리아로부터 사이토졸로 시트레이트를 수송하고, 시트레이트를 옥살로아세테이트 및 아세테이트 또는 아세틸-CoA로 전환하는 것을 수반한다. 어떤 구현예에서, 도 2, 3 및 8 중 하나에서 묘사된 변환을 수행할 수 있는 효소를 도입하여 세포질 아세틸-CoA의 이용가능성을 증가시키기 위해 진핵 유기체를 조작하는 방법이 본원에서 제공된다. 필요한 변환을 수행할 수 있는 예시적인 효소는 또한 본원에서 개시되어 있다.
세포 소기관, 예컨대 페록시솜 및 미토콘드리아에서 국한된 아세틸-CoA는 담체 단백질, 예컨대 카르니틴 또는 다른 아세틸 담체의 도움으로 사이토졸로 또한 수송될 수 있다. 본원에서 제공된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 소기관 막, 예컨대 미토콘드리아 또는 페록시솜 막을 가로지느는 아세틴 단위의 전좌는 담체 분자 또는 아실-CoA 수송체를 이용한다. 예시적인 아세틸 담체 분자는 카르니틴이다. 다른 예시적인 아세틸 담체 분자 또는 수송체는 글루타메이트, 피루베이트, 이미다졸 및 글루코사민을 포함한다.
담체 단백질을 이용하여 세포 소기관 예컨대 페록시솜 및 미토콘드리아에서 국한된 아세틸-CoA를 사이토졸로 수송하는 기전은, 예를 들면, 아세틸-CoA에서 유래하는 세포질 1,3-BDO 생산 경로의 배치를 가능하게 한다. 예시적인 아세틸카르니틴 전좌 경로는 도 6에서 묘사된다. 하나의 경로에서, 미토콘드리아 아세틸-CoA는 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소에 의해 아세틸카르니틴으로 전환된다. 그 다음 미토콘드리아 아세틸카르니틴은 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제에 의해 사이토졸로 미토콘드리아 막을 가로 질로 전위될 수 있고, 그 다음 세포질 아세틸카르니틴 전이효소에 의해 세포질 아세틸-CoA로 전환될 수 있다. 또 하나의 경로에서, 페록시솜 아세틸-CoA는 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소에 의해 아세틸카르니틴으로 전환된다. 그 다음 페록시솜 아세틸카르니틴은 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제에 의해 사이토졸로 페록시솜 막을 가로 질러 전위될 수 있고, 그 다음 세포질 아세틸카르니틴 전이효소에 의해 세포질 아세틸-CoA로 전환될 수 있다.
세포질 피루베이트 및 트레오닌을 세포질 아세틸-CoA로 전환하는 경로는, 예를 들면, 아세틸-CoA에서 유래하는 세포질 1,3-BDO 생산 경로의 배치를 가능하게 한다. 몇 개의 공지된 경로 외에, 도 5는 세포질 피루베이트를 세포질 아세틸-CoA로 전환하는 4 개의 신규 예시적인 경로를 묘사한다. 하나의 경로에서, 피루베이트는 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성)에 의해 아세테이트로 전환된다. 아세테이트는 차후에 직접적으로, 아세틸-CoA 합성효소, 리가제 또는 전이효소에 의해, 또는 간접적으로 아세틸-포스페이트 중간체를 통해 아세틸-CoA로 전환된다. 대안적인 경로에서, 피루베이트는 피루베이트 탈탄산효소에 의해 아세트알데하이드로 탈카복실레이트된다. 아세트알데하이드 탈수소효소는 아세트알데하이드를 아세테이트로 산화시킨다. 그 다음 아세테이트는 아세테이트 키나아제 및 포스포트랜스아세틸라제에 의해 아세틸-CoA로 전환된다. 또 하나의 경로에서, 피루베이트는 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성)에 의해 아세틸포스페이트로 산화된다. 그 다음 포스포트랜스아세틸라제는 아세틸포스페이트를 아세틸-CoA로 전환시킨다. 필요한 변환을 수행할 수 있는 예시적인 효소는 또한 본원에 개시되어 있다.
세포질 포스포에놀피루베이트 (PEP) 및 피루베이트를 세포질 아세틸-CoA로 전환하는 경로는, 예를 들면, 아세틸-CoA로부터 세포질 1,3-BDO 생산 경로의 배치를 가능하게 한다. 도 10은 세포질 PEP 및 피루베이트를 세포질 아세틸-CoA로 전환하는 12 개의 예시적인 경로를 묘사한다. 하나의 경로에서, PEP 카복실라제 또는 PEP 카복시키나아제는 PEP를 옥살로아세테이트로 전환시키고 (단계 A); 옥살로아세테이트 탈탄산효소는 옥살로아세테이트를 말로네이트로 전환시키고 (단계 B); 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소 (아세틸화)는 말로네이트 세미알데하이드를 아세틸-CoA로 전환시킨다 (단계 C). 또 하나의 경로에서 피루베이트 키나아제 또는 PEP 포스파타제는 PEP를 피루베이트로 전환시키고 (단계 N); 피루베이트 카복실라제는 피루베이트를로 전환시키고 (단계 H); 옥살로아세테이트 탈탄산효소는 옥살로아세테이트를 말로네이트로 전환시키고 (단계 B); 및 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소 (아세틸화)는 말로네이트 세미알데하이드를 아세틸-CoA로 전환시킨다 (단계 C). 또 하나의 경로에서 피루베이트 키나아제 또는 PEP 포스파타제는 PEP를 피루베이트로 전환시키고 (단계 N); 말산 효소는 피루베이트를 말레이트로 전환시키고 (단계 L); 말레이트 탈수소효소 또는 산화환원효소는 말레이트를 옥살로아세테이트로 전환시키고 (단계 M); 옥살로아세테이트 탈탄산효소는 옥살로아세테이트를 말로네이트로 전환시키고 (단계 B); 및 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소 (아세틸화)는 말로네이트 세미알데하이드를 아세틸-CoA로 전환시킨다 (단계 C). 또 하나의 경로에서, PEP 카복실라제 또는 PEP 카복시키나아제는 PEP를 옥살로아세테이트로 전환시키고 (단계 A); 옥살로아세테이트 탈탄산효소는 옥살로아세테이트를 말로네이트 세미알데하이드로 전환시키고 (단계 B); 말로닐-CoA 환원효소는 말로네이트 세미알데하이드를 말로닐-CoA로 전환시키고 (단계 G); 및 말로닐-CoA 탈탄산효소는 말로닐-CoA를 아세틸-CoA로 전환시킨다 (단계 (D). 또 하나의 경로에서, 피루베이트 키나아제 또는 PEP 포스파타제는 PEP를 피루베이트로 전환시키고 (단계 N); 피루베이트 카복실라제는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키고 (단계 H); (옥살로아세테이트 탈탄산효소는 옥살로아세테이트를 말로네이트 세미알데하이드로 전환시키고 (단계 B); 말로닐-CoA 환원효소는 말로네이트 세미알데하이드를 말로닐-CoA로 전환시키고 (단계 G); 및 말로닐-CoA 탈탄산효소는 말로닐-CoA를 아세틸-CoA로 전환시킨다 (단계 (D). 또 하나의 경로에서, 피루베이트 키나아제 또는 PEP 포스파타제는 PEP를 피루베이트로 전환시키고 (단계 N); 말산 효소는 피루베이트를 말레이트로 전환시키고 (단계 L); 말레이트 탈수소효소 또는 산화환원효소는 말레이트를 옥살로아세테이트로 전환시키고 (단계 M); 옥살로아세테이트 탈탄산효소는 옥살로아세테이트를 말로네이트 세미알데하이드로 전환시키고 (단계 B); 말로닐-CoA 환원효소는 말로네이트 세미알데하이드를 말로닐-CoA로 전환시키고 (단계 G); 및 말로닐-CoA 탈탄산효소는 말로닐-CoA를 아세틸-CoA로 전환시킨다 (단계 (D). 또 하나의 경로에서, PEP 카복실라제 또는 PEP 카복시키나아제는 PEP를 옥살로아세테이트로 전환시키고 (단계 A); 옥살로아세테이트 탈탄산효소는 옥살로아세테이트를 말로네이트 세미알데하이드로 전환시키고 (단계 B); 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소는 말로네이트 세미알데하이드를 말로네이트로 전환시키고 (단계 J); 말로닐-CoA 합성효소 또는 전이효소는 말로네이트를 말로닐-CoA로 전환시키고 (단계 K); 및 말로닐-CoA 탈탄산효소는 말로닐-CoA를 아세틸-CoA로 전환시킨다 (단계 D). 또 하나의 경로에서, 피루베이트 키나아제 또는 PEP 포스파타제는 PEP를 피루베이트로 전환시키고 (단계 N); 피루베이트 카복실라제는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키고 (단계 H); 옥살로아세테이트 탈탄산효소는 옥살로아세테이트를 말로네이트 세미알데하이드로 전환시키고 (단계 B); 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소는 말로네이트 세미알데하이드를 말로네이트로 전환시키고 (단계 J); 말로닐-CoA 합성효소 또는 전이효소는 말로네이트를 말로닐-CoA로 전환시키고 (단계 K); 및 말로닐-CoA 탈탄산효소는 말로닐-CoA를 아세틸-CoA로 전환시킨다 (단계 D). 또 하나의 경로에서, 피루베이트 키나아제 또는 PEP 포스파타제는 PEP를 피루베이트로 전환시키고 (단계 N); 말산 효소는 피루베이트를 말레이트로 전환시키고 (단계 L); 말레이트 탈수소효소 또는 산화환원효소는 말레이트를 옥살로아세테이트로 전환시키고 (단계 M); 옥살로아세테이트 탈탄산효소는 옥살로아세테이트를 말로네이트 세미알데하이드로 전환시키고 (단계 B); 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소는 말로네이트 세미알데하이드를 말로네이트로 전환시키고 (단계 J); 말로닐-CoA 합성효소 또는 전이효소는 말로네이트를 말로닐-CoA로 전환시키고 (단계 K); 및 말로닐-CoA 탈탄산효소는 말로닐-CoA를 아세틸-CoA로 전환시킨다 (단계 D). 또 하나의 경로에서, PEP 카복실라제 또는 PEP 카복시키나아제는 PEP를 옥살로아세테이트로 전환시키고 (단계 A); 옥살로아세테이트 탈수소효소 또는 옥살로아세테이트 산화환원효소는 옥살로아세테이트를 말로닐-CoA로 전환시키고 (단계 F); 및 말로닐-CoA 탈탄산효소는 말로닐-CoA를 아세틸-CoA로 전환시킨다 (단계 D). 또 하나의 경로에서, 피루베이트 키나아제 또는 PEP 포스파타제는 PEP를 피루베이트로 전환시키고 (단계 N); 피루베이트 카복실라제는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키고 (단계 H); 옥살로아세테이트 탈수소효소 또는 옥살로아세테이트 산화환원효소는 옥살로아세테이트를 말로닐-CoA로 전환시키고 (단계 F); 및 말로닐-CoA 탈탄산효소는 말로닐-CoA를 아세틸-CoA로 전환시킨다 (단계 D). 또 하나의 경로에서, 피루베이트 키나아제 또는 PEP 포스파타제는 PEP를 피루베이트로 전환시키고 (단계 N); 말산 효소는 피루베이트를 말레이트로 전환시키고 (단계 L); 말레이트 탈수소효소 또는 산화환원효소는 말레이트를 옥살로아세테이트로 전환시키고 (단계 M); 옥살로아세테이트 탈수소효소 또는 옥살로아세테이트 산화환원효소는 옥살로아세테이트를 말로닐-CoA로 전환시키고 (단계 F); 및 말로닐-CoA 탈탄산효소는 말로닐-CoA를 아세틸-CoA로 전환시킨다 (단계 D).
어떤 구현예에서, 본원에서 제공된 임의의 경로 (예를 들면, 아세틸-CoA 및/또는 1,3-BDO 경로)는, 예를 들면, 도 4, 7 또는 10에서 예시된 바와 같이 아세틸-CoA의 아세토아세틸-CoA로의 전환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 경로는 아세토아세틸-CoA 티올라제를 포함하고, 이것은 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시킨다 (도 4, 단계 A; 도 7, 단계 A; 도 10, 단계 I). 또 하나의 구현예에서, 상기 경로는 아세틸-CoA 카복실라제를 포함하고, 이것은 아세틸-CoA를 말로닐-CoA로 전환시키고 (도 7, 단계 E; 도 10, 단계 D)이고; 아세토아세틸-CoA 합성효소를 포함하고, 이것은 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시킨다 (도 7, 단계 F; 도 10, 단계 E)를 포함한다.
어떤 구현예에서, 본원에서 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체는 세포질 아세틸-CoA의 생산을 위해 아세틸-CoA 경로를 인코딩하는 유전자를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 아세틸 CoA 경로의 성공적인 조작은 충분한 활성 및 특이성을 갖는 적절한 세트의 효소를 확인하고, 상응하는 유전자를 생산 숙주로 클로닝하고, 미토콘드리아 아세틸-CoA의 세포질 아세틸-CoA로의 전환을 위한 배양 조건을 최적화하고, 수송 다음의 세포질 아세틸-CoA의 생산 또는 그 수준의 증가를 검정하는 것을 수반한다.
미토콘드리아 또는 페록시솜 아세틸-CoA 로부터의 세포질 아세틸-CoA의 생산은, 예를 들면, 약 2 내지 5 개의 효소 단계에서 수많은 경로에 의해 달성될 수 있다. 하나의 예시적인 경로에서, 미토콘드리아 아세틸-CoA 및 옥살로아세테이트는 시트레이트 합성효소에 의해 시트레이트에 조합되고 시트레이트 또는 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체에 의해 미토콘드리아 밖으로 수송된다 (참고, 예를 들면, 도 2). 사이토졸에서 시트레이트의 효소 전환으로 세포질 아세틸-CoA 및 옥살로아세테이트가 생긴다. 그 다음 세포질 옥살로아세테이트는 옥살로아세테이트 수송체 및/또는 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체에 의해 미토콘드리아로 선택적으로 역수송될 수 있다. 또 하나의 예시적인 경로에서, 세포질 옥살로아세테이트는 먼저 사이토졸에서 말레이트로 효소적으로 전환되고 그 다음 말레이트 수송체 및/또는 말레이트/시트레이트 수송체에 의해 미토콘드리아로 선택적으로 이동된다 (참고, 예를 들면, 도 3). 그 다음 미토콘드리아 말레이트는 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소로 옥살로아세테이트로 전환될 수 있다. 또 하나의 예시적인 경로에서, 미토콘드리아 아세틸-CoA는 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소에 의해 아세틸카르니틴으로 전환된다. 그 다음 미토콘드리아 아세틸카르니틴은 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제에 의해 사이토졸로 미토콘드리아 막을 가로 질러 전위될 수 있고, 그 다음 세포질 아세틸카르니틴 전이효소에 의해 세포질 아세틸-CoA로 전환된다. 또 하나의 예시적인 경로에서, 페록시솜 아세틸-CoA는 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소에 의해 아세틸카르니틴으로 전환된다. 그 다음 페록시솜 아세틸카르니틴 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제에 의해 사이토졸로 페록시솜을 가로 질러 전위될 수 있고, 그 다음 세포질 아세틸카르니틴 전이효소에 의해 세포질 아세틸-CoA로 전환된다.
세포질 피루베이트로부터의 세포질 아세틸-CoA의 생산은, 예를 들면, 약 2 내지 4 개의 효소 단계로 수많은 경로에 의해 달성될 수 있고 예시적인 경로는 묘사된 in 도 5. 하나의 경로에서, 피루베이트는 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성)에 의해 아세테이트로 전환된다. 아세테이트는 차후에 직접적으로, 아세틸-CoA 합성효소, 리가제 또는 전이효소에 의해, 또는 간접적으로 아세틸-포스페이트 중간체를 통해 아세틸-CoA로 전환된다. 대안적인 경로에서, 피루베이트는 피루베이트 탈탄산효소에 의해 아세트알데하이드로 탈카복실레이트된다. 아세트알데하이드 탈수소효소는 아세트알데하이드를 아세테이트로 산화시킨다. 그 다음 아세테이트는 아세테이트 키나아제 및 포스포트랜스아세틸라제 에 의해 아세틸-CoA로 전환된다. 또 하나의 경로에서, 피루베이트는 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성) 에 의해 아세틸포스페이트로 산화된다. 그 다음 포스포트랜스아세틸라제는 아세틸포스페이트를 아세틸-CoA로 전환시킨다. 세포질 피루베이트의 아세틸-CoA로의 전환을 위한 다른 예시적인 경로는 도 10에서 묘사된다.
상기에서 논의된 바와 같이, 미토콘드리아 아세틸-CoA를 세포질 아세틸-CoA로 전환시키고 진핵 유기체 내의 세포질 아세틸-CoA의 수준을 증가시키는 방법은 세포질 아세틸-CoA를 개시 물질로서 사용하는 세포질 생산 경로를 통해 1,3-BDO를 포함하는 산업적 관심의 몇 개의 화합물의 세포질 생산을 허용한다. 어떤 구현예에서, 본원에서 제공된 유기체는 세포질 아세틸-CoA를 개시 물질로서 사용하는 화합물의 생산을 위한 생합성 과정을 추가로 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 화합물은 1,3-BDO이다.
미생물은 1,3-BDO를 포함하는 아세틸-CoA를 사용하는 산업적 관심의 몇 개의 화합물을 생산하기 위해 조작될 수 있다. 따라서, 상품 화학물질, 예컨대 1,3-부탄디올을 생산하기 위해 조작될 수 있는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다. 1,3-BDO는 수화를 통해 아세틸렌으로부터 전통적으로 생산된4 개의 탄소 디올이다. 그 다음, 수득한 아세트알데하이드는 3-하이드록시부티르알데하이드로 전환되고, 이것은 차후에 환원되어 1,3-BDO를 형성한다. 더 최근에, 아세틸렌은 아세트알데하이드의 공급원으로서 덜 비싼 에틸렌에 의해 대체되었다. 1,3-BDO는 식품 풍미제를 위한 유기 용매로서 통상적으로 사용된다. 폴리우레탄 및 폴리에스테르 수지를 코-모노머로서 또한 사용되고 혈당강하제로서 널리 이용된다. 광학 활성 1,3-BDO는 생물학적 활성 화합물 및 액체 결정의 합성을 위한 유용한 개시 물질이다. 1,3-BDO의 실질적인 상업적 사용은 차후에 탈수되어 1,3-부타디엔을 얻는 것이다 (Ichikawa 등, J. of Molecular Catalysis A- Chemical , 256:106-112 (2006); Ichikawa 등, J. of Molecular Catalysis A- Chemical , 231:181-189 (2005)), 합성 고무 (예를 들면, 타이어), 라텍스, 및 수지를 제조하기 위해 사용된 250 억 lb/yr 석유화학물질. 1,3-BDO의 생산을 위한 석유계 공급원료에 대한 신뢰는 재생가능한 공급원료를 사용하여 1,3-BDO 및 부타디엔을 생산하는 대안적인 경로의 개발을 보장한다.
도 4는 아세틸-CoA로부터 1,3-BDO를 생산하기 위해 사용될 수 있는 개시 물질로서 아세틸-CoA를 사용하는 다양한 예시적인 경로를 묘사한다. 어떤 구현예에서, 도 4의 1.3-BDO 경로(들)에서 묘사된 아세토아세틸-CoA는 예를 들면 도 7 (단계 E 및 F) 또는 도 9에서 묘사된 바와 같이 아세토아세틸-CoA 합성효소에 의해 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA로부터 합성되고, 여기서 아세틸-CoA는 아세틸-CoA 카복실라제에 의해 말로닐-CoA로 전환되고, 아세토아세틸-CoA는 아세토아세틸-CoA 합성효소에 의해 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA로부터 합성된다.
사이토졸에서 1,3-BDO 생산은 필요한 전구체를 생산하기 위해 원상태 세포 기구에 의존한다. 도 4에서 보여진 바와 같이, 아세틸 CoA는 1,3-BDO의 생산을 위해 탄소 전구체를 제공할 수 있다. 따라서, 고농도의 세포질 아세틸-CoA를 생산할 수 있는 아세틸-CoA 경로는 아세틸-CoA에서 유래하는 세포질 1,3-BDO 생산 경로의 가능한 배치에 대해 바람직하다.
본원에서 제공된 어떤 아세틸-CoA 경로에서, 아세틸-CoA는 피루베이트 또는 트레오닌 전구체로부터 사이토존에서 합성된다 (도 5). 본원에서 제공된 다른 아세틸-CoA 경로에서, 아세틸-CoA는 포스포에놀피루베이트 (PEP) 또는 피루베이트로부터 사이토졸에서 합성된다 (도 10). 본원에서 제공된 다른 아세틸-CoA 경로에서, 아세틸-CoA는 세포 구획에서 합성되고 직접적으로 또는 간접적으로 사이토졸로 수송된다. 미토콘드리아 또는 페록시솜으로부터 사이토졸로 아세틸 단위를 수송하기 위한 하나의 예시적인 기전은 카르니틴 셔틀이다 (도 6). 또 하나의 예시적인 기전은 미토콘드리아 아세틸-CoA를 대사 중간체 예컨대 시트레이트 또는 시트라말레이트로 전환시키고, 그 중간체를 사이토졸로 수송하고, 그 다음 아세틸-CoA를 재생하는 것을 수반한다 (참고 도 2, 3 및 8). 예시적인 아세틸-CoA 경로 및 상응하는 효소는 하기에서 추가로 상세히 및 실시예 I-Ⅲ에서 기재되어 있다.
따라서, 또 하나의 측면에서, 하기 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 상기 유기체가, (i) 상기 유기체의 미토콘드리아 및/또는 페록시솜으로부터 상기 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하고, (ⅱ) 상기 유기체의 세포질에서 아세틸-CoA를 생산하고/거나 (ⅲ) 상기 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 아세틸-CoA 경로, 및 (2) 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로. 어떤 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다: 시트레이트 합성효소; 시트레이트 수송체; 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체; 시트레이트/말레이트 수송체; ATP 시트레이트 분해효소; 시트레이트 분해효소; 아세틸-CoA 합성효소; 옥살로아세테이트 수송체; 세포질 말레이트 탈수소효소; 말레이트 수송체; 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성); 아세틸-CoA 리가제 또는 전이효소; 아세테이트 키나아제; 포스포트랜스아세틸라제; 피루베이트 탈탄산효소; 아세트알데하이드 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성); 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 또는 피루베이트 포르메이트 분해효소; 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화); 트레오닌 알돌라아제; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소; 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소; 세포질 아세틸카르니틴 전이효소; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제; 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제; PEP 카복실라제; PEP 카복시키나아제; 옥살로아세테이트 탈탄산효소; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소 (아세틸화); 아세틸-CoA 카복실라제; 말로닐-CoA 탈탄산효소; 옥살로아세테이트 탈수소효소; 옥살로아세테이트 산화환원효소; 말로닐-CoA 환원효소; 피루베이트 카복실라제; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소; 말로닐-CoA 합성효소; 말로닐-CoA 전이효소; 말산 효소; 말레이트 탈수소효소; 말레이트 산화환원효소; 피루베이트 키나아제; PEP 포스파타제; 및/또는 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다: 아세토아세틸-CoA 티올라제; 아세틸-CoA 카복실라제; 아세토아세틸-CoA 합성효소; 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성); 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원); 4-하이드록시,2-부타논 환원효소; 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성); 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원); 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소; 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원); 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성); 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성); 아세토아세틸-CoA 전이효소, 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 아세토아세틸-CoA 합성효소, 또는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제; 아세토아세테이트 환원효소; 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소, 가수분해효소, 또는 합성효소; 3-하이드록시부티레이트 환원효소; 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소.
아세틸-CoA 경로를 포함하고 아세틸-CoA 경로 효소, 예컨대 본원에서 제공된 것을 포함하도록 조작된 임의의 비-자연 발생 진핵 유기체는 하나 이상의 1,3-BDO 경로 효소, 예컨대 본원에서 제공된 것을 추가로 포함하도록 조작될 수 있다.
또한 1,3-BDO를 생산하는 방법이 본원에서 제공되고, 이 방법은 1,3-BDO를 생산하는 조건 하에서 및 충분한 기간 동안1,3-BDO 경로를 포함하는 본원에서 제공된 유기체의 어떤 것을 배양하는 것을 포함한다. 본원에서 기재된 유기체 및 방법에 의해 생산된 1,3-BDO의 탈수로, 소규모 최종-사용 설비에서 재생가능한 부타디엔을 생산하는 기회를 제공하고, 이것은 이러한 가연성 및 반응성 화학물질을 수송할 필요를 제거한다.
제6 측면에서, 1,3-BDO를 생산하는 방법이 본원에서 제공되고, 이 방법은 1,3-BDO를 생산하는 조건 하에서 및 충분한 기간 동안 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 것을 포함하고, 여기서 상기 비-자연 발생 진핵 유기체는 (1) 아세틸-CoA 경로; 및 (2) 1,3-BDO 경로를 포함한다. 어떤 구현예에서, 1,3-BDO를 생산하는 방법이 본원에서 제공되고, 이 방법은 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 것을 포함한다: (1) 상기 유기체가, (i) 상기 유기체의 미토콘드리아 및/또는 페록시솜으로부터 상기 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하고, (ⅱ) 상기 유기체의 세포질에서 아세틸-CoA를 생산하고/거나 (ⅲ) 상기 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 아세틸-CoA 경로; 및 (2) 상기 유기체가 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로. 어떤 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다: 시트레이트 합성효소; 시트레이트 수송체; 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체; 시트레이트/말레이트 수송체; ATP 시트레이트 분해효소; 시트레이트 분해효소; 아세틸-CoA 합성효소; 옥살로아세테이트 수송체; 세포질 말레이트 탈수소효소; 말레이트 수송체; 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성); 아세틸-CoA 리가제 또는 전이효소; 아세테이트 키나아제; 포스포트랜스아세틸라제; 피루베이트 탈탄산효소; 아세트알데하이드 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성); 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 또는 피루베이트 포르메이트 분해효소; 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화); 트레오닌 알돌라아제; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소; 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소; 세포질 아세틸카르니틴 전이효소; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제; 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제; PEP 카복실라제; PEP 카복시키나아제; 옥살로아세테이트 탈탄산효소; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소 (아세틸화); 아세틸-CoA 카복실라제; 말로닐-CoA 탈탄산효소; 옥살로아세테이트 탈수소효소; 옥살로아세테이트 산화환원효소; 말로닐-CoA 환원효소; 피루베이트 카복실라제; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소; 말로닐-CoA 합성효소; 말로닐-CoA 전이효소; 말산 효소; 말레이트 탈수소효소; 말레이트 산화환원효소; 피루베이트 키나아제; PEP 포스파타제; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다: 아세토아세틸-CoA 티올라제; 아세틸-CoA 카복실라제; 아세토아세틸-CoA 합성효소; 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성); 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원); 4-하이드록시,2-부타논 환원효소; 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성); 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원); 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소; 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원); 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성); 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성); 아세토아세틸-CoA 전이효소, 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 아세토아세틸-CoA 합성효소, 또는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제; 아세토아세테이트 환원효소; 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소, 가수분해효소, 또는 합성효소; 3-하이드록시부티레이트 환원효소; 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소.
아세틸-CoA 경로를 포함하고 아세틸-CoA 경로 효소, 예컨대 본원에서 제공된 것을 포함하도록 조작된 임의의 비-자연 발생 진핵 유기체는, 하나 이상의 1,3-BDO 경로 효소를 추가로 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 1,3-BDO 경로와 함께 아세틸 CoA 경로의 성공적인 조작은 충분한 활성 및 특이성을 갖는 적절한 세트의 효소를 확인하고, 그것의 상응하는 유전자를 생산 숙주로 클로닝하고, 세포질 아세틸-CoA의 생산 및 1,3-BDO의 생산을 위해 배양 조적을 최적화하고, 1,3-BDO 생성물 형성의 수준의 증가를 검정하는 것을 수반한다.
아세틸-CoA의 1,3-BDO로의 전환은, 예를 들면, 도 4에서 보여진 바와 같이 약 3 내지 6 개의 효소 단계로 수많은 경로에 의해 달성될 수 있다. 도 4는 아세틸-CoA로부터 1,3-BDO를 생산하는 다중 경로를 약술한다. 아세틸-CoA로부터 1,3-BDO로의 각각의 이들 경로는 3 환원 등가물을 이용하고 1 몰의 1,3-BDO / 소비된 글루코오스의 몰의 이론 수율을 제공한다. 다른 탄소 대체물 예컨대 합성가스는 아세토아세틸-CoA의 생산을 위해 또한 사용될 수 있다. 합성가스를 형성하기 위한 글루코오스의 가스화로 1.09 몰의 1,3-BDO / 소비된 글루코오스의 몰의 최대 이론 수율이 생길 것이고, 6 몰의 CO 및 6 몰의 H2는 글루코오스로부터 수득된다는 것을 추정한다
6CO + 6H2 → 1.091 C4H10O2 + 1.636 CO2 + 0.545 H2
본원에서 제공된 방법은 부분적으로, 이들 비-자연 발생 진핵 유기체의 배양을 통해 1,3-BDO를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 기재된 유기체 및 방법에 의해 생산된 1,3-BDO의 탈수는 소규모 최종-사용 설비에서 재생가능한 부타디엔을 생산하는 기회를 제공하고, 이것은 이러한 가연성 및 반응성 화학물질을 수송할 필요를 제거한다.
일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 아세틸-CoA 경로를 포함하고, 여기서 상기 유기체는 (i) 상기 유기체의 미토콘드리아 및/또는 페록시솜으로부터 상기 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하고, (ⅱ) 상기 유기체의 세포질에서 아세틸-CoA를 생산하고/거나 (ⅲ) 상기 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 적어도 하나의 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 아세틸-CoA 경로 효소는 상기 유기체의 미토콘드리아 및/또는 페록시솜으로부터 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는데 충분한 양으로 발현된다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 아세틸-CoA 경로 효소는 상기 유기체에서 세포질 아세틸 CoA를 생산하는데 충분한 양으로 발현된다. 또 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 아세틸-CoA 경로 효소는 상기 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된다.
어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다: 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2K, 2L, 3H, 3I 또는 3J, 또는 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2K, 2L, 3H, 3I 및 3J의 임의의 조합; 여기서 2A는 시트레이트 합성효소이고; 2B는 시트레이트 수송체이고; 2C는 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체 또는 시트레이트/말레이트 수송체이고; 2D는 ATP 시트레이트 분해효소이고; 2E는 시트레이트 분해효소이고; 2F는 아세틸-CoA 합성효소이고; 2G는 옥살로아세테이트 수송체이고; 2K는 아세테이트 키나아제이고; 2L은 포스포트랜스아세틸라제이고; 3H는 세포질 말레이트 탈수소효소이고; 3I는 말레이트 수송체이고; 3J는 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소이다. 일부 구현예에서, 2C는 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체이다. 다른 구현예에서, 2C는 시트레이트/말레이트 수송체이다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 도 2에서 묘사된 아세틸-CoA 경로이다. 다른 구현예에서, 상기 아세틸-CoA 경로는 도 3에서 묘사된 아세틸-CoA 경로이다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함한다. 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸 CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸 CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸 CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3H를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3I를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G 및 3H를 포함한다. 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G 및 3I를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G 및 3J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3H 및 3I를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3H 및 3J를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3I 및 3J를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G, 3H 및 3I를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G, 3H 및 3J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G, 3I 및 3J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3H, 3I 및 3J를 포함한다.
일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2B를 포함한다. 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2C를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2E를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2F를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2K를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2L을 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 3H를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 3I를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 3J를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다: 2A 및 2B; 2A 및 2C; 2A 및 2D; 2A 및 2E; 2A 및 2F; 2A 및 2G; 2A 및 2K; 2A 및 2L; 2A 및 3H; 2A 및 3I; 2A 및 3J; 2B 및 2C; 2B 및 2D; 2B 및 2E; 2B 및 2F; 2B 및 2G; 2B 및 2K; 2B 및 2L; 2B 및 3H; 2B 및 3I; 2B 및 3J; 2C 및 2D; 2C 및 2E; 2C 및 2F; 2C 및 2G; 2C 및 2K; 2C 및 2L; 2C 및 3H; 2C 및 3I; 2C 및 3J; 2D 및 2E; 2D 및 2F; 2D 및 2G; 2D 및 2E; 2D 및 2F; 2D 및 2G; 2D 및 2K; 2D 및 2L; 2D 및 3H; 2D 및 3I; 2D 및 3J; 2E 및 2F; 2E 및 2G; 2E 및 2K; 2E 및 2L; 2E 및 3H; 2E 및 3I; 2E 및 3J; 2F 및 2G; 2F 및 2K; 2F 및 2L; 2F 및 3H; 2F 및 3I; 2F 및 3J; 2G 및 2K; 2G 및 2L; 2G 및 3H; 2G 및 3I; 2G 및 3J; 2K 및 2L; 2K 및 3H; 2K 및 3I; 2K 및 3J; 2L 및 3H; 2L 및 3I; 2L 및 3J; 3H 및 3I; 3H 및 3J; 또는 3I 및 3J. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 2 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 2 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다: 2A, 2B 및 2C; 2A, 2B 및 2D; 2A, 2B 및 2E; 2A, 2B 및 2F; 2A, 2B 및 2G; 2A, 2B 및 2K; 2A, 2B 및 2L; 2A, 2B 및 3H; 2A, 2B 및 3I; 2A, 2B 및 3J; 2A, 2C 및 2D; 2A, 2C 및 2E; 2A, 2C 및 2F; 2A, 2C 및 2G; 2A, 2C 및 2K; 2A, 2C 및 2L; 2A, 2C 및 3H; 2A, 2C 및 3I; 2A, 2C 및 3J; 2A, 2D 및 2E; 2A, 2D 및 2F; 2A, 2D 및 2G; 2A, 2D 및 2K; 2A, 2D 및 2L; 2A, 2D 및 3H; 2A, 2D 및 3I; 2A, 2D 및 3J; 2A, 2E 및 2F; 2A, 2E 및 2G; 2A, 2E 및 2K; 2A, 2E 및 2L; 2A, 2E 및 3H; 2A, 2E 및 3I; 2A, 2E 및 3J; 2A, 2F 및 2G; 2A, 2F 및 2K; 2A, 2F 및 2L; 2A, 2F 및 3H; 2A, 2F 및 3I; 2A, 2F 및 3J; 2B, 2C 및 2D; 2B, 2C 및 2E; 2B, 2C 및 2F; 2B, 2C 및 2G; 2B, 2C 및 2K; 2B, 2C 및 2L; 2B, 2C 및 3H; 2B, 2C 및 3I; 2B, 2C 및 3J; 2B, 2D 및 2E; 2B, 2D 및 2F; 2B, 2D 및 2G; 2B, 2D 및 2K; 2B, 2D 및 2L; 2B, 2D 및 3H; 2B, 2D 및 3I; 2B, 2D 및 3J; 2B, 2E 및 2F; 2B, 2E 및 2G; 2B, 2E 및 2K; 2B, 2E 및 2L; 2B, 2E 및 3H; 2B, 2E 및 3I; 2B, 2E 및 3J; 2B, 2F 및 2G; 2B, 2F 및 2K; 2B, 2F 및 2L; 2B, 2F 및 3H; 2B, 2F 및 3I; 2B, 2F 및 3J; 2B, 2G 및 2K; 2B, 2G 및 2L; 2B, 2G 및 3H; 2B, 2G 및 3I; 2B, 2G 및 3J; 2B, 2K 및 2L; 2B, 2K 및 3H; 2B, 2K 및 3I; 2B, 2K 및 3J; 2B, 2L 및 3H; 2B, 2L 및 3I; 2B, 2L 및 3J; 2C, 2D 및 2E; 2C, 2D 및 2F; 2C, 2D 및 2G; 2C, 2D 및 2K; 2C, 2D 및 2L; 2C, 2D 및 3H; 2C, 2D 및 3I; 2C, 2D 및 3J; 2C, 2E 및 2F; 2C, 2E 및 2G; 2C, 2E 및 2K; 2C, 2E 및 2L; 2C, 2E 및 3H; 2C, 2E 및 3I; 2C, 2E 및 3J; 2C, 2F 및 2G; 2C, 2F 및 2K; 2C, 2F 및 2L; 2C, 2F 및 2G; 2C, 2F 및 2K; 2C, 2F 및 2L; 2C, 2F 및 3H; 2C, 2F 및 3I; 2C, 2F 및 3J; 2D, 2E 및 2F; 2D, 2E 및 2G; 2D, 2E 및 2K; 2D, 2E 및 2L; 2D, 2E 및 3H; 2D, 2E 및 3I; 2D, 2E 및 3J; 2D, 2F 및 2G; 2D, 2F 및 2K; 2D, 2F 및 2L; 2D, 2F 및 3H; 2D, 2F 및 3I; 2D, 2F 및 3J; 2D, 2G 및 2K; 2D, 2G 및 2L; 2D, 2G 및 3H; 2D, 2G 및 3I; 2D, 2G 및 3J; 2D, 2K 및 2L; 2D, 2K 및 3H; 2D, 2K 및 3I; 2D, 2K 및 3J; 2D, 2L 및 3H; 2D, 2L 및 3I; 2D, 2L 및 3J; 2D, 3H 및 3I; 2D, 3H 및 3J; 2D, 3I 및 3J; 2E, 2F 및 2G; 2E, 2F 및 2K; 2E, 2F 및 2L; 2E, 2F 및 3H; 2E, 2F 및 3I; 2E, 2F 및 3J; 2E, 2G 및 2K; 2E, 2G 및 2L; 2E, 2G 및 3H; 2E, 2G 및 3I; 2E, 2G 및 3J; 2K, 2L 및 3H; 2K, 2L 및 3I; 2K, 2L 및 3J; 2K, 3H 및 3I; 2K, 3H 및 3J; 2K, 3I 및 3J; 2L, 3H 및 3I; 2L, 3H 및 3J; 2L, 3I 및 3J; 또는 3H, 3I 및 3J. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 3 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 3 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
어떤 구현예에서, 아세틸 CoA 경로는 하기를 포함한다: 2A, 2B, 2C 및 2D; 2A, 2B, 2C 및 2E; 2A, 2B, 2C 및 2F; 2A, 2B, 2C 및 2G; 2A, 2B, 2C 및 2K; 2A, 2B, 2C 및 2L; 2A, 2B, 2C 및 3H; 2A, 2B, 2C 및 3I; 2A, 2B, 2C 및 3J; 2A, 2B, 2D 및 2E; 2A, 2B, 2D 및 2F; 2A, 2B, 2D 및 2G; 2A, 2B, 2D 및 2K; 2A, 2B, 2D 및 2L; 2A, 2B, 2D 및 3H; 2A, 2B, 2D 및 3I; 2A, 2B, 2D 및 3J; 2A, 2B, 2E 및 2F; 2A, 2B, 2E 및 2G; 2A, 2B, 2E 및 2K; 2A, 2B, 2E 및 2L; 2A, 2B, 2E 및 3H; 2A, 2B, 2E 및 3I; 2A, 2B, 2E 및 3J; 2A, 2B, 2F 및 2G; 2A, 2B, 2F 및 2H; 2A, 2B, 2F 및 2I; 2A, 2B, 2F 및 3H; 2A, 2B, 2F 및 3I; 2A, 2B, 2F 및 3J; 2A, 2B, 2G 및 2K; 2A, 2B, 2G 및 2L; 2A, 2B, 2G 및 3H; 2A, 2B, 2G 및 3I; 2A, 2B, 2G 및 3J; 2A, 2B, 2K 및 2L; 2A, 2B, 2K 및 3H; 2A, 2B, 2K 및 3I; 2A, 2B, 2K 및 3J; 2A, 2B, 2L 및 3H; 2A, 2B, 2L 및 3I; 2A, 2B, 2L 및 3J; 2A, 2B, 3H 및 3I; 2A, 2B, 3H 및 3J; 2A, 2B, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2D 및 2E; 2A, 2C, 2D 및 2F; 2A, 2C, 2D 및 2G; 2A, 2C, 2D 및 2K; 2A, 2C, 2D 및 2L; 2A, 2C, 2D 및 3H; 2A, 2C, 2D 및 3I; 2A, 2C, 2D 및 3J; 2A, 2C, 2E 및 2F; 2A, 2C, 2E 및 2G; 2A, 2C, 2E 및 2K; 2A, 2C, 2E 및 2L; 2A, 2C, 2E 및 3H; 2A, 2C, 2E 및 3I; 2A, 2C, 2E 및 3J; 2A, 2C, 2F 및 2G; 2A, 2C, 2F 및 2K; 2A, 2C, 2F 및 2L; 2A, 2C, 2F 및 3H; 2A, 2C, 2F 및 3I; 2A, 2C, 2F 및 3J; 2A, 2C, 2G 및 2K; 2A, 2C, 2G 및 2L; 2A, 2C, 2G 및 3H; 2A, 2C, 2G 및 3I; 2A, 2C, 2G 및 3J; 2A, 2C, 2K 및 2L; 2A, 2C, 2K 및 3H; 2A, 2C, 2K 및 3I; 2A, 2C, 2K 및 3J; 2A, 2C, 2L 및 3H; 2A, 2C, 2L 및 3I; 2A, 2C, 2L 및 3J; 2A, 2C, 3H 및 3I; 2A, 2C, 3H 및 3J; 2A, 2C, 3I 및 3J; 2A, 2D, 2E 및 2F; 2A, 2D, 2E 및 2G; 2A, 2D, 2E 및 2K; 2A, 2D, 2E 및 2L; 2A, 2D, 2E 및 3H; 2A, 2D, 2E 및 3I; 2A, 2D, 2E 및 3J; 2A, 2D, 2F 및 2G; 2A, 2D, 2F 및 2K; 2A, 2D, 2F 및 2L; 2A, 2D, 2F 및 3H; 2A, 2D, 2F 및 3I; 2A, 2D, 2F 및 3J; 2A, 2D, 2G 및 2K; 2A, 2D, 2G 및 2L; 2A, 2D, 2G 및 3H; 2A, 2D, 2G 및 3I; 2A, 2D, 2G 및 3J; 2A, 2D, 2K 및 2L; 2A, 2D, 2K 및 3H; 2A, 2D, 2K 및 3I; 2A, 2D, 2K 및 3J; 2A, 2D, 2L 및 3H; 2A, 2D, 2L 및 3I; 2A, 2D, 2L 및 3J; 2A, 2D, 3H 및 3I; 2A, 2D, 3H 및 3J; 2A, 2D, 3I 및 3J; 2A, 2E, 2F 및 2G; 2A, 2E, 2F 및 2K; 2A, 2E, 2F 및 2L; 2A, 2E, 2F 및 3H; 2A, 2E, 2F 및 3I; 2A, 2E, 2F 및 3J; 2A, 2E, 2G 및 2K; 2A, 2E, 2G 및 2L; 2A, 2E, 2G 및 3H; 2A, 2E, 2G 및 3I; 2A, 2E, 2G 및 3J; 2A, 2E, 2K 및 2L; 2A, 2E, 2K 및 3H; 2A, 2E, 2K 및 3I; 2A, 2E, 2K 및 3J; 2A, 2E, 2L 및 3H; 2A, 2E, 2L 및 3I; 2A, 2E, 2L 및 3J; 2A, 2E, 3H 및 3I; 2A, 2E, 3H 및 3J; 2A, 2E, 3I 및 3J; 2A, 2F, 2G 및 2K; 2A, 2F, 2G 및 2L; 2A, 2F, 2G 및 3H; 2A, 2F, 2G 및 3I; 2A, 2F, 2G 및 3J; 2A, 2F, 2K 및 2L; 2A, 2F, 2K 및 3H; 2A, 2F, 2K 및 3I; 2A, 2F, 2K 및 3J; 2A, 2F, 2L 및 3H; 2A, 2F, 2L 및 3I; 2A, 2F, 2L 및 3J; 2A, 2F, 3H 및 3I; 2A, 2F, 3H 및 3J; 2A, 2F, 3I 및 3J; 2A, 2G, 2K 및 2L; 2A, 2G, 2K 및 3H; 2A, 2G, 2K 및 3I; 2A, 2G, 2K 및 3J; 2A, 2G, 2L 및 3H; 2A, 2G, 2L 및 3I; 2A, 2G, 2L 및 3J; 2A, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2G, 3I 및 3J; 2A, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2D 및 2E; 2B, 2C, 2D 및 2F; 2B, 2C, 2D 및 2G; 2B, 2C, 2D 및 2K; 2B, 2C, 2D 및 2L; 2B, 2C, 2D 및 3H; 2B, 2C, 2D 및 3I; 2B, 2C, 2D 및 3J; 2B, 2C, 2E 및 2F; 2B, 2C, 2E 및 2G; 2B, 2C, 2E 및 2K; 2B, 2C, 2E 및 2L; 2B, 2C, 2E 및 3H; 2B, 2C, 2E 및 3I; 2B, 2C, 2E 및 3J; 2B, 2C, 2F 및 2G; 2B, 2C, 2F 및 2K; 2B, 2C, 2F 및 2L; 2B, 2C, 2F 및 3H; 2B, 2C, 2F 및 3I; 2B, 2C, 2F 및 3J; 2B, 2C, 2G 및 2K; 2B, 2C, 2G 및 2L; 2B, 2C, 2G 및 3H; 2B, 2C, 2G 및 3I; 2B, 2C, 2G 및 3J; 2B, 2C, 2K 및 2L; 2B, 2C, 2K 및 3H; 2B, 2C, 2K 및 3I; 2B, 2C, 2K 및 3J; 2B, 2C, 2L 및 3H; 2B, 2C, 2L 및 3I; 2B, 2C, 2L 및 3J; 2B, 2C, 3H 및 3I; 2B, 2C, 3H 및 3J; 2B, 2C, 3I 및 3J; 2B, 2D, 2E 및 2F; 2B, 2D, 2E 및 2G; 2B, 2D, 2E 및 2K; 2B, 2D, 2E 및 2L; 2B, 2D, 2E 및 3H; 2B, 2D, 2E 및 3I; 2B, 2D, 2E 및 3J; 2B, 2D, 2F 및 2G; 2B, 2D, 2F 및 2K; 2B, 2D, 2F 및 2L; 2B, 2D, 2F 및 3H; 2B, 2D, 2F 및 3I; 2B, 2D, 2F 및 3J; 2B, 2D, 2G 및 2K; 2B, 2D, 2G 및 2L; 2B, 2D, 2G 및 3H; 2B, 2D, 2G 및 3I; 2B, 2D, 2G 및 3J; 2B, 2D, 2K 및 2L; 2B, 2D, 2K 및 3H; 2B, 2D, 2K 및 3I; 2B, 2D, 2K 및 3J; 2B, 2D, 2L 및 3H; 2B, 2D, 2L 및 3I; 2B, 2D, 2L 및 3J; 2B, 2D, 3H 및 3I; 2B, 2D, 3H 및 3J; 2B, 2D, 3I 및 3J; 2B, 2E, 2F 및 2G; 2B, 2E, 2F 및 2K; 2B, 2E, 2F 및 2L; 2B, 2E, 2F 및 3H; 2B, 2E, 2F 및 3I; 2B, 2E, 2F 및 3J; 2B, 2E, 2G 및 2K; 2B, 2E, 2G 및 2L; 2B, 2E, 2G 및 3H; 2B, 2E, 2G 및 3I; 2B, 2E, 2G 및 3J; 2B, 2E, 2K 및 2L; 2B, 2E, 2K 및 3H; 2B, 2E, 2K 및 3I; 2B, 2E, 2K 및 3J; 2B, 2E, 2L 및 3H; 2B, 2E, 2L 및 3I; 2B, 2E, 2L 및 3J; 2B, 2E, 3H 및 3I; 2B, 2E, 3H 및 3J; 2B, 2E, 3I 및 3J; 2B, 2F, 2G 및 2K; 2B, 2F, 2G 및 2L; 2B, 2F, 2G 및 3H; 2B, 2F, 2G 및 3I; 2B, 2F, 2G 및 3J; 2B, 2F, 2K 및 2L; 2B, 2F, 2K 및 3H; 2B, 2F, 2K 및 3I; 2B, 2F, 2K 및 3J; 2B, 2F, 2L 및 3H; 2B, 2F, 2L 및 3I; 2B, 2F, 2L 및 3J; 2B, 2F, 3H 및 3I; 2B, 2F, 3H 및 3J; 2B, 2F, 3I 및 3J; 2B, 2G, 2K 및 2L; 2B, 2G, 2K 및 3H; 2B, 2G, 2K 및 3I; 2B, 2G, 2K 및 3J; 2B, 2G, 2L 및 3H; 2B, 2G, 2L 및 3I; 2B, 2G, 2L 및 3J; 2B, 2G, 3H 및 3I; 2B, 2G, 3H 및 3J; 2B, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2K, 2L 및 3H; 2B, 2K, 2L 및 3I; 2B, 2K, 2L 및 3J; 2B, 2K, 3H 및 3I; 2B, 2K, 3H 및 3J; 2B, 2K, 3I 및 3J; 2B, 2L, 3H 및 3I; 2B, 2L, 3H 및 3J; 2B, 2L, 3I 및 3J; 2B, 3H, 3I 및 3J; 2C, 2D, 2E 및 2F; 2C, 2D, 2E 및 2G; 2C, 2D, 2E 및 2K; 2C, 2D, 2E 및 2L; 2C, 2D, 2E 및 3H; 2C, 2D, 2E 및 3I; 2C, 2D, 2E 및 3J; 2C, 2D, 2F 및 2G; 2C, 2D, 2F 및 2K; 2C, 2D, 2F 및 2L; 2C, 2D, 2F 및 3H; 2C, 2D, 2F 및 3I; 2C, 2D, 2F 및 3J; 2C, 2D, 2G 및 2K; 2C, 2D, 2G 및 2L; 2C, 2D, 2G 및 3H; 2C, 2D, 2G 및 3I; 2C, 2D, 2G 및 3J; 2C, 2D, 3H 및 3I; 2C, 2D, 2K 및 2L; 2C, 2D, 2K 및 3H; 2C, 2D, 2K 및 3I; 2C, 2D, 2K 및 3J; 2C, 2D, 2L 및 3H; 2C, 2D, 2L 및 3I; 2C, 2D, 2L 및 3J; 2C, 2D, 3H 및 3I; 2C, 2D, 3H 및 3J; 2C, 2D, 3I 및 3J; 2C, 2E, 2F 및 2G; 2C, 2E, 2F 및 2K; 2C, 2E, 2F 및 2L; 2C, 2E, 2F 및 3H; 2C, 2E, 2F 및 3I; 2C, 2E, 2F 및 3J; 2C, 2E, 2G 및 2K; 2C, 2E, 2G 및 2L; 2C, 2E, 2G 및 3H; 2C, 2E, 2G 및 3I; 2C, 2E, 2G 및 3J; 2C, 2E, 2K 및 2L; 2C, 2E, 2K 및 3H; 2C, 2E, 2K 및 3I; 2C, 2E, 2K 및 3J; 2C, 2E, 2L 및 3H; 2C, 2E, 2L 및 3I; 2C, 2E, 2L 및 3J; 2C, 2E, 3H 및 3I; 2C, 2E, 3H 및 3J; 2C, 2E, 3I 및 3J; 2C, 2F, 2G 및 2K; 2C, 2F, 2G 및 2L; 2C, 2F, 2G 및 3H; 2C, 2F, 2G 및 3I; 2C, 2F, 2G 및 3J; 2C, 2F, 2K 및 2L; 2C, 2F, 2K 및 3H; 2C, 2F, 2K 및 3I; 2C, 2F, 2K 및 3J; 2C, 2F, 2L 및 3H; 2C, 2F, 2L 및 3I; 2C, 2F, 2L 및 3J; 2C, 2F, 3H 및 3I; 2C, 2F, 3H 및 3J; 2C, 2F, 3I 및 3J; 2C, 2G, 2K 및 2L; 2C, 2G, 2K 및 3H; 2C, 2G, 2K 및 3I; 2C, 2G, 2K 및 3J; 2C, 2G, 2L 및 3H; 2C, 2G, 2L 및 3I; 2C, 2G, 2L 및 3J; 2C, 2G, 3H 및 3I; 2C, 2G, 3H 및 3J; 2C, 2G, 3I 및 3J; 2C, 2K, 2L 및 3H; 2C, 2K, 2L 및 3I; 2C, 2K, 2L 및 3J; 2C, 2K, 3H 및 3I; 2C, 2K, 3H 및 3J; 2C, 2K, 3I 및 3J; 2C, 2L, 3H 및 3I; 2C, 2L, 3H 및 3J; 2C, 2L, 3I 및 3J; 2C, 3H, 3I 및 3J; 2D, 2E, 2F 및 2G; 2D, 2E, 2F 및 2K; 2D, 2E, 2F 및 2L; 2D, 2E, 2F 및 3H; 2D, 2E, 2F 및 3I; 2D, 2E, 2F 및 3J; 2D, 2E, 2G 및 2K; 2D, 2E, 2G 및 2L; 2D, 2E, 2G 및 3H; 2D, 2E. 2G 및 3I; 2D, 2E, 2G 및 3J; 2D, 2E, 2K 및 2L; 2D, 2E, 2K 및 3H; 2D, 2E. 2K 및 3I; 2D, 2E, 2K 및 3J; 2D, 2E, 2L 및 3H; 2D, 2E. 2L 및 3I; 2D, 2E, 2L 및 3J; 2D, 2E, 3H 및 3I; 2D, 2E, 3H 및 3J; 2D, 2E, 3I 및 3J; 2D, 2F, 2G 및 2K; 2D, 2F, 2G 및 2L; 2D, 2F, 2G 및 3H; 2D, 2F, 2G 및 3I; 2D, 2F, 2G 및 3J; 2D, 2F, 2K 및 2L; 2D, 2F, 2K 및 3H; 2D, 2F, 2K 및 3I; 2D, 2F, 2K 및 3J; 2D, 2F, 2L 및 3H; 2D, 2F, 2L 및 3I; 2D, 2F, 2L 및 3J; 2D, 2F, 3H 및 3I; 2D, 2F, 3H 및 3J; 2D, 2F, 3I 및 3J; 2E, 2F, 2G 및 3H; 2E, 2F, 2G 및 3I; 2E, 2F, 2G 및 3J; 2E, 2F, 3H 및 3I; 2E, 2F, 3H 및 3J; 2E, 2F, 3I 및 3J; 2F, 2G, 3H 및 3I; 2F, 2G, 3H 및 3J; 2F, 2G, 3I 및 3J; 또는 2G, 3H, 3I 및 3J. 2D, 2G, 2K 및 2L; 2D, 2G, 2K 및 3H; 2D, 2G, 2K 및 3I; 2D, 2G, 2K 및 3J; 2D, 2G, 2L 및 3H; 2D, 2G, 2L 및 3I; 2D, 2G, 2L 및 3J; 2D, 2G, 2H 및 3I; 2D, 2G, 2H 및 3J; 2D, 2G, 3I 및 3J; 2D, 2K, 2L 및 3H; 2D, 2K, 2L 및 3I; 2D, 2K, 2L 및 3J; 2D, 2K, 3H 및 3I; 2D, 2K, 3H 및 3J; 2D, 2K, 3I 및 3J; 2D, 2L, 3H 및 3I; 2D, 2L, 3H 및 3J; 2D, 3H, 3I 및 3J; 2D, 3H, 3I 및 3J; 2E, 2F, 2G 및 2K; 2E, 2F, 2G 및 2L; 2E, 2F, 2G 및 3H; 2E, 2F, 2G 및 3I; 2E, 2F, 2G 및 3J; 2E, 2F, 2K 및 2L; 2E, 2F, 2K 및 3H; 2E, 2F, 2K 및 3I; 2E, 2F, 2K 및 3J; 2E, 2F, 2L 및 3H; 2E, 2F, 2L 및 3I; 2E, 2F, 2L 및 3J; 2E, 2F, 3H 및 3I; 2E, 2F, 3H 및 3J; 2E, 2F, 3I 및 3J; 2E, 2G, 2K 및 2L; 2E, 2G, 2K 및 3H; 2E, 2G, 2K 및 3I; 2E, 2G, 2K 및 3J; 2E, 2G, 2L 및 3H; 2E, 2G, 2L 및 3I; 2E, 2G, 2L 및 3J; 2E, 2G, 3H 및 3I; 2E, 2G, 3H 및 3J; 2E, 2G, 3I 및 3J; 2E, 2K, 2L 및 3H; 2E, 2K, 2L 및 3I; 2E, 2K, 2L 및 3J; 2E, 2K, 3H 및 3I; 2E, 2K, 3H 및 3J; 2E, 2K, 3I 및 3J; 2E, 2L, 3H 및 3I; 2E, 2L, 3H 및 3J; 2E, 2L, 3I 및 3J; 2E, 3H, 3I 및 3J. 2F, 2G, 2K 및 2L; 2F, 2G, 2K 및 3H; 2F, 2G, 2K 및 3I; 2F, 2G, 2K 및 3J; 2F, 2G, 2L 및 3H; 2F, 2G, 2L 및 3I; 2F, 2G, 2L 및 3J; 2F, 2G, 3H 및 3I; 2F, 2G, 3H 및 3J; 2F, 2G, 3I 및 3J; 2F, 2K, 2L 및 3H; 2F, 2K, 2L 및 3I; 2F, 2K, 2L 및 3J; 2F, 2K, 3H 및 3I; 2F, 2K, 3H 및 3J; 2F, 2K, 3I 및 3J; 2F, 3H, 3I 및 3J; 2G, 2K, 2L 및 3H; 2G, 2K, 2L 및 3I; 2G, 2K, 2L 및 3J; 2G, 2K, 3H 및 3I; 2G, 2K, 3H 및 3J; 2G, 2K, 3I 및 3J; 2G, 2L, 3H 및 3I; 2G, 2L, 3H 및 3J; 2G, 2L, 3I 및 3J; 2G, 3H, 3I 및 3J; 2K, 2L, 3H 및 3I; 2K, 2L, 3H 및 3J; 2K, 2L, 3I 및 3J; 또는 2L, 3H, 3I 및 3J. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 4 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 4 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
다른 구현예에서, 아세틸 CoA 경로는 하기를 포함한다: 2A, 2B, 2C, 2D 및 2E; 2A, 2B, 2C, 2D 및 2F; 2A, 2B, 2C, 2D 및 2G; 2A, 2B, 2C, 2D 및 3H; 2A, 2B, 2C, 2D 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2D 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F; 2A, 2B, 2C, 2E 및 2G; 2A, 2B, 2C, 2E 및 3H; 2A, 2B, 2C, 2E 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2E 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2F 및 2G; 2A, 2B, 2C, 2F 및 3H; 2A, 2B, 2C, 2F 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2F 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2G 및 3H; 2A, 2B, 2C, 2G 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2G 및 3J; 2A, 2B, 2C, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2C, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2C, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2D, 2E 및 3H; 2A, 2B, 2D, 2E 및 3I; 2A, 2B, 2D, 2E 및 3J; 2A, 2B, 2D, 2F 및 2G; 2A, 2B, 2D, 2F 및 3H; 2A, 2B, 2D, 2F 및 3I; 2A, 2B, 2D, 2F 및 3J; 2A, 2B, 2D, 2G 및 3H; 2A, 2B, 2D, 2G 및 3I; 2A, 2B, 2D, 2G 및 3J; 2A, 2B, 2D, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2D, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2D, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2E, 2F 및 2G; 2A, 2B, 2E, 2F 및 3H; 2A, 2B, 2E, 2F 및 3I; 2A, 2B, 2E, 2F 및 3J; 2A, 2B, 2E, 2G 및 3H; 2A, 2B, 2E, 2G 및 3I; 2A, 2B, 2E, 2G 및 3J; 2A, 2B, 2E, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2E, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2E, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2F, 2G 및 3H; 2A, 2B, 2F, 2G 및 3I; 2A, 2B, 2F, 2G 및 3J; 2A, 2B, 2F, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2F, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2F, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2B, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2E 및 2F; 2A, 2C, 2D, 2E 및 2G; 2A, 2C, 2D, 2E 및 3H; 2A, 2C, 2D, 2E 및 3I; 2A, 2C, 2D, 2E 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2F 및 2G; 2A, 2C, 2D, 2F 및 3H; 2A, 2C, 2D, 2F 및 3I; 2A, 2C, 2D, 2F 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2G 및 3H; 2A, 2C, 2D, 2G 및 3I; 2A, 2C, 2D, 2G 및 3J; 2A, 2C, 2D, 3H 및 3I; 2A, 2C, 2D, 3H 및 3J; 2A, 2C, 2D, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2E, 2F 및 2G; 2A, 2C, 2E, 2F 및 3H; 2A, 2C, 2E, 2F 및 3I; 2A, 2C, 2E, 2F 및 3J; 2A, 2C, 2E, 2G 및 3H; 2A, 2C, 2E, 2G 및 3I; 2A, 2C, 2E, 2G 및 3J; 2A, 2C, 2E, 3H 및 3I; 2A, 2C, 2E, 3H 및 3J; 2A, 2C, 2E, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2F, 2G 및 3H; 2A, 2C, 2F, 2G 및 3I; 2A, 2C, 2F, 2G 및 3J; 2A, 2C, 2F, 3H 및 3I; 2A, 2C, 2F, 3H 및 3J; 2A, 2C, 2F, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2C, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2C, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2C, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2D, 2E, 2F 및 2G; 2A, 2D, 2E, 2F 및 3H; 2A, 2D, 2E, 2F 및 3I; 2A, 2D, 2E, 2F 및 3J; 2A, 2D, 2E, 2G 및 3H; 2A, 2D, 2E, 2G 및 3I; 2A, 2D, 2E, 2G 및 3J; 2A, 2D, 2E, 3H 및 3I; 2A, 2D, 2E, 3H 및 3J; 2A, 2D, 2E, 3I 및 3J; 2A, 2D, 2F, 2G 및 3H; 2A, 2D, 2F, 2G 및 3I; 2A, 2D, 2F, 2G 및 3J; 2A, 2D, 2F, 3H 및 3I; 2A, 2D, 2F, 3H 및 3J; 2A, 2D, 2F, 3I 및 3J; 2A, 2D, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2D, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2D, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2D, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2E, 2F, 2G 및 3H; 2A, 2E, 2F, 2G 및 3I; 2A, 2E, 2F, 2G 및 3J; 2A, 2E, 2F, 3H 및 3I; 2A, 2E, 2F, 3H 및 3J; 2A, 2E, 2F, 3I 및 3J; 2A, 2E, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2E, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2E, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2E, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2E 및 2F; 2B, 2C, 2D, 2E 및 2G; 2B, 2C, 2D, 2E 및 3H; 2B, 2C, 2D, 2E 및 3I; 2B, 2C, 2D, 2E 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2F 및 2G; 2B, 2C, 2D, 2F 및 3H; 2B, 2C, 2D, 2F 및 3I; 2B, 2C, 2D, 2F 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2G 및 3H; 2B, 2C, 2D, 2G 및 3I; 2B, 2C, 2D, 2G 및 3J; 2B, 2C, 2D, 3H 및 3I; 2B, 2C, 2D, 3H 및 3J; 2B, 2C, 2D, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2E, 2F 및 2G; 2B, 2C, 2E, 2F 및 3H; 2B, 2C, 2E, 2F 및 3I; 2B, 2C, 2E, 2F 및 3J; 2B, 2C, 2E, 2G 및 3H; 2B, 2C, 2E, 2G 및 3I; 2B, 2C, 2E, 2G 및 3J; 2B, 2C, 2E, 3H 및 3I; 2B, 2C, 2E, 3H 및 3J; 2B, 2C, 2E, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2F, 2G 및 3H; 2B, 2C, 2F, 2G 및 3I; 2B, 2C, 2F, 2G 및 3J; 2B, 2C, 2F, 3H 및 3I; 2B, 2C, 2F, 3H 및 3J; 2B, 2C, 2F, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2G, 3H 및 3I; 2B, 2C, 2G, 3H 및 3J; 2B, 2C, 2G, 3I 및 3J; 2B, 2C, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2D, 2E, 2F 및 2G; 2B, 2D, 2E, 2F 및 3H; 2B, 2D, 2E, 2F 및 3I; 2B, 2D, 2E, 2F 및 3J; 2B, 2D, 2E, 2G 및 3H; 2B, 2D, 2E, 2G 및 3I; 2B, 2D, 2E, 2G 및 3J; 2B, 2D, 2E, 3H 및 3I; 2B, 2D, 2E, 3H 및 3J; 2B, 2D, 2E, 3I 및 3J; 2B, 2D, 2F, 2G 및 3H; 2B, 2D, 2F, 2G 및 3I; 2B, 2D, 2F, 2G 및 3J; 2B, 2D, 2F, 3H 및 3I; 2B, 2D, 2F, 3H 및 3J; 2B, 2D, 2F, 3I 및 3J; 2B, 2E, 2F, 2G 및 3H; 2B, 2E, 2F, 2G 및 3I; 2B, 2E, 2F, 2G 및 3J; 2B, 2E, 2F, 3H 및 3I; 2B, 2E, 2F, 3H 및 3J; 2B, 2E, 2F, 3I 및 3J; 2B, 2E, 2G, 3H 및 3I; 2B, 2E, 2G, 3H 및 3J; 2B, 2E, 2G, 3I 및 3J; 2B, 2E, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2B, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2B, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2B, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2C, 2D, 2E, 2F 및 3H; 2C, 2D, 2E, 2F 및 3I; 2C, 2D, 2E, 2F 및 3J; 2C, 2D, 2E, 2G 및 3H; 2C, 2D, 2E, 2G 및 3I; 2C, 2D, 2E, 2G 및 3J; 2C, 2D, 2E, 3H 및 3I; 2C, 2D, 2E, 3H 및 3J; 2C, 2D, 2E, 3I 및 3J; 2C, 2D, 2F, 2G 및 3H; 2C, 2D, 2F, 2G 및 3I; 2C, 2D, 2F, 2G 및 3J; 2C, 2D, 2F, 3H 및 3I; 2C, 2D, 2F, 3H 및 3J; 2C, 2D, 2F, 3I 및 3J; 2C, 2D, 2G, 3H 및 3I; 2C, 2D, 2G, 3H 및 3J; 2C, 2D, 2G, 3I 및 3J; 2C, 2D, 3H, 3I 및 3J; 2D, 2E, 2F, 2G 및 3H; 2D, 2E, 2F, 2G 및 3I; 2D, 2E, 2F, 2G 및 3J; 2D, 2E, 2F, 3H 및 3I; 2D, 2E, 2F, 3H 및 3J; 2D, 2E, 2F, 3I 및 3J; 2D, 2E, 2G, 3H 및 3I; 2D, 2E, 2G, 3H 및 3J; 2D, 2E. 2G, 3I 및 3J; 2D, 2E, 3H, 3I 및 3J; 2E, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2E, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2E, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2E, 2F, 3H, 3I 및 3J; 또는 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는, 5 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 5 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
또 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다: 2A, 2B, 2C, 2D, 2E 및 2F; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E 및 2G; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E 및 3H; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2F 및 2G; 2A, 2B, 2C, 2D, 2F 및 3H; 2A, 2B, 2C, 2D, 2F 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2D, 2F 및 3H; 2A, 2B, 2C, 2D, 2G 및 3H; 2A, 2B, 2C, 2D, 2G 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2D, 2G 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2D, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2E, 2F 및 2G; 2A, 2B, 2C, 2E, 2F 및 3H; 2A, 2B, 2C, 2E, 2F 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2E, 2F 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2E, 2G 및 3H; 2A, 2B, 2C, 2E, 2G 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2E, 2G 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2E, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2E, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2E, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2F, 2G 및 3H; 2A, 2B, 2C, 2F, 2G 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2F, 2G 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2F, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2F, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2F, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2D, 2E, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2D, 2E, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2D, 2E, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2D, 2F, 2G 및 3H; 2A, 2B, 2D, 2F, 2G 및 3I; 2A, 2B, 2D, 2F, 2G 및 3J; 2A, 2B, 2D, 2F, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2D, 2F, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2D, 2F, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2D, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2D, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2D, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2D, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2E, 2F, 2G 및 3H; 2A, 2B, 2E, 2F, 2G 및 3I; 2A, 2B, 2E, 2F, 2G 및 3J; 2A, 2B, 2E, 2F, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2E, 2F, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2E, 2F, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2E, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2E, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2E, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2E, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2E, 2F 및 2G; 2A, 2C, 2D, 2E, 2F 및 3H; 2A, 2C, 2D, 2E, 2F 및 3I; 2A, 2C, 2D, 2E, 2F 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2E, 2G 및 3H; 2A, 2C, 2D, 2E, 2G 및 3I; 2A, 2C, 2D, 2E, 2G 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2E, 3H 및 3I; 2A, 2C, 2D, 2E, 3H 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2E, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2F, 2G 및 3H; 2A, 2C, 2D, 2F, 2G 및 3I; 2A, 2C, 2D, 2F, 2G 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2F, 3H 및 3I; 2A, 2C, 2D, 2F, 3H 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2F, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2C, 2D, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2D, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2E, 2F, 2G 및 3H; 2A, 2C, 2E, 2F, 2G 및 3I; 2A, 2C, 2E, 2F, 2G 및 3J; 2A, 2C, 2E, 2F, 3H 및 3I; 2A, 2C, 2E, 2F, 3H 및 3J; 2A, 2C, 2E, 2F, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2E, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2C, 2E, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2C, 2E, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2E, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2C, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2C, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2D, 2E, 2F, 2G 및 3H; 2A, 2D, 2E, 2F, 2G 및 3I; 2A, 2D, 2E, 2F, 2G 및 3J; 2A, 2D, 2E, 2F, 3H 및 3I; 2A, 2D, 2E, 2F, 3H 및 3J; 2A, 2D, 2E, 2F, 3I 및 3J; 2A, 2D, 2E, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2D, 2E, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2D, 2E, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2D, 2E, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2D, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2D, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2D, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2D, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2D, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2E, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2E, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2E, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2E, 2F 및 2G; 2B, 2C, 2D, 2E, 2F 및 3H; 2B, 2C, 2D, 2E, 2F 및 3I; 2B, 2C, 2D, 2E, 2F 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2E, 2G 및 3H; 2B, 2C, 2D, 2E, 2G 및 3I; 2B, 2C, 2D, 2E, 2G 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2E, 3H 및 3I; 2B, 2C, 2D, 2E, 3H 및 3I; 2B, 2C, 2D, 2E, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2F, 2G 및 3H; 2B, 2C, 2D, 2F, 2G 및 3I; 2B, 2C, 2D, 2F, 2G 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2F, 3H 및 3I; 2B, 2C, 2D, 2F, 3H 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2F, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2G, 3H 및 3I; 2B, 2C, 2D, 2G, 3H 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2G, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2D, 3H., 3I 및 3J; 2B, 2C, 2E, 2F, 2G 및 3H; 2B, 2C, 2E, 2F, 2G 및 3I; 2B, 2C, 2E, 2F, 2G 및 3J; 2B, 2C, 2E, 2F, 3H 및 3I; 2B, 2C, 2E, 2F, 3H 및 3J; 2B, 2C, 2E, 2F, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2E, 2G, 3H 및 3I; 2B, 2C, 2E, 2G, 3H 및 3J; 2B, 2C, 2E, 2G, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2E, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2B, 2C, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2B, 2C, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2D, 2E, 2F, 2G 및 3H; 2B, 2D, 2E, 2F, 2G 및 3I; 2B, 2D, 2E, 2F, 2G 및 3J; 2B, 2D, 2E, 2F, 3H 및 3I; 2B, 2D, 2E, 2F, 3H 및 3J; 2B, 2D, 2E, 2F, 3I 및 3J; 2B, 2D, 2E, 2G, 3H 및 3I; 2B, 2D, 2E, 2G, 3H 및 3J; 2B, 2D, 2E, 2G, 3I 및 3J; 2B, 2D, 2E, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2D, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2B, 2D, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2B, 2D, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2B, 2D, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2B, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2B, 2E, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2B, 2E, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2E, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2C, 2D, 2E, 2F, 3H 및 3I; 2C, 2D, 2E, 2F, 3H 및 3J; 2C, 2D, 2E, 2F, 3I 및 3J; 2C, 2D, 2E, 2G, 3H 및 3I; 2C, 2D, 2E, 2G, 3H 및 3J; 2C, 2D, 2E, 2G, 3I 및 3J; 2C, 2D, 2E, 3H, 3I 및 3J; 2C, 2D, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2C, 2D, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2C, 2D, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2C, 2D, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2C, 2D, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2D, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2D, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2D, 2E, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2D, 2E, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2D, 2E, 2G, 3H, 3I 및 3J; 또는 2E, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는, 6 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 6 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다: 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F 및 2G; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F 및 3H; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2G 및 3H; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2G 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2G 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2F, 2G 및 3H; 2A, 2B, 2C, 2D, 2F, 2G 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2D, 2F, 2G 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2F, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2D, 2F, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2F, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2F, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2D, 2F, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2D, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2E, 2F, 2G 및 3H; 2A, 2B, 2C, 2E, 2F, 2G 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2E, 2F, 2G 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2E, 2F, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2E, 2F, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2E, 2F, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2E, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2E, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2E, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2E, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2D, 2E, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2D, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2D, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2D, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2D, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2D, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2E, 2F, 2G., 3I 및 3J; 2A, 2B, 2E, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2E, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G 및 3H; 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G 및 3I; 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 3H 및 3I; 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 3H 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2E, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2C, 2D, 2E, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2E, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2E, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2C, 2D, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2C, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2C, 2E, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2E, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2E, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2D, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2D, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2D, 2E, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2D, 2E, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2D, 2E, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2D, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2E, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G 및 3H; 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G 및 3I; 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 3H 및 3I; 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 3H 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2E, 2G, 3H 및 3I; 2B, 2C, 2D, 2E, 2G, 3H 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2E, 2G, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2E, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2B, 2C, 2D, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2B, 2C, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2B, 2C, 2E, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2E, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2E, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2D, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2B, 2D, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2B, 2D, 2E, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2B, 2D, 2E, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2D, 2E, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2D, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2E, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2C, 2D, 2E, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2C, 2D, 2E, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2C, 2D, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 또는 2D, 2E, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는, 7 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 7 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다: 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G 및 3H; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2D, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2F, 2G. 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2E, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2E, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2E, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2D, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2E, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2E, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2E, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2D, 2E, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2E, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2D, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2B, 2C, 2E, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 또는 2B, 2D, 2E, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는, 8 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 8 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다: 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3I; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 3H 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2D, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2B, 2C, 2E, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J; 또는 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는, 9 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 9 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는, 10 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 10 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I, 5J 또는 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I, 또는 5J의 임의의 조합을 포함하고, 여기서 5A는 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성)이고; 5B는 아세틸-CoA 합성효소, 리가제 또는 전이효소이고; 5C는 아세테이트 키나아제이고; 5D는 포스포트랜스아세틸라제이고; 5E는 피루베이트 탈탄산효소이고; 5F는 아세트알데하이드 탈수소효소이고; 5G는 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성)이고; 5H는 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 또는 피루베이트 포르메이트 분해효소이고; 5I 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화)이고; 5J는 트레오닌 알돌라아제이다. 어떤 구현예에서, 5B는 아세틸-CoA 합성효소이다. 또 하나의 구현예에서, 5B는 아세틸-CoA 리가제이다. 다른 구현예에서, 5B는 아세틸-CoA 전이효소이다. 일부 구현예에서, 5H는 피루베이트 탈수소효소이다. 다른 구현예에서, 5H는 피루베이트:페레독신 산화환원효소이다. 또 다른 구현예에서, 5H는 피루베이트 포르메이트 분해효소가다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 도 5에서 묘사된 아세틸-CoA 경로이다. 특이한 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함한다. 또 하나의 특이한 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함한다.
일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5B를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5C를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5E를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5F를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5I를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는, 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 하나 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다: 5A 및 5B; 5A 및 5C; 5A 및 5D; 5A 및 5E; 5A 및 5F; 5A 및 5G; 5A 및 5H; 5A 및 5I; 5A 및 5J; 5B 및 5C; 5B 및 5D; 5B 및 5E; 5B 및 5F; 5B 및 5G; 5B 및 5H; 5B 및 5I; 5B 및 5J; 5C 및 5D; 5C 및 5E; 5C 및 5F; 5C 및 5G; 5C 및 5H; 5C 및 5I; 5C 및 5J; 5D 및 5E; 5D 및 5F; 5D 및 5G; 5D 및 5E; 5D 및 5F; 5D 및 5G; 5D 및 5H; 5D 및 5I; 5D 및 5J; 5E 및 5F; 5E 및 5G; 5E 및 5H; 5E 및 5I; 5E 및 5J; 5F 및 5G; 5F 및 5H; 5F 및 5I; 5F 및 5J; 5G 및 5H; 5G 및 5I; 5G 및 5J; 5H 및 5I; 5H 및 5J; 또는 5I 및 5J. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 2 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 2 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다: 5A, 5B 및 5C; 5A, 5B 및 5D; 5A, 5B 및 5E; 5A, 5B 및 5F; 5A, 5B 및 5G; 5A, 5B 및 5H; 5A, 5B 및 5I; 5A, 5B 및 5J; 5A, 5C 및 5D; 5A, 5C 및 5E; 5A, 5C 및 5F; 5A, 5C 및 5G; 5A, 5C 및 5H; 5A, 5C 및 5I; 5A, 5C 및 5J; 5A, 5D 및 5E; 5A, 5D 및 5F; 5A, 5D 및 5G; 5A, 5D 및 5H; 5A, 5D 및 5I; 5A, 5D 및 5J; 5A, 5E 및 5F; 5A, 5E 및 5G; 5A, 5E 및 5H; 5A, 5E 및 5I; 5A, 5E 및 5J; 5A, 5F 및 5G; 5A, 5F 및 5H; 5A, 5F 및 5I; 5A, 5F 및 5J; 5B, 5C 및 5D; 5B, 5C 및 5E; 5B, 5C 및 5F; 5B, 5C 및 5G; 5B, 5C 및 5H; 5B, 5C 및 5I; 5B, 5C 및 5J; 5B, 5D 및 5E; 5B, 5D 및 5F; 5B, 5D 및 5G; 5B, 5D 및 5H; 5B, 5D 및 5I; 5B, 5D 및 5J; 5B, 5E 및 5F; 5B, 5E 및 5G; 5B, 5E 및 5H; 5B, 5E 및 5I; 5B, 5E 및 5J; 5B, 5F 및 5G; 5B, 5F 및 5H; 5B, 5F 및 5I; 5B, 5F 및 5J; 5C, 5D 및 5E; 5C, 5D 및 5F; 5C, 5D 및 5G; 5C, 5D 및 5H; 5C, 5D 및 5I; 5C, 5D 및 5J; 5C, 5E 및 5F; 5C, 5E 및 5G; 5C, 5E 및 5H; 5C, 5E 및 5I; 5C, 5E 및 5J; 5C, 5F 및 5G; 5C, 5F 및 5H; 5C, 5F 및 5I; 5C, 5F 및 5J; 5D, 5E 및 5F; 5D, 5E 및 5G; 5D, 5E 및 5H; 5D, 5E 및 5I; 5D, 5E 및 5J; 5D, 5F 및 5G; 5D, 5F 및 5H; 5D, 5F 및 5I; 5D, 5F 및 5J; 5D, 5G 및 5H; 5D, 5G 및 5I; 5D, 5G 및 5J; 5D, 5E 및 5F; 5D, 5E 및 5G; 5D, 5E 및 5H; 5D, 5E 및 5I; 5D, 5E 및 5J; 5D, 5F 및 5G; 5D, 5F 및 5H; 5D, 5F 및 5I; 5D, 5F 및 5J; 5D, 5G 및 5H; 5D, 5G 및 5I; 5D, 5G 및 5J; 5D, 5H 및 5I; 5D, 5H 및 5J; 5D, 5I 및 5J; 5E, 5F 및 5G; 5E, 5F 및 5H; 5E, 5F 및 5I; 5E, 5F 및 5J; 5F, 5G 및 5H; 5F, 5G 및 5I; 5F, 5G 및 5J; 5G, 5H 및 5I; 5G, 5H 및 5J; 또는 5H, 5I 및 5J. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 3 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 3 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
어떤 구현예에서, 아세틸 CoA 경로는 하기를 포함한다: 5A, 5B, 5C 및 5D; 5A, 5B, 5C 및 5E; 5A, 5B, 5C 및 5F; 5A, 5B, 5C 및 5G; 5A, 5B, 5C 및 5H; 5A, 5B, 5C 및 5I; 5A, 5B, 5C 및 5J; 5A, 5B, 5D 및 5E; 5A, 5B, 5D 및 5F; 5A, 5B, 5D 및 5G; 5A, 5B, 5D 및 5H; 5A, 5B, 5D 및 5I; 5A, 5B, 5D 및 5J; 5A, 5B, 5E 및 5F; 5A, 5B, 5E 및 5G; 5A, 5B, 5E 및 5H; 5A, 5B, 5E 및 5I; 5A, 5B, 5E 및 5J; 5A, 5B, 5F 및 5G; 5A, 5B, 5F 및 5H; 5A, 5B, 5F 및 5I; 5A, 5B, 5F 및 5J; 5A, 5B, 5G 및 5H; 5A, 5B, 5G 및 5I; 5A, 5B, 5G 및 5J; 5A, 5B, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5D 및 5E; 5A, 5C, 5D 및 5F; 5A, 5C, 5D 및 5G; 5A, 5C, 5D 및 5H; 5A, 5C, 5D 및 5I; 5A, 5C, 5D 및 5J; 5A, 5C, 5E 및 5F; 5A, 5C, 5E 및 5G; 5A, 5C, 5E 및 5H; 5A, 5C, 5E 및 5I; 5A, 5C, 5E 및 5J; 5A, 5C, 5F 및 5G; 5A, 5C, 5F 및 5H; 5A, 5C, 5F 및 5I; 5A, 5C, 5F 및 5J; 5A, 5C, 5G 및 5H; 5A, 5C, 5G 및 5I; 5A, 5C, 5G 및 5J; 5A, 5C, 5H 및 5I; 5A, 5C, 5H 및 5J; 5A, 5C, 5I 및 5J; 5A, 5D, 5E 및 5F; 5A, 5D, 5E 및 5G; 5A, 5D, 5E 및 5H; 5A, 5D, 5E 및 5I; 5A, 5D, 5E 및 5J; 5A, 5D, 5F 및 5G; 5A, 5D, 5F 및 5H; 5A, 5D, 5F 및 5I; 5A, 5D, 5F 및 5J; 5A, 5D, 5G 및 5H; 5A, 5D, 5G 및 5I; 5A, 5D, 5G 및 5J; 5A, 5D, 5H 및 5I; 5A, 5D, 5H 및 5J; 5A, 5D, 5I 및 5J; 5A, 5E, 5F 및 5G; 5A, 5E, 5F 및 5H; 5A, 5E, 5F 및 5I; 5A, 5E, 5F 및 5J; 5A, 5E, 5G 및 5H; 5A, 5E, 5G 및 5I; 5A, 5E, 5G 및 5J; 5A, 5E, 5H 및 5I; 5A, 5E, 5H 및 5J; 5A, 5E, 5I 및 5J; 5A, 5F, 5G 및 5H; 5A, 5F, 5G 및 5I; 5A, 5F, 5G 및 5J; 5A, 5F, 5H 및 5I; 5A, 5F, 5H 및 5J; 5A, 5F, 5I 및 5J; 5A, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5D 및 5E; 5B, 5C, 5D 및 5F; 5B, 5C, 5D 및 5G; 5B, 5C, 5D 및 5H; 5B, 5C, 5D 및 5I; 5B, 5C, 5D 및 5J; 5B, 5C, 5E 및 5F; 5B, 5C, 5E 및 5G; 5B, 5C, 5E 및 5H; 5B, 5C, 5E 및 5I; 5B, 5C, 5E 및 5J; 5B, 5C, 5F 및 5G; 5B, 5C, 5F 및 5H; 5B, 5C, 5F 및 5I; 5B, 5C, 5F 및 5J; 5B, 5C, 5G 및 5H; 5B, 5C, 5G 및 5I; 5B, 5C, 5G 및 5J; 5B, 5C, 5H 및 5I; 5B, 5C, 5H 및 5J; 5B, 5C, 5I 및 5J; 5B, 5D, 5E 및 5F; 5B, 5D, 5E 및 5G; 5B, 5D, 5E 및 5H; 5B, 5D, 5E 및 5I; 5B, 5D, 5E 및 5J; 5B, 5D, 5F 및 5G; 5B, 5D, 5F 및 5H; 5B, 5D, 5F 및 5I; 5B, 5D, 5F 및 5J; 5B, 5E, 5F 및 5G; 5B, 5E, 5F 및 5H; 5B, 5E, 5F 및 5I; 5B, 5E, 5F 및 5J; 5B, 5E, 5G 및 5H; 5B, 5E, 5G 및 5I; 5B, 5E, 5G 및 5J; 5B, 5E, 5H 및 5I; 5B, 5E, 5H 및 5J; 5B, 5E, 5I 및 5J; 5B, 5F, 5G 및 5H; 5B, 5F, 5G 및 5I; 5B, 5F, 5G 및 5J; 5B, 5G, 5H 및 5I; 5B, 5G, 5H 및 5J; 5B, 5H, 5I 및 5J; 5C, 5D, 5E 및 5F; 5C, 5D, 5E 및 5G; 5C, 5D, 5E 및 5H; 5C, 5D, 5E 및 5I; 5C, 5D, 5E 및 5J; 5C, 5D, 5F 및 5G; 5C, 5D, 5F 및 5H; 5C, 5D, 5F 및 5I; 5C, 5D, 5F 및 5J; 5C, 5D, 5G 및 5H; 5C, 5D, 5G 및 5I; 5C, 5D, 5G 및 5J; 5C, 5D, 5H 및 5I; 5C, 5D, 5H 및 5J; 5C, 5D, 5I 및 5J; 5D, 5E, 5F 및 5G; 5D, 5E, 5F 및 5H; 5D, 5E, 5F 및 5I; 5D, 5E, 5F 및 5J; 5D, 5E, 5G 및 5H; 5D, 5E. 5G 및 5I; 5D, 5E, 5G 및 5J; 5D, 5E, 5H 및 5I; 5D, 5E, 5H 및 5J; 5D, 5E, 5I 및 5J; 5E, 5F, 5G 및 5H; 5E, 5F, 5G 및 5I; 5E, 5F, 5G 및 5J; 5E, 5F, 5H 및 5I; 5E, 5F, 5H 및 5J; 5E, 5F, 5I 및 5J; 5F, 5G, 5H 및 5I; 5F, 5G, 5H 및 5J; 5F, 5G, 5I 및 5J; 또는 5G, 5H, 5I 및 5J. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 4 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 4 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
다른 구현예에서, 아세틸 CoA 경로는 하기를 포함한다: 5A, 5B, 5C, 5D 및 5E; 5A, 5B, 5C, 5D 및 5F; 5A, 5B, 5C, 5D 및 5G; 5A, 5B, 5C, 5D 및 5H; 5A, 5B, 5C, 5D 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5D 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5E 및 5F; 5A, 5B, 5C, 5E 및 5G; 5A, 5B, 5C, 5E 및 5H; 5A, 5B, 5C, 5E 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5E 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5F 및 5G; 5A, 5B, 5C, 5F 및 5H; 5A, 5B, 5C, 5F 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5F 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5G 및 5H; 5A, 5B, 5C, 5G 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5G 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5D, 5E 및 5H; 5A, 5B, 5D, 5E 및 5I; 5A, 5B, 5D, 5E 및 5J; 5A, 5B, 5D, 5F 및 5G; 5A, 5B, 5D, 5F 및 5H; 5A, 5B, 5D, 5F 및 5I; 5A, 5B, 5D, 5F 및 5J; 5A, 5B, 5D, 5G 및 5H; 5A, 5B, 5D, 5G 및 5I; 5A, 5B, 5D, 5G 및 5J; 5A, 5B, 5D, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5D, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5D, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5E, 5F 및 5G; 5A, 5B, 5E, 5F 및 5H; 5A, 5B, 5E, 5F 및 5I; 5A, 5B, 5E, 5F 및 5J; 5A, 5B, 5E, 5G 및 5H; 5A, 5B, 5E, 5G 및 5I; 5A, 5B, 5E, 5G 및 5J; 5A, 5B, 5E, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5E, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5E, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5F, 5G 및 5H; 5A, 5B, 5F, 5G 및 5I; 5A, 5B, 5F, 5G 및 5J; 5A, 5B, 5F, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5F, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5F, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5E 및 5F; 5A, 5C, 5D, 5E 및 5G; 5A, 5C, 5D, 5E 및 5H; 5A, 5C, 5D, 5E 및 5I; 5A, 5C, 5D, 5E 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5F 및 5G; 5A, 5C, 5D, 5F 및 5H; 5A, 5C, 5D, 5F 및 5I; 5A, 5C, 5D, 5F 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5G 및 5H; 5A, 5C, 5D, 5G 및 5I; 5A, 5C, 5D, 5G 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5H 및 5I; 5A, 5C, 5D, 5H 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5E, 5F 및 5G; 5A, 5C, 5E, 5F 및 5H; 5A, 5C, 5E, 5F 및 5I; 5A, 5C, 5E, 5F 및 5J; 5A, 5C, 5E, 5G 및 5H; 5A, 5C, 5E, 5G 및 5I; 5A, 5C, 5E, 5G 및 5J; 5A, 5C, 5E, 5H 및 5I; 5A, 5C, 5E, 5H 및 5J; 5A, 5C, 5E, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5F, 5G 및 5H; 5A, 5C, 5F, 5G 및 5I; 5A, 5C, 5F, 5G 및 5J; 5A, 5C, 5F, 5H 및 5I; 5A, 5C, 5F, 5H 및 5J; 5A, 5C, 5F, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5C, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5C, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5D, 5E, 5F 및 5G; 5A, 5D, 5E, 5F 및 5H; 5A, 5D, 5E, 5F 및 5I; 5A, 5D, 5E, 5F 및 5J; 5A, 5D, 5E, 5G 및 5H; 5A, 5D, 5E, 5G 및 5I; 5A, 5D, 5E, 5G 및 5J; 5A, 5D, 5E, 5H 및 5I; 5A, 5D, 5E, 5H 및 5J; 5A, 5D, 5E, 5I 및 5J; 5A, 5D, 5F, 5G 및 5H; 5A, 5D, 5F, 5G 및 5I; 5A, 5D, 5F, 5G 및 5J; 5A, 5D, 5F, 5H 및 5I; 5A, 5D, 5F, 5H 및 5J; 5A, 5D, 5F, 5I 및 5J; 5A, 5D, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5D, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5D, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5D, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5E, 5F, 5G 및 5H; 5A, 5E, 5F, 5G 및 5I; 5A, 5E, 5F, 5G 및 5J; 5A, 5E, 5F, 5H 및 5I; 5A, 5E, 5F, 5H 및 5J; 5A, 5E, 5F, 5I 및 5J; 5A, 5E, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5E, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5E, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5E, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5E 및 5F; 5B, 5C, 5D, 5E 및 5G; 5B, 5C, 5D, 5E 및 5H; 5B, 5C, 5D, 5E 및 5I; 5B, 5C, 5D, 5E 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5F 및 5G; 5B, 5C, 5D, 5F 및 5H; 5B, 5C, 5D, 5F 및 5I; 5B, 5C, 5D, 5F 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5G 및 5H; 5B, 5C, 5D, 5G 및 5I; 5B, 5C, 5D, 5G 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5H 및 5I; 5B, 5C, 5D, 5H 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5E, 5F 및 5G; 5B, 5C, 5E, 5F 및 5H; 5B, 5C, 5E, 5F 및 5I; 5B, 5C, 5E, 5F 및 5J; 5B, 5C, 5E, 5G 및 5H; 5B, 5C, 5E, 5G 및 5I; 5B, 5C, 5E, 5G 및 5J; 5B, 5C, 5E, 5H 및 5I; 5B, 5C, 5E, 5H 및 5J; 5B, 5C, 5E, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5F, 5G 및 5H; 5B, 5C, 5F, 5G 및 5I; 5B, 5C, 5F, 5G 및 5J; 5B, 5C, 5F, 5H 및 5I; 5B, 5C, 5F, 5H 및 5J; 5B, 5C, 5F, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5G, 5H 및 5I; 5B, 5C, 5G, 5H 및 5J; 5B, 5C, 5G, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5D, 5E, 5F 및 5G; 5B, 5D, 5E, 5F 및 5H; 5B, 5D, 5E, 5F 및 5I; 5B, 5D, 5E, 5F 및 5J; 5B, 5D, 5E, 5G 및 5H; 5B, 5D, 5E, 5G 및 5I; 5B, 5D, 5E, 5G 및 5J; 5B, 5D, 5E, 5H 및 5I; 5B, 5D, 5E, 5H 및 5J; 5B, 5D, 5E, 5I 및 5J; 5B, 5D, 5F, 5G 및 5H; 5B, 5D, 5F, 5G 및 5I; 5B, 5D, 5F, 5G 및 5J; 5B, 5D, 5F, 5H 및 5I; 5B, 5D, 5F, 5H 및 5J; 5B, 5D, 5F, 5I 및 5J; 5B, 5E, 5F, 5G 및 5H; 5B, 5E, 5F, 5G 및 5I; 5B, 5E, 5F, 5G 및 5J; 5B, 5E, 5F, 5H 및 5I; 5B, 5E, 5F, 5H 및 5J; 5B, 5E, 5F, 5I 및 5J; 5B, 5E, 5G, 5H 및 5I; 5B, 5E, 5G, 5H 및 5J; 5B, 5E, 5G, 5I 및 5J; 5B, 5E, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5B, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5B, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5B, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5C, 5D, 5E, 5F 및 5H; 5C, 5D, 5E, 5F 및 5I; 5C, 5D, 5E, 5F 및 5J; 5C, 5D, 5E, 5G 및 5H; 5C, 5D, 5E, 5G 및 5I; 5C, 5D, 5E, 5G 및 5J; 5C, 5D, 5E, 5H 및 5I; 5C, 5D, 5E, 5H 및 5J; 5C, 5D, 5E, 5I 및 5J; 5C, 5D, 5F, 5G 및 5H; 5C, 5D, 5F, 5G 및 5I; 5C, 5D, 5F, 5G 및 5J; 5C, 5D, 5F, 5H 및 5I; 5C, 5D, 5F, 5H 및 5J; 5C, 5D, 5F, 5I 및 5J; 5C, 5D, 5G, 5H 및 5I; 5C, 5D, 5G, 5H 및 5J; 5C, 5D, 5G, 5I 및 5J; 5C, 5D, 5H, 5I 및 5J; 5D, 5E, 5F, 5G 및 5H; 5D, 5E, 5F, 5G 및 5I; 5D, 5E, 5F, 5G 및 5J; 5D, 5E, 5F, 5H 및 5I; 5D, 5E, 5F, 5H 및 5J; 5D, 5E, 5F, 5I 및 5J; 5D, 5E, 5G, 5H 및 5I; 5D, 5E, 5G, 5H 및 5J; 5D, 5E. 5G, 5I 및 5J; 5D, 5E, 5H, 5I 및 5J; 5E, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5E, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5E, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5E, 5F, 5H, 5I 및 5J; 또는 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는, 5 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 5 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
또 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다: 5A, 5B, 5C, 5D, 5E 및 5F; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E 및 5G; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E 및 5H; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5F 및 5G; 5A, 5B, 5C, 5D, 5F 및 5H; 5A, 5B, 5C, 5D, 5F 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5D, 5F 및 5H; 5A, 5B, 5C, 5D, 5G 및 5H; 5A, 5B, 5C, 5D, 5G 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5D, 5G 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5D, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5E, 5F 및 5G; 5A, 5B, 5C, 5E, 5F 및 5H; 5A, 5B, 5C, 5E, 5F 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5E, 5F 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5E, 5G 및 5H; 5A, 5B, 5C, 5E, 5G 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5E, 5G 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5E, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5E, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5E, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5F, 5G 및 5H; 5A, 5B, 5C, 5F, 5G 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5F, 5G 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5F, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5F, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5F, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5D, 5E, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5D, 5E, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5D, 5E, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5D, 5F, 5G 및 5H; 5A, 5B, 5D, 5F, 5G 및 5I; 5A, 5B, 5D, 5F, 5G 및 5J; 5A, 5B, 5D, 5F, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5D, 5F, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5D, 5F, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5D, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5D, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5D, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5D, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5E, 5F, 5G 및 5H; 5A, 5B, 5E, 5F, 5G 및 5I; 5A, 5B, 5E, 5F, 5G 및 5J; 5A, 5B, 5E, 5F, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5E, 5F, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5E, 5F, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5E, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5E, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5E, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5E, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5E, 5F 및 5G; 5A, 5C, 5D, 5E, 5F 및 5H; 5A, 5C, 5D, 5E, 5F 및 5I; 5A, 5C, 5D, 5E, 5F 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5E, 5G 및 5H; 5A, 5C, 5D, 5E, 5G 및 5I; 5A, 5C, 5D, 5E, 5G 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5E, 5H 및 5I; 5A, 5C, 5D, 5E, 5H 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5E, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5F, 5G 및 5H; 5A, 5C, 5D, 5F, 5G 및 5I; 5A, 5C, 5D, 5F, 5G 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5F, 5H 및 5I; 5A, 5C, 5D, 5F, 5H 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5F, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5C, 5D, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5E, 5F, 5G 및 5H; 5A, 5C, 5E, 5F, 5G 및 5I; 5A, 5C, 5E, 5F, 5G 및 5J; 5A, 5C, 5E, 5F, 5H 및 5I; 5A, 5C, 5E, 5F, 5H 및 5J; 5A, 5C, 5E, 5F, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5E, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5C, 5E, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5C, 5E, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5E, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5C, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5C, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5D, 5E, 5F, 5G 및 5H; 5A, 5D, 5E, 5F, 5G 및 5I; 5A, 5D, 5E, 5F, 5G 및 5J; 5A, 5D, 5E, 5F, 5H 및 5I; 5A, 5D, 5E, 5F, 5H 및 5J; 5A, 5D, 5E, 5F, 5I 및 5J; 5A, 5D, 5E, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5D, 5E, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5D, 5E, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5D, 5E, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5D, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5D, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5D, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5D, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5D, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5E, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5E, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5E, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5E, 5F 및 5G; 5B, 5C, 5D, 5E, 5F 및 5H; 5B, 5C, 5D, 5E, 5F 및 5I; 5B, 5C, 5D, 5E, 5F 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5E, 5G 및 5H; 5B, 5C, 5D, 5E, 5G 및 5I; 5B, 5C, 5D, 5E, 5G 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5E, 5H 및 5I; 5B, 5C, 5D, 5E, 5H 및 5I; 5B, 5C, 5D, 5E, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5F, 5G 및 5H; 5B, 5C, 5D, 5F, 5G 및 5I; 5B, 5C, 5D, 5F, 5G 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5F, 5H 및 5I; 5B, 5C, 5D, 5F, 5H 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5F, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5G, 5H 및 5I; 5B, 5C, 5D, 5G, 5H 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5G, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5H., 5I 및 5J; 5B, 5C, 5E, 5F, 5G 및 5H; 5B, 5C, 5E, 5F, 5G 및 5I; 5B, 5C, 5E, 5F, 5G 및 5J; 5B, 5C, 5E, 5F, 5H 및 5I; 5B, 5C, 5E, 5F, 5H 및 5J; 5B, 5C, 5E, 5F, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5E, 5G, 5H 및 5I; 5B, 5C, 5E, 5G, 5H 및 5J; 5B, 5C, 5E, 5G, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5E, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5B, 5C, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5B, 5C, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5D, 5E, 5F, 5G 및 5H; 5B, 5D, 5E, 5F, 5G 및 5I; 5B, 5D, 5E, 5F, 5G 및 5J; 5B, 5D, 5E, 5F, 5H 및 5I; 5B, 5D, 5E, 5F, 5H 및 5J; 5B, 5D, 5E, 5F, 5I 및 5J; 5B, 5D, 5E, 5G, 5H 및 5I; 5B, 5D, 5E, 5G, 5H 및 5J; 5B, 5D, 5E, 5G, 5I 및 5J; 5B, 5D, 5E, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5D, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5B, 5D, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5B, 5D, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5B, 5D, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5B, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5B, 5E, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5B, 5E, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5E, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5C, 5D, 5E, 5F, 5H 및 5I; 5C, 5D, 5E, 5F, 5H 및 5J; 5C, 5D, 5E, 5F, 5I 및 5J; 5C, 5D, 5E, 5G, 5H 및 5I; 5C, 5D, 5E, 5G, 5H 및 5J; 5C, 5D, 5E, 5G, 5I 및 5J; 5C, 5D, 5E, 5H, 5I 및 5J; 5C, 5D, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5C, 5D, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5C, 5D, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5C, 5D, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5C, 5D, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5D, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5D, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5D, 5E, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5D, 5E, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5D, 5E, 5G, 5H, 5I 및 5J; 또는 5E, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는, 6 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 6 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다: 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F 및 5G; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F 및 5H; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5G 및 5H; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5G 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5G 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5F, 5G 및 5H; 5A, 5B, 5C, 5D, 5F, 5G 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5D, 5F, 5G 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5F, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5D, 5F, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5F, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5F, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5D, 5F, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5D, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5E, 5F, 5G 및 5H; 5A, 5B, 5C, 5E, 5F, 5G 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5E, 5F, 5G 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5E, 5F, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5E, 5F, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5E, 5F, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5E, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5E, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5E, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5E, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5D, 5E, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5D, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5D, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5D, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5D, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5D, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5E, 5F, 5G., 5I 및 5J; 5A, 5B, 5E, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5E, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G 및 5H; 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G 및 5I; 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5H 및 5I; 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5H 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5E, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5C, 5D, 5E, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5E, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5E, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5C, 5D, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5C, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5C, 5E, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5E, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5E, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5D, 5E, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5D, 5E, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5D, 5E, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5D, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G 및 5H; 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G 및 5I; 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5H 및 5I; 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5H 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5E, 5G, 5H 및 5I; 5B, 5C, 5D, 5E, 5G, 5H 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5E, 5G, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5E, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5B, 5C, 5D, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5B, 5C, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5B, 5C, 5E, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5E, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5E, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5B, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5B, 5D, 5E, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5B, 5D, 5E, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5D, 5E, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5D, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5C, 5D, 5E, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5C, 5D, 5E, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5C, 5D, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 또는 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는, 7 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 7 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다: 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G 및 5H; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5D, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5F, 5G. 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5E, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5E, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5E, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5D, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5E, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5E, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5D, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5B, 5C, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 또는 5B, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는, 8 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 8 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5I; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5D, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5B, 5C, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J; 또는 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는, 9 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 9 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는, 10 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 10 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A, 6B, 6C, 6D 또는 6E, 또는 6A, 6B, 6C, 6D 및 6E의 임의의 조합을 포함하고, 여기서 6A는 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소이고; 6B는 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소이고; 6C는 세포질 아세틸카르니틴 전이효소이고; 6D는 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제이고; 6E는 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제이다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 도 6에서 묘시된 아세틸-CoA 경로이다. 특이한 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함한다. 또 하나의 특이한 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함한다.
일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6B를 포함한다. 일부 구현예에서, 6C. 다른 구현예에서, 6D. 또 다른 구현예에서, 6E. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는, 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 하나 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다: 6A 및 6B; 6A 및 6C; 6A 및 6D; 6A 및 6E; 6B 및 6C; 6B 및 6D; 6B 및 6E; 6C 및 6D; 6C 및 6E; 또는 6D 및 6E. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 2 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 2 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다: 6A, 6B 및 6C; 6A, 6B 및 6D; 6A, 6B 및 6E; 6A, 6C 및 6D; 6A, 6C 및 6E; 6A, 6D 및 6E; 6B, 6C 및 6D; 6B, 6C 및 6E; 또는 6C, 6D 및 6E. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는, 3 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 3 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다: 6A, 6B, 6C 및 6D; 6A, 6B, 6C 및 6E; 또는 6B, 6C, 6D 및 6E. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는, 4 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 4 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A, 6B, 6C, 6D 및 6E를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는, 5 개 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 5 개 이상의 외인성 핵산 각각은 상이한 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10C, 10D, 10F, 10G, 10H. 10J, 10K, 10L, 10M, 10N, 또는 10A, 10B, 10C, 10D, 10F, 10G, 10H. 10J, 10K, 10L, 10M, 10N의 임의의 조합을 포함하고, 여기서 10A는 PEP 카복실라제 또는 PEP 카복시키나아제이고; 10B는 옥살로아세테이트 탈탄산효소이고; 10C는 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소 (아세틸화)이고; 10D는 말로닐-CoA 탈탄산효소이고; 10F는 옥살로아세테이트 탈수소효소 또는 옥살로아세테이트 산화환원효소이고; 10G는 말로닐-CoA 환원효소이고; 10H는 피루베이트 카복실라제이고; 10J는 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소이고; 10K는 말로닐-CoA 합성효소 또는 전이효소이고; 10L은 말산 효소이고; 10M은 말레이트 탈수소효소 또는 산화환원효소이고; 10N은 피루베이트 키나아제 또는 PEP 포스파타제이다. 일 구현예에서, 10A는 PEP 카복실라제이다. 또 하나의 구현예에서, 10A는 PEP 카복시키나아제이다. 구현예에서, 10F는 옥살로아세테이트 탈수소효소이다. 다른 구현예에서, 10F는 옥살로아세테이트 산화환원효소이다. 일 구현예에서, 10K는 말로닐-CoA 합성효소이다. 또 하나의 구현예에서, 10K는 말로닐-CoA 전이효소이다. 일 구현예에서, 10M은 말레이트 탈수소효소이다. 또 하나의 구현예에서, 10M은 말레이트 산화환원효소이다. 다른 구현예에서, 10N은 피루베이트 키나아제이다. 일부 구현예에서, 10N은 PEP 포스파타제이다.
일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10B를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10C를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10F를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10H를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10K를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10L을 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10M을 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N을 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 7A, 7E 또는 7F, 또는 7A, 7E 및 7F의 임의의 조합을 포함하고, 여기서 7A는 아세토아세틸-CoA 티올라제 (도 10, 단계 I)이고, 7E는 아세틸-CoA 카복실라제 (도 10, 단계 D)이고; 7F는 아세토아세틸-CoA 합성효소 (도 10, 단계 E)를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 도 10에서 묘사된 아세틸-CoA 경로이다. 특이한 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D를 포함한다.
아세틸-CoA 경로를 함유하는 진핵 유기체로서 본원에서 일반적으로 기재되지만, 아세틸-CoA 경로의 중간체를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 또한 본원에서 제공된다는 것을 이해한다. 예를 들면, 본원에서 개시된 바와 같이, 아세틸-CoA 경로는 도 2, 3, 5, 6, 7,8 및 10에서 예시된다. 따라서, 상기 유기체에서 세포질 아세틸-CoA를 생산하고, 미토콘드리아 또는 상기 유기체의 페록시솜으로부터 상기 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하고/거나 상기 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는 아세틸-CoA 경로를 함유하는 진핵 유기체 외에, 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 또한 제공되고, 여기서 상기 진핵 유기체는 아세틸-CoA 경로 중간체, 예를 들면, 시트레이트, 시트라말레이트, 옥살로아세테이트, 아세테이트, 말레이트, 아세트알데하이드, 아세틸포스페이트 또는 아세틸카르니틴을 생산한다.
실시예들에서 기재되고 도에서 예시된 바와 같이, 도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 경로를 포함하는 본원에서 개시된 임의의 경로는, 원하는 바와 같이, 임의의 경로 중간체 또는 생성물을 생산하는 비-자연 발생 진핵 유기체를 생성하기 위해 이용될 수 있는 것으로 이해된다. 본원에서 개시된 바와 같이, 중간체를 생산하는 그와 같은 진핵 유기체는 원하는 생성물을 생산하기 위해 다운스트림 경로 효소를 발현시키는 또 하나의 진핵 유기체와 함께 사용될 수 있다. 그러나, 아세틸-CoA 경로 중간체를 생산하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 원하는 생성물로서 중간체를 생산하기 위해 이용될 수 있는 것으로 이해된다.
아세틸-CoA 경로를 포함하고 아세틸-CoA 경로 효소, 예컨대 본원에서 제공된 것을 포함하도록 조작된 임의의 비-자연 발생 진핵 유기체는, 하나 이상의 1,3-BDO 경로 효소를 추가로 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 1,3-BDO 경로를 갖는 비-자연 발생 진핵 유기체는 1,3-BDO 경로 효소의 세트를 포함한다. 1,3-BDO 경로 효소의 세트는, 예를 들면, 도 4 또는 도 7에서 보여진 바와 같이 아세틸-CoA를 1,3-BDO로 전환시키는 효소의 그룹을 나타낸다.
일부 구현예에서, 하기 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 상기 유기체는, (i) 상기 유기체의 미토콘드리아 및/또는 페록시솜으로부터 상기 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하고, (ⅱ) 상기 유기체의 세포질에서 아세틸-CoA를 생산하고/거나 (ⅲ) 상기 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 아세틸-CoA 경로; 및 (2) 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로. 일 구현예에서, 적어도 하나의 아세틸-CoA 경로 효소는 상기 유기체의 미토콘드리아 및/또는 페록시솜으로부터 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는데 충분한 양으로 발현된다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 아세틸-CoA 경로 효소는 상기 유기체에서 세포질 아세틸-CoA를 생산하는데 충분한 양으로 발현된다. 또 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 아세틸-CoA 경로 효소는 상기 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된다. 일부 구현예에서, 아세틸 CoA 경로는 상기에서 또는 본원의 다른 곳에서 기재된 아세틸-CoA 경로 효소의 임의의 다양한 조합을 포함한다. 어떤 구현예에서, 1,3-BDO 부산물 경로는 삭제된다.
어떤 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2K, 2L, 3H, 3I 또는 3J, 또는 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J의 임의의 조합을 포함하고; 여기서 2A는 시트레이트 합성효소이고; 2B는 시트레이트 수송체이고; 2C는 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체 또는 시트레이트/말레이트 수송체이고; 2D는 ATP 시트레이트 분해효소이고; 2E는 시트레이트 분해효소이고; 2F는 아세틸-CoA 합성효소이고; 2G는 옥살로아세테이트 수송체이고; 2K는 아세테이트 키나아제이고; 2L은 포스포트랜스아세틸라제이고; 3H는 세포질 말레이트 탈수소효소이고; 3I는 말레이트 수송체이고; 3J는 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소이고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4K, 4L, 4M, 4N 또는 4O, 또는 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4K, 4L, 4M, 4N 및 4O의 임의의 조합을 포함하고; 여기서 4A는 아세토아세틸-CoA 티올라제이고; 여기서 4B는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성)이고; 여기서 4C는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원)이고; 여기서 4D는 4-하이드록시,2-부타논 환원효소이고; 여기서 4E는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성)이고; 여기서 4F는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원)이고; 여기서 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 여기서 4H는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원)이고; 여기서 4I는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성)이고; 여기서 4J는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성)이고; 여기서 4K는 아세토아세틸-CoA 전이효소, 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 아세토아세틸-CoA 합성효소, 또는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제이고; 여기서 4L은 아세토아세테이트 환원효소이고; 여기서 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소, 가수분해효소, 또는 합성효소이고; 여기서 4N은 3-하이드록시부티레이트 환원효소이고; 여기서 4O는 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소이다. 일부 구현예에서, 2C는 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체이다. 다른 구현예에서, 2C는 시트레이트/말레이트 수송체이다. 어떤 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 전이효소이다. 다른 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 가수분해효소이다. 일부 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 합성효소이다. 다른 구현예에서, 4K는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제이다. 어떤 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소이다. 일부 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA, 가수분해효소이다. 또 다른 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 합성효소이다.
일 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4B를 포함한다. 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4C를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4D를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4E를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4F를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4H를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4I를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4J를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4K를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4L을 포함한다. 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4M를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4N를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4O를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 도 2에서 묘사된 아세틸-CoA 경로이고, 상기 1,3-BDO 경로는 도 4에서 묘사된 1,3-BDO 경로이다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 도 3에서 묘사된 아세틸-CoA 경로이고, 상기 1,3-BDO 경로는 도 4에서 묘사된 1,3-BDO 경로이다. 또 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 도 7에서 묘사된 아세틸-CoA 경로이고, 상기 1,3-BDO 경로는 도 4 또는 도 7에서 묘사된 1,3-BDO 경로이다. 아세틸-CoA를 1,3-BDO로 전환시키는 1,3-BDO 경로 효소의 예시적인 세트는, 도 4에 따라, 4A, 4E, 4F 및 4G; 4A, 4B 및 4D; 4A, 4E, 4C 및 4D; 4A, 4H 및 4J; 4A, 4H, 4I 및 4G; 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함한다. 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸 CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸 CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸 CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3H를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3I를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G 및 3H를 포함한다. 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G 및 3I를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G 및 3J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3H 및 3I를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3H 및 3J를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3I 및 3J를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G, 3H 및 3I를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G, 3H 및 3J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G, 3I 및 3J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3H, 3I 및 3J를 포함한다.
본원에서 제공된 상기 아세틸-CoA 경로 효소의 임의의 것은 본원에서 제공된 상기 1,3-BDO 경로 효소의 임의의 것과 함께 있을 수 있다.
일 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
어떤 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 (i) 2A, 2B 및 2D; (ⅱ) 2A, 2C 및 2D; (ⅲ) 2A, 2B, 2C 및 2D; (ⅳ) 2A, 2B, 2E 및 2F; (v) 2A, 2C, 2E 및 2F; (ⅵ) 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F; (ⅶ) 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L; (ⅷ) 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L 또는 (ⅸ) 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 여기서 상기 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 4A, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 4A, 4B 및 4D; (ⅲ) 4A, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 4A, 4H 및 4J; (v) 4A, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 4A, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 4A, 4B 및 4D; (ⅲ) 4A, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 4A, 4H 및 4J; (v) 4A, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 각각의 외인성 핵산은 상이한 아세틸-CoA 경로 또는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다.
다른 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 4A, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 4A, 4B 및 4D; (ⅲ) 4A, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 4A, 4H 및 4J; (v) 4A, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 각각의 외인성 핵산은 상이한 아세틸-CoA 경로 또는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다.
다른 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 4A, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 4A, 4B 및 4D; (ⅲ) 4A, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 4A, 4H 및 4J; (v) 4A, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 각각의 외인성 핵산은 상이한 아세틸-CoA 경로 또는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다.
다른 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 4A, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 4A, 4B 및 4D; (ⅲ) 4A, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 4A, 4H 및 4J; (v) 4A, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 각각의 외인성 핵산은 상이한 아세틸-CoA 경로 또는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다.
다른 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 4A, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 4A, 4B 및 4D; (ⅲ) 4A, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 4A, 4H 및 4J; (v) 4A, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 각각의 외인성 핵산은 상이한 아세틸-CoA 경로 또는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다.
다른 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 4A, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 4A, 4B 및 4D; (ⅲ) 4A, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 4A, 4H 및 4J; (v) 4A, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 각각의 외인성 핵산은 상이한 아세틸-CoA 경로 또는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다.
일부 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 4A, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 4A, 4B 및 4D; (ⅲ) 4A, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 4A, 4H 및 4J; (v) 4A, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 각각의 외인성 핵산은 상이한 아세틸-CoA 경로 또는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다.
일부 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 4A, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 4A, 4B 및 4D; (ⅲ) 4A, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 4A, 4H 및 4J; (v) 4A, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3H를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3I를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G 및 3H를 포함한다. 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G 및 3I를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G 및 3J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3H 및 3I를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3H 및 3J를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3I 및 3J를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G, 3H 및 3I를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G, 3H 및 3J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 2G, 3I 및 3J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 추가로, 3H, 3I 및 3J를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 각각의 외인성 핵산은 상이한 아세틸-CoA 경로 또는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다.
일부 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 4A, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 4A, 4B 및 4D; (ⅲ) 4A, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 4A, 4H 및 4J; (v) 4A, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 각각의 외인성 핵산은 상이한 아세틸-CoA 경로 또는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다.
어떤 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5A, 5B, 5C, 5D 5E, 5F, 5G, 5H, 5I, 5J 또는 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J의 임의의 조합을 포함하고, 여기서 5A는 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성)이고; 5B는 아세틸-CoA 합성효소, 리가제 또는 전이효소이고; 5C는 아세테이트 키나아제이고; 5D는 포스포트랜스아세틸라제이고; 5E는 피루베이트 탈탄산효소이고; 5F는 아세트알데하이드 탈수소효소이고; 5G는 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성)이고; 5H는 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 또는 피루베이트 포르메이트 분해효소이고; 5I 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화)이고; 5J는 트레오닌 알돌라아제이고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4K, 4L, 4M, 4N 또는 4O, 또는 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4K, 4L, 4M, 4N 및 4O의 임의의 조합을 포함하고; 여기서 4A는 아세토아세틸-CoA 티올라제이고; 여기서 4B는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성)이고; 여기서 4C는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원)이고; 여기서 4D는 4-하이드록시,2-부타논 환원효소이고; 여기서 4E는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성)이고; 여기서 4F는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원)이고; 여기서 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 여기서 4H는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원)이고; 여기서 4I는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성)이고; 여기서 4J는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성)이고; 여기서 4K는 아세토아세틸-CoA 전이효소, 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 아세토아세틸-CoA 합성효소, 또는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제이고; 여기서 4L은 아세토아세테이트 환원효소이고; 여기서 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소, 가수분해효소, 또는 합성효소이고; 여기서 4N은 3-하이드록시부티레이트 환원효소이고; 여기서 4O는 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소이다. 어떤 구현예에서, 5B는 아세틸-CoA 합성효소이다. 또 하나의 구현예에서, 5B는 아세틸-CoA 리가제이다. 다른 구현예에서, 5B는 아세틸-CoA 전이효소이다. 일부 구현예에서, 5H는 피루베이트 탈수소효소이다. 다른 구현예에서, 5H는 피루베이트:페레독신 산화환원효소이다. 또 다른 구현예에서, 5H는 피루베이트 포르메이트 분해효소가다. 어떤 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 전이효소이다. 다른 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 가수분해효소이다. 일부 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 합성효소이다. 다른 구현예에서, 4K는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제이다. 어떤 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소이다. 일부 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA, 가수분해효소이다. 또 다른 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 합성효소이다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 도 5에서 묘사된 아세틸-CoA 경로이고, 상기 1,3-BDO 경로는 도 4에서 묘사된 1,3-BDO 경로이다. 아세틸-CoA 경로 효소의 예시적인 세트는, 도 5에 따라, 5A 및 5B; 5A, 5C 및 5D; 5G 및 5D; 5E, 5F, 5C 및 5D; 5J 및 5I; 5J, 5F 및 5B; 및 5H이다. 아세틸-CoA를 1,3-BDO로 전환시키는 1,3-BDO 경로 효소의 예시적인 세트는, 도 4에 따라, 4A, 4E, 4F 및 4G; 4A, 4B 및 4D; 4A, 4E, 4C 및 4D; 4A, 4H 및 4J; 4A, 4H, 4I 및 4G; 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 (i) 5A 및 5B; (ⅱ) 5A, 5C 및 5D; (ⅲ) 5E, 5F, 5C 및 5D; (ⅳ) 5G 및 5D; (v) 5J 및 5I; (ⅵ) 5J, 5F 및 5B; 또는 (ⅶ) 5H를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 4A, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 4A, 4B 및 4D; (ⅲ) 4A, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 4A, 4H 및 4J; (v) 4A, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
어떤 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 6A, 6B, 6C, 6D 또는 6E, 또는 6A, 6B, 6C, 6D 및 6E의 임의의 조합을 포함하고, 여기서 6A는 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소이고; 6B는 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소이고; 6C는 세포질 아세틸카르니틴 전이효소이고; 6D는 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제이고; 6E는 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제이고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4K, 4L, 4M, 4N 또는 4O, 또는 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4K, 4L, 4M, 4N 및 4O의 임의의 조합을 포함하고; 여기서 4A는 아세토아세틸-CoA 티올라제이고; 여기서 4B는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성)이고; 여기서 4C는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원)이고; 여기서 4D는 4-하이드록시,2-부타논 환원효소이고; 여기서 4E는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성)이고; 여기서 4F는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원)이고; 여기서 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 여기서 4H는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원)이고; 여기서 4I는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성)이고; 여기서 4J는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성)이고; 여기서 4K는 아세토아세틸-CoA 전이효소, 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 아세토아세틸-CoA 합성효소, 또는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제이고; 여기서 4L은 아세토아세테이트 환원효소이고; 여기서 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소, 가수분해효소, 또는 합성효소이고; 여기서 4N은 3-하이드록시부티레이트 환원효소이고; 여기서 4O는 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소이다. 어떤 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 전이효소이다. 다른 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 가수분해효소이다. 일부 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 합성효소이다. 다른 구현예에서, 4K는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제이다. 어떤 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소이다. 일부 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA, 가수분해효소이다. 또 다른 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 합성효소이다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 도 6에서 묘사된 아세틸-CoA 경로이고, 상기 1,3-BDO 경로는 도 4에서 묘사된 1,3-BDO 경로이다. 아세틸-CoA 경로 효소의 예시적인 세트는, 도 6에 따라, 6A, 6D 및 6C; 및 6B, 6E 및 6C이다. 아세틸-CoA를 1,3-BDO로 전환시키는 1,3-BDO 경로 효소의 예시적인 세트는, 도 4에 따라, 4A, 4E, 4F 및 4G; 4A, 4B 및 4D; 4A, 4E, 4C 및 4D; 4A, 4H 및 4J; 4A, 4H, 4I 및 4G; 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G.
일 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 (i) 6A, 6D 및 6C; 또는 (ⅱ) 6B, 6E 및 6C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 4A, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 4A, 4B 및 4D; (ⅲ) 4A, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 4A, 4H 및 4J; (v) 4A, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
어떤 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10C, 10D, 10F, 10G, 10H. 10J, 10K, 10L, 10M, 10N, 또는 10A, 10B, 10C, 10D, 10F, 10G, 10H. 10J, 10K, 10L, 10M, 10N의 임의의 조합을 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A (또한 도 10, 단계 I를 참고), 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4K, 4L, 4M, 4N 또는 4O, 또는 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4K, 4L, 4M, 4N 및 4O의 임의의 조합을 포함한다. 일 구현예에서, 10A는 PEP 카복실라제이다. 또 하나의 구현예에서, 10A는 PEP 카복시키나아제이다. 구현예에서, 10F는 옥살로아세테이트 탈수소효소이다. 다른 구현예에서, 10F는 옥살로아세테이트 산화환원효소이다. 일 구현예에서, 10K는 말로닐-CoA 합성효소이다. 또 하나의 구현예에서, 10K는 말로닐-CoA 전이효소이다. 일 구현예에서, 10M은 말레이트 탈수소효소이다. 또 하나의 구현예에서, 10M은 말레이트 산화환원효소이다. 다른 구현예에서, 10N은 피루베이트 키나아제이다. 일부 구현예에서, 10N은 PEP 포스파타제이다. 어떤 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 전이효소이다. 다른 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 가수분해효소이다. 일부 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 합성효소이다. 다른 구현예에서, 4K는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제이다. 어떤 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소이다. 일부 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA, 가수분해효소이다. 또 다른 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 합성효소이다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 도 10에서 묘사된 아세틸-CoA 경로이고, 상기 1,3-BDO 경로는 도 4에서 묘사된 1,3-BDO 경로이다. 아세틸-CoA 경로 효소의 예시적인 세트는, 도 10에 따라, 10A, 10B 및 10C; 10N, 10H, 10B 및 10C; 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C; 10A, 10B, 10G 및 10D; 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D; 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D; 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D; 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D; 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D; 10A, 10F 및 10D; 10N, 10H, 10F 및 10D; 및 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D이다. 아세틸-CoA를 1,3-BDO로 전환시키는 1,3-BDO 경로 효소의 예시적인 세트는, 도 4에 따라, 4A, 4E, 4F 및 4G; 4A, 4B 및 4D; 4A, 4E, 4C 및 4D; 4A, 4H 및 4J; 4A, 4H, 4I 및 4G; 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 (i) 10A, 10B 및 10C; (ⅱ) 10N, 10H, 10B 및 10C; (ⅲ) 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C; (ⅳ) 10A, 10B, 10G 및 10D; (v) 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D; (ⅵ) 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D; (ⅶ) 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D; (ⅷ) 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D; (ⅸ) 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D; (x) 10A, 10F 및 10D; (xi) 10N, 10H, 10F 및 10D; 또는 (ⅶ) 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 4A, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 4A, 4B 및 4D; (ⅲ) 4A, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 4A, 4H 및 4J; (v) 4A, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L. 10M, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L. 10M, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L. 10M, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L. 10M, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L. 10M, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L. 10M, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L. 10M, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L. 10M, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
추가적 구현예에서, 1,3-BDO 경로를 갖는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 비-자연 발생 진핵 유기체는, 기질을 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생성물로 전환시키는 효소 또는 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다: 아세틸-CoA에서 아세토아세틸-CoA로 (예를 들면, 4A); 아세토아세틸-CoA에서 4-하이드록시-2-부타논으로 (예를 들면, 4B); 3-옥소부티르알데하이드에서 4-하이드록시-2-부타논으로 (예를 들면, 4C); 4-하이드록시-2-부타논에서 1,3-BDO로 (예를 들면, 4D); 아세토아세틸-CoA에서 3-옥소부티르알데하이드로 (예를 들면, 4E); 3-옥소부티르알데하이드에서 3-하이드록시부티르알데하이드로 (예를 들면, 4F); 3-하이드록시부티르알데하이드에서 1,3-BDO로 (예를 들면, 4G); 아세토아세틸-CoA에서 3-하이드록시부티릴-CoA로 (예를 들면, 4H); 3-하이드록시부티릴-CoA에서 3-하이드록시부티르알데하이드로 (예를 들면, 4I), 3-하이드록시부티릴-CoA에서 1,3-BDO로 (예를 들면, 4J); 아세토아세틸-CoA에서 아세토아세테이트 (예를 들면, 4K); 아세토아세테이트에서 3-옥소부티르알데하이드로 (예를 들면, 4L); 3-하이드록시부티릴-CoA에서 3-하이드록시부티레이트로 (예를 들면, 4M); 3-하이드록시부티레이트에서 3-하이드록시부티르알데하이드로 (예를 들면, 4N); 및 아세토아세테이트에서 3-하이드록시부티레이트로 (예를 들면, 4O). 당해분야의 숙련가는, 이들은 단지 예시적이고 원하는 생성물을 생산하는데 적당하고 적절한 활성이 기질의 생성물로의 전환을 위해 이용가능한 본원 개시의 기질-생성물 쌍의 임의의 것은 본원의 교시를 기반으로 당해분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다를 것을 이해할 것이다. 따라서, 효소 또는 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 효소 또는 단백질은 1,3-BDO 경로, 예컨대 도 4에서 보여진 것의 생성물 및 기질을 전환시킨다.
아세틸-CoA 카복실라제 (7E), 아세토아세틸-CoA 합성효소 (7B) 또는 이들의 조합을 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 또한 제공된다. 도 4에서 예시된 것을 포함하는 본원에서 제공된 1,3-BDO 경로의 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA는 아세틸-CoA 카복실라제에 의해 말로닐-CoA로 전환되고, 아세토아세틸-CoA는 아세토아세틸-CoA 합성효소에 의해 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA로부터 합성된다 (참고 도 7 (단계 E 및 F) 및 도 9). 효소 또는 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 또한 제공되고, 여기서 상기 효소 또는 단백질은 1,3-BDO 경로, 예컨대 도 7에서 보여진 것의 기질 및 생성물을 전환시킨다.
어떤 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2K, 2L, 3H, 3I 또는 3J, 또는 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 3H, 3I 및 3J의 임의의 조합을 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4K, 4L, 4M, 4N 또는 4O, 또는 7E, 7F, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4K, 4L, 4M, 4N 및 4O의 임의의 조합을 포함하고; 여기서 7E는 아세틸-CoA 카복실라제이고; 여기서 7F는 아세토아세틸-CoA 합성효소이다. 일 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7B를 포함한다.
아세틸-CoA를 1,3-BDO로 전환시키는 1,3-BDO 경로 효소의 예시적인 세트는, 도 4 및 7에 따라, 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G; 7E, 7F, 4B 및 4D; 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D; 7E, 7F, 4H 및 4J; 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G; 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G; 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
어떤 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 (i) 2A, 2B 및 2D; (ⅱ) 2A, 2C 및 2D; (ⅲ) 2A, 2B, 2C 및 2D; (ⅳ) 2A, 2B, 2E 및 2F; (v) 2A, 2C, 2E 및 2F; (ⅵ) 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F; (ⅶ) 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L; (ⅷ) 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L 또는 (ⅸ) 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 여기서 상기 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 7E, 7F, 4B 및 4D; (ⅲ) 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 7E, 7F, 4H 및 4J; (v) 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 7E, 7F, 4B 및 4D; (ⅲ) 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 7E, 7F, 4H 및 4J; (v) 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 각각의 외인성 핵산은 상이한 아세틸-CoA 경로 또는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다.
다른 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 7E, 7F, 4B 및 4D; (ⅲ) 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 7E, 7F, 4H 및 4J; (v) 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 각각의 외인성 핵산은 상이한 아세틸-CoA 경로 또는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다.
다른 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 7E, 7F, 4B 및 4D; (ⅲ) 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 7E, 7F, 4H 및 4J; (v) 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C 및 2D를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 각각의 외인성 핵산은 상이한 아세틸-CoA 경로 또는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다.
다른 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 7E, 7F, 4B 및 4D; (ⅲ) 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 7E, 7F, 4H 및 4J; (v) 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 각각의 외인성 핵산은 상이한 아세틸-CoA 경로 또는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다.
다른 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 7E, 7F, 4B 및 4D; (ⅲ) 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 7E, 7F, 4H 및 4J; (v) 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 각각의 외인성 핵산은 상이한 아세틸-CoA 경로 또는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다.
다른 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 7E, 7F, 4B 및 4D; (ⅲ) 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 7E, 7F, 4H 및 4J; (v) 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E 및 2F를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 각각의 외인성 핵산은 상이한 아세틸-CoA 경로 또는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다.
일부 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 7E, 7F, 4B 및 4D; (ⅲ) 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 7E, 7F, 4H 및 4J; (v) 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 각각의 외인성 핵산은 상이한 아세틸-CoA 경로 또는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다.
일부 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 7E, 7F, 4B 및 4D; (ⅲ) 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 7E, 7F, 4H 및 4J; (v) 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 각각의 외인성 핵산은 상이한 아세틸-CoA 경로 또는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다.
일부 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 7E, 7F, 4B 및 4D; (ⅲ) 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 7E, 7F, 4H 및 4J; (v) 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 선택적으로 추가로, 2G, 3H, 3I, 3J, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 각각의 외인성 핵산은 상이한 아세틸-CoA 경로 또는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다.
어떤 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5A, 5B, 5C, 5D 5E, 5F, 5G, 5H, 5I, 5J 또는 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I 및 5J의 임의의 조합을 포함하고, 여기서 5A는 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성)이고; 5B는 아세틸-CoA 합성효소, 리가제 또는 전이효소이고; 5C는 아세테이트 키나아제이고; 5D는 포스포트랜스아세틸라제이고; 5E는 피루베이트 탈탄산효소이고; 5F는 아세트알데하이드 탈수소효소이고; 5G는 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성)이고; 5H는 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 또는 피루베이트 포르메이트 분해효소이고; 5I 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화)이고; 5J는 트레오닌 알돌라아제이고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4K, 4L, 4M, 4N 또는 4O, 또는 7E, 7F, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4K, 4L, 4M, 4N 및 4O의 임의의 조합을 포함하고; 여기서 7E, 7F는 아세토아세틸-CoA 티올라제이고; 여기서 4B는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성)이고; 여기서 4C는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원)이고; 여기서 4D는 4-하이드록시,2-부타논 환원효소이고; 여기서 4E는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성)이고; 여기서 4F는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원)이고; 여기서 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 여기서 4H는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원)이고; 여기서 4I는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성)이고; 여기서 4J는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성)이고; 여기서 4K는 아세토아세틸-CoA 전이효소, 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 아세토아세틸-CoA 합성효소, 또는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제이고; 여기서 4L은 아세토아세테이트 환원효소이고; 여기서 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소, 가수분해효소, 또는 합성효소이고; 여기서 4N은 3-하이드록시부티레이트 환원효소이고; 여기서 4O는 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소이다. 어떤 구현예에서, 5B는 아세틸-CoA 합성효소이다. 또 하나의 구현예에서, 5B는 아세틸-CoA 리가제이다. 다른 구현예에서, 5B는 아세틸-CoA 전이효소이다. 일부 구현예에서, 5H는 피루베이트 탈수소효소이다. 다른 구현예에서, 5H는 피루베이트:페레독신 산화환원효소이다. 또 다른 구현예에서, 5H는 피루베이트 포르메이트 분해효소가다. 어떤 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 전이효소이다. 다른 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 가수분해효소이다. 일부 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 합성효소이다. 다른 구현예에서, 4K는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제이다. 어떤 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소이다. 일부 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA, 가수분해효소이다. 또 다른 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 합성효소이다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 도 5에서 묘사된 아세틸-CoA 경로이고, 상기 1,3-BDO 경로는 도 4 및/또는 7에서 묘사된 1,3-BDO 경로이다. 아세틸-CoA 경로 효소의 예시적인 세트는, 도 5에 따라, 5A 및 5B; 5A, 5C 및 5D; 5G 및 5D; 5E, 5F, 5C 및 5D; 5J 및 5I; 5J, 5F 및 5B; 및 5H이다. 아세틸-CoA를 1,3-BDO로 전환시키는 1,3-BDO 경로 효소의 예시적인 세트는, 도 4 및 7에 따라, 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G; 7E, 7F, 4B 및 4D; 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D; 7E, 7F, 4H 및 4J; 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G; 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G; 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 (i) 5A 및 5B; (ⅱ) 5A, 5C 및 5D; (ⅲ) 5E, 5F, 5C 및 5D; (ⅳ) 5G 및 5D; (v) 5J 및 5I; (ⅵ) 5J, 5F 및 5B; 또는 (ⅶ) 5H를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 7E, 7F, 4B 및 4D; (ⅲ) 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 7E, 7F, 4H 및 4J; (v) 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
어떤 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 6A, 6B, 6C, 6D 또는 6E, 또는 6A, 6B, 6C, 6D 및 6E의 임의의 조합을 포함하고, 여기서 6A는 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소이고; 6B는 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소이고; 6C는 세포질 아세틸카르니틴 전이효소이고; 6D는 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제이고; 6E는 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제이고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4K, 4L, 4M, 4N 또는 4O, 또는 7E, 7F, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4K, 4L, 4M, 4N 및 4O의 임의의 조합을 포함하고; 여기서 7E, 7F는 아세토아세틸-CoA 티올라제이고; 여기서 4B는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성)이고; 여기서 4C는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원)이고; 여기서 4D는 4-하이드록시,2-부타논 환원효소이고; 여기서 4E는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성)이고; 여기서 4F는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원)이고; 여기서 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 여기서 4H는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원)이고; 여기서 4I는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성)이고; 여기서 4J는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성)이고; 여기서 4K는 아세토아세틸-CoA 전이효소, 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 아세토아세틸-CoA 합성효소, 또는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제이고; 여기서 4L은 아세토아세테이트 환원효소이고; 여기서 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소, 가수분해효소, 또는 합성효소이고; 여기서 4N은 3-하이드록시부티레이트 환원효소이고; 여기서 4O는 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소이다. 어떤 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 전이효소이다. 다른 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 가수분해효소이다. 일부 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 합성효소이다. 다른 구현예에서, 4K는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제이다. 어떤 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소이다. 일부 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA, 가수분해효소이다. 또 다른 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 합성효소이다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 도 6에서 묘사된 아세틸-CoA 경로이고, 상기 1,3-BDO 경로는 도 4 및/또는 7에서 묘사된 1,3-BDO 경로이다. 아세틸-CoA 경로 효소의 예시적인 세트는, 도 6에 따라, 6A, 6D 및 6C; 및 6B, 6E 및 6C이다. 아세틸-CoA를 1,3-BDO로 전환시키는 1,3-BDO 경로 효소의 예시적인 세트는, 도 4 및 7에 따라, 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G; 7E, 7F, 4B 및 4D; 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D; 7E, 7F, 4H 및 4J; 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G; 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G; 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 (i) 6A, 6D 및 6C; 또는 (ⅱ) 6B, 6E 및 6C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 7E, 7F, 4B 및 4D; (ⅲ) 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 7E, 7F, 4H 및 4J; (v) 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
어떤 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10C, 10D, 10F, 10G, 10H. 10J, 10K, 10L, 10M, 10N, 또는 10A, 10B, 10C, 10D, 10F, 10G, 10H. 10J, 10K, 10L, 10M, 10N의 임의의 조합을 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 7E (또한 도 10, 단계 D를 참고), 7F (또한 도 10, 단계 E를 참고), 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4K, 4L, 4M, 4N 또는 4O, 또는 7E, 7F, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4K, 4L, 4M, 4N 및 4O의 임의의 조합을 포함한다. 어떤 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 전이효소이다. 일 구현예에서, 10A는 PEP 카복실라제이다. 또 하나의 구현예에서, 10A는 PEP 카복시키나아제이다. 구현예에서, 10F는 옥살로아세테이트 탈수소효소이다. 다른 구현예에서, 10F는 옥살로아세테이트 산화환원효소이다. 일 구현예에서, 10K는 말로닐-CoA 합성효소이다. 또 하나의 구현예에서, 10K는 말로닐-CoA 전이효소이다. 일 구현예에서, 10M은 말레이트 탈수소효소이다. 또 하나의 구현예에서, 10M은 말레이트 산화환원효소이다. 다른 구현예에서, 10N은 피루베이트 키나아제이다. 일부 구현예에서, 10N은 PEP 포스파타제이다. 다른 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 가수분해효소이다. 일부 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 합성효소이다. 다른 구현예에서, 4K는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제이다. 어떤 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소이다. 일부 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA, 가수분해효소이다. 또 다른 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 합성효소이다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 도 10에서 묘사된 아세틸-CoA 경로이고, 상기 1,3-BDO 경로는 도 4 및/또는 7에서 묘사된 1,3-BDO 경로이다. 아세틸-CoA 경로 효소의 예시적인 세트는, 도 10에 따라, 10A, 10B 및 10C; 10N, 10H, 10B 및 10C; 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C; 10A, 10B, 10G 및 10D; 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D; 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D; 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D; 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D; 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D; 10A, 10F 및 10D; 10N, 10H, 10F 및 10D; 및 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D이다. 아세틸-CoA를 1,3-BDO로 전환시키는 1,3-BDO 경로 효소의 예시적인 세트는, 도 4 및 7에 따라, 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G; 7E, 7F, 4B 및 4D; 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D; 7E, 7F, 4H 및 4J; 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G; 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G; 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일 구현예에서, (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 (i) 10A, 10B 및 10C; (ⅱ) 10N, 10H, 10B 및 10C; (ⅲ) 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C; (ⅳ) 10A, 10B, 10G 및 10D; (v) 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D; (ⅵ) 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D; (ⅶ) 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D; (ⅷ) 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D; (ⅸ) 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D; (x) 10A, 10F 및 10D; (xi) 10N, 10H, 10F 및 10D; 또는 (ⅶ) 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 7E, 7F, 4B 및 4D; (ⅲ) 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 7E, 7F, 4H 및 4J; (v) 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G; (ⅵ) 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G; (ⅶ) 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 (ⅷ) 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L. 10M, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L. 10M, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L. 10M, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L. 10M, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L. 10M, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L. 10M, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L. 10M, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L. 10M, 10F 및 10D를 포함하고; 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다.
추가적 구현예에서, 1,3-BDO 경로를 갖는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 비-자연 발생 진핵 유기체는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생성물을 기질로 전환시키는 효소 또는 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다: 아세틸-CoA에서 아세토아세틸-CoA로 (예를 들면, 7E, 7F); 아세토아세틸-CoA에서 4-하이드록시-2-부타논으로 (예를 들면, 4B); 3-옥소부티르알데하이드에서 4-하이드록시-2-부타논으로 (예를 들면, 4C); 4-하이드록시-2-부타논 내지 1,3-BDO (예를 들면, 4D); 아세토아세틸-CoA에서 3-옥소부티르알데하이드로 (예를 들면, 4E); 3-옥소부티르알데하이드에서 3-하이드록시부티르알데하이드로 (예를 들면, 4F); 3-하이드록시부티르알데하이드에서 1,3-BDO로 (예를 들면, 4G); 아세토아세틸-CoA에서 3-하이드록시부티릴-CoA로 (예를 들면, 4H); 3-하이드록시부티릴-CoA에서 3-하이드록시부티르알데하이드로 (예를 들면, 4I), 3-하이드록시부티릴-CoA에서 1,3-BDO로 (예를 들면, 4J); 아세토아세틸-CoA에서 아세토아세테이트로 (예를 들면, 4K); 아세토아세테이트에서 3-옥소부티르알데하이드로 (예를 들면, 4L); 3-하이드록시부티릴-CoA에서 3-하이드록시부티레이트로 (예를 들면, 4M); 3-하이드록시부티레이트에서 3-하이드록시부티르알데하이드로 (예를 들면, 4N); 및 아세토아세테이트에서 3-하이드록시부티레이트로 (예를 들면, 4O). 당해분야의 숙련가는, 이들은 단지 예시적이고 원하는 생성물을 생산하는데 적당하고 적절한 활성이 기질의 생성물로의 전환을 위해 이용가능한 본원 개시의 기질-생성물 쌍의 임의의 것은 본원의 교시를 기반으로 당해분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다는 이해할 것이다. 따라서, 효소 또는 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 효소 또는 단백질은 1,3-BDO 경로, 예컨대 도 4 또는 7에서 보여진 것의 기질 및 생성물을 전환시킨다.
상기 언급된 효소 및/또는 그의 효소를 인코딩하는 임의의조합 및 임의의 수의 핵산은, 도 4 또는 도 7에서 예시된 바와 같이 완전한 1,3-BDO 경로를 완성하기 위해 숙주 진핵 유기체에 도입될 수 있다. 예를 들면, 비-자연 발생 진핵 유기체는 1,3-BDO 경로에서 1, 2, 3, 4, 5, 최대 모두의 핵산을 포함할 수 있고, 각각의 핵산은 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다. 그와 같은 핵산은, 이하에서 추가로 설명된 바와 같이, 이종기원 핵산, 현존하는 유전자의 부가적 복제물, 및 유전자 조절 요소를 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체의 경로는 실질적으로 혐기성 배양 배지에서 배양되도록 또한 적당하게 조작된다.
어떤 구현예에서 세포질 아세틸-CoA를 증가시키기 위한 본원에서 제공된 방법은 아세틸-CoA를 이용하는 경로를 결실 또는 약화시키는 것을 포함한다. 아세틸-CoA를 이용하는 경쟁 부산물 경로의 결실 또는 약화는 당해분야의 숙련가에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 그와 같은 경쟁 경로의 약화는, 야생형과 비교하여 감소된 효소 활성을 갖는 효소의 변종을 인코딩하는 돌연변이 형태의 핵산에 대한 경로의 효소를 인코딩하는 내인성 핵산을 대체하여 달성될 수 있다. 그와 같은 경로의 결실은, 예를 들면, 경로의 하나 이상의 효소를 인코딩하는 하나 이상의 내인성 핵산의 결실에 의해 또는 내인성 하나 이상의 핵산을 눌(null) 대립유전자 변종으로 대체하여 달성될 수 있다. 사카로마이세스 세레비시애 를 포함하는 숙주 진핵 유기체에서 내인성 핵산의 유전자 조작을 위한 예시적인 방법은 이하 및 실시예 X에서 기재되어 있다.
예를 들면, 아세틸-CoA를 이용하는 경쟁 경로에서 하나의 그와 같은 효소는 미토콘드리아 피루베이트 탈수소효소 복합물이다. 혐기성 조건 하에서 및 글루코오스 농도가 배지에서 높은 조건에서, 이러한 미토콘드리아 효소의 용량은 매우 제한적이고, 그것을 통한 유의미한 유동은 없다. 그러나, 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 비-자연 발생 진핵 유기체의 임의의 것은 조작되어 약화된 미토콘드리아 피루베이트 탈수소효소 또는 눌(null) 표현형을 발현시키고 1,3-BDO 생산을 증가시킬 수 있다. 예시적인 피루베이트 탈수소효소 유전자는 PDB1, PDA1, LAT1 및 LPD1를 포함한다. 약화 또는 결실이 1,3-BDO 생산을 개선할 수 있는 예시적인 경쟁 아세틸-CoA 소비 경로는, 비제한적으로, 미토콘드리아 TCA 사이클 및 대사 경로, 예컨대 지방산 생합성 및 아미노산 생합성을 포함한다.
어떤 구현예에서, 본원에서 제공된 진핵 유기체의 임의의 것은 하나 이상의 부산물 경로, 예컨대 도 7에서 "X"로 표시된 예시적인 부산물 경로의 하나 이상 또는 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소에 의한3-옥소부티르알데하이드의 아세토아세테이트로의 전환를 악화시키거나 결실하여 선택적으로 추가로 조작된다. 예를 들면, 일 구현예에서, 부산물 경로는 G3P를 글리세롤로 전환시키는 G3P 포스파타제를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 부산물 경로는 디하이드록시아세톤을 G3P로 전환시키는 G3P 탈수소효소, 및 G3P를 글리세롤로 전환시키는 G3P 포스파타제를 포함한다. 다른 구현예에서, 부산물 경로는 피루베이트를 아세트알데하이드로 전환시키는 피루베이트 탈탄산효소를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 부산물 경로는 아세트알데하이드를 에탄올로 전환시키는 에탄올 탈수소효소를 포함한다. 다른 구현예에서, 부산물 경로는 아세틸-CoA를 아세트알데하이드로 전환시키는 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화)및 아세트알데하이드를 에탄올로 전환시키는 에탄올 탈수소효소를 포함한다. 다른 구현예에서, 부산물 경로는 피루베이트를 아세트알데하이드로 전환시키는 피루베이트 탈탄산효소; 및 아세트알데하이드를 에탄올로 전환시키는 에탄올 탈수소효소를 포함한다. 다른 구현예에서, 부산물 경로는 아세틸-CoA를 아세트알데하이드로 전환시키는 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화)및 아세트알데하이드를 에탄올로 전환시키는 에탄올 탈수소효소를 포함한다. 어떤 구현예에서, 부산물 경로는 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 또는 아세토아세틸-CoA를 아세토아세테이트로 전환시키는 전이효소를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 부산물 경로는 3-하이드록시부티릴-CoA (3-HBCoA)를 3-하이드록시부티레이트로 전환시키는3-하이드록시부티릴-CoA-가수분해효소를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 부산물 경로는 3-하이드록시부티르알데하이드를 3-하이드록시부티레이트로 전환시키는 3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 부산물 경로는 1,3-부탄디올을 3-옥소부탄올로 전환시키는 1,3-부탄디올 탈수소효소를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 부산물 경로는 3-옥소부티르알데하이드를 아세토아세테이트로 전환시키는 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 부산물 경로는 미토콘드리아 피루베이트 탈수소효소를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 부산물 경로는 아세토아세틸-CoA 티올라제를 포함한다.
추가적 구현예에서, 1,3-BDO 경로를 갖는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 비-자연 발생 진핵 유기체는 기질을 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4L, 4N 및 4O로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생성물로 전환시키는 효소 또는 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 유기체는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함하는 1,3-BDO 경로를 포함한다. 다른 구현예에서, 유기체는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하는 1,3-BDO 경로를 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 본원에 기재된 바와 같은 부산물 경로의 하나 이상을 결실시키기 위해 추가로 조작된다.
당해분야의 숙련가는, 이들은 단지 예시적이고 원하는 생성물을 생산하는데 적당하고 적절한 활성이 기질의 생성물로의 전환을 위해 이용가능한 본원 개시의 기질-생성물 쌍의 임의의 것은 본원의 교시를 기반으로 당해분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 효소 또는 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 효소 또는 단백질은 1,3-BDO 경로, 예컨대 도 4 및 도 7에서 보여진 것의 기질 및 생성물을 전환시킨다.
임의의 조합 및 임의의 수의 상기 언급된 효소는 도 4 또는 7에서 예시된 바와 같이 숙주 진핵 유기체에 도입되어 1,3-BDO 경로를 완료할 수 있다. 예를 들면, 비-자연 발생 진핵 유기체는 1,3-BDO 경로에서 1, 2, 3, 4, 최대 모두의 핵산을 포함할 수 있고, 각각의 핵산은 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다. 그와 같은 핵산은 이하에서 추가로 설명된 바와 같이 이종기원 핵산, 현존하는 유전자의 부가적 복제물, 및 유전자 조절 요소를 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체의 경로는 실질적으로 혐기성 배양 배지에서 배양되도록 또한 적당하게 조작된다.
어떤 구현예에서, 진핵 유기체는 1,3-BDO 경로를 추가로 포함하는 것으로 언급되지만, 1,3-BDO 경로의 중간체를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소 을 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 또한 본원에서 제공되는 것으로 이해된다. 예를 들면, 본원에서 개시된 바와 같이, 1,3-BDO 경로는 도 4 또는 7에서 예시되어 있다. 따라서, 1,3-BDO를 생산하는 1,3-BDO 경로를 함유하는 진핵 유기체 외에, 1,3-BDO 경로 효소 을 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 진핵 유기체는 1,3-BDO 경로 중간체, 예를 들면, 아세토아세틸-CoA, 아세토아세테이트, 3-옥소부티르알데하이드, 3-하이드록시부티르알데하이드, 4-하이드록시-2-부타논, 3-하이드록시부티릴-CoA, 또는 3-하이드록시부티레이트를 생산한다.
도 4 또는 7의 경로를 포함하는 본원에서 개시된 임의의 경로는, 실시예들에서 기재되고 도에서 예시된 바와 같이, 원하는 바에 따라 임의의 경로 중간체 또는 생성물을 생산하는 비-자연 발생 진핵 유기체을 생성하는 것으로 이해된다. 본원에서 개시된 바와 같이, 중간체를 생산하는 그와 같은 진핵 유기체는 원하는 생성물을 생산하기 위해 다운스트림 경로 효소를 발현시키는 또 하나의 진핵 유기체와 함께 사용될 수 있다. 그러나, 1,3-BDO 경로 중간체를 생산하는 비-자연 발생 진핵 유기체는 원하는 생성물로서 중간체를 생산하기 위해 이용될 수 있는 것으로 이해된다.
아세틸-CoA의 1,3-BDO로의 전환은 도 4에서 보여진 바와 같이 약 3 내지 5 개의 효소 단계를 수반하는 수많은 경로에 의해 달성될 수 있다. 모든 경로의 제1 단계 (단계 A)에서, 아세틸-CoA는 효소 4A에 의해 아세토아세틸-CoA로 전환된다. 대안적으로, 아세틸-CoA는 아세틸-CoA 카복실라제에 의해 말로닐-CoA로 전환되고 (도 7, 단계 E), 및 아세토아세틸-CoA는 아세토아세틸-CoA 합성효소에 의해 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA로부터 합성된다 (도 7, 단계 F).
하나의 경로에서, 4A는 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시키고; 4E는 아세토아세틸-CoA를 3-옥소부티르알데하이드로 전환시키고; 4F는 3-옥소부티르알데하이드를 3-하이드록시부티르알데하이드로 전환시키고, 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드를 1,3-BDO로 전환시킨다. 또 하나의 경로에서, 4A는 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시키고; 4B는 아세토아세틸-CoA를 4-하이드록시-2-부타논으로 전환시키고; 4D는 4-하이드록시-2-부타논을 1,3-BDO로 전환시킨다. 하나의 경로에서, 4A는 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시키고; 4E는 아세토아세틸-CoA를 3-옥소부티르알데하이드로 전환시키고; 4C는 3-옥소부티르알데하이드를 4-하이드록시-2-부타논으로 전환시키고; 4D는 4-하이드록시-2-부타논을 1,3-BDO로 전환시킨다. 또 하나의 경로에서, 4A는 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시키고; 4H는 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA로 전환시키고; 4J는 3-하이드록시부티릴-CoA를 1,3-BDO로 전환시킨다. 또 하나의 경로에서, 4A는 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시키고; 4H는 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA로 전환시키고; 4I는 3-하이드록시부티릴-CoA를 3-하이드록시부티르알데하이드로 전환시키고; 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드를 1,3-BDO로 전환시킨다. 또 하나의 경로에서, 4A는 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시키고; 4H는 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA로 전환시키고; 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA를 3-하이드록시부티레이트로 전환시키고; 4N은 3-하이드록시부티레이트를 3-하이드록시부티르알데하이드로 전환시키고; 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드를 1,3-BDO로 전환시킨다. 하나의 경로에서, 4A는 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시키고; 4K는 아세토아세틸-CoA를 아세토아세테이트로 전환시키고; 4O는 아세토아세테이트를 3-하이드록시부티레이트로 전환시키고; 4N은 3-하이드록시부티레이트를 3-하이드록시부티르알데하이드로 전환시키고; 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드를 1,3-BDO로 전환시킨다. 또 하나의 경로에서, 4A는 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시키고; 4K는 아세토아세틸-CoA를 아세토아세테이트로 전환시키고; 4L은 아세토아세테이트를 3-옥소부티르알데하이드로 전환시키고; 4F는 3-옥소부티르알데하이드를 3-하이드록시부티르알데하이드로 전환시키고; 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드를 1,3-BDO로 전환시킨다.
아세틸-CoA로부터 1,3-BDO의 생산에 대해 상기에서 기재된 경로를 기반으로, 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 4A, 4E, 4F 및 4G; 4A, 4B 및 4D; 4A, 4E, 4C 및 4D; 4A, 4H 및 4J; 4A, 4H, 4I 및 4G; 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G 를 포함하는 1,3-BDO 경로 효소의 세트를 갖는다. 이들 효소를 인코딩하는 핵산의 임의의 수는 이들 효소를 인코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 최대 모두 5 개의 핵산을 포함하는 숙주 유기체에 도입될 수 있다. 1, 2, 3 또는 4 개의 외인성 핵산이 도입되는 경우, 예를 들면, 그와 같은 핵산은 5 개의 핵산의 돌연변이 당 임의의 것일 수 있다. 동일한 것은 인코딩될 효소의 수보다 작은 외인성 핵산의 임의의 다른 수에 대해 진실이다.
또 하나의 경로에서, 7E는 아세틸-CoA를 말로닐-CoA로 전환시키고 7F는 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시키고; 4E는 아세토아세틸-CoA를 3-옥소부티르알데하이드로 전환시키고; 4F는 3-옥소부티르알데하이드를 3-하이드록시부티르알데하이드로 전환시키고, 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드를 1,3-BDO로 전환시킨다. 또 하나의 경로에서, 7E는 아세틸-CoA를 말로닐-CoA로 전환시키고 7F는 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시키고; 4B는 아세토아세틸-CoA를 4-하이드록시-2-부타논으로 전환시키고; 4D는 4-하이드록시-2-부타논을 1,3-BDO로 전환시킨다. 하나의 경로에서, 7E는 아세틸-CoA를 말로닐-CoA로 전환시키고 7F는 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시키고; 4E는 아세토아세틸-CoA를 3-옥소부티르알데하이드로 전환시키고; 4C는 3-옥소부티르알데하이드를 4-하이드록시-2-부타논으로 전환시키고; 4D는 4-하이드록시-2-부타논을 1,3-BDO로 전환시킨다. 또 하나의 경로에서, 7E는 아세틸-CoA를 말로닐-CoA로 전환시키고 7F는 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시키고; 4H는 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA로 전환시키고; 4J는 3-하이드록시부티릴-CoA를 1,3-BDO로 전환시킨다. 또 하나의 경로에서, 7E는 아세틸-CoA를 말로닐-CoA로 전환시키고 7F는 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시키고; 4H는 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA로 전환시키고; 4I는 3-하이드록시부티릴-CoA를 3-하이드록시부티르알데하이드로 전환시키고; 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드를 1,3-BDO로 전환시킨다. 또 하나의 경로에서, 7E는 아세틸-CoA를 말로닐-CoA로 전환시키고 7F는 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시키고; 4H는 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA로 전환시키고; 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA를 3-하이드록시부티레이트로 전환시키고; 4N은 3-하이드록시부티레이트를 3-하이드록시부티르알데하이드로 전환시키고; 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드를 1,3-BDO로 전환시킨다. 하나의 경로에서, 7E는 아세틸-CoA를 말로닐-CoA로 전환시키고 7F는 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시키고; 4K는 아세토아세틸-CoA를 아세토아세테이트로 전환시키고; 4O는 아세토아세테이트를 3-하이드록시부티레이트로 전환시키고; 4N은 3-하이드록시부티레이트를 3-하이드록시부티르알데하이드로 전환시키고; 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드를 1,3-BDO로 전환시킨다. 또 하나의 경로에서, 7E는 아세틸-CoA를 말로닐-CoA로 전환시키고 7F는 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시키고; 4K는 아세토아세틸-CoA를 아세토아세테이트로 전환시키고; 4L은 아세토아세테이트를 3-옥소부티르알데하이드로 전환시키고; 4F는 3-옥소부티르알데하이드를 3-하이드록시부티르알데하이드로 전환시키고; 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드를 1,3-BDO로 전환시킨다.
아세틸-CoA로부터 1,3-BDO의 생산에 대해 상기에서 기재된 경로를 기반으로, 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G; 7E, 7F, 4B 및 4D; 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D; 7E, 7F, 4H 및 4J; 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G; 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G; 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G 를 포함하는 1,3-BDO 경로 효소의 세트를 갖는다. 이들 효소를 인코딩하는 핵산의 임의의 수는 이들 효소를 인코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 최대 모두 5 개의 핵산을 포함하는 숙주 유기체에 도입될 수 있다. 1, 2, 3 또는 4 개의 외인성 핵산이 도입되는 경우, 예를 들면, 그와 같은 핵산은 5 개의 핵산의 돌연변이 당 임의의 것일 수 있다. 동일한 것은 인코딩될 효소의 수보다 작은 외인성 핵산의 임의의 다른 수에 대해 진실이다.
유기체는 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이 예시적인 부산물 경로 ("X")의 하나 이상을 결실하기 위해 선택적으로 추가로 조작될 수 있다. 아세틸-CoA로부터 1,3-BDO의 생산에 대한 이들 경로를 기반으로, 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G 를 포함하는 1,3-BDO 경로 효소의 세트를 갖는다. 이들 효소를 인코딩하는 핵산의 임의의 수는 이들 효소를 인코딩하는 1, 2, 3, 4 또는 최대 모두 5 개의 핵산을 포함하는 숙주 유기체에 도입될 수 있다. 1, 2, 또는 3 개의 외인성 핵산이 도입되는 경우, 예를 들면, 그와 같은 핵산은 4 또는 5 개의 핵산의 돌연변이 당 임의의 것일 수 있다. 동일한 것은 인코딩될 효소의 수보다 작은 외인성 핵산의 임의의 다른 수에 대해 진실이다.
4.3 조합된 세포질//미토콘드리아 1,3- BDO 경로
진핵 유기체는, 본원에서 제공된 바와 같이, 조합된 미토콘드리아/세포질 1,3-BDO 경로로 탄소 및 환원 등가물을 효율적으로 이끌기 위해 또한 조작될 수 있다. 그와 같은 경로는 미토콘드리아에서 모노카복실 1,3-BDO 경로 중간체 예컨대 아세토아세테이트 또는 3-하이드록시부티레이트의 합성, 경로 중간체의 사이토졸로의 수송, 및 사이토졸에서 중간체의 1,3-BDO로의 차후의 전환을 필요로 한다. 예시적인 조합된 미토콘드리아/세포질 1,3-BDO 경로는 도 8에서 묘사된다.
조합된 미토콘드리아/세포질 1,3-BDO 생산 경로를 사용하여 1,3-BDO를 생산하는데 몇 개의 이점이 있다. 하나의 이점은 아세틸-CoA, 주요 1,3-BDO 경로 전구체의 자연적으로 풍부한 미토콘드리아 풀(pool)이다. 1,3-BDO 경로 폭(span) 다중 구획을 갖는 것은, 경로 효소가 그의 기질에 위해 적절하게 선택되지 않으면, 또한 유리할 수 있다. 예를 들면, 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 및 3-하이드록시부티르알데하이드 효소는 또한 아세틸-CoA를 에탄올로 환원시킬 수 있다. 따라서 미토콘드리아에서아세틸-CoA 풀(pool)의 격리는 아세틸-CoA로부터 유도된 부산물의 형성을 감소시킬 수 있다. 조합된 미토콘드리아/세포질 1,3-BDO 경로는 미토콘드리아 아세틸-CoA 소비 효소 또는 경로 예컨대 TCA 사이클의 약화로부터 유익할 수 있다.
아세토아세테이트 및 3-하이드록시부티레이트는 피루베이트 및/또는 모노카복실레이트 수송체에 의해 미토콘드리아 밖으로 쉽게 수송된다. 피루베이트의 흡수 및 또한 아세토아세테이트를 위한 양성자 동반수송체의 존재는 단리된 미토콘드리아에서 실증되었다 (Briquet, Biochem Biophys Acta 459:290-99 (1977)). 그러나, 이러한 수송체를 인코딩하는 유전자는 현재까지 확인되지 않았다. S. 세레비스시애는 5 개의 추정 모노카복실레이트 수송체 (MCH1-5)를 인코딩하고, 그 것의 몇 개는 미토콘드리아 막으로 국한될 수 있다 (Makuc 등, Yeast 18:1131-43 (2001)). NDT1은 또 하나의 추정 피루베이트 수송체이지만, 이러한 단백질의 역할은 문헌에서 논쟁의 여지가 있다 (Todisco 등, J Biol Chem 20:1524-31 (2006)). 예시적인 모노카복실레이트 수송체는 하기 표에서 보여진다:
표 1
Figure pct00001
어떤 구현예에서, 조합된 미토콘드리아/세포질 1,3-BDO 경로는 8A, 8B, 8C, 8D, 8E, 8F, 8G, 8H, 8I, 8J, 8K, 7E, 7F, 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4K, 4L, 4M, 4N, 및 4O, 또는 8A, 8B, 8C, 8D, 8E, 8F, 8G, 8H, 8I, 8J, 8K, 7E, 7F, 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4K, 4L, 4M, 4N, 및 4O의 임의의 조합을 포함하고, 여기서 8A는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 티올라제이고; 8B는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 환원효소이고; 8C는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8D는 미토콘드리아 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소이고, 전이효소 또는 합성효소이고; 8E는 미토콘드리아이다. 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소이고; 8F는 아세토아세테이트 수송체이고; 8G는 3-하이드록시부티레이트 수송체이고; 8H는 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소 또는 합성효소이고, 8I는 세포질 아세토아세틸-CoA 전이효소 또는 합성효소이고, 8J는 미토콘드리아 아세틸-CoA 카복실라제이고; 8K는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 합성효소이고; 7E는 아세틸-CoA 카복실라제이고, 7F는 아세토아세틸-CoA 합성효소이고, 4A는 아세토아세틸-CoA 티올라제이고; 4B는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성)이고; 4C는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원)이고; 4D는 4-하이드록시,2-부타논 환원효소이고; 4E는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성)이고; 4F는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원)이고; 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 4H는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원)이고; 4I는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성)이고; 4J는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성)이고; 4K는 아세토아세틸-CoA 전이효소, 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 아세토아세틸-CoA 합성효소, 또는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제이고; 4L은 아세토아세테이트 환원효소이고; 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소, 가수분해효소, 또는 합성효소이고; 4N은 3-하이드록시부티레이트 환원효소이고; 여기서 4O는 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소이다. 어떤 구현예에서, 8C는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 가수분해효소이다. 다른 구현예에서, 8C는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 전이효소이다. 어떤 구현예에서, 8C는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 합성효소이다. 어떤 구현예에서 8D는 미토콘드리아 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소이다. 다른 구현예에서 8D는 미토콘드리아 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소이다. 어떤 구현예에서 8D는 미토콘드리아 3-하이드록시부티릴-CoA 합성효소. 어떤 구현예에서, 8H는 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소이다. 다른 구현예에서, 8H는 3-하이드록시부티릴-CoA 합성효소. 어떤 구현예에서, 8I는 세포질 아세토아세틸-CoA 전이효소이다. 다른 구현예에서, 8I는 세포질 아세토아세틸-CoA 합성효소. 어떤 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 전이효소이다. 다른 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 가수분해효소이다. 일부 구현예에서, 4K는 아세토아세틸-CoA 합성효소이다. 다른 구현예에서, 4K는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제이다. 어떤 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소이다. 일부 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA, 가수분해효소이다. 또 다른 구현예에서, 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 합성효소이다.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 아세토아세테이트 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 아세토아세테이트를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세토아세테이트 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 아세토아세테이트 경로는 8A, 8C, 및 8F를 포함하고, 여기서 8A는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 티올라제이고; 8C는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8F는 아세토아세테이트 수송체이고; (2) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 4O, 4N, 및 4G; 및 (ⅱ) 4L, 4F, 및 4G로부터 선택된 경로를 포함하고; 여기서 4F는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원)이고; 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 4L은 아세토아세테이트 환원효소이고; 4N은 3-하이드록시부티레이트 환원효소이고; 4O는 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소이다. 일부 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4L, 4F, 및 4G를 포함한다.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 아세토아세테이트 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 아세토아세테이트를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세토아세테이트 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 아세토아세테이트 경로는 8J, 8K, 8C, 및 8F를 포함하고, 여기서 8J는 미토콘드리아 아세틸-CoA 카복실라제이고; 8K는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 합성효소이고; 8C는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8F는 아세토아세테이트 수송체이고; (2) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 4O, 4N, 및 4G; 및 (ⅱ) 4L, 4F, 및 4G로부터 선택된 경로를 포함하고; 여기서 4F는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원)이고; 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 4L은 아세토아세테이트 환원효소이고; 4N은 3-하이드록시부티레이트 환원효소이고; 4O는 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소이다. 일부 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4L, 4F, 및 4G를 포함한다.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 아세토아세틸-CoA 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 아세토아세틸-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세토아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 아세토아세틸-CoA 경로는 8A, 8C, 8F 및 8I를 포함하고, 여기서 8A는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 티올라제이고; 8C는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8F는 아세토아세테이트 수송체이고; 8I는 세포질 아세토아세틸-CoA 전이효소 또는 합성효소이고; (2) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 4B 및 4D; (ⅲ) 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 4H 및 4J; (v) 4H, 4I 및 4G; 및 (ⅵ) 4H, 4M, 4N 및 4G로부터 선택된 경로를 포함하고; 여기서 4B는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성)이고; 4C는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원)이고; 4D는 4-하이드록시,2-부타논 환원효소이고; 4E는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성)이고; 4F는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원)이고; 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 4H는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원)이고; 4I는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성)이고; 4J는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성)이고; 4L은 아세토아세테이트 환원효소이고; 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소, 가수분해효소, 또는 합성효소이고; 4N은 3-하이드록시부티레이트 환원효소이다. 일부 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4B 및 4D를 포함한다. 다른 구현예에서, 1,3-BDO 경로는 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 1,3-BDO 경로는 4H 및 4J를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 아세토아세틸-CoA 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 아세토아세틸-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세토아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 아세토아세틸-CoA 경로는 8J, 8K, 8C, 8F 및 8I를 포함하고, 여기서 8J는 미토콘드리아 아세틸-CoA 카복실라제이고; 8K는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 합성효소이고; 8C는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8F는 아세토아세테이트 수송체이고; 8I는 세포질 아세토아세틸-CoA 전이효소 또는 합성효소이고; (2) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 4E, 4F 및 4G; (ⅱ) 4B 및 4D; (ⅲ) 4E, 4C 및 4D; (ⅳ) 4H 및 4J; (v) 4H, 4I 및 4G; 및 (ⅵ) 4H, 4M, 4N 및 4G로부터 선택된 경로를 포함하고; 여기서 4B는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성)이고; 4C는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원)이고; 4D는 4-하이드록시,2-부타논 환원효소이고; 4E는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성)이고; 4F는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원)이고; 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 4H는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원)이고; 4I는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성)이고; 4J는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성)이고; 4L은 아세토아세테이트 환원효소이고; 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소, 가수분해효소, 또는 합성효소이고; 4N은 3-하이드록시부티레이트 환원효소이다. 일부 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4B 및 4D를 포함한다. 다른 구현예에서, 1,3-BDO 경로는 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 1,3-BDO 경로는 4H 및 4J를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 3-하이드록시부티레이트 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 3-하이드록시부티레이트를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 3-하이드록시부티레이트 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 3-하이드록시부티레이트 경로는 (i) 8A, 8B, 8D 및 8G; 및 (ⅱ) 8A, 8C, 8E 및 8G로부터 선택된 경로를 포함하고; 여기서 8A는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 티올라제이고; 8B는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 환원효소이고; 8C는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8D는 미토콘드리아 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8E는 미토콘드리아 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소이고; 8G는 3-하이드록시부티레이트 수송체이고; (2) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 1,3-BDO 경로는 4N 및 4G를 포함하고, 여기서 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 4N은 3-하이드록시부티레이트 환원효소이다. 일 구현예에서, 3-하이드록시부티레이트 경로는 8A, 8B, 8D 및 8G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 3-하이드록시부티레이트 경로는 8A, 8C, 8E 및 8G를 포함한다.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 3-하이드록시부티레이트 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 3-하이드록시부티레이트를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 3-하이드록시부티레이트 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 3-하이드록시부티레이트 경로는 (i) 8J, 8K, 8B, 8D 및 8G; 및 (ⅱ) 8J, 8K, 8C, 8E 및 8G로부터 선택된 경로를 포함하고; 여기서 8J는 미토콘드리아 아세틸-CoA 카복실라제이고; 8K는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 합성효소이고; 8B는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 환원효소이고; 8C는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8D는 미토콘드리아 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8E는 미토콘드리아 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소이고; 8G는 3-하이드록시부티레이트 수송체이고; (2) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 1,3-BDO 경로는 4N 및 4G를 포함하고, 여기서 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 4N은 3-하이드록시부티레이트 환원효소이다. 일 구현예에서, 3-하이드록시부티레이트 경로는 8J, 8K, 8B, 8D 및 8G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 3-하이드록시부티레이트 경로는 8J, 8K, 8C, 8E 및 8G를 포함한다.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 3-하이드록시부티릴-CoA 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 3-하이드록시부티릴-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 3-하이드록시부티릴-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 3-하이드록시부티릴-CoA 경로는 (i) 8A, 8B, 8D, 8G 및 8H; 및 (ⅱ) 8A, 8C, 8E, 8G 및 8H로부터 선택된 경로를 포함하고; 여기서 8A는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 티올라제이고; 8B는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 환원효소이고; 8C는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8D는 미토콘드리아 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8E는 미토콘드리아 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소이고; 8G는 3-하이드록시부티레이트 수송체이고; 8H는 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소 또는 합성효소이고, (2) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 4I 및 4G; 및 (ⅱ) 4J로부터 선택된 경로를 포함하고; 여기서 4I는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성)이고; 여기서 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 4J는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성)이다. 어떤 구현예에서, 3-하이드록시부티릴-CoA 경로는 8A, 8B, 8D, 8G, 및 8H를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4I 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 3-하이드록시부티릴-CoA 경로는 8A, 8B, 8D, 8G, 및 8H를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4J를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 3-하이드록시부티릴-CoA 경로는 8A, 8C, 8E, 8G, 및 8H를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4I 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 3-하이드록시부티릴-CoA 경로는 8A, 8C, 8E, 8G, 및 8H를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4J를 포함한다.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 3-하이드록시부티릴-CoA 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 3-하이드록시부티릴-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 3-하이드록시부티릴-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 3-하이드록시부티릴-CoA 경로는 (i) 8J. 8K, 8B, 8D, 8G 및 8H; 및 (ⅱ) 8J, 8K, 8C, 8E, 8G 및 8H로부터 선택된 경로를 포함하고; 여기서 8J는 미토콘드리아 아세틸-CoA 카복실라제이고; 8K는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 합성효소이고; 8B는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 환원효소이고; 8C는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8D는 미토콘드리아 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8E는 미토콘드리아 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소이고; 8G는 3-하이드록시부티레이트 수송체이고; 8H는 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소 또는 합성효소이고, (2) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 1,3-BDO 경로는 (i) 4I 및 4G; 및 (ⅱ) 4J로부터 선택된 경로를 포함하고; 여기서 4I는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성)이고; 여기서 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 4J는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성)이다. 어떤 구현예에서, 3-하이드록시부티릴-CoA 경로는 8A, 8B, 8D, 8G, 및 8H를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4I 및 4G를 포함한다. 다른 구현예에서, 3-하이드록시부티릴-CoA 경로는 8A, 8B, 8D, 8G, 및 8H를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4J를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 3-하이드록시부티릴-CoA 경로는 8J, 8K, 8C, 8E, 8G, 및 8H를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4I 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 3-하이드록시부티릴-CoA 경로는 8J, 8K, 8C, 8E, 8G, 및 8H를 포함하고, 상기 1,3-BDO 경로는 4J를 포함한다.
당해분야의 숙련가는, 이들은 단지 예시적이고 원하는 생성물을 생산하는데 적당하고 적절한 활성이 기질의 생성물로의 전환을 위해 이용가능한 본원 개시의 기질-생성물 쌍의 임의의 것은 본원의 교시를 기반으로 당해분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 효소 또는 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 효소 또는 단백질은 조합된 미토콘드리아/세포질 1,3-BDO 경로, 예컨대 도 8에서 보여진 것의 기질 및 생성물을 전환시킨다.
임의의 조합 및 임의의 수의 상기 언급된 효소는, 도 8에서 예시된 바와 같이, 조합된 미토콘드리아/세포질 1,3-BDO 경로를 완료하도록 숙주 진핵 유기체에 도입될 수 있다. 예를 들면, 비-자연 발생 진핵 유기체는 조합된 미토콘드리아/세포질 1,3-BDO 경로에서1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 최대 모두의 핵산을 포함할 수 있다, 각각의 핵산은 조합된 미토콘드리아/세포질 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩한다. 그와 같은 핵산은 이하에서 추가로 설명된 바와 같이 이종기원 핵산, 현존하는 유전자의 부가적 복제물, 및 유전자 조절 요소를 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체의 경로는 실질적으로 혐기성 배양 배지에서 배양되도록 또한 적당하게 조작된다.
4.4 보조인자 용법의 균형
1,3-BDO 생산 경로, 예컨대 도 4에서 묘사된 것은 환원된 보조인자 예컨대 NAD(P)H를 필요로 한다. 따라서, 1,3-BDO의 증가된 생산은 1,3-BDO 생산 경로에서 사용된 NAD(P)H 보조인자를 공급하는 경로를 포함하도록 본원에서 기재된 비-자연 발생 진핵 유기체의 임의의 것을 조작하여 부분적으로 달성될 수 있다. 진핵 유기체, 예컨대 몇 개의 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 칸디다, 아스페르길러스, 및 야로위아 종을 포함하는 몇 개의 유기체에서, NADH는, NADH이 당분해에 의해 다량으로 생산되기 때문에, 사이토졸에서 NADPH보다 더 풍부하다. NADH의 수준은 하기 효소 또는 효소 세트의 임의의 것을 통해 피루베이트를 아세틸-CoA로 전환시켜서 이들 진핵 유기체에서 증가될 수 있다: 1) NAD-의존적 피루베이트 탈수소효소; 2) 피루베이트 포르메이트 분해효소 및 NAD-의존적 포르메이트 탈수소효소; 3) 피루베이트:페레독신 산화환원효소 및 NADH:페레독신 산화환원효소; 4) 피루베이트 탈탄산효소 및 NAD-의존적 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소; 5) 피루베이트 탈탄산효소, NAD-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 아세테이트 키나아제, 및 포스포트랜스아세틸라제; 6) 피루베이트 탈탄산효소, NAD-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 및 아세틸-CoA 합성효소.
도 4에서 보여진 바와 같이, 아세틸-CoA의 1,3-BDO로의 전환은 3 개의 환원 단계를 통해 부분적으로 일어날 수 있다. 각각의 이들 3 개의 환원 단계는 환원제로서 NADPH 또는 NADH를 이용하고, 이들은 차례차례 NADP 또는 NAD의 분자로 각각 전환된다. 일부 유기체의 사이토졸에서 NADH의 존재비를 고려할 때, 일부 구현예에서 환원제로서 NADH를 허용하기 위해 상기 1,3-BDO 경로의 모든 환원 단계에 대해 유익할 수 있다. 따라서 고수율의 1,3-BDO는 하기에 의해 달성될 수 있다: 1) 다른 환원 등가물 예컨대 NADPH보다 NADH에 대해 강한 선호를 갖는 내인성 또는 외인성 1,3-BDO 경로 효소를 확인 및 시행하는 단계; 2) NADPH-의존적 감소 활성의 원인인 하나 이상의 내인성 1,3-BDO 경로 효소를 약화시키는 단계; 3) 천연 버전보다 NADH에 대해 더 강한 선호를 갖도록 내인성 또는 외인성 1,3-BDO 경로 효소의 보조인자 특이성를 변경하는 단계, 및/또는 4) 천연 버전보다 NADPH에 대해 더 약한 선호를 갖도록 내인성 또는 외인성 1,3-BDO 경로 효소의 보조인자 특이성을 변경하는 단계.
또 하나의 측면에서, 비-자연 발생 진핵 유기체에 도입될 외인성 1,3-BDO 경로 효소를 선택하는 방법이 본원에서 제공되고, 여기서 상기 외인성 1,3-BDO 경로 효소는 유기체에서 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현되고, 상기 방법은 하기를 포함한다: (i) 보조인자로서 NADH를 사용하는 적어도 하나의 1,3-BDO 경로 효소의 활성을 측정하는 단계; (ⅱ) 보조인자로서 NADPH를 사용하는 적어도 1,3-BDO 경로 효소의 활성을 측정하는 단계; 및 (ⅲ) 단계 (i) 및 (ⅱ)에서 결정된 바와 같이, 보조인자로서 NADPH보다 NADH에 대해 더 큰 선호도를 갖는 적어도 하나의 1,3-BDO 경로 효소를 상기 유기체에 도입하는 단계.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 추가로, 하기를 포함한다: (1) 상기 유기체가 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로; (2) 상기 유기체가 유기체에서 NADH를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 아세틸-CoA 경로; 여기서 상기 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다: (i.) NAD-의존적 피루베이트 탈수소효소; (ⅱ.) 피루베이트 포르메이트 분해효소 및 NAD-의존적 포르메이트 탈수소효소; (ⅲ.) 피루베이트:페레독신 산화환원효소 및 NADH:페레독신 산화환원효소; (ⅳ.) 피루베이트 탈탄산효소 및 NAD-의존적 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소; (v.) 피루베이트 탈탄산효소, NAD-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 아세테이트 키나아제, 및 포스포트랜스아세틸라제; 또는 (ⅵ.) 피루베이트 탈탄산효소, NAD-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 및 아세틸-CoA 합성효소. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 NAD-의존적 피루베이트 탈수소효소를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 피루베이트 포르메이트 분해효소 및 NAD-의존적 포르메이트 탈수소효소를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 피루베이트:페레독신 산화환원효소 및 NADH:페레독신 산화환원효소를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 피루베이트 탈탄산효소 및 NAD-의존적 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 피루베이트 탈탄산효소, NAD-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 아세테이트 키나아제, 및 포스포트랜스아세틸라제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 피루베이트 탈탄산효소, NAD-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 및 아세틸-CoA 합성효소를 포함한다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 추가로, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4L, 4N, 및 4O로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 하나 이상의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고; 여기서 적어도 하나의 핵산은 변경되었고 이로써 핵산에 의해 인코딩된 1,3-BDO 경로 효소는 미변경된 또는 야생형 핵산에 인코딩된 1,3-BDO 경로 효소보다 NADH에 대해 더 큰 친화도를 갖는다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4B를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4C를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4D를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4E를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4F를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4H를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4I를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4J를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4L을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4N을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4O를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4B 및 4D를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4E, 4C 및 4D를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 c4E, 4F 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4L, 4F 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4H, 4N 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4H 및 4J를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4H, 4I 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4L, 4F 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4O, 4N 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4A, 4N 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 추가로, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4L, 4N 및 4O로 이루어진 그룹으로부터 선택된 약화된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 하나 이상의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고; 여기서 상기 약화된 1,3-BDO 경로 효소는 NAPDH-의존적이고 비변경된 또는 야생형 핵산에 인코딩된 1,3-BDO 경로 효소와 비교할 때 더 낮은 효소 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4B를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4C를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4D를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4E를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4F를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4H를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4I를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4J를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4N을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4O를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4B 및 4D를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4E, 4C 및 4D를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 c4E, 4F 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4L, 4F 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4H, 4N 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4H 및 4J를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4H, 4I 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4L, 4F 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4O, 4N 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4A, 4N 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 추가로, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4L, 4N, 및 4O로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 하나 이상의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고; 여기서 적어도 하나의 핵산은 변경되었고 이로써 핵산에 의해 인코딩된 1,3-BDO 경로 효소는 미변경된 또는 야생형 핵산에 인코딩된 1,3-BDO 경로 효소보다 NADPH에 대해 더 낮은 친화도를 갖는다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4B를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4C를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4D를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4E를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4F를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4H를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4I를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4J를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4N을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4O를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4B 및 4D를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4E, 4C 및 4D를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 c4E, 4F 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4L, 4F 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4H, 4N 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4H 및 4J를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4H, 4I 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4L, 4F 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4O, 4N 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 4A, 4N 및 4G를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 추가로, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4L, 4N 및 4O로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1,3-BDO 경로 효소 를 인코딩하는 하나 이상의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고; 여기서 상기 진핵 유기체는 내인성 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소의 활성을 약화시키는 하나 이상의 유전자 파손을 포함하고다.
대안적으로, 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 1,3-BDO 경로를 포함하고, 여기서 상기 1,3-BDO 경로 효소의 하나 이상은 NADPH를 보조인자로서 이용한다. 따라서, 더 큰 수율의 1,3-BDO를 달성하기 위해 이들 진핵 유기체 NADPH의 생산을 증가시키는 것이 유익할 수 있다. NADPH의 세포질 생산을 증가시키는 몇 개의 접근법이 시행될 수 있고, 그 접근법은 야생형에 대해 펜토스 포스페이트 경로의 산화적 분기를 통해 증가된 양의 유동을 채널링하고, 야생형에 대해 엔트너 듀도르프 경로를 통해 증가된 양의 유동을 채널링하고, NADH를 NADPH로 전환하기 위해 가용성 또는 막-결합 수소전달효소를 도입하거나, 하기 효소의 NADP-의존적 버전을 이용하는 것을 포함한다: 인산화 또는 비-인산화 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소, 피루베이트 탈수소효소, 포르메이트 탈수소효소, 또는 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소. NADPH의 세포질 생산을 증가시키는 방법은 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소, 피루베이트 탈수소효소, 포르메이트 탈수소효소, 또는 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소를 포함하는 원상태 NAD-의존적 효소를 제거 또는 약화하여 증강될 수 있다. 증가된 NADPH 이용가능성를 조작하는 방법이 실시예 IX에서 기재된다.
또 하나의 측면에서 하기를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 제공된다: (1) 상기 유기체가 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로; 및 (2) 펜토스 포스페이트 경로, 여기서 상기 유기체는 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 6-포스포글루코노락토나제, 및 6 포스포글루코네이트 탈수소효소 (탈카복실화)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펜토스 포스페이트 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함한다. 어떤 구현예에서, 유기체는 추가로, 펜토스 포스페이트 경로로 대사 유동을 증가시키는 유전적 변이를 포함한다.
또 하나의 측면에서 하기를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 제공된다: (1) 상기 유기체가 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로; 및 (2) 엔트너 듀도르프 경로, 여기서 상기 유기체는 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 6-포스포글루코노락토나제, 포스포글루코네이트 탈수효소, 및 2-케토-3-데옥시글루코네이트 6-포스페이트 알돌라아제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 엔트너 듀도르프 경로 효소 을 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함한다. 어떤 구현예에서, 유기체는 추가로, 엔트너 듀도르프 경로로 대사 유동을 증가시키는 유전적 변이를 포함한다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 추가로, 하기를 포함한다: (1) 상기 유기체가 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로; 및 (2) 가용성 또는 막-결합 수소전달효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산, 여기서 상기 수소전달효소는 NADH를 NADPH로 전환하는데 충분한 수준에서 발현된다.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 상기 유기체가 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로; 및 (2) NADP-의존적 인산화 또는 비-인산화 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 상기 유기체가 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로; 및 (2) 상기 유기체가 유기체에서 NADPH를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 아세틸-CoA 경로; 여기서 상기 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다: (i) NADP-의존적 피루베이트 탈수소효소; (ⅱ) 피루베이트 포르메이트 분해효소 및 NADP-의존적 포르메이트 탈수소효소; (ⅲ) 피루베이트:페레독신 산화환원효소 및 NADPH:페레독신 산화환원효소; (ⅳ) 피루베이트 탈탄산효소 및 NADP-의존적 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소; (v) 피루베이트 탈탄산효소, NADP-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 아세테이트 키나아제, 및 포스포트랜스아세틸라제; 또는 (ⅵ) 피루베이트 탈탄산효소, NADP-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 및 아세틸-CoA 합성효소. 일 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 NADP-의존적 피루베이트 탈수소효소를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 피루베이트 포르메이트 분해효소 및 NADP-의존적 포르메이트 탈수소효소를 포함한다. 다른 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 피루베이트:페레독신 산화환원효소 및 NADPH:페레독신 산화환원효소를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 피루베이트 탈탄산효소 및 NADP-의존적 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 피루베이트 탈탄산효소, NADP-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 아세테이트 키나아제, 및 포스포트랜스아세틸라제를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아세틸-CoA 경로는 피루베이트 탈탄산효소, NADP-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 및 아세틸-CoA 합성효소를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 유기체는 추가로, 내인성 NAD-의존적 피루베이트 탈수소효소, NAD-의존적 포르메이트 탈수소효소, NADH:페레독신 산화환원효소, NAD-의존적 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소, 또는 NAD-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소을 약화시키는 하나 이상의 유전자 파손을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 유기체는 내인성 NAD-의존적 피루베이트 탈수소효소, NAD-의존적 포르메이트 탈수소효소, NADH:페레독신 산화환원효소, NAD-의존적 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소, 또는 NAD-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소의 활성을 약화시키는 하나 이상의 유전자 파손을 추가로 포함한다.
또 하나의 측면에서, 하기를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공된다: (1) 상기 유기체가 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로; 및 (2) 인산화 또는 비-인산화 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소; 피루베이트 탈수소효소; 포르메이트 탈수소효소; 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소로 이루어진 그룹으로부터 선택된 NAD(P)H 보조인자 효소를 인코딩하는 하나 이상의 내인성 및/또는 외인성 핵산; 여기서 NAD(P)H 보조인자 효소를 인코딩하는 하나 이상의 핵산은 변경되었고 이로써 핵산에 의해 인코딩된 NAD(P)H 보조인자 효소는 미변경된 또는 야생형 핵산에 의해 인코딩된 NAD(P)H 보조인자 효소보다 NADPH에 대해 더 큰 친화도를 갖는다. 일 구현예에서, NAD(P)H 보조인자 효소는 인산화 또는 비-인산화 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소이다. 또 하나의 구현예에서, NAD(P)H 보조인자 효소는 피루베이트 탈수소효소이다. 또 하나의 구현예에서, NAD(P)H 보조인자 효소는 포르메이트 탈수소효소이다. 또 하나의 구현예에서, NAD(P)H 보조인자 효소는 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소이다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 추가로, 하기를 포함한다: (1) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 NADPH 의존적 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고; (2) 인산화 또는 비-인산화 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소; 피루베이트 탈수소효소; 포르메이트 탈수소효소; 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소로 이루어진 그룹으로부터 선택된 NAD(P)H 보조인자 효소를 인코딩하는 하나 이상의 내인성 및/또는 외인성 핵산; 여기서 NAD(P)H 보조인자 효소 핵산을 인코딩하는 하나 이상의 핵산은 변경되었고 이로써 그 핵산이 인코딩하는 NAD(P)H 보조인자 효소는 미변경된 또는 야생형 핵산에 의해 인코딩된 NAD(P)H 보조인자 효소보다 NADH에 대해 더 작은 친화도를 갖는다. 일 구현예에서, NAD(P)H 보조인자 효소는 인산화 또는 비-인산화 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소이다. 또 하나의 구현예에서, NAD(P)H 보조인자 효소는 피루베이트 탈수소효소이다. 또 하나의 구현예에서, NAD(P)H 보조인자 효소는 포르메이트 탈수소효소이다. 또 하나의 구현예에서, NAD(P)H 보조인자 효소는 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소이다.
상기에서 제공된 진핵 유기체의 일 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 진핵 유기체는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아세틸-CoA 경로를 추가로 포함한다: (i) 2A, 2B 및 2D; (ⅱ) 2A, 2C 및 2D; (ⅲ) 2A, 2B, 2E 및 2F; (ⅳ) 2A, 2C, 2E 및 2F; (v) 2A, 2B, 2E, 2K, 및 2L; (ⅵ.) 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L; (ⅶ) 5A 및 5B; (ⅷ) 5A, 5C 및 5D; (ⅸ) 5E, 5F, 5C 및 5D; (x) 5G 및 5D; (xi) 6A, 6D 및 6C; (ⅶ) 6B, 6E 및 6C; (xⅲ) 10A, 10B 및 10C; (xⅳ) 10N, 10H, 10B 및 10C; (xv) 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C; (xⅵ) 10A, 10B, 10G 및 10D; (xⅶ) 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D; (xⅷ) 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D; (xⅸ) 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xx) 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xxi) 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xⅶ) 10A, 10F 및 10D; (xxⅲ) 10N, 10H, 10F 및 10D; 및 (xxⅳ) 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D.
상기 제공된 진핵 유기체의 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 진핵 유기체는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아세틸-CoA 경로를 추가로 포함한다: (i) 2A, 2B 및 2D; (ⅱ) 2A, 2C 및 2D; (ⅲ) 2A, 2B, 2E 및 2F; (ⅳ) 2A, 2C, 2E 및 2F; (v) 2A, 2B, 2E, 2K, 및 2L; (ⅵ.) 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L; (ⅶ) 5A 및 5B; (ⅷ) 5A, 5C 및 5D; (ⅸ) 5E, 5F, 5C 및 5D; (x) 5G 및 5D; (xi) 6A, 6D 및 6C; (ⅶ) 6B, 6E 및 6C; (xⅲ) 10A, 10B 및 10C; (xⅳ) 10N, 10H, 10B 및 10C; (xv) 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C; (xⅵ) 10A, 10B, 10G 및 10D; (xⅶ) 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D; (xⅷ) 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D; (xⅸ) 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xx) 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xxi) 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xⅶ) 10A, 10F 및 10D; (xxⅲ) 10N, 10H, 10F 및 10D; 및 (xxⅳ) 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D.
4.5 산화환원 비의 증가
진핵 유기체의 사이토졸에서 1,3-BDO의 합성은 충분한 탄소 및 환원 등가물의 이용가능성을 필요로 한다. 따라서, 작동의 임의의 특정한 이론에 구속되지 않으면서, NAD(P)H 대 NAD(P)의 산화환원 비의 증가는 순방향으로 상기 1,3-BDO 경로를 유도하는데 도움이 될 수 있다. NAD(P)H 대 NAD(P)의 산화환원 비를 증가시키는 방법은 호흡을 제거하고, 감소된 부산물을 생산하는 경쟁 경로를 약화 또는 제거하고, NADH 탈수소효소에 의해 NADH의 사용을 약화 또는 제거하고, 구획 사이의 산화환원 셔틀을 약화 또는 제거하는 것을 포함한다.
1,3-BDO의 형성을 가능하게 하기 위해 증가된 수의 환원 등가물, 예컨대 NAD(P)H를 제공하기 위한 하나의 예시적인 방법은 호흡 동안에 그와 같은 환원 등가물의 사용을 억제하는 것이다. 호흡은 산소의 이용가능성을 감소시키고, NADH 탈수소효소 및/또는 사이토크롬 산화효소 활성을 약화하고, G3P 탈수소효소를 약화하고/하거나 과잉 글루코오스를 크랩트리 양성 유기체에 제공함으로써 제한될 수 있다.
발효조에서 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하여 산소 이용가능성을 제한하는 것은 호흡을 제한하기 위한 하나의 접근법이고 그렇게 함으로써 NAD(P)H 대 NAD(P)의 비를 증가시킨다. NAD(P)H/NAD(P)의 비, 배양 조건이 더 많은 혐기성이 됨에 따라 증가하고, 완전한 혐기성 조건은 환원된 보조인자 대 산화된 보조인자의 최고 비를 제공한다. 예를 들면, 대장균에서 호기성 조건 에서 NADH/NAD의 비 = 0.02 및 혐기성 조건에서 0.75인 것으로 보고되었다 (de Graes 등, J Bacteriol 181:2351-57 (1999)).
호흡은 호기성 조건 하에서 세포에서 NADH 탈수소효소 및/또는 사이토크롬 산화효소의 발현 또는 활성을 감소시켜서 또한 제한될 수 있다. 이 경우에, 호흡은 전자 전달 사슬의 용량에 의해 제한될 것이다. 그와 같은 접근법은 완전한 호기성 조건 하에서 대장균의 혐기성 대사를 가능하게 하도록 사용되었다 (Portnoy 등, AEM 74:7561-9 (2008)). S. 세레비스시애는 NDE1 및 NDE2에 의해 인코딩된 외부 NADH 탈수소효소를 직접적으로 사용하여 세포질 NADH를 산화시킬 수 있다. 야로위아 리포라이티카 에서 하나의 그와 같은 NADH 탈수소효소는 NDH2에 의해 인코딩된다 (Kerscher 등, J Cell Sci 112:2347-54 (1999)). 이들 및 다른 NADH 탈수소효소 효소는 하기 표에서 열거되어 있다.
표 2
Figure pct00002
사카로마이세스 세레비시애의 사이토크롬 산화효소는 COX 유전자 생성물을 포함한다. COX1-3은 미토콘드리아 게놈에 의해 인코딩된 3 개의 코아 서브유닛이고, 반면에 COX4-13은 핵 유전자에 의해 인코딩된다. 임의의 사이토크롬 유전자의 약화 또는 결실로 호흡 성장이 감소 또는 차단된다 (Hermann 및 Funes, Gene 354:43-52 (2005)). 다른 유기체 중 사이토크롬 산화효소 유전자는 서열 상동성에 의해 추론될 수 있다.
표 3
Figure pct00003
일 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 NADH 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 NADH 탈수소효소를 발현시키고/거나; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 NADH 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 일 구현예에서, 유기체 (i)는 NADH 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 NADH 탈수소효소를 발현시킨다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 NADH 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 NADH 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅱ)는 약화된 NADH 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 NADH 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 NADH 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 NADH 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 NADH 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 사이토크롬 산화효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 사이토크롬 산화효소를 발현시키고/거나; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 사이토크롬 산화효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 일 구현예에서, 유기체 (i)는 사이토크롬 산화효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 사이토크롬 산화효소를 발현시키고. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 사이토크롬 산화효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 사이토크롬 산화효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅱ)는 약화된 사이토크롬 산화효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 사이토크롬 산화효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 사이토크롬 산화효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 사이토크롬 산화효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 사이토크롬 산화효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다.
어떤 구현예에서, 세포질 NADH는 세포질 NADH-연결된 G3P 탈수소효소 및 막-결합 G3P:유비퀴논 산화환원효소로 이루어진 G3P 탈수소효소 셔틀을 통해 호흡 사슬에 의해 또한 산화될 수 있다. G3P 탈수소효소 효소의 결실 또는 약화는 호흡을 위해 NADH의 산화를 또한 방지할 것이다. S. 세레비스시애는 사이토졸에서 GPD1 및 미토콘드리아에서 GDP2 및 GUT2에 의해 인코딩된 3 개의 G3P 탈수소효소 효소를 갖는다. GPD2는 대다수의 글리세롤 형성에 대해 책임 있는 효소를 인코딩하는 것으로 공지되어 있고 혐기성 조건 하에서 산화환원 밸런스를 유지하는 것에 책임이 있다. GPD1은 삼투 스트레스에 대한 S. 세레비스시애의 적응에 주로 책임이 있다 (Bakker 등, FEMS Microbiol Rev 24:15-37 (2001)). GPD1, GPD2 및/또는 GUT2의 약화는 글리세롤 형성을 감소시킬 것이다. GPD1 및 GUT2는 야로위아 리포라이티카 에서 G3P 탈수소효소를 인코딩한다 (Beopoulos 등, AEM 74:7779-89 (2008)). GPD1 및 GPD2는 S. 폼베에서 G3P 탈수소효소를 인코딩한다. 마찬가지로, G3P 탈수소효소는 칸디다 트로피칼리스에서 CTRG_02011 및 칸디다 알비칸스에서 GI:20522022로 나타낸 유전자에 의해 인코딩된다.
표 4
Figure pct00004
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 비-자연 발생 진핵 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 G3P 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 G3P 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 G3P 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않고/거나 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 글리세롤을 생산한다. 일 구현예에서, 유기체 (i)는 G3P 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 G3P 탈수소효소를 발현시킨다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 G3P 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 G3P 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 G3P 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고 및 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 글리세롤을 생산한다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅱ)는 약화된 G3P 탈수소효소를 발현시키고 및 (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 G3P 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅱ)는 약화된 G3P 탈수소효소를 발현시키고; (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 글리세롤을 생산한다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 G3P 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며; 및 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 글리세롤을 생산한다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 G3P 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 G3P 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 G3P 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 G3P 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 G3P 탈수소효소를 발현시키고; (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 글리세롤을 생산한다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 G3P 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 G3P 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 G3P 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며; 및 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 글리세롤을 생산한다.
추가로, 크랩트리 양성 유기체에서, 발효성 대사는 과잉의 글루코오스의 존재에서 달성될 수 있다. 예를 들면, S. 세레비스시애는 호기성 조건 하에서 에탄올을 고르게(even) 만든다. 에탄올 및 글리세롤의 형성은 감소/제거될 수 있고 과잉 글루코오스를 크랩트리 양성 유기체에 공급하여 크랩트리 양성 유기체에서1,3-BDO의 생산에 의해 대체될 수 있다. 또 하나의 측면에서 1,3-BDO를 생산하는 방법이 본원에서 제공되고, 이 방법은 1,3-BDO를 생산하는 조건 하에서 및 충분한 기간 동안 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 것을 포함하고, 여기서 상기 진핵 유기체는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 크랩트리 양성 유기체이고 여기서 진핵 유기체는 과잉 글루코오스를 포함하는 배양 배지에 있다.
환원된 발효 부산물의 형성 방지는 1,3-BDO에 대한 탄소 및 환원 등가물 둘 모두의 이용가능성을 또한 증가시킬 수 있다. 혐기성 및 미량호기성 조건 하의 2 개의 주요 감소된 부산물은 에탄올 및 글리세롤이다. 에탄올은 피루베이트 탈탄산효소 및 에탄올 탈수소효소에 의해 촉진된 2 개의 효소 단계에서 피루베이트로부터 형성될 수 있다. 글리세롤은 효소 G3P 탈수소효소 및 G3P 포스파타제에 의해 당분해 중간체 디하이드록시아세톤 포스페이트로부터 형성될 수 있다. 본원에서 제공된 진핵 유기체에서 이들 효소 활성의 하나 이상의 약화는 1,3-BDO의 수율을 증가시킬 수 있다. 에탄올 및 글리세롤 형성을 감소 또는 제거하기 위한 균주 조작 방법은 본원의 다른 곳에 추가로 상세히 기재되어 있다.
아세틸-CoA의 에탄올로의 전환은 1,3-BDO의 생산에 해로울 수 있는데, 이는 상기 전환 공정이 1,3-BDO 경로로부터 탄소 및 환원 등가물 모두를 내보낼 수 있기 때문이다. 에탄올은 피루베이트 탈탄산효소 및 에탄올 탈수소효소에 의해 촉매된 두 가지 효소 단계에서 피루베이트로부터 형성될 수 있다. 사카로마이세스 세레비지애는 세 가지 피루베이트 탈탄산효소(PDC1, PDC5 및 PDC6)를 가지며 이들 중 두 둘(PDC1, PDC5)은 강하게 발현된다. 이들 PDC 중 둘의 결실은 에탄올 생산을 유의하게 감소시킬 수 있다. 세 가지 모두의 결실은 에탄올 형성을 완전히 제거할 뿐만 아니라 세포가 바이오매스 형성을 위한 아세틸-CoA를 형성할 수 없기 때문에 성장 결함을 야기할 수 있다. 그러나, 이는 환원량의 C2 탄소 공급원(에탄올 또는 아세테이트)의 존재 하에 세포를 진화시킴으로써 극복될 수 있다(van Maris 등, AEM 69:2094-9 (2003)). 또한 피루베이트 탈탄산효소 PDC1 및 PDC5의 양성 조절물질 PDC2의 결실이 에탄올 형성을 야생형에 의해 만들어진 것의 ~10%까지 감소시켰다고 보고되었다(Hohmann 등, Mol Gen Genet 241:657-66 (1993)). PDC 효소의 단백질 서열 및 식별자들이 실시예 Ⅱ에서 열거되어 있다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 피루베이트 탈탄산효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 피루베이트 탈탄산효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 피루베이트 탈탄산효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않고/거나 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 피루베이트로부터 더 낮은 수준의 에탄올을 생산한다. 일 구현예에서, 유기체 (i)는 피루베이트 탈탄산효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 피루베이트 탈탄산효소를 발현시킨다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 피루베이트 탈탄산효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 피루베이트 탈탄산효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅱ)는 약화된 피루베이트 탈탄산효소를 발현시키고; (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 피루베이트로부터 더 낮은 수준의 에탄올을 생산한다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅱ)는 약화된 피루베이트 탈탄산효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 피루베이트 탈탄산효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅱ)는 약화된 피루베이트 탈탄산효소를 발현시키고; (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 피루베이트로부터 더 낮은 수준의 에탄올을 생산한다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 피루베이트 탈탄산효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며; 및 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 피루베이트로부터 더 낮은 수준의 에탄올을 생산한다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 피루베이트 탈탄산효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 피루베이트 탈탄산효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 피루베이트 탈탄산효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 피루베이트 탈탄산효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 피루베이트 탈탄산효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며; 및 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 피루베이트로부터 더 낮은 수준의 에탄올을 생산한다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅱ)는 약화된 피루베이트 탈탄산효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 피루베이트 탈탄산효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며; 및 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 피루베이트로부터 더 낮은 수준의 에탄올을 생산한다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 피루베이트 탈탄산효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 피루베이트 탈탄산효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 피루베이트 탈탄산효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며; 및 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 피루베이트로부터 더 낮은 수준의 에탄올을 생산한다.
대안적으로, 아세트알데하이드를 에탄올로 전환시키는 에탄올 탈수소효소가 결실되거나 약화되어 1,3-BDO 경로를 위한 탄소 및 환원 등가물을 제공할 수 있다. 현재까지, 7개의 알코올 탈수소효소인 ADHI - ADHVⅡ가 S. 세레비시애에서 보고되었다(de Smidt 등, FEMS Yeast Res 8:967-78 (2008)). ADH1(GI:1419926)은 혐기성 조건 하에서 세포질 내의 아세트알데하이드를 에탄올로 환원시키는 것을 담당하는 핵심 효소이다. ADH1이 결핍된 효모 균주는 활성 호흡 사슬이 NADH를 생성하고 ATP의 총 획득을 야기하는 유일한 대안적인 경로이기 때문에 혐기성으로 성장할 수 없는 것으로 보고되었다(Drewke 등, J Bacteriol 172:3909-17 (1990)). 이 효소는 에탄올 생산을 제한하는 하향조절을 위한 이상적인 후보이다. ADH2는 글루코오스의 존재하게 심하게 억제된다. K. lactis에서, 두 가지 NAD-의존적 세포질 알코올 탈수소효소가 동정되고 규명되었다. 이들 유전자는 또한 다른 지방족 알코올에 대해 활성을 나타낸다. 유전자 ADH1(GI:113358) 및 ADHⅡ(GI:51704293)는 글루코오스-성장된 세포에서 우선적으로 발현된다(Bozzi 등, Biochim Biophys Acta 1339:133-142 (1997)). 세포질 알코올 탈수소효소는 C. 알비칸스의 ADH1(GI:608690), S. 폼베에서의 ADH1(GI:3810864), Y. 리포라이티카에서의 ADH1(GI:5802617), 피치아 스티피 티스 또는 셰페르소마이세스 스티피티스에서의 ADH1(GI:2114038) 및 ADHⅡ(GI:2143328)에 의해 코딩된다(Passoth 등, Yeast 14:1311-23 (1998)). 후보 알코올 탈수소효소들이 하기 표에 나타나 있다.
표 5
Figure pct00005
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 에탄올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 에탄올 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 에탄올 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않고/거나 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 에탄올을 생산한다. 일 구현예에서, 유기체 (i)는 에탄올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 에탄올 탈수소효소를 발현시킨다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 에탄올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 에탄올 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 에탄올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 에탄올을 생산한다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅱ)는 약화된 에탄올 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 에탄올 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅱ)는 약화된 에탄올 탈수소효소를 발현시키고; (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 에탄올을 생산한다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 에탄올 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며; 및 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 에탄올을 생산한다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 에탄올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 에탄올 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 에탄올 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 에탄올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 에탄올 탈수소효소를 발현시키고; (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 에탄올을 생산한다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 에탄올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 에탄올 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며; 및 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 에탄올을 생산한다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 에탄올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 에탄올 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 에탄올 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며; 및 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 에탄올을 생산한다.
S. 세레비시애와 같은 효모는 혐기성 조건 하에서 NAD(P)의 생성을 가능하게 하는 글리세롤을 생산할 수 있다. 글리세롤은 효소 G3P 탈수소효소 및 G3P 포스파타제에 의해 당분해성 중간체 디하이드록시아세톤 포스페이트로부터 형성된다. 특정한 작동 이론에 의해 구속되지 않으면서, 이들 효소 중 하나 이상의 약화 또는 결실이 글리세롤의 형성을 제거하거나 감소시키고 이로써 1,3-BDO의 생산을 위한 환원 등가물을 보존할 수 있는 것으로 여겨진다. 예시적인 G3P 탈수소효소 효소들이 전술되었다. G3P 포스파타제는 G3P의 글리세롤로의 가수분해를 촉진한다. 이 활성을 갖는 효소는 사카로마이세스 세레비시애(GPP1 및 GPP2), 칸디다 알비칸스 및 더날레일라 파르바의 글리세롤-1-포스파타제(EC 3.1.3.21) 효소를 포함한다(Popp 등, Biotechnol Bioeng 100:497-505 (2008); Fan 등, FEMS Microbiol Lett 245:107-16 (2005)). D. 파르바 유전자는 현재까지 동정되지 않았다. 이들 및 부가적 G3P 포스파타제 효소들이 하기 표에 나타나 있다.
표 6
Figure pct00006
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 비-자연 발생 진핵 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 G3P 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 G3P 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 G3P 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않고/거나 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 글리세롤을 생산한다. 일 구현예에서, 유기체 (i)는 G3P 포스파타제를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 G3P 포스파타제를 발현시키고다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 G3P 포스파타제를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 G3P 포스파타제 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 G3P 포스파타제를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고 및 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 글리세롤을 생산한다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅱ)는 약화된 G3P 포스파타제를 발현시키고 및 (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 G3P 포스파타제 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅱ)는 약화된 G3P 포스파타제를 발현시키고; (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 글리세롤을 생산한다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 G3P 포스파타제 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며; 및 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 글리세롤을 생산한다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 G3P 포스파타제를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 G3P 포스파타제를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 G3P 포스파타제 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 G3P 포스파타제를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 G3P 포스파타제를 발현시키고; (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 글리세롤을 생산한다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 G3P 포스파타제를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 G3P 포스파타제를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 G3P 포스파타제 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며; 및 (ⅳ)는 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 글리세롤을 생산한다.
글리세롤 생산을 제거하는 또 다른 방법은 산소-제한 배양에 의한다(전술한 Bakker 등). 글리세롤 형성은 세포의 특이적 산소 흡수율이 생합성에서 형성된 NADH를 재산화시키는데 필요한 속도 이하로 감소될 때만 시작된다.
상기 열거된 산화환원 싱크(sink) 외에도, 말레이트 탈수소효소는 그것이 환원 방향으로 기능할 때 잠재적으로 환원 등가물을 내보낼 수 있다. S. 세레비시애에서 기능하는 것으로 여겨지는 몇 가지 산화환원 셔틀은 세포질 및 미토콘드리아 사이에서 환원 등가물을 전달하는 이 효소를 이용한다. 이러한 산화환원의 전달은 말레이트 탈수소효소 및/또는 말산 효소 활성을 제거함으로써 방지될 수 있다. mdh의 제거에 의해 차단될 수 있는 산화환원 셔틀은, (i) 말레이트-아스파르테이트 셔틀, (ii) 말레이트-옥살로아세테이트 셔틀, 및 (iii) 말레이트-피루베이트 셔틀을 포함한다. 말레이트 탈수소효소 및 말산 효소를 코딩하는 유전자들이 하기 표에 열거되어 있다:
표 7
Figure pct00007
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 말레이트 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 말레이트 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 말레이트 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않고/거나 (ⅳ)은 말레이트-아스파르테이트 셔틀, 말레이트 옥살로아세테이트 셔틀, 및/또는 말레이트-피루베이트 셔틀의 약화 또는 차단을 갖는다. 일 구현예에서, 유기체 (i)는 말레이트 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 말레이트 탈수소효소를 발현시킨다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 말레이트 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 말레이트 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 말레이트 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅳ)은 말레이트-아스파르테이트 셔틀, 말레이트 옥살로아세테이트 셔틀, 및/또는 말레이트-피루베이트 셔틀의 약화 또는 차단을 갖는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅱ)는 약화된 말레이트 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 말레이트 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅱ)는 약화된 말레이트 탈수소효소를 발현시키고; (ⅳ)은 말레이트-아스파르테이트 셔틀, 말레이트 옥살로아세테이트 셔틀, 및/또는 말레이트-피루베이트 셔틀의 약화 또는 차단을 갖는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 말레이트 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며; 및 (ⅳ)은 말레이트-아스파르테이트 셔틀, 말레이트 옥살로아세테이트 셔틀, 및/또는 말레이트-피루베이트 셔틀의 약화 또는 차단을 갖는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 말레이트 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 말레이트 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 말레이트 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 말레이트 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 말레이트 탈수소효소를 발현시키고; (ⅳ)은 말레이트-아스파르테이트 셔틀, 말레이트 옥살로아세테이트 셔틀, 및/또는 말레이트-피루베이트 셔틀의 약화 또는 차단을 갖는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 말레이트 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 말레이트 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며; 및 (ⅳ)은 말레이트-아스파르테이트 셔틀, 말레이트 옥살로아세테이트 셔틀, 및/또는 말레이트-피루베이트 셔틀의 약화 또는 차단을 갖는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 말레이트 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 말레이트 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 말레이트 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며; 및 (ⅳ)은 말레이트-아스파르테이트 셔틀, 말레이트 옥살로아세테이트 셔틀, 및/또는 말레이트-피루베이트 셔틀의 약화 또는 차단을 갖는다.
개별적으로 또는 다른 산화환원 싱크와 조합되어 산화환원하는 전술한 싱크의 전체적인 결실은 호흡 또는 부산물 형성을 위한 환원력의 사용을 제거할 것이다. 외부 NADH 탈수소효소(NDE1 및 NDE2) 및 미토콘드리아 G3P 탈수소효소(GUT2)의 결실이 S. 세레비시애에서 세포질 NAD+ 재생을 거의 완전히 제거하는 것으로 보고되었다(Overkamp 등, J Bacteriol 182:2823-30 (2000)).
상기에서 제공된 진핵 유기체의 일 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 진핵 유기체는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아세틸-CoA 경로를 추가로 포함한다: (i) 2A, 2B 및 2D; (ⅱ) 2A, 2C 및 2D; (ⅲ) 2A, 2B, 2E 및 2F; (ⅳ) 2A, 2C, 2E 및 2F; (v) 2A, 2B, 2E, 2K, 및 2L; (ⅵ.) 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L; (ⅶ) 5A 및 5B; (ⅷ) 5A, 5C 및 5D; (ⅸ) 5E, 5F, 5C 및 5D; (x) 5G 및 5D; (xi) 6A, 6D 및 6C; (ⅶ) 6B, 6E 및 6C; (xⅲ) 10A, 10B 및 10C; (xⅳ) 10N, 10H, 10B 및 10C; (xv) 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C; (xⅵ) 10A, 10B, 10G 및 10D; (xⅶ) 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D; (xⅷ) 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D; (xⅸ) 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xx) 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xxi) 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xⅶ) 10A, 10F 및 10D; (xxⅲ) 10N, 10H, 10F 및 10D; 및 (xxⅳ) 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D.
상기에서 제공된 진핵 유기체의 일 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 진핵 유기체는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아세틸-CoA 경로를 추가로 포함한다: (i) 2A, 2B 및 2D; (ⅱ) 2A, 2C 및 2D; (ⅲ) 2A, 2B, 2E 및 2F; (ⅳ) 2A, 2C, 2E 및 2F; (v) 2A, 2B, 2E, 2K, 및 2L; (ⅵ.) 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L; (ⅶ) 5A 및 5B; (ⅷ) 5A, 5C 및 5D; (ⅸ) 5E, 5F, 5C 및 5D; (x) 5G 및 5D; (xi) 6A, 6D 및 6C; (ⅶ) 6B, 6E 및 6C; (xⅲ) 10A, 10B 및 10C; (xⅳ) 10N, 10H, 10B 및 10C; (xv) 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C; (xⅵ) 10A, 10B, 10G 및 10D; (xⅶ) 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D; (xⅷ) 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D; (xⅸ) 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xx) 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xxi) 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xⅶ) 10A, 10F 및 10D; (xxⅲ) 10N, 10H, 10F 및 10D; 및 (xxⅳ) 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D.
4.6 경쟁하는 부산물 생산 경로의 약화
어떤 구현예에서, 1,3-BDO 형성을 향한 탄소 유동은 경쟁 경로를 결실시키거나 약화시킴으로써 개선된다. 효모의 전형적인 발효 생성물은 에탄올 및 글리세롤을 포함한다. 이들 부산물의 결실 또는 약화는 상기 기술된 접근법에 의해 달성될 수 있다.
또한, 1,3-BDO 경로에서, 경로 중간체에 작용하는 비-특이적 효소로 인해 일부 부산물이 형성될 수 있다. 예를 들면, CoA 가수분해효소 및 CoA 전이효소가 아세토아세틸-CoA 및 3-하이드록시부티릴-CoA에 작용하여 각각 아세토아세테이트 및 3-하이드록시부티레이트를 형성할 수 있다. 따라서, 어떤 구현예에서, 본원에서 제공된 임의의 비-자연 발생 진핵 유기체 내의 1,3-BDO 경로 중간체에 작용하는 경로의 결실 또는 약화는 이들 유기체에서 1,3-BDO의 생산을 증가시키는데 도움을 줄 수 있다.
3-하이드록시부티릴-CoA의 3-하이드록시부티레이트로의 전환은 3-하이드록시부티라틸-CoA 전이효소 또는 가수분해효소 활성을 갖는 효소에 의해 촉매될 수 있다. 유사하게, 아세토아세틸-CoA의 아세토아세테이트로의 전환은 아세토아세틸-CoA 전이효소 또는 가수분해효소 활성을 갖는 효소에 의해 촉매될 수 있다. 1,3-BDO 생산으로부터 1,3-BDO 경로 중간체를 우회시키는 이들 부반응들은 이들 활성을 갖는 효소들의 결실 또는 약화에 의해 방지될 수 있다. 예시적인 CoA 가수분해효소 및 CoA 전이효소들이 하기 표에 나타나 있다.
표 8
Figure pct00008
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 아세토아세틸-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 아세토아세틸-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 발현시키고/거나; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 아세토아세틸-CoA 가수분해효소 또는 전이효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 일 구현예에서, 유기체 (i)는 아세토아세틸-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 아세토아세틸-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 발현시킨다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 i)는 아세토아세틸- CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 아세토아세틸-CoA 가수분해효소 또는 전이효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅱ)는 약화된 아세토아세틸-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 아세토아세틸-CoA 가수분해효소 또는 전이효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 i)는 아세토아세틸-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 아세토아세틸-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 아세토아세틸-CoA 가수분해효소 또는 전이효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 발현시키고/거나; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 또는 전이효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 일 구현예에서, 유기체 (i)는 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 발현시킨다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 또는 전이효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅱ)는 약화된 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 또는 전이효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 또는 전이효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다.
비-특이적 원상태 알데하이드 탈수소효소들은 1,3-BDO 경로 중간체에 작용하는 효소들의 또 다른 예이다. 그러한 효소들은, 예를 들면, 아세틸-CoA를 아세트알데하이드로 또는 3-하이드록시부티르알데하이드를 3-하이드록시부티레이트로 또는 3-옥소부티르알데하이드를 아세토아세테이트로 전환시킬 수 있다. 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소들이 실시예 Ⅱ에 기재되어 있다. 몇 가지 사카로마이세스 세레비지애 효소들은 알데하이드의 산으로의 산화를 촉매하며, ALD1(ALD6), ALD2 및 ALD3을 포함한다(Navarro-Avino 등, Yeast 15:829-42 (1999); Quash 등, Biochem Pharmacol 64:1279-92 (2002)). 미토콘드리아 단백질 ALD4 및 ALD5는 유사한 변환을 촉진한다 (Wang 등, J Bacteriol 180:822-30 (1998); Boubekeur 등, Eur J Biochem 268:5057-65 (2001)). 아세트알데하이드의 아세테이트로의 전환을 촉진하는 대장균 내 알데하이드 탈수소효소는 YdcW, BetB, FeaB 및 AldA를 포함한다(Gruez 등, J Mol Biol 343:29-41 (2004); Yilmaz 등, Biotechnol Prog 18:1176-82 (2002); Rodriguez-Zavala 등, Protein Sci 15:1387-96 (2006)). 산-형성 알데하이드 탈수소효소들이 하기 표에서 열거되어 있다.
표 9
Figure pct00009
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화)를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화)를 발현시키고;/또는 (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화) 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 일 구현예에서, 유기체 (i)는 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화)를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화)를 발현시키고. 또 하나의 구현예에서 유기체 (i)는 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화)를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화) 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서 유기체 (ⅱ)는 약화된 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화)를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화) 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서 유기체 (i)는 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화)를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화)를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화) 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소를 발현시키고/거나; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 일 구현예에서, 유기체 (i)는 3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소를 발현시킨다. 또 하나의 구현예에서 유기체 (i)는 3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서 유기체 (ⅱ)는 약화된 3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서 유기체 (i)는 3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소를 발현시키고/거나; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 일 구현예에서, 유기체 (i)는 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소를 발현시킨다. 또 하나의 구현예에서 유기체 (i)는 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서 유기체 (ⅱ)는 약화된 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서 유기체 (i)는 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다.
1,3-BDO 경로 중간체에 작용하는 다른 효소들은 상기에서 논의된 바와 같이 아세트알데하이드를 에탄올로, 그리고 1,3-부탄디올을 3-옥소부탄올로 전환시키는 에탄올 탈수소효소를 포함한다. 수많은 유기체는 3-옥소부탄올 및 1,3-부탄디올의 상호전환을 촉진하는 유전자를 코딩하며, 이는 문헌[Matsuyama 등 J Mol Cat B Enz, 11:513-521 (2001)]에 기재된 바와 같이 바실러스 속, 브레비박테리아 속, 칸디다 속, 및 클렙시엘라 속에 속하는 것을 포함한다. 이들 효소의 하나인 칸디다 파랍실로시스 유래의 SADH가 클로닝되었고 대장균에서 규명되었다. 돌연변이된 로도코쿠스 페닐아세트알데하이드 환원효소(Sar268) 및 레이포니아 알코올 탈수소효소 역시 이 변환을 촉진하는 것으로 나타났다(Itoh 등, Appl . Microbiol Biotechnol . 75:1249-1256 (2007)). 이들 효소 및 아세트알데하이드를 에탄올로 전환시키는 것으로 종래 기술된 효소들이 결실 및/또는 약화를 위한 적합한 후보이다. 유전자 후보들이 상기에 열거되어 있다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 에탄올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 에탄올 탈수소효소를 발현시키고/거나; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 에탄올 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 일 구현예에서, 유기체 (i)는 에탄올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 에탄올 탈수소효소를 발현시킨다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 에탄올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 에탄올 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅱ)는 약화된 에탄올 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲi)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 에탄올 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 에탄올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 에탄올 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 에탄올 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 다른 알코올 탈수소효소는 에탄올 탈수소효소 대신에 사용된다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 1,3-부탄디올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 1,3-부탄디올 탈수소효소를 발현시키고/거나; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 1,3-부탄디올 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 일 구현예에서, 유기체 (i)는 1,3-부탄디올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 1,3-부탄디올 탈수소효소를 발현시킨다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 1,3-부탄디올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 1,3-부탄디올 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅱ)는 약화된 1,3-부탄디올 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲi)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 1,3-부탄디올 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 1,3-부탄디올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 1,3-부탄디올 탈수소효소를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 1,3-부탄디올 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않는다.
아세틸-CoA 카복실라제 및 아세토아세틸-CoA 합성효소(7E/7F)를 포함하는 1,3-BDO 경로를 발현하는 유기체에서, 일부 구현예에서, 내인성 아세토아세틸-CoA 티올라제 활성을 결실시키거나 약화시키는 것이 유리할 수 있다. 아세토아세틸-CoA 티올라제 효소는 전형적으로 가역적인 반면, 아세토아세틸-CoA 합성효소는 비가역적 반응을 촉진한다. 따라서, 아세토아세틸-CoA 티올라제의 결실은 아세토아세틸-CoA의 아세틸-CoA로의 역유동을 감소시키고, 이로써 1,3-BDO 생성물을 향한 유동을 개선할 것이다.
또 하나의 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 유기체 (i)는 아세토아세틸-CoA 티올라제를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 아세토아세틸-CoA 티올라제를 발현시키고;/또는 (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 아세토아세틸-CoA 티올라제 효소 활성을 가지거나 갖지 않는다. 일 구현예에서, 유기체 (i)는 아세토아세틸-CoA 티올라제를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 1 아세토아세틸-CoA 티올라제를 발현시킨다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 아세토아세틸-CoA 티올라제를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 아세토아세틸-CoA 티올라제 효소 활성을 가지거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (ⅱ)는 약화된 아세토아세틸-CoA 티올라제를 발현시키고; (ⅲi)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 아세토아세틸-CoA 티올라제 효소 활성을 가지거나 갖지 않는다. 또 하나의 구현예에서, 유기체 (i)는 아세토아세틸-CoA 티올라제를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고; (ⅱ)는 약화된 아세토아세틸-CoA 티올라제를 발현시키고; (ⅲ)은 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 아세토아세틸-CoA 티올라제 효소 활성을 가지거나 갖지 않는다.
상기에서 제공된 진핵 유기체의 일 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 진핵 유기체는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아세틸-CoA 경로를 추가로 포함한다: (i) 2A, 2B 및 2D; (ⅱ) 2A, 2C 및 2D; (ⅲ) 2A, 2B, 2E 및 2F; (ⅳ) 2A, 2C, 2E 및 2F; (v) 2A, 2B, 2E, 2K, 및 2L; (ⅵ.) 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L; (ⅶ) 5A 및 5B; (ⅷ) 5A, 5C 및 5D; (ⅸ) 5E, 5F, 5C 및 5D; (x) 5G 및 5D; (xi) 6A, 6D 및 6C; (ⅶ) 6B, 6E 및 6C; (xⅲ) 10A, 10B 및 10C; (xⅳ) 10N, 10H, 10B 및 10C; (xv) 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C; (xⅵ) 10A, 10B, 10G 및 10D; (xⅶ) 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D; (xⅷ) 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D; (xⅸ) 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xx) 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xxi) 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xⅶ) 10A, 10F 및 10D; (xxⅲ) 10N, 10H, 10F 및 10D; 및 (xxⅳ) 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D.
상기 제공된 진핵 유기체의 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 진핵 유기체는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아세틸-CoA 경로를 추가로 포함한다: (i) 2A, 2B 및 2D; (ⅱ) 2A, 2C 및 2D; (ⅲ) 2A, 2B, 2E 및 2F; (ⅳ) 2A, 2C, 2E 및 2F; (v) 2A, 2B, 2E, 2K, 및 2L; (ⅵ.) 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L; (ⅶ) 5A 및 5B; (ⅷ) 5A, 5C 및 5D; (ⅸ) 5E, 5F, 5C 및 5D; (x) 5G 및 5D; (xi) 6A, 6D 및 6C; (ⅶ) 6B, 6E 및 6C; (xⅲ) 10A, 10B 및 10C; (xⅳ) 10N, 10H, 10B 및 10C; (xv) 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C; (xⅵ) 10A, 10B, 10G 및 10D; (xⅶ) 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D; (xⅷ) 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D; (xⅸ) 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xx) 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xxi) 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xⅶ) 10A, 10F 및 10D; (xxⅲ) 10N, 10H, 10F 및 10D; 및 (xxⅳ) 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D.
4.7 1,3- BDO 수송
어떤 구현예에서, 1,3-부탄디올은 회수되고/거나 부타디엔으로 탈수되도록 하기 위해 생산 본원에서 제공된 유기체를 빠져나간다. 1,3-부탄디올의 수송을 용이하게 할 수 있는 효소를 인코딩하는 유전자의 예는 실시예 XI에서 제공된 글리세롤 프로모터 단백질 동족체를 포함한다.
일 측면에서, 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고; 여기서 상기 유기체는 추가로, 1,3-BDO 수송체를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 1,3-BDO 수송체를 인코딩하는 핵산은 진핵 유기체로부터 1,3-BDO의 방출에 충분한 양으로 발현된다.
상기에서 제공된 진핵 유기체의 일 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 진핵 유기체는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아세틸-CoA 경로를 추가로 포함한다: (i) 2A, 2B 및 2D; (ⅱ) 2A, 2C 및 2D; (ⅲ) 2A, 2B, 2E 및 2F; (ⅳ) 2A, 2C, 2E 및 2F; (v) 2A, 2B, 2E, 2K, 및 2L; (ⅵ.) 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L; (ⅶ) 5A 및 5B; (ⅷ) 5A, 5C 및 5D; (ⅸ) 5E, 5F, 5C 및 5D; (x) 5G 및 5D; (xi) 6A, 6D 및 6C; (ⅶ) 6B, 6E 및 6C; (xⅲ) 10A, 10B 및 10C; (xⅳ) 10N, 10H, 10B 및 10C; (xv) 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C; (xⅵ) 10A, 10B, 10G 및 10D; (xⅶ) 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D; (xⅷ) 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D; (xⅸ) 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xx) 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xxi) 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xⅶ) 10A, 10F 및 10D; (xxⅲ) 10N, 10H, 10F 및 10D; 및 (xxⅳ) 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D.
상기 제공된 진핵 유기체의 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 1,3-BDO 경로는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 진핵 유기체는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아세틸-CoA 경로를 추가로 포함한다: (i) 2A, 2B 및 2D; (ⅱ) 2A, 2C 및 2D; (ⅲ) 2A, 2B, 2E 및 2F; (ⅳ) 2A, 2C, 2E 및 2F; (v) 2A, 2B, 2E, 2K, 및 2L; (ⅵ.) 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L; (ⅶ) 5A 및 5B; (ⅷ) 5A, 5C 및 5D; (ⅸ) 5E, 5F, 5C 및 5D; (x) 5G 및 5D; (xi) 6A, 6D 및 6C; (ⅶ) 6B, 6E 및 6C; (xⅲ) 10A, 10B 및 10C; (xⅳ) 10N, 10H, 10B 및 10C; (xv) 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C; (xⅵ) 10A, 10B, 10G 및 10D; (xⅶ) 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D; (xⅷ) 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D; (xⅸ) 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xx) 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xxi) 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D; (xⅶ) 10A, 10F 및 10D; (xxⅲ) 10N, 10H, 10F 및 10D; 및 (xxⅳ) 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D.
4.8 1,3- BDO 의 미토콘드리아 생산
일부 구현예에서, 본원에서 제공된 진핵 유기체는 미토콘드리아 1,3-BDO 생산 경로 내로 탄소 및 환원 등가물을 효율적으로 유도하도록 조작된다. 미토콘드리아에서 1,3-BDO를 생산하는 한 가지 이점은, 1,3-BDO 경로 전구체의 핵심인 아세틸-CoA의 자연적으로 풍부한 미토콘드리아 풀(pool)이다. 미토콘드리아에서의 아세틸-CoA의 1,3-BDO로의 효율적 전환은 미토콘드리아에서 1,3-BDO 경로 효소를 발현하는 것을 필요로 한다. 이것은 또한 경로를 정방향으로 추진시키는 과잉의 환원 등가물을 필요로 한다. 미토콘드리아에서 환원된 NAD(P)H의 양을 증가시키는 예시적인 방법은 세포질에서 이용된 것과 유사하며, 하기에서 추가로 상세히 기재되어 있다. 아세틸-CoA 전구체의 이용가능성을 더 증가시키기 위해, 필요에 따라 미토콘드리아 및 세포질에서 아세틸-CoA를 소비하는 경로가 약화될 수 있다. 1,3-BDO 생성물이 원상태 효소에 의해 또는 확산에 의해 미토콘드리아 밖으로 나가지 않는 경우, 글리세롤 촉진인자와 같은 이종기원 1,3-BDO 수송체의 발현이 또한 1,3-BDO 생산을 개선할 수 있다.
일부 구현예에서, 미토콘드리아에 대한 유전자를 표적화하는 것은 1,3-BDO 경로 효소에 미토콘드리아 표적화 서열을 부가함으로써 달성된다. 미토콘드리아 표적화 서열은 당해기술에 공지되어 있다. 예를 들면, 효모 COX4 유전자 유래의 미토콘드리아 표적화 신호 펩타이드를 발렌센(valencene) 생산 경로 효소에 융합시키는 것은, 세포질에서 발현된 동일한 경로와 비교하여 증가된 역가를 생산하는 미토콘드리아 발렌센 생산 경로를 야기하였다(Farhi 등, Met Eng 13:474-81 (2011)). 하나의 구현예에서, 진핵 유기체는 1,3-BDO 경로를 포함하고, 여기서 상기 유기체는 진핵 유기체의 미토콘드리아에 국한된 1,3-BDO 경로 효소로 이루어진다.
다른 구현예에서, 1,3-BDO 경로를 통한 유동을 증가시키기 위해 미토콘드리아 내 대사 보조인자의 수준이 조작되며, 이는 1,3-BDO의 미토콘드리아 생산을 더 개선할 수 있다. 예를 들면, 환원된 NAD(P)H의 이용가능성을 증가시키는 것은 1,3-BDO 경로를 정방향으로 추진하는데 도움을 줄 수 있다. 이는, 예를 들면, 미토콘드리아에서 NAD(P)H의 공급을 증가시키고/거나 NAD(P)H 싱크를 약화시킴으로써 달성될 수 있다.
진핵세포에서, 세포의 NAD 풀의 상당한 부분은 미토콘드리아에 함유되어 있다(Di Lisa 등, FEBS Lett 492:4-8 (2001)). 미토콘드리아 NAD(P)H의 공급을 증가시키는 것은 상이한 방법으로 달성될 수 있다. 피리미딘 뉴클레오타이드는 세포질에서 합성되며 캐리어 단백질에 의해 NAD+의 형태로 미토콘드리아로 수송되어야 한다. 사카로마이세스 세레비지애의 NAD 담체 단백질은 NDT1(GI: 6322185) 및 NDT2(GI: 6320831)에 의해 코딩된다(Todisco 등, J Biol Chem 281:1524-31 (2006)). NAD(P)H와 같은 는 환원된 보조인자는 내부 미토콘드리아 막을 통과해 수송되지 않는다(von Jagow 등, Eur J Biochem 12:583-92 (1970); Lee 등, J Membr Biol 161:173-181 (1998)). 미토콘드리아 내의 NADH는 일반적으로 TCA 사이클 및 피루베이트 탈수소효소 복합체에 의해 생성된다. NADPH는 TAC 사이클에 의해 생성되고, 이는 유기체가 내인성 또는 외인성 미토콘드리아 NADH 수소전달효소를 발현하는 경우 NADH로부터 생성될 수 있다. NADH 수소전달효소 후보들이 하기에 기재되어 있다.
표 10
Figure pct00010
미토콘드리아의 산화환원 포텐셜(NAD(P)H/NAD(P) 비율)의 증가가 1,3-BDO 경로를 정방향으로 추진하는데 이용될 수 있다. 미토콘드리아 산화환원 싱크의 약화는 산화환원 포텐셜을 증가시킬 것이고 이에 따라 1,3-BDO에 이용가능한 환원 등가물을 증가시킬 것이다. 약화를 위한 예시적인 NAD(P)H 소비 효소 또는 경로는, TCA 사이클, NADH 탈수소효소 또는 산화효소, 알코올 탈수소효소 및 알데하이드 탈수소효소를 포함한다.
본원에 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체는, 어떤 구현예에서, 하나 이상의 1,3-BDO 또는 아세틸-CoA 경로에 관여하는 하나 이상의 효소 또는 단백질을 코딩하는 발현가능한 핵산을 도입함으로써 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체는 하나 이상의 아세틸-CoA 경로 및 하나 이상의 1,3-BDO 경로에 관여하는 하나 이상의 효소 또는 단백질을 코딩하는 발현가능한 핵산을 도입함으로써 생산될 수 있다. 선택된 숙주 진핵 유기체에 따라, 특정한 아세틸-CoA 경로 및/또는 1,3-BDO의 일부 또는 모두에 대한 핵산이 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 특정한 아세틸-CoA 경로의 일부 또는 모두에 대한 핵산이 발현된다. 다른 구현예에서, 진핵 유기체는 특정한 1,3-BDO 경로의 일부 또는 모두를 발현하는 핵산을 추가로 포함한다. 예를 들어, 선택된 숙주가 원하는 경로에 대한 하나 이상의 효소 또는 단백질이 결핍되는 경우, 상기 결핍된 효소(들) 또는 단백질(들)에 대한 발현가능한 핵산이 차후의 외인성 발현을 위해 숙주 내로 도입된다. 대안적으로, 선택된 숙주가 일부 경로 유전자의 내인성 발현을 나타내지만 다른 것들이 결핍된 경우, 1,3-BDO 생산과 조합된 세포질 아세틸-CoA 생산, 또는 아세틸-CoA 생산을 달성하기 위해 상기 결핍된 효소(들) 또는 단백질(들)을 위해 코딩된 핵산이 필요하다. 따라서, 어떤 구현예에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체는 원하는 아세틸-CoA 경로 및/또는 1,3-BDO 경로를 획득하기 위해 외인성 효소 또는 단백질 활성을 도입함으로써 생산될 수 있다. 대안적으로, 원하는 아세틸-CoA 경로는, 하나 이상의 내인성 효소 또는 단백질과 더불어, 유기체의 미토콘드리아로부터 유기체의 세포질로의 전달, 세포질 아세틸-CoA의 생산을 가능하게 하는 하나 이상의 외인성 효소 또는 단백질 활성을 도입함으로써 수득될 수 있다. 다른 구현예에서, 유기체는 하나 이상의 내인성 효소 또는 단백질과 더불어 유기체 내에서 1,3-BDO의 생산을 가능하게 하는 하나 이상의 외인성 효소 또는 단백질 활성을 도입함으로써 수득될 수 있는 1,3-BDO 경로를 추가로 포함한다.
1,3-BDO 생산을 용이하게 하고/거나 최적화하기 위해 본원에 기술된 추가적인 유전적 변형, 예를 들면, 경쟁하는 부산물 경로 및 효소를 약화시키거나 결실시키기 위해 숙주 세포 내의 목적하는 특정한 내인성 핵산의 조작이 당업계의 숙련가에게 공지된 그리고 예를 들면, 실시예 X에 제공된 바와 같은 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
숙주 진핵 유기체는, 예를 들면, 효모, 곰팡이 또는 발효 과정에 적용가능한 임의의 다양한 다른 진핵으로부터 선택될 수 있고, 이들에서 생성된 비-자연 발생 진핵 유기체일 수 있다. 예시적인 효모 또는 곰팡이는 사카로마이세스 세레비지애, 쉬조사카로마이세스 폼베, 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 막시아누스, 아스페르길러스 테레우스, 아스페르길루스 니게르, 피치아 패스토리스, 라이조푸스 아르히주스, 라이조부스 오리자에, 야로위아 리포라이티카 등으로부터 선택된 종을 포함한다. 임의의 적합한 진핵 숙주 유기체가 원하는 생성물을 생산하기 위해 대사적 및/또는 유전적 변형을 도입하는데 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 어떤 구현예에서, 진핵 유기체는 사카로마이세스 세레비지애와 같은 효모이다. 일부 구현예에서, 진핵 유기체는 곰팡이다.
본원에서 기재된 유기체 및 방법들은 이의 대사 반응, 반응물 또는 생성물을 일반적으로 참조하거나, 상기 언급된 대사 반응, 반응물 또는 생성물과 관련되거나 이를 촉진하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 핵산 또는 유전자, 또는 단백질을 특히 참조하여 설명된다. 본원에서 달리 명백히 언급하지 않는 한, 당해분야의 숙련가는, 반응의 언급이 반응의 반응물 및 생성물을 언급하는 것으로 이해할 것이다. 유사하게, 본원에서 달리 명백히 언급하지 않는 한, 반응물 또는 생성물의 언급, 및 임의의 이들 대상 구성요소의 언급은 또한 상기 언급된 반응, 반응물 또는 생성물과 연관된 촉진하는 효소를 코딩하는 유전자 또는 유전자들 또는 단백질들을 언급한다고 여겨진다. 마찬가지로, 널리 공지된 대사 생화학, 효소학 및 게놈학 분야를 고려할 때, 본원에서 유전자 또는 코딩 핵산에 대한 언급 역시 상응하는 코딩된 효소 및 그것이 촉진하는 반응 또는 상기 반응과 연관된 단백질 뿐만 아니라, 상기 반응의 반응물 및 생성물을 언급한다고 여겨진다.
원에서 개시된 바와 같이,1,3-BDO 경로의 중간체는 카복실산 또는 이의 CoA 에스테르, 예컨대 4-하이드록시 부티레이트, 3-하이드록시부티레이트, 이들의 CoA 에스테르 뿐만 아니라 크로토닐-CoA일 수 있다. 임의의 카복실산 중간체는 다양한 이온화 형태로 존재할 수 있고, 이는 완전히 양성자화된 형태, 부분적으로 양성자화된 형태, 및 완전히 탈양성자화된 형태를 포함한다. 따라서, 특히 이온화 형태가 화합물이 발견되는 pH에 좌우되는 것으로 공지되어 있으므로, 접미사 "-에이트" 또는 산 형태는 유리 산 형태 뿐만 아니라 임의의 탈양성자화된 형태를 기술하는데 상호교환적으로 사용될 수 있다. 카복실레이트 중간체는 O-카복실레이트 및 S-카복실레이트 에스테르와 같은 카복실레이트 생성물 또는 경로 중간체의 에스테르 형태를 포함하는 것으로 이해된다. O- 및 S-카복실레이트는 C1 내지 C6, 분지 또는 직쇄 카복실레이트인 저급 알킬을 포함할 수 있다. 일부 그러한 O- 또는 S-카복실레이트는, 비제한적으로, 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, i-프로필, sec-부틸, 및 tert-부틸, 펜틸, 헥실 O- 또는 S-카복실레이트를 포함하며, 이들 중 임의의 것은 불포화를 추가로 가져, 예를 들면, 프로페닐, 부테닐, 펜틸, 및 헥세닐 O- 또는 S-카복실레이트를 제공할 수 있다. O-카복실레이트는 생합성 경로의 생성물일 수 있다. 생합성 과정을 통해 접근되는 예시적인 O-카복실레이트는, 비제한적으로, 메틸 4-하이드록시부티레이트, 메틸-3-하이드록시부티레이트, 에틸 4-하이드록시부티레이트, 에틸 3-하이드록시부티레이트, n-프로필 4-하이드록시부티레이트, 및 n-프로필 3-하이드록시부티레이트를 포함할 수 있다. 생합성적으로 접근가능한 다른 O-카복실레이트는 C7-C22인 장쇄 그룹에 대한 매체, 지방 알코올 유래의 O-카복실레이트 에스테르, 예를 들면 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 라우릴, 트리데실, 미리스틸, 펜타데실, 세틸, 팔미톨릴, 헵타데실, 스테아릴, 노나데실, 아라키딜, 헤네이코실, 및 베헤닐 알코올을 포함할 수 있고, 이들 중 임의의 것은 선택적으로 분지되고/거나 불포화를 함유할 수 있다. O-카복실레이트 에스테르는 생화학적 또는 화학적 공정, 예컨대 유리 카복실산 생성물의 에스테르화 또는 O- 또는 S-카복실레이트의 에스테르교환반응을 통해 접근될 수 있다. S-카복실레이트는 CoA S-에스테르, 시스테이닐 S-에스테르, 알킬티오에스테르, 및 다양한 아릴 및 헤테로아릴 티오에스테르에 의해 예시된다.
1,3-BDO 경로를 포함하는 선택된 숙주 진핵 유기체의 1,3-BDO 생합성 과정 구성요소에 따라, 1,3-BDO 경로를 포함하는 본원에 제공된 비-자연 발생 유기체는 적어도 하나의 외인성으로 발현된 1,3-BDO 경로를 코딩하는 핵산 및 하나 이상의 1,3-BDO 생합성 과정에 대한 모든 코딩 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 1,3-BDO 생합성은 상응하는 코딩 핵산의 외인성 발현을 통해 경로 효소 또는 단백질이 결핍된 숙주에서 확립될 수 있다. 1,3-BDO 경로의 모든 효소 또는 단백질이 결핍된 숙주에서, 상기 숙주가 경로 효소 또는 단백질 중 적어도 하나를 함유함에도 불구하고 경로의 모든 효소 또는 단백질이 발현될 수 있긴 하지만, 상기 경로에서의 모든 효소 또는 단백질의 외인성 발현이 포함될 수 있다. 예를 들면, 1,3-BDO의 생산을 위한 경로 내의 모든 효소 또는 단백질의 외인성 발현이 포함될 수 있다.
또한, 선택된 숙주 진핵 유기체의 상기 아세틸-CoA 경로 구성요소에 따라, 본원에 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체는 적어도 하나의 외인성으로 발현된 아세틸-CoA 경로를 코딩하는 핵산 및 하나 이상의 아세틸-CoA 경로를 위한 모든 코딩 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 숙주의 세포질 내로의 미토콘드리아 및/또는 페록시솜 아세틸-CoA 배출 및/또는 숙주 내 세포질 아세틸-CoA의 증가는 핵산을 코딩하는 상응하는 코딩 핵산의 외인성 발현을 통해 경로 효소 또는 단백질이 결핍된 숙주에서 확립될 수 있다. 아세틸-CoA 경로의 모든 효소 또는 단백질이 결핍된 숙주에서, 상기 숙주가 경로 효소 또는 단백질 중 적어도 하나를 함유함에도 불구하고 경로의 모든 효소 또는 단백질이 발현될 수 있다고 이해되긴 하지만, 경로 내의 모든 효소 또는 단백질의 외인성 발현이 포함될 수 있다. 예를 들면, 시트레이트 생성효소, 시트레이트 수송체, 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체, 시트레이트/말레이트 수송체, ATP 시트레이트 분해효소, 시트레이트 분해효소, 아세틸-CoA 합성효소, 아세테이트 키나아제 및 포스포트랜스아세틸라제, 옥살로아세테이트 수송체, 세포질 말레이트 탈수소효소, 말레이트 수송체, 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성); 아세틸-CoA 리가제 또는 전이효소; 아세테이트 키나아제; 포스포트랜스아세틸라제; 피루베이트 탈탄산효소; 아세트알데하이드 탈수소효소; 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성); 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제 또는 피루베이트 포르메이트 분해효소; 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화); 트레오닌 알돌라아제; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소; 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소; 세포질 아세틸카르니틴 전이효소; 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제; 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제; PEP 카복실라제; PEP 카복시키나아제; 옥살로아세테이트 탈탄산효소; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소 (아세틸화); 아세틸-CoA 카복실라제; 말로닐-CoA 탈탄산효소; 옥살로아세테이트 탈수소효소; 옥살로아세테이트 산화환원효소; 말로닐-CoA 환원효소; 피루베이트 카복실라제; 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소; 말로닐-CoA 합성효소; 말로닐-CoA 전이효소; 말산 효소; 말레이트 탈수소효소; 말레이트 옥시도리덕타제; 피루베이트 키나아제; 또는 PEP 포스파타제와 같은, 세포질 아세틸-CoA의 생산을 위한 경로 내의 모든 효소 또는 단백질의 외인성 발현이 포함될 수 있다:
본원에 제공된 교시 및 지침을 고려할 때, 당해분야의 숙련가는, 발현가능한 형태로 도입되는 코딩 핵산의 수가 선택된 숙주 진핵 유기체의 아세틸-CoA 경로 결핍과 적어도 유사할 것임을 이해할 것이다. 따라서, 본원에 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체는 본원에 개시된 아세틸-CoA 경로를 구성하는 효소 또는 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 최대 모든 핵산을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 또한 유기체에서의 세포질 아세틸-CoA의 생산을 용이하게 하거나 최적화하는 다른 유전적 변형 또는 숙주 진핵 유기체에 다른 유용한 기능을 부여하는 다른 유전적 변형을 포함할 수 있다. 또한, 당해분야의 숙련가는, 아세틸-CoA 경로 및 1,3-BDO 경로를 포함하는 진핵 유기체를 포함하는 구현예에서, 발현가능한 형태로 도입되는 코딩 핵산의 수가 선택된 숙주 진핵 유기체의 1,3-BDO 경로 결핍과 적어도 유사할 것임을 더 이해할 것이다. 따라서, 본원에 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체는 본원에 개시된 1,3-BDO 생합성 과정을 구성하는 효소 또는 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4, 5, 최대 모든 핵산을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체는 또한 유기체에서의 1,3-BDO의 생합성을 용이하게 하거나 최적화하는 다른 유전적 변형 또는 숙주 진핵 유기체에 다른 유용한 기능을 부여하는 다른 유전적 변형을 포함할 수 있다. 그러한 다른 기능성 한가지는, 예를 들면, 아세틸-CoA와 같은 1,3-BDO 경로 전구체 중 하나 이상의 합성의 증가를 포함할 수 있다.
일반적으로, 숙주 진핵 유기체는, 원하는 전구체의 드노보 생산 또는 숙주 진핵 유기체에 의해 천연적으로 생산된 전구체의 생산 증가를 제공하는 천연적으로 생산된 분자로서 또는 조작된 생성물로서, 아세틸-CoA 경로의 전구체를 생산하도록 선택된다. 예를 들면, 미토콘드리아 아세틸-CoA는 사카로마이세스 세레비지애와 같은 숙주 유기체에서 천연적으로 생산된다. 숙주 유기체는 본원에 개시된 바와 같이 전구체의 생산을 증가시키도록 조작될 수 있다. 또한, 원하는 전구체를 생산하도록 조작된 진핵 유기체가 숙주 유기체로서 사용될 수 있고, 아세틸-CoA 경로, 및 선택적으로 1,3-BDO 경로의 효소 또는 단백질을 발현하도록 더 조작될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체는 세포질 아세틸-CoA를 합성하는 효소 능력을 함유하는 숙주로부터 생성된다. 이러한 특정 구현예에서, 아세틸-CoA 경로 생성물의 합성 또는 축적을 증가시켜, 예를 들면, 세포질 아세틸-CoA 생산 쪽으로 아세틸-CoA 경로 반응을 추진하는 것이 유용할 수 있다. 증가된 합성 또는 축적은, 예를 들면, 전술한 아세틸-CoA 경로 효소 또는 단백질 중 하나 이상을 코딩하는 핵산의 과발현에 의해 달성될 수 있다. 아세틸-CoA 경로의 효소 또는 효소들 및/또는 단백질 또는 단백질들의 과발현은, 예를 들면, 내인성 유전자 또는 유전자들의 외인성 발현을 통해, 또는 이종기원 유전자 또는 유전자들의 외인성 발현을 통해 일어날 수 있다. 따라서, 천연 유기체는, 예를 들면, 아세틸-CoA 경로 효소 또는 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10, 즉, 최대 모든 핵산의 과발현을 통해, 세포질 아세틸-CoA를 생산하는, 본원에 제공된 바와 같은 비-자연 발생 진핵 유기체로 쉽게 생성될 수 있다. 또한, 비-자연 발생 유기체는 아세틸-CoA 경로 내의 효소의 활성 증가를 야기하는 내인성 유전자의 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다.
진핵 유기체가 아세틸-CoA 경로 및 1,3-BDO 경로를 포함하는 어떤 구현예에서, 상기 유기체는 아세틸-CoA 및 1,3-BDO 모두를 합성하는 효소 능력을 함유하는 숙주로부터 생산된다. 이러한 특정 구현예에서, 세포질 아세틸-CoA 및/또는 1,3-BDO 경로 생성물의 합성 또는 축적을 증가시켜, 예를 들면, 1,3-BDO 생산 쪽으로 1,3-BDO 경로 반응을 추진하는 것이 유용할 수 있다. 증가된 합성 또는 축적은, 예를 들면, 상기 기재된 아세틸-CoA 및/또는 1,3-BDO 경로 효소 또는 단백질 중 하나 이상을 코딩하는 핵산의 과발현에 의해 달성될 수 있다. 아세틸-CoA 및/또는 1,3-BDO 경로의 효소 또는 효소들 및/또는 단백질 또는 단백질들의 과발현은, 예를 들면, 내인성 유전자 또는 유전자들의 외인성 발현을 통해, 또는 이종기원 유전자 또는 유전자들의 외인성 발현을 통해 일어날 수 있다. 따라서, 천연 유기체는, 예를 들면, 1,3-BDO 생합성 경로 효소 또는 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4, 5, 즉, 최대 모든 핵산의 과발현을 통해, 1,3-BDO를 생산하는, 본원에 제공된 바와 같은 비-자연 발생 진핵 유기체로 쉽게 생성될 수 있다. 또한, 비-자연 발생 유기체는 아세틸 CoA 및/또는 1,3-BDO 생합성 경로 내의 효소의 활성 증가를 야기하는 내인성 유전자의 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다.
특히 유용한 구현예에서, 상기 코딩 핵산의 외인성 발현이 이용된다. 외인성 발현은 숙주에 발현 및/또는 조절 요소를 맞추는 능력 및 사용자에 의해 조절된 원하는 발현 수준을 달성하는 적용을 부여한다. 그러나, 음성 조절 효과기를 제거하는 것에 의하거나 유도성 프로모터 또는 다른 조절 요소에 연결될 때 유전자의 프로모터를 유도하는 것에 의한 것과 같이, 다른 구현예에서 내인성 발현이 또한 이용될 수 있다. 따라서, 천연 유도성 프로모터를 갖는 내인성 유전자는 적절한 유도제를 제공함으로써 상향조절될 수 있거나, 내인성 유전자의 조절 영역은 유도성 조절 요소를 혼입하도록 조작됨으로써, 원하는 시간에 내인성 유전자의 발현 증가를 조절하게 하도록 조작될 수 있다. 마찬가지로, 비-자연 발생 진핵 유기체 내로 도입된 외인성 유전자를 위한 조절 요소로서 유도성 프로모터가 포함될 수 있다.
어떤 구현예에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체를 생산하기 위해 진핵 유기체 내로 하나 이상의 외인성 핵산 중 임의의 것이 도입될 수 있는 것으로 이해된다. 핵산(들)은, 예를 들면, 핵산(들)에 의해 코딩된 주어진 활성을 갖는 폴리펩타이드(들)를 발현시킴으로써, 예를 들면, 유기체에 아세틸-CoA 경로를 부여하기 위해 도입될 수 있다. 또한 상기 핵산은 유기체에 1,3-BDO 생합성 경로를 부여하기 위해 도입될 수 있다. 대안적으로, 코딩 핵산은 아세틸-CoA 생산 또는 수송을 부여하는 필요한 반응 중 일부를 촉진하는 생합성 능력, 또는 추가로 1,3-BDO 생합성 능력을 갖는 중간체 유기체를 생산하기 위해 도입될 수 있다. 예를 들면, 단독으로 또는 1,3-BDO 생합성 경로와 조합된, 아세틸-CoA 경로를 갖는 비-자연 발생 유기체는, 원하는 효소 또는 단백질을 코딩하는 적어도 두 가지 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 비-자연 발생 진핵 유기체는 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성) 및 아세틸-CoA 합성효소 (도 5, 단계 A 및 B)를 코딩하는 적어도 두 가지 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 따라서, 생합성 경로의 둘 이상의 효소 또는 단백질의 임의의 조합이 본원에 제공된 비-자연 발생 유기체에 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 마찬가지로, 생합성 경로의 셋 이상의 효소 또는 단백질의 임의의 조합이, 원하는 생합성 경로의 효소 및/또는 단백질의 조합이 상응하는 원하는 생성물의 생산을 야기하는 한, 본원에서 제공된 비-자연 발생 유기체에 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들면, 비-자연 발생 진핵 유기체는 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성), 아세테이트 키나아제, 및 포스포트랜스아세틸라제 (도 5, 단계 A, C 및 D); 또는 아세토아세틸-CoA 티올라제, 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원)이고, 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성) (도 4, 단계 A, H 및 J)를 코딩하는 적어도 세 가지 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 원하는 경우, 본원에서 개시된 바와 같이 생합성 경로의 네 가지 이상의 효소 또는 단백질의 임의의 조합이, 원하는 생합성 경로의 효소 및/또는 단백질의 조합이 상응하는 원하는 생성물의 생산을 야기하는 한, 본원에서 제공된 비-자연 발생 유기체에 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들면, 비-자연 발생 진핵 유기체는 시트레이트 생산효소, 시트레이트 수송체, 시트레이트 분해효소 및 아세틸-CoA 합성효소 (도 2, 단계 A, B, E 및 F); 또는 아세토아세틸-CoA 티올라제, 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원), 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성), 및 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소 (도 4, 단계 A, H, I 및 G)를 코딩하는 적어도 네 가지 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 도면에 묘사된 다른 개별적인 경로들 역시 본원에서 제공된 조성물 및 방법의 구현예에 고려된다. 마찬가지로, 비-자연 발생 진핵 유기체는, 예를 들면, 세 가지 아세틸-CoA 경로 효소를 코딩하는 세 가지 외인성 핵산 및 세 가지 1,3-BDO 경로 효소를 코딩하는 세 가지 외인성 핵산을 갖는, 적어도 6개의 외인성 핵산을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 핵산 및 경로 효소들의 다른 수 및/또는 조합이 마찬가지로 본원에서 고려된다.
일부 구현예에서, 진핵 유기체는 본원에 제공된 아세틸 Co-A 경로의 각각의 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. 다른 구현예에서, 진핵 유기체는 본원에 제공된 1,3-BDO 경로의 각각의 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 진핵 유기체는 본원에 제공된 아세틸 Co-A 경로의 각각의 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하고, 상기 진핵 유기체는 본원에서 제공된 1,3-BDO 경로의 각각의 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 더 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 단독으로 또는 1,3-BDO와 조합된, 세포질 아세틸-CoA의 생합성 외에도, 본원에 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체 및 방법들은 또한 서로 다양한 조합으로 이용될 수 있고, 다른 경로에 의해 생성물 생합성을 달성하는 당업계에 잘 알려진 다른 진핵 유기체 및 방법들과 다양한 조합으로 이용될 수 있다. 예를 들면, 세포질 아세틸-CoA 생산체의 사용 외에 세포질 아세틸-CoA를 생산하는 한 가지 대안은 아세틸-CoA 경로 중간체를 아세틸-CoA로 전환시킬 수 있는 또 다른 진핵 유기체의 부가를 통해서이다. 그러한 과정 한 가지는, 예를 들면, 아세틸-CoA 경로 중간체를 생산하는 진핵 유기체를 배양하거나 발효시키는 것을 포함한다. 이후 상기 아세틸-CoA 경로 중간체는 아세틸-CoA 경로 중간체를 세포질 아세틸-CoA로 전환시키는 제 2 진핵 유기체를 위한 기질로서 사용될 수 있다. 상기 아세틸-CoA 경로 중간체는 제 2 유기체의 또 다른 배양에 직접 부가되거나 아세틸-CoA 경로 중간체 생산체의 원 배양이, 예를 들면, 세포 분리에 의해 이들 진핵 유기체가 결핍될 수 있고, 그 다음 배양 배지로의 제 2 유기체의 부가가 이용되어 중간체 정제 단계 없이 최종 생성물을 생산할 수 있다.
비-자연 발생 진핵 유기체가 1,3-BDO 경로를 추가로 포함하는 다른 구현예에서, 1,3-BDO 생산체를 사용하는 것 이외에 1,3-BDO를 생산하는 한 가지 잠재적인 대안은 1,3-BDO 경로 중간체를 1,3-BDO로 전환시킬 수 있는 또 다른 진핵 유기체의 부가를 통해서이다. 그러한 절차 한 가지는, 예를 들면, 1,3-BDO 경로 중간체를 생산하는 진핵 유기체의 발효를 포함한다. 이후, 상기 1,3-BDO 경로 중간체는 1,3-BDO 경로 중간체를 1,3-BDO로 전환시키는 제 2 진핵 유기체를 위한 기질로서 사용될 수 있다. 상기 1,3-BDO 경로 중간체는 제 2 유기체의 또 다른 배양에 직접 부가되거나 1,3-BDO 경로 중간체 생산체의 원 배양이, 예를 들면, 세포 분리에 의해 이들 진핵 유기체가 결핍될 수 있고, 그 다음 배양 배지로의 제 2 유기체의 부가가 이용되어 중간체 정제 단계 없이 최종 생성물을 생산할 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체 및 방법들은, 예를 들면, 세포질 아세틸-CoA의 생합성을 달성하는 다양한 하부경로로 조립될 수 있다. 이들 구현예에서, 원하는 생성물을 위한 생합성 경로는 상이한 진핵 유기체로 분리될 수 있고, 상기 상이한 진핵 유기체들은 최종 생성물을 생산하기 위해 공동-배양될 수 있다. 그러한 생합성 계획에서, 하나의 진핵 유기체의 생성물은 최종 생성물이 합성될 때까지 제 2 진핵 유기체를 위한 기질이다. 예를 들면, 세포질 아세틸-CoA의 생합성은 하나의 경로 중간체를 또 다른 경로 중간체 또는 생성물로 전환시키기 위한 생합성 경로를 함유하는 진핵 유기체를 구축함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 세포질 아세틸-CoA는 또한 동일한 용기에서 두 유기체를 이용한 공동-배양 또는 공동-발효를 통해 진핵 유기체들로부터 생합성으로 생산될 수 있고, 여기서 제 1 진핵 유기체는 세포질 아세틸-CoA 중간체를 생산하고 제 2 진핵 유기체는 상기 중간체를 아세틸-CoA로 전환시킨다.
비-자연 발생 진핵 유기체가 1,3-BDO 경로를 추가로 포함하는 어떤 구현예에서, 본원에 제공된 유기체 및 방법들은 아세틸-CoA 및/또는 1,3-BDO의 생합성을 달성하는 다양한 하부경로로 조립될 수 있다. 이들 구현예에서, 본원에 제공된 원하는 생성물을 위한 생합성 경로는 상이한 진핵 유기체들로 분리될 수 있고, 상기 상이한 진핵 유기체들은 최종 생성물을 생산하기 위해 공동-배양될 수 있다. 그러한 생합성 계획에서, 하나의 진핵 유기체의 생성물은 최종 생성물이 합성될 때까지 제 2 진핵 유기체를 위한 기질이다. 예를 들면, 1,3-BDO의 생합성은 하나의 경로 중간체를 또 다른 경로 중간체 또는 생성물로 전환시키기 위한 생합성 경로를 함유하는 진핵 유기체를 구축함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 1,3-BDO는 또한 동일한 용기에서 두 유기체를 이용한 공동-배양 또는 공동-발효를 통해 진핵 유기체들로부터 생합성으로 생산될 수 있고, 여기서 제 1 진핵 유기체는 1,3-BDO 중간체를 생산하고 제 2 진핵 유기체는 상기 중간체를 1,3-BDO로 전환시킨다. 어떤 구현예는 아세틸-CoA 및 1,3-BDO 경로 구성요소들의 임의의 조합을 포함한다.
본원에 제공된 교시 및 지침을 고려할 때, 당해분야의 숙련가는, 하부경로를 갖는 다른 비-자연 발생 진핵 유기체의 공동-배양으로, 그리고 단독으로 또는 1,3-BDO와 조합되어, 세포질 아세틸-CoA를 생산하는 당업계에 잘 알려진 다른 화학적 및/또는 생화학적 과정의 조합으로, 다른 진핵 유기체와 더불어, 본원에 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체 및 방법들에 대해 다양한 조합 및 순열이 존재한다는 것을 이해할 것이다.
아세틸-CoA 경로 효소 또는 단백질에 대한 코딩 핵산의 공급원은, 예를 들면, 코딩된 유전자 생성물이 참조된 반응을 촉매할 수 있는 임의의 종을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 본원에 기재된 바와 같이 1,3-BDO 경로 효소 또는 단백질 또는 1,3-BDO 생산에 영향을 미치는 관련 단백질 또는 효소(예를 들면, 1,3-BDO 부산물 경로 효소)에 대한 코딩 핵산의 공급원은 상기 코딩된 유전자 생성물이 참조된 반응을 촉매할 수 있는 임의의 종을 포함할 수 있다. 그러한 종들은 원핵 및 진핵 유기체 모두를 포함하고, 이는 비제한적으로, 고세균 및 진정박테리아를 포함하는 박테리아, 및 효모, 식물, 곤충, 동물, 및 인간을 포함하는 포유동물을 포함하는 진핵을 포함한다. 그와 같은 공급원을 위한 예시적인 종은, 예를 들면, 대장균, 악시다미노코쿠스 페르멘탄스 , 아시네토박터 베일리이 , 아시네토박터 칼코아세티쿠스 , 아퀴펙스 아에올리쿠스 , 아라비돕시스 탈리아나 , 아차에오글로버스 풀기더스 , 아스페르길루스 니게르 , 아스페르길러스 테레우스 , 바실러스 서브틸리스 , 보스 타우루스 , 칸디다 알비칸스 , 칸디다 트로피칼리스, 클라마이도모나스 레인하르드티이 , 클로로비움 테피덤 , 사이트로박터 코세리, 사이트루스 주노스 , 클로스트리듐 아세토부틸리컴 , 클로스트리듐 클루이베리 , 클로스트리듐 사카로페르부틸아세토니컴 , 시아노비움 PCC7001 , 데설파티바실럼 알케니보란스, 닉티오스텔리움 디스코이데움 , 푸소박테리움 뉴클레아툼 , 할로아르큘라 마리스모르투이 , 호모사피엔스 , 하이드로게노박터 서모필러스 , 클렙시엘라 뉴모니아에 , 클루이베로마이세스 락티스 , 락토바실러스 브레비스 , 류코노스톡 메센테로이데스 , 메탈로파에라 세둘라 , 메타노테르모박터 테마우토트로피쿠스 , 머스 무스큘러스 , 미코박테리아 아비움 , 미코박테리아 보비스 , 미코박테리아 마리넘 , 마이코박테리움 스메그마티스, 니코티아나 타바큠 , 노카르디아 아이오웬시스 , 오릭톨라거스 쿠니큘러스 , 펜니실리움 크리소게넘 , 피치아 패스토리스 , 포르파이로모나스 진지발리스 , 포르파이로모나스 진지발리스 , 슈도모나스 아에루기노스 , 슈도모나스 푸티다 , 파이로바큘럼 에어로필럼 , 랄스토니아 유트로파 , 래투스 노르베기쿠스 , 로도박터 스파에로이데스 , 사카로마이세스 세레비지애 , 살모넬라 장용 , 살모넬라 타이피뮤리움 , 쉬조사카로마이세스 폼베 , 설포로버스 악시도칼다리우스 , 설포로버스 솔파타리쿠스 , 설포로버스 토코다이이, 테모아나에로박터 텡콘겐시스 , 테르무스 서모필러스 , 트라이파노소마 브루세이 , 츠가무렐라 파우로메타볼라, 야로위아 리포라이티카 , 주글레아 라미제라 및 자이모모나스 모빌리스 뿐만 아니라 본원에 개시되거나 상응하는 유전자를 위한 공급원 유기체로서 이용가능한 다른 예시적인 종들을 포함한다. 그러나, 395개의 진핵 유기체 게놈 및 다양한 효모, 진균, 식물, 및 포유동물 게놈을 포함하는 현재 550개가 넘는 종(이들 중 절반 이상이 NCBI와 같은 공공 데이타베이스 상에서 이용가능함)에 대해 이용가능한 완전한 게놈 서열을 이용하여, 예를 들면, 공지된 유전자의 동족체, 오쏘로그, 파라로그 및 비오쏘로그 유전자 치환, 및 유기체 간의 유전적 변이의 상호교환을 포함하는, 관련성이 있거나 관련성이 없는 종에서의 하나 이상의 유전자에 대한 필수 세포질 아세틸-CoA 및/또는 1,3-BDO 생합성 활성을 코딩하는 유전자의 동정은 당업계에 일상적인 것이며 잘 알려져 있다. 따라서, 특정한 유기체와 관련하여 본원에 기재된 세포질 아세틸-CoA 및/또는 1,3-BDO의 생합성을 가능하게 하는 대사 변화는 비슷한 다른 진핵 유기체에 쉽게 적용될 수 있다. 본원에서 제공된 교시 및 지침을 고려할 때, 당해분야의 숙련가는 하나의 유기체에서 예시된 대사 변화가 다른 유기체에 적용될 수 있다는 것을 알 것이다.
대안적인 세포질 아세틸-CoA 및/또는 1,3-BDO 생합성 과정이 관련없는 종에 존재하는 경우와 같은 일부 구현예에서, 예를 들면, 참조된 반응을 대체하는 유사하긴 하지만 동일하지는 않은 대사 반응을 촉진하는 관련없는 종으로부터 파라로그 또는 파라로그들의 외인성 발현에 의해, 세포질 아세틸-CoA 및/또는 1,3-BDO 생합성이 숙주 종에 부여될 수 있다. 대사 네트워크 중에 약간의 차이가 상이한 유기체 간에 존재하기 때문에, 당해분야의 숙련가는, 상이한 유기체 간의 실제 유전자 용법이 다를 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러나, 본원에서 제공된 교시 및 지침을 고려할 때, 당해분야의 숙련가는 또한 본원에 제공된 교시 및 방법들이, 단독으로 또는 1,3-BDO와 조합되어 세포질 아세틸-CoA를 합성할 관심있는 종에서의 진핵 유기체를 구축하기 위해 본원에 예시된 것에 대한 유사한 대사 변화를 이용하여 모든 진핵 유기체에 적용될 수 있는 것으로 이해할 것이다.
비-자연 발생 세포질 아세틸-CoA의 생산 숙주를 구축하고 발현 수준을 시험하는 방법들은, 예를 들면, 당업계에 잘 알려진 재조합 및 검출 방법들에 의해 수행될 수 있다. 비-자연 발생 1,3-BDO-생산 숙주를 구축하고 발현 수준을 시험하는 방법들은 또한 예를 들면, 당업계에 잘 알려진 재조합 및 검출 방법들에 의해 수행될 수 있다. 그러한 방법들은, 예를 들면, 문헌[brook 등, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)]에 기재된 바와 같이 확인될 수 있다.
세포질 아세틸-CoA의 생산을 위한 경로에 관여하는 외인성 핵산 서열들은, 비제한적으로, 콘주게이션, 전기천공, 화학적 형질전환, 형질도입, 형질감염, 및 초음파 형질전환을 포함하는, 당업계에 잘 알려진 기술을 이용하여 숙주세포 내로 안정적으로 또는 일시적으로 도입될 수 있다. 진핵 유기체가 1,3-BDO 경로를 추가로 포함하는 구현예에서, 1,3-BDO의 생산을 위한 경로에 관여하는 외인성 핵산 서열들은 이들 동일한 기술을 이용하여 숙주세포 내로 안정적으로 또는 일시적으로 도입될 수 있다. 효모 또는 다른 진핵 세포에서의 외인성 발현을 위해, 유전자들은 리더 서열의 부가없이 세포질에서 발현될 수 있거나, 숙주 세포에 적합한 미토콘드리아 표적화 또는 분비 신호와 같이 적합한 표적화 서열의 부가에 의해, 미토콘드리아 또는 다른 소기관에 표적화될 수 있거나, 분비를 위해 표적화될 수 있다. 따라서, 바람직한 특성을 부여하기 위해 표적화 서열을 제거하거나 포함하는 핵산 서열에 대한 적절한 변형이 외인성 핵산 서열 내로 혼입될 수 있는 것으로 이해된다. 더욱이, 유전자들은 단백질의 최적화된 발현을 달성하기 위해 당업계에 잘 알려진 기술을 이용하여 코돈 최적화될 수 있다.
발현 벡터 또는 벡터들은 숙주 유기체에서 기능적인 발현 대조군 서열에 작동가능하게 연결된 본원에 예시된 바와 같은 핵산을 코딩하는 하나 이상의 세포질 아세틸-CoA 생합성 경로를 포함하도록 구축될 수 있다. 발현 벡터 또는 벡터들은 또한 숙주 유기체에서 기능적인 발현 대조군 서열에 작동가능하게 연결된 본원에 예시된 바와 같은 핵산을 코딩하는 하나 이상의 1,3-BDO 생합성 경로를 포함하도록 구축될 수 있다. 본원에 제공된 진핵 숙주 유기체에서 사용하는데 적용될 수 있는 발현 벡터들은, 예를 들면, 플라스미드, 파아지 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 인공 염색체를 포함하고, 이는 벡터 및 숙주 염색체로의 안정한 혼입을 위해 작동가능한 선택 서열 또는 마커를 포함한다. 또한, 상기 발현 벡터들은 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자 및 적절한 발현 대조군 서열을 포함할 수 있다. 항생제 또는 독소에 대해 내성을 제공하거나, 영양요구성 결핍을 보충하거나, 배양 배지에 없는 매우 중요한 영양소를 공급하는 선택가능한 마커 유전자가 또한 포함될 수 있다. 발현 대조군 서열들은 당업계에 공지된 항시성 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서, 전사 종결자 등을 포함할 수 있다. 둘 이상의 외인성 코딩 핵산들이 공동-발현될 경우, 두 핵산들은, 예를 들면, 단일 발현 벡터 내로 또는 별개의 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 단일 벡터 발현의 경우, 코딩 핵산들은 하나의 통상적인 발현 대조군 서열에 작동가능하게 연결되거나 상이한 발현 대조군 서열, 예컨대 하나의 유도성 프로모터 및 하나의 항시성 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대사 또는 합성 경로에 관여하는 외인성 핵산 서열의 형질전환은 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 그러한 방법들은, 예를 들면, mRNA의 노던 블랏 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭, 또는 유전자 생성물의 발현에 대한 면역블로팅, 또는 도입된 핵산 서열 또는 그의 상응하는 유전자 생성물의 발현을 시험하는 다른 적합한 분석 방법과 같은 핵산 분석을 포함한다. 외인성 핵산은 원하는 생성물을 생산하기 위해 충분한 양으로 발현된다는 것이 당해분야의 숙련가에 의해 이해될 것이고, 발현 수준은 당업계에 잘 알려지고 본원에서 개시된 바와 같은 방법을 이용하여 충분한 발현을 수득하도록 최적화될 수 있는 것으로 더 이해된다.
일부 구현예에서, 세포질 아세틸-CoA를 생산하기 위한 충분한 기간 동안 충분한 조건 하에서 본원에 기술된 아세틸-CoA 경로를 포함하는 임의의 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 것을 포함하는, 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체에서 세포질 아세틸-CoA를 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 다른 구현예에서, 세포질 아세틸-CoA 및 1,3-BDO를 생산하기 위한 충분한 기간 동안 충분한 조건 하에서 본원에 기재된 1,3-BDO 경로를 포함하는 임의의 비-자연 발생 진핵 유기체를 배양하는 것을 포함하는, 아세틸-CoA 경로 및 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체에서 1,3-BDO를 생산하는 방법이 본원에 제공된다.
세포질 아세틸-CoA 및/또는 1,3-BDO의 생산을 시험하는 적합한 정제 및/또는 분석은 널리 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 시험될 각각의 조작된 균주를 위해 삼중 배양과 같이 적합한 복제물이 성장될 수 있다. 예를 들면, 조작된 생산 숙주에서의 생성물 및 부산물 형성이 관찰될 수 있다. 최종 생성물 및 중간체, 및 다른 유기 화합물들은, HPLC(고성능 액체 크로마토그래피), GC-MS(기체 크로마토그래피-질량 분광계) 및 LC-MS(액체 크로마토그래피-질량 분광계) 또는 당업계에 잘 알려진 일상적인 절차를 이용한 다른 적합한 분석적 방법과 같은 방법들에 의해 분석될 수 있다. 발효 액체배지 내에서의 생성물의 방출은 또한 배양 상청액을 이용하여 시험될 수 있다. 부산물 및 잔류 글루코오스는, 예를 들면, 글루코오스 및 알코올의 경우 굴절률 검출기, 및 유기산의 경우 UV 검출기(Lin 등, Biotechnol . Bioeng. 90:775-779 (2005))를 이용한 HPLC, 또는 당업계에 잘 알려진 다른 적합한 분석 및 검출 방법들에 의해 정량화될 수 있다. 외인성 DNA 서열로부터의 개별적인 효소 또는 단백질 활성은 또한 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 분석될 수 있다. 세포질 아세틸-CoA의 이용가능성의 증가는 세포질 아세틸-CoA로부터 형성된 대사물(예를 들면, 1-3-부탄디올)의 생산 증가에 의해 입증될 수 있다. 대안적으로, 기능적 세포질 아세틸-COA 경로는, 최소 배지 상에서 성장을 지지하는 충분한 세포질 아세틸-CoA를 합성할 수 없도록 조작된 유기체(예를 들면, S. 세레비시애)를 이용하여 스크리닝될 수 있다. WO/2009/013159호를 참조한다. 최소 배지 상에서의 성장은 세포질 아세틸-CoA 생산을 위한 유기체 내로 기능적 비-원상태 기전을 도입함으로써 회복된다.
세포질 아세틸-CoA 및/또는 1,3-BDO는 당업계에 잘 알려진 다양한 방법을 이용하여 배양액 내 다른 구성요소들로부터 분리될 수 있다. 그러한 분리 방법들은, 예를 들면, 추출 과정 뿐만 아니라 연속적 액체-액체 추출, 투석증발, 막 여과, 막 분리, 역삼투법, 전기투석, 증류, 결정화, 원심분리, 추출성 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 및 한외여과를 포함하는 방법을 포함한다. 상기 방법 모두는 본 기술분야에 널리 알려져 있다.
본원에서 기술된 임의의 비-자연 발생 진핵 유기체는 본원에 제공된 생합성 생성물을 생산하고/거나 분비하도록 배양될 수 있다. 예를 들면, 세포질 아세틸-CoA 생산체가 생합성 세포질 아세틸-CoA 및 또는 1,3-BDO의 생산을 위해 배양될 수 있다.
세포질 아세틸-CoA 및/또는 1,3-BDO의 생산을 위해, 재조합 균주들은 탄소 공급원 및 다른 필수 영양소를 갖는 배지에서 배양된다. 전체 공정의 비용을 줄이기 위해 발효조 내에 혐기성 조건을 유지하는 것이 때대로 바람직하며 아주 바람직할 수 있다. 그러한 조건들은, 예를 들면, 먼저 배지에 질소를 살포한 다음 격막 및 크림프-캡으로 플라스크를 밀봉함으로써 수득될 수 있다. 성장이 혐기성으로 관찰되지 않는 균주의 경우, 제한된 통기를 위해 격막에 작은 구멍을 뚫음으로써 미량호기성 또는 실질적으로 혐기성 조건이 적용될 수 있다. 예시적인 혐기성 조건들은 종래 기술되어 왔고, 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 호기성 및 혐기성 조건들은, 예를 들면, 2007년 8월 10일에 출원된 미국 공보 제2009/0047719호에 기재되어 있다. 발효는 본원에서 개시된 바와 같이 회분식, 유가식 또는 연속 방식으로 수행될 수 있다.
원하는 경우, 배지의 pH는 필요에 따라 바람직한 pH로 배양 배지를 유지하기 위해 NaOH와 같은 염기 또는 다른 염기들, 또는 산을 첨가하여, 원하는 pH, 특히 중성 pH, 예컨대 약 7의 pH로 유지될 수 있다. 성장률은 분광측정기(600 nm)를 이용하여 광학 밀도를 측정함으로써 결정될 수 있고, 글루코오스 흡수율은 시간에 따른 탄소 공급원 결핍을 관찰함으로써 결정될 수 있다.
상기 예시된 것과 같은 재생가능한 공급원료 이외에도, 본원에서 제공된 진핵 유기체는 또한 탄소의 그 공급원으로서 합성가스 상에서의 성장을 위해 변형될 수 있다. 이러한 특정 구현예에서, 하나 이상의 단백질 또는 효소들이 합성가스 또는 다른 가스성 탄소 공급원의 이용을 위한 대사 경로를 제공하기 위해 진핵 유기체에서 발현된다.
본원에 제공된 유기체는, 예를 들면, 비-자연 발생 진핵 유기체에게 탄소 공급원을 공급할 수 있는 임의의 탄수화물 공급원을 이용할 수 있고, 성장 배지는 이를 포함할 수 있다. 그러한 공급원은, 예를 들면, 글루코오스, 자일로스, 아라비노오스, 갈락토오스, 만노스, 푸룩토오스, 수크로오스 및 전분과 같은 당류를 포함한다. 탄수화물의 다른 공급원은, 예를 들면, 재생가능한 공급원료 및 바이오매스를 포함한다. 본원에서 제공된 방법에서 공급원료로서 사용될 수 있는 바이오매스의 예시적인 유형은 셀룰로오스계 바이오매스, 헤미셀룰로오스계 바이오매스 및 리그닌 공급원료 또는 공급원료의 일부를 포함한다. 그러한 바이오매스 공급원료는, 예를 들면, 글루코오스, 자일로스, 아라비노오스, 갈락토오스, 만노스, 프럭토오스 및 전분과 같은 탄소 공급원으로서 유용한 탄수화물 기질을 함유한다. 본원에서 제공된 교시 및 지침을 고려할 때, 당해분야의 숙련가는, 상기 예시된 것 이외의 재생가능한 공급원료 및 바이오매스가 또한 세포질 아세틸-CoA 및/또는 1,3-BDO의 생산을 위해 본원에서 제공된 진핵 유기체를 배양하는데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
상기 예시된 것과 같은 재생가능한 공급원료 이외에도, 본원에 제공된 진핵 유기체는 또한 탄소의 공급원으로서 합성가스 상에서의 성장을 위해 변형될 수 있다. 이러한 특정 구현예에서, 하나 이상의 단백질 또는 효소들이 합성가스 또는 다른 가스성 탄소 공급원의 이용을 위한 대사 경로를 제공하기 위해 세포질 아세틸-CoA 생산 유기체에서 발현된다.
발생로 가스(producer gas)로도 공지된 합성가스(syngas, synthesis gas)는, 농작물 및 잔해를 포함하는 바이오매스 물질과 같은 석탄 및 탄소질 물질의 가스화의 주된 생성물이다. 합성가스는 주로 H2 및 CO의 혼합물이며, 비제한적으로 석탄, 석유, 천연가스, 바이오매스, 및 폐유기물을 포함하는, 임의의 유기 공급원료의 가스화로부터 수득될 수 있다. 가스화는 일반적으로 높은 연료 대 산소 비율 하에서 수행된다. 대체로 H2 및 CO임에도 불구하고, 합성가스는 또한 더 적은 양으로 CO2 및 다른 가스를 포함할 수 있다. 따라서, 합성가스는 CO 및 추가로 CO2와 같은 가스성 탄소의 비용 효과적인 공급원을 제공한다.
따라서, 본원에서 제공된 교시 및 지침을 고려할 때, 당해분야의 숙련가는, 탄수화물과 같은 탄소 공급원에서 성장될 때 본원에 제공된 생합성된 화합물들을 분비하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 생산될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러한 화합물들은, 예를 들면, 세포질 아세틸-CoA 및 상기 아세틸-CoA 경로 내의 임의의 중간체 대사물을 포함한다. 그러한 화합물들은, 예를 들면, 1,3-BDO 및 상기 1,3-BDO 경로에서의 임의의 중간체 대사물을 포함한다. 필요한 전부는, 예를 들면, 세포질 아세틸-CoA 및/또는 1,3-BDO 생합성 경로의 일부 또는 모두의 포함을 포함하는, 원하는 화합물 또는 중간체의 생합성을 달성하기 위한 하나 이상의 필요한 효소 또는 단백질 활성을 조작하는 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, 탄수화물 또는 다른 탄소 공급원 상에서 성장할 때 세포질 아세틸-CoA를 생산하고/거나 분비하고 탄수화물 또는 다른 탄소 공급원 상에서 성장할 때 아세틸-CoA 경로에서 나타난 임의의 중간체 대사물을 생산하고/거나 분비하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에 제공된다. 본원에서 제공된 세포질 아세틸-CoA를 생산하는 진핵 유기체는 중간체, 예를 들면, 시트레이트 및 아세테이트로부터 합성을 개시할 수 있다. 다른 구현예에서, 탄수화물 또는 다른 탄소 공급원에서 성장할 때 1,3-BDO를 생산하고/거나 분비하고 탄수화물 또는 다른 탄소 공급원에서 상장할 때 1,3-BDO 경로에서 나타난 임의의 중간체 대사물을 생산하고/거나 분비하는 비-자연 발생 진핵 유기체가 본원에 제공된다. 1,3-BDO 생산 유기체는 아세틸-CoA로부터 1,3-BDO의 합성을 개시할 수 있고, 그와 같이 경로의 조합이 가능하다.
본원에서 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체는 세포질 아세틸-CoA를 생산하는데 충분한 양으로 아세틸-CoA 경로 효소 또는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 외인성으로 발현하도록 본원에 예시된 바와 같은 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 구축된다. 본원에서 제공된 진핵 유기체는 세포질 아세틸-CoA를 생산하는데 충분한 조건 하에서 배양되는 것으로 이해된다. 본원에서 제공된 교시 및 지침에 따라, 본원에서 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체는 세포질 아세틸-CoA의 생합성을 달성하여 약 0.1-200 mM 또는 그 이상의 세포내 농도를 야기할 수 있다. 일반적으로, 세포질 아세틸-CoA의 세포내 농도는 약 3-150 mM, 특히 약 5-125 mM 및 더욱 특히 약 8-100 mM이며, 이는 약 10 mM, 20 mM, 50 mM, 80 mM, 또는 그 이상을 포함한다. 이들 예시적인 범위의 사이 및 각각을 초과하는 세포내 농도 역시 본원에 제공된 비-자연 발생 유기체로부터 달성될 수 있다.
비-자연 발생 진핵 유기체가 아세틸-CoA 경로 및 1,3-BDO 경로를 포함하는 어떤 구현예에서, 유기체는 아세틸-CoA 및/또는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 아세틸-CoA 경로 및/또는 1,3-BDO 경로 효소 또는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 외인성으로 발현하도록 본원에 예시된 바와 같은 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 구축될 수 있다. 본원에서 제공된 진핵 유기체는 세포질 아세틸-CoA 및/또는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 조건 하에서 배양되는 것으로 이해된다. 본원에서 제공된 교시 및 지침에 따라, 본원에서 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체는 1,3-BDO의 생합성을 달성하여 약 0.1-2000 mM 또는 그 이상의 세포내 농도를 야기할 수 있다. 일반적으로, 1,3-BDO의 세포내 농도는 약 3-1800 mM, 특히 약 5-1700 mM 및 더욱 특히 약 8-1600 mM이며, 약 100 mM, 200 mM, 500 mM, 800 mM, 또는 그 이상을 포함한다. 이들 예시적인 범위의 사이 및 각각을 초과하는 세포내 농도 역시 본원에 제공된 비-자연 발생 유기체로부터 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 배양 조건들은 혐기성 또는 실질적으로 혐기성 성장 또는 유지 조건들을 포함한다. 예시적인 혐기성 조건들은 종래에 기술되어 왔고 당해기술에 공지되어 있다. 발효 과정을 위한 예시적인 혐기성 조건들은 본원에 기재되어 있고, 예를 들면, 2007년 8월 10일에 출원된 미국 공보 제2009/0047719호에 기재되어 있다. 이들 조건들 중 임의의 것이 비-자연 발생 진핵 유기체 뿐만 아니라 당업계에 잘 알려진 다른 무산소성 조건들을 이용하여 이용될 수 있다. 그러한 혐기성 또는 실질적으로 혐기성 조건 하에서, 세포질 아세틸-CoA 생산체는 0.005-1000 mM 또는 그 이상의 세포내 농도 뿐만 아니라 본원에 예시된 모든 다른 농도로 세포질 아세틸-CoA를 합성할 수 있다. 상기 설명이 세포내 농도를 참조함에도 불구하고, 세포질 아세틸-CoA 생산 진핵 유기체는 세포질 아세틸-CoA를 세포 내에서 생산하고/거나 배양 배지 내로 생성물을 분비할 수 있는 것으로 이해된다. 비-자연 발생 진핵 유기체가 1,3-BDO 경로를 추가로 포함하는 구현예에서, 그러한 혐기성 조건 하에서, 1,3-BDO 생산체는 5-10 mM 또는 그 이상의 세포내 농도 뿐만 아니라 본원에 예시된 모든 다른 농도로 1,3-BDO를 합성할 수 있다. 상기 설명이 세포내 농도를 참조함에도 불구하고, 1,3-BDO 생산 진핵 유기체는 1,3-BDO를 세포 내에서 생산하고/거나 배양 배지 내로 생성물을 분비할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 개시된 배양 및 발효 조건들 외에, 세포질 아세틸-CoA 및/또는 1,3-BDO의 생합성을 달성하기 위한 성장 조건은 배양 조건에 삼투보호제를 부가하는 것을 포함할 수 있다. 어떤 구현예에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체는 삼투보호제의 존재 하에 본원에 기재된 바와 같이 유지되거나, 배양되거나, 발효될 수 있다. 요약하면, 삼투보호제는 삼투물질로서 작용하고 본원에 기재된 바와 같은 진핵 유기체가 삼투 스트레스를 견디는데 도움을 주는 화합물을 지칭한다. 삼투보호제는, 비제한적으로, 베타인, 아미노산, 및 당 트레할로오스를 포함한다. 그러한 비-제한적인 예는, 글리신 베타인, 프랄린 베타인, 디메틸테틴, 디메틸슬포니오프로피오네이트, 3-디메틸설포니오-2-메틸프로피오네이트, 피페콜산, 디메틸설포니오아세테이트, 콜린, L-카르니틴 및 엑토인이다. 일 측면에서, 삼투보호제는 글리신 베타인이다. 삼투 스트레스로부터 본원에 기재된 진핵 유기체를 보호하는데 적합한 삼투보호제의 양 및 유형은 사용된 진핵 유기체에 좌우될 것으로 당업계의 당해분야의 숙련가에게 이해된다. 배양 조건 내 삼투보호제의 양은, 예를 들면, 약 0.1 mM 이하, 약 0.5 mM 이하, 약 1.0 mM 이하, 약 1.5 mM 이하, 약 2.0 mM 이하, 약 2.5 mM 이하, 약 3.0 mM 이하, 약 5.0 mM 이하, 약 7.0 mM 이하, 약 10 mM 이하, 약 50 mM 이하, 약 100 mM 이하 또는 약 500 mM 이하일 수 있다.
일부 구현예에서, 세포질 아세틸-CoA 또는 임의의 아세틸-CoA 경로 중간체에 존재하는 원자들의 동위원소 분포를 변경하기 위해, 탄소 공급원료 및 다른 세포 흡수 공급원, 예컨대 포스페이트, 암모니아, 설페이트, 클로라이드 및 다른 할로겐들이 선택될 수 있다. 상기 열거된 다양한 탄소 공급원료 및 다른 흡수 공급원은 본원에서 총괄하여 "흡수 공급원"으로서 지칭될 것이다. 흡수 공급원은 임의의 지점에서 경로로부터 분기될 때 생성되는 임의의 세포질 아세틸-CoA 불순물을 포함하는 생성물 세포질 아세틸-CoA 또는 아세틸-CoA 경로 중간체 내에 존재하는 임의의 원자에 대해 동위원소 농축(isotopic enrichment)을 제공할 수 있다. 동위원소 농축은, 예를 들면, 탄소, 수소, 산소, 질소, 황, 인, 클로라이드 또는 다른 할로겐들을 포함하는 임의의 표적 원자에 대해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 흡수 공급원은 탄소-12, 탄소-13, 및 탄소-14 비율을 변경하기 위해 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 흡수 공급원은 산소-16, 산소-17, 및 산소-18 비율을 변경하기 위해 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 흡수 공급원은 수소, 중수소, 및 트리튬 비율을 변경하기 위해 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 흡수 공급원은 질소-14 및 질소-15 비율을 변경하기 위해 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 흡수 공급원은 황-32, 황-33, 황-34, 및 황-35 비율을 변경하기 위해 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 흡수 공급원은 인-31, 인-32, 및 인-33 비율을 변경하기 위해 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 흡수 공급원은 염소-35, 염소-36, 및 염소-37 비율을 변경하기 위해 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 흡수 공급원의 표적 동위원소 비율은 흡수 공급원의 합성 화학적 농축을 통해 수득될 수 있다. 그러한 동위원소적으로 농축된 흡수 공급원은 상업적으로 구입되거나 실험실에서 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 흡수 공급원의 표적 동위원소 비율은 자연계에서 흡수 공급원의 기원을 선택함으로써 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 원자의 동위원소 비율은 하나 이상의 흡수 공급원을 선택함으로써 원하는 비율로 바뀔 수 있다. 흡수 공급원은 자연계에서 발견된 바와 같은, 천연 공급원으로부터 유래되거나, 인간이 만든 공급원으로부터 유래될 수 있고, 당해분야의 숙련가는 표적 원자의 원하는 동위원소 비율을 달성하기 위해 천연 공급원, 인간이 만든 공급원, 또는 이들의 조합을 선택할 수 있다. 인간이 만든 흡수 공급원의 예는, 예를 들면, 화학 합성 반응으로부터 적어도 일부 유래된 흡수 공급원을 포함한다. 그러한 동위원소적으로 농축된 흡수 공급원은 상업적으로 구입되거나 실험실에서 제조될 수 있고/거나 원하는 동위원소 비율을 달성하기 위해 임의로 흡수 공급원의 천연 공급원과 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 흡수 공급원의 표적 원자 동위원소 비율은 자연계에서 발견된 바와 같은 흡수 공급원의 원하는 기원을 선택함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 본원에서 논의된 바와 같이, 천연 공급원은 생물학적 유기체로부터 유래된 생물기반이거나 생물학적 유기체에 의해 합성될 수 있거나, 석유-기반 생성물 또는 대기와 같은 공급원일 수 있다. 일부 그러한 구현예에서, 탄소의 공급원은, 예를 들면, 탄소-14가 상대적으로 결핍될 수 있는 화석 연료-유래 탄소 공급원, 또는 그 석유-유래 대응물보다 더 많은 양의 탄소-14를 가질 수 있는, CO2와 같은 환경 탄소 공급원으로부터 선택될 수 있다.
불안정한 탄소 동위원소 탄소-14 또는 방사성탄소는 지구의 대기 내 1012 탄소 원자 중 대략 1을 차지하며 약 5700년의 반감기를 갖는다. 상기 탄소는 우주선(cosmic ray)과 일상적인 질소(14N)를 포함하는 핵 반응에 의해 상층부 대기에 의해 보충된다. 화석 연료는, 먼 옛날 부패하였기 때문에, 탄소-14를 함유하지 않는다. 화석 연료의 연소는 대기 중 탄소-14 분획을 낮춘다(소위 "수스(Suess) 효과").
화합물 내 원자의 동위원소 비율을 결정하는 방법들은 당해분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 동위원소 농축은 본 기술분야에 공지된 기술, 예컨대 가속화된 질량 분광분석법(AMS), 안정한 동위원소 방사성 질량 분광분석법(SIRMS) 및 핵자기 공명에 의한 부위-특이적 천연 동위원소 분획화(SNIF-NMR)를 이용한 질량 분광분석법에 의해 쉽게 평가된다. 그러한 질량 스펙트럼 기술은 액체 크로마토그래피(LC), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및/또는 기체 크로마토그래피 등과 같은 분리 기술과 통합될 수 있다.
탄소의 경우, 국제 미국 재료시험 협회(American Society for Testing and Materials (ASTM) International)에 의한 방사성탄소 연대측정을 이용하여 고체, 액체, 및 가스의 샘플의 생물기반 함량을 결정하는 표준화된 분석 방법으로서 미국에서 ASTM D6866이 개발되었다. 상기 표준은 생성물의 생물기반 함량의 결정을 위해 방사성탄소 연대측정을 사용하는 것에 기초한다. ASTM D6866은 2004년에 처음 공개되었고, 상기 표준의 현재 활성판은 ASTM D6866-11이다(2011년 4월 1일부터 유효). 본 명세서에서 기재된 것을 포함하는, 방사성탄소 연대측정 기술은 당해분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다.
화합물의 생물기반 함량은 탄소-14(14C) 대 탄소-12(12C)의 비율에 의해 추정된다. 구체적으로, Fraction Modern(Fm)이 식: Fm = (S-B)/(M-B)로부터 컴퓨터에 의해 계산되며, 여기서 B, S 및 M은 각각 블랭크, 샘플 및 모던 참조의 14C/12C 비율을 나타낸다. Fraction Modern은 "Modern"으로부터 샘플의 14C/12C 비율의 편차의 측정값이다. Modern은 δ13CVPDB=-19 per mil로 정규화된 국립 표준국(NBS) 옥살산 I(즉, 표준 참조 물질(SRM) 4990b)의 방사성탄소 농도(AD 1950)의 95%로서 정의된다. Olsson, The use of Oxalic acid as a Standard. in, Radiocarbon Variations and Absolute Chronology, Nobel Symposium, 12th Proc., John Wiley & Sons, New York (1970). 예를 들면, ASM에 의해 측정된, 질량 분광분석법 결과들은, δ13CVPDB=-19 per mil로 정규화된 NBS 옥살산 I(SRM 4990b)의 비활성의 0.95배의 국제적으로 합의된 정의를 이용하여 계산된다. 이것은 1.176 ± 0.010 x 10-12의 절대(AD 1950) 14C/12C 비율에 대응된다(Karlen 등, Arkiv Geofysik, 4:465-471 (1968)). 상기 표준 계산은, 도 다른 것에 대한 하나의 동위원소의 차별적인 흡수, 예를 들면 C14 대비 C13 대비 C12의 생물학적 시스템에서의 우선적인 흡수를 고려하며, 이들 보정은 δ13에 대해 수정된 Fm으로서 반영된다.
옥살산 표준(SRM 4990b 또는 HOx 1)은 1955 사탕무우의 작물로부터 만들어졌다. 1000 lbs가 만들어졌음에도 불구하고, 이 옥살산 표준은 더 이상 상업적으로 이용가능하지 않다. 옥살산 Ⅱ 표준(HOx 2; N.I.S.T 명칭 SRM 4990 C)은 1977 프랑스 사탕무우의 작물로부터 만들어졌다. 1980년대 초에, 12 실험실의 그룹들이 두 표준의 비율을 측정하였다. 옥살산 Ⅱ 대 1의 활성비는 1.2933±0.001(칭량된 평균)이다. HOx Ⅱ의 동위원소 비는 -17.8 per mille이다. ASTM D6866-11은 모던 표준에 위해 상기 이용가능한 옥살산 Ⅱ 표준 SRM 4990 C(Hox2)의 사용을 제시한다(Mann, Radiocarbon, 25(2):519-527 (1983)에서 원래 대 현재 이용가능한 옥살산 표준의 논의를 참고). Fm = 0%는 물질 내에 탄소-14 원자의 완전한 결핍을 나타내고, 따라서 화석(예를 들면, 석유 기반) 탄소 공급원을 가리킨다. 핵 폭탄 시험으로부터 대기 내로 탄소-14의 1950 주사 후에 대한 보정 이후의 Fm = 100%는 전적으로 모던 탄소 공급원을 가리킨다. 본원에 기재된 바와 같이, 그러한 "모던" 공급원은 생물기반 공급원을 포함한다.
ASTM D6866-11에 기재된 바와 같이 대기 중 탄소-14의 상당한 농축을 야기했던 1950년대 핵 시험 프로그램의 지속적이지만 감소하는 효과로 인해, ASTM D6866에 기재된 바와 같이, 퍼센트 모던 탄소(pMC)는 100%보다 더 클 수 있다. 모든 표본 탄소-14 활성이 "폭탄 전" 표준을 참조하기 때문에, 그리고 거의 모든 새로운 생물기반 생성물들이 폭탄 후 환경에서 생산되기 때문에, 샘플의 실제 생물기반 함량을 더 잘 반영하기 위해서는 모든 pMC 값(동위원소 분획에 대한 보정 후)에 0.95(2010년 이래)를 곱해야 한다. 103%보다 큰 생물기반 함량은 분석오차가 일어났거나, 생물기반 탄소의 공급원이 수 년 이상 전이다는 것을 제시한다.
ASTM D6866은 물질의 총 유기 함량 대비 생물기반 함량을 정량화하며 무기 탄소 및 다른 비-탄소 함유 물질이 존재하는 것을 고려하지 않는다. 예를 들면, 50% 전분계 물질 및 50% 물인 생성물은 ASTM D6866에 기초하여 생물기반 함량 = 100%(100% 생물기반인 50% 유기 함량)를 갖는 것으로 간주될 것이다. 또 하나의 예에서, 50% 전분계 물질, 25% 석유-기반, 및 25% 물인 생성물은 생물기반 함량 = 66.7%(75% 유기 함량이자만 단지 생성물의 50%가 생물기반임)를 가질 것이다. 또 하나의 예에서, 50% 유기 탄소이고 석유-기반 생성물인 생성물은 생물기반 함량 = 0%(50% 유기 탄소지만 화석 공급원 유래임)를 갖는 것으로 간주될 것이다. 따라서, 화합물 또는 물질의 생물기반 함량을 결정하는 잘 알려진 방법 및 공지된 표준에 기초하여, 당해분야의 숙련가는 생물기반 함량을 쉽게 결정할 수 있고/거나 원하는 생물기반 함량을 갖는 본 발명을 이용하는 제조된 하류 생성물을 쉽게 결정할 수 있다.
물질들의 생물기반 함량을 정량화하는 탄소-14 연대측정 기술의 적용은 당업계에 공지되어 있다(Currie 등, Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B, 172:281-287 (2000)). 예를 들면, 탄소-14 연대측정은 테레프탈레이트-함유 물질 내 생물기반 함량을 정량화하는데 사용되어 왔다(Colonna 등, Green Chemistry, 13:2543-2548 (2011)). 주목할만하게도, 재생가능한 1,3-프로판디올 및 석유-유도된 테레프탈산으로부터 유래된 폴리프로필렌 테레프탈레이트(PPT) 중합체는 30%에 가까운 Fm 값을 야기하였다(즉, 중합체 탄소 중 3/11이 재생가능한 1,3-프로판디올로부터 유래되고 8/11이 화석 최종 성분 테레프탈산으로부터 유래되므로)(Currie 등, supra, 2000). 그에 반해, 재생가능한 1,4-부탄디올 및 재생가능한 테레프탈산로부터 유래된 폴리부틸렌 테레프탈레이트 중합체는 90%이 넘는 생물기반 함량을 야기하였다(Colonna 등, supra, 2011).
따라서, 일부 구현예에서, 대기중 탄소 흡수 공급원을 반영하는 탄소-12, 탄소-13, 및 탄소-14 비율을 갖는 세포질 아세틸-CoA 또는 세포질 아세틸-CoA 중간체가 본원에 제공된다. 예를 들면, 일부 측면에서 세포질 아세틸-CoA 또는 세포질 아세틸-CoA 중간체는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100% 정도의 Fm 값을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 흡수 공급원은 CO2이다. 일부 구현예에서, 세포질 아세틸-CoA 또는 세포질 아세틸-CoA 중간체는 석유-기반 탄소 흡수 공급원을 반영하는 탄소-12, 탄소-13, 및 탄소-14 비율을 갖는다. 일부 구현예에서, 대기중 탄소 흡수 공급원과 석유-기반 흡수 공급원과의 조합에 의해 수득된 탄소-12, 탄소-13, 및 탄소-14 비율을 갖는 세포질 아세틸-CoA 또는 세포질 아세틸-CoA 중간체가 본원에 제공된다. 이러한 측면에서, 세포질 아세틸-CoA 또는 세포질 아세틸-CoA 중간체는 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 미만 1% 미만의 Fm 값을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 대기중 탄소 흡수 공급원과 석유-기반 흡수 공급원과의 조합에 의해 수득된 탄소-12, 탄소-13, 및 탄소-14 비율을 갖는 세포질 아세틸-CoA 또는 세포질 아세틸-CoA 중간체가 본원에 제공된다. 그러한 흡수 공급원들의 조합을 사용하는 것은 탄소-12, 탄소-13, 및 탄소-14 비가 달라질 수 있는 하나의 방식이고, 상기 각각의 비율은 흡수 공급원의 비율을 반영할 것이다.
진핵 유기체가 1,3-BDO 경로를 추가로 포함하는 다른 구현예에서, 대기중 탄소 흡수 공급원을 반영하는 탄소-12, 탄소-13, 및 탄소-14 비율을 갖는 1,3-BDO 또는 1,3-BDO 중간체가 본원에 제공된다. 예를 들면, 일부 측면에서 1,3-BDO 또는 1,3-BDO 중간체는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100% 정도의 Fm 값을 가질 것이다. 일부 구현예에서, 흡수 공급원은 CO2이다. 일부 구현예에서, 1,3-BDO 또는 1,3-BDO 중간체는 석유-기반 탄소 흡수 공급원을 반영하는 탄소-12, 탄소-13, 및 탄소-14 비율을 갖는다. 일부 구현예에서, 1,3-BDO 또는 1,3-BDO 중간체는 대기중 탄소 흡수 공급원과 석유-기반 흡수 공급원의 조합에 의해 수득된 탄소-12, 탄소-13, 및 탄소-14 비율을 갖는다. 이러한 측면에서, 1,3-BDO 또는 1,3-BDO 중간체는 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 미만 1% 미만의 Fm 값을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 대기중 탄소 흡수 공급원과 석유-기반 흡수 공급원의 조합에 의해 수득된 탄소-12, 탄소-13, 및 탄소-14 비율을 갖는 1,3-BDO 또는 1,3-BDO 중간체가 본원에 제공된다. 그러한 흡수 공급원들의 조합은 탄소-12, 탄소-13, 및 탄소-14 비율이 달라질 수 있는 하나의 방식이고, 상기 각각의 비율은 흡수 공급원의 비율을 반영할 것이다.
또한, 본 발명은 본원에서 개시된 바와 같은 생물학적으로 생산된 1,3-BDO 또는 1,3-BDO 중간체, 및 그것으로부터 유래된 생성물에 관한 것이고, 여기서 상기 1,3-BDO 또는 1,3-BDO 중간체는 환경 내에 존재하는 CO2와 거의 동일한 값의 탄소-12, 탄소-13, 및 탄소-14 동위원소 비율을 갖는다. 예를 들면, 일부 측면에서 본 발명은 환경 내에 존재하는 CO2와 거의 동일한 값의 탄소-12, 탄소-13, 및 탄소-14 동위원소 비율 또는 본원에 개시된 임의의 다른 비율을 갖는 생물유래된 1,3-BDO 또는 생물유래된 1,3-BDO 중간체를 제공한다. 본원에서 개시된 바와 같이, 생성물은 환경 내에 존재하는 CO2와 거의 동일한 값의 탄소-12, 탄소-13, 및 탄소-14 동위원소 비 또는 본원에 개시된 임의의 다른 비를 가질 수 있는 것으로 이해되며, 여기서 생성물은 본원에서 개시된 바와 같이 생물유래된 1,3-BDO 또는 생물유래된 1,3-BDO 중간체로부터 생성되고, 여기서 상기 생물유래된 생성물은 화학적으로 변형되어 최종 생성물을 생성한다. 원하는 생성물을 생성하기 위해 1,3-BDO, 또는 그의 중간체의 생물유래된 생성물을 화학적으로 변형시키는 방법은 본원에 기재된 바와 같이 당해분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 본 발명은 환경 내에 존재하는 CO2와 거의 동일한 값의 탄소-12, 탄소-13, 및 탄소-14 동위원소 비율을 갖는 유기 용매, 폴리우레탄 수지, 폴리에스테르 수지, 혈당강하제, 부타디엔 및/또는 부타디엔계 생성물을 추가로 제공하며, 여기서 상기 유기 용매, 폴리우레탄 수지, 폴리에스테르 수지, 혈당강하제, 부타디엔 및/또는 부타디엔계 생성물은 본원에서 개시된 바와 같이 생물유래된 1,3-BDO 또는 생물유래된 1,3-BDO 중간체로부터 또는 이의 조합으로부터 직접 생성된다.
1,3-BDO는 많은 상업적 및 산업적 적용에서 통상적으로 사용되는 화합물이며, 광범위한 생성물의 생산에 원료로서도 사용된다. 그러한 적용 및 생성물의 비제한적인 예는, 유기 용매, 폴리우레탄 수지, 폴리에스테르 수지, 혈당강하제, 부타디엔 및/또는 부타디엔계 생성물 유기 용매, 폴리우레탄 수지, 폴리에스테르 수지, 혈당강하제, 부타디엔 및/또는 부타디엔계 생성물을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 비-자연 발생 미생물에 의해 생산되거나 본원에 개시된 방법을 이용하여 생산된 하나 이상의 생물유래된 1,3-BDO 또는 생물유래된 1,3-BDO 중간체를 포함하는 광범위한 생성물의 생산에 원료로 사용되는 생물기반을 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물유래"는 생물학적 유기체로부터 유래되거나 생물학적 유기체에 의해 합성된 것을 의미하며 생물학적 유기체에 의해 생성될 수 있기 때문에 재생가능한 자원으로 간주될 수 있다. 그러한 생물학적 유기체, 특히 본원에 개시된 본 발명의 미생물은 농업, 식물, 박테리아, 또는 동물 공급원으로부터 수득된 당류 또는 탄수화물과 같은 공급원료 또는 바이오매스를 이용할 수 있다. 대안적으로, 생물학적 유기체는 대기 중 탄소를 이용할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물기반"은 전체 또는 일부가 본 발명의 생물유래된 화합물로 구성된 전술한 바와 같은 생성물을 의미한다. 생물기반 또는 생물유래된 생성물은 석유 또는 석유화학 공급원료로부터 유래되거나 이로부터 합성된 석유 유래된 생성물과 대치된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 생물유래된 1,3-BDO 또는 생물유래된 1,3-BDO 중간체를 포함하는 유기 용매, 폴리우레탄 수지, 폴리에스테르 수지, 저혈당성 제제, 부타디엔 및/또는 부타디엔계 생성물을 제공하고, 여기서 상기 생물유래된 1,3-BDO 또는 생물유래된 1,3-BDO 중간체는 유기 용매, 폴리우레탄 수지, 폴리에스테르 수지, 저혈당성 제제, 부타디엔 및/또는 부타디엔계 생성물의 생산에 사용되는 1,3-BDO 또는 1,3-BDO 중간체의 전부 또는 일부를 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 본 발명은 본원에서 개시된 바와 같이 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100% 생물유래된 1,3-BDO 또는 생물유래된 1,3-BDO 중간체를 포함하는 생물기반 유기 용매, 폴리우레탄 수지, 폴리에스테르 수지, 저혈당성 제제, 부타디엔 및/또는 부타디엔계 생성물을 제공한다. 또한, 일부 측면에서, 본 발명은, 생산에 사용되는 1,3-BDO 또는 1,3-BDO 중간체가 생물유래 및 석유 유래 1,3-BDO 또는 1,3-BDO 중간체의 조합인, 생물기반 유기 용매, 폴리우레탄 수지, 폴리에스테르 수지, 저혈당성 제제, 부타디엔 및/또는 부타디엔계 생성물을 제공한다. 예를 들면, 생물기반 유기 용매, 폴리우레탄 수지, 폴리에스테르 수지, 저혈당성 제제, 부타디엔 및/또는 부타디엔계 생성물은, 생성물의 적어도 일부가 본원에 개시된 미생물에 의해 생산된 생물유래된 생성물을 포함하는 한, 50% 생물유래된 1,3-BDO 및 50% 석유 유래된 1,3-BDO 또는 다른 원하는 비, 예컨대 60%/40%, 70%/30%, 80%/20%, 90%/10%, 95%/5%, 100%/0%, 40%/60%, 30%/70%, 20%/80%, 10%/90%의 생물유래된/석유 유래된 전구체들을 이용하여 생산될 수 있다. 본 발명의 생물유래된 1,3-BDO 또는 생물유래된 1,3-BDO 중간체를 이용하여 유기 용매, 폴리우레탄 수지, 폴리에스테르 수지, 저혈당성 제제, 부타디엔 및/또는 부타디엔계 생성물을 생산하는 방법은 당업계에 공지된 것으로 이해된다.
배양 조건은, 예를 들면, 액체 배양 절차 뿐만 아니라 발효 및 다른 대규모 배양 절차를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 1,3-BDO 등과 같은, 특히 유용한 수율의 세포질 아세틸-CoA 및/또는 생합성 생성물은 혐기성 배양 조건 또는 실질적으로 혐기성 배양 조건 하에서 수득될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 세포질 아세틸-CoA 및/또는 1,3-BDO의 생합성을 달성하기 위한 한 가지 예시적인 성장 조건은 혐기성 배양 또는 발효 조건을 포함한다. 어떤 구현예에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 진핵 유기체들은 혐기성 또는 실질적으로 혐기성 조건 하에서 살아가거나, 배양되거나 발효될 수 있다. 요약하면, 혐기성 조건은 산소가 없는 환경을 지칭한다. 실질적으로 혐기성 조건은, 예를 들면, 배지 중의 용존 산소 농도가 0 내지 10%의 포화도를 유지하는 것과 같은 배양, 회분 발효 또는 연속 발효를 포함한다. 실질적으로 혐기성 조건은 또한 밀봉된 챔버 내의 액체 배지에서 또는 고체 한천 상에서 성장중이거나 휴지중인 세포가 1% 미만의 산소의 분위기로 유지되는 것으로 포함한다. 산소의 퍼센트는, 예를 들면, 배양물에 N2/CO2 혼합물 또는 다른 적당한 비-산소 가스 또는 가스를 살포함으로써 유지될 수 있다.
본원에 기재된 배양 조건은 세포질 아세틸-CoA를 생산하기 위해 연속적으로 규모확장되거나 성장될 수 있다. 예시적인 성장 절차는, 예를 들면, 유가 발효 및 회분 분리; 유가 발효 및 연속 분리, 또는 연속 발효 및 연속 분리를 포함한다. 이들 공정 모두는 당업계에 공지되어 있다. 발효 절차는 세포질 아세틸-CoA의 생합성 생산에 특히 유용하다. 일반적으로, 그리고 비-연속 배양 절차와 마찬가지로, 세포질 아세틸-CoA의 연속 및/또는 거의-연속 생산은, 성장을 대수증식기로 유지시키고/거나 거의 유지시키는 충분한 영양소와 배지 중에서 세포질 아세틸-CoA를 사용하여 합성될 수 있는 화합물의 생산을 위한 생합성 경로를 추가로 포함하는, 본원에 제공된 비-자연 발생 세포질 아세틸-CoA를 생산하는 유기체를 배양하는 것을 포함할 것이다. 본원에 기재된 배양 조건은 1,3-BDO의 제조를 위해 연속적으로, 사용되고, 규모확장되고, 성장될 수 있다. 발효 절차는 상업적 양의 1,3-BDO의 생합성 생산에 특히 유용하다. 일반적으로, 그리고 비-연속 배양 절차와 마찬가지로, 1,3-BDO의 연속 및/또는 거의-연속 생산은, 성장을 대수증식기로 유지하고/거나 거의 유지하는 충분한 영양소 및 배지 중에서 비-자연 발생 1,3-BDO를 생산하는 유기체를 배양하는 것을 포함할 것이다.
그러한 조건 하에서의 연속 배양은, 예를 들면, 1일, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 일 이상 동안의 성장을 포함할 수 있다. 또한, 연속 배양은 1주, 2, 3, 4 또는 5주 이상 및 최대 몇 개월의 더 긴 기간을 포함할 수 있다. 대안적으로, 본원에 제공된 유기체는, 특정한 응용에 적합한 경우, 수시간 동안 배양될 수 있다. 연속 및/또는 거의-연속 배양 조건은 또한 이러한 예시적인 기간 사이에 있는 모든 시간 간격을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 제공된 진핵 유기체를 배양하는 시간은 원하는 목적을 위해 충분한 양의 생성물을 생산하기 위한 충분한 기간 동안인 것으로 더 이해된다.
발효 절차는 당업계에 공지되어 있다. 요약하면, 세포질 아세틸-CoA의 생합성 생산을 위한 발효는, 예를 들면, 유가 발효 및 회분 분리; 유가 발효 및 연속 분리, 또는 연속 발효 및 연속 분리에서 이용될 수 있다. 회분 및 연속 발효 절차의 예는 당업계에 공지되어 있다.
실질적인 양의 세포질 아세틸-CoA의 연속 생산을 위해 본원에 제공된 세포질 아세틸-CoA 생산체를 이용하는 상기 발효 절차 외에도, 세포질 아세틸-CoA 생산체는 또한, 예를 들면, 생성물을 다른 화합물로 전환시키는 화학적 합성 절차들을 동시에 받거나, 생성물은 발효 배양물로부터 분리되어 원하는 경우 순차적으로 생성물을 다른 화합물로 전환시키는 화학적 또는 효소적 전환을 받을 수 있다. 마찬가지로, 1,3-BDO 생산체는 또한, 예를 들면, 생성물을 다른 화합물로 전환시키는 화학적 합성 절차들을 동시에 받거나, 생성물은 발효 배양물로부터 분리되어 원하는 경우 순차적으로 생성물을 다른 화합물로 전환시키는 화학적 전환을 받을 수 수 있다. 예를 들면, 1,3-BDO는 탈수되어 1,3-BDO를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체는, 전구체로서 세포질 아세틸-CoA를 사용하는, 화합물의 생산을 위한 생합성 과정을 추가로 포함하고, 상기 생합성 과정은 화합물을 생산하기 위해 충분한 양으로 발현된 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 전구체로서 세포질 아세틸-CoA를 사용하여 생산될 수 있는 흥미로운 화합물은 1,3-BDO 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 합성가스는 탄소 공급원료로서 사용될 수 있다. 합성가스 발효를 위한 중요한 공정 고려대상은 높은 바이오매스 농도 및 우수한 가스-액체 물질 전달이다(Bredwell 등, Biotechnol Prog., 15:834-844 (1999)). 물에서의 CO의 용해도는 산소의 용해도보다 다소 낮다. 연속적으로 가스-살포된 발효는 질량 분광분석법에 의한 끊임없는 배기가스 분석 및 GC 및 HPLC에 의한 주기적 액체 표본추출 및 분석을 갖는 제어된 발효조에서 수행될 수 있다. 액체상은 회분 방식으로 기능할 수 있다. 잔류 메탄올과 함께, 알코올, 유기산, 및 잔류 글루코오스와 같은 발효 생성물은 예를 들면, HPLC 칼럼의 아민x® 시리즈(예를 들면, HPX-87 시리즈)(BioRad, Hercules CA)를 이용하여, 글루코오스 및 알코올의 경우 굴절률 검출기를 이용하여, 그리고 유기산의 경우 UV 검출기를 이용하여, HPLC(Shimadzu, Columbia MD)에 의해 정량화된다. 성장률은 분광측정기(600 nm)를 이용하여 광학 밀도를 측정함으로써 결정된다. 이들 시스템에서의 모든 파이프는 혐기성 조건을 유지하기 위해 유리 또는 금속이다. 가스 살포는 기포 크기를 감소시키고 물질 전달을 개선하기 위해 유리 프릿으로 수행된다. 약 0.1 내지 1 vvm (분당 기체 부피)의 범위의 다양한 살포율이 시험된다. 가스 흡수율의 정확한 측정값을 얻기 위해, 주기적 시험이 수행되고, 여기서 상기 가스 유동이 일시적으로 정지되고, 기상 조성물이 시간의 함수로서 관찰된다.
전체 표적 생산성을 달성하기 위해, 세포 체류 또는 재순환 방법이 이용된다. 미생물 농도를 증가시키는 한 가지 방법은 측류(sidestream)로부터 접촉 유동 막을 통해 세포를 재순환하는 것이다. 무렐라에 의해 아세테이트 생산용으로 앞서 기술된, 반복된 회분 배양이 또한 사용될 수 있다(Sakai 등, J Biosci. Bioeng, 99:252-258 (2005)). 다양한 다른 방법들이 또한 사용될 수 있다(Bredwell 등, Biotechnol Prog., 15:834-844 (1999); Datar 등, Biotechnol Bioeng, 86:587-594 (2004)). 부가적 최적화는 물질 전달을 개선하기 위해 예컨대 1.5 압력에서의 초과압력에서 시험될 수 있다(Najafpour 등, Enzyme and Microbial Technology, 38[1-2], 223-228 (2006)).
공급원료로서 순수한 H2/CO를 이용하여 만족스러운 성능이 달성되면, 상업적 합성가스에 존재할 가능성이 있는 억제제를 함유하는 합성 가스 혼합물이 생성된다. 예를 들면, 전형적인 불순물 프로파일은 4.5% CH4, 0.1% C2H2, 0.35% C2H6, 1.4% C2H4, 및 150 ppm 산화질소이다(Datar 등, Biotechnol Bioeng, 86:587-594 (2004)). 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠, p-자일렌, o-자일렌, 및 나프탈렌과 같은 화합물에 의해 대표되는 타르가 생산에 미치는 임의의 효과를 시험하기 위해 ppm 수준으로 첨가된다. 예를 들면, 40 ppm NO는 C. 카복시디보란스를 억제하는 것으로 나타났다(Ahmed 등, Biotechnol Bioeng, 97:1080-1086 (2007)). 배양은 쉐이크-플라스크 배양에서 시험된 후 발효조로 이동된다. 또한, 잠재적인 억제 화합물이 세포 성장에 미치는 효과를 정량화하기 위해 상이한 수준의 이들 잠재적인 억제 화합물이 시험된다. 이러한 지식은 합성가스 순도에 대한 규격을 개발하는데 사용되고, 이는 규모확장 연구 및 생산에 이용된다. 만약 임의의 특정한 성분이 줄거나 규모 확장에 사용된 합성가스로부터 제거되기 어렵다고 확인되면, 하나 이상의 불순물에 견디도록 세포를 적응시키기 위해 적응 진화 과정이 이용된다.
단백질 공학 분야의 진전은 본원에 개시된 임의의 효소가 이들에게 자연스럽지 않다고 알려진 기질에 효과적으로 작동하도록 이들을 변경하는 것을 실현가능하게 한다. 관심있는 다양한 클래스로부터의 광범위한-특이성 효소 및 비-자연 발생 기질에 작용하도록 상기 효소를 진화시키는 데 사용된 방법들의 몇 가지 예가 하기에 제시되어 있다.
보다 우수한 생산체를 생성하기 위해, 대사 모델링이 성장 조건을 최적화하는데 이용될 수 있다. 모델링은 또한 부가적으로 경로의 이용을 최적화하는 유전자 넉아웃을 디자인하는데 사용될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 공보 US 제2002/0012939호, US 제2003/0224363호, US 제2004/0029149호, US 제2004/0072723호, US 제2003/0059792호, US 제2002/0168654호 및 US 제2004/0009466호, 및 미국 특허 제7,127,379호 참고). 모델링 분석은 대사를 보다 효율적인 세포질 아세틸-CoA의 생산 쪽으로 이동시키는 세포 성장에 대해 미치는 효과들의 신뢰할만한 예측을 가능하게 한다.
원하는 생성물의 생합성을 선호하는 대사 변경을 확인하고 설계하기 위한 컴퓨터를 이용한 한 가지 방법은 OptKnock 컴퓨터를 이용한 프레임워크이다(Burgard 등, Biotechnol . Bioeng. 84:647-657 (2003)). OptKnock는 대사 모델링 및 시뮬레이션 프로그램으로서, 표적 생성물을 과생산하는 유전적으로 안정한 진핵 유기체를 야기하는 유전자 결실 또는 파괴 방법을 제시한다. 구체적으로, 상기 프레임워크는 원하는 생화학 물질이 세포 성장의 의무적인 부산물이 되게 하는 유전적 조작을 제시하기 위해 진핵 유기체의 완전한 대사 및/또는 생화학적 네트워크를 조사한다. 전략적으로 중요한 곳에 위치한 유전자 결실 또는 다른 기능적 유전자 파손을 통해 생화학적 생산과 세포 성장을 결합함으로써, 생물반응기에서 오랜 시간 후 상기 조작된 균주 상에 부과된 성장 선택 압력은 강제적인 성장-결합된 생화학물질 생산의 결과로서 성능 개선을 야기한다. 마지막으로, 유전자 결실이 구축되면, OptKnock에 의해 선택된 유전자가 게놈으로부터 완전히 제거될 것이기 때문에 상기 설계된 균주들이 이들의 야생형 상태로 되돌아갈 가능성은 무시할만 하다. 따라서, 이 계산적 방법론은 원하는 생성물의 생합성을 야기하는 대안적인 경로를 확인하는데 사용되거나, 원하는 생성물의 생합성의 추가적인 최적화를 위해 비-자연 발생 진핵 유기체와 관련되어 사용될 수 있다.
요약하면, OptKnock는 세포 대사를 모델화하기 위한 계산적 방법과 시스템을 지칭하기 위해 본원에 사용된 용어이다. OptKnock 프로그램은 특정한 제약을 유동 밸런스 분석(FBA) 모델 내로 통합하는 모델 및 방법의 프레임워크에 관한 것이다. 이들 제약은, 예를 들면, 정성적 운동 정보, 정성적 규제 정보, 및/또는 DNA 마이크로어레이 실험 데이터를 포함한다. OptKnock는 또한 유동 밸런스 모델을 통해 유래된 유동 경계를 확고히 한 후, 유전자 부가 또는 결실의 존재 하에 대사 네트워크의 성능 제한을 조사함으로써 다양한 대사 문제들에 대한 해결책을 산출한다. OptKnock 계산적 프레임워크는 대사 네트워크의 성능 제한의 효과적인 문의를 허용하는 모델 제형의 구성을 허용하고, 초래되는 혼합-정수 선형 계획 문제를 해결하는 방법을 제공하는 모델 공식화의 구축을 허용한다. OptKnock으로서 본원에 지칭되는 상기 대사 모델링 및 시뮬레이션 방법들은, 예를 들면, 2002년 1월 10일에 출원된 미국 공보 제2002/0168654호, 2002년 1월 10일에 출원된 국제 특허 제PCT/US02/00660호, 및 2007년 8월 10일에 출원된 미국 공보 제2009/0047719호에 기술되어 있다.
생성물의 생합성 생산을 선호하는 대사 변경을 확인하고 설계하기 위한 또 하나의 계산적 방법은 SimPheny®로 명명된 대사 모델링 및 시뮬레이션 시스템이다. 이 계산적 방법 및 시스템은, 예를 들면, 2002년 6월 14일에 출원된 미국 공보 제2003/0233218호, 및 2003년 6월 13일에 출원된 국제 특허 출원 제PCT/US03/18838호에 기술되어 있다. SimPheny®은 가상환경에서 네트워크 모델을 생산하는데 사용되고, 시스템 내에 화학적 반응의 임의의 그리고 모든 가능한 기능을 함유하는 해결 공간을 한정하는 생물학적 시스템의 화학적 반응을 통해 물질, 에너지 또는 전하의 흐름을 시뮬레이션함으로써 생물학적 시스템에 대한 허용된 활성 범위를 결정하는데 사용될 수 있는 계산적 시스템이다. 이 접근법은, 포함된 반응의 공지된 화학양론과 같은 제약 뿐만 아니라 반응을 통한 최대 유동과 관련된 반응 열역학적 및 용량 제약에 의해 상기 해결 공간이 한정되기 때문에, 제약-기반 모델링으로서 지칭된다. 이들 제약에 의해 한정된 공간은 생물학적 시스템 또는 그의 생화학적 요소의 표현형 능력 및 거동을 결정하기 위해 조사될 수 있다.
이들 계산적 접근법은, 생물학적 시스템이 유연하고 많은 다른 방식으로 동일한 결과에 도달할 수 있기 때문에 생물학적 현실과 일치한다. 생물학적 시스템은 모든 살아있는 시스템이 직면해야하는 근본적인 제약에 의해 제한되어 온 진화론적 기전을 통해 설계된다. 따라서, 제약-기반 모델링 전략은 이들 일반적인 현실을 포괄한다. 게다가, 제약의 확고화를 통해 네트워크 모델에 추가적인 제약을 계속적으로 부과하는 능력은 해결 공간의 크기 감소를 야기하고, 이로써 생리적 성능 또는 표현형이 예측될 수 있는 정확성을 향상시킨다.
본원에 제공된 교시 및 지침을 고려할 때, 당해분야의 숙련가는 숙주 유기체에서 원하는 화합물의 생합성을 설계하고 시행하는 대사 모델링 및 시뮬레이션을 위해 다양한 계산적 프레임워크를 적용할 수 있을 것이다. 그러한 대사 모델링 및 시뮬레이션 방법은, 예를 들면, SimPheny® 및 OptKnock으로서 상기에 예시된 계산적 시스템을 포함한다. 예를 들어, 몇 가지 방법은 모델링 및 시뮬레이션을 위해 OptKnock 계산적 프레임워크를 참조하여 본원에 기재되어 있다. 당해분야의 숙련가는 OptKnock를 이용하여 대사 변경을 확인하고, 설계하고, 실행하는 것을, 당업계에 잘 알려진 임의의 그러한 다른 대사 모델링 및 시뮬레이션 계산적 프레임워크 및 방법에 적용하는 방법을 알 것이다.
상기 기재된 방법은 방해하는 한 세트의 대사 반응을 제공할 것이다. 상기 세트 또는 대사 변형 내의 각 반응의 제거는 유기체의 성장기 동안 의무적인 생성물로서 원하는 생성물을 야기할 수 있다. 상기 반응은 공지되어 있기 때문에, 2단 OptKnock 문제에 대한 해결책이 또한 반응의 세트 내에 각 반응을 촉진하는 하나 이상의 효소를 코딩하는 연관된 유전자 또는 유전자를 제공할 것이다. 반응의 세트 및 각 반응에 관여하는 효소를 코딩하는 이들의 상응하는 유전자의 동정은 일반적으로 자동화 공정이며, 이는 상기 반응들과 효소와 코딩 유전자 사이에 관련성이 있는 반응 데이터베이스와의 상관관계를 통해 달성된다.
일단 확인되면, 원하는 생성물의 생산을 달성하기 위해 파괴될 반응들의 세트가, 세트 내 각 대사 반응을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 기능적 파괴에 의해 표적 세포 또는 유기체에서 시행된다. 반응 세트의 기능적 파괴를 달성하는 한 가지 특히 유용한 수단은 각 코딩 유전자의 결실에 의한다. 그러나, 일부 예에서, 예를 들면, 돌연변이, 프로모터 또는 조절 요소를 위한 시스 결합 부위와 같은 조절 영역의 결실, 또는 임의의 수많은 위치에서의 코딩 서열의 절단에 의한 것을 포함하는 다른 유전적 이상에 의해 반응을 방해하는 것이 유익할 수 있다. 전체보다 적은 유전자 결실을 야기하는 이들 후자의 이상은, 예를 들면, 생성물의 커플링을 신속한 평가하는 것이 요구되거나 유전적 회귀가 일어날 것 같지 않은 경우, 유용할 수 있다.
원하는 생성물의 성장-결합된 생합성을 포함하는 생합성을 야기할 수 있는 방해하는 반응 또는 대사 변형의 추가 세트를 야기하는 전술한 2단 OptKnock 문제에 대한 생산적인 해결책을 확인하기 위해, 정수 커트(integer cuts)라 불리는 최적화 방법이 시행될 수 있다. 이 방법은 각 반복에서 정수 커트라 불리는 추가적인 제약을 통합하여 상기 예시된 OptKnock 문제를 반복적으로 해결함으로써 진행된다. 정수 커트 제약은, 해결 과정이 의무적으로 생성물 생합성을 성장과 결합시키는 임의의 이전 반복에서 확인된 정확하게 동일한 반응 세트를 선택하는 것을 효과적으로 방지한다. 예를 들면, 만약 이전에 확인된 성장-결합된 대사 변형이 파괴를 위해 반응 1, 2, 및 3을 명시하면, 이후 하기 제약이 이후 해결책에서 동일한 반응이 동시에 고려되는 것을 방지한다. 정수 커트 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 문헌[Burgard 등, Biotechnol . Prog. 17:791-797 (2001)]에 기재되어 확인될 수 있다. 대사 모델링 및 시뮬레이션을 위해 OptKnock 계산적 뼈대와 조합되어 사용되는 것과 관련하여 본원에 기술된 모든 방법과 마찬가지로, 반복적인 계산적 분석에서 중복을 줄이는 정수 커트 방법은 또한, 예를 들면, SimPheny®을 포함하는 당업계에 잘 알려진 다른 계산적 프레임워크를 이용하여 적용될 수 있다.
본원에 예시된 방법은 표적 생화학적 생성물의 생산을 확인된 유전적 변이를 갖도록 조작된 세포 또는 유기체의 성장과 의무적으로 결합시키는 것을 포함하는, 원하는 생성물을 생합성으로 생산하는 세포 또는 유기체의 구축을 허용한다. 따라서, 본원에 기재된 계산적 방법들은 OptKnock 또는 SimPheny®로부터 선택된 가상환경에서의 방법에 의해 확인된 대사 변형의 확인 및 실행을 허용한다. 대사 변형 세트는, 예를 들면, 하나 이상의 생합성 과정 효소의 부가 및/또는, 예를 들면 유전자 결실의 파괴를 포함하는 하나 이상의 대사 반응의 기능적 파괴를 포함할 수 있다.
상기에서 논의된 바와 같이, OptKnock 방법론은 돌연변이 미생물 네트워크가 오랜 기산의 성장 선택에 놓여졌을 때 이들의 계산적으로 예측되는 최대-성장 표현형 쪽으로 진화할 수 있다는 것을 전제로 개발되었다. 바꿔 말하면, 상기 접근법은 선택적 압력 하에서 스스로 최적화하는 유기체의 능력을 활용한다. OptKnock 프레임워크는 네트워크 화학양론에 기초하여 생화학적 생산과 세포 성장 간의 결합을 강요하는 유전자 결실 조합의 철저한 조사를 가능하게 한다. 최적 유전자/반응 넉아웃의 확인은, 생성되는 네트워크를 위한 최적의 성장 해결책이 관심있는 생화학물질을 과잉생산하도록, 활성 반응들의 세트를 선택하는 2단 최적화 문제의 해결책을 필요로 한다(Burgard 등, Biotechnol . Bioeng. 84:647-657 (2003)).
대장균 대사의 가상환경에서의 화학양론 모델이 종래 예시되고 예를 들면, 미국 특허 공보 US 제2002/0012939호, US 제2003/0224363호, US 제2004/0029149호, US 제2004/0072723호, US 제2003/0059792호, US 제2002/0168654호 및 US 제2004/0009466호, 및 미국 특허 제7,127,379호에 기재된 바와 같이 대사 경로를 위한 필수적인 유전자들을 확인하는데 이용될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, OptKnock 수학 프레임워크는 원하는 생성물의 성장-결합된 생산을 이끄는 유전자 결실을 정확히 짚어내는데 적용될 수 있다. 또한, 2단 OptKnock 문제의 해결책은 단지 한 가지 세트의 결실을 제공한다. 모든 의미있는 해결책, 즉 성장-결합된 생산 형성을 야기하는 넛아웃의 모든 세트를 조사하기 위해, 정수 커트라 불리는 최적화 기술이 시행될 수 있다. 이것은 상기에서 논의된 바와 같이 각 반복에서 정수 커트로서 지칭되는 부가적인 제약을 통합하여 OptKnock 문제를 반복적으로 해결하는 것을 수반한다.
본원에서 개시된 바와 같이, 아세틸-CoA 경로 및/또는 1,3-BDO 경로의 원화는 활성을 코딩하는 핵산이 숙주 유기체 내로 도입될 수 있다. 일부 경우, 세포질 아세틸-CoA 또는 1,3-BDO의 생산을 각각 증가시키기 위해, 아세틸-CoA 경로 효소 또는 단백질 및/또는 1,3-BDO 경로 효소 또는 단백질의 활성을 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 단백질 또는 효소의 활성을 증가시키는 공지된 돌연변이가 코딩 핵산 분자 내로 도입될 수 있다. 또한, 최적화 방법이 효소 또는 단백질의 활성을 증가시키고/거나 억제 활성을 감소시키는데, 예를 들면, 음성 조절물질을 활성을 감소시키는데 적용될 수 있다.
그러한 한 가지 최적화 방법은 유도 진화이다. 유도 진화 방법은 비천연 기질의 어레이 상에서 기능하는 효소의 변형을 가능하게 하였다. P. 에어루기노사 내 리파제의 기질 특이성은 활성 부위 근처의 아미노산 잔기들의 무작위추출에 의해 확대되었다. 이것은 이 효소에 의해 알파-치환된 카복실산 에스테르의 허용을 가능하게 하였다(Reetz 등, Angew. Chem. Int. Ed Engl. 44:4192-4196 (2005)). 또 하나의 성공적인 시도에서, DNA 셔플링이 야생형 효소에 의해 거의 받아들여지지 않았던 β-분지된 기질을 받아들인 대장균 아미노전이효소를 만드는데 이용되었다((Yano 등, Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 95:5511-5515 (1998)). 구체적으로, 4회의 셔플링 말기에, 발린 및 2-옥소발린에 대한 아스파라진산 아미노전이효소의 활성은 최대 5자리수까지 증가한 반면, 천연 기질인 아스파르테이트에 대한 활성은 최대 30배까지 감소하였다. 최근에, 비-자연 발생 및 비-생물학적 기질인 4-하이드록시-4-(6-메톡시-2-나프틸)-2-부타논 내의 탄소-탄소 결합 절단을 촉진하는데 사용될 수 있는 역-알돌라아제를 설계하기 위해 알고리즘이 사용되었다. 이들 알고리즘은 새로운 효소를 설계하기 위해 4개의 상이한 촉매 모티프의 조합을 사용하였고, 실험적 규명을 위한 상기 선택된 설계물 중 20개는 촉매되지 않은 반응 대비 4배 개선된 속도를 가지고 있었다(Jiang 등, Science 319:1387-1391 (2008)). 따라서, 이들 조작된 접근법은 효소가 작용할 수 있는 기질의 어레이를 확장시킬 수 있을 뿐만 아니라, 매우 효율적인 효소들의 설계 및 구축을 가능하게 한다. 예를 들면, DNA 셔플링 방법(일시적인 주형 또는 RACHITT 상에서의 무작위 키메라생성)은 복합 기질에 대한 탈황화의 개선된 속도 뿐만 아니라 비-자연 발생 기질의 20배 더 빠른 전환을 갖는 조작된 모노옥시게나제를 야기한다고 보고되었다(Coco 등 Nat . Biotechnol . 19:354-359 (2001)). 마찬가지로, 둔화된 돌연변이 트리오스포스페이트 이소머라제 효소의 비활성은 1.3배로부터 19배까지 개선되었다(Hermes 등, Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 87:696-700 (1990)). 이러한 비활성 증대는 단백질의 전장에 걸친 무작위 돌연변이유발을 이용하여 달성되었고, 상기 개선은 6개의 아미노산 잔기에서의 돌연변이에서 유래될 수 있다.
원하는 기질에 대한 효소의 기질 특이성을 변화시키는 단백질 공학 접근법의 효율성이 또한 입증되었다. 테르무스 서모필러스 유래의 이소프로필말레이트 탈수소효소는 상기 효소가 기질로서 말레이트 및 D-락테이트에 작용할 수 있도록 활성 부위 근처의 잔기들을 바꿈으로써 변형되었다(Fujita 등, Biosci . Biotechnol Biochem. 65:2695-2700 (2001)). 이 연구에서 뿐만 아니라 다른 연구에서, 하나 또는 몇 가지 잔기들이 기질 특이성을 바꾸기 위해 변형될 수 있다고 지적되었다. 좋은 예는 디하이드로캡프페롤을 우선적으로 환원시킬 수 있는 추정상의 기질-결합 영역 내에서 단일 아미노산이 바뀐 디하이드로플라보놀 4-환원효소이다(Johnson 등, Plant J. 25:325-333 (2001)). 대장균 유래의 매우 특이적인 이소시트레이트 탈수소효소의 기질 특이성은 활성 부위 내의 하나의 잔기를 바꿈으로써 이소시트레이트로부터 이소프로필말레이트로 바뀌었다(Doyle 등, Biochemistry 40:4234-4241 (2001)). 유사한 정맥에서, NAD+-의존적 1,5-하이드록시프로스타글란딘 탈수소효소의 보조인자 특이성은 N-말단 근처의 몇 가지 잔기를 바꿈으로서 NADP+로 변경되었다(Cho 등, Arch . Biochem . Biophys . 419:139-146 (2003)). 변형을 위한 핵심 잔기들을 확인하기 위해 서열 분석 및 분자 모델링 분석이 사용되었고, 이는 위치지향적 돌연변이유발에 의해 더 연구되었다.
푸코시다제는 DNA 셔플링 및 스크리닝에 의해 대장균 내 갈락토시다아제로부터 진화되었다(Zhang 등, Proc Natl Acad Sci U S. A. 94:4504-4509 (1997)). 마찬가지로, 대장균 유래의 아스파라진산 아미노전이효소는 상동성 모델링 및 위치지향적 돌연변이유발을 이용하여 티로신 아미노전이효소로 전환되었다(Onuffer 등, Protein Sci. 4:1750-1757 (1995)). 전하는 바에 따르면 P. 푸티다 유래의 벤조일포르메이트 탈탄산효소의 활성 부위 내 2가지 잔기의 위치지향적 돌연변이유발은 천연 및 비-자연 발생 기질에 대한 친화도(Km)를 변경하였다(Siegert 등, Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)). 사카로마이세스 세레비지애 유래의 사이토크롬 c 페록시다아제(CCP)는 고전적인 퍼옥시다아제 기질 구아이아콜에 대해 증가된 활성을 갖는 돌연변이를 생성하기 위해 유도 분자 진화되었고, 따라서 단백질 사이토크롬 c로부터 유기 소분자로 CCP의 기질 특이성을 바꾸었다. DNA 셔플링 및 스크리닝 3회 이후, 구아이아콜에 대해 300-배 증가된 활성을 가지며 천연 기질에 비해 이 기질에 대해 최대 1000-배 증가된 특이성을 갖는 돌연변이가 분리되었다(Iffland 등, Biochemistry 39:10790-10798 (2000)).
일부 경우, 두 가지 모 효소보다 상이한 기질 선호도를 갖는 효소들이 얻어졌다. 예를 들면, 폴리염소화된 바이페닐의 바이페닐-디옥시게나제-매개된 분해가 두 가지 박테리아인 슈도모나스 슈도알칼리겐스 및 버크홀데리아 세파시아로 유래의 유전자를 셔플링함으로써 개선되었다((Kumamaru 등, Nat . Biotechnol. 16, 663-666 (1998)). 생성된 키메라 바이페닐 옥시게나제들은 두 가지 모 효소보다 상이한 기질 선호도를 나타내었고, 효소에 대해 원래 좋지 않았던 기질인 관련된 바이페닐 화합물 및 단일 방향족 고리 탄화수소, 예컨대 톨루엔 및 벤젠에 대해 향상된 분해 활성을 나타내었다.
효소 특이성을 바꾸는 것이 가능할 뿐만 아니라 효소가 천연적으로 낮은 활성을 갖는 기질에 대한 활성을 향상시키는 것이 가능하다. 한 가지 연구는 광범위한 기질 특이성(라이신, 아르기닌, 알라닌, 세린, 메티오닌, 시스테인, 류신 및 히스티딘 등에 대해)을 갖지만 트립토판에 대한 낮은 활성을 갖는 P. 푸티다 유래의 아미노산 라세마제가 무작위 돌연변이유발에 의해 유의하게 개선될 수 있음을 입증하였다(Kino 등, Appl . Microbiol . Biotechnol. 73:1299-1305 (2007)). 마찬가지로, 대안적인 기질 아세틸-CoA를 선호하도록 소 BCKAD의 활성 부위가 조작되었다(Meng 등, Biochemistry 33:12879-12885 (1994)). 이들 접근법의 흥미로운 측면은, 유효한 활성을 갖는 이들 돌연변이된 효소를 생성하기 위해 무작위 방법들이 적용되어왔을 때에도, 활성 개선을 제공하는 정확한 돌연변이 또는 구조 변화가 확인될 수 있다는 점이다. 예를 들면, 상기 언급된 연구에서, 트립토판에 대해 개선된 활성을 촉진한 돌연변이는 두 가지 상이한 위치에서 유래될 수 있다.
유도 진화는 또한 발현하기 힘든 단백질을 발현하는데 사용되어 왔다. 예를 들면, 호스래디쉬 퍼옥시다아제를 무작위 돌연변이유발 및 유전자 재조합하여 야생형보다 14-배가 넘는 활성을 갖는 돌연변이가 추출될 수 있었다(Lin 등, Biotechnol. Prog. 15:467-471 (1999)).
유도 진화의 마지막 예는 효소가 원하는 기능의 범위를 달성하게 될 수 있는 광범위한 변형을 보여준다. 바실러스 스테아로테모필루스 유래의 효소인 락테이트 탈수소효소는 위치지향적 돌연변이유발되었고, 상이한 하이드록시산에 대한 특이성을 결정하도록 드러난 부위에서 세 가지 아미노산 치환이 이뤄졌다((Clarke 등, Biochem. Biophys . Res . Commun . 148:15-23 (1987)). 이들 돌연변이 이후, 피루베이트 대비 옥살로아세테이트에 대한 특이성은 옥살로아세테이트 대비 피루베이트에 대해 1000의 촉매 특이성을 가지고 있었던 야생형 효소와 달리 500까지 증가하였다. 이 효소는 분지쇄 치환된 피루베이트에 대한 활성을 갖도록 위치지향적 돌연변이유발을 이용하여 더 조작되었다((Wilks 등, Biochemistry 29:8587-8591 (1990)). 구체적으로, 상기 효소는 알파-케토이소카프로에이트에 대해 55배 Kcat이 개선되었다. 락테이트로부터 말레이트로 그 기질 특이성을 변화시키기 위해 동일한 효소에서 세 가지 구조 변형이 이뤄졌다. 상기 효소는 고활성이었고 말레이트에 대해 특이적이었다(Wilks 등, Science 242:1541-1544 (1988)). B. 스테아로테모필루스 유래의 동일한 효소는 뒤이어 암모늄 기를 함유하는 것과 같이 양으로 하전된 측쇄를 갖는 알파-케토 산에 대해 높은 촉매 활성을 갖도록 조작되었다((Hogan 등, Biochemistry 34:4225-4230 (1995)). 상기 효소의 위치 102에 도입된 산성 아미노산을 갖는 돌연변이들은 그러한 측쇄 암모늄 그룹의 결합을 선호하였다. 얻어진 결과들은 상기 돌연변이가 오메가-아미노-알파-케토산 기질에 대해 kcat/Km 값이 최대 25배 개선되었음을 입증하였다. 이 효소는 또한 락테이트 탈수소효소 대신에 페닐락테이트 탈수소효소로서 기능하도록 구조적으로 변형되었다((Wilks 등, Biochemistry 31:7802-7806 (1992)). 유전자의 영역이 절단되는 것을 허용한 효소에 대한 유전자 내로 제한 부위가 도입되었다. 이 영역은 벌크 용매로부터 활성 부위 액포를 정상적으로 밀봉하며 기질 특이성의 주요 결정요인인 폴리펩타이드(잔기 98-110)의 이동성 표면 루프를 코딩하였다. 다양한 길이 및 서열 루프가 상기 절단된 유전자 내로 삽입되었고, 변경된 기질 특이성을 갖는 하이드록시산 탈수소효소를 합성하는데 사용되었다. 한 가지 더 긴 루프 구축을 이용하여, 피루베이트를 갖는 활성은 백만배 감소하였지만 페닐피루베이트를 갖는 활성은 크게 변경되지 않았다. 390,000배의 특이성(kcat/Km) 전환이 달성되었다. 피루베이트 대비 페닐피루베이트에 대한 이 효소의 1700:1 선택성은 페닐락테이트 탈수소효소에서 요구되는 것이다.
상기에서 표시된 바와 같이, 유도 진화는 효소의 특성을 개선하고/거나 변화하기 위해 특이 유전자에 표적화된 돌연변이를 도입하는 것을 수반하는 강력한 접근법이다. 개선된 및/또는 변경된 효소들은 많은 효소 변종들의 자동화된 스크리닝을 허용하는 민감한 고효율 스크리닝 분석(예를 들면, >104)의 발달 및 실행을 통해 확인될 수 있다. 반복적인 횟수의 돌연변이유발 및 스크리닝은 통상적으로 효소에게 최적화된 특성을 부여하도록 수행된다. 돌연변이유발을 위한 유전자의 영역을 확인하는데 도움을 줄 수 있는 계산적 알고리즘이 또한 개발되었고, 이는 생성되고 스크리닝될 필요가 있는 효소 변종들의 수를 유의하게 감소시킬 수 있다.
다양한 변종 라이브러리를 만드는데 효과적인 수많은 유도 진화 기술이 개발되었고(검토를 위해, 문헌[Hibbert 등, Biomol . Eng 22:11-19 (2005); Huisman and Lalonde, Biocatalysis in the Pharmaceutical and Biotechnology Industries pgs. 717-742 (2007), Patel (ed.), CRC Press; Otten and Quax. Biomol . Eng 22:1-9 (2005).; and Sen 등, Appl Biochem . Biotechnol 143:212-223 (2007)] 참조), 이들 방법들은 많은 효소 클래스에 걸쳐 광범위한 특성을 개선하는데 성공적으로 적용되어 왔다.
유도 진화 기술에 의해 개선되고/거나 변경되어 온 효소 특성은, 예를 들면: 비-자연 발생 기질의 전환을 위한 선택성/특이성; 강력한 고온 처리를 위한 온도 안정성; 더 낮거나 더 높은 pH 조건 하에서의 생체처리를 위한 pH 안정성; 높은 생성물 역가가 달성될 수 있기 위한 기질 또는 생성물 내성; 기질 결합이 비-자연 발생 기질을 포함하도록 확장시키는 것을 포함하는 결합(Km); 생성물, 기질, 또는 핵심 중간체에 의한 억제를 제거하기 위한 억제(Ki); 원하는 유동을 달성하기 위해 효소 반응 속도를 증가시키는 활성(kcat); 단백질 수율 및 전체 경로 유동을 증가시키는 발현 수준; 호기성 조건 하에서 공기 민감성 효소의 작동을 위한, 산소 안정성; 및 산소의 부재하에 호기성 효소의 작동을 위한, 혐기성 활성을 포함한다.
특정 효소의 원하는 특성을 표적으로 하는 유전자의 돌연변이유발 및 다양성을 위해 수많은 예시적인 방법이 개발되어 왔다. 그러한 방법은 당해분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 이들 중 임의의 것은 아세틸-CoA 경로 효소 또는 단백질의 활성을 변화시키고/거나 최적화하는데 사용될 수 있다. 그러한 방법은, 비제한적으로 PCR 반응에서 DNA 폴리머라제의 정확도를 감소시킴으로써 무작위 점 돌연변이를 도입하는 EpPCR(Pritchard 등, J Theor . Biol . 234:497-509 (2005); 전체의 원형 플라스미드가 주형으로 사용되고 마지막 2 뉴클레오타이드 상에서 엑소뉴클레아제 내성 티오포스페이트 연결을 갖는 랜덤 6-머가 플라스미드를 증폭시키는데 사용된 다음 플라스미드가 종열 중복으로 재원형화되는 세포 내로 형질전환시키는 것을 제외하고, epPCR과 유사한 오류유발 롤링 서클 증폭(Error-prone Rolling Circle Amplification(epRCA)(Fujii 등, Nucleic Acids Res . 32:e145 (2004); and Fujii 등, Nat . Protoc . 1:2493-2497 (2006)); 전형적으로 둘 이상의 변종 유전자를 뉴클레아제, 예컨대 Dnase I 또는 EndoV로 절단하여 DNA 폴리머라제의 존재 하에 어닐링 및 확대 사이클에 의해 재조립되는 무작위 단편의 풀을 생성하여 키메라 유전자의 라이브러리를 창출하는 것을 포함하는, DNA 또는 패밀리 셔플링(Stemmer, Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751 (1994); 및 Stemmer, Nature 370:389-391 (1994)); 변성 및 매우 짧은 지속시간의 어닐링/확대(5초 정도로 짧음)를 갖는 2단계 PCR의 반복된 사이클을 수반하는 시차를 둔 확대(StEP)(Zhao 등, Nat . Biotechnol . 16:258-261 (1998)); 주형의 상이한 세그먼트에 대해 상보적인 여러 짧은 DNA 단편을 생성하는데 무작위 서열 프라이머가 사용되는, 랜덤 프라이밍 재조합(RPR)(Shao 등, Nucleic Acids Res 26:681-683 (1998))을 포함한다.
부가적 방법들은, 선형화된 플라스미드 DNA가 불일치 복구에 의해 복구된 헤테로듀클렉스를 형성하는데 사용되는 헤테로듀플렉스 재조합(Volkov 등, Nucleic Acids Res . 27:e18 (1999); and Volkov 등, Methods Enzymol . 328:456-463 (2000)); 단일가닥 DNA(ssDNA)의 Dnase I 단편화 및 크기 분획화를 이용하는, 일시적인 주형 (RACHITT) 상에서의 무작위 키메라생성(Coco 등, Nat . Biotechnol . 19:354-359 (2001)); 주형의 풀로서 사용된 단일방향의 ssDNA 단편의 존재하에 프라이머로부터 단일방향으로 성장하는 가닥의 주형 스위치를 수반하는, 끝이 잘린 주형 상에서의 재조합된 확대(RETT)(Lee 등, J. Molec . Catalysis 26:119-129 (2003)); 축퇴성 프라이머가 분자 간의 재조합을 제어하는데 사용되는, 축퇴성 올리고뉴클레오타이드 유전자 셔플링(DOGS)(Bergquist and Gibbs, Methods Mol . Biol 352:191-204 (2007); Bergquist 등, Biomol . Eng 22:63-72 (2005); Gibbs 등, Gene 271:13-20 (2001)); 목적하는 유전자 또는 유전자 단편 중 하나의 염기쌍 결실을 갖는 조합 라이브러리를 생성하는, 하이브리드 효소의 생성을 위한 증분 절단(ITCHY)(Ostermeier 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 96:3562-3567 (1999); and Ostermeier 등, Nat . Biotechnol . 17:1205-1209 (1999)); 포스포티오에이트 dNTP가 절단을 생성하는데 사용되는 것을 제외하고 ITCHY와 유사한, 하이브리드 효소의 생성을 위한 티오-증분 절단(THIO-ITCHY)((Lutz 등, Nucleic Acids Res 29:E16 (2001)); 유전자를 재조합하는 두 가지 방법인 ITCHY와 DNA 셔플링을 조합한 SCRATCHY(Lutz 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 98:11248-11253 (2001)); epPCR을 통해 돌연변이가 만들어진 다음 그들의 유지되는 사용가능한 활성을 스크리닝/선택하는, 무작위 드리프트(Drift) 돌연변이유발(RNDM)(Bergquist 등, Biomol . Eng. 22:63-72 (2005)); 이노신과 같은 "보편적인" 염기의 존재하에 확장하는 주형으로서 사용되는, 포스포티올레이트 뉴클레오타이드 및 절단의 무작위 혼입을 이용한 무작위 길이 단편의 풀을 생성하고, 이노신-함유 보체의 복제가 무작위 염기 혼입을 야기하고, 그 결과 돌연변이를 야기하는, 무작위 돌연변이인 서열 포화 돌연변이유발(SeSaM)(Wong 등, Biotechnol . J. 3:74-82 (2008); Wong 등, Nucleic Acids Res . 32:e26 (2004); and Wong 등, Anal . Biochem . 341:187-189 (2005)); "표적 내의 모든 유전적 다양성"을 코딩하도록 설계된 오버래핑 올리고뉴클레오타이드를 사용하고, 셔플링된 자손에 매우 높은 다양성을 허용하는, 합성 셔플링(Ness 등, Nat . Biotechnol . 20:1251-1255 (2002)); dUTP 혼입 후 종료점 DNA 단편화를 수행하기 위해 우라실 DNA 글리코실라제과 그 다음으로 피페리딘을 처리하는 것의 조합을 이용하는, 뉴클레오타이드 교환 및 절제 기술(Muller 등, Nucleic Acids Res . 33:e117 (2005))을 포함한다.
추가 방법은, 두 개의 관련성이 적거나 관련성이 없는 유전자 간의 융합을 용이하게 하기 위해 링커가 사용되며, 상기 두 유전자 사이에 다양한 키메라가 생성되어 단일-교차 하이브리드의 라이브러리를 야기하는, 서열 상동성-비의존적 단백질 재조합(SHIPREC)(Sieber 등, Nat . Biotechnol . 19:456-460 (2001)); 출발 물질들이 삽입물과, 원하는 부위의 돌연변이에서 축퇴성인 두 개의 프라이머를 함유하는 초나선 이중 가닥 DNA (dsDNA) 플라스미드를 포함하는, Gene Site Saturation Mutagenesis™(GSSM™)(Kretz 등, Methods Enzymol . 388:3-11 (2004)); 제한된 영역을 다수의 가능한 아미노산 서열 변경으로 대체하는 짧은 올리고뉴클레오타이드 카세트의 사용을 수반하는, 조합 카세트 돌연변이유발(CCM)(Reidhaar-Olson 등 Methods Enzymol. 208:564-586 (1991); and Reidhaar-Olson 등 Science 241:53-57 (1988)); 본질적으로 CCM에 유사하고 높은 돌연변이 비율로 epPCR을 사용하여 핫 스팟 및 핫 영역을 확인한 다음 CMCM에 의해 확대하여 단백질 서열 공간의 규정된 영역을 커버하는, 조합 다중 카세트 돌연변이유발(CMCM)(Reetz 등, Angew . Chem . Int. Ed Engl . 40:3589-3591 (2001)); 선별 동안 무작위 및 자연 돌연변이 빈도를 20 내지 4000배 증가시키고 선별이 요구되지 않을 때 해로운 돌연변이의 축적을 차단하는, DNA 폴리머라아제 Ⅲ의 돌연변히 하부단위를 코딩하는, mutD5 유전자를 이용하는 조건성 ts 돌연변히 플라스미를 이용하는, 돌연변이유발자 균주 기술(Selifonova 등, Appl . Environ . Microbiol . 67:3645-3649 (2001)); Low 등, J. Mol . Biol. 260:359-3680 (1996))을 포함한다.
부가적 예시적인 방법은, 선택된 아미노산의 조합 돌연변이를 평가하고 최적화하는 다차원 돌연변이유발 방법인, 룩-쓰루(Look-Through) 돌연변이유발(LTM) (Rajpal 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 102:8466-8471 (2005)); 특정 접힘을 갖는 구조적으로 규명된 단백질 백본을 갖고, 상기 접힘과 전체적인 단배질 에너지론을 안정화시킬 수 있는 아미노산 치환을 위한 서열 공간을 탐색하고, 공지된 삼차원 구조를 갖는 단백질에 일반적으로 가장 효과적으로 작동하는, 최적화 알고리즘인 가상환경에서의 단백질 설계 자동화(PDA)인, 한번에 다수의 유전자에 적용될 수 있는 또는 단일 유전자의 키메라의 큰 라이브러리(다수의 돌연변이)를 생성하는 DNA 셔플링(Verenium Corporation에 의해 공급된 Tunable GeneReassembly™(TGR™) 기술)인 유전자 재조립(Hayes 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 99:15926-15931 (2002)); 및 효소 개선을 위한 가능성 있는 부위를 선택하기 위해 구조/기능의 지식을 이용하고, Stratagene QuikChange (Stratagene; San Diego CA)와 같은 돌연변이유발 방법을 이용하여 선택된 부위에서 포화 돌연변이 유발을 수행하고, 원하는 특성으로 스크리닝/선택하고, 개선된 클론(들)을 이용하여 또 다른 부위에서 시작하여 원하는 특성이 달성될 때까지 계속 반복하는 것을 수반하는, 반복적인 포화 돌연변이유발 (ISM)(Reetz 등, Nat . Protoc . 2:891-903 (2007); and Reetz 등, Angew . Chem. Int . Ed Engl . 45:7745-7751 (2006)).
돌연변이 유발을 위한 임의의 전술한 방법들은 단독으로 또는 임의로 조합되어 사용될 수 있다. 또한, 유도 진화 방법 중 어느 하나 또는 조합이 본원에 기술된 바와 같은 적응 진화 기술과 함께 사용될 수 있다.
실질적으로 본원에 제공된 다양한 구현예의 활성에 영향을 미치지 않는 변형이 또한 본원에 제공된 정의 내에서 제공되는 것으로 이해된다. 따라서, 하기 실시예는 예시하지만 제한하는 것이 아닌 것으로 의도된다.
실시예 I
미토콘드리아 아세틸- CoA 로부터 세포질 아세틸- CoA 를 생산하기 위한 경로
미토콘드리아 아세틸-CoA로부터 세포질 아세틸-CoA의 생산은 수많은 경로에 의해, 예를 들면, 3개 내지 5개의 효소 단계로 달성될 수 있다. 하나의 예시적인 경로에서, 미토콘드리아 아세틸-CoA 및 옥살로아세테이트는 시트레이트 생성효소에 의해 시트레이트로 조합되며 시트레이트는 시트레이트 수송체 또는 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체에 의해 미토콘드리아 밖으로 배출된다. 세포질에서의 시트레이트의 효소 전환은 세포질 아세틸-CoA 및 옥살로아세테이트를 야기한다. 이후, 세포질 옥살로아세테이트는 임의로 옥살로아세테이트 수송체 및/또는 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체에 의해 미토콘드리아로 다시 수송될 수 있다. 또 하나의 예시적인 경로에서, 세포질 옥살로아세테이트는 일차적으로 세포질에서 효소적으로 말레이트로 전환된 다음, 임의로 말레이트 수송체 및/또는 말레이트/시트레이트 수송체에 의해 미토콘드리아 내로 이동된다. 이후, 미토콘드리아 말레이트는 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소를 이용하여 옥살로아세테이트로 전환될 수 있다.
또 하나의 예시적인 경로에서, 미토콘드리아 아세틸-CoA는 시트라말레이트 중간체를 통해 세포질 아세틸-CoA로 전환될 수 있다. 예를 들면, 미토콘드리아 아세틸-CoA 및 피루베이트는 시트라말레이트 생성효소에 의해 시트라말레이트로 전환된다. 이후, 시트라말레이트는 시트라말레이트 또는 디카복실산 수송체에 의해 세포질 내로 수송될 수 있다. 이후, 세포질 아세틸-CoA 및 피루베이트는, 직접적으로 또는 간접적으로 시트라말레이트로부터 재생되고, 피루베이트는 미토콘드리아로 다시 들어갈 수 있다.
이들 라인을 따라, 미토콘드리아 아세틸-CoA로부터 세포질 아세틸-CoA를 생산하기 위한 몇 가지 예시적인 아세틸-CoA 경로가 도 2, 3 및 8에 나타나 있다. 일 구현예에서, 미토콘드리아 옥살로아세테이트는 미토콘드리아 아세틸-CoA와 조합되어 시트레이트 생성효소(도 2, 3 및 8, A)에 의해 시트레이트를 형성한다. 시트레이트는 시트레이트 수송체(도 2, 3 및 8, B), 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체(도 2C) 또는 시트레이트/말레이트 수송체(도 3C)에 의해 미토콘드리아 밖으로 수송된다. 세포질 시트레이트는 ATP 시트레이트 분해효소(도 2, 3, D)에 의해 세포질 아세틸-CoA 및 옥살로아세테이트로 전환된다. 또 하나의 경로에서, 세포질 시트레이트는 시트레이트 분해효소에 의해 아세테이트 및 옥살로아세테이트로 전환된다 (도 2 및 3, E). 이후, 아세테이트는 아세틸-CoA 합성효소 또는 전이효소(도 2 및 3, F)에 의해 세포질 아세틸-CoA로 전환될 수 있다. 대안적으로, 아세테이트는 아세테이트 키나아제(도 2 및 3, K)에 의해 아세틸 포스페이트로 전환될 수 있고, 아세틸 포스페이트는 포스포트랜스아세틸라제에 의해 세포질 아세틸-CoA로 전환될 수 있다(도 2 및 3, L). 아세틸-CoA 경로 효소의 예시적인 효소 후보들이 하기에 기재되어 있다.
옥살로아세테이트 및 미토콘드리아 아세틸-CoA의 전환은 시트레이트 생성효소(도 2, 3 및 8, A)에 의해 촉매된다. 어떤 구현예에서, 비-자연 발생 진핵 유기체의 미토콘드리아에서 발현된 시트레이트 생성효소가 본원에 제공된다.
표 11
Figure pct00011
미토콘드리아로부터 세포질로의 시트레이트의 수송은 몇 가지 수송 단백질에 의해 수행될 수 있다. 그러한 단백질은 시트레이트를 세포질로 직접 내보내거나(즉, 시트레이트 수송체, 도 2, 3 및 8, B), 도 2, 3 및 8에 나타난 바와 같이 세포질로부터 미토콘드리아 내로 말레이트(즉, 시트레이트/말레이트 수송체, 도 3C) 또는 옥살로아세테이트(즉, 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체 도 2C)와 같은 분자를 동시에 수송하면서 시트레이트를 세포질로 내보낸다. 이들 변환을 수행하는 예시적인 수송 효소들이 하기 표에 제공되어 있다.
표 12
Figure pct00012
ATP 시트레이트 생성효소로도 불리는 ATP 시트레이트 분해효소(ACL, EC 2.3.3.8, 도 2 및 3, D)는 또한 시트레이트의 옥살로아세테이트 및 아세틸-CoA로의 ATP-의존적 절단을 촉진한다. 어떤 구현예에서, ATP 시트레이트 분해효소는 진핵 유기체의 세포질에서 발현된다. ACL은 녹색 황 박테리아 클로로비움 리미콜라 및 클로로비움 테피덤에서 연구되어 온 RTCA 사이클의 효소이다. 클로로비움 리미콜라 유래의 알파(4)베타(4) 헤테로머 효소가 클로닝되었고 대장균에서 특성이 규명되었다(Kanao 등, Eur . J. Biochem. 269:3409-3416 (2002)). aclAB에 의해 코딩된 C. limicola 효소는 비가역적이고 효소의 활성은 ADP/ATP의 비율에 의해 조절된다. 클로로비움 테피덤 유래의 재조합 ACL은 또한 대장균에서 발현되었고 상기 전효소는 촉매적 기전에서의 알파 및 베타 서브유닛의 역할을 설명하는 연구에서, 시험관내에서 재구성되었다((Kim and Tabita, J. Bacteriol. 188:6544-6552 (2006)). ACL 효소는 또한 발네아리움 리토트로피쿰, 설푸리하이드로게니비움 서브테라네움 및 박테리아 ㅍ피필룸 아퀴피캐의 다른 멤버에서 확인되었다((Hugler 등, Environ. Microbiol. 9:81-92 (2007)). 이 활성은 또한 일부 균류에서 보고되어 왔다. 예시적인 유기체는 소르다리아 매크로스포라(Nowrousian 등, Curr . Genet . 37:189-93 (2000)), 아스페르길러스 니둘란스 및 야로위아 리포라이티카(Hynes and Murray, Eukaryotic Cell, July: 1039-1048, (2010)), 및 아스페르길루스 니게르(Meijer 등 J. Ind . Microbiol . Biotechnol. 36:1275-1280 (2009))를 포함한다. 다른 후보들은 서열 상동성에 기초하여 확인될 수 있다. 이들 효소와 관련된 정보들이 하기에 표로 작성되어 있다.
표 13
Figure pct00013
일부 유기체에서, 시트레이트의 옥살로아세테이트 및 아세틸-CoA로의 전환은 시트릴-CoA 중간체를 통해 진행되고 두 가지 별개의 효소인 시트릴-CoA 합성효소(EC 6.2.1.18) 및 시트릴-CoA 분해효소(EC 4.1.3.34)에 의해 촉매된다(Aoshima, M., Appl . Microbiol. Biotechnol . 75:249-255 (2007). 시트릴-CoA 합성효소는 시트레이트의 시트릴-CoA로의 활성화를 촉진한다. 하이드로게노박터 서모필러스 효소는 각각 ccsA 및 ccsB에 의해 코딩된 크고 작은 서브유닛들로 구성된다((Aoshima 등, Mol . Micrbiol. 52:751-761 (2004)). 아퀴펙스 아에올리쿠스의 시트릴-CoA 합성효소는 sucC1 및 sucD1에 의해 코딩된 알파 및 베타 서브유닛들로 구성된다((Hugler 등, Environ . Microbiol. 9:81-92 (2007)). 시트릴-CoA 분해효소는 시트릴-CoA를 옥살로아세테이트 및 아세틸-CoA로 분리한다. 이 효소는 하이드로게노박터 서모필러스에서의 ccl(Aoshima 등, Mol . Microbiol. 52:763-770 (2004)) 및 아퀴펙스 아에올리쿠스에서의 aq_150(Hugler 등, supra (2007))에 의해 코딩된 동종삼량체이다. 시트레이트를 옥살로아세테이트 및 시트릴-CoA로 전환하는 이 기전에 대한 유전자가 최근에 클로로비움 테피덤에서 보고되었다(Eisen 등, PNAS 99(14): 9509-14 (2002)).
표 14
Figure pct00014
시트레이트 분해효소(EC 4.1.3.6, 도 2 및 3, E)는 시트레이트의 아세테이트 및 옥살로아세테이트로의 절단을 야기하는 일련의 반응을 촉진한다. 어떤 구현예에서, 시트레이트 분해효소는 진핵 유기체의 세포질에서 발현된다. 상기 효소는 혐기성 조건 하에서 활성이며 세 가지 서브유닛: 아실-담체 단백질(ACP, 감마), ACP 전이효소(알파), 및 아실 분해효소(베타)로 구성된다. 효소 활성화는 아세틸-CoA와 구조가 유사한, 드문 보결 그룹인 2'-(5"-포스포리보실)-3-'-데포스포-CoA의 아세틸화의 공유 결합 및 아세틸화를 이용한다. 아실화는 시트레이트 분해효소 합성효소인 CitC에 의해 촉매된다. 두 가지 부가적 단백질인 CitG 및 CitX는 아포 효소를 활성인 전효소로 전환하는데 사용된다(Schneider 등, Biochemistry 39:9438-9450 (2000)). 야생형 대장균은 시트레이트 분해효소 활성을 가지고 있지 않지만, 몰리브데늄 보조인자 합성이 결핍된 돌연변이는 활성 시트레이트 분해효소를 갖는다(Clark, FEMS Microbiol . Lett. 55:245-249 (1990)). 대장균 효소는 citEFD에 의해 코딩되고 시트레이트 분해효소 합성효소는 citC에 의해 코딩된다(Nilekani and SivaRaman, Biochemistry 22:4657-4663 (1983)). 류코노스톡 메센테로이데스 시트레이트 분해효소는 클로닝되고, 규명되고, 대장균에서 발현되었다((Bekal 등, J. Bacteriol. 180:647-654 (1998)). 시트레이트 분해효소 효소는 또한 탄소 및 에너지 공급원으로서 시트레이트를 이용하는, 살모넬라 타이피뮤리움 및 클렙시엘라 뉴모니아에를 포함하는 엔테로박테리아에서 확인되어왔다 (Bott, Arch . Microbiol. 167: 78-88 (1997); Bott 및 Dimroth, Mol . Microbiol. 14:347-356 (1994)). 상기 언급된 단백질들은 하기에 표로 작성되어 있다.
표 15
Figure pct00015
아세테이트의 아세틸-CoA로의 아실화는 아세틸-CoA 합성효소 활성을 갖는 효소(도 2 및 3, F)에 의해 촉매된다. 어떤 구현예에서, 아세틸-CoA 합성효소는 진핵 유기체의 세포질에서 발현된다. 이 반응을 촉진하는 두 가지 효소는 AMP-형성 아세틸-CoA 합성효소(EC 6.2.1.1) 및 ADP-형성 아세틸-CoA 합성효소(EC 6.2.1.13)이다. AMP-형성 아세틸-CoA 합성효소(ACS)는 아세테이트의 아세틸-CoA로의 활성화를 위한 지배적인 효소이다. 예시적인 ACS 효소는 대장균(Brown 등, J. Gen . Microbiol . 102:327-336 (1977)), 랄스토니아 유트로파(Priefert and Steinbuchel, J. Bacteriol . 174:6590-6599 (1992)), 메타노테르모박터 테마우토트로피쿠스(Ingram-Smith and Smith, Archaea 2:95-107 (2007)), 살모넬라 엔테리카(Gulick 등, Biochemistry 42:2866-2873 (2003)) 및 사카로마이세스 세레비지애(Jogl and Tong, Biochemistry 43:1425-1431 (2004))에서 발견된다.
표 16
Figure pct00016
ADP-형성 아세틸-CoA 합성효소(ACD, EC 6.2.1.13)는 아실-CoA 에스테르의 이들의 상응하는 산으로의 전환을 ATP의 동시 합성과 결합시키는 또 하나의 후보 효소이다. 광범위한 기질 특이성을 갖는 몇 가지 효소들이 문헌에 기재되어 왔다. AF1211에 의해 코딩된, 아차에오글로버스 풀기더스 유래의 ACD I은 아세틸-CoA, 프로피노일-CoA, 부티릴-CoA, 아세테이트, 프로피오네이트, 부틸레이트, 이소부틸레이트, 이소발레레이트, 석시네이트, 푸마레이트, 페닐아세테이트, 인돌아세테이트를 포함하는, 다양한 선형 및 분지쇄 기질 상에서 작동하는 것으로 나타났다((Jogl and Tong, Biochemistry 43:1425-1431 (2004)). 할로아르큘라 마리스모르투이 유래의 효소(석시닐-CoA 합성효소로 표기됨)는 기질로서 프로피오네이트, 부틸레이트, 및 분지쇄 산(이소발레레이트 및 이소부틸레이트)을 받아들이고, 정방향 및 역방향으로 작동하는 것으로 나타났다(Brasen 등, Arch . Microbiol . 182:277-287 (2004)). 과호열성 크레나르캐온(crenarchaeon) 파이로바큘럼 에어로필럼 유래의 PAE3250에 의해 코딩된 ACD는 아세틸-CoA, 이소부티릴-CoA(바람직한 기질) 및 페닐아세틸-CoA와 반응하는, 모든 규명된 ACD 중 가장 광범위한 기질 범위를 나타내었다(Brasen 등, supra (2004)). A. 풀기더스 , H. 마리스모르투이 및 P. 에어로필럼 유래의 효소들은 모두 대장균에서 클로닝되었고, 기능적으로 발현되었으며, 규명되었다(Musfeldt 등, supra; Brasen 등, supra (2004)). 부가적 후보들은 대장균 내의 sucCD에 의해 코딩된 석시닐-CoA 합성효소(Buck 등, Biochemistry 24:6245-6252 (1985)) 및 슈도모나스 푸티다 유래의 아실-CoA 리가제(Fernandez-Valverde 등, Appl . Environ . Microbiol. 59:1149-1154 (1993))를 포함한다. 이들 단백질 및 유전자와 관련된 정보들이 하기에 나타나 있다.
표 17
Figure pct00017
아세테이트에 CoA 모이어티를 부가하는 대안적인 방법은 포스페이트-전이성 아실전이효소 및 아세테이트 키나아제(도 2 및 3, F, 도 8E 및 8F)와 같은 한 쌍의 효소를 적용하는 것이다. 이 활성은 ATP의 동시 소비와 함께 아세틸-CoA의 순수한 형성을 가능하게 한다. 어떤 구현예에서, 포스포트랜스아세틸라제는 진핵 유기체의 세포질에서 발현된다. 예시적인 포스페이트-전이성 아실전이효소는 pta에 의해 코딩된 포스포트랜스아세틸라제이다. 대장균 유래의 pta 유전자는 아세틸-CoA를 아세틸-포스페이트로 전환시키고, 그 반대로 전환시킬 수 있는 효소를 코딩한다(Suzuki, T. Biochim.Biophys.Acta 191:559-569 (1969)). 이 효소는 또한 공정에서 아세틸-CoA 형성 프로피오네이트 대신에 프로피노일-CoA를 이용할 수 있다(Hesslinger 등 Mol.Microbiol 27:477-492 (1998)). 살모넬라 엔테리카 및 클라마이도모나스 레인하르드티이를 포함하는 몇 가지 다른 유기체 내에 동족체가 존재한다.
표 18
Figure pct00018
예시적인 아세테이트 키나아제는 ackA에 의해 코딩된 대장균 아세테이트 키나아제이다(Skarstedt and Silverstein J. Biol . Chem . 251:6775-6783 (1976)). 살모넬라 엔테리카 및 클라마이도모나스 레인하르드티이를 포함하는 몇 가지 다른 유기체 내에 동족체가 존재한다. 이들 단백질 및 유전자와 관련된 정보들이 하기에 나타나 있다:
표 19
Figure pct00019
일부 구현예에서, 세포질 옥살로아세테이트는 옥살로아세테이트 수송체에 의해 미토콘드리아 내로 다시 수송된다. 이후, 미토콘드리아 내로 다시 수송된 옥살로아세테이트는 본원에 기재된 아세틸-CoA 경로에서 사용될 수 있다.
세포질로부터 미토콘드리아로의 옥살로아세테이트의 수송은 몇 가지 수송 단백질들에 의해 수행될 수 있다. 그러한 단백질은 옥살로아세테이트를 직접 미토콘드리아로 들여보내거나(즉, 옥살로아세테이트 수송체, 도 2G 및 8H), 도 2 및 3에 나타난 바와 같이 미토콘드리아로부터 세포질 안으로 시트레이트(즉, 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체, 도 2C 및 8H)를 동시에 수송하면서 옥살로아세테이트를 세포질로 들여보낸다. 이들 변환을 수행하는 예시적인 수송 효소들이 하기 표에 제공되어 있다.
표 20
Figure pct00020
일부 구현예에서, 세포질 옥살로아세테이트는 세포질 말레이트 탈수소효소(도 3H 및 8J)에 의해 일차적으로 말레이트로 전환된다. 세포질 말레이트는 말레이트 수송체 또는 시트레이트/말레이트 수송체(도 3 및 8, I)에 의해 미토콘드리아 내로 수송된다. 이후, 미토콘드리아 말레이트는 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소(도 3J 및 8K)에 의해 옥살로아세테이트로 전환된다. 이후, 미토콘드리아 옥살로아세테이트는 본원에 기재된 아세틸-CoA 경로에 사용될 수 있다. 각각의 이들 효소들의 예시적인 예가 하기에 제공되어 있다.
옥살로아세테이트는 말레이트 탈수소효소(EC 1.1.1.37, 도 3H 및 8J)에 의해 말레이트로 전환된다. 말레이트가 세포질로부터 미토콘드리아로 수송된 디카복실레이트인 경우, 예를 들면, 도 3에 나타난 바와 같은, 두 가지 세포질 및 미토콘드리아 형태의 말레이트 탈수소효소의 발현이 사용될 수 있다. S. 세레비시애는 3 복제수의 말레이트 탈수소효소, MDH1(McAlister-Henn and Thompson, J. Bacteriol. 169:5157-5166 (1987)), MDH2(Minard and McAlister-Henn, Mol . Cell . Biol. 11:370-380 (1991); Gibson and McAlister-Henn, J. Biol . Chem. 278:25628-25636 (2003)), 및 MDH3(Steffan and McAlister-Henn, J. Biol . Chem. 267:24708-24715 (1992))를 가지며, 이들은 각각 미토콘드리아, 세포질, 및 퍼옥시좀에 국한된다. S. 세레비시애 유래의 세포질 말레이트 탈수소효소인 MDH2에 가까운 동족체들이 클루이베로마이세스 락티스 및 칸디다 트로피칼리스를 포함하는 몇 가지 유기체에서 발견된다. 대장균은 또한 mdh에 의해 코딩된 활성 말레이트 탈수소효소를 갖는 것으로 알려져 있다.
표 21
Figure pct00021
세포질로부터 미토콘드리아로의 말레이트의 수송은 몇 가지 수송 단백질들에 의해 수행될 수 있다. 그러한 단백질은 말레이트를 직접 미토콘드리아로 들여보내거나(즉, 말레이트 수송체), 도 2, 3 및 8에 나타난 바와 같이 미토콘드리아로부터 세포질 내로 시트레이트(즉, 시트레이트/말레이트 수송체)와 같은 분자를 동시에 수송하면서 말레이트를 세포질로 들여보낸다. 이들 변환을 수행하는 예시적인 수송 효소들이 하기 표에 제공되어 있다.
표 22
Figure pct00022
말레이트는 말레이트 탈수소효소(EC 1.1.1.37, 도 3, J)에 의해 옥살로아세테이트로 전환될 수 있다. 말레이트가 세포질로부터 미토콘드리아로 수송된 디카복실레이트인 경우, 어떤 구현예에서, 도 3에 나타난 바와 같이 두 가지 세포질 및 미토콘드리아 형태의 말레이트 탈수소효소가 발현된다. S. 세레비시애는 3 복제수의 말레이트 탈수소효소, MDH1(McAlister-Henn and Thompson, J. Bacteriol. 169:5157-5166 (1987)), MDH2(Minard and McAlister-Henn, Mol . Cell . Biol. 11:370-380 (1991); Gibson and McAlister-Henn, J. Biol . Chem. 278:25628-25636 (2003)), 및 MDH3(Steffan and McAlister-Henn, J. Biol . Chem. 267:24708-24715 (1992))를 가지며, 이들은 각각 미토콘드리아, 세포질, 및 퍼옥시좀에 국한된다. S. 세레비시애 유래의 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소인 MDH1에 가까운 동족체들이 클루이베로마이세스 락티스, 야로위아 리포라이티카, 칸디다 트로피칼리스를 포함하는 몇 가지 유기체에서 발견된다. 대장균은 또한 mdh에 의해 코딩된 활성 말레이트 탈수소효소를 갖는 것으로 알려져 있다.
표 23
Figure pct00023
실시예 Ⅱ
세포질 피루베이트로부터 세포질 아세틸- COA 를 생산하기 위한 경로
도 5에 나타난 바와 같이, 하기 실시예는 세포질 피루베이트 및 트레오닌의 세포질 아세틸-CoA로의 전환을 위한 예시적인 경로를 기술한다.
피루베이트의 아세틸-CoA로의 직접적인 전환은 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트 포르메이트 분해효소, 피루베이트:NAD(P) 산화환원효소 또는 피루베이트:페레독신 산화환원효소에 의해 촉매될 수 있다 도 5H).
피루베이트의 아세틸-CoA로의 간접적인 전환은 몇 가지 대안적인 경로를 통해 진행될 수 있다. 피루베이트는 피루베이트 탈탄산효소에 의해 아세트알데하이드로 전환될 수 있다. 이후, 아세트알데하이드는 (CoA-의존적) 아세트알데하이드 탈수소효소를 아실화함으로서 아세틸-CoA로 전환될 수 있다. 대안적으로, 피루베이트 탈탄산효소에 의해 생성된 아세트알데하이드는 "PDH 우회" 경로에 의해 아세틸-CoA로 전환될 수 있다. 이 경로에서, 아세트알데하이드는 아세트알데하이드 탈수소효소에 아세테이트로 전환되고, 이는 이후에 CoA 리가제, 합성효소 또는 전이효소에 의해 아세틸-CoA로 전환된다. 또 하나의 구현예에서, 아세테이트 중간체는 아세테이트 키나아제에 의해 아세틸-포스페이트로 전환되며, 이는 이후에 포스포트랜스아세틸라제에 의해 아세틸-CoA로 전환된다. 또 하나의 구현예에서, 피루베이트는 피루베이트 산화효소에 의해 아세틸-포스페이트로 직접 전환된다(아세틸-포스페이트 형성). 피루베이트의 아세테이트 중간체로의 전환은 또한 아세테이트-형성 피루베이트 산화효소에 의해 촉매될 수 있다.
도 5는 세포질 피루베이트의 세포질 아세틸-CoA로의 간접적인 전환에 대한 몇 가지 경로를 묘사한다(5A/5B, 5A/5C/5D, 5E/5F/5C/5D, 5G/1D). 첫 번째 경로에서, 피루베이트는 피루베이트 산화효소에 의해 아세테이트로 전환된다(아세테이트 형성)(단계 A). 아세테이트는 차후에 아세틸-CoA 합성효소, 리가제 또는 전이효소에 의해 아세틸-CoA로 직접적으로 전환되거나(단계 B), 또는 아세틸-포스페이트 중간체를 통해 간접적으로 전환된다(단계 C, D). 대안적인 경로에서, 피루베이트는 피루베이트 탈탄산효소에 의해 아세트알데하이드로 탈카복실화된다(단계 E). 아세트알데하이드 탈수소효소는 아세트알데하이드를 산화하여 아세테이트를 형성한다(단계 F). 아세테이트는 이후에 아세테이트 키나아제 및 포스포트랜스아세틸라제에 의해 아세틸-CoA로 전환될 수 있다(단계 C 및 D). 또 하나의 경로에서, 피루베이트는 피루베이트 산화효소에 의해 아세틸포스페이트로 산화될 수 있다(아세틸-포스페이트 형성)(단계 G). 포스포트랜스아세틸라제는 이후에 아세틸포스페이트를 아세틸-CoA로 전환할 수 있다(단계 D).
세포질 아세틸-CoA는 또한 원상태 또는 이종기원 트레오닌 알돌라아제를 발현함으로써 트레오닌으로부터 합성될 수 있다(도 5J)(van Maris 등, AEM 69:2094-9 (2003)). 트레오닌 알돌라아제는 트레오닌을 아세트알데하이드 및 글리신으로 전환시킬 수 있다. 그리고 나서, 아세트알데하이드 생성물은 전술한 다양한 경로에 의해 아세틸-CoA로 전환될 수 있다.
도 5에 나타난 아세틸-CoA 형성 효소에 대한 유전자 후보들이 하기에 기재되어 있다.
피루베이트 산화효소(아세테이트-형성)(도 5A) 또는 피루베이트:퀴논 산화환원효소(PQO)는 전자 수용체로서 유비퀴논(EC 1.2.5.1) 또는 퀴논(EC 1.2.2.1)을 이용하여 피루베이트의 아세테이트로의 산화적 탈카복실화를 촉매할 수 있다. 대장균 효소인 PoxB는 내막에 국한된다(Abdel-Hamid 등, Microbiol 147:1483-98 (2001)). 상기 효소는 티아민 파이로포스페이트 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(FAD) 보조인자를 갖는다(Koland and Gennis, Biochemistry 21:4438-4442 (1982)); O'Brien 등, Biochemistry 16:3105-3109 (1977); O'Brien and Gennis, J. Biol. Chem. 255:3302-3307 (1980)). PoxB는 S. 세레비시애 및 자이모모나스 모빌리스의 피루베이트 탈탄산효소와 유사성을 갖는다. 코라이네박테리움 글루타미쿰의 pqo 전사체는 퀴논-의존적 및 아세테이트-형성 피루베이트 산화환원효소를 코딩한다(Schreiner 등, J Bacteriol 188:1341-50 (2006)). 유사한 효소들이 서열 상동성에 의해 추론될 수 있다.
표 24
Figure pct00024
아세테이트의 아세틸-CoA로의 아실화(도 5B)는 아세틸-CoA 합성효소, 리가제 또는 전이효소 활성을 갖는 효소에 의해 촉매될 수 있다. 이 반응을 촉매할 수 있는 두 가지 효소는 AMP-형성 아세틸-CoA 합성효소 또는 리가제(EC 6.2.1.1) 및 ADP-형성 아세틸-CoA 합성효소(EC 6.2.1.13)이다. AMP-형성 아세틸-CoA 합성효소(ACS)는 아세테이트의 아세틸-CoA로의 활성화를 위한 지배적인 효소이다. 예시적인 ACS 효소는 대장균(Brown 등, J. Gen . Microbiol . 102:327-336 (1977)), 랄스토니아 유트로파(Priefert and Steinbuchel, J. Bacteriol . 174:6590-6599 (1992)), 메타노테르모박터 테마우토트로피쿠스(Ingram-Smith and Smith, Archaea 2:95-107 (2007))), 살모넬라 엔테리카(Gulick 등, Biochemistry 42:2866-2873 (2003)) 및 사카로마이세스 세레비지애((Jogl and Tong, Biochemistry 43:1425-1431 (2004))에서 발견된다. ADP-형성 아세틸-CoA 합성효소는 일반적으로 광범위한 기질 범위를 갖는 가역적 효소이다(Musfeldt and Schonheit, J. Bacteriol. 184:636-644 (2002)). ADP-형성 아세틸-CoA 합성효소의 두 가지 동질효소는 AF1211 및 AF1983에 의해 코딩된 아차에오글로버스 풀기더스 게놈 내에서 코딩된다(Musfeldt and Schonheit, supra (2002)). 할로아르큘라 마리스모르투이 유래의 효소(석시닐-CoA 합성효소로 표기됨)는 또한 기질로서 아세테이트를 받아들이며 상기 효소의 가역성은 입증되었다(Musfeldt and Schonheit, supra (2002)). 과호열성 크레나르캐온 파이로바큘럼 에어로필럼 유래의 PAE3250에 의해 코딩된 ACD는 아세테이트, 이소부티릴-CoA(바람직한 기질) 및 페닐아세틸-CoA와 반응하는, 모든 규명된 ACD 중 가장 광범위한 기질 범위를 나타내었다(Brasen and Schonheit, supra (2004). 유도 진화 또는 조작이 숙주 유기체의 생리적 온도에서 작동하도록 이 효소를 변형시키는데 사용될 수 있다. A. 풀기더스, H. 마리스모르투이 및 P. 에어로필럼 유래의 효소들은 모두 대장균에서 클로닝되었고, 기능적으로 발현되었으며, 규명되었다(Brasen and Schonheit, supra (2004); Musfeldt and Schonheit, supra (2002))). 부가적 후보들은 대장균 내의 sucCD에 의해 코딩된 석시닐-CoA 합성효소(Buck 등, Biochemistry 24:6245-6252 (1985)) 및 슈도모나스 푸티다 유래의 아실-CoA 리가제(Fernandez-Valverde 등, Appl . Environ . Microbiol. 59:1149-1154 (1993))를 포함한다. 상기 언급된 단백질들이 하기에 나타나 있다.
표 25
Figure pct00025
아세테이트의 아세틸-CoA로의 아실화는 또한 CoA 전이효소 효소에 의해 촉매될 수 있다(도 5B). 수많은 효소들이 CoA 수용체로서 아세테이트를 이용하여, 아세틸-CoA의 형성을 야기한다. 예시적인 CoA 전이효소는 대장균 atoA(알파 서브유닛) 및 atoD(베타 서브유닛) 유전자에 의해 코딩된, 아세토아세틸-CoA 전이효소이다(Korolev 등, Acta Crystallogr .D. Biol . Crystallogr . 58:2116-2121 (2002); Vanderwinkel 등, 33:902-908 (1968)). 이 효소는 광범위한 기질 범위를 가지고(Sramek 등, Arch Biochem Biophys 171:14-26 (1975)), CoA 모이어티를 이소부틸레이트(Matthies 등, Appl Environ . Microbiol 58:1435-1439 (1992)), 발레레이트 (Vanderwinkel 등, Biochem . Biophys . Res . Commun . 33:902-908 (1968)) 및 부타노에이트 (Vanderwinkel 등, Biochem . Biophys . Res . Commun . 33:902-908 (1968))를 포함하는, 다양한 분지 및 선형 아실-CoA 기질 유래의 아세테이트로 수송하는 것으로 나타났다. 유사한 효소들이 코라이네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032(Duncan 등, 68:5186-5190 (2002)), 클로스트리듐 아세토부틸리컴 (Cary 등, Appl Envrion Microbiol 56:1576-1583 (1990); Wiesenborn 등, Appl Envrion Microbiol 55:323-329 (1989)), 및 클로스트리듐 사카로페르부틸아세토니컴 (Kosaka 등, Biosci.Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007))에 존재한다.
표 26
Figure pct00026
아세테이트 키나아제(EC 2.7.2.1)는 아세테이트의 아세틸포스페이트로의 가역적인 ATP-의존적 인산화를 촉매할 수 있다(도 5C). 예시적인 아세테이트 키나아제 효소는 대장균, 클로스트리듐 아세토부틸리컴 및 메타노사르시나 테모필라를 포함하는 많은 유기체에서 규명되었다(Ingram-Smith 등, J. Bacteriol. 187:2386-2394 (2005); Fox and Roseman, J. Biol . Chem . 261:13487-13497 (1986); Winzer 등, Microbioloy 143 (Pt 10):3279-3286 (1997)). 아세테이트 키나아제 활성은 대장균 purT의 유전자 생성물에서 입증되었다(Marolewski 등, Biochemistry 33:2531-2537 (1994)). 일부 부틸레이트 키나아제 효소(EC 2.7.2.7), 예를 들면 클로스트리듐 아세토부틸리컴 유래의 buk1 및 buk2는 또한 기질로서 아세테이트를 받아들인다(Hartmanis, M.G., J. Biol . Chem. 262:617-621 (1987)). 살모넬라 엔테리카 및 클라마이도모나스 레인하르드티이를 포함하는 몇 가지 다른 유기체 내에 동족체들이 존재한다.
표 27
Figure pct00027
아세틸포스페이트로부터의 아세틸-CoA의 형성은 포스포트랜스아세틸라제(EC 2.3.1.8)에 의해 촉매될 수 있다(도 5D). 대장균 유래의 pta 유전자는 아세틸-CoA를 아세틸-포스페이트로 가역적으로 전환시키는 효소를 코딩한다(Suzuki, T., Biochim . Biophys. Acta 191:559-569 (969)). 부가적인 아세틸트랜스페라제 효소들은 바실러스 서브틸리스(Rado and Hoch, Biochim. Biophys. Acta 321:114-125 (1973), 클로스트리듐 클루이베리(Stadtman, E., Methods Enzymol. 1:5896-599 (1955)), 및 써모토가 마르티마(Bock 등, J. Bacteriol. 181:1861-1867 (1999))에서 규명되었다. 이 반응은 또한 클로스트리듐 아세토부틸리컴 유래의 ptb 유전자 생성물을 포함하는, 일부 포스포트랜스부티라아제 효소(EC 2.3.1.19)에 의해 촉매될 수 있다(Wiesenborn 등, App . Environ . Microbiol. 55:317-322 (1989); Walter 등, Gene 134:107-111 (1993)). 부가적 ptb 유전자는 부틸레이트-생산 박테리아 L2-50(Louis 등, J. Bacteriol. 186:2099-2106 (2004)) 및 바실러스 메가테리움(Vazquez 등, Curr. Microbiol. 42:345-349 (2001))에서 발견된다. 살모넬라 엔테리카 및 클라마이도모나스 레인하르드티이를 포함하는 몇 가지 다른 유기체 내에 대장균 pta 유전자에 대한 동족체들이 존재한다.
표 28
Figure pct00028
피루베이트 탈탄산효소(PDC)는 피루베이트의 아세트알데하이드로의 탈카복실화를 촉진하는, 알코올성 발효에서의 핵심 효소이다. 사카로마이세스 세레비지애 유래의 PDC1 효소는 광범위하게 연구되어 왔다(Killenberg-Jabs 등, Eur.J.Biochem. 268:1698-1704 (2001); Li 등, Biochemistry . 38:10004-10012 (1999); ter Schure 등, Appl . Environ . Microbiol . 64:1303-1307 (1998)). 다른 잘-규명된 PDC 효소는 자이모모나스 모빌루스(Siegert 등, Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)), 아세토박터 페이스테우리안스(Chandra 등, 176:443-451 (2001)) 및 클루이베로마이세스 락티스(Krieger 등, 269:3256-3263 (2002))에서 발견된다. 사카로마이세스 세레비시아의 PDC1 및 PDC5 효소는 PDC2에 의한 양성 전사 조절의 대상이다(Hohmann 등, Mol Gen Genet 241:657-66 (1993)). 피루베이트 탈탄산효소 활성은 또한 칸디다 트로피칼리스 내의 CTRG_03826(GI:255729208), 클루이베로마이세스 락티스 내의 PDC1(GI 번호: 1226007), 야로위아 리포라이티카 내의 YALI0D10131g(GI:50550349), 피치아 패스토리스 내의 PAS_chr3_0188(GI:254570575), 쉬조사카로마이세스 폼베에서의 피루베이트 탈탄산효소(GI: GI:159883897), 아스페르길루스 니게르 내의 ANI_1_1024084(GI:145241548), ANI_1_796114(GI:317034487), ANI_1_936024(GI:317026934) 및 ANI_1_2276014(GI:317025935)에 의해 코딩된 단백질에 의해 보유된다.
표 29
Figure pct00029
EC 클래스 1.2.1 내의 알데하이드 탈수소효소는 아세트알데하이드의 아세테이트로의 산화를 촉진한다(도 5F). 이 활성을 코딩하는 예시적인 유전자들이 상기에 기술되었다. 아세트알데하이드의 아세테이트로의 산화는 또한 아세트알데하이드 산화효소 활성을 갖는 알데하이드 산화효소에 의해 촉매될 수 있다. 그러한 효소는 아세트알데하이드, 물 및 O2를 아세테이트 및 과산화수소로 전환시킬 수 있다. 이 변환을 촉진하는 것으로 나타난 예시적인 알데하이드 산화효소 효소들은 보스 타우루스 및 무스 무스큘러스에서 발견될 수 있다(Garattini 등, Cell Mol Life Sci 65:1019-48 (2008); Cabre 등, Biochem Soc Trans 15:882-3 (1987)). 부가적 알데하이드 산화효소 유전자 후보는 zmAO -1 및 zmAO -2에 의해 코딩된, 옥수수의 두 가지 플라빈- 및 몰리브데늄- 함유 알데하이드 산화효소를 포함한다(Sekimoto 등, J Biol Chem 272:15280-85 (1997)).
표 30
Figure pct00030
피루베이트 산화효소(아세틸-포스페이트 형성)는 피루베이트, 산소 및 포스페이트의 아세틸-포스페이트 및 과산화수소로의 전환을 촉매할 수 있다(도 5G). 이러한 유형의 피루베이트 산화효소는 가용성이며 보조인자 티아민 이인산 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(FAD)를 필요로 한다. 아세틸-포스페이트를 형성하는 피루베이트 산화효소 효소는 젖산균 락토바실러스 델브루엑키 및 락토바실러스 플란타럼에서 발견될 수 있다(Lorquet 등, J Bacteriol 186:3749-3759 (2004); Hager 등, Fed Proc 13:734-38 (1954)). L. plantarum 효소의 결정 구조는 해독되었다(Muller 등, (1994)). 스트렙토코쿠스 산구이니스 및 스트렙토코쿠스 폐렴에서, 아세틸-포스페이트를 형성하는 피루베이트 산화효소는 spxB 유전자에 의해 코딩된다(Spellerberg 등, Mol Micro 19:803-13 (1996); Ramos-Montanez 등, Mol Micro 67:729-46 (2008)). SpxR은 S. 뉴모니애에서 spxB의 전사를 양성 조절하는 것으로 나타났다 (Ramos-Montanez 등, supra). S. 산구이니스 내의 유사한 조절물질이 서열 상동성에 의해 확인되었다. 카탈라제 활성의 도입 또는 변형은 과산화수소 생성물의 축적을 감소시킬 수 있다.
표 31
Figure pct00031
피루베이트 탈수소효소(PDH) 복합체는 피루베이트의 아세틸-CoA로의 전환을 촉매할 수 있다(도 5H). 대장균 PDH 복합체는 유전자 aceEF 및 lpdA에 의해 코딩된다. 효소 공학 노력은 혐기성 조건 하에서 대장균 PDH 효소 활성을 개선해왔다 (Kim 등, J. Bacteriol . 190:3851-3858 (2008); Kim 등, Appl . Envrion . Microbiol . 73:1766-1771 (2007); Zhou 등, Biotechnol . Lett . 30:335-342 (2008)). 대장균 PDH와 달리, B. subtilis 복합체는 활성이며 혐기성 조건 하에서의 성장에 필요하다(Nakano 등, 179:6749-6755 (1997)). 글리세롤 상에서 성장하는 동안 규명된, 클렙시엘라 뉴모니아에 PDH 역시 혐기성 조건 하에서 활성이다(Menzel 등, 56:135-142 (1997)). 소 신장 유래의 효소 복합체(Zhou 등, 98:14802-14807 (2001)) 및 아조토박터 비넬란디이 유래의 E2 촉매 도메인의 결정 구조들이 이용가능하다(Mattevi 등, Science . 255:1544-1550 (1992)). 일부 포유동물 PDH 효소 복합체는 대안적인 기질, 예컨대 2-옥소부타노에이트에 반응할 수 있다. 래투스 노르베기쿠스 PDH 및 BCKAD의 비교 동력학은 BCKAD가 기질로서 2-옥소부타노에이트에 대해 더 높은 활성을 가진다는 것을 보여준다(Paxton 등, Biochem .J. 234:295-303 (1986)). S. 세레비시애 복합체는 E1에 결합하는 E2 (LAT1) 코아(PDA1, PDB1), E3(LPD1), 및 단백질 X(PDX1) 요소로 구성될 수 있다 (Pronk 등, Yeast 12:1607-1633 (1996)).
표 32
Figure pct00032
전술한 거대한 다중효소 PDH 복합체에 대한 대안으로서, 일부 유기체는 2-케토산 산화환원효소 패밀리(OFOR) 내의 효소들을 이용하여 2-케토산의 산화적 탈카복실화를 아실화하는 것을 촉진한다. 탈수소효소 복합체들과는 달리, 이들 효소는 철-황 클러스터를 함유하고, 상이한 보조인자를 이용하며, NAD(P)H 대신에 전자 수용체로서 페레독신 또는 플라보딕신을 사용한다. 피루베이트 페레독신 산화환원효소(PFOR)는 피루베이트의 산화를 촉매하여 아세틸-CoA를 형성할 수 있다(도 5H). 데설포비브리오 아프리카누스 유래의 PFOR이 클로닝되었고 대장균에서 발현되었으며, 산소의 존재 하에 며칠간 안정적이었던 활성 재조합 효소를 야기하였다(Pieulle 등, J Bacteriol . 179:5684-5692 (1997)). 산소 안정성은 PFOR에서 상대적으로 드물고 D. 아프리카누스 효소의 폴리펩타이드 사슬 내의 60 잔기 확대에 의해 부여되는 것으로 여겨진다. M. 테모아세티카 PFOR 역시 잘 규명되어 있고(Menon 등, Biochemistry 36:8484-8494 (1997)) 심지어 독립영양 성장 동안 피루베이트 합성 방향으로 높은 활성을 갖는 것으로 나타났다(Furdui 등, J Biol Chem . 275:28494-28499 (2000)). 게다가, 대장균은 M. 테모아세티카 PFOR와 51% 동일한 단백질을 코딩하는 규명되지 않은 열린 해독틀인 ydbK를 보유한다. 대장균에서의 피루베이트 산화환원효소 활성의 증거가 기술되어 왔다(Blaschkowski 등, Eur .J Biochem . 123:563-569 (1982)). 몇 가지 부가적인 PFOR 효소가 문헌[Ragsdale, Chem . Rev . 103:2333-2346 (2003)]에 기술되어 있다. 마지막으로, 플라보독신 환원효소(예를 들면, 헬리코박터 파일로리 또는 캠필로박터 제주니 유래의 fqrB(St Maurice 등, J.Bacteriol. 189:4764-4773 (2007))) 또는 Rnf-유형 단백질(Seedorf 등, Proc.Natl.Acad.Sci.U S.A. 105:2128-2133 (2008); Herrmann 등, J. Bacteriol . 190:784-791 (2008))은 PFOR에 의해 생성된 환원된 페레독신으로부터 NADH 또는 NADPH를 생성하는 수단을 제공한다. 이들 단백질들은 하기에 확인된다.
표 33
Figure pct00033
대장균에서 pflB에 의해 코딩된, 피루베이트 포르메이트-분해효소(PFL, EC 2.3.1.54)(도 5H)는 피루베이트를 아세틸-CoA 및 포르메이트로 전환시킬 수 있다. PFL의 활성은 pflA에 의해 코딩된 활성화 효소에 의해 증대될 수 있다(Knappe 등, Proc . Natl . Acad . Sci U.S.A 81:1332-1335 (1984); Wong 등, Biochemistry 32:14102-14110 (1993)). 2-케토부틸레이트 포르메이트-분해효소(KFL) 및 피루베이트 포르메이트-분해효소 4로도 알려진 케토-산 포메이트-분해효소(EC 2.3.1.-)는 대장균 내 tdcE의 유전자 생성물이다. 이 효소는 혐기성 트레오닌 분해 동안 2-케토부틸레이트의 프로피노일-CoA 및 포르메이트로의 전환을 촉매하고, 또한 혐기성 이화에서 피루베이트 포르메이트-분해효소를 대체할 수 있다(Simanshu 등, J Biosci . 32:1195-1206 (2007)). 상기 효소는 산소-민감성이고, PflB와 마찬가지로, 활성 부위 내 글라이실 라디칼을 활성화시키기 위해 PFL-AE에 의한 번역후 수식을 필요로 할 수 있다(Hesslinger 등, Mol . Microbiol 27:477-492 (1998)). pflD에 의해 코딩된 아차에오글로버스 풀기더스 유래의 피루베이트 포르메이트-분해효소가 클로닝되었고, 대장균에서 발현되었고 규명되었다(Lehtio 등, J Mol . Biol . 357:221-235 (2006); Leppanen 등, Structure . 7:733-744 (1999)). A. 풀기더스 및 대장균 효소의 결정 구조가 해결되었다(Lehtio 등, J Mol . Biol . 357:221-235 (2006); Leppanen 등, Structure . 7:733-744 (1999)). 부가적인 PFL 및 PFL-AE 후보들이 락토코쿠스 락티스(Melchiorsen 등, Appl Microbiol Biotechnol 58:338-344 (2002)), 및 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Takahashi-Abbe 등, Oral . Microbiol Immunol . 18:293-297 (2003)), 클라마이도모나스 레인하르드티이(Hemschemeier 등, Eukaryot . Cell 7:518-526 (2008b); Atteia 등, J. Biol . Chem . 281:9909-9918 (2006)) 및 클로스트리듐 페이스테우리아넘(Weidner 등, J Bacteriol . 178:2440-2444 (1996))에서 발견된다.
표 34
Figure pct00034
아세트알데하이드의 아세틸-CoA로의 NAD(P)+ 의존적 산화(도 5I)는 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소(EC 1.2.1.10)에 의해 촉매될 수 있다. 대장균의 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소 효소는 adhE, eutE, 및 mhpF에 의해 코딩된다(Ferrandez 등, J Bacteriol 179:2573-81 (1997)). dmpF에 의해 코딩된, 슈도모나스 속 CF600 효소는 메타-절단 경로에 참여하고 4-하이드록시-2-옥소발레레이트 알돌라아제와 복합체를 형성한다(Shingler 등, J Bacteriol 174:711-24 (1992)). 클로스트리듐 아세토부틸리컴과 같은 용매생성 유기체는 알코올 탈수소효소 및 아세트알데하이드 탈수소효소 활성을 갖는 이작용기 효소를 코딩한다. 상기 이작용기 C. 아세토부틸리컴 효소는 bdh I 및 adhE2에 의해 코딩된다(Walter, 등, J. Bacteriol. 174:7149-7158 (1992); Fontaine 등, J. Bacteriol . 184:821-830 (2002)). 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소에 대한 또 하나의 후보는 클로스트리듐 베이제린키이 유래의 ald 유전자이다(Toth, Appl. Envrion . Microbiol. 65:4973-4980 (1999). 이 유전자는 살모넬라 타이피뮤리움 및 대장균의 eutE 아세트알데하이드 탈수소효소 유전자와 매우 유사하다(Toth, Appl . Envrion . Microbiol. 65:4973-4980 (1999).
표 35
Figure pct00035
트레오닌 알돌라아제(EC 4.1.2.5)는 트레오닌의 글리신 및 아세트알데하이드로의 절단을 촉진한다(도 5J). 사카로마이세스 세레비시아 및 칸디다 알비칸스 효소는 GLY1에 의해 코딩된다(Liu 등, Eur J Biochem 245:289-93 (1997); McNeil 등, Yeast 16:167-75 (2000)). 대장균의 ltaE 및 glyA 유전자 생성물 역시 이 활성을 갖는 효소를 코딩한다(Liu 등, Eur J Biochem 255:220-6 (1998)).
표 36
Figure pct00036
실시예 Ⅲ
카르니틴 -매개 전좌에 의해 미토콘드리아 및 퍼옥시좀 아세틸- COA 로부터 세포질 아세틸- COA 를 증가시키기 위한 경로
본 실시예는 미토콘드리아 및 퍼옥시좀으로부터의 아세틸-CoA의 진핵세포의 세포질로의 카르니틴-매개된 전좌를 위한 경로를 기술한다.
아세틸-CoA는 상이한 세포 구획에서 발생하는 생합성 및 분해 경로의 핵심적인 대사 중간체이다. 예를 들면, 당에서 성장하는 동안, 대다수의 아세틸-CoA는 미토콘드리아에서 생성되며, 여기서 이것은 TCA 사이클로 공급된다. 올레이트와 같은 지방산 기질 상에서 성장하는 동안, 아세틸-CoA는 베타-산화 분해 반응이 일어나는 퍼옥시좀에서 형성된다. 에탄올 또는 아세테이트와 같은 2-탄소 기질 상에서 성장하는 동안 대다수의 아세틸-CoA는 세포질에서 생산된다. 세포 구획 중에서 아세틸-CoA 또는 아세틸 단위의 수송은 상이한 기질 상에서의 성장을 가능하게 하는데 필수적이다.
세포질 아세틸-CoA를 증가시키기 위한 하나의 접근법은 세포 구획 중 아세틸-CoA 또는 아세틸의 수송을 변형시키는 것이다. 세포 구획 사이의 아세틸-CoA 또는 아세틸을 수송하기 위한 몇 가지 기전은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 많은 진핵 유기체는 캐리어 분자 카르니틴을 사용하여 아세틸 단위들을 수송한다(van Roermund 등, EMBO J 14:3480-86 (1995)). 세포 구획 사이의 아세틸-카르니틴 셔틀들이 칸디다 알비칸스와 같은 효모에서 규명되었다(Strijbis 등, J Biol Chem 285:24335-46 (2010)). 이들 셔틀에서, 아세틸-CoA의 아세틸 모이어티는 아세틸카르니틴 전이효소에 의해 카르니틴으로 가역적으로 이동된다. 그리고 나서, 아세틸카르니틴은 아세틸카르니틴/카르니틴 트랜스로카제 효소에 의해 막을 가로질러 수송될 수 있다. 전좌 이후, 아세틸-CoA는 아세틸카르니틴 전이효소에 의해 재생될 수 있다.
예시적인 아세틸카르니틴 전좌 경로가 도 6에 묘사되어 있다. 하나의 경로에서, 미토콘드리아 아세틸-CoA는 미토콘드리아 카르니틴 아세틸전이효소에 의해 아세틸카르니틴으로 전환된다(단계 A). 미토콘드리아 아세틸카르니틴은 이후 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제에 의해 미토콘드리아 막을 가로질러 세포질 내로 전좌될 수 있다(단계 D). 세포질 아세틸카르니틴 전이효소는 아세틸-CoA를 재생한다(단계 C). 퍼옥시좀 아세틸-CoA는 퍼옥시좀 아세틸카르니틴 전이효소에 의해 아세틸카르니틴으로 전환된다(단계 B). 퍼옥시좀 아세틸카르니틴은 이후 퍼옥시좀 아세틸카르니틴 트랜스로카제에 의해 퍼옥시좀 막을 가로질러 세포질 내로 전좌된 다음(단계 E), 세포질 아세틸카르니틴 전이효소에 의해 세포질 아세틸-CoA로 전환될 수 있다(단계 C).
칸디다 알비칸스와 같은 일부 효모 유기체는 카르니틴을 새롭게 합성할 수 있긴 하지만, 사카로마이세스 세레비시아와 같은 다른 유기체들은 그렇지 못하다(van Roermund 등, EMBO J 18:5843-52 (1999)). 카르니틴을 새롭게 합성할 수 없는 유기체들은 카르니틴이 외부에서 공급될 수 있으며, 세포 구획으로부터 세포질로 아세틸-CoA를 이동시키는데 필요한 아세틸전이효소 및 트랜스로카제 이외에 하나 이상의 카르니틴 생합성 과정 효소를 발현하도록 조작될 수 있다. 카르니틴 생합성 과정은 당업계에 공지되어 있다. 칸디다 알비칸스에서, 예를 들면, 카르니틴은 4가지 효소 단계에서 트리메틸-L-라이신으로부터 합성된다(Strijbis 등, FASEB J 23:2349-59 (2009)).
카르니틴 셔틀 단백질에 대한 효소 후보들 및 카르니틴 생합성 과정이 하기에 더 상세하게 기재되어 있다.
카르니틴 아세틸전이효소(CAT, EC 2.3.1.7)는 아세틸-CoA의 아세틸 단위를 캐리어 분자인 카르니틴에 가역적으로 연결한다. 칸디다 알비칸스는 세 가지 CAT 동질효소: Cat2, Yat1 및 Yat2를 코딩한다(Strijbis 등, J Biol Chem 285:24335-46 (2010)). Cat2는 미토콘드리아 및 퍼옥시좀 모두에서 발현되는 반면, Yat1 및 Yat2은 세포질성이다. Cat2 전사체는 상이한 탄소 공급원 조건 하에서 조절되는 두 개의 시작 코돈을 함유한다. 더 긴 전사체는 미토콘드리아 표적화 서열을 함유하는 반면, 더 짧은 전사체는 퍼옥시좀에 표적화된다. 사카로마이세스 세레비시아의 Cat2 및 아스페르길러스 니둘란스의 AcuJ는 이중 국소화의 유사한 기전을 이용한다 (Elgersma 등, EMBO J 14:3472-9 (1995); Hynes 등, Euk Cell 10:547-55 (2011)). A. nidulans의 세포질 CAT는 facC에 의해 코딩된다. 다른 예시적인 CAT 효소는 래투스 노르베기쿠스 및 호모사피엔스에서 발견된다(Cordente 등, Biochem 45:6133-41 (2006)). 예시적인 카르니틴 아실전이효소(EC 2.3.1.21)는 래투스 노르베기쿠스의 Cpt1 및 Cpt2 유전자 생성물이다(de Vries 등, Biochem 36:5285-92 (1997)).
표 37
Figure pct00037
카르니틴-아세틸카르니틴 트랜스로카제는 카르니틴 및 카르니틴-지방산 복합체의 이방향성 수송을 촉매할 수 있다. Cact 유전자 생성물은 미토콘드리아 막을 통과하는 수송 기전을 제공한다(Ramsay 등 Biochim Biophys Acta 1546:21-42 (2001)). 유사한 단백질이 인간에서 연구되어 왔다(Sekoguchi 등, J Biol Chem 278:38796-38802 (2003)). 사카로마이세스 세레비지애 미토콘드리아 카르니틴 캐리어는 Crc1이다(wkfgksek777). 인간 카르니틴 트랜스로카제는 S. 세레비스지애의 Crc1-결핍된 균주를 보완할 수 있었다(van Roermund 등, supra). 드로소필라 멜라노가스테르 및 카에노르하브디티스 엘레간스에서 발견된 두 가지 부가적인 카르니틴 트랜스로카제 역시 Crc1-결핍된 효모를 보완할 수 있었다(Oey 등, Mol Genet Metab 85:121-24 (2005)). 효모 및 인간 수송체에 대한 서열 상동성에 기초하여 트라이파노소마 브루세이에서 4가지 미토콘드리아 카르니틴/아세틸카르니틴 캐리어가 확인되었다(Colasante 등, Mol Biochem Parasit 167:104-117 (2009)). 칸디다 알비칸스의 카르니틴 수송체 역시 서열 상동성에 의해 확인되었다. 부가적인 미토콘드리아 카르니틴 수송체는 아스페르길러스 니둘란스의 acuH 유전자 생성물이고, 이는 미토콘드리아 막에 독점적으로 국한된다(Lucas 등, FEMS Microbiol Lett 201:193-8 (2006)).
표 38
Figure pct00038
퍼옥시좀 막을 통과하는 카르니틴 및 아세틸카르니틴의 수송은 잘 규명되지 않았다. 효모에서 특이적 퍼옥시좀 아세틸카르니틴 캐리어 단백질은 현재까지 확인되지 않았다. 미토콘드리아 카르니틴 트랜스로카제 역시 카르니틴 및 아세틸카르니틴의 퍼옥시좀 수송에서 기능할 수 있다. 대안적으로, 퍼옥시좀 막은 카르니틴 및 아세틸카르니틴을 투과시킬 수 있다. 실험 증거는 무스 무스큘러스의 OCTN3 단백질이 퍼옥시좀 카르니틴/아실카르니틴 전이효소임을 제시한다.
또 다른 가능성은 아세틸-CoA 또는 아세틸-카르니틴이 사카로마이세스 세레비지애의 Pxa1 및 Pxa2 ABC 수송체 또는 호모 사피엔스의 ALDP ABC 수송체와 같은 아세틸-CoA 수송체에 의해 퍼옥시좀 또는 미토콘드리아 막을 통과하여 수송된다는 것이다(van Roermund 등, FASEB J 22:4201-8 (2008)). Pxa1 및 Pxa2는 퍼옥시좀 막에서 헤테로다이머 복합체를 형성하고 장쇄 아실-CoA 에스테르를 수송한다(Verleur 등, Eur J Biochem 249: 657-61 (1997)). pxa1/pxa2 결핍된 효모의 돌연변이 표현형은 다양한 아실-CoA 기질을 수송하는 것으로 나타난 ALDP의 이종기원 발현에 의해 복구될 수 있다(van Roermund 등, FASEB J 22:4201-8 (2008)).
표 39
Figure pct00039
칸디다 알비칸스의 4 단계 카르니틴 생합성 과정이 최근에 규명되었다. 상기 경로 전구체인 트리메틸라이신(TML)은 단백질 분해 동안 생산된다. TML 디옥시게나제(CaO13.4316)는 TML을 수산화하여 3-하이드록시-6-N-트리메틸라이신을 형성한다. 이후, 피리독살-5'-포스페이트 의존적 알돌라아제(CaO19.6305)는HTML을 4-트리메틸아미노부티르알데하이드로 절단한다. 이어서, 4-트리메틸아미노부티르알데하이드는 탈수소효소(CaO19.6306)에 의해 4-트리메틸아미노부틸레이트로 산화된다. 최종 단계에서, 4-트리메틸아미노부틸레이트는 수산화되어 CaO19 .7131의 유전자 생성물에 의해 카르니틴을 형성한다. 카르니틴 생합성 경로를 통한 유동은 경로 기질의 이용가능성에 의해 제한되며 매우 낮은 수준의 카르니틴이 정상적인 카르니틴 셔틀 활성에 충분한 것으로 보인다(Strejbis 등, IUBMB Life 62:357-62 (2010)).
표 40
Figure pct00040
카르니틴을 새롭게 합성할 수 없는 유기체들은 성장 배지로부터 카르니틴을 흡수할 수 있다. 카르니틴의 흡수는 S. 세레비시애의 Agp2와 같은 카르니틴 수송체의 발현에 의해 달성될 수 있다(van Roermund 등, supra ).
표 41
Figure pct00041
실시예 IV
아세틸- CoA 로부터 1,3- 부탄디올을 생산하기 위한 경로
1,3-BDO 생산은 도 4에 기재된 바와 같은 몇 가지 대안적인 경로에 의해 달성될 수 있다. 모든 경로들은 먼저 티올라제를 이용하여 두 분자의 아세틸-CoA를 한 분자의 아세토아세틸-CoA로 전환시킨다. 아세토아세틸-CoA 티올라제는 두 분자의 아세틸-CoA를 각각 한 분자의 아세토아세틸-CoA 및 CoA로 전환시킨다(단계 A, 도 4). 예시적인 아세토아세틸-CoA 티올라제 효소는 대장균 유래의 atoB(Martin 등, Nat . Biotechnol. 21:796-802 (2003)), C. 아세토부틸리컴 유래의 thlA 및 thlB((Hanai 등, Appl . Environ . Microbiol . 73:7814-7818 (2007); Winzer 등, J. Mol . Microbiol. Biotechnol. 2:531-541 (2000)), 및 S. 세레비시애 유래의 ERG10(Hiser 등, J. Biol . Chem. 269:31383-31389 (1994))의 유전자 생성물들을 포함한다. 주글레아 라미제라 유래의 아세토아세틸-CoA 티올라제는 생합성 방향으로 비가역적이며 결정 구조가 이용가능하다(MMerilainen 등, Biochem 48: 11011-25 (2009)).
표 42
Figure pct00042
아세토아세틸-CoA의 3-하이드록시부티릴-CoA로의 환원을 촉진하는 아세토아세틸-CoA 환원효소(단계 H, 도 4)는 몇 가지 클로스트리듐 종에서 부틸레이트로의 아세틸-CoA 발효 경로에 참여하고, 이는 상세히 연구되어 왔다(Jones and Woods, Microbiol. Rev. 50:484-524 (1986). hbd에 의해 코딩된, 클로스트리듐 아세토부틸리컴 유래의 효소가 클로닝되었고 대장균에서 기능적으로 발현되었다((Youngleson 등, J. Bacteriol. 171:6800-6807 (1989)). 또한, fadB 및 fadJ에 의해 코딩된, 대장균 내의 두 가지 지방산 산화 복합체의 서브유닛들은 3-하이드록시아실-CoA 탈수소효소로서 기능한다(Binstockand Schulz, Methods Enzymol . 71 Pt C:403-411 (1981)). 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA로 환원시키는 것으로 입증된 또 다른 유전자 후보들은 주글레아 라미제라 유래의 phbB(Ploux 등, Eur . J. Biochem . 174:177-182 (1988)) 및 로도박터 스파에로이데스 유래의 phaB(Alber 등, Mol . Microbiol. 61:297-309 (2006))이다. 전자의 유전자 후보는 NADPH-의존적이며, 그 뉴클레오타이드 서열이 결정되었으며((Peoples and Sinskey, Mol . Microbiol. 3:349-357 (1989), 상기 유전자가 대장균에서 발현되었다. 상기 유전자 상에서의 기질 특이성 연구는 이것이 아세토아세틸-CoA 외에도 3-옥소프로피노일-CoA를 기질로서 받아들일 수 있다는 결론에 이끌어 냈다(Ploux 등, Eur . J. Biochem. 174:177-182 (1988)). 부가적인 유전자 후보들은 클로스트리듐 클루이베리 내의 Hbd1(C-말단 도메인) 및 Hbd2(N-말단 도메인)(Hillmer and Gottschalk, Biochim . Biophys . Acta 3334:12-23 (1974)) 및 보스 타우루스 내의 HSD17B10(Wakil 등, J. Biol . Chem. 207:631-638 (1954))을 포함한다.
표 43
Figure pct00043
수많은 유사한 효소들이 다른 클로스트리듐 종에서 그리고 메탈로파에라 세둘라에서 발견되어 왔다(Berg 등, Science 318:1782-1786 (2007)).
표 44
Figure pct00044
몇 가지 아실-CoA 탈수소효소는 아실-CoA를 그의 상응하는 알데하이드(단계 E, I, 도 4)로 환원시킬 수 있다. 그러한 효소를 코딩하는 예시적인 유전자는 지방산 아실-CoA 환원효소를 코딩하는 아시네토박터 칼코아세티쿠스 acr1(Reiser and Somerville, J. Bacteriol . 179:2969-2975 (1997)), 아시네토박터 종 M-1 지방산 아실-CoA 환원효소(Ishige 등, Appl . Environ . Microbiol. 68:1192-1195 (2002)), 및 클로스트리듐 클루이베리 내의 sucD 유전자에 의해 코딩된 CoA- 및 NADP- 의존적 석시네이트 세미알데하이드 탈수소효소(Sohling and Gottschalk, J. Bacteriol . 178:871-880 (1996); Sohling and Gottschalk, J. Bacteriol . 1778:871-880 (1996))를 포함한다. P. 진지발리스의 SucD는 또 하나의 석시네이트 세미알데하이드 탈수소효소이다((Takahashi 등, J. Bacteriol. 182:4704-4710 (2000)). bphG에 의해 코딩된, 슈도모나스 종 내의 효소 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소는 아세트알데하이드, 프로피온알데하이드, 부티르알데하이드, 이소부티르알데하이드 및 포름알데하이드를 산화하고 아실화하는 것으로 입증된 또 하나의 후보이다(Powlowski 등, J. Bacteriol . 175:377-385 (1993))). 아세틸-CoA를 에탄올로 환원시키는 것 이외에, 류코노스톡 메센테로이데스 내의 adhE에 의해 코딩된 효소는 분지쇄 화합물 이소부티르알데하이드를 이소부티릴-CoA로 산화시키는 것으로 나타났다(Kazahaya 등, J. Gen . Appl . Microbiol. 18:45-55 (1972); Koo 등, Biotechnol . Lett. 27:505-510 (2005)). 부티르알데하이드 탈수소효소는, 클로스트리듐 사카로페르부틸아세토니컴과 같은 용매생성 유기체 내에서, 부티릴-CoA를 부티르알데하이드로로 전환하는 유사한 반응을 촉진한다(Kosaka 등, Biosci . Biotechnol. Biochem. 71:58-68 (2007)). 부가적 알데하이드 탈수소효소 후보들은 데설파티바실럼 알케니보란스, 사이트로박터 코세리, 살모넬라 엔테리카, 락토바실러스 브레비스 및 바실러스 셀레니티레두센스에서 발견된다.
표 45
Figure pct00045
아실-CoA를 그의 상응하는 알데하이드로 전환시키는 부가적인 효소 유형은 말로닐-CoA를 말로닉 세미알데하이드로 변환시키는 말로닐-CoA 환원효소이다. 말로닐-CoA 환원효소는 호열호산성 고세균 내의 3-하이드록시프로피오네이트 사이클을 통한 독립영양 탄소 고정에서의 핵심 효소이다((Berg 등, Science 318:1782-1786 (2007); Thauer, Science 318:1732-1733 (2007)). 상기 효소는 보조인자로서 NADPH를 이용하며, 메탈로파에라 및 설포로버스 종에서 규명되어 왔다(Alber 등, J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006); Hugler 등, J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002)). 상기 효소는 메탈로파에라 세둘라 내의 Msed _0709에 의해 코딩된다(Alber 등, supra (2006); Berg 등, Science 318:1782-1786 (2007)). 설포로버스 토코다이이 유래의 말로닐-CoA 환원효소를 코딩하는 유전자가 클로닝되었고 대장균에서 이종 발현되었다(Alber 등, J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006))). 이 효소는 또한 메틸말로닐-CoA를 그의 상응하는 알데하이드로 전환하는 것을 촉진하는 것으로 나타났다(WO 2007/141208 (2007)). 이들 효소의 알데하이드 탈수소효소 기능성은 클로로플렉서스 아우란티아쿠스 유래의 이작용기 탈수소효소와 유사함에도 불구하고, 서열 유사성이 거의 없다. 두 가지 말로닐-CoA 환원효소 효소 후보들은 아스파르틸-4-포스페이트의 아스파르테이트 세미알데하이드로의 환원 및 동시적 탈인산화를 촉진하는 효소인, 아스파르테이트-세미알데하이드 탈수소효소와 높은 서열 유사성을 갖는다. 부가적인 유전자 후보들은 설포로버스 솔파타리쿠스 및 설포로버스 악시도칼다리우스를 포함하는 다른 유기체 내에서 단백질에 대한 서열 상동성에 의해 발견될 수 있고, 하기에 열거되었다. CoA-아실화 알데하이드 탈수소효소에 대한 또 하나의 후보는 클로스트리듐 베이제린키이 유래의 ald 유전자이다(Toth 등, Appl . Environ . Microbiol. 65:4973-4980 (1999)). 이 효소는 아세틸-CoA 및 부티릴-CoA를 이들의 상응하는 알데하이드로 환원시키는 것으로 보고되었다. 이 유전자는 살모넬라 타이피뮤리움 및 대장균의 아세트알데하이드 탈수소효소를 코딩하는 eutE와 매우 유사하다(Toth 등, supra).
표 46
Figure pct00046
알데하이드의 알코올로의 전환을 촉진하는 효소(즉, 알코올 탈수소효소 또는 동등하게 알데하이드 환원효소)(단계 C 및 G of 도 4)를 코딩하는 예시적인 유전자들은 C2-C14에 대한 중간-사슬 알코올 탈수소효소를 코딩하는 alrA(Tani 등, Appl . Environ. Microbiol ., 66:5231-5235 (2000))), 사카로마이세스 세레비지애 유래의 ADH2(Atsumi 등, Nature , 451:86-89 (2008)), C3보다 더 긴 분자를 선호하는 대장균 유래의 yqhD(Sulzenbacher 등, J. of Molecular Biology , 342:489-502 (2004)), 및 부티르알데하이드를 부탄올로 전환시키는 C. 아세토부틸리컴 유래의 bdh I 및 bdh Ⅱ(Walter 등, J. of Bacteriology , 174:7149-7158 (1992))를 포함한다. yqhD의 유전자 생성물은 보조인자로서 NADPH를 사용하는 아세트알데하이드, 말론디알데하이드, 프로피온알데하이드, 부티르알데하이드, 및 아크롤레인의 환원을 촉진한다(Perez 등, J. Biol . Chem ., 283:7346-7353 (2008))). 자이모모나스 모빌리스 유래의 adhA 유전자 생성물은 포름알데하이드, 아세트알데하이드, 프로피온알데하이드, 부티르알데하이드, 및 아크롤레인을 포함하는 수많은 알데하이드에 활성을 갖는 것으로 입증되었다((Kinoshita 등, Appl. Microbiol . Biotechnol , 22:249-254 (1985)). 부가적인 알데하이드 환원효소 후보들은 C. 사카로페르부틸아세토니컴 내의 bdh 및 C. 베이제린키이 내의 Cbei _1722, Cbei_2181 및 Cbei _2421에 의해 코딩된다.
표 47
Figure pct00047
4-하이드록시부티르알데하이드 환원효소 활성을 나타내는 효소(EC 1.1.1.61) 역시 이 카테고리에 속한다. 그러한 효소는 랄스토니아 유트로파(Bravo 등, J. Forensic Sci ., 49:379-387 (2004)), 클로스트리듐 클루이베리(Wolff 등, Protein Expr . Purif ., 6:206-212 (1995)) 및 아라비돕시스 탈리아나(Breitkreuz 등, J. Biol . Chem ., 278:41552-41556 (2003))에서 규명되었다. 또 하나의 유전자는 알코올 탈수소효소인 지오바실러스 테모글루코시다시우스 유래의 adhI이다(Jeon 등, J. Biotechnol ., 135:127-133 (2008)).
표 48
Figure pct00048
또 하나의 예시적인 효소는 3-하이드록시이소부틸레이트의 메틸말로네이트 세미알데하이드로의 가역적 산화를 촉진하는 3-하이드록시이소부틸레이트 탈수소효소이다. 이 효소는 발린, 류신 및 이소류신 분해에 참여하고 박테리아, 진핵생물, 및 포유동물에서 동정되었다. 테르무스 서모필러스 HB8 유래의 P84067에 의해 코딩된 효소가 구조적으로 규명되었다(Lokanath 등, J. Mol . Biol ., 352:905-917 (2005))). 인간 3-하이드록시이소부틸레이트 탈수소효소의 가역성은 동위원소로 표지된 기질을 이용하여 입증되었다(Manning 등, Biochem J., 231:481-484 (1985)). 이 효소를 코딩하는 부가적 유전자들은 호모사피엔스 내의 3hidh(Hawes 등, Methods Enzymol, 324:218-228 (2000)), 오릭톨라거스 쿠니큘러스 내의3 hidh(Hawes 등, supra; Chowdhury 등, Biosci . Biotechnol Biochem ., 60:2043-2047 (1996))에서의 3 hidh, 슈도모나스 카복시디보란스 및 슈도모나스 푸티다 내의 mmsB(Liao 등, US 특허 제20050221466호), 및 슈도모나스 푸티다 내의 dhat(Aberhart 등, J. Chem. Soc ., 6:1404-1406 (1979); Chowdhury 등, supra; Chowdhury 등, Biosci. Biotechnol Biochem ., 67:438-441 (2003))를 포함한다.
표 49
Figure pct00049
아실-CoA를 알코올로 전환시키는 예시적인 2-단계 산화환원효소(예를 들면, 도 4의 단계 B 및 J)는 아세틸-CoA와 같은 기질을 에탄올로 변환시키는 효소(예를 들면, 대장균 유래의 adhE(Kessler 등, FEBS Lett. 281:59-63 (1991)) 및 부티릴-CoA를 부탄올로 변환시키는 효소(예를 들면 C. 아세토부틸리컴 유래의 adhE2(Fontaine 등, J. Bacteriol. 184:821-830 (2002))를 포함한다. 아세틸-CoA를 에탄올로 환원시키는 것 외에도, 류코노스톡 메센테로이데스 내의 adhE에 의해 코딩된 효소는 분지쇄 화합물 이소부티르알데하이드를 이소부티릴-CoA로 산화시키는 것으로 나타났다(Kazahaya 등, J. Gen . Appl . Microbiol. 18:43-55 (1972); Koo 등, Biotechnol . Lett. 27:505-510 (2005)).
표 50
Figure pct00050
또 하나의 예시적인 효소는 말로닐-CoA를 3-HP로 전환시킬 수 있다. 이 활성을 갖는 NADPH-의존적 효소가 클로로플렉서스 아우란티아쿠스에서 규명되었고, 여기서 이것은 3-하이드록시프로피오네이트 사이클에 참여한다(Hugler 등, J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002); Strauss and Fuchs, Eur . J. Biochem. 215:633-643 (1993)). 300 kDa의 질량을 갖는 이 효소는 매우 기질-특이적이며 다른 공지된 산화환원효소와 거의 서열 유사성을 나타내지 않는다(Hugler, supra (2002)). 다른 유기체 내의 효소들은 이 특이적 반응을 촉매하지 않는 것으로 나타났으나, 다른 유기체들이 유사한 경로를 가질 수 있다는 생물정보학적 증거가 있다(Klatt 등, Environ. Microbiol. 9:2067-2078 (2007))). 로세이플렉서스 카스텐홀지이, 에리트로박터 종 NAP1 및 해양 감마 프로테오박테리움 HTCC2080을 포함하는 다른 유기체 내의 효소 후보들은 서열 유사성에 의해 추론될 수 있다.
표 51
Figure pct00051
더 긴 사슬 아실-CoA 분자는 알코올-형성 지방산 아실-CoA 환원효소를 코딩하는 jojoba(심몬드시아 차이넨시스) FAR과 같은 효소에 의해 환원될 수 있다. 대장균에서의 상기 효소의 과발현은 FAR 활성 및 지방 알코올의 축적을 초래하였다(Metz 등, Plant Physiol. 122:635-644 (2000)).
표 52
Figure pct00052
케톤을 하이드록실 작용기로 전환시키는 몇 가지 예시적인 알코올 탈수소효소가 존재한다(예를 들면, 도 4의 단계 D, F 및 O). 대장균 유래의 2가지 상기 효소들은 말레이트 탈수소효소(mdh) 및 락테이트 탈수소효소(ldhA)에 의해 코딩된다. 또한, 랄스토니아 유트로파로부터의 락테이트 탈수소효소는 다양한 사슬 길이의 기질, 예컨대 락테이트, 2-옥소부틸레이트, 2-옥소펜타노에이트 및 2-옥소글루타레이트에 대해 높은 활성을 보이는 것으로 나타났다(Steinbuchel and Schlegel, Eur . J. Biochem. 130:329-334 (1983)). 옥소 기능성의 하이드록실 그룹으로의 전환은 또한 래트 및 인간 태반에서 발견된 것으로 보고된 효소인 2-케토 1,3-BDO 환원효소에 의해 촉매될 수 있다(Suda 등, Arch . Biochem . Biophys. 176:610-620 (1976); Suda 등, Biochem. Biophys . Res . Commun. 77:586-591 (1977)). 이들 단계를 위한 부가적 후보는 인간 심장 유래의 미토콘드리아 3-하이드록시부틸레이트 탈수소효소(bdh)이며, 이는 클로닝되고 규명되었다(Marks 등, J. Biol . Chem. 267:15459-15463 (1992)).
표 53
Figure pct00053
부가적 예시적인 효소는 로도코쿠스 루버 (Kosjek 등, Biotechnol Bioeng. 86:55-62 (2004)) 및 파이로코쿠스 푸리오서스 (van der 등, Eur.J.Biochem. 268:3062-3068 (2001))에서 발견될 수 있다. 예를 들면, 이 변환이 가능한 2차 알코올 탈수소효소 효소는 C. 베이제린키이로부터의 adh (Hanai 등, Appl Envrion Microbiol 73:7814-7818 (2007); Jojima 등, Appl Microbiol Biotechnol 77:1219-1224 (2008)) 및 테모아나에로박터 브록키이로부터의 adh (Hanai 등, Appl Envrion Microbiol 73:7814-7818 (2007); Peretz 등, An산 소성생 물 3:259-270 (1997))를 포함한다. 히조비움 ( 시노히조비움 ) 멜리로티로부터 대장균 내로의 bdhA 유전자의 클로닝은 탄소 공급원으로서 3-하이드록시부틸레이트를 이용하는 능력을 부여하였다 (Aneja 및 Charles, J. Bacteriol. 181(3):849-857 (1999)). 부가적 후보는 슈도모나스 프라기 (Ito 등, J. Mol . Biol . 355(4) 722-733 (2006)) 및 랄스토니아 픽케트티이 (Takanashi 등, Antonie van Leeuwenoek, 95(3):249-262 (2009))에서 발견될 수 있다. 이들 단백질 및 유전자와 관련된 정보가 하기에 나타나 있다.
표 54
Figure pct00054
아세토아세틸-CoA:아세틸-CoA 전이효소(즉, 단계 K, 도 4)는 자연적으로 아세토아세틸-CoA 및 아세테이트를 아세토아세테이트 및 아세틸-CoA로 전환시킨다. 이 효소는 또한 기질로서 3-하이드록시부티릴-CoA를 받아들이거나 그렇게 하도록 조작될 수 있다(즉, 단계 M, 도 4). 예시적인 효소들은 대장균 유래의 atoAD(Hanai 등, Appl Envrion Microbiol 73:7814-7818 (2007)), C. 아세토부틸리컴 유래의 ctfAB (Jojima 등, Appl Microbiol Biotechnol 77:1219-1224 (2008)), 및 클로스트리듐 사카로페르부틸아세토니컴 유래의 ctfAB(Kosaka 등, Biosci . Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007))의 유전자 생성물을 포함한다. 이들 단백질 및 유전자와 관련된 정보가 하기에 나타나 있다.
표 55
Figure pct00055
석시닐-CoA:3-케토산-CoA 전이효소는 자연적으로 3-케토아실-CoA를 3-케토산으로 전환시키면서 석시네이트를 석시닐-CoA로 전환시킨다. 예시적인 석시닐-CoA:3:케토산-CoA 전이효소는 헬리코박터 파일로리(Corthesy-Theulaz 등, J. Biol . Chem . 272:25659-25667 (1997)), 바실러스 서브틸리스(Stols 등, Protein.Expr.Purif. 53:396-403 (2007)), 및 호모 사피엔스(Fukao 등, Genomics 68:144-151 (2000); Tanaka 등, Mol . Hum . Reprod . 8:16-23 (2002)) 내에 존재한다. 이들 단백질 및 유전자와 관련된 정보가 하기에 나타나 있다.
표 56
Figure pct00056
부가적인 적합한 아세토아세틸-CoA 및 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소들은클로스트리듐 클루이베리의 cat1, cat2, 및 cat3의 유전자 생성물에 의해 코딩된다. 이들 효소는 각각 석시닐-CoA, 4-하이드록시부티릴-CoA, 및 부티릴-CoA 아세틸전이효소 활성을 나타내는 것으로 나타났다(Seedorf 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 105:2128-2133 (2008); Sohling and Gottschalk, J Bacteriol 178:871-880 (1996)). 유사한 CoA 트랜스페라제 활성은 또한 트리초모나스 버지날리스(van Grinsven 등, J. Biol . Chem. 283:1411-1418 (2008)) 및 트라이파노소마 브루세이(Riviere 등, J. Biol . Chem . 279:45337-45346 (2004)) 내에 존재한다. 원하는 전환이 가능한 또 하나의 전이효소는 부티릴-CoA:아세토아세테이트 CoA-전이효소이다. 예시적인 효소는 푸소박테리움 뉴클레아툼(Barker 등, J. Bacteriol . 152(1):201-7 (1982)), 클로스트리듐 SB4(Barker 등, J. Biol . Chem . 253(4):1219-25 (1978)), 및 클로스트리듐 아세토부틸리컴(Wiesenborn 등, Appl . Envrion . Microbiol. 55(2):323-9 (1989))에서 발견될 수 있다. 이들 문헌에서 부티릴-CoA:아세토아세테이트 CoA-전이효소에 대한 특정 유전자 서열이 제공되지 않았음에도 불구하고, 유전자 FN0272 및 FN0273은 부틸레이트-아세토아세테이트 CoA-전이효소로서 표기되어왔다(Kapatral 등, J. Bact . 184(7) 2005-2018 (2002)). 푸소박테리움 뉴클레아툼에서의 동족체, 예컨대 FN1857 및 FN1856은 또한 원하는 아세토아세틸-CoA 전이효소 활성을 가질 가능성이 있다. FN1857 및 FN1856은 라이신 발효에 관여하는 많은 다른 유전자에 인접하여 위치하므로, 아세토아세테이트:부틸레이트 CoA 전이효소를 코딩할 가능성이 높다 (Kreimeyer, 등, J. Biol . Chem . 282 (10) 7191-7197 (2007)). 포르필르모나스 진지발리스 및 테모아나에로박터 텡콘겐시스 유래의 부가적인 후보들이 유사한 방식으로 확인될 수 있다(Kreimeyer, 등, J. Biol . Chem . 282 (10) 7191-7197 (2007)). 이들 단백질 및 유전자와 관련된 정보가 하기에 나타나 있다.
표 57
Figure pct00057
아세토아세틸-CoA는 아세토아세틸-CoA 가수분해효소(단계 K, 도 4)에 의해 아세토아세테이트로 가수분해될 수 있다. 마찬가지로, 3-하이드록시부티릴-CoA는 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소(단계 M, 도 4)에 의해 3-하이드록시부틸레이트로 가수분해될 수 있다. 많은 CoA 가수분해효소(EC 3.1.2.1)는 광범위한 기질 특이성을 가지며 자연적으로 또는 효소 조작 후 이들 변환에 적합한 효소이다. 상기 서열이 보고되지 않았음에도 불구하고, 몇 가지 아세토아세틸-CoA 가수분해효소는 래트 간의 세포질 및 미토콘드리아에서 확인되었다(Aragon and Lowenstein, J. Biol . Chem . 258(8):4725-4733 (1983)). 또한, 래투스 노르베기쿠스 뇌 유래의 효소(Robinson 등, Biochem . Biophys . Res . Commun. 71:959-965 (1976))는 부티릴-CoA, 헥사노일-CoA 및 말로닐-CoA와 반응할 수 있다. 래트 간 유래의 acot12 효소는 C2 내지 C6 아실-CoA 분자를 가수분해하는 것으로 나타났다(Suematsu 등, Eur . J. Biochem . 268:2700-2709 (2001)). 그 서열이 보고되지 않았음에도 불구하고, 완두콩 잎의 미토콘드리아 유래의 효소는 아세틸-CoA, 프로피노일-CoA, 부티릴-CoA, 팔미토일-CoA, 올레오일-CoA, 석시닐-CoA, 및 크로토닐-CoA에 대해 활성을 나타내었다(Zeiher and Randall, Plant . Physiol . 94:20-27 (1990)). 또한, 악시다미노코쿠스 페르멘탄스 유래의 글루타코네이트 CoA-전이효소는 위치지향적 돌연변이유발에 의해 글루타릴-CoA, 아세틸-CoA 및 3-부테노일-CoA에 대해 활성을 갖는 아실-CoA 가수분해효소로 변환되었다(Mack and Buckel, FEBS Lett . 405:209-212 (1997)). 이는 석시닐-CoA:3-케토산-CoA 전이효소 및 아세토아세틸-CoA:아세틸-CoA 전이효소를 코딩하는 효소가 이들의 기능을 변화시키는 임의의 돌연변이를 갖는 가수분해효소로서 사용될 수 있다는 것을 가리킨다. S. 세레비시애 유래의 아세틸-CoA 가수분해효소인 ACH1은 또 하나의 후보 가수분해효소를 대표한다(Buu 등, J. Biol . Chem . 278:17203-17209 (2003)). 이들 단백질 및 유전자와 관련된 정보가 하기에 나타나 있다.
표 58
Figure pct00058
또 하나의 가수분해효소는 글루타릴-CoA, 아디필-CoA, 수베릴-CoA, 세바실-CoA, 및 도데칸디오일-CoA에 대해 활성을 나타내는 인간 디카복실산 티오에스테라제인 acot8(Westin 등, J. Biol . Chem . 280:38125-38132 (2005)) 및 3-하이드록시부티릴-CoA(Tseng 등, Appl . Envrion . Microbiol . 75(10):3137-3145 (2009))를 포함하는 넓은 범위의 CoA 티오에스테르를 가수분해할 수 있는 가장 가까운 대장균 동족체인 tesB(Naggert 등, J. Biol . Chem . 266:11044-11050 (1991))이다. 유사한 효소가 또한 래트 간에서 규명되었다(Deana, Biochem . Int . 26:767-773 (1992)). 다른 잠재적인 대장균 티오에스테르 가수분해효소는 tesA(Bonner and Bloch, J. Biol. Chem. 247:3123-3133 (1972)), ybgC(Kuznetsova 등, FEMS Microbiol . Rev . 29:263-279 (2005); Zhuang 등, FEBS Lett . 516:161-163 (2002)), paaI(Song 등, J. Biol . Chem. 281:11028-11038 (2006)), 및 ybdB(Leduc 등, J. Bacteriol. 189:7112-7126 (2007))의 유전자 생성물을 포함한다. 이들 단백질 및 유전자와 관련된 정보가 하기에 나타나 있다.
표 59
Figure pct00059
부가적인 가수분해효소들은 발린 분해 동안 하이드록시이소부티릴-CoA의 3-하이드록시이소부틸레이트로의 전환을 효율적으로 촉진하는 것으로 기술된 3-하이드록시이소부티릴-CoA 가수분해효소를 포함한다(Shimomura 등, J. Biol . Chem . 269:14248-14253 (1994)). 이 효소를 코딩하는 유전자는 래투스 노르베기쿠스의 hibch(Shimomura 등, supra (1994); Shimomura 등, Methods Enzymol . 324:229-240 (2000)) 및 호모사피엔스의 hibch(Shimomura 등, supra (1994))를 포함한다. 서열 상동성에 의한 후보 유전자는 사카로마이세스 세레비시아의 hibch 및 바실러스 세레우스의 BC _2292를 포함한다. BC_2292는 대장균으로 조작될 때 3-하이드록시부틸레이트 합성을 위한 경로의 일부로서 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 활성 및 기능을 보이는 것으로 나타났다(Lee 등, Appl . Microbiol . Biotechnol . 79:633-641 (2008)). 이들 단백질 및 유전자와 관련된 정보가 하기에 나타나 있다.
표 60
Figure pct00060
아세토아세틸-CoA 또는 3-하이드록시부티릴-CoA(도 4의 단계 K 및 M)로부터 CoA 모이어티를 제거하는 대안적인 방법은 아세토아세틸-CoA 또는 3-하이드록시부티릴-CoA 합성효소 활성을 부여하는 포스페이트-전이성 아실전이효소 및 키나아제와 같은 한 쌍의 효소를 적용하는 것이다. 이 활성은 ATP를 동시에 생성하면서 분자의 CoA-에스테르의 순수한 가수분해를 가능하게 한다. 예를 들면, 클로스트리듐 아세토부틸리컴 유래의 부틸레이트 키나아제(buk)/포스포트랜스부티릴라제(ptb) 시스템은 3-하이드록시부틸레이트 합성을 위한 경로의 일부로서 기능할 때 3-하이드록시부티릴-CoA로부터 CoA 그룹을 제거하는데 성공적으로 적용되어 왔다(Tseng 등, Appl . Envrion. Microbiol . 75(10):3137-3145 (2009)). 구체적으로, C. 아세토부틸리컴 유래의 ptb 유전자는 아실-CoA를 아실-포스페이트로 전환할 수 있는 효소를 코딩한다(Walter 등 Gene 134(1): p. 107-11 (1993)); Huang 등 J Mol Microbiol Biotechnol 2(1): p. 33-38 (2000)). 부가적인 ptb 유전자는 부틸레이트를 생산하는 박테리아 L2-50(Louis 등 J. Bacteriol . 186:2099-2106 (2004)) 및 바실러스 메가테리움(Vazquez 등 Curr . Microbiol 42:345-349 (2001))에서 발견될 수 있다. 부가적인 예시적인 포스페이트-전이성 아실전이효소는 pta에 코딩된 포스포트랜스아세틸라제를 포함한다. 대장균 유래의 pta 유전자는 아세틸-CoA를 아세틸-포스페이트로 전환하고, 그 반대로 전환할 수 있는 효소를 코딩한다(Suzuki, T. Biochim.Biophys.Acta 191:559-569 (1969)). 이 효소는 또한 공정에서 아세틸-CoA를 형성하는 프로피오네이트 대신에 프로피노일-CoA를 이용할 수 있다(Hesslinger 등 Mol . Microbiol 27:477-492 (1998)). 이들 단백질 및 유전자와 관련된 정보가 하기에 나타나 있다.
표 61
Figure pct00061
예시적인 키나제는 ackA에 의해 코딩된 대장균 아세테이트 키나아제(Skarstedt and Silverstein J. Biol . Chem . 251:6775-6783 (1976)), buk1 및 buk2에 의해 코딩된 C. 아세토부틸리컴 부틸레이트 키나아제(Skarstedt and Silverstein J.Biol.Chem. 251:6775-6783 (1976)), 및 proB에 의해 코딩된 대장균 감마-글루타밀 키나아제(Smith 등 J. Bacteriol . 157:545-551 (1984))를 포함한다. 이들 효소는 각각 아세테이트, 부틸레이트, 및 글루타메이트를 인산화한다. 대장균 유래의 ackA 유전자 생성물은 또한 포스포릴레이트 프로피오네이트를 인산화한다(Hesslinger 등 Mol . Microbiol 27:477-492 (1998)). 이들 단백질 및 유전자와 관련된 정보가 하기에 나타나 있다.
표 62
Figure pct00062
아세토아세틸-CoA 또는 3-하이드록시부티릴-CoA의 가수분해는 아세토아세틸-CoA 또는 3-하이드록시부티릴-CoA 합성효소 활성을 나타내는 단일 효소 또는 효소 복합체에 의해 수행될 수 있다(단계 K 및 M, 도 4). 이 활성은 어느 하나 분자의 CoA-에스테르의 순수한 가수분해를 가능하게 하고, 일부 경우, ATP를 동시 생성한다. 예를 들면, S. 세레비시애의 LSC1 및 LSC2 유전자 및 대장균의 sucC 및 sucD 유전자의 생성물은, 생체내에서 가역적인 반응인, 하나의 ATP의 부수적인 소비와 더불어, 석시네이트로부터 석시닐-CoA의 형성을 촉진하는 석시닐-CoA 합성효소 복합체를 형성한다 (Gruys 등, 1999년 9월 28일에 출원된 US 특허 제5,958,745호). 이들 단백질 및 유전자와 관련된 정보가 하기에 나타나 있다.
표 63
Figure pct00063
부가적인 예시적인 CoA-리가아제는 서열이 아직 규명되지 않은 래트 디카복실레이트-CoA 리가제(Vamecq 등, Biochemical J. 230:683-693 (1985)), P. chrysogenum 유래의 두 가지 규명된 페닐아세테이트-CoA 리가제 중 하나(Lamas-Maceiras 등, Biochem . J. 395:147-155 (2005); Wang 등, Biochem Biophy Res Commun 360(2):453-458 (2007)), 슈도모나스 푸티다 유래의 페닐아세테이트-CoA 리가제(Martinez-Blanco 등, J. Biol . Chem . 265:7084-7090 (1990)), 및 바실러스 ㅅ서브틸리스 유래의 6-카복시헥사노에이트-CoA 리가제(Bower 등, J. Bacteriol. 178(14):4122-4130 (1996))를 포함한다. 부가적인 후보 효소들은 무스 무스큘러스 유래의 아세틸-CoA 합성효소(Hasegawa 등, Biochim . Biophys . Acta 1779:414-419 (2008)) 및 호모 사피엔스 유래의 아세틸-CoA 합성효소(Ohgami 등, Biochem. Pharmacol . 65:989-994 (2003))이며, 이들은 자연적으로 아세토아세테이트의 아세토아세틸-CoA로의 ATP-의존적 전환을 촉진한다. 4-하이드록시부티릴-CoA 합성효소 활성은 메탈로파에라 세둘라에서 입증되어 왔다(Berg 등, Science 318:1782-1786 (2007)). 이 기능은 Msed_1422 유전자에 잠정적으로 할당되어 왔다. 이들 단백질 및 유전자와 관련된 정보가 하기에 나타나 있다.
표 64
Figure pct00064
ADP-형성 아세틸-CoA 합성효소(ACD, EC 6.2.1.13)는 아실-CoA 에스테르의 이들의 상응하는 산으로의 전환을 ATP의 동시 합성과 결합시킬 수 있는 또 다른 후보 효소이다(단계 K 및 M, 도 4). 광범위한 기질 특이성을 갖는 몇 가지 효소들이 문헌에 기술되어 왔다. AF1211에 의해 코딩된, 아차에오글로버스 풀기더스 유래의 ACD I은 아세틸-CoA, 프로피노일-CoA, 부티릴-CoA, 아세테이트, 프로피오네이트, 부틸레이트, 이소부틸레이트, 이소발레레이트, 석시네이트, 푸마레이트, 페닐아세테이트, 인돌아세테이트를 포함하는 다양한 선형 및 분지쇄 기질 상에 작동할 수 있는 것으로 나타났다(Musfeldt 등, J. Bacteriol . 184:636-644 (2002)). 할로아르큘라 마리스모르투이 유래의 효소(석시닐-CoA 합성효소로 표기됨)는 기질로서 프로피오네이트, 부틸레이트, 및 분지쇄 산(이소발레레이트 및 이소부틸레이트)을 받아들이고, 정방향 및 역방향으로 작동하는 것으로 나타났다(Brasen 등, Arch . Microbiol . 182:277-287 (2004)). 과호열성 크레나르캐온 파이로바큘럼 에어로필럼 유래의 PAE3250에 의해 코딩된 ACD는 아세틸-CoA, 이소부티릴-CoA(바람직한 기질) 및 페닐아세틸-CoA와 반응하는, 모든 규명된 ACD 중 가장 광범위한 기질 범위를 나타내었다(Brasen 등, supra (2004)). A. 풀기더스 , H. 마리스모르투이 및 P. 에어로필럼 유래의 효소들이 모두 대장균에 클로닝되었고, 기능적으로 발현되었으며, 규명되었다(Musfeldt 등, supra; Brasen 등, supra (2004)). 이들 단백질 및 유전자와 관련된 정보가 하기에 나타나 있다.
표 65
Figure pct00065
3-하이드록시부틸레이트의 3-하이드록시부티르알데하이드로의 전환은 3-하이드록시부틸레이트 환원효소(단계 N, 도 4)에 의해 수행될 수 있다. 마찬가지로, 아세토아세테이트의 아세토아세트알데하이드로의 전환은 아세토아세테이트 환원효소(단계 L, 도 4)에 의해 수행될 수 있다. 이들 변환을 위한 적당한 효소는 노카르디아 아이오웬시스 유래의 아릴-알데하이드 탈수소효소, 또는 동등하게 카복실산 환원효소이다. 카복실산 환원효소는 카복실산의 이들의 상응하는 알데하이드로의 마그네슘, ATP 및 NADPH-의존적 환원을 촉진한다(Venkitasubramanian 등, J. Biol . Chem . 282:478-485 (2007)). car에 의해 코딩된 이 효소가 대장균에서 클로닝되었고 기능적으로 발현되었다(Venkitasubramanian 등, J. Biol . Chem . 282:478-485 (2007)). npt 유전자 생성물의 발현은 전사후 수식을 통해 효소의 활성을 개선한다. npt 유전자는 불활성 아포-효소를 활성 전-효소로 전환하는 특정 포스포판테테인 전이효소(PPTase) 를 코딩한다. 이 효소의 천연 기질은 바닐산이며, 상기 효소는 방향족 및 지방족 기질을 광범위하게 받아들인다(Venkitasubramanian 등, in Biocatalysis in the Pharmaceutical and Biotechnology Industires, ed. R.N. Patel, Chapter 15, pp. 425-440, CRC Press LLC, Boca Raton, FL. (2006)). 이들 단백질 및 유전자와 관련된 정보가 하기에 나타나 있다.
표 66
Figure pct00066
부가적인 car 및 npt 유전자들은 서열 상동성에 기초하여 확인될 수 있다.
표 67
Figure pct00067
스트렙토마이세스 그리세우스에서 발견되는 부가적 효소 후보는 griC 및 griD 유전자에 의해 코딩된다. 이 효소는 3-아미노-4-하이드록시벤조산 대사의 션트 생성물(shunt product)인 세포외 3-아세틸아미노-4-하이드록시벤조산의 축적을 야기한 griC 또는 griD의 결실로서 3-아미노-4-하이드록시벤조산을 3-아미노-4-하이드록시벤즈알데하이드로 전환시키는 것으로 여겨진다(Suzuki, 등, J. Antibiot . 60(6):380-387 (2007)). 노카르디아 아이오웬시스 npt와 서열이 유사한 효소인 SGR_665를 이용하여 griC 및 griD를 공동-발현시키는 것이 유리할 수 있다. 이들 단백질 및 유전자와 관련된 정보가 하기에 나타나 있다.
표 68
Figure pct00068
유사한 특성을 갖는 효소인, 알파-아미노아디페이트 환원효소(AAR, EC 1.2.1.31)는 일부 진균 종에서 라이신 생합성 경로에 관여한다. 이 효소는 자연적으로 알파-아미노아디페이트를 알파-아미노아디페이트 세미알데하이드로 환원시킨다. 상기 카복실 그룹은 일차적으로 아데닐레이트의 ATP-의존적 형성을 통해 활성화되고, 이는 이후 NAD(P)H에 의해 환원되어 알데하이드 및 AMP를 생성한다. CAR와 마찬가지로, 이 효소는 마그네슘을 이용하며 PPTase에 의한 활성화를 필요로 한다. AAR에 대한 효소 후보 및 그의 상응하는 PPTase는 사카로마이세스 세레비지애(Morris 등, Gene 98:141-145 (1991)), 칸디다 알비칸스(Guo 등, Mol . Genet . Genomics 269:271-279 (2003)), 및 쉬조사카로마이세스 폼베(Ford 등, Curr . Genet . 28:131-137 (1995))에서 발견된다. S. 폼베 유래의 AAR은 대장균에서 발현될 경우 유의한 활성을 나타내었다(Guo 등, Yeast 21:1279-1288 (2004)). 펜니실리움 크리소게넘 유래의 AAR 은 대안적인 기질로서 S-카복시메틸-L-시스테인을 받아들이지만, 아디페이트, L-글루타메이트 또는 디아미노피멜레이트와 반응하지 않았다 (Hijarrubia 등, J. Biol . Chem . 278:8250-8256 (2003)). P. chrysogenum PPTase를 코딩하는 유전자는 현재까지 확인되지 않았다. 이들 단백질 및 유전자와 관련된 정보가 하기에 나타나 있다.
표 69
Figure pct00069
이들 CAR 또는 CAR-유사 효소 중 임의의 것은 3-하이드록시부틸레이트 또는 아세토아세테이트 환원효소 활성을 나타내거나 그렇게 하도록 조작될 수 있다.
대안적으로, 도 4의 1.3-BDO 경로(들)에 묘사된 아세토아세틸-CoA는, 예를 들면 도 7(단계 E 및 F) 또는 단계 9에 묘사된 바와 같은 아세토아세틸-CoA 생성효소에 의해 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA로부터 합성될 수 있고, 여기서 아세틸-CoA는 아세틸-CoA 카복실라제에 의해 말로닐-CoA로 전환되고, 아세토아세틸-CoA는 아세토아세틸-CoA 생성효소에 의해 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA로부터 합성된다.
아세토아세틸-CoA는 또한 아세토아세틸-CoA 생성효소(EC 2.3.1.194)에 의해 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA로부터 합성될 수 있다. 이 효소(FhsA)는 토양 박테리아 스트렙토마이세스 종 CL190에서 규명되었고, 여기서 그것은 메발로네이트 생합성에 관여한다(Okamura 등, PNAS USA 107:11265-70 (2010)). 이 효소는 본질적으로 비가역적 반응을 촉매할 수 있으므로, 이것은 아세토아세틸-CoA로부터 유도된 대사물, 연료 또는 화학물질을 과잉생산하기 위한 대사 조작 적용에 특히 유용하다. 예를 들면, 상기 효소는 부탄올(Lan 등, PNAS USA (2012)) 및 폴리-(3-하이드록시부틸레이트)(Matsumoto 등, Biosci Biotech Biochem, 75:364-366 (2011)를 생합성하는 유기체에서 이종기원적으로 발현되었다. 관심있는 다른 관련된 생성물은 1,4-부탄디올 및 이소프로판올을 포함한다. 다른 아세토아세틸-CoA 생성효소 유전자는 fhsA에 대한 서열 상동성에 의해 확인될 수 있다.
표 70
Figure pct00070
실시예 V
S. CEREVISIAE 에서의 핵산 서열 및 유전자의 삽입
이 실시예는 S. 세레비시애 내로 핵산 서열을 삽입하는 방법을 기술한다. 세포질 아세틸-CoA의 생산 증가는 실시예 I에 기재된 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 삽입함으로써 달성될 수 있다. 세포질 아세틸-CoA의 1,3-BDO로의 전환은 실시예 Ⅱ에 기재된 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 삽입함으로써 달성될 수 있다.
핵산 서열 및 유전자는 몇 가지 방법을 이용하여 S. 세레비시애 내로 삽입되어 발현될 수 있다. 일부 삽입 방법은 플라스미드-기반인 반면, 다른 방법은 염색체 내로의 유전자의 통합을 허용한다(Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology , Part B,Volume 350, Academic Press (2002); Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology , Part C, Volume 351, Academic Press (2002)). 영양요구성(예를 들면, URA3, TRP1, HIS3, LEU2) 또는 항생제 선택 마커(예를 들면, ZeoR 또는 KanR)를 이용한 높은 복제수 플라스미드가 종종 PGK1 또는 ACT1과 같은 강한 항시성 프로모터 및 CYC1 또는 AOX 유래의 것과 같은 전사 종결자-폴리아데닐화 영역과 함께 사용될 수 있다. pVV214(URA3 선택마커를 갖는 2 마이크론 플라스미드) 및 pVV200(TRP1 선택 마커를 갖는 2 마이크론 플라스미드)를 포함하는, 많은 예가 이용가능하다(Van 등, Yeast 20:739-746 (2003)). 대안적으로, pRS313 및 pRS315를 포함하는, 비교적 낮은 복제수 플라스미드가 사용될 수 있는데(Sikorski and Hieter, Genetics 122:19-27 (1989)), 이들 모두 프로모터(예를 들면, PGK1 또는 ACT1) 및 종결자(예를 들면, CYC1, AOX)의 부가를 필요로 한다.
염색체 내로의 유전자의 통합은 통합 프로모터-기반 발현 벡터, 예를 들면, 프로모터, 관심 유전자, 종결자, 및 선택 마커를 포함하는 구조체를 필요로 하며, FRT 부위, loxP 부위, 또는 직접 반복의 옆에 있는 프로모터는 내성 마커의 제거 및 재활용을 가능하게 한다. 상기 방법은 적당한 프라이머를 이용한 관심 유전자의 합성 및 증폭 이후, 예컨대 EcoRI 및 XhoI 효소에 의해 생성된 것과 같은 독특한 제한 부위에서의 유전자의 절단을 수반한다(Vellanki 등, Biotechnol Lett . 29:313-318 (2007)). 상기 관심 유전자는 프로모터의 하류에 있는 적당한 발현 벡터 내로 EcoRI 및 XhoI 부위에 삽입된다. 상기 유전자 삽입은 PCR 및 DNA 서열 분석에 의해 입증된다. 이후, 재조합 플라스미드가 선형화되고 적절한 형질전환 방법을 이용하여 S. 세레비시애의 염색체 DNA 내로 원하는 부위에서 통합된다. 세포는 적절한 선택 마커(예를 들면, 카나마이신)를 갖는 YPD 배지 상에 도말되고 2-3 일간 배양된다. 형질전환체를 대상으로 콜로니 PCR에 의해 필요한 유전자 삽입물을 분석한다.
구조체로부터 loxP 부위의 옆에 있는 항생제 마커를 제거하기 위해, Cre 재조합효소를 함유하는 플라스미드가 도입된다. Cre 재조합효소는 loxP 부위의 옆에 있는 서열의 절제를 촉진한다(Gueldener 등, Nucleic Acids Res . 30:e23 (2002)). 수득한 균주는 어떤 항생제도 존재하지 않는 배지 상에서 연속 배양에 의해 Cre 플라스미드를 복구한다. 최종 균주는 마커가 없는 유전자 결실을 가지며, 따라서 동일한 균주에서 다중 삽입을 도입하는데 동일한 방법이 사용될 수 있다. 대안적으로, FLP-FRT 시스템이 유사한 방식으로 사용될 수 있다. 이 시스템은 효모 사카로마이세스 세레비지애의 2μ 플라스미드로부터 유래된 플리파제 재조합 효소 (FLP)에 의해 짧은 플리파제 인식 표적(FRT) 부위 사이에서의 서열들의 재조합을 수반한다(Sadowski, P. D., Prog. Nucleic . Acid . Res . Mol . Biol. 51:53-91 (1995); Zhu 뭉 Sadowski J. Biol . Chem. 270:23044-23054 (1995)). 마찬가지로, 유전자 결실 방법론은 문헌[Baudin 등, Nucleic . Acids Res. 21:3329-3330 (1993); Brachmann 등, Yeast 14:115-132 (1998); Giaever 등, Nature 418:387-391 (2002); Longtine 등, Yeast 14:953-961 (1998) Winzeler 등, Science 285:901-906 (1999)]에 기재된 대로 수행될 수 있다.
실시예 VI
S. CEREVISIAE 에서의 핵산 서열 및 유전자의 삽입
본 실시예는 1,3-BDO의 생산을 위해 S. 세레비시애 내로의 유전자의 삽입을 기술한다.
균주 구축: 사카로마이세스 게놈 결실 프로젝트로부터의 pdc5:kanr (clone ID 4091)인 카나마이신 내성 유전자로 대체된 pdc5를 갖는, 사카로마이세스 세레비지애 반수체 균주 BY4741(MATa his3△1 leu2△0 met15△0 ura3△0)는 TRP1 유전자를 URA3으로 대체하는 상동 재조합을 이용한 이중 교차 사건에 의해 더 조작될 수있다. 균주를 "URA 블라스트"하기 위해 생성된 균주는 5-FOA 플레이트 상에서 성장할 수 있으며, 그렇게 함으로써 ura3 돌연변이를 갖는 클론을 선별한다. 이 플레이트로부터의 클론은 확장될 수 있다. 최종 유전자형 BY4741(MATa his3△1 leu2△0 met15△0 ura3△0 trp1:ura3 pdc5:kanr)을 갖는 균주가 1,3-BDO 이종기원 경로 발현을 위해 사용될 수 있다. 상기 균주는 효모 질소 베이스(1.7g/L), 암모늄 설페이트(5g/L)를 함유하고 -His, -Leu, -Trp, -Ura, -덱스트로오스가 제외된 아미노산의 완전 보충 혼합물(CSM)이 또한 첨가될 수 있는 합성 규정 배지 상에서 성장할 수 있다(Sunrise Science Products, Inc. San Diego, CA catalog #1788-100). 적절한 탄소 공급원은 0.2% 글루코오스 또는 0.2% 수크로오스 및 2% 갈락토오스이다.
S. 세레비시애에서 1,3-BDO 경로를 구축하기 위해, 유전자들이 동정되고, 클로닝되고, 서열분석되고, 발현 벡터로부터 발현될 수 있다. 유전자 및 승인 번호가 실시예 I에 기재되어 있다. 1,3-BDO 경로 유전자는 pESC 벡터 pESC-HIS, pESC-LEU, pESC-TRP, 및 pESC-URA(Stratagene, cat #217455) 내로 클로닝될 수 있다. 이들은 대장균 또는 S. 세레비시애에서 복제할 수 있는 셔틀 벡터이다. 이들은 덱스트로오스(글루코오스)의 존재 하에 억제되나 갈락토오스 당의 존재 하에 유도성 발현을 제공하는 이중 갈락토오스(GAL1 , GAL10) 분기성 프로모터를 갖는다. 아세토아세틸-CoA 티올라제 및 아세토아세틸-CoA 환원효소는 pESC-His 내로 클로닝될 수 있고; 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 및 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소는 pESC-Leu 내로 클로닝될 수 있으며, 피루베이트 포르메이트 분해효소 서브유닛 A 및 B는 pESC-Ura 내로 클로닝될 수 있다.
모든 효소 분석은 적절한 유전자(들)를 일차적으로 발현한 세포로부터 수행될 수 있다. 세포는 원심분리되고 유리 비드를 갖는 비드 비터에서 용해되고, 세포 잔사는 원심분리에 의해 제거되어 조 추출물을 생성한다.
기질이 세포 추출물에 첨가되어 활성이 분석될 수 있다. 아세토아세틸-CoA 티올라제 활성은 아세틸-CoA를 추출물에 첨가함으로써 결정될 수 있다. 만약 상기 반응이 아세틸-CoA 성분을 농축시키면, 유리 CoA-SH가 방출될 것이다. 유리 CoA-SH는 DTNB와 복합체를 형성하여 DTNB-CoA를 형성하고, 이는 410 nm에서의 흡광도에 의해 검출될 수 있다. 아세토아세틸-CoA 환원효소 활성을 검정하기 위해, 아세토아세틸-CoA 및 NADH가 추출물에 부가될 수 있다. 아세토아세타틸-CoA는 304 nm에서 흡수되고 그 감소가 아세토아세틸-CoA의 3-하이드록시부티릴-CoA로의 전환을 관찰하는데 사용된다. 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 및 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소는 NADH와 함께 적절한 기질을 세포 추출물에 첨가함으로써 분석될 수 있다. NADH가 340 nm의 파장을 갖는 빛을 흡수하고 450 nm의 파장을 갖는 2차 (형광) 광자를 방사하므로, NADH의 감소는 이후 형광에 의해 분석될 수 있다.
효모에서 피루베이트 포르메이트 분해효소 활성을 검출하기 위해, 세포, 추출물 및 시약은 산소에 의해 억제되는 것으로 공지된 효소와 마찬가지로 혐기성으로 제조될 수 있다. DTNB-CoA 반응은 혐기성 추출물의 제조에 필요한 환원제에 의해 억제되기 때문에, DNTB를 이용한 CoA-SH의 방출의 분석은 수행될 수 없다. 따라서, 상기 반응의 생성물(아세틸-CoA)은 추출물이 피루베이트와 함께 제공되는 경우 질량 분광분석법에 의해 직접 분석될 수 있다.
효모 배양은 His, Leu, Trp, Ura가 없는 합성 규정 배지 내로 접종될 수 있다. 1,3-BDO 생산 배양물의 샘플은 미세원심분리기에서 실온에서 5분간 17,000 rpm에서 원심분리하여 대다수의 세포를 제거함으로써 수집될 수 있다. 상청액은 미량의 세포를 제거하기 위해 0.22 μm 필터를 통해 여과될 수 있고 GC-MS에 의한 분석에 직접 사용될 수 있다.
조작된 균주는 성장률, 기질 흡수율, 및 생성물/부산물 분비율을 측정함으로써 규명될 것이다. 배양물은 밤새 성장될 것이고 지수 성장 동안 측정이 이뤄지는 신선한 회분 배양을 위한 접종물로서 사용될 것이다. 성장률은 분광측정기(A600)를 이용하여 광학 밀도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 배양 상청액 내 글루코오스, 1,3-BDO, 알코올, 및 다른 유기산 부산물의 농도는 HPX-87H 칼럼(BioRad), 또는 GC-MS을 이용하는 HPLC를 포함하는 분석적 방법에 의해 결정될 수 있고, 흡수 및 분비율을 계산하는데 사용될 수 있다. 이후, 배양물은 효소 분석을 위한 서브-배양을 통해 정상 상태 지수 성장으로 된다. 모든 실험은 삼반복 배양을 이용하여 수행될 것이다.
실시예 VⅡ
NADH 를 선호하는 경로 효소의 이용
글루코오스로부터의 아세틸-CoA의 생산은 많아야 4개의 NADH의 형태의 환원 등가물을 생성할 수 있다. 환원 등가물의 수율을 극대화하는 간단하고 에너지 효율적인 방식은 엠덴-마이어호프-파르나스 당분해 경로(EMP 경로)를 이용하는 것이다. 탄수화물을 이용하는 많은 유기체에서, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소에 의해 각각의 글리세르알데하이드-3-포스페이트 분자의 산화 당 하나의 NADH 분자가 생성된다. EMP 경로를 통해 대사된 글루코오스 분자 당 두 분자의 글리세르알데하이드-3-포스페이트가 생성된다는 것을 고려할 때, 글루코오스의 피루베이트로의 전환으로부터 2개의 NADH 분자가 수득될 수 있다.
EMP 경로를 통해 대사된 글루코오스 분자 당 두 분자의 피루베이트가 생성된다는 것을 고려할 때, 피루베이트의 아세틸-CoA로의 전환으로부터 두 개의 부가적인 NADH 분자들이 생성될 수 있다. 이것은 피루베이트를 아세틸-CoA로 전환하는 하기 효소 또는 효소 세트 중 임의의 것을 이용하는 것을 필요로 할 것이다:
1) NAD-의존적 피루베이트 탈수소효소;
2) 피루베이트 포르메이트 분해효소 및 NAD-의존적 포르메이트 탈수소효소;
3) 피루베이트:페레독신 산화환원효소 및 NADH:페레독신 산화환원효소;
4) 피루베이트 탈탄산효소 및 NAD-의존적 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소;
5) 피루베이트 탈탄산효소, NAD-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 아세테이트 키나아제, 및 포스포트랜스아세틸라제이고;
6) 피루베이트 탈탄산효소, NAD-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 및 아세틸-CoA 합성효소.
대사된 글루코오스 분자 당 총 4개의 NADH 분자들이 얻어질 수 있다. 1,3-BDO 경로는 아세틸-CoA로부터 3가지 환원 단계를 필요로 한다. 따라서, 이들 3가지 환원 단계 각각은 환원제로서 NADPH 또는 NADH를 이용할 것이고, 결국 이들 분자들을 각각 NADP 또는 NAD로 전환할 수 있다. 따라서, 1,3-BDO의 수율을 극대화하기 위해서는 모든 환원 단계가 NADH-의존성인 것이 바람직하다. 따라서 고수율의 1,3-BDO가 하기에 의해 달성될 수 있다:
1) NADPH과 같은 다른 환원 등가물보다 NADH에 더 강한 선호도를 갖는 내인성 또는 외인성 1,3-BDO 경로 효소를 확인하고 실행하는 것,
2) NADPH-의존적 감소 활성에 기여하는 하나 이상의 내인성 1,3-BDO 경로 효소를 약화시키는 것,
3) 내인성 또는 외인성 1,3-BDO 경로 효소들이 이들의 천연형보다 NADH에 더 강한 선호도를 갖도록, 이들 효소들의 보조인자 특이성을 변화시키는 것, 또는
4) 내인성 또는 외인성 1,3-BDO 경로 효소들이 이들의 천연형보다 NADPH보다 더 약한 선호도를 갖도록, 이들 효소들의 보조인자 특이성을 변화시키는 것.
내인성 또는 외인성 DNA 서열 유래의 개별적인 효소 또는 단백질 활성은 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 분석될 수 있다. 예를 들면, 유전자들은 대장균에서 발현될 수 있고, 이들의 코딩된 단백질의 활성은 실시예 V에 기재된 바와 같이 세포 추출물을 이용하여 측정될 수 있다. 대안적으로, 효소들은 당업계에 잘 알려진 표준 절차를 이용하여 정제될 수 있고, 활성이 분석될 수 있다. 분광광도 기반 분석이 특히 효과적이다.
효소들의 보조인자 특이성을 변화시키는 몇 가지 예와 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, Khoury 등(Protein Sci. 2009 October; 18(10): 2125-2138)은 NADH에 대해 증가된 친화도 및 NADPH에 대해 감소된 친화도를 갖는 몇 가지 자일로스 환원효소 효소를 만들어냈다. Ehsani 등(Biotechnology and Bioengineering, Volume 104, Issue 2, pages 381-389, 1 October 2009)은 NADPH의 활성을 증가시키면서 NADH에 대한 2,3-부탄디올 탈수소효소의 활성을 급격하게 감소시켰다. Machielsen 등(Engineering in Life Sciences, Volume 9, Issue 1, pages 38-44, February 2009)은 NADH에 대한 알코올 탈수소효소의 활성을 극적으로 증가시켰다. Khoury 등(Protein Sci. 2009 October; 18(10): 2125-2138)은 25개가 넘는 다른 효소의 보조인자 선호도를 성공적으로 변화시킨 몇 가지 이전 예를 표 I에 열거하고 있다. 부가적인 설명은 문헌[Lutz 등, Protein Engineering Handbook, Volume 1 and Volume 2, 2009, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, in particular, Chapter 31: Altering Enzyme Substrate and Cofactor Specificity via Protein Engineering]에서 발견될 수 있다.
실시예 VⅢ :
경로 효소의 보조인자 선호도를 결정하는 것
본 실시예는 효소의 보조인자 선호도를 결정하는 실험 방법을 기술한다.
각각의 경로 단계에 대한 효소의 보조인자 선호도는 항시성 또는 유도성 프로모터 뒤에서 플라스미드 상에 개별적인 유전자를 클로닝하고 숙주 유기체, 예컨대 대장균 내로 형질전환시킴으로써 결정된다. 예를 들면, 1) 아세토아세틸-CoA로부터 3-하이드록시부티릴-CoA로, 2) 3-하이드록시부티릴-CoA로부터 3-하이드록시부티르알데하이드로, 3) 3-하이드록시부티르알데하이드로부터 1,3-부탄디올로, 또는 4) 3-하이드록시부틸레이트로부터 3-하이드록시부티르알데하이드로의 경로 단계를 촉진하는 효소를 코딩하는 유전자는 하기 기재된 바와 같이 pZ-기반 발현 벡터 상으로 조립될 수 있다.
pZ -기반 발현 벡터에서의 스터퍼(Stuffer ) 단편의 교체. 벡터 백본을 Expressys(http://www.expressys.de/)의 롤프 루츠 박사로부터 수득하였다. 상기 벡터 및 균주는 루츠 및 부자드(Nucleic Acids Res 25, 1203-1210 (1997))에 의해 개발된 pZ 발현 시스템에 기초한다. pZE13luc, pZA33luc, pZS*13luc 및 pZE22luc는 스터퍼 단편으로서 루시퍼라아제 유전자를 함유한다. 루시퍼라아제 스터퍼 단편을 적절한 제한 효소 부위의 옆에 있는 lacZ-알파 단편으로 교체하기 위해, EcoRI 및 XbaI를 이용한 절단에 의해 각각의 벡터로부터 루시퍼라아제 스터퍼 단편을 제거한다. lacZ-알파 단편을 하기 프라이머를 이용하여 pUC19로부터 PCR 증폭시킨다:
lacZ알파-RI
5'GACGAATTCGCTAGCAAGAGGAGAAGTCGACATGTCCAATTCACTGGCCGTCGTTTTAC3' (서열번호: 1)
lacZ알파 3'BB
5'-GACCCTAGGAAGCTTTCTAGAGTCGACCTATGCGGCATCAGAGCAGA-3' (서열번호: 2)
이것은 EcoRI 부위, NheI 부위, 리보솜 결합 부위, SalI 부위 및 시작 코돈의 5' 말단을 갖는 하나의 단편을 생성한다. 상기 단편의 3' 말단에는 정지 코돈, XbaI, HindⅢ, 및 AvrⅡ 부위가 있다. PCR 생성물을 EcoRI 및 AvrⅡ로 절단하고 EcoRI 및 XbaI로 절단된 기본 벡터 내로 라이게이션한다(XbaI 및 AvrⅡ는 양립가능한 말단을 가지며 비-부위(non-site)를 생성함). NheI 및 XbaI 제한 효소 부위가 함께 라이게이션될 수 있는 양립가능한 말단을 생성하기 때문에(하지만 라이게이션 후 하나의 효소에 의해 절단되지 않는 부위를 생성함), 상기 벡터 내로 클로닝된 유전자는 함께 "생물벽돌이 쌓아질(biobricked)" 수 있다(http://openwetware.org/wiki/Synthetic_Biology:BioBricks). 간단히 말해서, 이 방법은 동일한 2개의 제한 부위를 이용하여 무제한의 유전자를 벡터 내로 연결할 수 있는데(상기 부위가 유전자에 대해 내부인 것으로 보이지 않는 한), 상기 유전자들 사이에 있는 부위들이 각각의 부가 후 파괴되기 때문이다. 이들 벡터는 차후에 EcoRI 및 NheI 부위 사이에 스페이서 서열 AATTAA를 삽입하는 Phusion® 위치지향적 돌연변이유발 키트(NEB, Ipswich, MA, USA)를 이용하여 변형될 수 있다. 이는 RBS 및 시작 코돈을 결합시키는 RNA 내의 추정 스템 루프 구조를 제거한다.
모든 벡터는 pZ 명칭 다음에 복제 기점, 항생제 내성 마커 및 프로모터/조절 유닛을 표시하는 문자 및 숫자를 갖는다. 복제 기점은 두번째 철자이고, ColE1의 경우 E, p15A의 경우 A 및 pSC101의 경우 S (뿐만 아니라 a lower 복제수 버전 of pSC101dml 낮은 복제수 형태는 S*로 지정됨)-기반 복제 기점으로 표시된다. 첫 번째 숫자는 항생제 내성 마커(암피실린의 경우 1, 카나마이신의 경우 2, 클로르암페니콜의 경우 3)를 나타낸다. 마지막 숫자는 관심 유전자를 조절하는 프로모터를 정의한다(PLtetO-1의 경우 1, PLlacO-1의 경우 2 및 PA1lacO-1의 경우 3). 본원에 논의된 작업의 경우, 본 발명자들은 상기에서 논의된 바와 같이 생물벽돌을 위해 변형된, 세 개의 기본 벡터인 pZS*13S, pZA33S 및 pZE13S를 이용하였다.
이후, 경로 효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 플라스미드는 이소프로필 β-D-l-티오갈락토피라노사이드(IPTG)의 부가에 의해 유도성 발현을 허용하는, lacIQ를 함유하는 숙주 균주 내로 형질전환될 수 있다. 이종기원 효소의 활성은 경로 유전자를 함유하는 플라스미드 구조체를 위한 숙주로서 균주 대장균 MG1655 lacIQ를 이용하여, 시험관내 분석에서 시험된다. 세포는 각각의 구조체에 대해 적절한 항생제를 함유하는 LB 배지(Difco)에서 호기적으로 성장할 수 있고, 광학 밀도(OD600)가 대략 0.5에 도달할 때 1 mM의 IPTG를 부가하여 유도될 수 있다. 세포는 6 시간 후 수확될 수 있고, 효소 분석은 하기 논의된 바와 같이 수행될 수 있다.
시험관내 효소 분석. 활성 분석을 위한 조 추출물을 수득하기 위해, 세포는 10분간 4,500 rpm에서 원심분리(Beckman-Coulter, Allegera X-15R)에 의해 수확될 수 있다. 상기 펠렛은 벤조나제 및 리소자임을 갖는 0.3 mL BugBuster(Novagen) 시약에 재현탁되고, 서서히 교반하면서 실온에서 약 15분간 용해가 진행된다. 4℃에서 30분간 14,000 rpm에서의 원심분리(Eppendorf centrifuge 5402)에 의해 세포가 없는 용해물을 수득한다. 표본 내 세포 단백질을 문헌[Bradford 등, Anal. Biochem. 72:248-254 (1976)]의 방법을 이용하여 결정하고, 하기 기재된 바와 같이 효소 분석을 수행한다. 활성은 Units/mg 단백질로 보고되고, 여기서 활성의 단위는 실온에서 1분 내에 1 마이크로몰의 기질을 전환하는데 필요한 효소의 양으로서 정의된다.
경로 단계는 몇 개의 문헌 소스로부터 채택된 과정을 이용하여 환원적 방향으로 분석될 수 있다(Durre 등, FEMS Microbiol. Rev. 17:251-262 (1995); Palosaari and Rogers, Bacteriol. 170:2971-2976 (1988) and Welch 등, Arch. Biochem. Biophys. 273:309-318 (1989). 그리고 나서, NADH 또는 NADPH의 산화를 실온에서 4초간 총 240초 동안 340 nM에서 흡광도를 판독할 수 있다. 상기 환원적 분석은 100 mM MOP(KOH로 pH 7.5로 조정됨), 0.4 mM NADH 또는 0.4 mM NADPH, 및 1 내지 50 μmol의 세포 추출물에서 수행될 수 있다. 카복실산 환원효소-유사 효소의 경우, ATP가 포화 농도로 부가될 수 있다. 상기 반응은 하기 시약을 첨가함으로써 개시될 수 있다: 100 μmol의 100 mM 아세토아세틸-CoA, 3-하이드록시부티릴-CoA, 3-하이드록시부틸레이트, 또는 3-하이드록시부티르알데하이드. 분광측정기를 빠르게 블랭크한 다음, 운동 판독을 시작한다. 340 nM에서의 NAD(P)H의 몰 소멸 계수 (6000) 및 추출물의 단백질 농도와 함께, 분당 340 nM에서의 생성된 흡광도 감소 기울기를 사용하여 비활성을 결정할 수 있다.
실시예 IX
NADPH 이용가능성을 증가시키는 방법
일부 경우, 환원제로서 NADPH를 이용하여, 활성을 갖는 경로 효소를 이용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들면, NADPH-의존적 경로 효소는 경로 중간체, 예컨대 아세토아세틸-CoA, 3-하이드록시부티릴-CoA, 3-하이드록시부틸레이트, 또는 3-하이드록시부티르알데하이드에 대해 상당히 특이적일 수 있거나 기질로서 NADPH를 이용하여 호의적인 운동 특성을 가질 수 있다. 만약 하나 이상의 경로 단계들이 NADPH 의존적이면, NADPH 이용가능성을 증가시키는 몇 가지 대안적인 접근법들이 이용될 수 있다. 이들은 하기를 포함한다:
1) 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 6-포스포글루코노락토나제, 및 6-포스포글루코네이트 탈수소효소(탈카복실화)를 포함하는 펜토스 포스페이트 경로의 산화적 가지를 통해 야생형 대비 유동을 증가시키는 것. 이것은 대사된 글루코오스-6-포스페이트 분자 당 2개의 NADPH 분자를 생성할 것이다. 그러나, 상기 탈카복실화 단계는 1,3-부탄디올의 최대 이론 수율을 감소시킬 것이다.
2) 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 6-포스포글루코노락토나제, 포스포글루코네이트 탈수효소, 및 2-케토-3-데옥시글루코네이트 6-포스페이트 알돌라아제를 포함하는 엔트너 듀도르프 경로를 통해 야생형 대비 유동을 증가시키는 것.
3) NADH를 NADPH로 전환시키는 가용성 수소전달효소를 도입하는 것.
4) NADH를 NADPH로 전환시키는 막-결합 수소전달효소를 도입하는 것.
5) NADP-의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소를 이용하는 것.
6) 피루베이트를 아세틸-CoA로 전환시키는 하기 효소 또는 효소 세트 중 어느 것을 이용하는 것
a) NADP-의존적 피루베이트 탈수소효소;
b) 피루베이트 포르메이트 분해효소 및 NADP-의존적 포르메이트 탈수소효소;
c) 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제 및 NADPH:페레독신 산화환원효소;
d) 피루베이트 탈탄산효소 및 NADP-의존적 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소;
e) 피루베이트 탈탄산효소, NADP-의존적 아세트알데하이드 탈수소효소, 아세테이트 키나아제, 및 포스포트랜스아세틸라제;
f) 피루베이트 탈탄산효소, NADP-의존적 아세트알데하이드 탈수소효소, 및 아세틸-CoA 합성효소; 및 이들 효소들의 임의로 약화시키는 NAD-의존적 형태.
7) 이들의 천연형보다 NADPH에 대해 더 강한 선호도를 갖도록 원상태 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소, 피루베이트 탈수소효소, 포르메이트 탈수소효소, 또는 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소의 보조인자 특이성을 변화시키는 것.
8) 이들의 천연형보다 NADPH에 대해 더 약한 선호도를 갖도록 원상태 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소, 피루베이트 탈수소효소, 포르메이트 탈수소효소, 또는 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소의 보조인자 특이성을 변화시키는 것.
내인성 또는 외인성 DNA 서열 유래의 개별적인 효소 또는 단백질 활성은 당업계에 알려진 방법을 이용하여 분석될 수 있다. 예를 들면, 유전자는 대장균에서 발현되고 이들의 코딩된 단백질의 활성은 이전 실시예에 기재된 바와 같이 세포 추출물을 이용하여 측정될 수 있다. 대안적으로, 효소는 당업계에 잘 알려진 표준 절차를 이용하여 정제될 수 있고 활성이 분석될 수 있다. 분광광도 기반의 분석이 특히 효과적이다.
효소들의 보조인자 특이성을 변화시키는 몇 가지 예와 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, Khoury 등(Protein Sci. 2009 October; 18(10): 2125-2138)은 NADH에 대해 증가된 친화도 및 NADPH에 대해 감소된 친화도를 갖는 몇 가지 자일로스 환원효소 효소를 만들어냈다. Ehsani 등(Biotechnology and Bioengineering, Volume 104, Issue 2, pages 381-389, 1 October 2009)은 NADPH의 활성을 증가시키면서 NADH에 대한 2,3-부탄디올 탈수소효소의 활성을 급격하게 감소시켰다. Machielsen 등(Engineering in Life Sciences, Volume 9, Issue 1, pages 38-44, February 2009)은 NADH에 대한 알코올 탈수소효소의 활성을 극적으로 증가시켰다. Khoury 등(Protein Sci. 2009 October; 18(10): 2125-2138)은 25개가 넘는 다른 효소의 보조인자 선호를 성공적으로 변화시킨 몇 가지 이전 예를 표 I에 열거하고 있다. 부가적인 설명은 문헌[Lutz 등, Protein Engineering Handbook, Volume 1 and Volume 2, 2009, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, in particular, Chapter 31: Altering Enzyme Substrate and Cofactor Specificity via Protein Engineering]에서 발견될 수 있다.
이들 단계에 대한 효소 후보들이 하기에 제공되어 있다.
표 70
글루코오스-6- 포스페이트 탈수소효소
Figure pct00071
표 71
6- 포스포글루코노락토나제
Figure pct00072
표 72
6- 포스포글루코네이트 탈수소효소 ( 탈카복실화 )
Figure pct00073
표 73
포스포글루코네이트 탈수효소
Figure pct00074
표 74
2- 케토 -3- 데옥시글루코네이트 6- 포스페이트 알돌라아제
Figure pct00075
표 75
가용성 수소전달효소
Figure pct00076
표 76
막-결합 수소전달효소
Figure pct00077
표 77
NADP -의존적 글리세르알데하이드 -3- 포스페이트 탈수소효소
Figure pct00078
표 78
NAD -의존적 글리세르알데하이드 -3- 포스페이트 탈수소효소
Figure pct00079
표 79
NADP -의존적 피루베이트 탈수소효소
Figure pct00080
문헌[Biochemistry, 1993, 32 (11), pp 2737-2740]에 기재된 대장균 K-12 MG1655 유래의 돌연변이된 LpdA:
MSTEIKTQVVVLGAGPAGYSAAFRCADLGLETVIVERYNTLGGVCLNVGCIPSKALLHVAKVIEEAKALAEHGIVFGEPKTDIDKIRTWKEKVINQLTGGLAGMAKGRKVKVVNGLGKFTGANTLEVEGENGKTVINFDNAⅡAAGSRPIQLPFIPHEDPRIWDSTDALELKEVPERLLVMGGGⅡGLEMGTVYHALGSQIDVVVRKHQVIRAADKDIVKVFTKRISKKFNLMLETKVTAVEAKEDGIYVTMEGKKAPAEPQRYDAVLVAIGRVPNGKNLDAGKAGVEVDDRGFIRVDKQLRTNVPHIFAIGDIVGQPMLAHKGVHEGHVAAEVIAGKKHYFDPKVIPSIAYTEPEVAWVGLTEKEAKEKGISYETATFPWAASGRAIASDCADGMTKLIFDKESHRVIGGAIVGTNGGELLGEIGLAIEMGCDAEDIALTIHAHPTLHESVGLAAEVFEGSITDLPNPKAKKK (서열번호:3)
문헌[Biochemistry, 1993, 32 (11), pp 2737-2740]에 기재된 대장균 K-12 MG1655 유래의 돌연변이된 LpdA:
MSTEIKTQVVVLGAGPAGYSAAFRCADLGLETVIVERYNTLGGVCLNVGCIPSKALLHVAKVIEEAKALAEHGIVFGEPKTDIDKIRTWKEKVINQLTGGLAGMAKGRKVKVVNGLGKFTGANTLEVEGENGKTVINFDNAⅡAAGSRPIQLPFIPHEDPRIWDSTDALELKEVPERLLVMGGGⅡALEMATVYHALGSQIDVVVRKHQVIRAADKDIVKVFTKRISKKFNLMLETKVTAVEAKEDGIYVTMEGKKAPAEPQRYDAVLVAIGRVPNGKNLDAGKAGVEVDDRGFIRVDKQLRTNVPHIFAIGDIVGQPMLAHKGVHEGHVAAEVIAGKKHYFDPKVIPSIAYTEPEVAWVGLTEKEAKEKGISYETATFPWAASGRAIASDCADGMTKLIFDKESHRVIGGAIVGTNGGELLGEIGLAIEMGCDAEDIALTIHAHPTLHESVGLAAEVFEGSITDLPNPKAKKK (서열번호:4)
표 80
NADP -의존적 포르메이트 탈수소효소
Figure pct00081
저널[Molecular Catalysis B: Enzymatic, Volume 61, Issues 3-4, December 2009, Pages 157-161]에 기재된 돌연변이 칸디다 보디니이 효소:
MKIVLVLYDAGKHAADEEKLYGCTENKLGIANWLKDQGHELITTSDKEGETSELDKHIPDADⅢTTPFHPAYITKERLDKAKNLKLVVVAGVGSDHIDLDYINQTGKKISVLEVTGSNVVSVAEHVVMTMLVLVRNFVPAHEQⅡNHDWEVAAIAKDAYDIEGKTIATIGAGRIGYRVLERLLPFNPKELLYYQRQALPKEAEEKVGARRVENIEELVAQADIVTVNAPLHAGTKGLINKELLSKFKKGAWLVNTARGAICVAEDVAAALESGQLRGYGGDVWFPQPAPKDHPWRDMRNKYGAGNAMTPHYSGTTLDAQTRYAEGTKNILESFFTGKFDYRPQDⅡLLNGEYVTKAYGKHDKK (서열번호:5)
저널[Molecular Catalysis B: Enzymatic, Volume 61, Issues 3-4, December 2009, Pages 157-161]에 기재된 돌연변이 칸디다 보디니이 효소:
MKIVLVLYDAGKHAADEEKLYGCTENKLGIANWLKDQGHELITTSDKEGETSELDKHIPDADⅢTTPFHPAYITKERLDKAKNLKLVVVAGVGSDHIDLDYINQTGKKISVLEVTGSNVVSVAEHVVMTMLVLVRNFVPAHEQⅡNHDWEVAAIAKDAYDIEGKTIATIGAGRIGYRVLERLLPFNPKELLYYSPQALPKEAEEKVGARRVENIEELVAQADIVTVNAPLHAGTKGLINKELLSKFKKGAWLVNTARGAICVAEDVAAALESGQLRGYGGDVWFPQPAPKDHPWRDMRNKYGAGNAMTPHYSGTTLDAQTRYAEGTKNILESFFTGKFDYRPQDⅡLLNGEYVTKAYGKHDKK (서열번호:6)
문헌[Biochem J. 2002 November 1:367(Pt. 3):841-847]에 기재된 돌연변이 사카로마이세스 세레비지애 효소:
MSKGKVLLVLYEGGKHAEEQEKLLGCIENELGIRNFIEEQGYELVTTIDKDPEPTSTVDRELKDAEIVITTPFFPAYISRNRIAEAPNLKLCVTAGVGSDHVDLEAANERKITVTEVTGSNVVSVAEHVMATILVLIRNYNGGHQQAINGEWDIAGVAKNEYDLEDKⅡSTVGAGRIGYRVLERLVAFNPKKLLYYARQELPAEAINRLNEASKLFNGRGDIVQRVEKLEDMVAQSDVVTINCPLHKDSRGLFNKKLISHMKDGAYLVNTARGAICVAEDVAEAVKSGKLAGYGGDVWDKQPAPKDHPWRTMDNKDHVGNAMTVHISGTSLDAQKRYAQGVKNILNSYFSKKFDYRPQDⅡVQNGSYATRAYGQKK (서열번호:7).
표 81
NADPH : 페레독신 산화환원효소
Figure pct00082
표 82
NADP -의존적 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소
Figure pct00083
피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 산화환원효소, 피루베이트 포르메이트 분해효소, 피루베이트 탈탄산효소, 아세테이트 키나아제, 포스포트랜스아세틸라제 및 아세틸-CoA 합성효소를 코딩하는 예시적인 유전자들이 실시예 Ⅱ에 기재되어 있다.
1,3-부탄디올의 수송을 용이하게 할 수 있는 효소를 코딩하는 유전자들은 하기에 제공된 것과 같은 글리세롤 촉진인자 단백질 동족체를 포함한다.
실시예 X
화학적 생산을 위해 SACCHAROMYCES CEREVISIAE 를 조작하는 것
진핵 숙주는 원핵 시스템에 비해 몇 가지 이점을 갖는다. 이들은 번역후 수식 및 숙주 막에 고정되고 소기관 특이적 효소들을 지지할 수 있다. 진핵생물 내의 유전자는 전형적으로 인트론을 가지며, 이는 유전자 발현 및 단백질 구조의 타이밍에 영향을 미칠 수 있다.
산업적인 화학적 생산에 잘 맞춰진 예시적인 진핵 유기체는 사카로마이세스 세레비지애이다. 이 유기체는 잘 규명되어 있고, 유전적으로 다루기 쉬우며, 산업적으로 강력하다. 유전자는 당해분야에서 공지된 방법을 이용하여 쉽게 삽입되거나, 결실되거나, 대체되거나, 과발현되거나 발현 중일 수 있다. 일부 방법은 플라스미드-기반인 반면 다른 방법은 염색체 내로의 유전자의 통합을 허용한다(Guthrie and Fink. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology , Part B, Volume 350, Academic Press (2002); Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology , Part C, Volume 351, Academic Press (2002)).
플라스미드-매개의 유전자 발현은 효모 에피좀 플라스미드(YEp)에 의해 가능하게 된다. Yep는 높은 수준의 발현을 허용하지만 이들은 매우 안정적이지 못하고 이들은 선택 배지에서의 배양을 필요로 한다. 이들은 또한 숙주 대사에 대해 높은 유지 비용을 갖는다. 영양요구성(예를 들면, URA3, TRP1, HIS3, LEU2) 또는 항생제 선택 마커(예를 들면, ZeoR 또는 KanR)를 이용하는 높은 복제수 플라스미드가, 종종 PGK1 또는 ACT1과 같은 강한 항시성 프로모터 및 CYC1 또는 AOX 유래의 것과 같은 전사 종결자-폴리아데닐화 영역과 함께 사용될 수 있다. 많은 예들이 본 기술분야의 숙련가에게 이용가능하다. 이들은 pVV214(URA3 선택 마커를 갖는 2 마이크론 플라스미드) 및 pVV200(TRP1 선택 마커를 갖는 2 마이크론 플라스미드)을 포함한다(Van 등, Yeast 20:739-746 (2003)). 대안적으로, 비교적 낮은 복제수 플라스미드가 사용될 수 있다. 많은 예들이 본 기술분야의 숙련가에게 이용가능하다. 이들은 pRS313 및 pRS315(Sikorski and Hieter, Genetics 122:19-27 (1989))를 포함하며, 이들 모두는 프로모터(예를 들면, PGK1 또는 ACT1) 및 종결자(예를 들면, CYC1, AOX)의 부가를 필요로 한다.
산업적 응용을 위해, 유전자의 염색체 과발현이 플라스미드-매개된 과발현보다 바람직하다. 유전자를 S. 세레비시애와 같은 진핵 유기체 내로 삽입하는 수단은 당업계에 공지되어 있다. 특히 유용한 수단은 효모 통합 플라스미드(YIp), 효모 인공 염색체(YACS) 및 유전자 표적화/상동 재조합을 포함한다. 이들 수단은 또한 숙주의 게놈을 삽입하거나, 결실시키거나, 대체하거나, 저발현하거나, 변경하는데 사용될 수 있다는 것에 유념한다.
효모 통합 플라스미드(YIp)는 DNA를 염색체 내로 효율적으로 통합하는 원상태 효모 상동 재조합 시스템을 이용한다. 이들 플라스미드는 복제 기점을 함유하지 않으며, 따라서 염색체 통합 후 단지 유지될 수 있다. 예시적인 구조체는 프로모터, 관심 유전자, 종결자, 및 선택 마커를 포함하고, FRT 부위, loxP 부위, 또는 직접 반복의 옆에 있는 프로모터는 내성 마커의 제거 및 재활용을 가능하게 한다. 상기 방법은 적당한 프라이머를 이용한 관심 유전자의 합성 및 증폭 이후, 예컨대 EcoRI 및 XhoI 효소에 의해 생성된 독특한 제한 부위에서의 유전자의 절단을 수반한다(Vellanki 등, Biotechnol Lett . 29:313-318 (2007)). 상기 관심 유전자는 프로모터의 하류에서 적당한 발현 벡터 내로 EcoRI 및 XhoI 부위에 삽입된다. 상기 유전자 삽입은 PCR 및 DNA 서열 분석에 의해 입증된다. 이후, 재조합 플라스미드는 선형화되고 적절한 형질전환 방법을 이용하여 S. 세레비시애의 염색체 DNA 내로 원하는 부위에서 통합된다. 세포는 적절한 선택 마커(예를 들면, 카나마이신)를 갖는 YPD 배지 상에 도말되고 2-3일간 배양된다. 형질전환체를 대상으로 콜로니 PCR에 의해 필요한 유전자 삽입물을 분석한다. loxP 부위의 옆에 있는 구조체로부터 항생제 마커를 제거하기 위해, Cre 재조합효소를 함유하는 플라스미드가 도입된다. Cre 재조합효소는 loxP 부위의 옆에 있는 서열의 절제를 촉진한다(Gueldener 등, Nucleic Acids Res 30:e23 (2002)). 생성된 균주는 어떠한 항생제도 존재하지 않는 배지 상에서의 연속 배양에 의해 Cre 플라스미드가 복구된다. 최종 균주는 마커가 없는 유전자 결실을 가지며, 따라서 동일한 균주에서 다중 삽입을 도입하는데 동일한 방법이 사용될 수 있다. 대안적으로, FLP-FRT 시스템이 유사한 방식으로 사용될 수 있다. 이 시스템은 효모 사카로마이세스 세레비지애의 2μ 플라스미드로부터 유래된 플리파제 재조합 효소(FLP)에 의해 짧은 플리파제 인식 표적(FRT) 부위 사이에 있는 서열들의 재조합을 수반한다(Sadowski, P. D., Prog . Nucleic . Acid . Res . Mol . Biol . 51:53-91 (1995); Zhu and Sadowski J. Biol . Chem . 270:23044-23054 (1995)). 마찬가지로, 유전자 결실 방법론은 문헌[Baudin 등 Nucleic . Acids Res . 21:3329-3330 (1993); Brachmann 등, Yeast 14:115-132 (1998); Giaever 등, Nature 418:387-391 (2002); Longtine 등, Yeast 14:953-961 (1998) Winzeler 등, Science 285:901-906 (1999)]에 기재된 대로 수행될 수 있다.
효모 염색체를 조작하는 또 하나의 강력한 접근법은 유전자 표적화이다. 이 접근법은 효모에서의 이중 가닥 DNA 손상이 상동 재조합에 의해 복구된다는 사실을 이용한다. 따라서, 표적화 서열의 옆에 있는 선형 DNA 단편은 원상태 상동 재조합 기구를 이용하여 효모 게놈 내로 효율적으로 통합될 수 있다. 유전자를 삽입하는 응용 외에도, 유전자 표적화 접근법은 유전자를 결실시키거나, 유전자에 돌연변이, 그 프로모터 또는 다른 조절 요소를 도입하거나, 유전자에 태그를 부가하는 것과 같은 게놈 DNA 조작에 유용하다.
효모 인공 염색체(YAC)는 경로 구축 및 조립에 유용한 인공 염색체이다. YAC는 다중 유전자를 함유하는 큰 서열의 DNA(100-3000 kB)의 발현을 가능하게 한다. YAC의 사용은 최근에 효모에서 플라보노이드 생합성을 조작하는데 적용되었다(Naesby 등, Microb Cell Fact 8:49-56 (2009)). 이 접근법에서, YAC가 최적의 조합을 찾기 위해 무작위로 조립된 경로 유전자를 빠르게 시험하는데 사용되었다.
유전자의 발현 수준은 유전자 및/또는 그의 조절 영역의 서열을 변화시킴으로써 조절될 수 있다. 그러한 유전자 조절 영역은, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 인트론, 및 종결자를 포함한다. 억제인자 및/또는 사일런서와 같은 음성 조절 인자의 기능적 파괴 역시 유전자 발현을 향상시키는데 이용될 수 있다. RNA 기반 도구들 역시 유전자 발현을 조절하는데 이용될 수 있다. 그러한 도구들은 RNA 앱타머, 리보스위치, 안티센스 RNA, 리보자임 및 리보스위치를 포함한다.
그의 프로모터에 의한 유전자의 발현을 변화시키기 위해, 다양한 강도의 항시성 및 유도성 프로모터의 라이브러리가 이용가능하다. 강한 항시성 프로모터는 pTEF1, pADH1 및 당분해 경로 유전자로부터 유래된 프로모터를 포함한다. pGAL 프로모터는 갈락토오스에 의해 활성화되고 글루코오스에 의해 억제되는 잘 연구된 유도성 프로모터이다. 또 하나의 통상적으로 사용되는 유도성 프로모터는 구리 유도성 프로모터 pCUP1이다(Farhi 등, Met Eng 13:474-81 (2011)). 돌연변이유발 또는 셔플링 방법에 의해 프로모터 세기의 추가적 변이가 도입될 수 있다. 예를 들면, 오류 유발 PCR은 알퍼 및 동료(Alper 등, PNAS 102:12678-83 (2005))에 의해 제시된 바와 같이 합성 프로모터 라이브러리를 생성하는데 적용될 수 있다. 프로모터 세기는 리포터 단백질, 예컨대 베타-갈락토시다아제, 형광 단백질 및 루시퍼라아제에 의해 규명될 수 있다.
게놈 내에서 삽입된 유전자의 배치는 그 발현 수준을 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 통합된 유전자의 과발현은 리보솜 DNA 또는 긴 말단 반복부와 같은 반복 DNA 요소 내로 유전자를 통합시킴으로써 달성될 수 있다.
효모 또는 다른 진핵세포에서의 외인성 발현을 위해, 유전자는 리더 서열의 부가없이 세포질에서 발현되거나, 미토콘드리아 또는 다른 소기관에 표적화되거나, 숙주세포에게 적합한 미토콘드리아 표적화 또는 분비 신호와 같은 적합한 표적화 서열의 부가에 의해 분비에 표적화될 수 있다. 따라서, 표적화 서열을 제거하거나 포함시키는 핵산 서열의 적절한 변형이 바람직한 특성을 부여하기 위해 외인성 핵산 서열 내로 통합될 수 있음이 이해된다. 또한 폴리펩타이드 합성을 향상시키기 위해 유전적 변형이 이뤄질 수 있다. 예를 들면, 번역 효율은 리보솜 결합 부위를 최적의 또는 공통 서열로 치환하고/거나 2차 구조를 부가하거나 제거하기 위해 유전자의 서열을 변화시킴으로써 향상된다. 또한, 번역 속도는 하나의 코딩 서열을 숙주의 코돈 선호도에 더 잘 일치하는 또 하나의 코딩 서열로 치환함으로써 증가될 수 있다.
실시예 XI
1,3- BDO 배출을 위한 예시적인 유전자
1,3-부탄디올은 부타디엔으로 회수되고/거나 탈수되기 위해 생산 유기체를 떠나야 한다. 1,3-부탄디올의 수송을 용이하게할 수 있는 효소를 코딩하는 유전자는 글리세롤 촉진인자 단백질 동족체 예컨대 하기 제공된 것을 포함한다. OmrA, LmrA 및 동족체 (참고, 예를 들면, Burd 및 Bhattacharyya, US 특허 출원 20090176288)를 포함하는, 부탄올을 배출하는 다중약물 내성 수송체는 또한 1,3-부탄디올을 위한 적당한 수송체이다.
표 83
Figure pct00084
실시예 XⅡ
PEP 및 피루베이트로부터 아세틸- CoA 를 생산하기 위한 경로
도 10은 PEP 및 피루베이트를 아세틸-CoA, 아세토아세틸-CoA, 및 추가로 1,3-부탄디올과 같이 아세토아세틸-CoA로부터 유래된 생성물들로 전환시키기 위한 수많은 경로를 나타낸다. 도 10에 나타난 상기 반응을 위한 효소 후보들이 하기에 기재되어 있다.
표 84
Figure pct00085
도 10에서의 몇 가지 효소에 대한 효소 후보들은 본문의 다른 곳에 기술되었다. 이들은 아세토아세틸-CoA 합성효소(표 70), 아세토아세틸-CoA 티올라제(표 42), 말로닐-CoA 환원효소(말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소(아실화)로도 불림)(표 35, 46), 말레이트 탈수소효소(표 7 및 23)를 포함한다.
1.1.n.a
말레이트 탈수소효소 또는 산화환원효소는 말레이트의 옥살로아세테이트로의 산화를 촉진한다. 상이한 캐리어들이 이 클래스 내의 효소에 대한 전자 수용체로서 작용할 수 있다. 말레이트 탈수소효소는 전자 수용체로서 NADP 또는 NAD를 이용한다. 말레이트 탈수소효소(단계 M) 후보들이 실시예 1에 기재되어 있다(표 7, 23). 말레이트:퀴논 산화환원효소(EC 1.1.5.4)는 막에 결합되어 있고 전자 수용체로서 퀴논, 플라빈단백질 또는 비타민 K를 이용한다. 대장균, 헬리코박터 파일로리 및 슈도모나스 시린가에의 말레이트:퀴논 산화환원효소는 mqo에 의해 코딩된다(Kather 등, J Bacteriol 182:3204-9 (2000); Mellgren 등, J Bacteriol 191:3132-42 (2009)). C. gluamicum의 Cgl2001 유전자도 MQO 효소를 코딩한다(Mitsuhashi et al . Biosci Biotechnol Biochem 70:2803-6 (2006)).
표 85
Figure pct00086
1.1.1.d
말산 효소(말레이트 탈수소효소)는 피루베이트의 말레이트로의 가역적 산화적 카복실화를 촉진한다. 대장균은 두 가지 말산 효소인 MaeA 및 MaeB를 코딩한다(Takeo, J. Biochem. 66:379-387 (1969)). 말산 효소가 전형적으로 말레이트로부터 피루베이트 형성 방향으로 작동하는 것으로 추정됨에도 불구하고, maeA에 의해 코딩된 NAD-의존적 효소는 탄소-고정 방향으로 작동하는 것으로 입증되어 왔다(Stols and Donnelly, Appl . Envrion . Microbiol . 63(7) 2695-2701 (1997)). Ascaris suum 유래의 말산 효소를 대장균에서 과발현시 유사한 관찰이 이뤄졌다(Stols 등, Appl . Biochem. Biotechnol . 63-65(1), 153-158 (1997)). maeB에 의해 코딩된 제 2 대장균 말산 효소는 NADP-의존적이며 옥살로아세테이트 및 다른 알파-케토산을 탈카복실화한다(Iwakura 등, J. Biochem. 85(5):1355-65 (1979)). 또 하나의 적당한 효소 후보는 옥수수 유래의 me1이다(Furumoto 등, Plant Cell Physiol 41:1200-1209 (2000)).
표 86
Figure pct00087
1.2.1.a
말로네이트 세미알데하이드의 말로네이트로의 산화는 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소(EC 1.2.1.15)에 의해 촉매된다. 이 효소는 슈도모나스 카복시디보란스에서 규명되었다(Nakamura 등, Biochim Biophys Acta 50:147-52 (1961)). 유글레나 그라실라스의 NADP 및 NAD-의존적 석시네이트 세미알데하이드 탈수소효소 효소는 기질로서 말로네이트 세미알데하이드를 받아들인다(Tokunaga 등, Biochem Biophys Act 429:55-62 (1976)). 이들 효소를 코딩하는 유전자는 현재까지 확인되지 않았다. 진핵 유기체 예컨대 S. 세레비시애, C. 알비칸스 , Y. 리포라이티카 및 A. niger와 같은 진핵 유기체 유래의 알데하이드 탈수소효소는 전형적으로 광범위한 기질 특이성을 가지며, 적당한 후보이다. 이들 효소 및 기타 산 형성 알데하이드 탈수소효소 및 알데하이드 산화효소들이 앞에 기재되어 있으며 표 9 및 30에 열거되어 있다. 부가적인 MSA 탈수소효소 후보는 NAD(P)+-의존적 알데하이드 탈수소효소(EC 1.2.1.3)를 포함한다. 인간 간에서 발견되는 두 가지 알데하이드 탈수소효소인 ALDH-1 및 ALDH-2는 다양한 지방족, 방향족 및 폴리사이클릭 알데하이드에 대해 광범위한 기질 범위를 갖는다(Klyosov, Biochemistry 35:4457-4467 (1996a)). 활성 ALDH-2는 샤페로닌으로서 GroEL 단백질을 이용하여 대장균에서 효율적으로 발현되었다(Lee 등, Biochem . Biophys. Res . Commun . 298:216-224 (2002)). 래트 미토콘드리아 알데하이드 탈수소효소 역시 광범위한 기질 범위를 갖는다(Siew 등, Arch . Biochem . Biophys . 176:638-649 (1976)). 대장균 유전자 astD 및 aldH는 NAD+-의존적 알데하이드 탈수소효소를 코딩한다. AstD는 석시닉 세미알데하이드에 대해 활성이고(Kuznetsova 등, FEMS Microbiol Rev 29:263-279 (2005)), aldH는 광범위한 방향족 및 지방족 기질에 대해 활성이다(Jo 등, Appl Microbiol Biotechnol 81:51-60 (2008)).
표 87
Figure pct00088
1.2.1.f
말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소(아세틸화)(EC 1.2.1.18)는 말로네이트 세미알데하이드의 아세틸-CoA로의 산화적 탈카복실화를 촉진한다. 예시적인 효소는 할로모나스 종 HTNK1의 ddcC(Todd 등, Envrion Microbiol 12:237-43 (2010)) 및 락토바실러스 카세이의 IolA(Yebra 등, AEM 73:3850-8 (2007))에 의해 코딩된다. DdcC 효소는 하기 표에 나타난, A. niger 및 C. 알비칸스에서 동족체를 갖는다. 래투스 노르베기쿠스 내의 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소인 Mmsdh는 또한 말로네이트 세미알데하이드를 아세틸-CoA로 전환시킨다(US 8048624). 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소(아세틸화)는 상기 유전자가 현재까지 동정되지 않았음에도 불구하고, 슈도모나스 플루오레스센스에서 규명되어 왔다(Hayaishi 등, J Biol Chem 236:781-90 (1961)). 메틸말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소(아세틸화)(EC 1.2.1.27) 역시 적당한 후보인데, 바실러스 서브틸리스의 Msdh(Stines-Chaumeil 등, Biochem J 395:107-15 (2006)) 및 R. norvegicus의 메틸말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소(Kedishvii 등, Methods Enzymol 324:207-18 (2000))를 포함하는, 이 클래스 내의 몇 가지 효소가 기질로서 말로네이트 세미알데하이드를 받아들이기 때문이다.
표 88
Figure pct00089
2.7.2.a
포스포에놀피루베이트 합성효소(EC 2.7.9.2)로도 알려진, 피루베이트 키나아제(단계 10N)는 피루베이트 및 ATP를 PEP 및 AMP로 전환시킨다. 이 효소는 S. 세레비시애 내의 PYK1(Burke 등, J. Biol . Chem . 258:2193-2201 (1983)) 및 PYK2(Boles 등, J. Bacteriol . 179:2987-2993 (1997)) 유전자에 의해 코딩된다. 대장균에서, 이 활성은 pykF 및 pykA의 유전자 생성물에 의해 촉매된다. S. 세레비시애 효소의 선택된 동족체가 또한 하기 표에 나타나 있다.
표 89
Figure pct00090
2.8.3.a
말로네이트의 말로닐-CoA로의 활성화는 EC 클래스 2.8.3.a 내의 CoA 전이효소에 의해 촉매된다. 말로닐-CoA:아세테이트 CoA 전이효소(EC 2.8.3.3)는 슈도모나스 플루오레스센스 및 슈도모나스 푸티다를 포함하는 슈도모나스 종에서 규명되었다(Takamura 등, Biochem Int 3:483-91 (1981); Hayaishi 등, J Biol Chem 215:125-36 (1955)). 이들 효소와 연관된 유전자는 현재까지 동정되지 않았다. 래투스 노르베기쿠스 간에서 발견된 미토콘드리아 CoA 전이효소 역시 이 반응을 촉매하며 다양한 CoA 공여체 및 수용체를 이용할 수 있다(Deana 등, Biochem Int 26:767-73 (1992)). 상기 기재된 몇 가지 CoA 전이효소는 또한 도 10의 단계 K를 촉진하는데 적용될 수 있다. 이들 효소는 아세틸-CoA 전이효소(표 26), 3-HB CoA 전이효소(표 8), 아세토아세틸-CoA 전이효소(표 55), SCOT(표 56) 및 다른 CoA 전이효소(표 57)를 포함한다.
3.1.3.a
포스포에놀피루베이트 포스파타제(EC 3.1.3.60, 단계 10N)는 PEP의 피루베이트 및 포스페이트로의 가수분해를 촉진한다. 수많은 포스파타제 효소들은 이 활성을 촉매하며, 알칼리 포스파타제(EC 3.1.3.1), 산 포스파타제(EC 3.1.3.2), 포스포글리세레이트 포스파타제(EC 3.1.3.20) 및 PEP 포스파타제(EC 3.1.3.60)를 포함한다. PEP 포스파타제 효소는 비그니아 라디에이트, 브루구에라 섹산굴라 및 브라씨카 니그라와 같은 식물에서 규명되어 왔다. 아스페르길러스 푸미가테스 유래의 피타아제, 호모 사피엔스 유래의 산 포스파타제 및 대장균의 알칼리 포스파타제 역시 PEP의 피루베이트로의 가수분해를 촉진한다(Brugger 등, Appl Microbiol Biotech 63:383-9 (2004); Hayman 등, Biochem J 261:601-9 (1989); 등, The Enzymes 3rd Ed. 4:373-415 (1971))). 유사한 효소가 캠필로박터 제주니(van Mourik 등, Microbiol. 154:584-92 (2008)), 사카로마이세스 세레비지애(Oshima 등, Gene 179:171-7 (1996)) 및 스타필로코쿠스 아우레우스 (Shah and Blobel, J. Bacteriol . 94:780-1 (1967))에서 규명되어 왔다. 효소 공학 및/또는 표적화 서열의 제거가 알칼리 포스파타제 효소가 세포질 내에서 기능하는데 필요할 수 있다.
표 90
Figure pct00091
4.1.1.a
도 10에서의 몇 가지 반응은 옥살로아세테이트 탈탄산효소(단계 B), 말로닐-CoA 탈탄산효소(단계 D) 및 피루베이트 카복실라제 또는 카복시키나아제(단계 A)를 포함하는, EC 클래스 4.1.1 내의 탈탄산효소 효소에 의해 촉매된다.
포스포에놀피루베이트의 옥살로아세테이트로의 카복실화는 포스포에놀피루베이트 카복실라제(EC 4.1.1.31)에 의해 촉매된다. 예시적인 PEP 카복실라제 효소는 대장균에서의 ppc(Kai 등, Arch . Biochem . Biophys. 414:170-179 (2003), 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1 에서의 ppcA(Arps 등, J. Bacteriol. 175:3776-3783 (1993), 및 코라이네박테리움 글루타미쿰에서의 ppc(Eikmanns 등, Mol . Gen . Genet. 218:330-339 (1989)에 의해 코딩된다.
표 91
Figure pct00092
포스포에놀피루베이트의 옥살로아세테이트로의 카복실화를 위한 대안적인 효소는 PEP 카복시키나아제(EC 4.1.1.32, 4.1.1.49)이며, 이는 ATP 또는 GTP를 동시에 형성한다. 대부분의 유기체에서, PEP 카복시키나아제는 글루코네오제닉 기능을 제공하며 하나의 ATP를 희생하여 옥살로아세테이트를 PEP로 전환시킨다. S. 세레비시애는 원상태 PEP 카복시키나아제인 PCK1이 글루코네오제닉 역할을 하는 그러한 한 가지 유기체이다(Valdes-Hevia 등, FEBS Lett. 258:313-316 (1989)). 대장균이 그러한 또 다른 유기체인데, 옥살로아세테이트를 생산하는 PEP 카복시키나아제의 역할이 PEP 카복실라제와 비교하여 작다고 여겨지기 때문이다(Kim 등, Appl . Envrion . Microbiol. 70:1238-1241 (2004)). 그럼에도 불구하고, PEP로부터 옥살로아세테이트로의 원상태 대장균 PEP 카복시키나아제의 활성은 대장균 K-12의 ppc 돌연변이체에서 최근에 입증되었다(Kwon 등, J. Microbiol . Biotechnol . 16:1448-1452 (2006)). 이들 균주는 성장 결함을 나타내지 않았고 높은 NaHCO3 농도에서 석시네이트 생산을 증가시켰다. 대장균의 돌연변이 균주는 적응 진화 이후 지배적인 CO2-고정화 효소로서 Pck를 채택할 수 있다(Zhang 등 2009). 일부 유기체, 특히 반추위세균에서, PEP 카복시키나아제는 PEP로부터 옥살로아세테이트를 생산하고 ATP를 생성하는데 상당히 효율적이다. 대장균 내로 클로닝된 PEP 카복시키나아제 유전자의 예는 만헤이미아 석시니시프로두센스(Lee 등, Biotechnol . Bioprocess Eng . 7:95-99 (2002)), 아나에로바이오스피릴럼 석시니시프로두센스 (Laivenieks 등, Appl . Envrion . Microbiol. 63:2273-2280 (1997), 및 악티노바실러스 석시노게네스(Kim 등 supra) 유래의 유전자를 포함한다. 헤모필루스 인플루엔자에 의해 코딩된 PEP 카복시키나아제 효소는 PEP로부터 옥살로아세테이트를 형성하는데 효과적이다. 또 하나의 적당한 후보는 메가타이서스 막시무스 유래의 PEPCK 효소이며, 이는 대장균 효소에서 속도-제한적인 것으로 여겨지는 기질인 CO2에 대해 낮은 Km을 갖는다(Chen 등, Plant Physiol 128:160-164 (2002); Cotelesage 등, Int .J Biochem . Cell Biol . 39:1204-1210 (2007)). 쿠프로아비더스 넥케이터로부터의 GTP-의존적 pepck 유전자 생성물의 동력학은 옥살로아세테이트 형성을 선호한다(US8048624 and Lea 등, Amino Acids 20:225-41 (2001)).
표 92
Figure pct00093
옥살로아세테이트 탈탄산효소는 옥살로아세테이트의 말로네이트 세미알데하이드로의 탈카복실화를 촉진한다. 이 반응을 촉진하는 효소는 미코박테리아 투버큘로시스의 kgd(GenBank ID: O50463.4, GI: 160395583)를 포함한다. 옥살로아세테이트에 대해 개선된 활성 및/또는 기질 특이성을 갖는 kgd로부터 진화된 효소들이 또한 기술되어 왔다(US 특허 8048624). 이 반응을 촉진하는데 유용한 부가적 효소는 하기 표에 나타난 케토-산 탈탄산효소를 포함한다.
표 93
Figure pct00094
케토-산의 탈카복실화는 피루베이트 탈탄산효소(EC 4.1.1.1), 벤조일포르메이트 탈탄산효소(EC 4.1.1.7), 알파-케토글루타레이트 탈탄산효소 및 분지쇄 알파-케토산 탈탄산효소를 포함하는, 다양한 기질 특이성을 갖는 다양한 효소이다. 케토-산 탈탄산효소로도 명명된, 피루베이트 탈탄산효소(PDC)는 알코올 발효에서의 핵심 효소로서, 피루베이트의 아세트알데하이드로의 탈카복실화를 촉진한다. 사카로마이세스 세레비지애 유래의 PDC1 효소는 2-케토부틸레이트, 2-케토발레레이트, 3-하이드록시피루베이트 및 2-페닐피루베이트(22)를 포함하는 지방족 2-케토산에 대해 광범위한 기질 범위를 갖는다. 이 효소는 광범위하게 연구되어 왔고, 활성 변경을 위해 조작되어 왔으며, 대장균에서 기능적으로 발현되어 왔다(Killenberg-Jabs 등, Eur.J.Biochem. 268:1698-1704 (2001); Li 등, Biochemistry . 38:10004-10012 (1999); ter Schure 등, Appl . Environ . Microbiol . 64:1303-1307 (1998)). pdc에 의해 코딩된, 자이모모나스 모빌루스 유래의 PDC 역시 광범위한 기질 범위를 가지며 상이한 기질에 대한 친화도를 변화시키는 유도 공학 연구의 대상이었다(Siegert 등, Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)). 이 효소의 결정 구조는 이용가능하다(Killenberg-Jabs 등, Eur .J. Biochem . 268:1698-1704 (2001)). 잘 규명된 기타 PDC 후보는 아세토박터 페이스테우리안스(Chandra 등, 176:443-451 (2001)) 및 클루이베로마이세스 락티스(Krieger 등, 269:3256-3263 (2002)) 유래의 효소를 포함한다.
표 94
Figure pct00095
PDC와 마찬가지로, 벤조일포르메이트 탈탄산효소(EC 4.1.1.7)는 광범위한 기질 범위를 가지며 효소 공학 연구의 표적이 되어 왔다. 슈도모나스 푸티다 유래의 효소는 광범위하게 연구되어 왔고 이 효소의 결정 구조는 이용가능하다 (Polovnikova 등, 42:1820-1830 (2003); Hasson 등, 37:9918-9930 (1998)). 슈도모나스 푸티다 효소의 활성 부위에서의 두 가지 잔기의 위치지향적 돌연변이유발은 천연 및 비천연 기질의 친화도(Km)를 변화시켰다(Siegert 등, Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)). 이 효소의 특성은 유도 공학에 의해 더 변형되었다(Lingen 등, Chembiochem. 4:721-726 (2003); Lingen 등, Protein Eng 15:585-593 (2002)). mdlC에 의해 코딩된 슈도모나스 카복시디보란스 유래의 효소 역시 실험적으로 규명되었다(Barrowman 등, 34:57-60 (1986)). 슈도모나스 스투체리, 슈도모나스 플루오레스센스 및 다른 유기체 유래의 부가적인 유전자 후보들은 서열 상동성에 의해 추론되거나 슈도모나스 푸티다에서 개발된 성장 선택 시스템을 이용하여 확인될 수 있다(Henning 등, Appl . Environ . Microbiol . 72:7510-7517 (2006)).
표 95
Figure pct00096
2-옥소산을 탈카복실화할 수 있는 제 3 효소는 알파-케토글루타레이트 탈탄산효소(KGD, EC 4.1.1.71)이다. 이러한 부류의 효소의 기질 범위는 현재까지 연구되지 않았다. 예시적인 KDC는 미코박테리아 투버큘로시스 내의 kad에 의해 코딩된다(Tian 등, PNAS 102:10670-10675 (2005)). KDC 효소 활성은 또한 브래디히조비움 야포니쿰 및 메조히조비움 로티를 포함하는 몇 가지 근류균 종에서 검출되었다(Green 등, J Bacteriol 182:2838-2844 (2000)). KDC-코딩 유전자(들)이 이들 유기체에서 분리되지 않았음에도 불구하고, 게놈 서열이 이용가능하며, 각 게놈 내의 몇 가지 유전자는 추정 KDC로 표기된다. 유글레나 그라실리스 유래의 KDC 역시 규명되었지만, 이 활성과 연관된 유전자는 현재까지 확인되지 않았다(Shigeoka 등, Arch.Biochem.Biophys. 288:22-28 (1991)). N-말단으로부터 시작되는 첫 번째 20개 아미노산은 서열분석된 MTYKAPVKDVKFLLDKVFKV(서열번호:8)이다(Shigeoka and Nakano, Arch. Biochem . Biophys . 288:22-28 (1991)). 상기 유전자는 KDC 활성을 위해 이 N-말단 서열을 함유하는 후보 유전자를 시험함으로써 확인될 수 있다. 신규 클래스의 AKG 탈탄산효소 효소는 사이네초코쿠스 종 PCC 7002와 같은 시아노박테리아 및 동족체들에서 최근에 확인되었다(Zhang and Bryant, Science 334:1551-3 (2011)).
표 96
Figure pct00097
이 반응을 촉매하기 위한 제 4 후보 효소는 분지된 사슬 알파-케토산 탈탄산효소(BCKA)이다. 이러한 부류의 효소는 3 내지 6개의 탄소로 사슬 길이가 다른 다양한 화합물에 작용하는 것으로 나타났다(Oku 등, J Biol Chem . 263:18386-18396 (1988); Smit 등, Appl Envrion Microbiol 71:303-311 (2005)). 락토코쿠스 락티스 내의 상기 효소가 2-옥소부타노에이트, 2-옥소헥사노에이트, 2-옥소펜타노에이트, 3-메틸-2-옥소부타노에이트, 4-메틸-2-옥소부타노에이트 및 이소카프로에이트를 포함하는 다양한 분지 및 선형 기질 상에서 규명되어 왔다(Smit 등, Appl Envrion Microbiol 71:303-311 (2005)). 상기 효소는 구조적으로 규명되었다(Berg 등, Science. 318:1782-1786 (2007)). 락토코쿠스 락티스 효소 및 자이모모나스 모빌루스의 피루베이트 탈탄산효소 간의 서열 정렬은 촉매적 및 기질 인식 잔기들이 거의 동일하다는 것을 가리키며(Siegert 등, Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)), 따라서 이 효소는 유도 공학을 위한 유망한 후보일 것이다. 사카로마이세스 세레비시아의 몇 가지 케토산 탈탄산효소는 ARO10, PDC6, PDC5, PDC1 및 THI3을 포함하는, 분지된 기질의 탈카복실화를 촉진한다(Dickenson 등, J Biol Chem 275:10937-42 (2000)). 또 하나의 BCKAD 효소는 미코박테리아 투버큘로시스의 rv0853c에 의해 코딩된다(Werther 등, J Biol Chem 283:5344-54 (2008)). 이 효소는 알파-케토산 기질에 의해 알로스테릭 활성화된다. BCKA에 의한 알파-케토글루타레이트의 탈카복실화가 바실러스 서브틸리스에서 검출되었으나, 이 활성은 다른 분지쇄 기질에 대한 활성에 비해 낮았고(5%)(Oku and Kaneda, J Biol Chem . 263:18386-18396 (1988)) 이 효소를 코딩하는 유전자는 현재까지 확인되지 않았다. 부가적인 BCKA 유전자 후보가 락토코쿠스 락티스 단백질 서열에 대한 상동성에 의해 확인될 수 있다. 이 효소에 대한 많은 고-평점 BLASTp 히트는 인돌피루베이트 탈탄산효소(EC 4.1.1.74)로서 표기된다. 인돌피루베이트 탈탄산효소(IPDA)는 식물 및 식물 박테리아에서 인돌피루베이트의 인돌아세트알데하이드로의 탈카복실화를 촉진하는 효소이다. 호모사피엔스 및 보스 타우루스 유래의 미토콘드리아 분지쇄 케토산 탈수소효소 복합체의 E1 서브유닛으로부터 유도된 재조합 분지된 사슬 알파-케토 산 탈탄산효소가 클로닝되었고, 대장균에서 기능적으로 발현되었다(Davie 등, J. Biol . Chem . 267:16601-16606 (1992); Wynn 등, J. Biol . Chem . 267:12400-12403 (1992); Wynn 등, J. Biol . Chem . 267:1881-1887 (1992)). 이들 연구에서, 저자들은 샤페로닌 GroEL 및 GroES의 공동-발현이 탈탄산효소의 비활성을 500배까지 증대시켰다는 것을 발견하였다(Wynn 등, J.Biol.Chem. 267:12400-12403 (1992)). 이들 효소는 두 개의 알파 및 두 개의 베타 서브유닛으로 구성된다.
표 97
Figure pct00098
3-포스포노피루베이트 탈탄산효소(EC 4.1.1.82)는 3-포스포노피루베이트의 2-포스포노아세트알데하이드로의 탈카복실화를 촉진한다. 예시적인 포스포노피루베이트 탈탄산효소는 스트렙토마이세스 루리더스의 dhpF, 스트렙토마이세스 비리도크로모겐의 ppd, 스트렙토마이세스 웨드모렌시스의 fom2 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피우스의 bcpC에 의해 코딩된다(Circello 등, Chem Biol 17:402-11 (2010); Blodgett 등, FEMS Microbiol Lett 163:149-57 (2005); Hidaka 등, Mol Gen Genet 249:274-80 (1995); Nakashita 등, Biochim Biophys Acta 1490:159-62 (2000)). aepY에 의해 코딩된 박테로이드 프라길리스 효소 역시 탈카복실레이트 피루베이트 및 설포피루베이트이다(Zhang 등, J Biol Chem 278:41302-8 (2003)).
표 98
Figure pct00099
대장균 내의 eda 유전자 생성물(EC 4.1.1.3)과 같은 많은 옥살로아세테이트 탈탄산효소는 옥살로아세테이트의 말단 산에 작용하여 피루베이트를 형성한다. 3-케토산 위치에서의 탈카복실화가 2-케토산 위치에서의 말로네이트 세미알데하이드 형성 탈카복실화와 경쟁하기 때문에, 이 효소 활성은 말로네이트 세미알데하이드 중간체를 통해 진행되는 경로를 갖는 숙주 균주에서 넉아웃될 수 있다.
말로닐-CoA 탈탄산효소(EC 4.1.1.9)는 말로닐-CoA의 아세틸-CoA로의 탈카복실화를 촉진한다. 효소들이 히조비움 레구미노사럼 및 아시네토박터 칼코아세티쿠스에서 규명되었다(An 등, Eur J Biochem 257: 395-402 (1998); Koo 등, Eur J Biochem 266:683-90 (1999)). 유사한 효소가 스트렙토마이세스 에리트레우스에서 규명되었다 (Hunaiti 등, Arch Biochem Biophys 229:426-39 (1984)). 재조합 인간 말로닐-CoA 탈탄산효소는 대장균에서 과발현되었다(Zhou 등, Prot Expr Pur 34:261-9 (2004)). 말로닐-CoA를 탈카복실화하는 메틸말로닐-CoA 탈탄산효소 역시 적당한 후보이다. 예를 들면, 베일로넬라 파르불라 효소는 기질로서 말로닐-CoA를 받아들인다(Hilpert 등, Nature 296:584-5 (1982)). 대장균 효소는 ygfG에 의해 코딩된다(Benning 등, Biochemistry . 39:4630-4639 (2000); Haller 등, Biochemistry. 39:4622-4629 (2000)). 상기 대장균 효소의 입체 특이성은 보고되지 않았지만, 프로피오니게늄 모데스툼(Bott 등, Eur .J. Biochem . 250:590-599 (1997)) 및 베일로넬라 파르불라(Huder 등, J. Biol . Chem . 268:24564-24571 (1993)) 내의 효소는 메틸말로닐-CoA의 (S)-입체이성질체의 탈카복실화를 촉진한다(Hoffmann 등, FEBS . Lett . 220:121-125 (1987)). P. modestum 및 V. parvula 유래의 효소는 (S)-메틸말로닐-CoA를 탈카복실화할 뿐만 아니라 에너지를 생성하는 수단으로서 세포막을 통해 나트륨 이온을 수송하는 펌프를 만들어내는 다중 서브유닛으로 구성된다.
표 99
Figure pct00100
6.2.1.a
말로네이트의 말로닐-CoA로의 활성화는 EC 클래스 6.2.1.a 내의 CoA 합성효소에 의해 촉매된다. 이 반응을 촉진하는 CoA 합성효소는 현재까지 문헌에 기술되지 않았다. 상기 기재된 몇 가지 CoA 합성효소는 도 10의 단계 K를 촉진하는데 적용될 수 있다. 이들 효소는 아세틸-CoA 합성효소(표 16, 25) 및 ADP를 형성하는 CoA 합성효소(표 17)를 포함한다.
6.4.1.a
피루베이트 카복실라제(EC 6.4.1.1)는 하나의 ATP를 소비하여 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시킨다 (단계 H). 예시적인 피루베이트 카복실라제 효소는 사카로마이세스 세레비지애 내의 PYC1(Walker 등, Biochem . Biophys . Res . Commun. 176:1210-1217 (1991) 및 PYC2 (Walker 등, supra), 및 마이코박테리움 스메그마티스 내의 pyc (Mukhopadhyay and Purwantini, Biochim . Biophys . Acta 1475:191-206 (2000))에 의해 코딩된다.
표 100
Figure pct00101
아세틸-CoA 카복실라제(EC 6.4.1.2)는 아세틸-CoA의 말로닐-CoA로의 ATP-의존적 카복실화를 촉진한다. 이 효소는 바이오틴 의존적이며 몇 가지 유기체에서 지방산 생합성 개시의 첫 번째 반응이다. 예시적인 효소는 대장균의 accABCD(Davis 등, J Biol Chem 275:28593-8 (2000)), 사카로마이세스 세레비지애 및 동족체의 ACC1(Sumper 등, Methods Enzym 71:34-7 (1981))에 의해 코딩된다.
표 101
Figure pct00102
5. 서열목록
본 명세서는 컴퓨터 판독가능한 형태(CRF)의 서열목록 사본으로 제출된다. 2012년 9월 7일에 생성되었고, 18,766 바이트 크기의 12956-192_SEQLIST.txt라는 명칭의 상기 CRF는 서열목록의 서류 사본과 동일하고 전체가 참조로써 본원에 통합되어 있다.
* * * * *
본원에 걸쳐 다양한 간행물이 언급되었다. GenBank 및 GI 번호 간행물을 포함하는 이들 전체로의 이들 간행물의 개시내용은 본 발명이 속하는 기술분야를 보다 충분히 설명하기 위해 본원에 참고로써 통합되어 있다.
본 발명이 상기 제공된 실시예 및 구현예와 관련하여 기재되었음에도 불구하고, 본원에 제공된 본 발명의 정신을 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 이뤄질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Genomatica, Inc. <120> EUKARYOTIC ORGANISMS AND METHODS FOR INCREASING THE AVAILABILITY OF CYTOSOLIC ACETYL-COA, AND FOR PRODUCING 1,3-BUTANEDIOL <130> 12956-192-228 <140> TBA <141> 2012-09-07 <150> 61/532,492 <151> 2011-09-08 <150> 61/541,951 <151> 2011-09-30 <150> 61/558,959 <151> 2011-11-11 <150> 61/649,039 <151> 2012-05-18 <150> 61/655,355 <151> 2012-06-04 <160> 8 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lacZ alpha-RI primer for PCR amplification <400> 1 gacgaattcg ctagcaagag gagaagtcga catgtccaat tcactggccg tcgttttac 59 <210> 2 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lacZ alpha-3-prime BB primer for PCR amplification <400> 2 gaccctagga agctttctag agtcgaccta tgcggcatca gagcaga 47 <210> 3 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated LpdA from E. coli K-12 MG1655 <400> 3 Met Ser Thr Glu Ile Lys Thr Gln Val Val Val Leu Gly Ala Gly Pro 1 5 10 15 Ala Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Arg Cys Ala Asp Leu Gly Leu Glu Thr 20 25 30 Val Ile Val Glu Arg Tyr Asn Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val 35 40 45 Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Leu His Val Ala Lys Val Ile Glu 50 55 60 Glu Ala Lys Ala Leu Ala Glu His Gly Ile Val Phe Gly Glu Pro Lys 65 70 75 80 Thr Asp Ile Asp Lys Ile Arg Thr Trp Lys Glu Lys Val Ile Asn Gln 85 90 95 Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met Ala Lys Gly Arg Lys Val Lys Val 100 105 110 Val Asn Gly Leu Gly Lys Phe Thr Gly Ala Asn Thr Leu Glu Val Glu 115 120 125 Gly Glu Asn Gly Lys Thr Val Ile Asn Phe Asp Asn Ala Ile Ile Ala 130 135 140 Ala Gly Ser Arg Pro Ile Gln Leu Pro Phe Ile Pro His Glu Asp Pro 145 150 155 160 Arg Ile Trp Asp Ser Thr Asp Ala Leu Glu Leu Lys Glu Val Pro Glu 165 170 175 Arg Leu Leu Val Met Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met Gly Thr 180 185 190 Val Tyr His Ala Leu Gly Ser Gln Ile Asp Val Val Val Arg Lys His 195 200 205 Gln Val Ile Arg Ala Ala Asp Lys Asp Ile Val Lys Val Phe Thr Lys 210 215 220 Arg Ile Ser Lys Lys Phe Asn Leu Met Leu Glu Thr Lys Val Thr Ala 225 230 235 240 Val Glu Ala Lys Glu Asp Gly Ile Tyr Val Thr Met Glu Gly Lys Lys 245 250 255 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val Ala Ile Gly 260 265 270 Arg Val Pro Asn Gly Lys Asn Leu Asp Ala Gly Lys Ala Gly Val Glu 275 280 285 Val Asp Asp Arg Gly Phe Ile Arg Val Asp Lys Gln Leu Arg Thr Asn 290 295 300 Val Pro His Ile Phe Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln Pro Met Leu 305 310 315 320 Ala His Lys Gly Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu Val Ile Ala 325 330 335 Gly Lys Lys His Tyr Phe Asp Pro Lys Val Ile Pro Ser Ile Ala Tyr 340 345 350 Thr Glu Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Leu Thr Glu Lys Glu Ala Lys 355 360 365 Glu Lys Gly Ile Ser Tyr Glu Thr Ala Thr Phe Pro Trp Ala Ala Ser 370 375 380 Gly Arg Ala Ile Ala Ser Asp Cys Ala Asp Gly Met Thr Lys Leu Ile 385 390 395 400 Phe Asp Lys Glu Ser His Arg Val Ile Gly Gly Ala Ile Val Gly Thr 405 410 415 Asn Gly Gly Glu Leu Leu Gly Glu Ile Gly Leu Ala Ile Glu Met Gly 420 425 430 Cys Asp Ala Glu Asp Ile Ala Leu Thr Ile His Ala His Pro Thr Leu 435 440 445 His Glu Ser Val Gly Leu Ala Ala Glu Val Phe Glu Gly Ser Ile Thr 450 455 460 Asp Leu Pro Asn Pro Lys Ala Lys Lys Lys 465 470 <210> 4 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated LpdA from E. coli K-12 MG1655 <400> 4 Met Ser Thr Glu Ile Lys Thr Gln Val Val Val Leu Gly Ala Gly Pro 1 5 10 15 Ala Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Arg Cys Ala Asp Leu Gly Leu Glu Thr 20 25 30 Val Ile Val Glu Arg Tyr Asn Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val 35 40 45 Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Leu His Val Ala Lys Val Ile Glu 50 55 60 Glu Ala Lys Ala Leu Ala Glu His Gly Ile Val Phe Gly Glu Pro Lys 65 70 75 80 Thr Asp Ile Asp Lys Ile Arg Thr Trp Lys Glu Lys Val Ile Asn Gln 85 90 95 Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met Ala Lys Gly Arg Lys Val Lys Val 100 105 110 Val Asn Gly Leu Gly Lys Phe Thr Gly Ala Asn Thr Leu Glu Val Glu 115 120 125 Gly Glu Asn Gly Lys Thr Val Ile Asn Phe Asp Asn Ala Ile Ile Ala 130 135 140 Ala Gly Ser Arg Pro Ile Gln Leu Pro Phe Ile Pro His Glu Asp Pro 145 150 155 160 Arg Ile Trp Asp Ser Thr Asp Ala Leu Glu Leu Lys Glu Val Pro Glu 165 170 175 Arg Leu Leu Val Met Gly Gly Gly Ile Ile Ala Leu Glu Met Ala Thr 180 185 190 Val Tyr His Ala Leu Gly Ser Gln Ile Asp Val Val Val Arg Lys His 195 200 205 Gln Val Ile Arg Ala Ala Asp Lys Asp Ile Val Lys Val Phe Thr Lys 210 215 220 Arg Ile Ser Lys Lys Phe Asn Leu Met Leu Glu Thr Lys Val Thr Ala 225 230 235 240 Val Glu Ala Lys Glu Asp Gly Ile Tyr Val Thr Met Glu Gly Lys Lys 245 250 255 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val Ala Ile Gly 260 265 270 Arg Val Pro Asn Gly Lys Asn Leu Asp Ala Gly Lys Ala Gly Val Glu 275 280 285 Val Asp Asp Arg Gly Phe Ile Arg Val Asp Lys Gln Leu Arg Thr Asn 290 295 300 Val Pro His Ile Phe Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln Pro Met Leu 305 310 315 320 Ala His Lys Gly Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu Val Ile Ala 325 330 335 Gly Lys Lys His Tyr Phe Asp Pro Lys Val Ile Pro Ser Ile Ala Tyr 340 345 350 Thr Glu Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Leu Thr Glu Lys Glu Ala Lys 355 360 365 Glu Lys Gly Ile Ser Tyr Glu Thr Ala Thr Phe Pro Trp Ala Ala Ser 370 375 380 Gly Arg Ala Ile Ala Ser Asp Cys Ala Asp Gly Met Thr Lys Leu Ile 385 390 395 400 Phe Asp Lys Glu Ser His Arg Val Ile Gly Gly Ala Ile Val Gly Thr 405 410 415 Asn Gly Gly Glu Leu Leu Gly Glu Ile Gly Leu Ala Ile Glu Met Gly 420 425 430 Cys Asp Ala Glu Asp Ile Ala Leu Thr Ile His Ala His Pro Thr Leu 435 440 445 His Glu Ser Val Gly Leu Ala Ala Glu Val Phe Glu Gly Ser Ile Thr 450 455 460 Asp Leu Pro Asn Pro Lys Ala Lys Lys Lys 465 470 <210> 5 <211> 364 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Candida bodinii enzyme <400> 5 Met Lys Ile Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Ala Asp 1 5 10 15 Glu Glu Lys Leu Tyr Gly Cys Thr Glu Asn Lys Leu Gly Ile Ala Asn 20 25 30 Trp Leu Lys Asp Gln Gly His Glu Leu Ile Thr Thr Ser Asp Lys Glu 35 40 45 Gly Glu Thr Ser Glu Leu Asp Lys His Ile Pro Asp Ala Asp Ile Ile 50 55 60 Ile Thr Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Leu Asp 65 70 75 80 Lys Ala Lys Asn Leu Lys Leu Val Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp 85 90 95 His Ile Asp Leu Asp Tyr Ile Asn Gln Thr Gly Lys Lys Ile Ser Val 100 105 110 Leu Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val 115 120 125 Met Thr Met Leu Val Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln 130 135 140 Ile Ile Asn His Asp Trp Glu Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala Tyr 145 150 155 160 Asp Ile Glu Gly Lys Thr Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly 165 170 175 Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Leu Pro Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu 180 185 190 Tyr Tyr Gln Arg Gln Ala Leu Pro Lys Glu Ala Glu Glu Lys Val Gly 195 200 205 Ala Arg Arg Val Glu Asn Ile Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp Ile 210 215 220 Val Thr Val Asn Ala Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu Ile Asn 225 230 235 240 Lys Glu Leu Leu Ser Lys Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu Val Asn Thr 245 250 255 Ala Arg Gly Ala Ile Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Leu Glu 260 265 270 Ser Gly Gln Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro 275 280 285 Ala Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly Ala 290 295 300 Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln 305 310 315 320 Thr Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Lys Asn Ile Leu Glu Ser Phe Phe Thr 325 330 335 Gly Lys Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Leu Leu Asn Gly Glu 340 345 350 Tyr Val Thr Lys Ala Tyr Gly Lys His Asp Lys Lys 355 360 <210> 6 <211> 364 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Candida bodinii enzyme <400> 6 Met Lys Ile Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Ala Asp 1 5 10 15 Glu Glu Lys Leu Tyr Gly Cys Thr Glu Asn Lys Leu Gly Ile Ala Asn 20 25 30 Trp Leu Lys Asp Gln Gly His Glu Leu Ile Thr Thr Ser Asp Lys Glu 35 40 45 Gly Glu Thr Ser Glu Leu Asp Lys His Ile Pro Asp Ala Asp Ile Ile 50 55 60 Ile Thr Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Leu Asp 65 70 75 80 Lys Ala Lys Asn Leu Lys Leu Val Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp 85 90 95 His Ile Asp Leu Asp Tyr Ile Asn Gln Thr Gly Lys Lys Ile Ser Val 100 105 110 Leu Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val 115 120 125 Met Thr Met Leu Val Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln 130 135 140 Ile Ile Asn His Asp Trp Glu Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala Tyr 145 150 155 160 Asp Ile Glu Gly Lys Thr Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly 165 170 175 Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Leu Pro Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu 180 185 190 Tyr Tyr Ser Pro Gln Ala Leu Pro Lys Glu Ala Glu Glu Lys Val Gly 195 200 205 Ala Arg Arg Val Glu Asn Ile Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp Ile 210 215 220 Val Thr Val Asn Ala Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu Ile Asn 225 230 235 240 Lys Glu Leu Leu Ser Lys Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu Val Asn Thr 245 250 255 Ala Arg Gly Ala Ile Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Leu Glu 260 265 270 Ser Gly Gln Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro 275 280 285 Ala Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly Ala 290 295 300 Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln 305 310 315 320 Thr Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Lys Asn Ile Leu Glu Ser Phe Phe Thr 325 330 335 Gly Lys Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Leu Leu Asn Gly Glu 340 345 350 Tyr Val Thr Lys Ala Tyr Gly Lys His Asp Lys Lys 355 360 <210> 7 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Saccharomyces cerevisiae enzyme <400> 7 Met Ser Lys Gly Lys Val Leu Leu Val Leu Tyr Glu Gly Gly Lys His 1 5 10 15 Ala Glu Glu Gln Glu Lys Leu Leu Gly Cys Ile Glu Asn Glu Leu Gly 20 25 30 Ile Arg Asn Phe Ile Glu Glu Gln Gly Tyr Glu Leu Val Thr Thr Ile 35 40 45 Asp Lys Asp Pro Glu Pro Thr Ser Thr Val Asp Arg Glu Leu Lys Asp 50 55 60 Ala Glu Ile Val Ile Thr Thr Pro Phe Phe Pro Ala Tyr Ile Ser Arg 65 70 75 80 Asn Arg Ile Ala Glu Ala Pro Asn Leu Lys Leu Cys Val Thr Ala Gly 85 90 95 Val Gly Ser Asp His Val Asp Leu Glu Ala Ala Asn Glu Arg Lys Ile 100 105 110 Thr Val Thr Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His 115 120 125 Val Met Ala Thr Ile Leu Val Leu Ile Arg Asn Tyr Asn Gly Gly His 130 135 140 Gln Gln Ala Ile Asn Gly Glu Trp Asp Ile Ala Gly Val Ala Lys Asn 145 150 155 160 Glu Tyr Asp Leu Glu Asp Lys Ile Ile Ser Thr Val Gly Ala Gly Arg 165 170 175 Ile Gly Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Val Ala Phe Asn Pro Lys Lys 180 185 190 Leu Leu Tyr Tyr Ala Arg Gln Glu Leu Pro Ala Glu Ala Ile Asn Arg 195 200 205 Leu Asn Glu Ala Ser Lys Leu Phe Asn Gly Arg Gly Asp Ile Val Gln 210 215 220 Arg Val Glu Lys Leu Glu Asp Met Val Ala Gln Ser Asp Val Val Thr 225 230 235 240 Ile Asn Cys Pro Leu His Lys Asp Ser Arg Gly Leu Phe Asn Lys Lys 245 250 255 Leu Ile Ser His Met Lys Asp Gly Ala Tyr Leu Val Asn Thr Ala Arg 260 265 270 Gly Ala Ile Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Glu Ala Val Lys Ser Gly 275 280 285 Lys Leu Ala Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Asp Lys Gln Pro Ala Pro 290 295 300 Lys Asp His Pro Trp Arg Thr Met Asp Asn Lys Asp His Val Gly Asn 305 310 315 320 Ala Met Thr Val His Ile Ser Gly Thr Ser Leu Asp Ala Gln Lys Arg 325 330 335 Tyr Ala Gln Gly Val Lys Asn Ile Leu Asn Ser Tyr Phe Ser Lys Lys 340 345 350 Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Val Gln Asn Gly Ser Tyr Ala 355 360 365 Thr Arg Ala Tyr Gly Gln Lys Lys 370 375 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Euglena gracilis <220> <223> first 20 amino acids starting from the N-terminus of a KDC from Euglena gracilis <400> 8 Met Thr Tyr Lys Ala Pro Val Lys Asp Val Lys Phe Leu Leu Asp Lys 1 5 10 15 Val Phe Lys Val 20

Claims (45)

  1. 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체로서, 상기 유기체는 상기 유기체의 미토콘드리아로부터 상기 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하고/거나 상기 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 아세틸-CoA 경로는 하기:
    i. 2A, 2B 및 2D;
    ⅱ. 2A, 2C 및 2D;
    ⅲ. 2A, 2B, 2E 및 2F;
    ⅳ. 2A, 2C, 2E 및 2F;
    v. 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L; 및
    ⅵ. 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L;
    로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로를 포함하고, 여기서 2A는 시트레이트 합성효소이고; 2B는 시트레이트 수송체이고; 2C는 시트레이트/옥살로아세테이트 수송체 또는 시트레이트/말레이트 수송체이고; 2D는 ATP 시트레이트 분해효소이고; 2E는 시트레이트 분해효소이고; 2F는 아세틸-CoA 합성효소이고; 2K는 아세테이트 키나아제이고; 2L은 포스포트랜스아세틸라제인 비-자연 발생 진핵 유기체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 아세틸-CoA 경로는 2G, 3I 및/또는 3J를 추가로 포함하고, 여기서 2G는 옥살로아세테이트 수송체이고, 3H는 세포질 말레이트 탈수소효소이고, 3I는 말레이트 수송체이고, 3J는 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소인 유기체.
  3. 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체로서, 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 아세틸-CoA 경로는 하기:
    i. 5A 및 5B;
    ⅱ. 5A, 5C 및 5D;
    ⅲ. 5E, 5F, 5C 및 5D; 및
    ⅳ. 5G 및 5D;
    로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로를 포함하고, 여기서 5A는 피루베이트 산화효소 (아세테이트 형성)이고; 5B는 아세틸-CoA 합성효소, 리가제 또는 전이효소이고; 5C는 아세테이트 키나아제이고; 5D는 포스포트랜스아세틸라제이고; 5E는 피루베이트 탈탄산효소이고, 5F는 아세트알데하이드 탈수소효소이고; 5G는 피루베이트 산화효소 (아세틸-포스페이트 형성)인 비-자연 발생 진핵 유기체.
  4. 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체로서, 상기 유기체는 상기 유기체의 미토콘드리아 및/또는 페록시솜으로부터 상기 유기체의 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하고/거나 상기 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 아세틸-CoA 경로는 하기:
    i. 6A, 6D 및 6C; 및
    ⅱ. 6B, 6E 및 6C;
    로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로를 포함하고, 여기서 6A는 미토콘드리아 아세틸카르니틴 전이효소이고; 6B는 페록시솜 아세틸카르니틴 전이효소이고; 6C는 세포질 아세틸카르니틴 전이효소이고; 6D는 미토콘드리아 아세틸카르니틴 트랜스로카제이고; 6E는 페록시솜 아세틸카르니틴 트랜스로카제인 비-자연 발생 진핵 유기체.
  5. 아세틸-CoA 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체로서, 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 아세틸-CoA 경로는 하기:
    i. 10A, 10B 및 10C;
    ⅱ. 10N, 10H, 10B 및 10C;
    ⅲ. 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C;
    ⅳ. 10A, 10B, 10G 및 10D;
    v. 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D;
    ⅵ. 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D;
    ⅶ. 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D;
    ⅷ. 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D;
    ⅸ. 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D;
    x. 10A, 10F 및 10D;
    xi. 10N, 10H, 10F 및 10D; 및
    ⅶ. 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D;
    로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로를 포함하고, 여기서 10A는 PEP 카복실라제 또는 PEP 카복시키나아제이고; 10B는 옥살로아세테이트 탈탄산효소이고; 10C는 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소 (아세틸화)이고; 10D는 말로닐-CoA 탈탄산효소이고; 10F는 옥살로아세테이트 탈수소효소 또는 옥살로아세테이트 산화환원효소이고; 10G는 말로닐-CoA 환원효소이고; 10H는 피루베이트 카복실라제이고; 10J는 말로네이트 세미알데하이드 탈수소효소이고; 10K는 말로닐-CoA 합성효소 또는 전이효소이고; 10L은 말산 효소이고; 10M은 말레이트 탈수소효소 또는 산화환원효소이고; 10N은 피루베이트 키나아제 또는 PEP 포스파타제인 비-자연 발생 진핵 유기체.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 진핵 유기체는 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 외인성 핵산 각각을 포함하는 유기체.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 하나의 항에 있어서, 1,3-부탄디올 (1,3-BDO) 경로를 추가로 포함하고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 1,3-BDO 경로는 하기:
    i. 4A, 4E, 4F 및 4G;
    ⅱ. 4A, 4B 및 4D;
    ⅲ. 4A, 4E, 4C 및 4D;
    ⅳ. 4A, 4H 및 4J;
    v. 4A, 4H, 4I 및 4G;
    ⅵ. 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G;
    ⅶ. 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G;
    ⅷ. 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G;
    ⅸ. 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G;
    x. 7E, 7F, 4B 및 4D;
    xi. 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D;
    ⅶ. 7E, 7F, 4H 및 4J;
    xⅲ. 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G;
    xⅳ. 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G;
    xv. 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 및
    xⅵ. 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G;
    로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로를 포함하고, 여기서 4A는 아세토아세틸-CoA 티올라제이고; 4B는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성)이고; 4C는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원)이고; 4D는 4-하이드록시,2-부타논 환원효소이고; 4E는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성)이고; 4F는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원)이고; 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 4H는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원)이고; 4I는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성)이고; 4J는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성)이고; 4K는 아세토아세틸-CoA 전이효소, 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 아세토아세틸-CoA 합성효소, 또는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제이고; 4L은 아세토아세테이트 환원효소이고; 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소, 가수분해효소, 또는 합성효소이고; 4N은 3-하이드록시부티레이트 환원효소이고; 4O는 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소이고; 7E는 아세틸-CoA 카복실라제이고; 7F는 아세토아세틸-CoA 합성효소인 유기체.
  8. 청구항 7에 있어서,
    i. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    ⅱ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (ⅱ) 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    ⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    ⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    v. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    ⅵ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    ⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    ⅷ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B 및 2D를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    ⅸ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    x. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    xi. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    ⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    xⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    xⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    xv. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    xⅵ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C 및 2D를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    xⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    xⅷ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    xⅸ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    xx. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    xxi. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    xⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    xxⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 또는 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    xxⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E 및 2F를 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    xxv. (1) 2A, 2C, 2E 및 2F 및 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    xxⅵ. (1) 2A, 2C, 2E 및 2F 및 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    xxⅶ. (1) 2A, 2C, 2E 및 2F 및 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    xxⅷ. (1) 2A, 2C, 2E 및 2F 및 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    xxⅸ. (1) 2A, 2C, 2E 및 2F 및 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    xxx. (1) 2A, 2C, 2E 및 2F 및 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    xxxi. (1) 2A, 2C, 2E 및 2F 및 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    xxⅶ. (1) 2A, 2C, 2E 및 2F 및 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    xxxⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    xxxⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (ⅱ) 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    xxxv. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    xxxⅵ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    xxxⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    xxxⅷ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    xxxⅸ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    xl. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L을 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    xli. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    xlⅱ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 (ⅱ) 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    xlⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    xlⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    xlv. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    xlⅵ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    xlⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    xlⅷ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L을 포함하고 (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    xlⅸ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    l. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    li. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    lⅱ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    lⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    lⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    lv. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    lⅵ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5A 및 5B를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    lⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    lⅷ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    lⅸ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    lx. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    lxi. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    lⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    lxⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    lxⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5A, 5C 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    lxv. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    lxⅵ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    lxⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    lxⅷ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    lxⅸ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    lxx. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    lxxi. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    lxⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5E, 5F, 5C 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    lxxⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    lxxⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    lxxv. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    lxxⅵ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    lxxⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    lxxⅷ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    lxxⅸ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고; 또는
    lxxx. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5G 및 5D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    lxxxi. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    lxxⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    lxxxⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    lxxxⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    lxxxv. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    lxxxⅵ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    lxxxⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    lxxxⅷ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 6A, 6D 및 6C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    lxxxⅸ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    xc. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    xci. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    xcⅱ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    xcⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    xcⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    xcv. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    xcⅵ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 6B, 6E 및 6C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    xcⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    xcⅷ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    xcⅸ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    c. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    ci. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    cⅱ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    cⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    cⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    cv. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    cⅵ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    cⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    cⅷ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    cⅸ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    cx. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    cxi. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    cⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    cxⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    cxⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    cxv. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    cxⅵ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    cxⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    cxⅷ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    cxⅸ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    cxx. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    cxxi. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    cxⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    cxxⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    cxxⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    cxxv. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    cxxⅵ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    cxxⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    cxxⅷ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    cxxⅸ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    cxxx. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    cxxxi. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    cxxⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    cxxxⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    cxxxⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    cxxxv. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    cxxxⅵ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    cxxxⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    cxxxⅷ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    cxxxⅸ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    cxl. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    cxli. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    cxlⅱ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    cxlⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    cxlⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    cxlv. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    cxlⅵ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    cxlⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    cxlⅷ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    cxlⅸ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    cl. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    cli. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    clⅱ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    clⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    clⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    clv. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    clⅵ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    clⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    clⅷ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    clⅸ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    clx. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    clxi. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    clⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    clxⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    clxⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    clxv. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    clxⅵ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    clxⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    clxⅷ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    clxⅸ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    clxx. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    clxxi. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    clxⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    clxxⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    clxxⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    clxxv. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    clxxⅵ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10A, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    clxxⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    clxxⅷ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    clxxⅸ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    clxxx. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    clxxxi. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    clxxⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    clxxxⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    clxxxⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10H, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    clxxxv. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    clxxxⅵ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    clxxxⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    clxxxⅷ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    clxxxⅸ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    cxc. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    cxci. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고; 또는
    cxcⅱ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하는 유기체.
  9. 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체:
    (1) 아세틸-CoA 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 아세틸-CoA 경로는 하기:
    i. 5J 및 5I;
    ⅱ. 5J, 5F 및 5B; 및
    ⅲ. 5H
    로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로를 포함하고; 여기서 5B는 아세틸-CoA 합성효소, 리가제 또는 전이효소이고; 5F는 아세트알데하이드 탈수소효소이고; 5H는 피루베이트 탈수소효소, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 또는 피루베이트 포르메이트 분해효소이고; 5I는 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화)이고; 5J는 트레오닌 알돌라아제이고;
    (2) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 1,3-BDO 경로는 하기:
    i. 4A, 4E, 4F 및 4G;
    ⅱ. 4A, 4B 및 4D;
    ⅲ. 4A, 4E, 4C 및 4D;
    ⅳ. 4A, 4H 및 4J;
    v. 4A, 4H, 4I 및 4G;
    ⅵ. 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G;
    ⅶ. 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G;
    ⅷ. 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G;
    ⅸ. 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G;
    x. 7E, 7F, 4B 및 4D;
    xi. 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D;
    ⅶ. 7E, 7F, 4H 및 4J;
    xⅲ. 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G;
    xⅳ. 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G;
    xv. 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 및
    xⅵ. 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G
    로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로를 포함하고; 여기서 4A는 아세토아세틸-CoA 티올라제이고; 4B는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성)이고; 4C는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원)이고, 여기서 4D는 4-하이드록시,2-부타논 환원효소이고; 4E는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성)이고; 4F는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원)이고; 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소 또는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 4H는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원)이고; 4I는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성)이고; 4J는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성)이고; 4K는 아세토아세틸-CoA 전이효소, 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 아세토아세틸-CoA 합성효소, 또는 포스포트랜스아세토아세틸라제 및 아세토아세테이트 키나아제이고; 4L은 아세토아세테이트 환원효소이고; 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소, 가수분해효소, 또는 합성효소이고; 4N은 3-하이드록시부티레이트 환원효소이고; 4O는 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소이고; 7E는 아세틸-CoA 카복실라제이고; 7F는 아세토아세틸-CoA 합성효소이다.
  10. 청구항 9에 있어서,
    i. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    ⅱ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    ⅲ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    ⅳ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    v. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    ⅵ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    ⅶ. (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    ⅷ. 여기서 (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5J 및 5I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    ⅸ. 여기서 (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    x. 여기서 (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    xi. 여기서 (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    ⅶ. 여기서 (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    xⅲ. 여기서 (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    xⅳ. 여기서 (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    xv. 여기서 (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고;
    xⅵ. 여기서 (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5J, 5F 및 5B를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하고;
    xⅶ. 여기서 (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    xⅷ. 여기서 (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4B 및 4D; 또는 7E, 7F, 4B 및 4D를 포함하고;
    xⅸ. 여기서 (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4E, 4C 및 4D; 또는 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    xx. 여기서 (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H 및 4J; 또는 7E, 7F, 4H 및 4J를 포함하고;
    xxi. 여기서 (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4I 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    xⅶ. 여기서 (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    xxⅲ. 여기서 (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G를 포함하고; 또는
    xxⅳ. 여기서 (1) 상기 아세틸-CoA 경로는 5H를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G; 또는 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G를 포함하는 유기체.
  11. 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체:
    (1) 아세토아세틸-CoA 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 아세토아세틸-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세토아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 아세토아세틸-CoA 경로는 하기를 포함하고:
    i. 8A, 8C, 8F 및 8I, 여기서 8A는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 티올라제이고; 8C는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8F는 아세토아세테이트 수송체이고; 8I는 세포질 아세토아세틸-CoA 전이효소 또는 합성효소이고; 또는
    ⅱ. 8J, 8K, 8C, 8F 및 8I; 여기서 8J는 미토콘드리아 아세틸-CoA 카복실라제이고; 8K는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 합성효소이고; 8C는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8F는 아세토아세테이트 수송체이고; 8I는 세포질 아세토아세틸-CoA 전이효소 또는 합성효소이고;
    (2) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 1,3-BDO 경로는 하기로부터 선택된 경로를 포함하고:
    i. 4E, 4F 및 4G;
    ⅱ. 4B 및 4D;
    ⅲ. 4E, 4C 및 4D;
    ⅳ. 4H 및 4J;
    v. 4H, 4I 및 4G; 및
    ⅵ. 4H, 4M, 4N 및 4G;
    여기서 4B는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알코올 형성)이고; 4C는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (알데하이드 환원)이고; 4D는 4-하이드록시,2-부타논 환원효소이고; 4E는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (CoA-의존적, 알데하이드 형성)이고; 4F는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원)이고; 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 4H는 아세토아세틸-CoA 환원효소 (케톤 환원)이고; 4I는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성)이고; 4J는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성)이고; 4L은 아세토아세테이트 환원효소이고; 4M은 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소, 가수분해효소, 또는 합성효소이고; 4N은 3-하이드록시부티레이트 환원효소이다.
  12. 청구항 11에 있어서,
    i. (1) 상기 아세토아세틸-CoA 경로는 8A, 8C, 8F 및 8I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    ⅱ. (1) 상기 아세토아세틸-CoA 경로는 8A, 8C, 8F 및 8I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4B 및 4D를 포함하고;
    ⅲ. (1) 상기 아세토아세틸-CoA 경로는 8A, 8C, 8F 및 8I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    ⅳ. (1) 상기 아세토아세틸-CoA 경로는 8A, 8C, 8F 및 8I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4H 및 4J를 포함하고;
    v. (1) 상기 아세토아세틸-CoA 경로는 8A, 8C, 8F 및 8I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4H, 4I 및 4G를 포함하고;
    ⅵ. (1) 상기 아세토아세틸-CoA 경로는 8A, 8C, 8F 및 8I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하고;
    ⅶ. (1) 상기 아세토아세틸-CoA 경로는 8J, 8K, 8C, 8F 및 8I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4E, 4F 및 4G를 포함하고;
    ⅷ. (1) 상기 아세토아세틸-CoA 경로는 8J, 8K, 8C, 8F 및 8I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4B 및 4D를 포함하고;
    ⅸ. (1) 상기 아세토아세틸-CoA 경로는 8J, 8K, 8C, 8F 및 8I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4E, 4C 및 4D를 포함하고;
    x. (1) 상기 아세토아세틸-CoA 경로는 8J, 8K, 8C, 8F 및 8I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4H 및 4J를 포함하고;
    xi. (1) 상기 아세토아세틸-CoA 경로는 8J, 8K, 8C, 8F 및 8I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4H, 4I 및 4G를 포함하고; 또는
    ⅶ. (1) 상기 아세토아세틸-CoA 경로는 8J, 8K, 8C, 8F 및 8I를 포함하고; (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4H, 4M, 4N 및 4G를 포함하는 유기체.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유기체는 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 외인성 핵산 각각을 포함하는 유기체.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 외인성 핵산은 이종기원 핵산인 유기체.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유기체는 실질적으로 혐기성 배양 배지에 있는 유기체.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 부산물 경로의 약화 또는 결실을 추가로 포함하는 유기체.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 하나 이상의 부산물 경로는 도 7, 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소 또는 아세토아세틸-CoA 티올라제에서 묘사된 하나 이상의 부산물 경로인 유기체.
  18. 청구항 16 또는 19에 있어서, 상기 부산물 경로는 하기를 포함하는 유기체:
    i. 디하이드록시아세톤를 G3P로 전환시키는 글리세롤-3-포스페이트 (G3P) 탈수소효소;
    ⅱ. G3P를 글리세롤로 전환시키는 G3P 포스파타제;
    ⅲ. 피루베이트를 아세트알데하이드로 전환시키는 피루베이트 탈탄산효소;
    ⅳ. 아세트알데하이드를 에탄올로 전환시키는 에탄올 탈수소효소;
    v. 아세틸-CoA를 아세트알데하이드로 전환시키는 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화);
    ⅵ. 아세토아세틸-CoA를 아세토아세테이트로 전환시키는 아세토아세틸-CoA 가수분해효소 또는 전이효소;
    ⅶ. 3-하이드록시부티릴-CoA (3-HBCoA)를 3-하이드록시부티레이트로 전환시키는3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 또는 전이효소;
    ⅷ. 3- 하이드록시부티르알데하이드를 3-하이드록시부티레이트로 전환시키는3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소;
    ⅸ. 1,3-부탄디올을 3-옥소부탄올로 전환시키는 1,3-부탄디올 탈수소효소;
    x. 피루베이트를 아세틸-CoA로 전환시키는 미토콘드리아 피루베이트 탈수소효소;
    xi. 3-옥소부티르알데하이드를 아세토아세테이트로 전환시키는3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소; 및/또는
    ⅶ. 아세토아세틸-CoA를 아세틸-CoA로 전환시키는 아세토아세틸-CoA 티올라제.
  19. 비-자연 발생 진핵 유기체의 미토콘드리아로부터 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는 방법으로서, 상기 방법은 비-자연 발생 진핵 유기체의 미토콘드리아로부터 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는 조건 하에서 및 충분한 기간 동안 청구항 1 내지 18 중 어느 하나의 항의 유기체를 배양하는 것을 포함하는 방법.
  20. 비-자연 발생 진핵 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 유기체의 사이토졸에서 아세틸-CoA를 증가시키는 조건 하에서 및 충분한 기간 동안 청구항 1 내지 18 중 어느 하나의 항의 유기체를 배양하는 것을 포함하는 방법.
  21. 비-자연 발생 진핵 유기체의 페록시솜으로부터 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는 방법으로서, 상기 방법은 비-자연 발생 진핵 유기체의 페록시솜으로부터 사이토졸로 아세틸-CoA를 수송하는 조건 하에서 및 충분한 기간 동안 청구항 4 또는 6 내지 19 중 어느 하나의 항의 유기체를 배양하는 것을 포함하는 방법.
  22. 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체로서, 여기서 상기 유기체는 추가로, 하기를 인코딩하는 하나 이상의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체:
    i. 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4L, 4N, 4O, 7E 및 7F로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1,3-BDO 경로 효소; 여기서 적어도 하나의 핵산은 변경되었고 이로써 핵산에 의해 인코딩된 1,3-BDO 경로 효소는 미변경된 또는 야생형 핵산에 인코딩된 1,3-BDO 경로 효소보다 NADH에 대해 더 큰 친화도를 가지며;
    ⅱ. 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4L, 4N, 4O, 7E 및 7F로 이루어진 그룹으로부터 선택된 약화된 1,3-BDO 경로 효소; 여기서 상기 약화된 1,3-BDO 경로 효소는 NAPDH-의존적이고 비변경된 또는 야생형 핵산에 인코딩된 1,3-BDO 경로 효소와 비교할 때 더 낮은 효소 활성을 가지며;
    ⅲ. 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4L, 4N, 4O, 7E 및 7F로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1,3-BDO 경로 효소; 여기서 상기 진핵 유기체는 내인성 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소의 활성을 약화시키는 하나 이상의 유전자 파손을 포함하고; 또는
    ⅳ. 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4L, 4N, 4O, 7E 및 7F로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1,3-BDO 경로 효소; 여기서 적어도 하나의 핵산은 변경되었고 이로써 핵산에 의해 인코딩된 1,3-BDO 경로 효소는 미변경된 또는 야생형 핵산에 인코딩된 1,3-BDO 경로 효소보다 NADPH에 대해 더 낮은 친화도를 갖는다.
  23. 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체:
    (1) (a) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고;
    (b) 아세틸-CoA 경로, 여기서 상기 유기체는 유기체에서 NADH를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고; 여기서 상기 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함하고:
    i. NAD-의존적 피루베이트 탈수소효소;
    ⅱ. 피루베이트 포르메이트 분해효소 및 NAD-의존적 포르메이트 탈수소효소;
    ⅲ. 피루베이트:페레독신 산화환원효소 및 NADH:페레독신 산화환원효소;
    ⅳ. 피루베이트 탈탄산효소 및 NAD-의존적 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소;
    v. 피루베이트 탈탄산효소, NAD-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 아세테이트 키나아제, 및 포스포트랜스아세틸라제; 또는
    ⅵ. 피루베이트 탈탄산효소, NAD-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 및 아세틸-CoA 합성효소;
    (2) (a) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고;
    (b) 가용성 또는 막-결합 수소전달효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산, 여기서 상기 수소전달효소는 NADH를 NADPH로 전환하는데 충분한 양으로 발현되고;
    (3) (a) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고;
    (b) NADP-의존적 인산화 또는 비-인산화 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산;
    (4) (a) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고;
    (b) 인산화 또는 비-인산화 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소; 피루베이트 탈수소효소; 포르메이트 탈수소효소; 및 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소로 이루어진 그룹으로부터 선택된 NAD(P)H 보조인자 효소를 인코딩하는 하나 이상의 내인성 및/또는 외인성 핵산; 여기서 NAD(P)H 보조인자 효소를 인코딩하는 하나 이상의 핵산은 변경되었고 이로써 핵산에 의해 인코딩된 NAD(P)H 보조인자 효소는 미변경된 또는 야생형 핵산에 의해 인코딩된 NAD(P)H 보조인자 효소보다 NADPH에 대해 더 큰 친화도를 가지며; 또는
    (5) (a) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 NADPH 의존적 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고;
    (b) 인산화 또는 비-인산화 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소; 피루베이트 탈수소효소; 포르메이트 탈수소효소; 및 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소로 이루어진 그룹으로부터 선택된 NAD(P)H 보조인자 효소를 인코딩하는 하나 이상의 내인성 및/또는 외인성 핵산; 여기서 NAD(P)H 보조인자 효소 핵산을 인코딩하는 하나 이상의 핵산은 변경되었고 이로써 그 핵산이 인코딩하는 NAD(P)H 보조인자 효소는 미변경된 또는 야생형 핵산에 의해 인코딩된 NAD(P)H 보조인자 효소보다 NADH에 대해 더 작은 친화도를 갖는다.
  24. 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체:
    (1) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고;
    (2) 펜토스 포스페이트 경로, 여기서 상기 유기체는 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 6-포스포글루코노락토나제, 및 6 포스포글루코네이트 탈수소효소 (탈카복실화)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펜토스 포스페이트 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함한다.
  25. 청구항 24에 있어서, 펜토스 포스페이트 경로로 대사 유동을 증가시키는 유전적 변경을 추가로 포함하는 진핵 유기체.
  26. 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체:
    (1) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고;
    (2) 엔트너 듀도르프 경로, 여기서 상기 유기체는 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 6-포스포글루코노락토나제, 포스포글루코네이트 탈수효소, 및 2-케토-3-데옥시글루코네이트 6-포스페이트 알돌라아제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 엔트너 듀도르프 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함한다.
  27. 청구항 26에 있어서, 엔트너 듀도르프 경로로 대사 유동을 증가시키는 유전적 변경을 추가로 포함하는 진핵 유기체.
  28. 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체:
    (1) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 NADPH-의존적 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고;
    (2) 아세틸-CoA 경로, 여기서 상기 유기체는 유기체에서 NADPH를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세틸-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고; 여기서 상기 아세틸-CoA 경로는 하기를 포함한다:
    i. NADP-의존적 피루베이트 탈수소효소;
    ⅱ. 피루베이트 포르메이트 분해효소 및 NADP-의존적 포르메이트 탈수소효소;
    ⅲ. 피루베이트:페레독신 산화환원효소 및 NADPH:페레독신 산화환원효소;
    ⅳ. 피루베이트 탈탄산효소 및 NADP-의존적 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소;
    v. 피루베이트 탈탄산효소, NADP-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 아세테이트 키나아제, 및 포스포트랜스아세틸라제; 또는
    ⅵ. 피루베이트 탈탄산효소, NADP-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소, 및 아세틸-CoA 합성효소.
  29. 청구항 28에 있어서, 내인성 NAD-의존적 피루베이트 탈수소효소, NAD-의존적 포르메이트 탈수소효소, NADH:페레독신 산화환원효소, NAD-의존적 아실화 아세틸알데하이드 탈수소효소, 또는 NAD-의존적 아실화 아세트알데하이드 탈수소효소의 활성을 약화시키는 하나 이상의 유전자 파손을 추가로 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체.
  30. 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체로서, 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체:
    (1) 여기서 상기 유기체는,
    i. NADH 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고;
    ⅱ. 약화된 NADH 탈수소효소를 발현시키고;
    ⅲ. 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 NADH 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며;
    ⅳ. (i.) 및 (ⅱ.);
    v. (i.) 및 (ⅲ.);
    ⅵ. (ⅱ.) 및 (ⅲ.); 또는
    ⅶ. (i.), (ⅱ.) 및 (ⅲ.);
    (2) 여기서 상기 유기체는,
    i. 사이토크롬 산화효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고;
    ⅱ. 약화된 사이토크롬 산화효소를 발현시키고;
    ⅲ. 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 사이토크롬 산화효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며;
    ⅳ. (i.) 및 (ⅱ.);
    v. (i.) 및 (ⅲ.);
    ⅵ. (ⅱ.) 및 (ⅲ.); 또는
    ⅶ. (i.), (ⅱ.) 및 (ⅲ.);
    (3) 여기서 상기 유기체는,
    i. 피루베이트 탈탄산효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고;
    ⅱ. 약화된 피루베이트 탈탄산효소를 발현시키고;
    ⅲ. 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 피루베이트 탈탄산효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며;
    ⅳ. 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 피루베이트로부터 더 낮은 수준의 에탄올을 생산하고;
    v. (i.) 및 (ⅱ.);
    ⅵ. (i.) 및 (ⅲ.);
    ⅶ. (i.) 및 (ⅳ.);
    ⅷ. (ⅱ.) 및 (ⅲ.);
    ⅸ. (ⅱ.) 및 (ⅳ.);
    x. (ⅲ.) 및 (ⅳ.);
    xi. (i.), (ⅱ.) 및 (ⅲ.);
    ⅶ. (i.), (ⅲ.) 및 (ⅳ.);
    xⅲ. (ⅱ.), (ⅲ.) 및 (ⅳ.); 또는
    xⅳ. (i.), (ⅱ.), (ⅲ.) 및 (ⅳ.);
    (4) 여기서 상기 유기체는,
    i. 에탄올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고;
    ⅱ. 약화된 에탄올 탈수소효소를 발현시키고;
    ⅲ. 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 에탄올 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며;
    ⅳ. 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 에탄올을 생산하고;
    v. (i.) 및 (ⅱ.);
    ⅵ. (i.) 및 (ⅲ.);
    ⅶ. (i.) 및 (ⅳ.);
    ⅷ. (ⅱ.) 및 (ⅲ.);
    ⅸ. (ⅱ.) 및 (ⅳ.);
    x. (ⅲ.) 및 (ⅳ.);
    xi. (i.), (ⅱ.) 및 (ⅲ.);
    ⅶ. (i.), (ⅲ.) 및 (ⅳ.);
    xⅲ. (ⅱ.), (ⅲ.) 및 (ⅳ.); 또는
    xⅳ. (i.), (ⅱ.), (ⅲ.) 및 (ⅳ.);
    (5) 여기서 상기 유기체는,
    i. 말레이트 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고;
    ⅱ. 약화된 말레이트 탈수소효소를 발현시키고;
    ⅲ. 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 말레이트 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며;
    ⅳ. 말레이트-아스파르테이트 셔틀, 말레이트 옥살로아세테이트 셔틀, 및/또는 말레이트-피루베이트 셔틀의 약화 또는 차단을 가지며;
    v. (i.) 및 (ⅱ.);
    ⅵ. (i.) 및 (ⅲ.);
    ⅶ. (i.) 및 (ⅳ.);
    ⅷ. (ⅱ.) 및 (ⅲ.);
    ⅸ. (ⅱ.) 및 (ⅳ.);
    x. (ⅲ.) 및 (ⅳ.);
    xi. (i.), (ⅱ.) 및 (ⅲ.);
    ⅶ. (i.), (ⅲ.) 및 (ⅳ.);
    xⅲ. (ⅱ.), (ⅲ.) 및 (ⅳ.); 또는
    xⅳ. (i.), (ⅱ.), (ⅲ.) 및 (ⅳ.);
    (6) 여기서 상기 유기체:
    i. 아세토아세틸-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고;
    ⅱ. 약화된 아세토아세틸-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 발현시키고;
    ⅲ. 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 아세토아세틸-CoA 가수분해효소 또는 전이효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며;
    ⅳ. (i.) 및 (ⅱ.);
    v. (i.) 및 (ⅲ.);
    ⅵ. (ⅱ.) 및 (ⅲ.); 또는
    ⅶ. (i.), (ⅱ.) 및 (ⅲ.);
    (7) 여기서 상기 유기체:
    i. 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고;
    ⅱ. 약화된 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 또는 전이효소를 발현시키고;
    ⅲ. 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소 또는 전이효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며;
    ⅳ. (i.) 및 (ⅱ.);
    v. (i.) 및 (ⅲ.);
    ⅵ. (ⅱ.) 및 (ⅲ.); 또는
    ⅶ. (i.), (ⅱ.) 및 (ⅲ.);
    (8) 여기서 상기 유기체는,
    i. 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화)를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고;
    ⅱ. 약화된 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화)를 발현시키고;
    ⅲ. 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 아세트알데하이드 탈수소효소 (아실화) 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며;
    ⅳ. (i.) 및 (ⅱ.);
    v. (i.) 및 (ⅲ.);
    ⅵ. (ⅱ.) 및 (ⅲ.); 또는
    ⅶ. (i.), (ⅱ.) 및 (ⅲ.);
    (9) 여기서 상기 유기체는,
    i. a 3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고;
    ⅱ. 약화된 3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소를 발현시키고;
    ⅲ. 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 3-하이드록시부티르알데하이드 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며;
    ⅳ. (i.) 및 (ⅱ.);
    v. (i.) 및 (ⅲ.);
    ⅵ. (ⅱ.) 및 (ⅲ.); 또는
    ⅶ. (i.), (ⅱ.) 및 (ⅲ.);
    (10) 여기서 상기 유기체:
    i. 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고;
    ⅱ. 약화된 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소를 발현시키고;
    ⅲ. 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 3-옥소부티르알데하이드 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며;
    ⅳ. (i.) 및 (ⅱ.);
    v. (i.) 및 (ⅲ.);
    ⅵ. (ⅱ.) 및 (ⅲ.); 또는
    ⅶ. (i.), (ⅱ.) 및 (ⅲ.);
    (11) 여기서 상기 유기체:
    i. 1,3-부탄디올 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고;
    ⅱ. 약화된 1,3-부탄디올 탈수소효소를 발현시키고;
    ⅲ. 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 1,3-부탄디올 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며;
    ⅳ. (i.) 및 (ⅱ.);
    v. (i.) 및 (ⅲ.);
    ⅵ. (ⅱ.) 및 (ⅲ.); 또는
    ⅶ. (i.), (ⅱ.) 및 (ⅲ.); 또는
    (12) 여기서 상기 유기체:
    i. 아세토아세틸-CoA 티올라제를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고
    ⅱ. 약화된 아세토아세틸-CoA 티올라제를 발현시키고
    ⅲ. 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 아세토아세틸-CoA 티올라제 효소 활성을 가지거나 갖지 않으며;
    ⅳ. (i.) 및 (ⅱ.);
    v. (i.) 및 (ⅲ.);
    ⅵ. (ⅱ.) 및 (ⅲ.); 또는
    ⅶ. (i.), (ⅱ.) 및 (ⅲ).
  31. 청구항 1 내지 6 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유기체는 추가로, 1,3-BDO 경로를 포함하고, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 유기체:
    (1) 여기서 상기 유기체는,
    i. G3P 탈수소효소를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고;
    ⅱ. 약화된 G3P 탈수소효소를 발현시키고;
    ⅲ. 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 G3P 탈수소효소 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며;
    ⅳ. 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 글리세롤을 생산하고;
    v. (i.) 및 (ⅱ.);
    ⅵ. (i.) 및 (ⅲ.);
    ⅶ. (i.) 및 (ⅳ.);
    ⅷ. (ⅱ.) 및 (ⅲ.);
    ⅸ. (ⅱ.) 및 (ⅳ.);
    x. (ⅲ.) 및 (ⅳ.);
    xi. (i.), (ⅱ.) 및 (ⅲ.);
    ⅶ. (i.), (ⅲ.) 및 (ⅳ.);
    xⅲ. (ⅱ.), (ⅲ.) 및 (ⅳ.); 또는
    xⅳ. (i.), (ⅱ.), (ⅲ.) 및 (ⅳ.); 또는
    (2) 여기서 상기 유기체:
    i. G3P 포스파타제를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산에서 파괴를 포함하고;
    ⅱ. 약화된 G3P 포스파타제를 발현시키고;
    ⅲ. 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 G3P 포스파타제 효소 활성을 갖거나 갖지 않으며;
    ⅳ. 진핵 유기체의 야생형 버전과 비교할 때 더 낮은 수준의 글리세롤을 생산하고;
    v. (i.) 및 (ⅱ.);
    ⅵ. (i.) 및 (ⅲ.);
    ⅶ. (i.) 및 (ⅳ.);
    ⅷ. (ⅱ.) 및 (ⅲ.);
    ⅸ. (ⅱ.) 및 (ⅳ.);
    x. (ⅲ.) 및 (ⅳ.);
    xi. (i.), (ⅱ.) 및 (ⅲ.);
    ⅶ. (i.), (ⅲ.) 및 (ⅳ.);
    xⅲ. (ⅱ.), (ⅲ.) 및 (ⅳ.); 또는
    xⅳ. (i.), (ⅱ.), (ⅲ.) 및 (ⅳ.).
  32. 1,3-BDO 경로를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체로서, 여기서 상기 유기체는 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고; 여기서 상기 유기체는 추가로, 1,3-BDO 수송체를 인코딩하는 내인성 및/또는 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 1,3-BDO 수송체를 인코딩하는 핵산은 진핵 유기체로부터 1,3-BDO의 방출에 충분한 양으로 발현되는 비-자연 발생 진핵 유기체.
  33. 청구항 24 내지 32 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 1,3-BDO 경로 효소는 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4L, 4N, 및 4O로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유기체.
  34. 청구항 23 내지 33 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 1,3-BDO 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로를 포함하는 유기체:
    i. 4A, 4E, 4F 및 4G;
    ⅱ. 4A, 4B 및 4D;
    ⅲ. 4A, 4E, 4C 및 4D;
    ⅳ. 4A, 4H 및 4J;
    v. 4A, 4H, 4I 및 4G;
    ⅵ. 4A, 4H, 4M, 4N 및 4G;
    ⅶ. 4A, 4K, 4O, 4N 및 4G;
    ⅷ. 4A, 4K, 4L, 4F 및 4G
    ⅸ. 7E, 7F, 4E, 4F 및 4G;
    x. 7E, 7F, 4B 및 4D;
    xi. 7E, 7F, 4E, 4C 및 4D;
    ⅶ. 7E, 7F, 4H 및 4J;
    xⅲ. 7E, 7F, 4H, 4I 및 4G;
    xⅳ. 7E, 7F, 4H, 4M, 4N 및 4G;
    xv. 7E, 7F, 4K, 4O, 4N 및 4G; 및
    xⅵ. 7E, 7F, 4K, 4L, 4F 및 4G.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 유기체는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아세틸-CoA 경로를 포함하는 유기체:
    i. 2A, 2B 및 2D;
    ⅱ. 2A, 2C 및 2D;
    ⅲ. 2A, 2B, 2E 및 2F;
    ⅳ. 2A, 2C, 2E 및 2F;
    v. 2A, 2B, 2E, 2K 및 2L;
    ⅵ. 2A, 2C, 2E, 2K 및 2L;
    ⅶ. 5A 및 5B;
    ⅷ. 5A, 5C 및 5D;
    ⅸ. 5E, 5F, 5C 및 5D;
    x. 5G 및 5D;
    xi. 6A, 6D 및 6C;
    ⅶ. 6B, 6E 및 6C;
    xⅲ. 10A, 10B 및 10C;
    xⅳ. 10N, 10H, 10B 및 10C;
    xv. 10N, 10L, 10M, 10B 및 10C;
    xⅵ. 10A, 10B, 10G 및 10D;
    xⅶ. 10N, 10H, 10B, 10G 및 10D;
    xⅷ. 10N, 10L, 10M, 10B, 10G 및 10D;
    xⅸ. 10A, 10B, 10J, 10K 및 10D;
    xx. 10N, 10H, 10B, 10J, 10K 및 10D;
    xxi. 10N, 10L, 10M, 10B, 10J, 10K 및 10D;
    xⅶ. 10A, 10F 및 10D;
    xxⅲ. 10N, 10H, 10F 및 10D; 및
    xxⅳ. 10N, 10L, 10M, 10F 및 10D.
  36. 청구항 22 내지 35 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 내인성 및/또는 외인성 핵산은 내인성 핵산인 유기체.
  37. 청구항 22 내지 35 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 내인성 및/또는 외인성 핵산은 외인성 핵산인 유기체.
  38. 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체:
    (1) 아세토아세테이트 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 아세토아세테이트를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 아세토아세테이트 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 아세토아세테이트 경로는 8A, 8C, 및 8F를 포함하고, 여기서 8A는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 티올라제이고; 8C는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8F는 아세토아세테이트 수송체이고;
    (2) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 1,3-BDO 경로는 하기로부터 선택된 경로를 포함한다:
    i. 4O, 4N, 및 4G; 및
    ⅱ. 4L, 4F, 및 4G;
    여기서 4F는 3-옥소부티르알데하이드 환원효소 (케톤 환원)이고; 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 4L은 아세토아세테이트 환원효소이고; 4N은 3-하이드록시부티레이트 환원효소이고; 4O는 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소이다.
  39. 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체:
    (1) 3-하이드록시부티레이트 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 3-하이드록시부티레이트를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 3-하이드록시부티레이트 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 3-하이드록시부티레이트 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로를 포함하고:
    i. 8A, 8B, 8D 및 8G;
    ⅱ. 8A, 8C, 8E 및 8G;
    ⅲ. 8J, 8K, 8D 및 8G; 및
    ⅳ. 8J, 8K, 8E 및 8G;
    여기서 8A는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 티올라제이고; 8B는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 환원효소이고; 8C는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8D는 미토콘드리아 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8E는 미토콘드리아 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소이고; 8G는 3-하이드록시부티레이트 수송체이고; 8J는 미토콘드리아 아세틸-CoA 카복실라제이고; 8K는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 합성효소이고;
    (2) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 1,3-BDO 경로는 4N 및 4G를 포함하고, 여기서 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 4N은 3-하이드록시부티레이트 환원효소이다.
  40. 하기를 포함하는 비-자연 발생 진핵 유기체:
    (1) 3-하이드록시부티릴-CoA 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 3-하이드록시부티릴-CoA를 증가시키는데 충분한 양으로 발현된 3-하이드록시부티릴-CoA 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 3-하이드록시부티릴-CoA 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로를 포함하고:
    i. 8A, 8B, 8D, 8G 및 8H;
    ⅱ. 8A, 8C, 8E, 8G 및 8H;
    ⅲ. 8J, 8K, 8B, 8D, 8G, 8H; 및
    ⅳ. 8J, 8K, 8C, 8E, 8G, 8H;
    여기서 8A는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 티올라제이고; 8B는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 환원효소이고; 8C는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8D는 미토콘드리아 3-하이드록시부티릴-CoA 가수분해효소, 전이효소 또는 합성효소이고; 8E는 미토콘드리아 3-하이드록시부티레이트 탈수소효소이고; 8G는 3-하이드록시부티레이트 수송체이고; 8H는 3-하이드록시부티릴-CoA 전이효소 또는 합성효소이고; 8J는 미토콘드리아 아세틸-CoA 카복실라제이고; 8K는 미토콘드리아 아세토아세틸-CoA 합성효소이고;
    (2) 1,3-BDO 경로, 여기서 상기 유기체는 상기 유기체의 사이토졸에서 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현된 1,3-BDO 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 여기서 상기 1,3-BDO 경로는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로를 포함한다:
    i. 4I 및 4G; 및
    ⅱ. 4J;
    여기서 4I는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알데하이드 형성)이고; 여기서 4G는 3-하이드록시부티르알데하이드 환원효소이고; 4J는 3-하이드록시부티릴-CoA 환원효소 (알코올 형성)이다.
  41. 청구항 40에 있어서,
    i. (1) 3-하이드록시부티릴-CoA 경로는 8A, 8B, 8D, 8G, 및 8H를 포함하고, (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4I 및 4G를 포함하고;
    ⅱ. (1) 3-하이드록시부티릴-CoA 경로는 8A, 8C, 8E, 8G, 및 8H를 포함하고, (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4I 및 4G를 포함하고;
    ⅲ. (1) 3-하이드록시부티릴-CoA 경로는 8J, 8K, 8B, 8D, 8G, 및 8H를 포함하고, (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4I 및 4G를 포함하고;
    ⅳ. (1) 3-하이드록시부티릴-CoA 경로는 8J, 8K, 8C, 8E, 8G, 및 8H를 포함하고, (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4I 및 4G를 포함하고;
    v. (1) 3-하이드록시부티릴-CoA 경로는 8A, 8B, 8D, 8G, 및 8H를 포함하고, (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4J를 포함하고;
    ⅵ. (1) 3-하이드록시부티릴-CoA 경로는 8A, 8C, 8E, 8G, 및 8H를 포함하고, (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4J를 포함하고;
    ⅶ. (1) 3-하이드록시부티릴-CoA 경로는 8J, 8K, 8B, 8D, 8G, 및 8H를 포함하고, (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4J를 포함하고; 또는
    ⅷ. (1) 3-하이드록시부티릴-CoA 경로는 8J, 8K, 8C, 8E, 8G, 및 8H를 포함하고, (2) 상기 1,3-BDO 경로는 4J를 포함하는 유기체.
  42. 청구항 22 내지 41 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유기체는 실질적으로 혐기성 배양 배지에 있는 유기체.
  43. 1,3-BDO를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 1,3-BDO를 생산하는 조건 하에서 및 충분한 기간 동안 청구항 7 내지 17 또는 21 내지 42 중 어느 하나의 항의 유기체를 배양하는 것을 포함하는 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, 상기 유기체는 크랩트리 양성 유기체이고, 여기서 진핵 유기체는 과잉 글루코오스를 포함하는 배양 배지에 있는 방법.
  45. 하기 단계를 포함하는, 비-자연 발생 진핵 유기체에 도입될 외인성 1,3-BDO 경로 효소를 선택하는 방법으로서, 상기 외인성 1,3-BDO 경로 효소는 유기체에서 1,3-BDO를 생산하는데 충분한 양으로 발현되는 방법:
    (i) 보조인자로서 NADH를 사용하는 적어도 하나의 1,3-BDO 경로 효소의 활성을 측정하는 단계;
    (ⅱ) 보조인자로서 NADPH를 사용하는 적어도 하나의 1,3-BDO 경로 효소의 활성을 측정하는 단계; 및
    (ⅲ) 단계 (i) 및 (ⅱ)에서 측정된 바와 같이 보조인자로서 NADPH보다 NADH에 대해 더 큰 선호도를 갖는 적어도 하나의 1,3-BDO 경로 효소를 상기 유기체에 도입하는 단계.
KR1020147009246A 2011-09-08 2012-09-07 1,3-부탄디올을 생산하기 위한 진핵 유기체 및 방법 KR20140058691A (ko)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161532492P 2011-09-08 2011-09-08
US61/532,492 2011-09-08
US201161541951P 2011-09-30 2011-09-30
US61/541,951 2011-09-30
US201161558959P 2011-11-11 2011-11-11
US61/558,959 2011-11-11
US201261649039P 2012-05-18 2012-05-18
US61/649,039 2012-05-18
US201261655355P 2012-06-04 2012-06-04
US61/655,355 2012-06-04
PCT/US2012/054152 WO2013036764A1 (en) 2011-09-08 2012-09-07 Eukaryotic organisms and methods for producing 1,3-butanediol

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20140058691A true KR20140058691A (ko) 2014-05-14

Family

ID=47830417

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147009246A KR20140058691A (ko) 2011-09-08 2012-09-07 1,3-부탄디올을 생산하기 위한 진핵 유기체 및 방법

Country Status (10)

Country Link
US (2) US20130066035A1 (ko)
EP (1) EP2753699A4 (ko)
KR (1) KR20140058691A (ko)
CN (1) CN103917651A (ko)
BR (1) BR112014005352A2 (ko)
CA (1) CA2848064A1 (ko)
IN (1) IN2014CN02584A (ko)
MX (1) MX2014002787A (ko)
SG (1) SG11201400466TA (ko)
WO (1) WO2013036764A1 (ko)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
JPWO2014045781A1 (ja) * 2012-09-24 2016-08-18 昭和電工株式会社 ブタンジオール類の製造方法
AU2014239256B2 (en) 2013-03-15 2018-11-08 Genomatica, Inc. Process and systems for obtaining 1,4-butanediol from fermentation broths
EP2971021A4 (en) 2013-03-15 2016-12-21 Genomatica Inc MICROORGANISMS AND METHODS FOR PRODUCING BUTADIENE AND RELATED COMPOUNDS BY ASSIMILATING FORMAT
US10066245B2 (en) 2013-06-14 2018-09-04 Technical University Of Denmark Microbial production of 3-hydroxypropionic acid
EP3058059A4 (en) 2013-10-18 2017-09-27 Biopetrolia AB ENGINEERING OF ACETYL-CoA METABOLISM IN YEAST
US20160376600A1 (en) * 2013-11-25 2016-12-29 Genomatica, Inc. Methods for enhancing microbial production of specific length fatty alcohols in the presence of methanol
US10808262B2 (en) 2013-12-03 2020-10-20 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for improving product yields on methanol using acetyl-CoA synthesis
WO2015100338A2 (en) 2013-12-27 2015-07-02 Genomatica, Inc. Methods and organisms with increased carbon flux efficiencies
DK3194604T3 (da) 2014-09-18 2020-05-25 Genomatica Inc Ikke-naturlig mikrobielle organismer med forbedret energisk effektivitet
JP6797110B2 (ja) 2014-12-12 2020-12-09 ベルサリス、ソシエタ、ペル、アチオニＶｅｒｓａｌｉｓ Ｓ．Ｐ．Ａ． １，３−ブタジエンの１，３−ブタンジオールからの製造方法
EP3262019A1 (en) 2015-02-23 2018-01-03 Versalis S.p.A. Process for the dehydration of oxygenated compounds
CN108026214B (zh) 2015-05-30 2021-03-02 基因组股份公司 乙烯基异构酶-脱水酶、烯醇脱水酶、芳樟醇脱水酶和/或巴豆醇脱水酶及其制备和使用
CN104988162B (zh) * 2015-06-08 2020-03-17 天津大学 辅因子再生模块在增强次级代谢产物在微生物中合成的应用
CN104988168A (zh) * 2015-06-08 2015-10-21 天津大学 乙酰辅酶a增强模块在增强7-脱氢胆甾醇在微生物中合成的应用
KR101704212B1 (ko) 2015-06-12 2017-02-08 씨제이제일제당 (주) 젖산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 젖산 제조 방법
WO2017006183A1 (en) * 2015-07-08 2017-01-12 Conradie Alex Van Eck Methods and host cells for enhancing production of 1,3-butanediol
EP3325608B1 (en) * 2015-07-21 2021-11-24 The Governing Council of the University of Toronto Methods and microorganisms for the production of 1,3-butanediol
EP3359655B1 (en) * 2015-10-06 2019-11-20 DSM IP Assets B.V. Eukaryotic cell with increased production of fermentation product
SG11201803164SA (en) 2015-10-30 2018-05-30 Genomatica Inc Methanol dehydrogenase fusion proteins
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CN110730820A (zh) 2017-03-31 2020-01-24 基因组股份公司 醛脱氢酶变体和使用方法
US11898172B2 (en) 2017-03-31 2024-02-13 Genomatica, Inc. 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase variants and methods of use
US11608488B2 (en) 2017-07-11 2023-03-21 Adisseo France S.A.S. Enhanced metabolite-producing yeast
WO2019014310A1 (en) * 2017-07-13 2019-01-17 Verdezyne (Abc), Llc BIOLOGICAL METHODS FOR THE PREPARATION OF TERPENES
CA3069697A1 (en) * 2017-07-13 2019-01-17 Radici Chimica S.P.A. Biological methods for modifying cellular carbon flux
US20210079334A1 (en) 2018-01-30 2021-03-18 Genomatica, Inc. Fermentation systems and methods with substantially uniform volumetric uptake rate of a reactive gaseous component
EP3814515A2 (en) 2018-06-26 2021-05-05 Genomatica, Inc. Engineered microorganisms with g3p---> 3pg enzyme and/or fructose-1,6-bisphosphatase including those having synthetic or enhanced methylotrophy
KR20210068049A (ko) 2018-09-21 2021-06-08 베르살리스 에스.피.에이. 발효 브로스로부터 바이오-1,3-부탄디올의 정제 공정
KR20210068489A (ko) 2018-09-26 2021-06-09 게노마티카 인코포레이티드 알데하이드 데하이드로게나제 변이체 및 이의 이용 방법
WO2020077059A1 (en) * 2018-10-12 2020-04-16 Yield10 Bioscience, Inc. Genetically engineered plants that express a quinone-utilizing malate dehydrogenase
US11390889B2 (en) 2018-10-30 2022-07-19 Green Earth Institute Co., Ltd. Method for manufacturing 1,3-propanediol
CN110564662B (zh) * 2019-09-30 2022-03-25 南京农业大学 一种整合型高效表达乙醛脱氢酶枯草杆菌的构建方法
CN117701489B (zh) * 2024-02-05 2024-05-10 北京绿色康成生物技术有限公司 一种提高大肠杆菌生产1,3-丁二醇的方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996036715A1 (en) * 1995-05-18 1996-11-21 University Of Stellenbosch A method and nucleotide sequence for transforming microorganisms
US8956850B2 (en) * 2008-06-05 2015-02-17 Butamax Advanced Biofuels Llc Enhanced pyruvate to acetolactate conversion in yeast
WO2008042338A2 (en) * 2006-09-28 2008-04-10 Microbia, Inc. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
GB2487866A (en) * 2009-09-27 2012-08-08 Opx Biotechnologies Inc Method for producing 3-Hydroxypropionic acid and other products
KR20120120493A (ko) * 2009-12-10 2012-11-01 게노마티카 인코포레이티드 합성 가스 또는 기타 가스상 탄소원 및 메탄올을 1,3-부탄디올로 변환하는 방법 및 변환용 유기체
US8871488B2 (en) * 2010-06-18 2014-10-28 Butamax Advanced Biofuels Llc Recombinant host cells comprising phosphoketolases

Also Published As

Publication number Publication date
AU2012304428A1 (en) 2013-05-02
US20170247709A1 (en) 2017-08-31
MX2014002787A (es) 2014-12-08
AU2012304428B2 (en) 2016-03-17
BR112014005352A2 (pt) 2017-03-28
IN2014CN02584A (ko) 2015-08-07
EP2753699A1 (en) 2014-07-16
EP2753699A4 (en) 2015-08-19
CA2848064A1 (en) 2013-03-14
US20130066035A1 (en) 2013-03-14
WO2013036764A1 (en) 2013-03-14
SG11201400466TA (en) 2014-04-28
CN103917651A (zh) 2014-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11708589B2 (en) Microorganisms for producing 1,3-butanediol and methods related thereto
US20170247709A1 (en) Eukaryotic organisms and methods for increasing the availability of cytosolic acetyl-coa, and for producing 1,3-butanediol
US9284581B2 (en) Methods and organisms for converting synthesis gas or other gaseous carbon sources and methanol to 1,3-butanediol
KR102302146B1 (ko) 1,3-부탄다이올 생산 유기체
US20140322779A1 (en) Eukaryotic organisms and methods for increasing the availability of cytosolic acetyl-coa, and for the producing 1,3-butanediol
US20230287464A1 (en) Microorganisms and methods for the production of butadiene using acetyl-coa
TW202208621A (zh) 用於生產特定長度脂肪醇及相關化合物之微生物及方法
US20140363864A1 (en) Microorganisms and methods for the production of 1,4-cyclohexanedimethanol
KR20120068763A (ko) 아이소프로판올, ｎ-부탄올 및 아이소부탄올 생산 유기체
WO2012177601A2 (en) Microorganisms for producing isobutanol and methods related thereto
AU2012321079A1 (en) Eukaryotic organisms and methods for increasing the availability of cytosolic acetyl-CoA, and for producing 1,3-butanediol
AU2012304428B9 (en) Eukaryotic organisms and methods for producing 1,3-butanediol
AU2013203770B2 (en) Eukaryotic organisms and methods for producing 1,3-butanediol
AU2013202629B2 (en) Organisms for the production of 1,3-butanediol
AU2013203764A1 (en) Eukaryotic organisms and methods for increasing the availability of cytosolic acetyl-coa, and for producing 1,3-butanediol
AU2013203166A1 (en) Microorganisms for producing 1,3-butanediol and methods related thereto

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Withdrawal due to no request for examination