MX2012009455A

MX2012009455A - Mejoramiento de la actividad de proteinas que requieren centros fe-s.

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Publication number: MX2012009455A
Application number: MX2012009455A
Authority: MX
Inventors: Dennis Flint; Rick W Ye; Brian James Paul
Original assignee: Butamax Tm Advanced Biofuels
Priority date: 2010-02-17
Filing date: 2011-02-17
Publication date: 2012-09-07
Also published as: US9512435B2; BR112012020589A8; JP5950830B2; NZ601241A; US20170101653A1; EP2536821A4; JP2016171790A; CA2788842A1; US10308964B2; MX348605B; CA2788842C; AU2011218090A1; WO2011103300A2; MX357290B; US20120064561A1; BR112012020589B8; EP2536821A2; JP2013519397A; BR112012020589A2; AU2011218090B2

Abstract

La presente invención se relaciona con una célula huésped recombinante, particularmente, una célula de levaduras, que comprende un polipéptido dihidroxiácido deshidratasa. La invención se relaciona, además, con una célula huésped recombinante que tiene actividad específica incrementada del polipéptido dihidroxiácido deshidratasa como resultado de la expresión incrementada del polipéptido, la modulación de la biosíntesis de centros Fe-S de la célula, o una combinación de estos. Además, la presente invención incluye métodos para usar las células huésped, así como métodos para identificar polipéptidos que incrementan el flujo en una ruta de biosíntesis de centros Fe-S en una célula huésped.

Description

MEJORAMIENTO DE LA ACTIVIDAD DE PROTEINAS QUE REQUIEREN CENTROS FE-S Campo de la Invención Esta invención se relaciona, generalmente, con los campos de la microbiología y la bioquímica. Específicamente, la presente invención se relaciona con una célula huésped recombinante , particularmente, una célula de levaduras que comprende un polipéptido dihidroxi cido deshidratasa . La invención se relaciona, además, con una célula huésped recombinante que tiene actividad específica incrementada del polipéptido dihidroxiácido deshidratasa como resultado de la expresión incrementada del polipéptido, la modulación de la actividad de biosíntesis de centros Fe-S de la célula, o una combinación de estos. La presente invención incluye, además, métodos para usar las células huésped, así como métodos para identificar polipéptidos que incrementan el flujo en una ruta de biosíntesis de centros Fe-S en una célula huésped.

Antecedentes de la Invención Los centros de hierro-azufre (Fe-S) sirven de cofactores o grupos prostéticos esenciales para la función normal de la clase de proteínas que los contienen. En la clase de las proteínas que contienen centros Fe-S, se ha, descubierto que Ref . : 232992 los centros Fe-S desempeñan varias funciones. Cuando se sintetizan por primera vez en la célula, las proteínas de esta clase carecen de los centros Fe-S requeridos para su correcto funcionamiento y se denominan apoproteínas . Los centros Fe-S son creados en una serie de reacciones por proteínas involucradas en la biosíntesis de centros Fe-S y se transfieren a las apoproteínas para formar el centro Fe-S funcional que contiene holoproteínas ..

Una de estas proteínas que requiere centros Fe-S para funcionar correctamente es la dihidroxiácido deshidratasa (DHAD) (E.C. 4.2.1.9). La DHAD cataliza la conversión de 2 , 3 -dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato, y de 2,3-dihidroximetilvalerato a a-cetometilvalerato . La enzima DHAD es parte de las rutas biosintéticas naturales que producen aminoácidos de cadena ramificada (es decir, valina, isoleucina y leucina) , y. ácido pantoténico (vitamina B5) . Además, la conversión de 2, 3-dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato catalizada por la DHAD es una etapa común en las múltiples rutas biosintéticas de isobutanol que se describen en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20070092957 Al, incorporada en la presente descripción como referencia. En ella se describen, por ejemplo, la manipulación genética de microorganismos recombinantes para la producción de isobutanol .

Se desea contar con niveles altos de actividad DHAD para la producción incrementada de productos a partir de rutas biosintéticas que incluyen esta actividad enzimática, que incluyen, por ejemplo, la producción microbiana incrementada de aminoácidos de cadena ramificada, ácido pantoténico e isobutanol. Particularmente, el isobutanol es útil como aditivo para combustibles, y su fácil disponibilidad puede reducir la demanda de combustibles petroquímicos . Sin embargo, dado que todas las enzimas DHAD conocidas requieren un centro Fe-S para su funcionamiento, estas enzimas deben expresarse en un huésped que tenga la maquinaria genética para proporcionar los centros Fe-S requeridos por estas proteínas. En levaduras, la mitocondria desempeña una función esencial en la biosíntesis de centros Fe-S. Si la DHAD debe expresarse funcionalmente en el citosol de levaduras, se requiere un sistema para transportar el precursor de Fe-S requerido o la señal de la mitocondria y ensamblar el centro Fe-S en la apoproteína citosólica. Antes del trabajo de los inventores presentes, se desconocía previamente si las levaduras podían proporcionar centros Fe-S para cualquier DHAD localizada en el citoplasma (dado que la DHAD de levadura nativa se localiza en la mitocondria) y, lo que es más importante, cuando la DHAD se expresa en niveles altos en el citoplasma.

En ciertas condiciones, la velocidad de síntesis de las apoproteínas que requieren centros Fe-S puede exceder la capacidad de la célula para sintetizar y ensamblar los centros Fe-S para ellas. Las apoproteínas que carecen de estos centros que se acumulan en estas condiciones no pueden llevar a cabo su función normal. Las condiciones pueden incluir 1) la expresión de una proteína heteróloga que requiere centros Fe-S, especialmente, en cantidades altas, 2) la expresión de una proteína de biosíntesis de centros Fe-S nativa en niveles mayores que los normales, o 3) un estado en el que la capacidad de la célula huésped para sintetizar los centros Fe-S está debilitada.

Breve Descripción de la Invención En la presente invención, se describe el descubrimiento sorprendente de que las células huésped recombinantes que expresan un nivel alto de una proteína heteróloga que requiere un centro Fe-S pueden suministrar el complemento de centros Fe-S para esa proteína si se altera (n) el (los) nivel (es) de por lo menos una proteína para la captación de Fe, el uso de Fe y/o biosíntesis de centros Fe-S.

En la presente invención, se proporcionan células huésped recombinantes que comprenden por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa, en donde por lo menos un polinucleótido heterólogo comprende un plásmido con un número alto de copias o un plásmido que tiene un número de copias que se puede regular. Se proporcionan, además, células huésped recombinantes que comprenden por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratase, en donde por lo menos un polinucleótido heterólogo se integra al menos una vez en el ADN recombinante de la célula huésped. Se proporcionan, además, células huésped recombinantes que comprenden por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa, en donde la célula huésped comprende por lo menos una supreción, mutación y/o sustitución en un gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta el metabolismo del hierro o la biosíntesis de centros Fe-S. Se proporcionan, además, células huésped recombinantes que comprenden por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa y por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que afecta el metabolismo del hierro o la biosíntesis de centros Fe-S.

En modalidades, el polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S se selecciona del grupo que consiste en los genes de las Tablas 7, 8 y 9. En modalidades, el polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S se selecciona del grupo que consiste en AFT1, AFT2 , CCC1, FRA2 y GRX3 , y combinaciones de estos. En modalidades, el polipéptido está codificado por un polinucleótido que es un mutante constitutivo. En modalidades, el mutante constitutivo se selecciona del grupo que consiste en AFT1 L99A, AFT1 L102A, AFT1 C291F, AFT1 C293F, y combinaciones de estos. En modalidades, el polipeptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S está codificado por un polinucleótido que comprende un plásmido con un número alto de copias o un plásmido que tiene un número de copias que se puede regular. En modalidades, el polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S está codificado por un polinucleótido integrado por lo menos una vez en el ADN recombinante de la célula huésped. En modalidades, por lo menos una de las deleciones, mutaciones y/o sustituciones en un gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S se selecciona del grupo que consiste en CCC1, FRA2 y GRX3 , y combinaciones de estos. En modalidades, por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S se selecciona del grupo que consiste en AFT1, AFT2, sus mutantes, y combinaciones de estos.

En modalidades, por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa se expresa en múltiples copias. En modalidades, por lo menos un polinucleótido heterólogo comprende un plásmido con un número alto de copias o un plásmido que tiene un número de copias que se puede regular.

En modalidades, por lo menos un polinucleótido heterólogo se integra al menos una vez en el ADN recombinante de la célula huésped. En modalidades, se incrementa la biosíntesis de centros Fe-S en comparación con una célula huésped recombinante que tiene biosíntesis de centros Fe-S endógenos.

En modalidades, la célula huésped es una célula huésped dé levaduras. En modalidades, la célula huésped de levaduras se selecciona del grupo que consiste en Saccharo yces, SchizoSaccharo yces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, Issatchenkia y Pichia.

En modalidades, el polipéptido heterólogo que tiene, actividad dihidroxiácido deshidratasa se expresa en el citosol de la célula huésped. En modalidades, el polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tiene una secuencia de aminoácidos que coincide con el Perfil HMM de la Tabla 12 con un valor E de < 10"5, en donde el polipéptido comprende, además, las tres cisteínas conservadas, correspondientes a las posiciones 56, 129 y 201 en las secuencias de aminoácidos de la enzima DHAD de Streptococcus mutans que corresponde a la sec. con núm. de ídent.:168. En modalidades, el polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tiene una secuencia de aminoácidos con por lo menos aproximadamente 90 % de identidad con la sec. con núm. de ident . : 168 o sec. con núm. de ident.: 232. En modalidades, el polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tiene una actividad específica seleccionada del grupo que consiste en: una actividad específica mayor que aproximadamente 5 veces con respecto a la célula huésped de control que comprende por lo menos un polinucleótido heterologo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa; mayor que aproximadamente 8 veces con respecto a la célula huésped de control que comprende por lo menos un polinucleótido heterologo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa; o mayor que aproximadamente 10 veces con respecto a la célula huésped de control que comprende por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa. En modalidades, el polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tiene una actividad específica seleccionada del grupo que consiste en: una actividad específica mayor que aproximadamente 3 veces con respecto a la célula huésped de control que comprende por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa; y mayor que aproximadamente 6 veces con respecto a la célula huésped de control que comprende por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa. En modalidades, el polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tiene una actividad específica seleccionada del grupo que consiste en una actividad: mayor que aproximadamente 0.25 U/mg; mayor que aproximadamente 0.3 U/mg; mayor que aproximadamente 0.5 U/mg; mayor que aproximadamente 1.0 U/mg; mayor que aproximadamente 1.5 U/mg; mayor que aproximadamente 2.0 U/mg; mayor que aproximadamente 3.0 U/mg; mayor que aproximadamente 4.0 U/mg; mayor que aproximadamente 5.0 U/mg; mayor que aproximadamente 6.0 U/mg; mayor que aproximadamente 7.0 U/mg; mayor que aproximadamente 8.0 U/mg; mayor que aproximadamente 9.0 U/mg; mayor que aproximadamente 10.0 U/mg; mayor que aproximadamente 20.0 U/mg; y mayor que aproximadamente 50.0 U/mg .

En modalidades, la célula huésped recombinante produce isobutanol y, en modalidades, la célula huésped recombinante comprende una ruta biosintética de isobutanol.

Además, en la presente invención, se proporcionan métodos para fabricar un producto; los métodos comprenden: proporcionar una célula huésped recombinante; y poner la célula huésped recombinante en contacto con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en condiciones en las que se produce el producto; en donde el producto se selecciona del grupo que consiste en aminoácidos de cadena ramificada, ácido pantoténico, 2-metil-l-butanol, 3-metil-l-butanol, isobutanol, y combinaciones de estos. En modalidades, los métodos comprenden, además, recubrir opcionalmente el producto. En modalidades, los métodos comprenden, además, recubrir el producto.

Se proporcionan, además, métodos para fabricar isobutanol; los métodos comprenden: proporcionar una célula huésped recombinante ,· poner la célula huésped recombinante en contacto con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en condiciones en las que se produce isobutanol. En modalidades, los métodos comprenden, además, recubrir opcionalmente el isobutanol. En modalidades, los métodos comprenden, además, recubrir el isobutanol.

Además, se proporcionan métodos para la conversión de 2 , 3-dihidroxiisovalerato a -cetoisovalerato; los métodos comprenden: proporcionar una célula huésped recombinante; cultivar la célula huésped recombinante en condiciones en las que el 2 , 3 -dihidroxiisovalerato se convierte a OÍ-cetoisovalerato . En modalidades, la conversión de 2,3-dihidroxiisovalerato a -cetoisovalerato en. comparación con una célula huésped de control que comprende por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa se incrementa en una cantidad seleccionada del grupo que consiste en: (a) por lo menos aproximadamente 5 %; (b) por lo menos aproximadamente 10 %; (c) por lo menos aproximadamente 15 %; (d) por lo menos aproximadamente 20 %; (e) por lo menos aproximadamente 25 %; (f) por lo menos aproximadamente 30 %; (g) por lo menos aproximadamente 35 %; (h) por lo menos aproximadamente 40 %; (i) po lo menos aproximadamente 45 %; (j) por lo menos aproximadamente 50 %; (k) por lo menos aproximadamente 60 %; (1) por lo menos aproximadamente 70 %; (m) por lo menos aproximadamente 80 %,· (n) por lo menos aproximadamente 90 %; y (o) por lo menos aproximadamente 95 %.

Se proporcionan, además, métodos para incrementar la actividad específica de un polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa en una célula huésped recombinante; los métodos comprenden: proporcionar una célula huésped recombinante; y cultivar la célula huésped recombinante en condiciones mediante las cuales el polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa se expresa en una forma funcional que tiene una actividad específica mayor que una célula huésped igual que carece de ese polipéptido heterólogo.

Se proporcionan, además, métodos para incrementar el flujo en una ruta de biosíntesis de centros Fe-S en úna célula huésped; los métodos comprenden: proporcionar una célula huésped recombinante; y cultivar la célula huésped recombinante en condiciones mediante las cuales se incrementa el flujo en la ruta de biosíntesis de centros Fe-S en la célula huésped.

Se proporcionan, además, métodos para incrementar la actividad de una proteína que requiere centros Fe-S en una célula huésped recombinante; los métodos comprenden: proporcionar una célula huésped recombinante que comprende una proteína que requiere centros Fe-S; modificar la expresión o la actividad de un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S en la célula huésped; y cultivar la célula huésped recombinante en condiciones mediante las cuales se incrementa la actividad de la proteína que requiere centros Fe-S. En modalidades, el incremento en actividad se selecciona del grupo que consiste en una cantidad: mayor que aproximadamente 10 %; mayor que aproximadamente 20 %; mayor que aproximadamente 30 %; mayor que aproximadamente 40 %; mayor que aproximadamente 50 %; mayor que aproximadamente 60 %; mayor que aproximadamente 70 %; mayor que aproximadamente 80 %; mayor que aproximadamente 90 %; y mayor que aproximadamente 95 %, 98 % o 99 %. En modalidades, el incremento en -actividad se selecciona del grupo que consiste en una cantidad: mayor que aproximadamente 5 veces; mayor que aproximadamente 8 veces; mayor que aproximadamente 10 veces. En modalidades, el incremento en actividad se selecciona del grupo que consiste en una cantidad: mayor que aproximadamente 3 veces y mayor que aproximadamente 6 veces.

Un método para identificar polipéptidos que incrementan el flujo en una ruta de biosíntesis de centros Fe-S en una célula huésped; el método comprende: modificar la expresión o la actividad de un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S; determinar la actividad de una proteína heteróloga que requiere centros Fe-S; y comparar la actividad de la proteína heteróloga que requiere centros Fe-S, determinada en presencia de la modificación en la expresión o la actividad de un polipéptido, con respecto a la actividad de una proteína heteróloga que requiere centros Fe-S, determinada en ausencia de la modificación en la expresión o la actividad de un polipéptido, en donde un incremento en la actividad de la proteína heteróloga que requiere centros Fe-S indica un incremento en el flujo en la ruta de biosíntesis de centros Fe-S.

En la presente invención, se proporcionan métodos para identificar polipéptidos que incrementan el flujo en una ruta de biosíntesis de centros Fe-S en una célula huésped; los métodos comprenden: modificar la expresión o la actividad de un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S; determinar la actividad de un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa; y comparar la actividad del polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa, determinada en presencia de la modificación, con respecto a la actividad del polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa, determinada en ausencia de la modificación, en donde un incremento en la actividad del polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa indica un incremento en el flujo en la ruta de biosíntesis de centros Fe-S.

En modalidades, la modificación en la expresión o la actividad de un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S comprende suprimir, mutar, sustituir, expresar, regular ascendentemente, regular descendentemente, alterar la localización celular, alterar el estado de la proteína, y/o adicionar un cofactor. En modalidades, la proteína que requiere centros Fe-S tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa, y en donde la proteína que requiere centros Fe-S que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tiene una secuencia de aminoácidos que coincide con el Perfil HMM de la Tabla 12 con un valor E de < 10"5, en donde el polipéptido comprende, además, las tres cisteínas conservadas, correspondientes a las posiciones 56, 129 y 201 en las secuencias de aminoácidos de la enzima DHAD de Streptococcus mutans que corresponde a la sec. con núm. de ident.:168. En modalidades, el polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S se selecciona del grupo que consiste en los genes de las Tablas 7, 8 y 9.

Se proporcionan, además, las células huésped recombinantes que comprenden por lo menos un polinucleótido que codifica un polipéptido identificado por los métodos proporcionados en la presente descripción. En modalidades, la célula huésped comprende, además, por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa. En modalidades, el polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa se expresa en múltiples copias. En modalidades, el polinucleótido heterólogo comprende un plásmido con un número alto de copias y un plásmido que tiene un número de copias que se puede regular. En modalidades, el polinucleótido heterólogo se integra al menos una vez en el ADN recombinante de la célula huésped.

En modalidades, la célula huésped es una célula huésped de levaduras. En modalidades, la célula huésped de levaduras se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces, SchizoSaccharomyces, Hansenula, . Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, Issatchenkia y Pichia. En modalidades, el polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa se expresa en el citosol de la célula huésped. En modalidades, el polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tiene una secuencia de aminoácidos que coincide con el Perfil HMM de. la Tabla 12 con un valor E de < 10"5, en donde el polipéptido comprende, además, las tres cisteínas conservadas, correspondientes a las posiciones 56, 129 y 201 en las secuencias de aminoácidos de la enzima DHAD de Streptococcus mutans que corresponde a la sec. con núm. de ident.:168. En modalidades, la célula huésped recombinante produce un producto seleccionado del grupo que consiste en aminoácidos de cadena ramificada, ácido pantoténico, 2-metil-1-butanol, 3-metil-l-butanol, isobutanol, y combinaciones de estos. En modalidades, la célula huésped recombinante produce isobutanol. En modalidades, la célula huésped recombinante comprende una ruta biosintética de isobutanol. En modalidades, la ruta biosintética de isobutanol comprende por lo menos un polipéptido codificado por un polinucleótido heterólogo para la célula huésped. En modalidades, la ruta biosintética de isobutanol comprende por lo menos dos polipéptidos codificados por polinucleótidos heterologos para la célula huésped.

En modalidades, los monómeros de los polipéptidos de la invención que tienen actividad dihidroxiácido deshidratasa tienen una carga de centros Fe-S seleccionada del grupo que consiste en: (a) por lo menos aproximadamente 10 %; (b) por lo menos aproximadamente 15 %; (c) por lo menos aproximadamente 20 %; (d) por lo menos aproximadamente 25 %; (e) por lo menos aproximadamente 30 %; (f) por lo menos aproximadamente 35 %; (g) por lo menos aproximadamente 40 %; (h) por lo menos aproximadamente 45 %; (i) por lo menos aproximadamente 50 %; (j) por lo menos aproximadamente 60 % (k) por lo menos aproximadamente 70 ¾; (1) por lo menos aproximadamente 80 %; (m) por lo menos aproximadamente 90 %; y. (n) por lo menos aproximadamente 95 %.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1A ilustra un mapa vectorial de un vector para la sobreexpresión del gen TlvD de S. mutans.

La Figura IB ilustra un mapa vectorial de un vector de integración para la sobreexpresión del gen TlvD de S. mutans en el cromosoma.

La Figura 2 ilustra un mapa vectorial de un vector con un centrómero usado para clonar AFTl o mutantes de AFTl y útil para otros genes de interés.

La Figura 3 ilustra, un espectro de absorbancia de luz ultravioleta-visible de la DHAD de S. mutans purificada.

La Figura 4 ilustra un espectro de EPR de la DHAD de S. mutans purificada.

La Figura 5 ilustra una ruta biosintética para la biosíntesis de isobutanol.

La Figura 6A ilustra un esquema de los genes nif de Azotobacter vinelandii.

La Figura 6B ilustra un esquema de otros genes nif de Azotobacter vinelandii.

La Figura 6C ilustra un esquema de la ecuación en la que NFU actúa como una persulfuro reductasa.

La Figura 7 ilustra un esquema de los genes nif de Helicobacter pylori.

La Figura 8 ilustra un esquema de los genes isc de E. coli.

La Figura 9 ilustra un esquema de los genes suf de E. coli.

La Figura 10 ilustra un esquema de la biosíntesis de [2Fe-2S] citosólicos y un sistema de ensamblado.

La Figura 11 ilustra un mapa vectorial de un vector para la sobreexpresión del gen IlvD de L. lactis.

La Tabla 12 es una tabla del Perfil HMM para dihidroxiácido deshidratasas con base en enzimas con función ensayada preparadas como se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/569,636, presentada el 29 de setiembre de 2009. La Tabla 12 se entrega en formato electrónico junto con la presente invención y se incorpora en la presente descripción como referencia.

Información del listado de secuencias El contenido del listado de secuencias entregado en formato electrónico en el archivo de texto ASCII "CL4842sequencelisting.txt", presentado con la solicitud, se incorpora en su totalidad en la presente descripción como referencia.

Descripción Detallada de la Invención En la presente invención se describe un método para incrementar la fracción de las proteínas que requieren centros Fe-S que se cargan con centros Fe-S. Se describen, además, células huésped recombinantes que expresan proteínas funcionales que requieren centros Fe-S, tales como enzimas DHAD, y por lo menos una proteína heteróloga para la captación o uso de Fe, o la biosíntesis de centros Fe-S, células huésped recombinantes que expresan enzimas funcionales DHAD y comprenden por lo menos una supreción, mutación y/o sustitución en una proteína nativa involucrada en el uso de Fe o la biosíntesis de centros Fe-S, o células huésped recombinantes que comprenden combinaciones de estos. Adicionalmente, la presente invención describe un método para identificar polipéptidos que incrementan el flujo en una ruta de biosíntesis de centros Fe-S en una célula huésped. Se describe, además, un método para identificar polipéptidos que alteran la actividad de una protelna que requiere centros Fe-S. Definiciones A menos que se defina lo contrario, todos los términos científicos y técnicos que se usan en la presente descripción tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por una persona con conocimiento ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención. En caso de disputa, prevalecerá la presente solicitud junto con las definiciones pertinentes. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán los plurales, y los términos en plural incluirán el singular. Todas las publicaciones, patentes y otras referencias mencionadas en la presente descripción se incorporan en su totalidad como referencia para todo propósito.

Con el fin de definir adicionalmente esta invención, se proporcionan los siguientes términos y definiciones en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, se comprenderá que los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye" , "tiene" , "que tiene" , "contiene" o "que contiene" , o cualquier otra variante de estos, implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros mencionados, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros. Por ejemplo, una composición, una mezcla, un proceso, un método, un artículo o un aparato que comprende una lista de elementos no se limita, necesariamente, solo a esos elementos, sino que puede incluir otros que no estén expresamente listados o sean inherentes a tal composición, mezcla, proceso, método, artículo o aparato. Además, a menos que se especifique expresamente en contrario, la disyunción se relaciona con un "o" incluyente y no con un "o" excluyente. Por ejemplo, una condición A o B se satisface mediante cualquiera de los siguientes criterios: A es verdadero (o actual) y B es falso (o no actual) , A es falso (o no actual) y B es verdadero (o actual) , y tanto A como B son verdaderos (o actuales) .

Como se usa en la presente descripción, el término "consiste en", o sus variantes, tales como "consisten en" o "que consiste (n) en" , tal como se usan en toda esta descripción y en las reivindicaciones, indican la inclusión de cualquier número entero o grupo de números enteros mencionados, pero que no puede añadirse ningún otro número entero o grupo de números enteros al método, la estructura o composición especificados.

Como se usa en la presente descripción, el término "consiste esencialmente en", o sus variantes, tales como "que consiste esencialmente en" o "que consiste (n) esencialmente en", tal como se usan en toda esta descripción y en las reivindicaciones, indican la inclusión de cualquier número entero o grupo de números enteros mencionados y la inclusión opcional de cualquier número entero o grupo de números enteros mencionados que no modifiquen materialmente las propiedades básicas o novedosas del método, la estructura o composición especificados. Ver M.P.E.P. § 2111.03.

Además, los artículos indefinidos "un (a)" y "unos (as)" que preceden a un elemento o componente de la invención están previstos para ser no restrictivos con respecto a la cantidad de instancias, es decir, apariciones, del elemento o componente. Por consiguiente, "un (a)" o "unos (as)" deben interpretarse para incluir uno o al menos uno, y la forma singular de la palabra del elemento o componente incluye, además, el plural, a menos que el número, obviamente, indique que es singular.

El término "invención" o "presente invención", tal como se usa en la presente descripción, es un término no limitante y no está previsto para referirse a cualquier modalidad individual de la invención particular, sino que abarca todas las modalidades posibles según se describen en la solicitud.

Como se usa en la presente descripción, el término "aproximadamente" , que modifica la cantidad de un ingrediente o reactivo empleados en la invención, se refiere a la variación que puede producirse en la cantidad numérica, por ejemplo, a través de procedimientos típicos de manejo de líquidos y de mediciones usados para preparar concentrados o soluciones en el mundo real; a través de errores inadvertidos en estos procedimientos; a través de diferencias en la fabricación, procedencia o pureza de los ingredientes empleados para preparar las composiciones o llevar a cabo los métodos; y similares. El término "aproximadamente" abarca, además, cantidades que difieren debido a condiciones de equilibrio diferentes para una composición que resulta de una mezcla inicial particular. Estén o no modificadas por el término "aproximadamente" , las reivindicaciones incluyen equivalentes para las cantidades. En una modalidad, el término "aproximadamente" significa una cantidad dentro del 10 % del valor numérico reportado, preferentemente, dentro del 5 % del valor numérico reportado.

El término "ruta biosintética de isobutanol" se refiere a una ruta enzimática para producir isobutanol a partir de piruvato.

La frase "un anaerobio facultativo" se refiere a un microorganismo que puede crecer en ambientes tanto aerobios como anaerobios .

Las frases "sustrato de carbono" o "sustrato de carbono fermentable" se refieren a una fuente de carbono capaz de ser metabolizada por organismos huésped de la presente invención y, particularmente, a fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste en monosacáridos , oligosacáridos , polisacáridos y sustratos de un solo carbono, o mezclas de estos.

La frase "biosíntesis de centros Fe-S" se refiere a la biosíntesis de centros Fe-S e incluye, por ejemplo, el ensamblado y carga de los centros Fe-S. Las frases "genes para la biosíntesis de centros Fe-S" , "proteínas para la biosíntesis de centros Fe-S" o "ruta de biosíntesis de centros Fe-S" se refieren a los polinucleótidos/genes y los polipéptidos codificados que están involucrados en la biosíntesis de centros Fe-S e incluyen, por ejemplo, el ensamblado y la carga de centros Fe-S.

La frase "captación y uso de Fe" se refiere a procesos que pueden afectar la biosíntesis de centros Fe-S, tales como la detección, la captación, el uso y la homeostasis de Fe. La frase "genes para captación y uso de Fe" se refiere a aquellos polinucleótidos/genes y los polipéptidos codificados que están involucrados en la captación, el uso y la homeostasis dé Fe. Algunos de estos polinucleótidos/genes están incluidos en el "regulador de Fe" que se ha descrito en la literatura y se describe, adicionalmente, más adelante. Como se usa en la presente invención, los genes para uso y captación de Fe y los genes para la biosíntesis de centros Fe-S pueden codificar un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S.

El término "actividad específica" , como se usa en la presente descripción, se define como las unidades de actividad en una cantidad dada de proteína. Así, la actividad específica no se determina directamente, sino que se calcula al dividir 1) la actividad en unidades/ml de la muestra de enzimas por 2) la concentración de proteína en esa muestra, para que la actividad específica se exprese como unidades/mg. La actividad específica de una muestra de enzima pura totalmente activa es una característica de esa enzima. La actividad específica de una muestra de una mezcla de proteínas es una medida de la fracción relativa de proteína en esa muestra que se compone de la enzima activa de interés. La actividad específica de un polipéptido de la invención puede seleccionarse de una actividad mayor que aproximadamente 0.25 U/mg; mayor que aproximadamente 0.3 U/mg; mayor que aproximadamente 0.4 U/mg; mayor que aproximadamente 0.5 U/mg; mayor que aproximadamente 0.6 U/mg; mayor que aproximadamente 0.7 U/mg; mayor que aproximadamente 0.8 U/mg; mayor que aproximadamente 0.9 U/mg; mayor que aproximadamente 1.0 U/mg; mayor que aproximadamente 1.5 U/mg; mayor que aproximadamente 2.0 U/mg; mayor que aproximadamente 2.5 U/mg; mayor que aproximadamente 3.0 u/mg; mayor que aproximadamente 3.5 U/mg; mayor que aproximadamente 4.0 U/mg; mayor que aproximadamente 5.5 U/mg; mayor que aproximadamente 5.0 U/mg; mayor que aproximadamente 6.0 U/mg; mayor que aproximadamente 6.5 U/mg; mayor que aproximadamente 7.0 U/mg; mayor que aproximadamente 7.5 U/mg; mayor que aproximadamente 8.0 U/mg; mayor que aproximadamente 8.5 U/mg; mayor que aproximadamente 9.0 U/mg; mayor que aproximadamente 9.5 U/mg; mayor que aproximadamente 10.0 U/mg; mayor que' aproximadamente 20.0 U/mg; o mayor que aproximadamente 50.0 U/mg. En una modalidad, la actividad específica de un polipéptido de la invención es mayor que aproximadamente 0.25 U/mg. En otra modalidad, la actividad específica es mayor que aproximadamente 1.0 U/mg. En aún otra modalidad, la actividad específica es mayor que aproximadamente 2. O U/mg o mayor que aproximadamente 3.0 U/mg.

El término "polinucleótido" está previsto para abarcar la forma singular así como la plural de "ácido nucleico" , y se refiere a una molécula o constructo de ácido nucleico, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN plasmídico (ADNp) . Un polinucleótido puede contener la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ADNc de longitud completa, o un fragmento de esta, que incluye las secuencias 51 y 31 no traducidas y las secuencias codificantes. El polinucleótido puede estar compuesto de cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden componerse de ADN monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenario, y ARN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarios o, más típicamente, bicatenarios, o una mezcla de regiones monocatenarias o bicatenarias. El término "polinucleótido" abarca formas química, enzimática o metabólicamente modificadas.

Una secuencia de polinucleótidos puede mencionarse como "aislado" , en el que esta se ha eliminado de su ambiente de origen. Por ejemplo, un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido o fragmento polipeptídico que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa incluido en un vector se considera aislado para los fines de la presente invención. Los ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterólogas o polinucleótidos (parcial o prácticamente) purificados en solución. Los ácidos nucleicos o polinucleótidos aislados de conformidad con la presente invención incluyen, además, las moléculas producidas sintéticamente. Un fragmento del polinucleótido aislado en la forma de un polímero de ADN puede comprender uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

El término "gen" se refiere un polinucleótido que es capaz de expresarse como una proteína específica, que incluye, opcionalmente, secuencias reguladoras antes (secuencias no codificantes 5') y después (secuencias no codificantes 3') de la secuencia codificante. "Gen nativo" se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza, con sus propias secuencias reguladoras . "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no sea un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. En consecuencia, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se derivan de fuentes diferentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se derivan de la misma fuente, pero que están organizadas de una forma diferente a la encontrada en la naturaleza.

Como se usa en la presente descripción, una "región codificante" es una porción de ácido nucleico que consiste en codones traducidos a aminoácidos. Aunque un "codón de terminación" (TAG, TGA, o TAA) no se traduce a un aminoácido, puede considerarse parte de una región codificante, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo, promotores, sitios de unión al ribosoma, terminadores transcripcionales, intrones, y similares, no son parte de una región codificante. Dos o más regiones codificantes de la presente invención pueden estar presentes en un solo constructo de polinucleótidos, por ejemplo, en un solo vector, o en constructos separados de polinucleótidos, por ejemplo, en vectores separados (diferentes) . Además, cualquier vector puede contener una sola región codificante o puede comprender dos o más regiones codificantes. Adicionalmente, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la invención puede codificar regiones codificantes heterólogas .

El término "endógeno" , cuando se usa con referencia a un polinucleótido, un gen o un polipéptido, se refiere a un polinucleótido o gen nativo en su localización natural en el genoma de un organismo o, para un polipéptido nativo, se transcribe y traduce desde ese lugar en el genoma.

El término "heterólogo" , cuando se usa con referencia a un polinucleótido, un gen o un polipéptido, se refiere a un polinucleótido, gen o polipéptido que no se encuentra normalmente en el organismo huésped. "Heterólogo" incluye, además, una región codificante nativa, o porción de esta, que se reintroduce en el organismo de origen en una forma que es diferente a la del gen nativo correspondiente, por ejemplo, no en su localización natural en el genoma del organismo. El polinucleótido o gen heterólogo puede introducirse en el organismo huésped, por ejemplo, por transferencia de genes. Un gen heterólogo puede incluir una región codificante nativa con regiones reguladoras no nativas que se reintroduce en el huésped nativo. Un "transgén" es un gen que se ha introducido en el genoma por medio de un procedimiento de transformación.

La frase "elemento recombinante para expresión genética" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una o más proteínas específicas, que incluyen las secuencias reguladoras antes (secuencias no codificantes 5') y después (secuencias de terminación 3 ' ) de las secuencias codificantes para las proteínas . Un gen quimérico es un elemento recombinante de expresión genética. Las regiones codificantes de un operón pueden formar un elemento recombinante de expresión genética, junto con una región promotora y de terminación operativamente unidas .

"Secuencias reguladoras" se refiere a las secuencias de nucleótidos que se localizan corriente arriba (secuencias no codificantes 5'), dentro, o corriente abajo (secuencias no codificantes 3 ' ) de una secuencia codificante y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del AR , o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, potenciadores, operadores, represores, señales de terminación de transcripción, secuencias líderes de traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitio de procesamiento del ARN, sitio de unión a efectores y la estructura de tallo y lazo.

El término "promotor" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN funcional. Generalmente, una secuencia codificante se localiza en dirección 3' con respecto a una secuencia promotora. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo o pueden estar compuestos por elementos diferentes derivados de promotores diferentes que se encuentran en la naturaleza, o incluso comprender segmentos sintéticos de ácidos nucleicos. Los experimentados en la técnica comprenderán que distintos promotores pueden dirigir la expresión de un gen en tejidos o tipos de células diferentes, o en etapas de desarrollo diferentes, o en respuesta a condiciones ambientales o fisiológicas diferentes . Los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayoría de tipos de células la mayor parte de las veces se denominan, comúnmente, "promotores constitutivos" . Por otra parte, los "promotores inducibles" hacen que un gen se exprese cuando el promotor está inducido o activado por una señal o molécula específica para el promotor. Se entiende, además, que dado que en la mayoría de los casos los límites precisos de las secuencias reguladoras no se han definido, completamente, los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener una actividad promotora idéntica.

El término "operativamente unido" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico para que la función de una se vea afectada por la otra. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante cuando es capaz de afectar la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor) . Las secuencias codificantes pueden estar operativamente unidas a secuencias reguladoras en orientación codificante o no codificante.

Como se usa en la presente descripción, el término "expresión" se refiere a la transcripción y acumulación de ARN codificante (ARNm) o ARN no codificante derivado del fragmento de ácido nucleico de la invención. El término también puede referirse a la traducción del ARNm en un polipéptido. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del polinucleótido, gen o polipéptido expresado dentro de la célula e incluye, sin limitación, la inactivación de genes, así como también la expresión transitoria y la expresión estable.

El término "sobreexpresión" , como se usa en la presente descripción, se refiere a una expresión que es mayor que la expresión endógena de un gen o polinucleótido igual o relacionado. Un polinucleótido o gen heterólogo se sobreexpresa, además, si su expresión es mayor que la de un gen endógeno comparable, o si su expresión es mayor que la de un mismo polinucleótido o gen introducido por un medio que no sobreexpresa el polinucleótido o gen. Por ejemplo, un polinucleótido puede expresarse en una célula huésped a partir de un plásmido con un número bajo de copias, que está presente solo en algunas copias o en un número limitado de estas, y el mismo polinucleótido puede sobreexpresarse en una célula huésped a partir de un plásmido con un número alto de copias o un plásmido que tiene un número de copias que se puede regular, que está presente en múltiples copias. Puede usarse cualquier método para sobreexpresar un polinucleótido, siempre que incremente las copias del polinucleótido en la célula huésped. Adicionalmente a usar un plásmido con un número alto de copias, o un plásmido con un número de copias que se puede regular, puede sobreexpresarse un polinucleótido por integraciones cromosómicas múltiples.

La expresión o sobreexpresión de un polipéptido de la invención en una célula huésped recombinante puede cuantificarse de conformidad con cualquiera de una variedad de métodos conocidos por el técnico experimentado y puede representarse, por ejemplo, con un porcentaje de la proteína total en la célula. El porcentaje de proteína total puede seleccionarse de una cantidad mayor que aproximadamente 0.001 % de proteína total en la célula; mayor que aproximadamente 0.01 % de proteína total en la célula; mayor que aproximadamente 0.1 % de proteína total en la célula; mayor que aproximadamente 0.5 % de proteína total en la célula; mayor que aproximadamente 1.0 % de proteína total en la célula mayor que aproximadamente 2.0 % de proteína total en la célula; mayor que aproximadamente 3 % de proteína total en la célula; mayor que aproximadamente 4.0 % de proteína total en la célula; mayor que aproximadamente 5 % de proteína total en la célula; mayor que aproximadamente 6.0 % de proteína total en la célula; mayor que aproximadamente 7.0 % de proteína total en la célula; mayor que aproximadamente 8.0 % de proteína total en la célula; mayor que aproximadamente 9.0 % de proteína total en la célula; mayor que aproximadamente 10 % de proteína total en la célula; o mayor que aproximadamente 20 % de proteína total en la célula. En una modalidad, la cantidad de polipéptido expresada es mayor que aproximadamente 0.5 % de proteína tótal en la célula. En otra modalidad, la cantidad de polipéptido expresada es mayor que aproximadamente 1.0 % de proteína total en la célula o mayor que aproximadamente 2.0 % de proteína total en la célula.

Como se usa en la presente descripción, el término "transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico a un organismo huésped, lo que produce una herencia genéticamente estable con o sin selecciones. _ Los organismos huéspedes que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados se denominan organismos "transgénicos" , "recombinantes" o "transformados" .

Los términos "plásmido" y "vector" , como se usan en la presente descripción, se refieren a un elemento extracromosómico que, frecuentemente, presenta genes que no son parte del metabolismo central de la célula y, usualmente, están en la forma de moléculas circulares de ADN bicatenario. Estos elementos pueden ser secuencias que se replican autónomamente, secuencias integradoras de genomas, secuencias de nucleótidos o fagos, lineales o circulares, de un ARN o ADN mono o bicatenario, derivadas de cualquier fuente, en donde varias de las secuencias de nucleótidos se han unido o recombinado en una construcción única capaz de introducir un fragmento de un promotor y secuencia de ADN para un producto génico seleccionado junto con la secuencia no traducida 3' apropiada en una célula.

Como se usa en la presente descripción, la expresión "degeneración codónica" se refiere a la naturaleza del código genético que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. El técnico experimentado conoce perfectamente la "preferencia codónica" exhibida por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por ello, cuando se sintetiza un gen para expresión mejorada en una célula huésped, es conveniente diseñar el gen de manera que su frecuencia de uso de codones se aproxime a la frecuencia preferida de uso de codones de la célula huésped.

El término "optimizado por codón" , en lo que se refiere a genes o regiones codificantes de moléculas de ácido nucleico para transformación de diversos huéspedes, se refiere a la alteración de codones en el gen o regiones codificantes de las moléculas de ácido nucleico para reflejar el uso de codones típicos del organismo huésped sin alterar el polipéptido codificado por el ADN. Dicha optimización incluye reemplazar al menos uno o más que uno, o un número significativo de codones, con uno o más codones que se usan, más frecuentemente, en los genes de ese organismo.

Las desviaciones en la secuencia de nucleótidos que comprende los codones que codifican los aminoácidos de cualquier cadena de polipéptidos permiten las variaciones en la secuencia que codifica el gen. Dado que cada codón consiste en tres nucleótidos, y los nucleótidos que comprenden el ADN se encuentran restringidos a cuatro bases específicas, existen 64 combinaciones posibles de nucleótidos, 61 de estos codifican los aminoácidos (los tres codones restantes codifican señales que finalizan la- traducción) . El "código genético" que muestra cuáles son los codones que codifican ciertos aminoácidos se reproduce en la presente descripción como Tabla 1. Como resultado, muchos aminoácidos se designan con más de un codón. Por ejemplo, los aminoácidos alanina y prolina están codificados por cuatro tripletes, serina y arginina por seis, en tanto que triptófano y metionina están codificados por solamente un triplete. Esta degeneración permite que la composición de la base de ADN varíe en un intervalo amplio sin alterar la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas por el ADN.

Tabla 1. Código genético estándar Muchos organismos muestran una parcialidad de uso de codones particulares para codificar la inserción de un aminoácido particular en una cadena de péptidos en crecimiento. La selección de codón, o preferencia codónica, 3d las diferencias en el uso de codones entre organismos, se logra por degeneración del código genético, y está documentada con respecto a muchos organismos. La preferencia codónica se correlaciona, frecuentemente, con la eficacia de traducción del ARN mensajero (ARNm) , el cual se cree, a su vez, que es dependiente de, entre otras, las propiedades de los codones que se traducen y la disponibilidad de las moléculas del ARN de transferencia (ARNt) particular. La predominancia de los ARNt seleccionados en una célula es, generalmente, una reflexión de los codones usados, más frecuentemente, en síntesis de péptidos. En consecuencia, los genes pueden adaptarse para una expresión génica óptima en un organismo dado en función de la optimización por codón.

Dado el gran número de secuencias de genes disponibles para una amplia variedad de especies de origen animal, vegetal y microbianas, es posible calcular las frecuencias relativas de uso de codones. Las tablas de uso de codones se encuentran disponibles, fácilmente, por ejemplo, en la "Codon Usage Datábase" (Base de datos de uso de codones) disponible en http://www.kazusa.or.jp/codon/ (visitada el 20 de marzo de 2008) , y estas tablas pueden adaptarse de varias maneras. Ver Nakamura, Y., et al. Nucí. Acids Res. 28:292 (2000) . Las tablas de uso de codones para levadura, calculadas a partir de la publicación del GenBank 128.0 [15 de febrero de 2002] , se reproducen a continuación en la Tabla 2. Esta tabla usa la nomenclatura del ARNm y, entonces, en lugar de timina (T) que se encuentra en el ADN, las tablas usan uracilo (U) que se encuentra en el ARN. La Tabla 2 se ha adaptado para que las frecuencias se calculen para cada aminoácido, y no para los 64 codones.

Tabla 2. Tabla de uso de codones para genes de Saccharomyces cerevisiae .

Al usar esta tabla o tablas similares, las personas con conocimiento ordinario en la técnica pueden aplicar las frecuencias a cualquier secuencia dada de un polipéptido y producir un fragmento de ácido nucleico de una región codificante optimizada por codón que codifica el polipéptido, pero que usa codones óptimos para una especie dada.

La asignación aleatoria de codones a una frecuencia optimizada para codificar una secuencia dada de un polipéptido puede realizarse manualmente al calcular las frecuencias de codones para cada aminoácido y, después, asignar los codones a la secuencia del polipéptido aleatoriamente. Adicionalmente, varios algoritmos y programas informáticos se encuentran fácilmente disponibles para las personas con conocimiento ordinario en la técnica. Por ejemplo, la función "EditSeq" en el paquete Lasergene, disponible de- DNAstar, Inc., Madison, WI, la función "backtranslation" en el VectorNTI Suite, disponible de InforMax, Inc., Bethesda, MD, y la función "backtranslate" en el Paquete GCG-Wisconsin, disponible de Accelrys, Inc., San Diego, CA. Además, varios recursos se encuentran disponibles públicamente para optimizar por codón secuencias de la región codificante, por ejemplo, la función "backtranslation" en http : //www. entelechon. com/bioinformatics/backtranslation. php? lang=eng (visitado el 15 de abril de 2008) y la función "backtranseq" disponible en http: //bioinfo.pbi .nrc .ca: 8090/EMBOSS/index. html (visitado el 9 de julio de 2002) . La construcción de un algoritmo rudimentario para asignar codones en función de una frecuencia dada puede ser llevada a cabo fácilmente, además, con funciones matemáticas básicas por una persona con conocimiento ordinario en la técnica.

Las regiones codificantes optimizadas por codón pueden diseñarse con varios métodos conocidos por los experimentados en la técnica, e incluyen paquetes de programas informáticos tales como "synthetic gene designer" (diseñador de genes sintéticos) (http : //phenotype . biosci . umbc . edu/codon/sgd/index . php) .

Como se usa en la presente descripción, el término "polipéptido" está previsto para abarcar un "polipéptido" en singular, así como el plural "polipéptidos" , y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces amídicos (conocidos, además, como enlaces peptídicos) . El término "polipéptido" se refiere a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto. De este modo, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos , "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término usado para referirse a una o más cadenas de dos o más aminoácidos se incluyen dentro de la definición de "polipéptido" , y el término "polipéptido" puede usarse en lugar de, o intercambiablemente con, cualquiera de estos términos. Un polipéptido puede derivarse de una fuente biológica natural o ser producido por tecnología recombinante, pero no es, necesariamente, traducido de una secuencia de ácido nucleico designada. Puede generarse de cualquier modo, incluso, mediante síntesis química.

Por polipéptido "aislado" o un fragmento, variante, o derivado de este, se entiende un polipéptido que no se encuentra en su medio natural . No se requiere ningún nivel de purificación particular. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede extraerse de su ambiente natural o de origen. Los polipéptidos producidos recombinantemente y las proteínas expresadas en células huésped se consideran aislados para los propósitos de la invención, dado que son polipéptidos nativos o recombinantes que se han separado, fraccionado o están parcial o prácticamente purificados por cualquiera técnica adecuada.

Como se usa en la presente descripción, el término "variante" se refiere a un polipéptido que difiere de un polipéptido de la invención específicamente mencionado, tal como DHAD, por inserciones, deleciones, mutaciones y sustituciones de aminoácidos que se crean al usar, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, tal como mutagenésis. La guía para determinar qué residuos de aminoácidos pueden reemplazarse, agregarse o eliminarse sin suprimir actividades de interés, puede encontrarse al comparar la secuencia del polipéptido particular con la de polipéptidos homólogos, por ejemplo, de levaduras o bacterianos, y minimizar el número de cambios de secuencias de aminoácidos realizados en regiones de homología alta (regiones conservadas) o al reemplazar aminoácidos con secuencias de consenso.

Alternativamente, las variantes del polinucleótido recombinante que codifican estos mismos polipéptidos, o similares, pueden sintetizarse o seleccionarse al hacer uso de la "redundancia" en el código genético. Varias sustituciones de codón, tales como los cambios silentes que producen varios sitios de restricción, pueden introducirse para optimizar la clonación en un plásmido o vector viral para expresión. Las mutaciones en la secuencia dé polinucleótidos pueden reflejarse en el polipéptido o dominios de otros péptidos agregados al polipéptido para modificar las propiedades de cualquier parte del polipéptido. Por ejemplo, pueden usarse modificaciones para reducir o eliminar la expresión de una proteína objetivo e incluyen, pero no se limitan a, la supreción de todo el gen o de una porción de este, la inserción de un fragmento de ADN en el gen (en la región codificante o la promotora) para que la proteína no se exprese o se exprese en niveles más bajos, la introducción de una mutación en la región codificante que agrega un codón de terminación o cambio en el marco para que una proteína funcional no se exprese, y la introducción de una o más mutaciones en la región codificante para alterar aminoácidos y que se exprese una proteína no funcional o menos enzimáticamente activa.

Las "sustituciones" de aminoácidos pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades químicas y/o estructurales similares, es decir, reemplazos conservadores de aminoácidos, o pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido con un aminoácido que tiene propiedades químicas y/o estructurales diferentes, es decir, reemplazos no conservadores de aminoácidos . Las sustituciones "conservadoras" de aminoácidos pueden realizarse en función de la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad o la naturaleza antipática de los residuos involucrados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y los aminoácidos cargados negativamente (acídicos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Alternativamente, las sustituciones "no conservadoras" de aminoácidos pueden realizarse al seleccionar las diferencias en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad o la naturaleza anfipática de cualquiera de estos aminoácidos. Las "inserciones" o "deleciones" pueden estar dentro del intervalo de variación de conformidad con la tolerancia estructural o funcional de las proteínas recombinantes . La variación permitida puede determinarse experimentalmente al realizar, sistemáticamente, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en una molécula de polipéptidos mediante el uso de técnicas de ADN recombinante y al realizar ensayos de actividad en las variantes recombinantes resultantes.

Una "porción sustancial" de una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos es aquella porción que comprende una cantidad suficiente de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o la secuencia de nucleótidos de un gen para identificar putativamente ese polipéptido o gen, ya sea por evaluación manual de la secuencia por parte de una persona con experiencia en la técnica o por comparación e identificación de secuencias automatizada por computadora mediante el uso de algoritmos, tales como BLAST (Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol . , 215:403-410 (1993)). Generalmente, se necesita una secuencia de diez o más aminoácidos contiguos o treinta o más nucleótidos para identificar putativamente una secuencia de polipéptidos o de ácidos nucleicos como homologa de una proteína o un gen -conocidos. Además, con respecto a las secuencias de nucleótidos, las sondas de oligonucleótidos específicas para genes que comprenden de 20 a 30 nucleótidos contiguos pueden usarse en métodos dependientes de secuencias para identificación (por ejemplo, hibridación Southern) y aislamiento (por ejemplo, hibridación in situ de colonias bacterianas o placas bacteriófagas) de genes. Además, los oligonucleótidos cortos de 12-15 bases pueden usarse como cebadores para la amplificación por PCR con el fin de obtener un fragmento específico de ácido nucleico que comprende los cebadores. Por consiguiente, una "porción sustancial" de una secuencia de nucleótidos comprende una cantidad suficiente de la secuencia para identificar y/o aislar específicamente un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia. La presente descripción instruye sobre la secuencia completa de aminoácidos y de nucleótidos que codifican proteínas específicas. El técnico experimentado, con el beneficio de las secuencias como se reportan en la presente descripción, puede usar ahora todas o una porción sustancial de las secuencias descritas para propósitos conocidos para los experimentados en la técnica. Por lo tanto, la presente invención comprende las secuencias completas como se reportan en el listado de secuencias anexo, así como las porciones sustanciales de aquellas secuencias, tal como se definieron anteriormente.

El término "complementario" se usa para describir la relación entre bases nucleotídicas que son capaces de hibridarse entre sí. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenina es complementaria de la timina y la citosina es complementaria de la guanina, y con respecto al ARN, la adenina es complementaria del uracilo y la citosina es complementaria de la guanina.

La frase "porcentaje de identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos,. según lo determinado al comparar las secuencias. En la técnica, "identidad" significa, además, el grado de relación de secuencias entre las secuencias de polipéptidos o de polinucleótidos, según sea el caso, como lo determina la coincidencia entre las cadenas de las secuencias. La "identidad" y la "similitud" pueden calcularse fácilmente con métodos conocidos que incluyen, pero no se limitan a, los descritos en: 1.) Computational Molecular Biology .(Lesk, A. M . , Ed.) Oxford University: NY (1988) ; 2.) Biocomputing : Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed. ) Academic : NY (1993) ; 3.) Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M . , y Griffin, H. G. , Eds . ) Humania: NJ (1994) ; 4.) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G. , Ed.) Academic (1987) ; y 5.) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J. , Eds.) Stockton: NY (1991) .

Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para dar la mejor coincidencia entre las secuencias sometidas a prueba. Los métodos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas informáticos públicamente disponibles. Los cálculos de alineamientos de secuencias y de porcentajes de identidad pueden realizarse con el programa MegAlign™ del conjunto de programas bioinformáticos LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI) . Los alineamientos múltiples de las secuencias se realizan con el "método de alineamiento Clustal" , que abarca distintas variedades del algoritmo que incluyen el "método de alineamiento Clustal V" que corresponde al método de alineamiento identificado como Clustal V (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl . Biosci., 8:189-191 (1992)) e incluido en el programa MegAlign™ del conjunto de programas bioinformáticos LASERGENE (DNASTAR Inc.). Para alineamientos múltiples, los valores predeterminados corresponden a PENALIZACIÓN POR INTERRUPCIÓN10 y PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE INTERRUPCIÓN=10. Los parámetros predeterminados para alineamientos en pares y cálculo del porcentaje de identidad de las secuencias de proteínas con el uso del método Clustal son KTUPLE=1, PENALIZACIÓN POR INTERRUPCIÓN=3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5. En el caso de los ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLE=2, PENALIZACIÓN POR INTERRUPCIÓN=5 , VENTANA=4 y DIAGONALES GUARDADAS=4. Después del alineamiento de las secuencias por medio del uso del programa Clustal V, es posible obtener un "porcentaje de identidad" al ver la tabla de "distancias de la secuencia" en el mismo programa. Además, el "método de alineamiento Clustal W" se encuentra disponible y corresponde al método de alineamiento identificado como Clustal (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Co put. Appl . Biosci. 8:189-191 (1992)) e incluido en el programa MegAlign™ v6.1 del conjunto de programas bioinformáticos LASERGENE (DNASTAR Inc.). Parámetros predeterminados para alineamiento múltiple (PENALIZACIÓN POR INTERRUPCIÓN=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE LA INTERRUPCIÓN=0.2 , retardo de las secuencias divergentes (%) =30 , valor de la transición del ADN=0.5, matriz de pesos de proteínas=series de Gonnet, matriz de pesos del ADN=IUB) . Después del alineamiento de las secuencias mediante el uso del programa Clustal W, es posible obtener un "porcentaje de identidad" al ver la "tabla de "distancias de secuencia" en el mismo programa.

Un experimentado en la técnica comprenderá muy bien que son útiles muchos niveles de identidad de secuencias para identificar polipéptidos , a partir de otras especies, en donde los polipéptidos tienen una función o actividad igual o similar, o para describir los polinucleótidos correspondientes. Los ejemplos útiles de porcentajes de identidad incluyen, pero no se limitan a: 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 %, o cualquier porcentaje entero desde 55 % a 100 % puede ser útil para describir la presente invención, tales como 55 %, 56 % 57 %, 58 %, 59 %., 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 % 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 % , 71 %, 72 %, 73 %, 74 % 75 %, 76 %, 77 , 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 % 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 % 93 , 94 %, 95 ( 96 ,. 97 %, 98 % o 99 %. Los fragmentos de polinucleótidos adecuados no solo tienen las homologías mencionadas anteriormente, sino que comprenden, típicamente, un polinucleótido que tiene por lo menos 50 nucleótidos, por lo menos 100 nucleótidos, por lo menos 150 nucleótidos, por lo menos 200 nucleótidos, o por lo menos 250 nucleótidos. Además, los fragmentos de polinucleótidos adecuados que tienen las homologías mencionadas anteriormente codifican un polipéptido que tiene por lo menos 50 aminoácidos, por lo menos 100 aminoácidos, por lo menos 150 aminoácidos, por lo menos 200 aminoácidos, o por lo menos 250 aminoácidos.

El término "programa informático para análisis de secuencias" se refiere a cualquier programa informático o algoritmo computacional que resulta útil para el análisis de secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. El "programa para análisis de secuencias" puede estar disponible comercialmente o desarrollado de manera independiente. El programa informático típico para el análisis de secuencias incluye, pero no se limita a: 1.) el conjunto de programas GCG ( isconsin Package , Versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI); 2.) BLASTP", BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol . , 215:403-410 (1990)); 3.) DNASTAR (DNASTAR, Inc . Madison, WI) ; 4.) SEQUENCHER (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI); y 5.) el programa FASTA, que incorpora el algoritmo Smith-Waterman (W. R. Pearson, Comput . Methods Genome Res., [Proc. Int. Sym . ] (1994), Fecha de reunión 1992, 111-20. Editor(es): Suhai , Sandor. Plenum: New York, NY) . En el contexto de esta solicitud, se entenderá que cuando el análisis se realiza con el programa de análisis de secuencias, los resultados del análisis estarán basados en los "valores predeterminados" del programa de la referencia, a menos que se especifique de cualquier otra forma. Como se usa en la presente descripción, los "valores predeterminados" se refieren a cualquier conjunto de valores o parámetros que se cargan originalmente con el programa la primera vez que se inicia.

Las técnicas estándar de clonación molecular y de ADN recombinante usadas en la presente descripción son muy conocidas en la técnica y se describen en Sambrook, J.; Fritsch, E. F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) (de aquí en adelante, "Maniatis"); y en Silhavy, T. J., Bennan, M. L. y Enquist, L. W. , Experimente with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); y en Ausubel, F. M. et al., Current Protocole in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc . y Wiley- Interscience (1987) .

Funciones de las proteínas que requieren centros Fe-S Las funciones de las proteínas que contienen centros Fe-S son diversas. Uno de los esfuerzos más completos para clasificar estas funciones se muestra en la siguiente tabla, que está adaptada de Johnson, D.C., et al., Structure, function, and formation of biological iron-sulfur clusters (Estructura, función y formación de centros biológicos de hierro-azufre) . Annu. Rev. Biochem. , 2005. 74: págs . 247-281.

Tabla 3. Funciones de centros biológicos [Fe-S]a. a Las abreviaturas usadas son SAM, S-adenosilmetionina; acetil CoA, acetil coenzima A; FNR, reducción de fumarato y nitrato; IRP, proteína reguladora de hierro; IscR, proteína reguladora del ensamblado de centros de hierro-azufre; PRPP, fosforibosilpirofosfato .

Se cree que un incremento en el suministro y la eficacia de carga de centros Fe-S en uno o más de los miembros de las clases mencionadas anteriormente tendrá beneficios comerciales y/o médicos. De las muchas posibilidades que el técnico experimentado apreciará, se dan tres ejemplos. 1) Cuando se usa una enzima que contiene un centro Fe-S en una ruta para un producto de fermentación y debe expresarse en niveles altos para mantener un flujo alto en la ruta del producto (por ejemplo, dihidroxiácido deshidratasa en la ruta para isobutanol) . 2) Cuando se usa una enzima que contiene un centro Fe-S en una ruta para un producto de fermentación, y el centro Fe-S experimenta recambio durante la catálisis (por ejemplo, biotina sintasa en la fermentación comercial de glucosa para biotina) . 3) En un estado de enfermedad, para que la concentración normal de una proteina de importancia para la buena salud que contiene un centro Fe-S sea baja (por ejemplo, en casos de ataxia de Friedreich) .

DHAD y ensayos de DHAD La DHAD es una proteína de la clase de las deshidratasas (más apropiadamente, hidroliasas) que requiere centros Fe-S. Puede usarse un gen que codifica una enzima DHAD para proporcionar expresión de actividad DHAD en una célula huésped recombinante . La DHAD cataliza la conversión de 2 , 3 -dihidroxiisovalerato a OÍ-cetoisovalerato y de 2 , 3 -dihidroximetilvalerato a o¡-cetometilvalerato y tiene la clasificación E.C. 4.2.1.9. Las secuencias codificantes para las DHAD que son adecuadas para usarse en una célula huésped recombinante pueden derivarse de fuentes bacterianas, fúngicas o vegetales. Las DHAD que pueden usarse pueden tener un centro [4Fe-4S] o uno [2Fe-2S] . Las Tablas 4a, 4b, 5, y 6 presentan las sec . con núms . de ident . para regiones codificantes y proteínas de las DHAD representativas que pueden usarse en la presente invención. Las proteínas con por lo menos aproximadamente 95 % de identidad con ciertas secuencias listadas se han omitido en aras de la simplificación, pero se entiende que las proteínas, que incluyen las omitidas en aras de la simplificación, con por lo menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia con cualquiera de las proteínas presentadas n las Tablas 4a, 4b, 5, y 6 y que tengan actividad DHAD pueden usarse como se describe en la presente descripción. Otras proteínas DHAD y sus secuencias codificantes pueden identificarse con búsquedas BLAST en bases de datos públicas, como conocen muy bien los experimentados en la técnica. Típicamente, las búsquedas BLAST (descritas anteriormente) en bases de datos disponibles públicamente con secuencias de DHAD conocidas, tales como las proporcionadas en la presente descripción, se usan para identificar las DHAD y sus secuencias codificantes que pueden expresarse en las células de la presente invención. Por ejemplo, las proteínas DHAD que tienen identidades de secuencias de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 80-85 %, por lo menos aproximadamente 85-90 %, por lo menos aproximadamente 90-95 %, o por lo menos aproximadamente 98 % de identidad de secuencia con cualquiera de las proteínas DHAD de la Tabla 3 pueden expresarse en las células de la presente invención. Las identidades toman como base el método de alineamiento CLustal W al usar los parámetros predeterminados de PENALIZACIÓN POR INTERRUPCIÓN =10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE INTERRUPCIÓN = 0.1 y la serie Gonnet 250 para la matriz de pesos de proteínas.

Tabla 4a. Núms . de identificación de secuencias de proteínas DHAD [2Fe-2S] bacterianas representativas y secuencias de codificación. 1 Tabla 4b. Otras proteínas DHAD [2Fe-2S] bacterianas representativas y secuencias de codificación Tabla 5. Núms. de identificación de secuencias de proteínas DHAD [2Fe-2S] fúngicas y vegetales representativas y secuencias de codificación.

Tabla 6. Nüms . de identificación de secuencias de proteínas DHAD [4Fe-4S] representativas y secuencias de codificación.

Pueden identificarse otras DHAD [2Fe-2S] al usar el análisis descrito en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/569,636, presentada el 29 de setiembre de 2009, que se incorpora en la presente descripción como referencia. El análisis es el siguiente: Se preparó un Perfil de modelos ocultos de Markov (HMM, por sus siglas en inglés) basado en secuencias de aminoácidos de ocho DHAD verificadas funcionalraente . Se ha descrito la aplicación del Perfil HMM. Ver, por ejemplo, Krogh et al., J". Mol. Biol. 235:1501-1531 (1994) y Durbin et al., "Markov chains and hidden Markov models" , en Biological Sequence Analysis : Probabilistic Models of. Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press (1998) . Un Perfil HMM es un modelo estadístico creado a partir de alineamientos múltiples de secuencias que pueden usarse para determinar si una secuencia de prueba pertenece o no a una familia particular de secuencias. Ver ídem Puede crearse un Perfil HMM al generar primero un alineamiento de secuencias funcionalmente verificadas con el uso de herramientas convencionales para el alineamiento de secuencias. Después, el alineamiento de secuencias se usa para crear el Perfil HMM al usar los programas informáticos públicamente disponibles (por ejemplo, HMMER) que usan un sistema de puntaje específico por posición para capturar información acerca del grado de conservación en varias posiciones de aminoácidos en el alineamiento múltiple de las secuencias de entrada. Más específicamente, se capturan los puntajes de residuos de aminoácidos en un estado de coincidencia (es decir, puntajes de emisión de estados de coincidencia) , o en un estado de inserción (es decir, puntajes de emisión de estados de inserción) que son proporcionales a la expresión: Log 2 (p_x) / (null_x) . Ver ídem. En esta expresión, el término "p_x" es la probabilidad de un residuo de aminoácidos, en una posición particular en el alineamiento, de conformidad con el Perfil HMM, y el término "null_x" es la probabilidad de conformidad con el modelo nulo. Ver ídem. El modelo nulo es un modelo probabilístico simple de un solo estado con un conjunto precalculado de probabilidades de emisión para cada uno de los aminoácidos derivados de la distribución de aminoácidos. Ver ídem. Se calculan, además, los puntajes de transición de "estado" como parámetros logarítmicos de posibilidades y son proporcionales a Log 2 (t_x) . Ver ídem. En esta expresión, el' término "t_x" es la probabilidad de transitar a un estado emisor o no emisor. Ver ídem. Puede obtenerse información adicional con respecto a análisis estadísticos particulares para generar un Perfil HMM en Krogh et al., J. Mol. Biol . 235:1501-1531 (1994) y Durbin et al., "Markov chains and hidden Markov models" , en Biological Sequence Analysis : Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press (1998) , y en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/569,636.

Se preparó un perfil de modelos ocultos de Markov (HMM) basado en secuencias de aminoácidos de ocho DHAD funcionalmente verificadas que son de Nitrosomonas. europaea (sec. de ADN con núm. de ident.:309; sec. de proteínas con núm. de ident.:310), Synechocystis sp. PCC6803 (sec. de ADN con núm. de ident.:297; sec. de proteínas con núm. de ident.:298), Streptococcus mutans (sec. de ADN con núm. de ident.:167; sec. de proteínas con núm. de ident . : 168 ) , Streptococcus thermophilus (sec. de ADN con núm. de ident. :163; sec. con núm. de ident .: 164 ) Ralstonia metallidurans (sec. de ADN con núm. de ident. :345; sec. de proteínas con núm. de ident. :346), Ralstonia eutropha (sec. de ADN con núm. de ident. :343; sec. de proteínas con núm. de ident. :344), y Lactococcus lactis (sec. de ADN con núm. de ident. :231; sec. de proteínas con núm. de ident. :232). Adicionalmente , se descubrió que la DHAD de FlavoJacterium johnsoniae' (sec. de ADN con núm. de ident. :229; sec. de proteínas con núm. de ident.: 230) tenía actividad dihidroxiácido deshidratasa cuando se expresaba en E. coli y se usó para preparar el perfil. El Perfil HMM se prepara con el paquete de programas informáticos HMMER (La base teórica del perfil HMM se describe en R. Durbin, S. Eddy, A. Krogh, y G. Mitchison, Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids, Cambridge University Press, 1998; Krogh et al., 1994; J. Mol. Biol . 235:1501-1531),· según la guía del usuario, que puede obtenerse de HMMER (Janelia Farm Research Campus, Ashburn, VA) . La salida del programa informático HMMER es un perfil de modelos ocultos de Markov (HMM) que caracteriza las secuencias de entrada. El perfil HMM preparado para las ocho proteínas DHAD se proporciona en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/569,636, presentada el 29 de setiembre de 2009, y en la Tabla 12.

La primera línea de la Tabla 12 para cada posición informa la probabilidad de que cada aminoácido esté en ese "estado" (puntajes de emisión de estados de coincidencia) . La segunda línea informa los puntajes de emisión de estados de inserción, y la tercera línea informa los puntajes de transición de estados. La probabilidad más alta aparece resaltada para cada posición. Estos puntajes pueden convertirse en "valores E" (valores esperados) , que son la cantidad de aciertos o coincidencias con el Perfil HMM que se esperaría obtener por azar. Una proteína que tiene un valor E de < 10"5 de coincidencia con el perfil HMM indica que la proteína comparte una similitud de secuencia significativa con las proteínas de semillas usadas para construir el perfil HMM, y que la proteína pertenece a la familia representada por el perfil HMM.

Cualquier proteína que coincida con el perfil HMM con un valor E de < 10"5 es una proteína relacionada con DHAD, que incluye las DHAD [4Fe-4S] , las DHAD [2Fe-2S] , arabonate deshidratasas y fosfogluconato deshidratasas. En modalidades, las secuencias que coinciden con el perfil HMM se analizan, después, para determinar la presencia de las tres cisteínas conservadas, correspondientes a las posiciones 56, 129 y 201 en la DHAD de Streptococcus mutans . La presencia de las tres cisteínas conservadas es característica de proteínas que tienen un centro [2Fe-2S] . Las proteínas que tienen las tres cisteínas conservadas incluyen arabonate deshidratasas y las DHAD [2Fe-2S] . Las DHAD [2Fe-2S] pueden distinguirse de las arabonate deshidratasas al analizar los aminoácidos conservados distintivos que se encontró estaban presentes en las DHAD [2Fe-2S] o en las arabonate deshidratasas en posiciones que corresponden a las siguientes en la secuencia de aminoácidos de la DHAD de Streptococcus mutans. Estos aminoácidos distintivos están en las DHAD [2Fe-2S] o en arabonate deshidratasas, respectivamente, en las siguientes posiciones (con una manifestación mayor que 90 %) : 88 asparagina en comparación con ácido glutámico,-113 no conservados en comparación con ácido glutámico; 142 arginina o asparagina en comparación con no conservados; 165 no conservados en comparación con glicina; 208 asparagina en comparación con no conservados; 454 leucina en comparación con no conservados; 477 fenilalanina o tirosina en comparación con no conservados; y 487 glicina en comparación con no conservados .

Adicionalmente , las secuencias de las regiones codificantes de la DHAD proporcionadas en la presente descripción pueden usarse para identificar otros homólogos naturales. Estos métodos son muy conocidos en la técnica, y varios métodos que pueden usarse para aislar genes que codifican proteínas homologas se describen en la solicitud de patente de los Estados ' Unidos núm. 12/569,636, presentada el 29 de setiembre de 2009, y estos métodos se incorporan en la presente descripción como referencia.

La presencia de actividad DHAD en una célula manipulada genéticamente para expresar una DHAD heterologa puede confirmarse mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Para dar un ejemplo, y según lo demostrado en los ejemplos en la presente descripción, los extractos crudos de células manipuladas genéticamente para expresar una DHAD bacteriana pueden usarse en un ensayo de DHAD, como se describe en Flint y Emptage (J. Biol. Chem. (1988) 263(8): 3558-64), al usar dinitrofenilhidrazina . En otro ejemplo, puede evaluarse la actividad DHAD al expresar una DHAD heterologa, identificable por los métodos descritos en la presente descripción, en una cepa de levadura que no tiene actividad DHAD endógena. Si la actividad DHAD está presente, la cepa de levadura crecerá en ausencia de aminoácidos de cadena ramificada. La actividad DHAD puede confirmarse, además, con métodos más indirectos, tales como mediante el análisis de un producto corriente abajo de una ruta que requiera actividad DHAD. Cualquier producto que tenga -cetoisovalerato o -cetometilvalerato como intermedio de ruta puede analizarse en un ensayo para determinar la actividad DHAD. Una lista de estos productos incluye, pero no se limita a, valina, isoleucina, leucina, ácido pantoténico, 2-metil-l-butanol, 3-metil-l-butanol e isobutanol .

Sobreexpresión de actividad DHAD Los solicitantes han descubierto que la expresión de una DHAD heterologa puede proporcionar actividad DHAD cuando se expresa en una célula huésped. La expresión de una DHAD que puede identificarse como se describe en la presente descripción puede proporcionar actividad DHAD para una ruta biosintética que incluye la conversión de 2 , 3 -dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato o 2,3-dihidroximetilvalerato a a-cetometilvalerato .

Adicionalmente , en la solicitud de patente relacionada de los Estados Unidos núm. 12/569,636, presentada el 29 de setiembre de 2009, incorporada en la presente descripción como referencia, se demostró que la DHAD [2Fe-2S] de S. mutans tiene una mayor estabilidad en el aire en comparación con la sensibilidad en el aire de la DHAD [4Fe-4S] de E. coli, lo cual es conveniente para obtener mejor actividad en una célula huésped heterologa.

Además, como se describe en la presente descripción, se ha descubierto que expresar una proteína' DHAD heterologa en niveles más altos puede proporcionar actividad DHAD incrementada cuando se expresa en una célula huésped. La expresión alta de un polinucleótido recombinante puede lograrse, por lo menos, de dos maneras: 1) al incrementar el número de copias de un plásmido que comprende el polinucleótido recombinante; o 2) al integrar múltiples copias del gen de interés en el cromosoma de la célula huésped. Como se ejemplifica en la presente descripción, la expresión de múltiples copias de la DHAD heteróloga proporciona un incremento en la actividad específica de la DHAD heteróloga.

Los polinucleótidos recombinantes son clonados, típicamente, para expresión al usar la secuencia codificante como parte de un gen quimérico usado para transformación que incluye un promotor unido operativamente a la secuencia codificante así como un sitio de unión al ribosoma y una región de control de terminación. La región codificante puede ser de la célula huésped para la transformación y combinarse con secuencias reguladoras que no son nativas para el gen natural que codifica la DHAD. Alternativamente, la región codificante puede ser de otra célula huésped.

Los vectores útiles para la transformación de una variedad de células huésped son comunes y se describen en la literatura. Típicamente, el vector contiene un marcador seleccionable y secuencias que permiten la replicación autónoma o integración cromosómica en el huésped deseado.

Además, los vectores adecuados pueden comprender una región promotora que alberga controles dé iniciación de la transcripción y una región de control de terminación de la transcripción entre las que puede insertarse un fragmento de ADN de región codificante para proporcionar la expresión de la región codificante insertada. Ambas regiones de control pueden derivarse de genes homólogos a la célula huésped transformada, aunque debe entenderse que estas regiones de control pueden derivarse, además, de genes que no son nativos para las especies específicas seleccionadas como huésped de producción.

Las células de levaduras que pueden ser huéspedes para la expresión o sobreexpresión de una DHAD bacteriana heteróloga son cualquier célula de levadura que pueda someterse a manipulación genética e incluyen, pero no se limitan a, Saccharomyces, SchizoSaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, Issatchenkia y Pichia. Las cepas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Saccharomyces cerevisiae, SchizoSaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces ' thermotolerans, Candida glabrata, Candida albicans, Pichia stipitis y Yarrowia lipolytica. En una modalidad, el huésped es Saccharomyces cerevisiae .

La expresión se logra al transformar una célula huésped con un gen que comprende una secuencia que codifica una DHAD, por ejemplo, una DHAD presentada en las Tablas 4a, 4b, 5 o 6, o identificada al usar los métodos de selección de la solicitud de patente relacionada de los Estados Unidos núm. 12/569,636, presentada el 29 de setiembre de 2009, incorporada en la presente descripción como referencia. La región codificante de la DHAD que se expresará puede estar optimizada por codón para la célula huésped objetivo, como es del conocimiento de una persona con experiencia en la técnica.- Los métodos para la expresión génica en levaduras se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Methods in Enzymology, Volumen 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (Parte A, 2004, Christine Guthrie y Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego, CA) . La expresión de genes en levaduras requiere, típicamente, un promotor operativamente unido a una región codificante de interés, y un terminador transcripcional . Pueden usarse varios promotores de levaduras para construir casetes de expresión para genes en levaduras, e incluyen, pero no se limitan a, promotores derivados de los siguientes genes: CYC1, HIS3, GAL1, GALIO, ADH1, PGK, PH05 , GAPDH, ADC1 , TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, CUP1, FBA, GPD, GPM y AOX1. Los terminadores transcripcionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, FBAt, GPDt, GPMt, ERGIOt, GALlt, CYC1 y ADH1.

Los promotores y terminadores transcripcionales adecuados, y las regiones codificantes de DHAD pueden clonarse en vectores lanzadera de levaduras de E. coli y transformarse en células de levaduras. Estos vectores permiten la propagación de la cepa tanto en cepas de E. coli como en cepas de levadura. En una modalidad, el vector usado contiene un marcador seleccionable y secuencias que permiten la replicación autónoma o integración cromosómica en el huésped deseado. Los ejemplos de plasmidos usados en levaduras son los vectores lanzadera pRS423, pRS424, pRS425 y pRS426 (American Type Culture Collection, Manassas, VA), que contienen un origen de replicación de E. coli {por ejemplo, p Bl) , un origen de replicación de levadura de 2 mieras y un marcador para selección nutricional. Los marcadores de selección para estos cuatro vectores son His3 (vector pRS423) , Trpl (vector pRS424), Leu2 (vector pRS425) y Ura3 (vector pRS426) . La construcción de vectores de expresión con un gen quimérico que codifica las DHAD descritas puede llevarse a cabo con cualquier técnica estándar de clonación molecular en E. coli o con el método de recombinación de reparación de interrupciones en levaduras .

El método de clonación de reparación de la interrupción aprovecha la recombinación homologa sumamente eficiente en levadura. Por ejemplo, el ADN de un vector de levaduras se digiere (por ejemplo, en su sitio de clonación múltiple) para crear una "interrupción" en su secuencia. Se generan varios insertos de los ADN de interés que contienen una secuencia de = 21 pb en ambos extremos 5' y '3, que se traslapan secuencialmente entre sí, y con el extremo 5' y' 3 del ADN del vector. Por ejemplo, para construir un vector de expresión en levadura para el "Gen X" , se seleccionan un promotor de levadura y un terminador de levadura para el cásete de expresión. El promotor y el terminador se amplifican a partir del ADN genómico de la levadura, y el Gen X se amplifica o bien por PCR a partir de su organismo de origen o se obtiene de un vector de clonación que comprende la secuencia del Gen X. Por lo menos hay una secuencia de superposición de 21 pb entre el extremo 5' del vector linealizado y la secuencia promotora, entre el promotor y el Gen X, entre el Gen X y la secuencia terminadora, y entre el terminador y el extremo 3' del vector linealizado. Después, el vector con "interrupciones" y los insertos de ADN se cotransforman en una cepa de levadura y se siembran en una placa sobre el medio que contiene las mezclas de compuestos apropiados que permiten la complementación de los marcadores de selección nutricional en los plásmidos. La presencia de las combinaciones correctas de insertos puede confirmarse con mapeo por PCR mediante el uso del ADN plasmídico preparado a partir de las células seleccionadas. Después, el ADN plasmídico aislado de levaduras (usualmente, bajo en concentración) puede transformarse en una cepa de E. coli, por ejemplo TOP10, seguido de minipreparaciones y mapeo de restricción para verificar, adicionalmente , el constructo del plásmido. Finalmente, el constructo puede verificarse por análisis de secuencias.

Al igual que la técnica de reparación de la interrupción, la integración en el genoma de la levadura también aprovecha el sistema de recombinación homologa en levadura. Por ejemplo, un cásete que contiene una región codificante más elementos de control (promotor y terminador) y un marcador auxotrófico se amplifica por PCR con una ADN polimerasa de alta fidelidad mediante el uso de cebadores que se hibridizan con el cásete y contienen de 40 a 70 pares de bases de homología de secuencias para las regiones 51 y 3 ' del área genómica en donde se desea la inserción. Después, el producto de la PCR se transforma en levadura y se siembra en una placa con un medio que contiene las mezclas de compuestos apropiados que permiten la selección del marcador auxotrófico integrado. Por ejemplo, para integrar el "Gen X" en la ubicación cromosómica "Y", el constructo de promotor-región codificante X-terminador se amplifica por PCR a partir de un constructo de ADN plasmídico y se une a un marcador autotrófico (tal como URA3) por medio de PCR SOE (PCR con método de unión por extensión de solapamiento , por sus siglas en inglés) o por métodos' comunes de clonación y digestión por restricción. El cásete completo, que contiene el promotor-región codificante X- terminador-región de URA3 se amplifica por PCR con secuencias de cebadores que contienen de 40 a 70 pb de homología para las regiones 5 ' y 3 ' de la ubicación "Y" en el cromosoma de la levadura. El producto de la PCR se transforma en levadura y se selecciona en medios de crecimiento sin uracilo. Los transformantes pueden verificarse o bien por PCR de colonias o por secuenciación directa del ADN cromosómico.

Adicionalmente a los materiales y métodos mencionados anteriormente que pueden usarse para expresar una DHAD heteróloga, estos mismos materiales y métodos, o materiales y métodos similares, pueden usarse para sobreexpresar una DHAD heteróloga al usar modificaciones conocidas por un experimentado en la técnica. Por ejemplo, cuando se usa un sistema basado en plásmidos para sobreexpresar el polinucléotido recombinante , puede construirse un vector con un número alto de copias o un vector que tiene un número de copias que se puede regular.

Un sistema regulable o inducible de este tipo se describe en la presente descripción, en el Ejemplo 1; sin embargo, un experimentado en la técnica conocerá otros sistemas, y estos pueden usarse para construir otros vectores con un número alto de copias o con un número de copias que se puede regular. Alternativamente, cuando se usa un sistema basado, en integraciones para sobreexpresar el polipéptido recombinante, se requiere un vector de integración para dirigirse a sitios de integración múltiple. Un sistema basado en integraciones múltiples se describe en la presente descripción, en el Ejemplo 2; sin embargo, un experimentado en la técnica conocerá otros sistemas basados en integraciones múltiples, y estos pueden usarse para dirigir integraciones múltiples de un polipéptido recombinante, por ejemplo, la integración en regiones del ADNr .

La expresión de la DHAD heteróloga en la célula huésped recombinante puede cuantificarse , por ejemplo, con un porcentaje de proteína total en la célula. Esta sobreexpresión puede cuantificarse en una cantidad seleccionada del grupo que consiste en una cantidad: (a) mayor que aproximadamente 0.001 % de proteína total en la célula; (b) mayor que aproximadamente 0.01 % de proteína total en la célula; (c) mayor que aproximadamente 0.1 % de proteína total en la célula; (d) mayor que aproximadamente 0.5 % de proteína total en la célula; (e) mayor que aproximadamente 1.0 % de proteína total en la célula; (f) mayor que aproximadamente 2.0 % de proteína total en la célula; (g) mayor que aproximadamente 5 % de proteína total en la célula; (h) mayor que aproximadamente 10 % de proteína total en la célula; y (i) mayor que aproximadamente 20 % de proteína total en la célula.

La actividad específica de la DHAD heterologa producida en una célula huésped recombinante puede cuantificarse , por ejemplo, como U/mg. La actividad específica de la DHAD heterologa puede seleccionarse del grupo que consiste en una cantidad: (a) mayor que aproximadamente 0.25 U/mg; (b) mayor que aproximadamente 0.3 U/mg; (c) mayor que aproximadamente 0.5 U/mg; (d) mayor que aproximadamente 1.0 U/mg; (e) mayor que aproximadamente 1.5 U/mg; (f) mayor que .aproximadamente 2.0 U/mg; (g) mayor que aproximadamente 3.0 U/mg; (h) mayor que aproximadamente 4.0 U/mg; (i) mayor que aproximadamente 5.0 U/mg; (j) mayor, que aproximadamente 6.0 U/mg; (k) mayor que aproximadamente 7.0 U/mg; (1) mayor que aproximadamente 8.0 U/mg; (m) mayor que aproximadamente 9.0 U/mg; (n) mayor que aproximadamente 10.0 U/mg; (o) mayor que aproximadamente 20.0 U/mg; y (p) mayor que aproximadamente 50.0 U/mg.

Además, la actividad específica de la DHAD heterologa puede cuantificarse , por ejemplo, como un porcentaje de comparación con respecto a la actividad específica de una DHAD endógena o con respecto a la actividad específica de alguna otra DHAD de control. Un ejemplo de actividad específica de una DHAD de "control" es el de una DHAD heteróloga expresada en una célula huésped recombinante al usar un plásmido con un número bajo de copias o un plásmido que no es, de cualquier otra forma, inducible o regulable. Un control de este tipo establece una referencia a partir de la cual comparar la actividad específica de la misma DHAD. heteróloga expresada en una célula huésped recombinante al usar un plásmido con un número alto de copias o un plásmido que tiene un número de copias que se puede regular, o coexpresada con polinucleótidos que codifican polipéptidos que afectan la biosíntesis de los centros Fe-S o el uso y captación de Fe, como se describe más adelante. Así, el incremento en la actividad específica de la DHAD heteróloga cuando se compara con la actividad específica de la DHAD de control puede seleccionarse del grupo que consiste en un incremento: mayor que aproximadamente 10 %; mayor que aproximadamente 20 ¾; mayor que aproximadamente 30 %; mayor que aproximadamente 40 % ; mayor que aproximadamente 50 % ; mayor que aproximadamente 60 %; mayor que aproximadamente 70 %; mayor que aproximadamente 80 %; mayor que aproximadamente 90 %; mayor que aproximadamente 95 %; mayor que aproximadamente 98 %; y mayor que aproximadamente 99 %. La actividad específica de la DHAD heteróloga puede expresarse, además, por "múltiplos de incremento" con respecto al control. Así, el incremento en la actividad específica puede seleccionarse del grupo que consiste en un incremento: (a) mayor que aproximadamente 2 veces, (b) mayor que aproximadamente 5 veces, (c) mayor que aproximadamente 8 veces, o (d) mayor que aproximadamente 10 veces más que el control.

Proteínas formadoras de centros Fe-S y regulación, uso y homeostasis de Fe Como se describió anteriormente, las enzimas DHAD requieren centros Fe-S para su funcionamiento; por lo tanto, deben expresarse en un huésped que tenga la maquinaria genética para producir y cargar centros Fe-S en la apoproteína si van a expresarse en una forma funcional. Como se describe en otras partes de la presente descripción, en levaduras normales, la mitocondria desempeña una función importante en la biosíntesis de centros Fe-S. Se cree que el flujo en la formación y movimiento de los precursores de centros Fe-S desde la mitocondria a las proteínas que requieren centros Fe-S en el citosol de levaduras normales es limitado. Por ejemplo, después de un punto, un incremento adicional en la expresión de la proteína de las DHAD heterólogas en el citosol no produce un incremento correspondiente en la actividad de la DHAD. Sin la intención de limitarse por la teoría, se cree que esto se debe a que las cantidades incrementadas de la DHAD heterologa no se cargan con el centro Fe-S requerido para actividad porque la célula no tiene la capacidad de abastecer la demanda .incrementada de centros Fe-S que surge de las condiciones descritas anteriormente. En la presente descripción, se demuestra que las células de levaduras pueden modificarse genéticamente de dos maneras (por separado o simultáneamente) que producirán que una fracción incrementada de la DHAD heterologa expresada en el citosol se cargue con el centro Fe-S requerido. Una manera es modificar la expresión de genes de levadura involucrados en la formación de centros Fe-S, tales como los genes de las rutas de biosíntesis de centros Fe-S o los genes de captación y uso de Fe. La otra manera es expresar genes heterólogos involucrados en la biosíntesis de centros Fe-S o la captación y uso de Fe en el citoplasma de levaduras.

Los genes de levaduras que codifican polipéptidos que están involucrados en el uso y captación de Fe y la biosíntesis de centros Fe-S son Candidatos para modificar la expresión. En modalidades, la modificación produce una función incrementada de una proteína seleccionada que requiere un centro Fe-S.

Como ejemplo, se ha descubierto que Aftl actúa como activador de la transcripción para genes en el regulador de hierro (Kumanovics, et al. J. Biol. Chem. , 2008. 283, págs. 10276-10286; Li , H., et al., The Yeast Iron Regulatory Proteins Grx3/4 and Fra2 form Heterodimeric Complexes Containing a [2Fe-2S] Cluster with Cysteinyl and Histidyl Ligation. Biochemistry, 2009. 48(40) : págs. 9569-9581. Como se ejemplifica en la presente descripción, la supreción de inhibidores conocidos de la translocación de Aftl producé un incremento en la actividad específica de una proteína que requiere un centro Fe-S, dado que conduce a un incremento en la carga de centros Fe-S de la proteína. Sin la intención de limitarse por la teoría, se cree, de este modo, que alterar la expresión de ciertos genes del regulador de Fe, ya sea directamente o a través de la supreción o regulación ascendente de inhibidores, incrementará, análogamente, la carga y función de las proteínas que requieren centros Fe-S. Por ejemplo, los genes que desempeñan una función en, o son parte de, el uso y la homeostasis de Fe en levaduras, tales como los genes del regulador de Fe, pueden ser un grupo elegido como objetivo para alterar la expresión. Estos genes' son conocidos en la técnica, y los ejemplos de estos genes se presentan en la Tabla 7. (La lista de la Tabla 7 está tomada de Rutherford, J.C., et al., Activation of the Iron Regulon by the Yeast Aftl/Af 2 Transcription Factors Depende on Mitochondrial but Not Cytosolic Iron-Sulfur Protein Biogénesis, J. Biol, Chem. , 2005. 280(11) : págs . 10135-10140; Foury, F. y D. Talibi, Mitochondrial control of iron homeostasis . A genome wide analysis of gene expression in a yeast frataxin-deficient strain. J. Biol. Chem., 2001. 276(11) : págs. 7762-7768; y Shakoury-Elizeh, M., et al., Transcriptional remodeling in response to iron deprivation in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. Cell, 2004. 15(3) : págs. 1233-1243.) Tabla 7. Ejemplos de genes de levaduras asociados con el uso y la captación de Fe. 5 4 Con base en sus funciones y la asociación con el uso y a captación de Fe, las proteínas codificadas por los enes descritos en la Tabla 7 son Candidatas para afectar a biosíntesis de centros Fe-S. Otros genes de levaduras asociados con la captación y el uso de Fe o la biosíntesi de centros Fe-S incluyen los que se presentan en la Tabl 8.

Tabla 8. Genes asociados con la captación y el uso de Fe o la biosíntesis de centros Fe-S en levaduras 5 Se han identificado otros genes que codifican polipéptidos que afectan la biosíntesis de centros Fe-S de otras células huésped e incluyen, pero no se limitan a, los genes que se presentan en la Tabla 9.

Tabla 9. Genes directamente involucrados en la biosíntesis de centros Fe-S de varias células iscA EcoCyc: IscA es una proteína de ensamblado de 5, 906) centros de hierro-azufre que forma el centro [2Fe-2S] de ferredoxina. Se ha demostrado la funión de hierro con una constante de asociación aparente de 3x10-19 M"1. In vitro, ¡en presencia de IscS y cisteína, IscA puede suministrar hierro a iscU.

SufA [2Fe-2S] en su forma nativa puede transferir su centro Fe-S a ambas apoproteínas , [2Fe-2S] y [4Fe-4S] . (ver Gupta, V., et al., J. Am. Chem. Soc. 131 (17) : 6149-53 (2009)) Los resultados sugieren que la biogénesis de los centros [4Fe-4S] y los centros [2Fe-2S] pueden tener rutas distintas, y que los parálogos IscA/SufA son esenciales para el ensamblado de centros [4Fe-4S] , pero son prescindibles para el ensamblado de centros [2Fe-2S] en E. coli en condiciones aerobias.

(Tan, G. , et al., Bioche . J. , 420 (3 ): 463 -72 (2009) ) (NP_417023.1 ; complemento inverso de tiucleótidos 2657585 a 2657908 de NC 000913.2) Los genes para la captación y el metabolismo de Fe y/o para la biosíntesis de centros Fe-S que incluyen, pero no se limitan a, los presentados en las Tablas 7, 8 o 9 pueden, potencialmente, suprimirse, mutarse, expresarse, regularse ascendentemente o regularse descendentemente para incrementar el flujo en una ruta de biosíntesis de centros Fe-S y mejorar la actividad específica de proteínas que requieren centros Fe-S, tales como la DHAD. Adicionalmente, pueden agregarse cofactores para modificar la actividad de polipéptidos que tienen actividad reguladora de centros Fe-S a fin de incrementar el flujo en una ruta de biosíntesis de centros Fe-S y mejorar la actividad específica de la DHAD.

Por ejemplo, los genes que incrementan el flujo en una ruta de biosíntesis de centros Fe-S pueden expresarse para mejorar la actividad de la DHAD al proporcionar una cantidad adecuada de centros Fe-S para la apoenzima. Cualquier gen, o una combinación de ellos, tales como uno o más de los genes presentados en las Tablas 7, 8, o 9, pueden clonarse y expresarse en un plásmido pRS411, como se describe en el Ejemplo 4. Los constructos resultantes, junto con el vector de expresión de DHAD, pHR81 FBA ilvD(Sm), pueden transformarse, después, en el tipo silvestre BY4741. Como control, pRS411 sin ningún gen de interés, y el vector pHR81 FBA ilvD(Sm) se transforman en una cepa de tipo silvestre. Los transformantes se seleccionan en placas con agar y medio SD sin uracilo y metionina para mantener ambos plásmidos como se describe en el Ejemplo 4. Puede determinarse la actividad enzimática para la DHAD en el extracto crudo de cepas diferentes de la transformación. Los resultados pueden compararse con la actividad específica obtenida del control pRS 11 sin ningún gen de interés y el vector pHR81 FBA ilvD(Sm) transformados en una cepa de tipo silvestre. Un incremento en la actividad específica indica un gen que puede usarse para incrementar el flujo en una ruta de biosíntesis de centros Fe-S.

Adicionalmente, pueden crearse cepas con deleciones en más de uno de los genes involucrados en la actividad reguladora de centros Fe-S y proporcionar efectos aditivos para mejorar las enzimas o proteínas que contienen uno o más centros Fe-S. Por ejemplo, pueden usarse mutantes dobles con deleciones en ambos genes, FRA2 y GXR3 , para transformar el vector pHR81 FBA-IlvD (sm) , y puede determinarse la actividad de la DHAD en el extracto crudo de los transformantes.

Otra alternativa es alterar la expresión, por ejemplo, del gen PSE1 (sec. con núm. de ident.:777), que codifica una proteína involucrada en la importación de Aftlp en el núcleo (Fukunaka, et al., 2003, J. Biological Chem. , vol . 278, págs. 50120-50127) . Puede lograrse la expresión de este gen al clonarlo en el vector pRS411, como se describió anteriormente.

Así, en la presente invención, se proporcionan células huésped recombinantes que comprenden una alteración en la expresión de cualquier polipéptido codificado por un gen para el uso y la captación de Fe o para la biosínteis de centros Fe-S. Quedan abarcadas las células huésped recombinantes que comprenden por lo menos un polinucleótido heterólogo de cualquiera de los genes mencionados anteriormente para la biosíntesis de centros Fe-S. Quedan abarcadas, además, las células huésped recombinantes en donde la célula huésped comprende por lo menos una supreción, mutación y/o sustitución en un gen endógeno de cualquiera de los genes mencionados anteriormente para la captación y el uso de Fe o para la biosíntesis de centros Fe-S. Se proporcionan, además, las células huésped recombinantes que comprenden por lo menos un polinucleótido heterólogo de cualquiera de los genes mencionados anteriormente para la captación y el uso de Fe o para la biosíntesis de centros Fe-S, en donde la célula huésped comprende por lo menos una supreción, mutación y/o sustitución en un gen endógeno de cualquiera de los genes mencionados anteriormente para la captación y el uso de Fe o para la biosíntesis de centros Fe-S.

Estas células huésped recombinantes pueden comprender, además, por lo menos una proteína heteróloga que requiere centros Fe-S. Por ejemplo, en la presente invención, se proporciona una célula huésped recombinante que comprende por lo menos una DHAD heteróloga y por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S. Se proporciona, además, una célula huésped recombinante que comprende por lo menos una DHAD heterologa, en donde la célula huésped comprende por lo menos una supreción, mutación y/o sustitución en un gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S. Se proporciona, además, una célula huésped recombinante que comprende por lo menos una DHAD heterologa y por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S, en donde la célula huésped comprende por lo menos una supreción, mutación y/o sustitución en un gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S.

Las células huésped que pueden usarse en la presente invención incluyen células huésped de levaduras que incluyen, pero no se limitan a, Saccharomyces, SchizoSaccharoyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia Issatchenkia y Pichia. Las células huésped bacterianas pueden usarse, además, para crear células huésped recombinantes que comprenden por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad DHAD y por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S. Por ejemplo, las bacterias de ácido láctico que comprenden una DHAD recombinante y por lo menos un elemento recombinante para expresión genética que codifica proteínas formadoras de centros Fe-S son el tema de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/569,103, presentada el 29 de setiembre de 2009, que se incorpora en la presente descripción como referencia. Las células huésped recombinantes de la presente invención que comprenden por lo menos un polinucleótido heterologo que codifica un polipéptido que tiene actividad DHAD y por lo menos un polinucleótido heterologo que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S no incluyen las bacterias de ácido láctico descritas en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/569,103, presentada el 29 de setiembre de 2009, que se incorpora en la presente descripción como referencia.

El polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S puede seleccionarse del grupo que consiste en los genes para la captación y el uso de Fe o para la ruta de biosíntesis de centros Fe-S de las Tablas 7, 8 y 9. En una modalidad, el polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S está codificado por ARN1, ARN2, ATX1, CCC2, COT1, ENB1, FET3, FET5, FIT1, FIT2, FIT3, FREI, FRE2, FRE3, FRE4, FRE5, FRE6, FTH1, FTR1, HMX1 , SIT1, SMF3, TISil, VHT1, AFT1, AFT2, AIM1 , ARH1, ATM1 , BUD32, CAD1, CCC1, CFD1, CIA1, CMK1, CTH1, CTI6, CYC8, DAP1, DRE2, ERV1, ESA1, FET4, FRA1, FRA2, GEF1, GGC1, GRX1, GRX2, GRX4 , GRX5, HDA1, IBA57, ISA1, ISA2, ISU1, ISU2, JAC1, MGE1, MRS3, MRS4, MSN5, NAR1, NFS1, NFU1, NHP6a , NHP6b, PSE1, SMF1, SNF1 , SNF2, SNF3, SNF4, SSQ1, TIM12, TUPI, NP_ 011911 .1, VPS41, YAP5, YF 1, YRA1, ZPR1, iscAnif, nifU, nifS, cysEl, cysE2, iscS, iscU, iscA, hscB, hscA, Fdx, sufS, sufE, cysE3, sufS2, iscA2, Nfu, nfuA, nfuV, nfu, sufA, sufB, sufC, sufD, sufEl, sufS2, o sufE2. En una modalidad, el polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S es AFTl, AFT2, PSE1, FRA2 , GRX3 o MSN5. En una modalidad, el polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S se selecciona del grupo que consiste en AFTl, AFT2, PSEl, FRA2, GRX3 , MSN5 , y combinaciones de estos. En una modalidad, el polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S se selecciona del grupo que consiste en AFTl, AFT2, PSEl, FRA2, MSN5 , y combinaciones de estos. En otra modalidad, el polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S se selecciona del grupo que consiste en AFTl, AFT2, PSEl, FRA2, GRX3 , MSN5 , y combinaciones de estos, y el polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S está codificado por un polinucleótido que comprende un plásmido. En algunas modalidades, la DHAD se coexpresa con AFTl, AFT2, PSEl, y combinaciones de estos. El polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S puede ser un mutante constitutivo, tal como, pero sin limitarse a, AFTl L99A, AFTl L102A, AFTl C291F, AFTl C293F, y combinaciones de estos. La supreción, mutación y/o sustitución en el gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S puede seleccionarse del grupo que consiste en FRA2, GRX3, MSN5, y combinaciones de estos.

La presente invención proporciona, además, un método para incrementar la actividad de una proteína que requiere un centro Fe-S en una célula huésped recombinante ; . el método comprende proporcionar una célula huésped recombinante que comprende una proteína que 'requiere un centro Fe-S, modificar la expresión o la actividad de un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S en la célula huésped, y cultivar la célula huésped recombinante con la expresión o la actividad modificada en condiciones mediante las cuales se incrementa la actividad de la proteína que requiere un centro Fe-S. Puede usarse un método de este tipo para incrementar la actividad de una proteína endógena que requiere un centro Fe-S, o una proteína heteróloga que requiere un centro Fe-S. Puede usarse un método de este tipo para incrementar la actividad específica de una DHAD descrita en la presente invención, o identificada por los métodos descritos en la presente invención. El incremento en la actividad de la proteína que requiere centros Fe-S puede seleccionarse de una i cantidad mayor que aproximadamente 10 %; mayor que aproximadamente 15 %; mayor que aproximadamente 20 %; mayor que aproximadamente 25 %; mayor que aproximadamente 30 %; mayor que aproximadamente 35 %; mayor que aproximadamente 40 %; mayor que aproximadamente 45 %; mayor que aproximadamente 50 %; mayor que aproximadamente 55 %; mayor que aproximadamente 60 % mayor que aproximadamente 65 %; mayor que aproximadamente 70 %; mayor que aproximadamente 75 %; mayor que aproximadamente 80 %; mayor que aproximadamente 85 %; mayor que aproximadamente 90 %; y mayor que aproximadamente 95 %. El incremento en actividad puede ser mayor que aproximadamente 3 veces, mayor que aproximadamente 5 veces, mayor que aproximadamente 8 veces o mayor que aproximadamente 10 veces. En modalidades, la actividad de la proteína que requiere centros Fe-S puede estar en una cantidad que es por lo menos aproximadamente 60 % de la teórica, por lo menos aproximadamente 70 % de la teórica, por lo menos aproximadamente 80 % de la teórica o por lo menos aproximadamente 90 % de la teórica.

La presente invención puede usarse, además, para incrementar el flujo en la ruta de biosíntesis de centros Fe-S en una célula huésped y para identificar polipéptidos que incrementan el flujo en una ruta de biosíntesis de centros Fe-S en una célula huésped. En una modalidad,, se proporciona un método para incrementar el flujo en una ruta de biosíntesis de centros Fe-S en una célula huésped; el método comprende proporcionar una célula huésped recombinante que comprende una proteína que requiere centros Fe-S y o bien por lo menos un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S o por lo menos una supreción, mutación y/o sustitución en un gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S, o una combinación de ambos, y cultivar la célula huésped recombinante en condiciones mediante las cuales se incrementa el flujo en la ruta de biosíntesis de centros Fe-S en la célula huésped. En otra modalidad, se proporciona un método para identificar polipéptidos que incrementan el flujo en una ruta de biosíntesis de centros Fe-S en una célula huésped; el método comprende: (a) modificar la expresión o la actividad de un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S; (b) determinar la actividad de una proteína que requiere centros Fe-S; y (c) comparar la actividad de la proteína que requiere centros Fe-S determinada en presencia de la modificación en la expresión o la actividad del polipéptido de la etapa (a) con respecto a la actividad de una proteína que requiere centros Fe-S determinada en ausencia de la modificación de la expresión o la actividad del polipéptido de la etapa (a) , en donde un incremento en la actividad de la proteína heteróloga que requiere centros Fe-S indica un incremento en el flujo de la ruta.de biosíntesis de centros Fe-S. En estos métodos, la proteína que requiere centros Fe-S puede ser endógena o heteróloga para la célula huésped.

La expresión o la actividad del polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S puede modificarse con métodos muy conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, suprimir, mutar, sustituir, expresar, regular ascendentemente, regular descendentemente, alterar la localización celular, alterar el estado de la proteína, y/o adicionar un cofactor, y combinaciones de estos. Alterar el estado de la proteína puede incluir, pero no se limita a, alteraciones tales como fosforilación o ubiquitinación. Puede usarse cualquier variedad de métodos descritos en la presente invención o conocidos en la técnica para determinar la actividad de la proteína que requiere centros Fe-S, dependiendo de la proteína que requiere centros Fe-S que se seleccione. Por ejemplo, si la proteína que requiere centros Fe-S es la DHAD, puede usarse el ensayo descrito en el Ejemplo 7 para medir la actividad de la DHAD y determinar si existe un incremento en el flujo de la ruta de biosíntesis de centros Fe-S de la célula huésped.

Isobutanol y otros productos La expresión de una DHAD en una célula huésped recombinante , como se describe en la presente invención, proporciona la célula huésped recombinante transformada con actividad dihidroxiácido deshidratasa para la conversión de 2, 3-dihidroxiisovalerato a -cetoisovalerato o de 2,3-dihidroximetilvalerato a a-cetometilvalerato. Un producto que tenga a-cetoisovalerato o oí-cetometilvalerato como un intermedio de ruta puede producirse con mayor eficacia en una célula huésped, descrita en la presente invención, que tenga la DHAD heteróloga descrita. Una lista de estos productos incluye, pero no se limita a, valina, isoleucina, leucina, ácido pantoténico, 2-metil-l-butanol, 3-metil-l-butanol e isobutanol.

Por ejemplo, la biosíntesis de valina en levaduras incluye las etapas de la conversión de acetolactato a 2,3-dihidroxi-isovalerato por la acetohidroxiácido reductoisomerasa (ILV5) , la conversión de 2 , 3-dihidroxi-isovalerato a a-cetoisovalerato (denominado, además, 2-cetoisovalerato) por la dihidroxiácido deshidratasa, y la conversión de a-cetoisovalerato a valina por la transaminasa de aminoácidos de cadena ramificada (BAT2) y la aminotransferasa de aminoácidos de cadena ramificada (BATI) . La biosíntesis de leucina incluye las mismas etapas para -cetoisovalerato, seguidas por la conversión de a-cetoisovalerato a alfa-isopropilmalato por la alfa-isopropilmalato sintasa (LEU9, LEU4) , la conversión de alfa-isopropilmalato a beta-isopropilmalato por la isopropilmalato isomerasa (LEU1) , la conversión de beta-isopropilmalato a alfa-cetoisocaproato por la beta-IPM deshidrogenasa (LEU2) y, finalmente, la conversión de alfa-cetoisocaproato a leucina por la transaminasa de aminoácidos de cadena ramificada (BAT2) y la aminotransferasa de aminoácidos de cadena ramificada (BATI) . La ruta bacteriana es similar e involucra proteínas y genes denominados de manera diferente. La conversión incrementada de 2, 3-dihidroxi-isovalerato a -cetoisovalerato incrementará el flujo en estas rutas, particularmente, si se sobreexpresan una o más enzimas adicionales de una ruta. Así, para la producción de valina o leucina, se desea usar una cepa descrita en la presente invención.

La biosíntesis de ácido pantoténico incluye una etapa realizada por la DHAD, así como las etapas realizadas por la cetopantoato hidroximetiltransferasa y la pantotenato sintasa. La manipulación genética de la expresión de estas enzimas para la producción incrementada de la biosíntesis del ácido pantoténico en microorganismos se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 6,177,264.

El producto -cetoisovalerato de la DHAD es un intermedio en las rutas biosintéticas de isobutanol descritas en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20070092957 Al, que se incorpora en la pr sente descripción como referencia. Un diagrama de las rutas biosintéticas de isobutanol descritas se proporciona en la Figura 5. La producción de isobutanol en una cepa descrita en la presente invención puede beneficiarse a partir de la actividad incrementada de la DHAD. Como se describe en la presente invención, la actividad incrementada de la DHAD se proporciona mediante la expresión de una DHAD en una célula huésped, por ejemplo, al sobreexpresar la DHAD, al modular la expresión o la actividad de un polipéptido que tiene actividad reguladora de centros Fe-S, o una combinación de la expresión de una DHAD y la modulación de la expresión o la actividad de un polipéptido que tiene actividad reguladora de centros Fe-S. Como se describe en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20070092957 Al, que se 14 S incorpora en la presente descripción como referencia, las etapas de una ruta biosintética de isobutanol ilustrativa incluyen la conversión de: piruvato a acetolactato (ver la Figura 5, etapa a de la ruta en esa figura) , como se ha catalizado, por ejemplo, por la acetolactato sintasa, acetolactato a 2 , 3 -dihidroxiisovalerato (ver la Figura 5, etapa b de la ruta en esa figura) , como se ha catalizado, por ejemplo, por la acetohidroxiácido isomerorreductasa - 2 , 3 -dihidroxiisovalerato a oí-cetoisovalerato (ver la Figura 5, etapa c de la ruta en esa figura), como se ha catalizado, por ejemplo, por la acetohidroxiácido deshidratasa, denominada, además, dihidroxiácido deshidratasa (DHAD) - oí-cetoisovalerato a isobutiraldehído (ver la Figura 5, etapa d de la ruta en esa figura) , como se ha catalizado, por ejemplo, por la a-cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada; y isobutiraldehído a isobutanol (ver la Figura 5, etapa e de la ruta en esa figura) , como se ha catalizado, por ejemplo, por la alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada .

El sustrato para las conversiones de productos y las enzimas involucradas en estas reacciones para las etapas f, g, h, I, j, y k de rutas alternativas se describen en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20070092957 Al, que se incorpora en la presente descripción como referencia.

Los genes que pueden usarse para expresión de las enzimas en etapas de rutas que se mencionaron anteriormente, que no son las DHAD descritas en la presente invención, así como para otras rutas de isobutanol, se describen en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20070092957 Al, que se incorpora en la presente descripción como referencia. Un experimentado en la técnica podrá identificar otros genes que pueden usarse mediante el uso de técnicas bioinformáticas o a través de métodos muy conocidos en la técnica, tales como los varios métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/569,636, presentada el 29 de setiembre de 2009, que se incorpora en la presente descripción como referencia, para aislar homólogos. Las enzimas cetoácido reductoisomerasa (KARI, por sus siglas en inglés) adecuadas se describen en las publicaciones de solicitudes de patentes de los Estados Unidos núms . 20080261230 Al, 20090163376, 20100197519, y en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm.' 12/893077, todas incorporadas en la presente descripción como referencia. Los ejemplos de las KARI descritas en ellas son de Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa PAOl y Pseudomonas fluorescens PF5. La publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0269823 y la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 61/290,636, incorporadas en la presente descripción como referencia, describen las alcohol deshidrogenasas adecuadas.

Adicionalmente, en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20070092957 Al, que se incorpora en la presente descripción como referencia, se describe la construcción de genes quiméricos y la manipulación genética de bacterias y levaduras para la producción de isobutanol al usar las rutas biosintéticas descritas.

Modificaciones adicionales Los ejemplos de modificaciones adicionales que pueden ser útiles en las células proporcionadas en la presente invención incluyen modificaciones para reducir la actividad glicerol-3-fosfato deshidrogenasa y/o la interrupción en por lo menos un gen que codifica un polipéptido que tiene actividad piruvato descarboxilasa o una interrupción en por lo menos un gen que codifica un elemento regulador que controla la expresión génica de piruvato descarboxilasa, como 'se describe en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2-0090305363 (incorporada en la presente descripción como referencia) , modificaciones a una célula huésped que posibilitan un flujo incrementado de carbono a través de una ruta de Entner-Doudoroff , o la reducción del balance de equivalentes, como se describe en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20100120105 (incorporada en la presente descripción como referencia) . Otras modificaciones incluyen la integración de por lo menos un polinucleótido que codifica un polipéptido que cataliza una etapa en una ruta biosintética que usa piruvato, descrita en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 61/380563 (incorporada en la presente descripción como referencia) . Las modificaciones adicionales que pueden ser adecuadas se describen en la solicitud de patente de los Estados Unidos, núm. de serie 12/893089. Adicionalmente , las células huésped que comprenden un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido con actividad fosfocetolasa y las células huésped que comprenden un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido con actividad fosfotransacetilasa se describen en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 61/356379. Cultivo para producción Las células huésped recombinantes descritas en la presente invención se cultivan en medios de fermentación que contienen sustratos de carbono adecuados. Los sustratos de carbono adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, monosacáridos , tales como glucosa, fructosa, oligosacáridos, tales como lactosa, maltosa, galactosa o sacarosa, polisacáridos , tales como almidón o celulosa, o mezclas de estos, y mezclas no purificadas de materias primas renovables, tales como permeato de suero de queso, líquido de maceración de maíz, molasa de betabel azucarero y malta de cebada. Otros sustratos de carbono pueden incluir etanol, lactato, succinato o glicerol.

Adicionalmente , los sustratos de carbono pueden ser, además, sustratos de un solo carbono, tal como dióxido de carbono o metanol, para los que se ha demostrado la conversión metabólica en productos intermedios bioquímicos clave. Además, pueden ser adecuados los sustratos de dos carbonos, tales como etanol. Adicionalmente a los sustratos de uno y de dos carbonos, los organismos metilotróficos son conocidos, además, por usar muchos otros compuestos que contienen carbono, tales como metilamina, glucosamina y una variedad de aminoácidos para la actividad metabólica. Por ejemplo, las levaduras metilotróficas son conocidas por usar el carbono de la metilamina para formar trehalosa o glicerol (Bellion et al., Microb. Growth Cl Compd. , [Int. Sy p . ] , 7.° (1993), 415-32, Editor(es): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, Reino Unido de Gran Bretaña) . Análogamente, diversas especies de Candida metabolizarán alanina u ácido oleico (Sulter et al., Arch. Microbiol. 153:485-489 (1990)). Por lo tanto, se contempla que la fuente de carbono empleada en la presente invención puede abarcar una amplia variedad de sustratos que contienen carbono y solo estará limitada por la elección del organismo.

Aunque se contempla que todos los sustratos de carbono mencionados anteriormente y las mezclas de estos son adecuados en la presente invención, en algunas modalidades, los sustratos de carbono son glucosa, fructosa y sacarosa, o mezclas de estos con azúcares de C5, tales como xilosa y/o arabinosa para células de levadura modificadas para usar azúcares de C5. La sacarosa puede derivarse de fuentes de azúcar renovables, tales como caña de azúcar, betabel azucarero, mandioca, sorgo dulce, y mezclas de estos . La glucosa y la dextrosa pueden derivarse de fuentes de granos renovables a través de la sacarificación de materias primas a base de almidón que incluyen granos, tales como maíz, trigo, centeno, cebada, avena, y mezclas de estos. Adicionalmente, los azúcares fermentables pueden derivarse de biomasa renovable celulósica o lignocelulósica a través de procesos de pretratamiento y sacarificación, tal como se describe, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente copendiente y de propiedad mancomunada de los Estados Unidos nüm. 20070031918 Al, que se incorpora en la presente descripción cómo referencia. La biomasa se refiere a cualquier material celulósico o lignocelulósico e incluye materiales que comprenden celulosa y que comprenden, además, opcionalmente, hemicelulosa, lignina, almidón, oligosacáridos y/o monosacáridos . La biomasa puede comprender, además, otros componentes, tales como proteínas y/o lípidos. La biomasa puede derivarse de una sola fuente o puede comprender una mezcla derivada de más de una fuente; por ejemplo, la biomasa puede comprender una mezcla de mazorcas del maíz y rastrojos del maíz, o una mezcla de pastos y hojas. La biomasa incluye, pero no se limita a, cultivos bioenergéticos, residuos agrícolas, residuos sólidos municipales, residuos sólidos industriales, sedimentos de la fabricación del papel, residuos orgánicos, residuos forestales y de silvicultura. Los ejemplos de biomasa incluyen, pero no se limitan a, granos de maíz, mazorcas del maíz, residuos de cultivos, tales como cascaras de granos de maíz, rastrojos del maíz, hierbas, trigo, paja del trigo, cebada, paja de la cebada, heno, paja de arroz, pasto panizo, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, árboles, ramas, raíces, hojas, astillas de maderas, aserrín, matas y arbustos, vegetales, frutas, flores, estiércol, y mezclas de estos.

Adicionalmente a la fuente de carbono adecuada, los medios de cultivo deben contener minerales, sales, cofactores, soluciones tampónas y otros componentes apropiados, conocidos para los experimentados en la técnica, que son adecuados para el crecimiento de los cultivos y la promoción de una ruta enzimática que comprende una proteína que requiere centros Fe-S, tal como, por ejemplo, una DHAD. Condiciones de cultivo Típicamente, las células se cultivan a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 40 °C en un medio apropiado. Los medios de crecimiento adecuados en la presente invención son medios comunes comercialmente preparados, tales como el caldo Luria Bertani (LB, por sus siglas en inglés) , el caldo Sabouraud Dextrose (SD) , caldo de medio de levadura (YM, por sus siglas en inglés) o caldo que incluye una base nitrogenada de levadura, sulfato de amonio y dextrosa (como la fuente de carbono/energía) o medio YPD, una combinación de peptona, extracto de levadura y dextrosa en proporciones óptimas para cultivar el mayor número de cepas de Saccharomyces cerevisiae . Pueden usarse, además, otros medios de crecimiento definidos o sintéticos, y el medio adecuado para crecimiento del microorganismo específico será conocido para una persona con experiencia en la técnica de la ciencia de microbiología o fermentación. Además, puede incorporarse el uso de agentes conocidos para modular la represión de catabolitos directa o indirectamente, por ejemplo, adenosina 2':3'-monofosfato cíclico, al medio de crecimiento.

Los intervalos de pH adecuados para el cultivo son de aproximadamente un pH de 5.0 a aproximadamente un pH de 9.0. En una modalidad, se usa de aproximadamente un pH de 6.0 a aproximadamente un pH de 8.0 para la condición inicial. Los intervalos adecuados de pH para la fermentación de levadura se encuentran, típicamente, de aproximadamente un pH de 3.0 a aproximadamente un pH de 9.0. En una modalidad, se usa de aproximadamente un pH de 5.0 a aproximadamente un pH de 8.0 para la condición incial. Los intervalos adecuados de pH para la fermentación de otros microorganismos se encuentran de aproximadamente un pH de 3.0 a aproximadamente un pH de 7.5. En una modalidad, se usa de aproximadamente un pH de 4.5 a aproximadamente un pH de 6.5 para la condición inicial.

El cultivo puede llevarse a cabo en condiciones aerobias o anaerobias. En una modalidad, se usan condiciones anaerobias o microaerobias para el cultivo.

Fermentaciones industriales continuas y discontinuas Puede producirse isobutanol, u otros productos, al usar un método de fermentación discontinua. Una fermentación discontinua clásica es un sistema cerrado en donde la composición del medio se define al comienzo de la fermentación y no está sujeta a alteraciones artificiales durante la fermentación. Una variación del sistema discontinuo estándar es el sistema de alimentación discontinua o por lotes. Los procesos de fermentación con alimentación por lotes también son adecuados en la presente invención y comprenden un sistema discontinuo típico, con la excepción de que el sustrato se agrega en incrementos a medida que avanza la fermentación. Los sistemas de alimentación por lotes son útiles cuando la represión de catabolitos es apta para inhibir el metabolismo de las células, y en donde es conveniente contar con cantidades limitadas de sustrato en los medios . Las fermentaciones discontinuas y de alimentación por lotes son comunes y muy conocidas en la técnica, y se pueden encontrar-ejemplos en Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA. , o en Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol. , 36:227, (1992), que se incorporan en la presente descripción como referencia.

Puede producirse isobutanol, u otros productos, al usar un método de fermentación continua. La fermentación continua es un sistema abierto, en donde un medio de fermentación definido se agrega continuamente a un biorreactor y se extrae, simultáneamente, una cantidad igual de medio acondicionado para procesamiento. Generalmente, la fermentación continua mantiene los cultivos a una densidad elevada constante en donde las células están, principalmente, en la fase de crecimiento logarítmica. La fermentación continua permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afectan el crecimiento celular o la concentración del producto final. Los métodos para modular nutrientes y factores de crecimiento para procesos de fermentación continua, así como las técnicas para maximizar la velocidad de la formación del producto, son muy conocidos en la técnica de la microbiología industrial, y se detalla una variedad de métodos por Brock, supra.

Se contempla que la producción de isobutanol, u otros productos, puede practicarse al usar procesos continuos, discontinuos o de alimentación discontinua, y que será adecuado cualquier otro modo de fermentación conocido. Además, se contempla que las células pueden inmovilizarse sobre un sustrato como catalizadores de células enteras y someterse a condiciones de fermentación para la producción de isobutanol. Métodos para aislar isobutanol del medio de fermentación El isobutanol producido biológicamente puede aislarse del medio de fermentación mediante el uso de métodos conocidos en la técnica para fermentaciones ABE (ver, por ejemplo, Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol. 45:639-648 (1998), Groot et al., Process. Biochem. 27:61-27 (1992) y las referencias allí contenidas. Por ejemplo, los sólidos pueden extraerse del medio de fermentación por centrifugación, filtración, decantación, o similares. Después, el isobutanol puede aislarse del medio de fermentación mediante el uso de métodos tales como destilación, destilación azeotrópica, extracción líquido- líquido, adsorción, extracción por arrastre con gas, evaporación de membrana o pervaporación.

Dado que el isobutanol forma una mezcla azeotrópica con agua y de bajo punto de ebullición, puede usarse la destilación para separar la mezcla hasta su composición azeotrópica. La destilación puede usarse en combinación con otro método de separación para obtener la separación alrededor del azeótropo. Los métodos que pueden usarse en combinación con la destilación para aislar y purificar el butanol incluyen, pero no se limitan a, decantación, extracción líquido-líquido, adsorción y técnicas basadas en membranas. Además, el butanol puede aislarse mediante el uso de destilación azeotrópica al usar un arrastrante (ver, por ejemplo, Doherty y Malone, Conceptual Design of Distillation Systems, McGraw Hill, New York, 2001) .

La mezcla de butanol-agua forma un azeótropo heterogéneo para que la destilación pueda usarse en combinación con decantación para aislar y purificar el isobutanol. En este método, el caldo de fermentación que contiene isobutanol se destila hasta acercarse a la composición azeotrópica. Después, se condensa la mezcla azeotrópica, el isobutanol se separa del medio de fermentación por decantación. La fase acuosa decantada puede retornarse a la primera columna de destilación como reflujo. La fase orgánica decantada rica en isobutanol puede purificarse aún más por destilación en una segunda columna de destilación.

Además, el isobutanol puede aislarse del medio de fermentación mediante el uso de extracción líquido- líquido en combinación con destilación. En este método el isobutanol se extrae del caldo de fermentación al usar una extracción líquido- líquido con un solvente adecuado. Después, la fase orgánica que contiene butanol se destila para separar el butanol del solvente.

Puede usarse, además, destilación en combinación con adsorción para aislar isobutanol del medio de fermentación En este método el caldo de fermentación que contiene el isobutanol se destila hasta acercarse a la composición azeotrópica y, después, se extrae el resto del agua mediante el uso de un adsorbente, tal como los tamices moleculares (Aden et al. Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover, Informe NREL/TP-510-32438, National Renewable Energy Laboratory, junio de 2002) .

Adicionalmente, puede usarse destilación en combinación con pervaporación para aislar y purificar el isobutanol del medio de fermentación. En este método, el caldo de fermentación que contiene el isobutanol se destila hasta acercarse a la composición azeotrópica y, después, se extrae el resto del agua por pervaporación a través de una membrana hidrófila (Guo et al., J". Membr. Sci. 245, 199-210 (2004)). Modalidades de la invención Modalidad 1 (El) . Una célula huésped recombinante que comprende por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa, en donde por lo menos un polinucleótido heterólogo comprende un plásmido con un número alto de copias o un plásmido que tiene un número de copias que se puede regular.

E2. Una célula huésped recombinante que comprende por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa, en donde por lo menos un polinucleótido heterólogo se integra al menos una vez en el ADN recombinante de la célula huésped.

Una célula huésped recombinante que comprende por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa, en donde la célula huésped comprende por lo menos una supreción, . mutación y/o sustitución en un gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S.

Una célula huésped recombinante que comprende por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa y por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S.

La célula huésped recombinante de cualquiera de las modalidades E3-E4, en donde el polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S se selecciona del grupo que consiste en los genes de las Tablas 8 y 9.

La célula huésped recombinante de cualquiera de las Modalidades E3-E4, en donde el polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S se selecciona del grupo que consiste en los genes de la Tabla 7.

E7. La célula huésped recombinante de las Modalidades E5 o E6, en donde el polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S se selecciona del grupo que consiste en AFT1, AFT2, PSE1, FRA2, GRX3, MSN5 , y combinaciones de estos.

E8. La célula huésped recombinante de la Modalidad E7, en donde el polipéptido está codificado por un polinucleótido que es un imitante constitutivo.

E9. La célula huésped recombinante de la Modalidad E8 , en donde el imitante constitutivo se selecciona del grupo que consiste en AFT1 L99A, AFT1 L102A, AFT1 C291F, AFT1 C293F, y combinaciones de estos.

E10. La célula huésped recombinante de la Modalidad E7, en donde el polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S está codificado por un polinucleótido que comprende un plásmido con un número alto de copias o un plásmido con un número de copias que se puede regular.

Ell. La célula huésped recombinante de la Modalidad E7, en donde el polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S está codificado por un polinucleótido integrado al menos una vez en el ADN recombinante de la célula huésped. E12. La célula huésped recombinante de la Modalidad E3 , en donde por lo menos una supreción, mutación y/o sustitución en un gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S se selecciona del grupo que consiste en FRA2, GRX3 , MSN5, y combinaciones de estos.

E13. La célula huésped recombinante de la Modalidad E4 , en donde por lo menos un polinucleótido heterologo que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S se selecciona del grupo que consiste en AFTl, AFT2, PSE1, y combinaciones de estos.

E14. La célula huésped recombinante de cualquiera de las Modalidades E3-E13, en donde por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa se expresa en múltiples copias .

El5. La célula huésped recombinante de la Modalidad E14 , en donde por lo menos un polinucleótido heterólogo comprende un plásmido con un número alto de copias o un plásmido con un número de copias que se puede regular.

E16. La célula huésped recombinante de la Modalidad E14 , en donde por lo menos un polinucleótido heterólogo se integra al menos una vez en el ADN recombinante de la célula huésped.

E17. La célula huésped recombinante de cualquiera de las Modalidades E3-E16, en donde la biosíntesis de centros Fe- S se incrementa en comparación con una célula huésped recombinante que tiene biosíntesis de centros Fe-S endógenos .

E18. La célula huésped recombinante de cualquiera de las Modalidades E1-E17, en donde la célula huésped es una célula huésped de levaduras .

E19. La célula huésped recom inante de la Modalidad E18, en donde la célula huésped de levaduras se selecciona del grupo que consiste en Saccharcmyces, SchizoSaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, Issatchenkia y Pichia.

E20. La célula huésped recombinante de cualquiera de las Modalidades E1-E19, en donde el polipéptido heterologo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa se expresa en el citosol de la célula huésped.

E21. La célula huésped recombinante de cualquiera de las Modalidades E1-E20, en donde el polipéptido heterologo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tiene una secuencia de aminoácidos que coincide con el perfil HMM de la Tabla 12 con un valor E de < 10"5, en donde el polipéptido comprende, además, las tres cisteínas conservadas, correspondientes a las posiciones 56, 129 y 201 en las secuencias de aminoácidos de la enzima DHAD de Streptococcus mutans que corresponde a la sec. con núm. de ident . : 168.

E22. La célula huésped recombinante de cualquiera de las Modalidades E1-E21, en donde el polipéptido heterologo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tiene una secuencia de aminoácidos con por lo menos aproximadamente 90 % de identidad con la sec. con núm. de ident. : 168 o sec . con núm. de ident.: 232.

La célula huésped recombinante de cualquiera de las Modalidades E1-E22, en donde el polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tiene una actividad específica seleccionada del grupo que consiste en una actividad: mayor que aproximadamente 5 veces con respecto a la célula huésped de control que comprende por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa; mayor que aproximadamente 8 veces con respecto a la célula huésped de control que comprende por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa; y mayor que aproximadamente 10 veces con respecto a la célula huésped de control que comprende por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa.

La célula huésped recombinante de cualquiera de las Modalidades E1-E22, en donde el polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tiene una actividad específica seleccionada del grupo que consiste en una actividad: mayor que . aproximadamente 0.25 U/mg; b. mayor que aproximadamente 0.3 U/mg; c . mayor que aproximadamente 0.5 U/mg; d. mayor que aproximadamente 1.0 U/mg; e . mayor que aproximadamente 1.5 U/mg; f . mayor que aproximadamente 2.0 U/mg; g- mayor que aproximadamente 3.0 U/mg; h. mayor que aproximadamente 4.0 U/mg; i . mayor que aproximadamente 5.0 U/mg; j · mayor que aproximadamente 6.0 U/mg; k. mayor que aproximadamente 7.0 U/mg; 1. mayor que aproximadamente 8.0 U/mg; m. mayor que aproximadamente 9.0 U/mg; n. mayor que aproximadamente 10.0 U/mg; o. mayor que aproximadamente 20.0 U/mg; y P- mayor que aproximadamente 50.0 U/mg.

E25. La célula huésped recombinante de Modalidades E1-E24, en donde la célula huésped recombinante produce isobutanol.

E26. La célula huésped recombinante de la Modalidad E25, en donde la célula huésped recombinante comprende una ruta biosintética de isobutanol .

E27. Un método para fabricar un producto; el método comprende: a. proporcionar la célula huésped recombinante de cualquiera de las Modalidades E1.-E24; y b. poner la célula huésped recombinante de (a) en contacto con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en condiciones en las que se produce el producto; en donde el producto se selecciona del grupo que consiste en aminoácidos de cadena ramificada, ácido pantoténico, 2- metil-l-butanol,. 3-metil-l-butanol, isobutanol, y combinaciones de estos.

E28. Un método para fabricar isobutanol; el método comprende: a. proporcionar la célula huésped recombinante de cualquiera de las Modalidades E1-E24; b. poner la célula huésped recombinante de (a) en contacto con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en condiciones en las que se produce isobutanol .

E29. Un método para la conversión de 2, 3-dihidroxiisovalerato a -cetoisovalerato; el método comprende: a. proporcionar el huésped recombinante de cualquiera de las Modalidades E1-E24; b. cultivar la célula huésped recombinante de (aj en condiciones en las que el 2, 3-dihidroxiisovalerato se convierte a a-cetoisovalerato, en donde el 2, 3-dihidroxiisovalerato se convierte a o¡- cetoisovalerato .

E30. Un método para incrementar la actividad específica de un polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa en una célula huésped recombinante; el método comprende : proporcionar una célula huésped recombinante de cualquiera de las Modalidades E1-E24; y cultivar la célula huésped recombinante de (a) en condiciones mediante las cuales el polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa se expresa en una forma funcional que tiene una actividad específica mayor que una célula huésped igual que carece de ese polipéptido heterólogo.

Un método para incrementar el flujo en una ruta de biosíntesis de centros Fe-S en una célula huésped; el método comprende: proporcionar una célula huésped recombinante de cualquiera de las Modalidades E3-E24; y cultivar la célula huésped recombinante de (a) en condiciones mediante las cuales se incrementa el flujo en la ruta de biosíntesis de centros Fe-S en la célula huésped.

Un método para incrementar la actividad de una proteína que requiere centros Fe-S en una célula huésped recombinante; el método comprende: proporcionar una célula huésped recombinante que comprende una proteína que requiere centros Fe-S; modificar la expresión o la actividad de un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S en la célula huésped; y c. cultivar la célula huésped recombinante de (b) en condiciones mediante las cuales se incrementa la actividad de la proteína que requiere centros Fe-S.

E33. El método de la Modalidad E32, en donde el incremento en actividad se selecciona del grupo que consiste en una cantidad: a. mayor que aproximadamente 10 %; b. mayor que aproximadamente 20 %; c . mayor que aproximadamente 30 %; d. mayor que aproximadamente 40 %; e. mayor que aproximadamente 50 %; f . mayor que aproximadamente 60 % ; g. mayor que aproximadamente 70 %; h. mayor que aproximadamente 80 %; i. mayor que aproximadamente 90 %; y j. mayor que aproximadamente 95 %.

E34. El método de la Modalidad E32, en donde el incremento en actividad se selecciona del grupo que consiste en una cantidad: a. mayor que aproximadamente 5 veces; b. mayor que aproximadamente 8 veces; c. mayor que aproximadamente 10 veces.

E35. Un método para identificar polipéptidos que incrementan el flujo en una ruta de biosíntesis de centros Fe-S en una célula huésped; el método comprende: modificar la expresión o la actividad de un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S; determinar la actividad de una proteína heteróloga que requiere centros Fe-S; y y comparar la actividad de la proteína heteróloga que requiere centros Fe-S determinada en presencia de la modificación en la expresión o la actividad de un polipéptido de la etapa (a) con respecto a la actividad de una proteína heteróloga que requiere centros Fe-S determinada en ausencia de la modificación en la expresión o la actividad de un polipéptido de la etapa (a) , en donde un incremento en la actividad de la proteína heteróloga que requiere centros Fe-S indica un incremento en el flujo de la ruta de biosíntesis de centros Fe-S.

Un método para identificar polipéptidos que incrementan el flujo en una ruta de biosíntesis de centros Fe-S en una célula huésped; el método comprende: modificar la expresión o la actividad de un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S; determinar la actividad de un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa; y y comparar la actividad del polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa determinada en presencia de la modificación en la expresión o la actividad de un polipéptido de la etapa (a) con respecto a la actividad de un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa determinada en ausencia de la modificación en la expresión o la actividad de un polipéptido de la etapa (a) , en donde un incremento en la actividad del polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa indica un incremento en el flujo de la ruta de biosíntesis de centros Fe-S.

E37. El método de cualquiera de las Modalidades E30-E36, en donde la modificación de la expresión o la actividad de un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S comprende suprimir, mutar, sustituir, expresar, regular ascendentemente, regular descendentemente, alterar la localización celular, alterar el estado de la proteína y/o adicionar un cofactor.

E38. El método de cualquiera de las Modalidades E32-E37, en donde la proteína que requiere centros Fe-S tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa, y en donde la proteína que requiere centros Fe-S que tiene dihidroxiácido deshidratasa tiene una secuencia de aminoácidos que coincide con el Perfil HMM de la Tabla 12 con un valor E de< 10"5, en donde el polipéptido comprende, además, las tres cisteínas conservadas, correspondientes a las posiciones 56, 129 y 201 en las secuencias de aminoácidos de la enzima DHAD de Streptococcus mutans que corresponde a la sec. con núm. de ident.:168.

E39. El método de cualquiera de las Modalidades E32-E38, en donde el polipéptido que afecta la biosintesis de centros Fe-S se selecciona del grupo que consiste en los genes de las Tablas 7, 8 y 9.

E40. Una célula huésped recombinante que comprende por lo menos un polinucleótido que codifica a polipéptido identificado por los métodos de cualquiera de las Modalidades E35-E37.

E41. La célula huésped recombinante de la Modalidad E40, en donde la célula huésped comprende, además, por lo menos un polinucleótido heterologo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa.

E42. La célula huésped recombinante de la Modalidad E41, en donde el polinucleótido heterologo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa se expresa en múltiples copias .

E43. La célula huésped recombinante de la Modalidad E41, en donde el polinucleótido heterologo comprende un plásmido con un número alto de copias o un plásmido con un número de copias que se puede regular.

E44. La célula huésped recombinante de la Modalidad E41, en donde el polinucleótido heterologo se integra al menos una vez en el ADN recombinante de la célula huésped.

E45. El método de la Modalidad E35 o E36, en donde la célula huésped es una célula huésped de levaduras.

E46. El método de la Modalidad E45, en donde la célula huésped de levaduras se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces, SchizoSaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, Issatchenkia y Pichia.

E47. El método de cualquiera de las Modalidades E28-E39, en donde la célula huésped es una célula huésped de levaduras .

E48. El método de la Modalidad E47, en donde la célula huésped de levaduras se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces, SchizoSaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, Issatchenkia y Pichia.

E49. La célula huésped recombinante de cualquiera de las Modalidades E40-E44, en donde la célula huésped recombinante es una célula huésped de levaduras .

E50. La célula huésped recombinante de la Modalidad E49, en donde la célula huésped de levaduras se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces, SchizoSaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, Issatchenkia y Pichia.

E51. La célula huésped recombinante de cualquiera de las Modalidades E40-E44 o E49-E50, en donde el polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa se expresa en el citosol de la célula huésped.

E52. La célula huésped recombinante de cualquiera de las Modalidades E40-E44 o E49-E50, en donde el polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tiene una secuencia de aminoácidos que coincide con el Perfil HMM de la Tabla 12 con un valor E de < 10~s, en donde el polipéptido comprende, además, las tres cisteínas conservadas, correspondientes a las posiciones 56, 129 y 201 en las secuencias de aminoácidos de la enzima DHAD de Streptococcus mutans que corresponde a la sec. con núm. de ident. :168.

E53. La célula huésped recombinante de cualquiera de las Modalidades E40-E44 o E49-E50, en donde la célula huésped recombinante produce un producto seleccionado del grupo que consiste en aminoácidos de cadena ramificada, ácido pantoténico, 2-metil-l-butanol, 3-metil-l-butanol, isobutanol, y combinaciones de estos.

E54. La célula huésped recombinante de la Modalidad E53, en donde la célula huésped recombinante produce isobutanol. E55. La célula huésped recombinante de la Modalidad E54, en donde la célula huésped recombinante comprende una ruta ' biosintética de isobutanol .

EJEMPLOS El significado de las abreviaturas usadas es el siguiente: "min" significa minuto (s), "h" significa hora(s), "s" significa segundo(s), "µ?" significa microlitro(s) , "mi" significa mililitro (s) , "1" significa litro(s), "nm" significa nanómetro (s) , "mm" significa milímetro (s) , "cm" significa centímetro (s) , "µp?" significa micra(s), "mM" significa milimolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimol(es), "µt???" significa micromol (es) , "g" significa gramo(s), w g" significa microgramo (s) , " g" significa miligramo (s) , "rpm" significa revoluciones por minuto, "p/v" significa peso/volumen, "OD" significa densidad óptica, y "OD600" significa densidad óptica medida a una longitud de onda de 600 nm.

Métodos generales : Las técnicas estándares de clonación molecular y ADN recombinante usadas en los ejemplos son muy conocidas en la técnica y se describen en Sambrook, J. , Fritsch, E. F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. , 1989, de T. J. Silhavy, M. L. Bennan, y L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. , 1984, y de Ausubel, F. M. et al., Current Protocole in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, N.Y., 1987.

Además, los materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de cultivos bacterianos son muy conocidos en la técnica. Las técnicas adecuadas para usarse en los siguientes ejemplos pueden encontrarse en Manual of Methods for General Bacteriology, Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg y G. Briggs Phillips, eds . , American Society for Microbiology, Washington, DC. , 1994, o en Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda edición, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, 1989. Todos los reactivos, enzimas de restricción y materiales usados para el crecimiento y mantenimiento de células bacterianas se obtuvieron de Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI) , BD Diagnostic Systems (Sparks, MD) , Life Technologies (Rockville, MD) , o Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) , a menos que se indique de cualquier otra forma. Ejemplo 1. Sobreexpresión de la proteína DHAD codificada por el gen ilvD de S. mutans al usar un sistema basado en plásmidos en citosol de levaduras.

La sobreexpresión de un polinucleótido recombinante puede lograrse al incrementar el número de copias de un plásmido que comprende el polinucleótido recombinante. Para sobreexpresar la proteína DHAD en levaduras , se construyó un vector inducible. El vector pHR81 contiene un marcador Ura3 así como un marcador LEU con un promotor defectuoso (ver la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0092957, que se incorpora en la presente descripción como referencia) . Cuando se cambia el medio de crecimiento sintético selectivo (SD, por sus siglas en inglés; conocido, además, como medios mínimos completos; Teknova) para levaduras de SD sin uracilo a SD sin leucina, aumenta el número de copias del plásmido pHR81, lo que da como resultado un nivel mucho más alto de expresión del polinucleótido recombinante . La estructura básica del vector pHR81 se derivó de pLH472 JEG4y (sec. con núm. de ident.: 921) y se preparó al digerir el vector pLH472 JEG4y con Spel y SacII.

Para la sobreexpresión de una proteína DHAD, se usó el gen de ilvD de la DHAD de S. mutans (sec. con núm. de ident. ¡167) (ver la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009-0305363A1, que se incorpora en la presente descripción como referencia) . Este gen se ha clonado bajo el control del promotor FBA en el vector pRS423 FBA ilvD Strep-lumio (ver la solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 2009-0305363A1, que se incorpora en la presente descripción como referencia) . La región que contiene el cásete con el promotor FBA, el gen ilvD y el terminador FBA se amplificó con un conjunto . de cebadores FBAp-F (Nhel) y FBAt-R (SacII) (sec. con núms . de ident.: 915 y 916) y se clonó en el vector pHR81. El vector de expresión resultante se designó pHR81 FBA-IlvD(Sm) (sec. con núm. de ident. : 917; Figura 1A) .

Para sobreexpresar la proteína DHAD de S. mutans, el vector de expresión pHR81 FBA- IlvD (Sm) se transformó en la cepa silvestre de levadura BY4741. Se seleccionaron los transformantes en placas con agar y SD sin uracilo. Para la sobreexpresión, las cepas de levadura que contenían el plásmido se cultivaron inicialmente a 30 °C en medio líquido SD sin uracilo. Después, un cultivo nuevo preparado durante toda la noche (5 mi) se transfirió a un matraz de 125 mi que contenía . 75 mi de medio SD sin leucina. Como control, se transfirió 5 mi otro cultivo nuevo preparado durante toda la noche a un matraz que contenía 75 mi de SD sin uracilo. Los cultivos se incubaron durante toda la noche antes de recolectarse por centrifugación. La actividad DHAD se determinó en extractos crudos de estas muestras al usar el ensayo descrito en el Ejemplo 7.

La actividad específica de la DHAD obtenida en el extracto crudo en las muestras de control cultivadas en SD sin uracilo estuvo en el intervalo de 0.2 a 0.3 U mg"1. Sin embargo, la actividad específica promedio obtenida de cepas cultivadas en el medio SD sin leucina fue de 1.6 U mg"1, mucho más alta (de ~5 a 8 veces más alta) que la actividad de las muestras de control. La DHAD requiere un centro Fe-S para su funcionamiento, y no se conocía previamente si la ruta de biosíntesis de centros Fe-S en levaduras nativas podía albergar una proteína sobreexpresada que requiriera un centro Fe-S en el citosol de la levadura. En un experimento de selección previo que usó un vector no inducible con un número bajo de copias, la DHAD de S. mutans pudo expresarse de manera recombinante en el citosol de levaduras con una actividad específica en el intervalo de 0.1 a 0.2 U mg"1 en el extracto crudo {ver la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/569,636, presentada el 29 de setiembre de 2009, que se incorpora en la presente descripción como referencia). Así, en una modalidad, la sobreexpresión de una proteína que requiere centros Fe-S, tal como una DHAD, en levaduras al usar un vector con un número alto de copias proporciona actividad específica incrementada, en donde la actividad específica se incrementa de por lo menos aproximadamente 5 veces a por lo menos aproximadamente 8 veces .

Ejemplo 2. Sobreexpresión de la proteína DHAD codificada por el gen ilvD de S. mutans a través de integración cromosómica .

Una manera alternativa de incrementar la expresión de un gen en levaduras es integrar múltiples copias del gen de interés en el cromosoma de la célula huésped. Para integrar el gen ilvD de S. mutans (sec. con núm. de ident.:167) en un cromosoma de levaduras, se construyó el vector de integración pZK-Delta (s) -Leu2-FBA-ilvD (Sm) -FBAt (sec. con núm. de ident . : 918; Figura IB). La estructura básica del vector de integración se derivó de pSuperscript (Stratagene, La Jolla, CA) . El gen ilvD de S. mutans (nucleótidos 1306-3018 de la cadena no codificante) se clonó en el vector de integración bajo el control del promotor FBA (nucleótidos 3026-4023 de la cadena no codificante) para que el gen ilvD estuviera flanqueado por una secuencia delta de levaduras (nucleótidos 118-267 y 5061-5760 de la cadena no codificante) . S. cerevisiae contiene más de 200 secuencias delta de levaduras (Kim J et al. Genome Res. 1998; 8:464-478). Estas secuencias delta son destinos para integraciones múltiples. Además, el vector de integración se manipuló genéticamente para contener el marcador defectuoso LEU2 (nucleótidos 4100-5191 de la cadena no codificante) para selección de cepas transformadas con eventos de integraciones múltiples.

Para integración, el ADN del vector se linealizó con digestión de AscI y AatlI para generar las cadenas flanqueadas por secuencias delta del ADN del vector que comprende el gen ilvD, que después se transformaron en la cepa. de levadura BY4741. Los transformantes se seleccionaron sobre agar con medio SD sin leucina. Después, estos transformantes se cultivaron en medio líquido SD sin leucina a 30 °C, y se recolectaron y analizaron los cultivos para determinar la actividad DHAD. La actividad específica de la DHAD obtenida en el extracto crudo estuvo en el intervalo de 0.7 a 1.2 U mg"1. Esta actividad especifica fue aproximadamente de 3 a 6 veces más alta que la encontrada en cepas BY4741 transformadas con un plásmido que contenía el gen ilvD sin sobreexpresión.

Ejemplo 3. Mejoramiento de la actividad específica de la DHAD en cepas de levaduras con deleeiones > .

Aunque las cepas para sobreexpresión descritas en los Ejemplos 1 y 2 tuvieron un nivel alto de actividad, no todas las proteínas DHAD expresadas estuvieron activas. Por ejemplo, la proteína DHAD sobreexpresada representó de aproximadamente 5 a 10 % de proteína total en la célula, aunque produjo una actividad específica de aproximadamente 0.7 a 1.6 U mg"1. Dado que la actividad específica de la enzima DHAD purificada de S. mutans es 100 U mg"1, se esperaría que la éxpresión de DHAD a 10 % de proteína total en la célula produjera una actividad específica mayor que 5-10 U mg"1. Sin la intención de limitarse por ninguna teoría particular, la diferencia entre la actividad específica esperada y la observada fue, probablemente, el resultado de una carga insuficiente de centros Fe-S. Así, podría aumentarse la carga de centros Fe-S al manipular adicionalmente las cepas de sobreexpresión para incrementar la actividad específica de la DHAD.

Con el propósito de mejorar la actividad específica, se usaron cepas de levaduras con deleciones en genes involucrados en la detección de centros Fe-S y el metabolismo del hierro para investigar sus efectos sobre la actividad específica de la DHAD. Estas cepas (estructura básica de BY474) se obtuvieron de Open Biosystem (Huntsville, AL) y se presentan en la Tabla 10. Como se describe en el Ejemplo 1, el plásmido pHR81 FBA-IlvD(Sm) con un número alto de copias se transformó en estas cepas, y se indujo la sobreexpresión de DHAD al modificar el medio de crecimiento a SD sin leucina. Se prepararon extractos crudos de los cultivos y se sometieron a prueba para determinar la actividad DHAD. Los resultados se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10. Efectos de las deleciones de genes involucrados en el metabolismo del Fe.

Sorprendentemente, la actividad específica de la DHAD en el extracto crudo en cepas con una supreción en el gen FRA2 o en el gen GRX3 se incrementó de dos a tres veces, lo cual fue inesperado, ya que muchas de las deleciones ensayadas no aumentaron la actividad específica de la DHAD. Se ha demostrado que la maquinaria de ensamblado de hierro-azufre citosólico (CIA, por sus siglas en inglés) en levaduras es responsable del ensamblado de centros Fe-S para proteínas citosólicas, tales como isopropilmalato isomerasa (Leul) . Los resultados previos indican que esta maquinaria CIA es independiente del sistema de detección de hierro que involucra a Aftl y un heterodímero de Grx3/Grx4 - Fra2 como represor (Rutherford et al., J Biol Chem. 250:10135-10140 (2005)).

Otro hallazgo inesperado es el efecto de una supreción en Grx3 en la actividad de la DHAD. Se ha demostrado que Grx3 y Grx4 son funcionalmente equivalentes. Si bien las mutaciones dobles en ambos genes, GRX3 y GRX4 , produjeron una • activación drástica del regulador del Fe, la mutación en Grx4 por sí sola confiere el fenotipo mínimo (Pujol-Car ion, et al., J Cell Sci. 115:4554-4564 (2006); Ojeda, et al., J Biol Chem. 281:17661-17669 (2006).). Como se muestra en la Tabla 10 anterior, la supreción en GRX3 por sí sola conduce a una mejora significativa en la actividad específica de la DHAD.

Así, estos resultados demuestran que la modulación de genes involucrados en el metabolismo del hierro puede incrementar la actividad de una proteína que requiere centros Fe-S, por ejemplo, una DHAD, cuando se expresa en el citosol de levaduras. Como se describe en la Figura 10, el efecto de las deleciones de los genes FRA2 y GRX3 en la actividad específica de la DHAD podría resultar, por ejemplo, de la activación de la transcripción de uno o más de los genes en el regulador de hierro por medio del regulador global Aftlp. Sin la intención de limitarse por ninguna teoría particular, la activación de estos genes podría conducir a un incremento en la captación de hierro y un incremento en la biosíntesis citoplasmática de centros Fe-S y producir una carga más alta de centros Fe-S de la proteína (Figura 10) . La demostración de la carga incrementada de centros Fe-S se describe en el Ejemplo 11.

Ejemplo 4. Efecto de la expresión de Aftlp y sus mutantes en la actividad específica de la DHAD.

Como se describe en el Ejemplo 3 y se muestra en la Figura 10, Fra2, Grx3 y Grx4 son represores que regulan la función de Aftlp (Kumánovics, et al., J". Biol. Chem. 283:10276-10286 (2008)). Aftlp es un regulador global de hierro. La activación de genes involucrados en la captación y metabolismo del hierro requiere la localización nuclear de Aftlp. La expresión de mutantes constitutivos de Aftl o un incremento en la expresión del tipo silvestre de Aftlp podría conducir a la activación del regulador de Fe en una cepa silvestre o en una cepa con supreción de AFT1 (Yamaguchi-Iwai, et al., EMBO J. 14:1231-1239 (1995); Yamaguchi-Iwai, et al., J". Biol. Chem. 277:18914-18918 (2002); Kaplan, et al., Chem. Rev. 105:4536-4552(2009)). Con base en los hallazgos novedosos descritos en el Ejemplo 3, es posible que la expresión de la proteína Aftlp y sus mutantes constitutivos mejore la fracción activa de la enzima DHAD que requiere centros Fe-S para su actividad.

Para analizar esta posibilidad, el tipo silvestre del gen AFT1 y sus mutantes constitutivos se clonaron al usar un vector con un centrómero, pRS411 (ATCC® Número: 87538; sec. con núm. de ident . : 919). Este vector tiene un marcador de selección de ampicilina para crecimiento en E. coli y un marcador nutricional de metionina para selección en levaduras. El tipo silvestre del gen AFT1, que incluye su propio promotor y terminador, puede clonarse entre los sitios Kpnl y SacI y dar como resultado el constructo pRS411-Aftl+flanqueantes (sec. con núm. de ident. : 920; Figura 2) . Puede usarse una estrategia similar para clonar genes que codifican mutantes constitutivos de Aftl. En primer lugar, se examinaron los mutantes constitutivos de Aftl con sustituciones en los aminoácidos L99 para A y C291 para F (con respecto a la sec. con núm. de ident.: 703) . Los constructos pRS411 con genes que codifican el gen de tipo silvestre AFTl o sus mutantes constitutivos se transformaron, junto con el vector de expresión pHR81 FBA IlvD(Sm), en la cepa silvestre de levaduras BY4741 o una cepa de levaduras con una supreción en AFTl, GRX3 , o FRA2. Los transformantes se seleccionaron en placas con agar y medio SD sin metionina y uracilo. Las cepas transformadas se cultivaron en medio SD sin metionina y leucina para sobreexpresar la proteína DHAD en presencia de estos genes o mutantes. Se determinó la actividad DHAD en el extracto crudo de estos cultivos .

Los resultados de la expresión de los tipos silvestres de Aftlp, Aftlp (C291F) , y Aftlp(L99A) se muestran en la Tabla 11. Se observó un incremento moderado en la actividad específica de la DHAD con Aftlp (C291F) en comparación con el tipo silvestre de Aftlp. Se observó un incremento mucho mayor en la actividad de la DHAD con Aftlp(L99A). La actividad específica de la DHAD en levaduras que expresan Aftlp (L99A) fue similar a la actividad específica obtenida en la cepa con supreción de GRX3 (ver Tabla 10) .

Tabla 11. Efectos de la expresión de Aftlp y sus mutantes sobre la actividad de la DHAD de S. mutans en la cepa Aaffcl.

Ejemplo 5. Incremento en la actividad específica de la DHAD citosólica en una cepa con delección de CCCl.

Se desconoce el mecanismo exacto para incrementar la capacidad de biosíntesis de centros Fe-S para la proteína DHAD citosólica. Con base en los hallazgos con cepas con •supreción de FRA2 y GRX3 (Ejemplo 3) y con expresión de mutantes de Aftlp (Ejemplo 4) , incrementar la disponibilidad del contenido de Fe en el citosol puede mejorar, además, la actividad específica de la DHAD. Se ha demostrado que la supreción de CCCl incrementa el contenido de Fe del citosol (Li L, et al., J Biol Chem. 276:29515-29519 (2001)). Para someter a prueba esta hipótesis, la cepa de BY4741 con supreción de CCCl se transformó con el plásmido pHR81 FBA-Ilv (Sm), como se describe en el Ejemplo 1. Los extractos crudos de células con el plásmido se sometieron a prueba para determinar la actividad de la DHAD. La Tabla 13 muestra los resultados del experimento. Cuando la cepa con supreción de CCC1 con el plásmido de DHAD se cultivó en medio SD sin uracilo, se verificó un incremento en la actividad específica de la DHAD en comparación con las células de tipo silvestre con el mismo plásmido. Cuando se agregó una cantidad adicional de Fe, se observó un incremento adicional en la DHAD en la cepa con supreción de CCC1. La adición de Fe no mostró ningún efecto en la actividad específica de la DHAD en las células de tipo silvestre. Para lograr una sobreexpresión de la proteína DHAD, las cepas se cultivaron en medio SD sin leucina (Ejemplo 1) . En estas condiciones, se detectó un incremento en la actividad específica de la DHAD.

Tabla 13. Expresión de la DHAD de S. mutans en la cepa BY4741 (Acccl) .

Ejemplo 6. Mejoramiento de la actividad específica de la DHAD de L. lactis expresada en levadura.

Los Ejemplos 1-5 usaron la enzima DHAD de S. mutans para identificar maneras novedosas de incrementar la actividad específica de la DHAD cuando se expresa en levaduras. En este ejemplo, se investigó la aplicación de estos métodos para mejorar la actividad específica de la enzima DHAD de L . lactis (sec. con núm. de ident.: 958). El gen IlvD de L. lactis (sec. con núm. de ident.: 959) se clonó en el vector pHR81 bajo el control del promotor FBA (Figura 11) . El constructo resultante, pHR81 FBA-IlvD (Ll) -ADHt (Figura 11; sec. con núm. de ident.: 960) se transformó en cepas con una supreción en el gen FRA2 o en el gen GRX3. Para analizar el efecto del mutante constitutivo Aftlp(L99A) sobre la DHAD de L. lactis, pHR81 FBA- IlvD (Ll) -ADHt se cotransformó en un huésped de levadura junto con el vector pRS411-Afti (L99A) (ver Ejemplo 4). Para sobreexpresar el gen IlvD, los transformantes se cultivaron en medio sintético selectivo para levaduras sin leucina o sin leucina ni metionina, dependiendo de las cepas. Los resultados de los ensayos enzimáticos se resumen en la Tabla 14. Las deleciones en los genes FRA2 y GRX3 incrementaron la actividad específica de la DHAD de L. lactis cuando se expresa en levaduras. Adicionalmente, la expresión del mutante constitutivo de Aftl, L99A, incrementó de manera similar la actividad específica de la DHAD de L. lactis.

Tabla 14. Sobreexpresion de la DHAD bacteriana de L. lactis en S. cerevisiae .

Ejemplo 7. Determinación de la actividad específica de la DHAD. (Método de ensayo) La cuantificación de la actividad de proteínas que requieren centros Fe-S puede hacerse en un formato de ensayo. Si la proteína es una enzima, tal como DHAD, la actividad se expresa, típicamente, en términos de unidades de actividad. La Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica ha definido una unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 micromol del sustrato por minuto en condiciones estándar (International Union of Biochemistry, Report of the Commission on Enzymes, Oxford: Pergamon Press, 1961) . Además, el término "actividad específica" se define como las unidades de actividad en una cantidad dada de enzima. Así, la actividad específica no se determina directamente, sino que se calcula al dividir 1) la actividad en unidades/ml de la muestra de enzimas por 2) la concentración de proteínas en esa muestra, para que la actividad específica se exprese como unidades/mg. La actividad específica de una muestra de enzima pura totalmente activa es una característica de esa enzima. La actividad específica de una muestra de una mezcla de proteínas es una medida de la fracción relativa de proteínas en esa muestra que se compone de la enzima activa de interés. La actividad DHAD puede determinarse espectrofotométricamente en un ensayo de punto final al usar el método de 2,4-dinitrofenilhidrazina (2,4-DNPH), como se describe en Flint, D.H. y M.H. Emptage, J. Biol . Chem. 253:3558-64 (1988) . En este ensayo, la 2,4-DNPH reacciona con el grupo ceto del producto del ácido 2-cetoisovalérico para formar una hidrazona, que se detecta por su absorbancia a 550 nm. La solución tampón del ensayo contiene Tris, HC1 50 mM, MgCl2 10 mM, a un pH de 8.0 (solución tampón TM8) . Se agrega la cantidad suficiente de ácido 2 , 3 -dihidroxiisovalérico a la solución tampón del ensayo para que su concentración final en la mezcla del ensayo sea de 10 mM. En cada ensayo, una solución que contiene enzimas y una solución tampón que contiene la cantidad suficiente de sustrato se mezclan para que el volumen final sea de 1 mi . La mezcla del ensayo se incuba, normalmente, a 37 °c por 30 minutos.

El ensayo se detiene al agregar 250 µ? de ácido tricloroacético al 10 % (p/v) . Algunos minutos después, se agrega 500 µ? de una solución saturada de 2,4-DNPH en HCl 1N. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante por lo menos 10 minutos para permitir la formación de la hidrazona. Después, se agrega 1.75 mi de NaOH para solubilizar la hidrazona y para precipitar la 2,4-DNPH sin reaccionar. Algunos minutos después de agregar el NaOH, los tubos de ensayo se colocan en un baño de ultrasonido por 10 minutos para desgasificarse. Después, se centrifugan los tubos en una centrífuga de laboratorio a velocidad máxima durante 2 minutos para sedimentar el precipitado.

Se lee entonces la absorbancia del sobrenadante a 550 nm dentro de un período de 1 hora. La absorbancia de los ensayos de las muestras menos los ensayos de control se divide por 2600 (determinado a partir de una curva estándar de ácido a-cetoisovalérico) para hallar las unidades de actividad enzimática en el ensayo. Este ensayo se usó en los ejemplos descritos en la presente invención en los que se determinó la actividad específica de la DHAD.

Ejemplo 8. Purificación y caracterización de la DHAD de S. mutans expresada en E. coli.

La DHAD de S. mutans se purificó y se caracterizó de la siguiente manera. Seis litros de cultivo de la cepa Turner de E. coli que albergaba el plásmido pET28a que contenía el gen ilvD de S. mutans se cultivaron e indujeron con IPTG. La DHAD de S. mutans se purificó por ruptura de células con un sonicador en una solución tampón TM8 (ver Ejemplo 7) , se centrifugó el extracto crudo para eliminar los restos de células y, después, se cargó el sobrenadante del extracto crudo en una columna Q Sepharose (GE Healthcare) para eluir la DHAD con una concentración creciente de NaCl en la solución tampón TM8. Se agruparon las fracciones que contenían la DHAD, se llevaron a (NH4)2S04 1 M, y se cargaron en una columna Phenyl-Sepharose (GE Healthcare) equilibrada con (NH4)2S04 1 M. La DHAD se eluyó con una concentración decreciente de (NH4)2S04. Se agruparon las fracciones que contenían la DHAD, se concentraron a = 10 mi, se cargaron en una columna Superdex 200 de 35 x 600 cm (577 mi de volumen de lecho) (GE Healthcare) y se eluyeron con solución tampón TM8. Según lo determinado con geles de SDS, se calculó que la pureza de la DHAD de S. mutans que eluyó de la columna Superdex fue de = 90 %.

El espectro de luz ultravioleta-visible de la DHAD de S. mutans purificada se muestra en la Figura 3. La cantidad de picos por encima de 300 nm es típico de las proteínas con centros [2Fe-2S] . La DHAD de S. mutans se redujo con ditionita de sodio, y se determinaron sus espectros de EPR a varias temperaturas. La Figura 4 muestra los espectros de EPR determinados a temperaturas de entre 20 °K y 70 °K. El espectro de EPR de la DHAD de S. mutans es medible hasta 70 °K, lo que indica que contiene un centro [2Fe-2S] y no un centro [4Fe-4S] , porque los espectros de EPR de proteínas que contienen centros [4Fe-4S] no pueden observarse a temperaturas superiores a 10 °K.

El contenido exacto de proteínas del lote de la DHAD de S. mutans purificada con la actividad específica más alta al usar el ensayo de proteínas de Bradford se determinó por análisis cuantitativo de aminoácidos. Al combinarse la actividad con el contenido de proteínas se obtuvo una actividad específica de 100 unidades/mg para este lote. El contenido de hierro de este lote determinado por ICP-MS al usar la metodología conocida en la técnica fue de 2 moléculas de hierro por molécula de DHAD. Esto es consistente con este lote de la DHAD de S. mutans que contiene un complemento completo de centros [2Fe-2S] .

Ejemplo 9. Separación de las formas de DHAD en el extracto crudo de levadura de otras proteínas en la célula y entre sí para determinar la cantidad de DHAD presente .

La proteína DHAD en células de levadura existe en las formas de dímeros. con dos centros Fe-S/dímero, un solo centro Fe-S/dímero y ningún centro Fe-S/dímero. Se desarrolló un método para medir la concentración de estas tres formas de la proteína DHAD en extractos crudos de levadura al usar una columna Mono Q y una columna Source 15 PHE PE 4.6/100 (ambas columnas obtenidas de GE Healthcare), y se describe a continuación.

Se descongelaron células de levadura congeladas, se suspendieron en Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, pH de 8.0 (TM8) y, después, se rompieron mecánicamente con microesferas de cristal. Se centrifugaron las células rotas para eliminar los restos de células y generar el extracto crudo de levadura.

El extracto crudo se cargó en una columna Mono Q de 4 mi acoplada a un sistema cromatográfico AKTA (GE Healthcare) ; la solución tampón A fue TM8 y la solución tampón B, TM8 que contenía NaCl 0.5 M. Se equilibró la columna con la solución tampón A antes de cargar la muestra. La DHAD de S. mutans se unió a la columna Mono Q en estas condiciones. Una vez cargada la muestra en la columna, la columna se lavó con 10 mi de solución tampón TM8 y, después, se incrementó la concentración de NaCl en el eluyente a NaCl 0.22 M. A esto le siguió un gradiente lineal de 30 mi de Nací de 0.22 M a 0.35 M. Durante la cromatografía, se supervisó la A215 del eluato de la columna, y se recolectaron fracciones de 1 mi. Se sometieron a prueba las fracciones para determinar la actividad de la DHAD. La suma de la actividad de la DHAD en las fracciones fuera de la columna Mono Q resultó próxima a la del extracto crudo. Se obtuvieron separaciones adecuadas al usar esta columna con una cantidad de 5 mi de extracto crudo que representa hasta 1 g de la pasta de células de levadura. Se agruparon las fracciones que contenían la DHAD que dieron 1.35 M en (NH4)2S04 en preparación para la cromatografía en la columna PHE.

La columna Source 15 PHE PE 4.6/100 también se acopló a un sistema cromatográfico AKTA; la solución tampón A fue TM8 que contenía (NH4)2S04 1.5 M, y la solución tampón B fue TM8.

Antes de cada ejecución, la columna se equilibró con 90 % de A. Las fracciones agrupadas de la columna Mono Q que dieron 1.35 M en (NH4)2S04 se cargaron en la columna PHE, y a esta concentración de (NH ) 2S04 , la DHAD se unió a la columna. Durante la cromatografía, se supervisó la A2i5 del eluato de la columna, y se recolectaron fracciones de 1 mi . La DHAD ' eluyó de la columna en tres picos cuando la columna se desarrolló con un gradiente lineal decreciente de 30 mi de (NH )2S04 de 1.35 M a 0 M. El área de cada uno de los picos de la DHAD se determinó por integración. Se comprobó que este esquema de elución es ideal para separar la DHAD de S. mutans de otras proteínas de levadura que eluyeron conjuntamente con la DHAD fuera de la columna Mono Q. Los geles de SDS usados en fracciones en donde se eluyeron picos mostraron que bastante más del 90 % de la proteína presente en estos picos era DHAD cuando esta se expresaba a 1 % de la proteína soluble en células de levaduras. Las fracciones que contenían cada uno de los tres picos de la DHAD se agruparon por separado. Con base en el espectro absorbente de luz ultravioleta visible y el contenido de hierro y sulfuro de la DHAD en estos picos, se determinó que el primer pico contenía DHAD con dos centros [2Fe-2S] /dímeros , el segundo pico contenía DHAD con un solo centro [2Fe-2S] /dímero, y el tercer pico contenía DHAD sin ningún centro [2Fe-2S] /dímeros . Así, en su estado nativo, la enzima DHAD de S. mutans parece existir como un dimero de dos proteínas DHAD monoméricas.

Una curva estándar que relaciona la cantidad de DHAD presente en una muestra con la suma del área de los tres picos de la DHAD fuera de la columna PHE se obtuvo de la siguiente manera. A extractos crudos de células de levadura que no contenían ninguna DHAD de S. mutans se les añadió cantidades diversas de la DHAD de S. mutans purificada. Estos extractos se sometieron a una cromatografía en las columnas Mono Q y PHE, como se describió anteriormente. Se integró el área debajo de cada uno de los tres picos de la DHAD. Se trazó una gráfica de la suma de estas áreas contra la cantidad de DHAD pura añadida en los extractos crudos de levaduras . Se usó la gráfica para derivar la siguiente ecuación: #pg de DHAD en la muestra de extracto crudo = 0.507 x (recuentos de las áreas sumadas de los tres picos de la DHAD) La actividad de la DHAD en un extracto crudo de levadura puede determinarse fácilmente con el método descrito en el Ejemplo 7. La cantidad de proteína DHAD en extractos crudos de levadura puede determinarse con el procedimiento descrito en este ejemplo. Con estos datos, se puede calcular la actividad específica de la proteína DHAD de S. mutans per se en extractos crudos de conformidad con el procedimiento del Ejemplo 10.

Ejemplo 10. Métodos para determinar la fracción de DHAD en extractos crudos de levadura cargada con centros Fe-S.

Cuando una proteína purificada que requiere centros S contiene un complemento completo de centros, esta tendrá una actividad específica característica. Como se mencionó anteriormente, para la DHAD de S. mutans, esta actividad específica es de 100 unidades/mg cuando tiene un complemento completo de centros .

Una muestra de DHAD que tiene, en promedio, un solo centro Fe-S/por dimero podría contener algunos dímeros con dos centros, algunos dímeros con un solo centro y algunos dímeros sin ningún centro. Alternativamente, si la adición de centros a un dimero es de todos los centros o de ninguno y, en promedio, hay un solo centro Fe-S/dímero en una muestra, la mitad de los dímeros de la DHAD tendrían un complemento completo de centros y la otra mitad no tendría centros . A partir de los resultados del Ejemplo 9, se sabe que el comportamiento de todos o de ninguno no es el que sigue la DHAD de S. mutans, porque puede aislarse una especie con un solo centro por dimero. Se ha descubierto que los dímeros de la DHAD de S. mutans que tienen un. solo centro Fe-S tienen el 50 % de actividad de dímeros con dos centros Fe-S/dímero, es decir, la actividad específica de la DHAD de S. mutans con 50 % de un complemento completo de centros Fe-S es 50 unidades/mg. Esto implica que la ausencia de un centro Fe-S en uno de los monómeros de un dimero no influye sobre la actividad del otro monómero en el caso que este contuviera un centro Fe-S.

Con la información obtenida con los procedimientos descritos en el Ejemplo 9 y la información descrita hasta • ahora en este ejemplo, puede determinarse el grado de carga de centros Fe-S en una muestra de DHAD de dos maneras diferentes.

En primer lugar, puede compararse la relación de las cantidades de los tres picos de DHAD para determinar la cantidad relativa que tiene dos centros por dímero, un solo centro por dímero y ningún centro por dímero. Esto da el grado de carga de centros. Por ejemplo, si el área de pico l fuera de la columna PHE fue 25 %, el pico 2 fue 50 % y el pico 3 fue 25 % de la suma de las áreas de pico 1, pico 2 y pico 3, puede calcularse que el porcentaje de los monómeros cargados con centros es de 50 % de conformidad con la siguiente ecuación-. 100* [2 * (área de pico 1) + 1 * (área de pico 2) + 0 * (área de pico 3)]/ [2 * (total del área de picos)] = % de monómeros de la DHAD con centros Fe-S.

En segundo lugar, se puede usar la actividad específica de la DHAD presente para calcular el grado de carga de centros. Se determina la actividad específica al dividir la actividad determinada como se describe en el Ejemplo 7 con la cantidad de proteína DHAD determinada como se describe en el Ejemplo 9. Después, la actividad específica se divide por 100 U/mg para determinar la fracción de monómeros cargada con centros. Esta fracción se multiplica por 100 para determinar el porcentaje de monómeros de la DHAD con centros Fe-S.

Por ejemplo, si se comprueba que la actividad específica es de 50 U/mg, la fracción cargada con centros es 0.5, y el porcentaje de monomeros de la DHAD con centros Fe-S es 50 %.

Para realizar este cálculo, la actividad específica debe tomar como base la concentración de la proteína DHAD en el extracto crudo (no la proteína total) . La determinación de la concentración de la DHAD de S. mutans en presencia de otras proteínas puede lograrse al usar los métodos descritos en el Ejemplo 9.

Ejemplo 11. Actividades especificas y fracción inferida de las proteínas cargadas en la DHAD.

Para determinar la fracción de monomeros . de la DHAD cargada con centros Fe-S en varias cepas de levaduras cultivadas en condiciones diferentes, se usaron los métodos descritos anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla 15.

Tabla 15. Actividades específicas y fracción inferida de las proteínas cargadas en la DHAD.

Estos resultados indican que, en estas condiciones de cultivo, el nivel de carga de centros Fe-S en la DHAD en cepas que no tienen los genes FRA2 y GRX3 es mayor que en cepas que contienen copias funcionales de estos genes. Así, una fracción más alta de la proteína DHAD está en la forma activa en las cepas con deleciones,. porque el contenido de los centros Fe-S (que se requieren para actividad) es mayor. Ejemplo 12. Construcción de las cepas PNY1505, PNY1541, y PNY1542 de Saccharomyces cerevisiae.

El propósito de este ejemplo fue construir las cepas PNY1505, PNY1541 y PNY1542 de Saccharomyces cerevisiae. Estas cepas se derivaron de PNY1503 (BP1064) . PNY1503 se derivó de CEN.PK 113-7D (CBS 8340; Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversiry Centre, Países Bajos) . La construcción de PNY1503 (BP1064) se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 61/368,436, incorporada en la presente descripción como referencia, y en el Ejemplo 13 a continuación. PNY1505 contiene una supreción del gen FRA2. PNY1541 y PNY1542 contienen una integración del gen AFT1 con la mutación L99A (AFT1-L99A) en el sitio YPRCA15.

Las deleciones/integraciones se crearon por recombinación homologa con fragmentos de PCR que contenían regiones de homología corriente arriba y corriente abajo del gen objetivo y el gen URA3 para selección de transformantes. El gen URA3 se eliminó por recombinación homologa para crear una supreción/integración sin marcas.

El procedimiento de supreción/integración sin marcas se adaptó de Akada et al., Yeast, 23 (5) : 399-405 (2006). El cásete de PCR para cada supreción/integración se preparó al combinar cuatro fragmentos, A-B-U-C, ya sea por PCR de traslapamiento o por clonación de los fragmentos individuales, y el gen por integrarse, en un plásmido antes de amplificar todo el cásete por PCR para el procedimiento de supreción/integración. El cásete de PCR contenía un marcador seleccionable/contraseleccionable, URA3 (Fragmento U) , que consistía en el gen nativo CEN.PK 113-7D URA3 , junto con las regiones promotora (250 pb corriente arriba del gen URA3 ) y terminadora (150 pb corriente abajo del gen URA3) . Los fragmentos A (de 150 pb a 500 pb de longitud) y C (250 pb de longitud) correspondieron a la secuencia inmediatamente corriente arriba del gen objetivo (Fragmento A) y la secuencia 3' del gen objetivo (Fragmento C) . Los fragmentos A y C se usaron para integración del cásete en el cromosoma por recombinación homologa. El Fragmento B (500 pb de longitud) correspondió a los 500 pb inmediatamente corriente abajo del gen objetivo y se usó para escisión del marcador URA3 y el Fragmento C del cromosoma por recombinación homologa, ya que una repetición directa de la secuencia correspondiente al Fragmento B se creó después de la integración del cásete en el cromosoma.

Al usar el cásete ABUC producto de la PCR, el marcador URA3 se integró primero en el cromosoma y, después, se extrajo del cromosoma por recombinación homologa. La integración inicial suprimió el gen y excluyó la secuencia 31. Después de la escisión, se suprimió, además, la región 3' del gen. Para la integración de genes con este método, el gen para integrarse se incluyó en el cásete entre los fragmentos A y B. Supreción de FRA2.

La supreción de FRA2 (descrita, además, en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 61/380,563, incorporada en la presente descripción como referencia) se diseñó para suprimir 250 nucleótidos del extremo 3' de la secuencia codificante y dejar intactos los primeros 113 nucleótidos de la secuencia codificante de FRA2. Un codón de terminación en el marco estuvo presente 7 nucleótidos corriente abajo de la supreción. Los cuatro fragmentos del cásete de PCR para la supreción sin marcas de FRA2 se amplificaron al usar la mezcla para PCR de alta fidelidad "Phusion High Fidelity PCR Master Mix" (New England BioLabs; Ipswich, MA) y el ADN genómico de CEN.PK 113-7D como plantilla, preparado con un conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen; Valencia, CA) . El Fragmento A de FRA2 se amplificó con el cebador oBP594 (sec. con núm. de ident.: 961) y el cebador OBP595 (sec. con núm. de ident.: 962), que contenía una cola en 5 ' con homología con el extremo 5 ' del Fragmento B de FRA2. El Fragmento B de FRA2 se amplificó con el cebador OBP596 (sec. con núm. de ident.: 963), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 3' del Fragmento A de FRA2, y el cebador oBP597 (sec. con núm. de ident.: 964), que contenía una cola en 51 con homología con el extremo 51 del Fragmento U de FRA2. El Fragmento U de FRA2 se amplificó con el cebador oBP598 (sec. con núm. de ident.: 965), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 3' del Fragmento B de FRA2, y el cebador ???599 (sec. con núm. de ident.: 966), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 5' del Fragmento C de FRA2. El Fragmento C de FRA2 se amplificó con el cebador 0BP6OO (sec. con núm. de ident.: 967), que contenía una cola en 5 ' con homología con el extremo 31 del Fragmento U de FRA2 , y el cebador 0BP6OI (sec. con núm. de ident.: 968). Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) . El Fragmento AB de FRA2 se creó por PCR de traslapamiento al mezclar el Fragmento A de FRA2 con el Fragmento B de FRA2 y amplificar con los cebadores OBP594 (sec. con núm. de ident.: 961) y OBP597 (sec. con núm. de ident.: 964). El Fragmento UC de FRA2 se creó por PCR de traslapamiento al mezclar el Fragmento U de FRA2 con el Fragmento C de FRA2 y amplificar con los cebadores ???598 (sec. con núm. de ident.: 965) y 0BP6OI (sec. con núm. de ident.: 968). Los productos resultantes de la PCR se purificaron sobre un gel de agarosa y, después, se usó un conjunto de reactivos para extracción en gel (Qiagen) . El, cásete ABUC de FRA2 se creó por PCR de traslapamiento al mezclar el Fragmento AB de FRA2 con el Fragmento UC de FRA2 y amplificar con los cebadores OBP594 (sec. con núm. de ident.: 961) y 0BP6OI (sec. con núm. de ident. : 968) . El producto de la PCR se purificó con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) .

Se prepararon células competentes de PNY1503 y se transformaron con el cásete ABUC preparado por PCR con FRA2 al usar el conjunto de reactivos para transformación de levaduras wFrozen-EZ Yeast Transíormation II" (Zymo Research; Orange, CA) . Las mezclas de transformación se cultivaron en placas en medios sintéticos completos sin uracilo suplementados con 1 % de etanol a 30 °C. Los transformantes con una inactivación génica en fra.2 se seleccionaron por PCR con los cebadores OBP602 (sec. con núm. de ident . : 969) y OBP603 (sec. con núm. de ident, : 970) al usar el ADN genómico preparado con el conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen) . Un transformante correcto se cultivó en YPE (extracto de levadura, peptona, 1 % de etanol) y se colocó en placas sobre medio sintético completo suplementado con 1 % de etanol y que contenía ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador URA3. La supreción y eliminación del marcador se confirmaron por PCR con los cebadores oBP602 (sec. con núm. de ident. : 969) y OBP603 (sec. con núm. de ident. : 970) al usar el ADN genómico preparado con un conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen) . La ausencia del gen FRA2 del aislado se demostró con un resultado negativo de PCR al usar cebadores específicos para la secuencia codificante suprimida de FRA2, ???605 ,(sec. con núm. de ident..- 971) y 0BP6O6 (sec. con núm. de ident.: 972) . El aislado correcto se seleccionó como cepa CEN.PK 113-7D MATa ura3A::loxP his3A pdc6A pdclA : : P [ PDC1 ] -DHAD | ilvD_Sm-PDClt pdc5A: : P [PDC5] -ADH| sadB_Ax-PDC5t gpd2A::loxP fra2A y se designó PNY1505 (BP1135) .

Tabla 16. Cebadores usados en la supreción de FRA2 Supreción de YPRCA15 e integración de AFT1-L99A Se suprimió el sitio de YPRCA15 y se reemplazó con AFT1-L99A junto con las regiones nativas del promotor (800 pb) y del terminador (800 pb) de AFT1. El cásete para la supreción sin marcas de YPRCA15 - integración de AFT1L99A se clonó primero en el plásmido pUC19-URA3MCS (descrito en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 61/356,379, incorporada en la presente descripción como referencia) . El vector toma como base el pUC19 y contiene 'la secuencia del gen URA3 de S. cerevisiae CEN.PK 113-7D situada dentro de un sitio de clonación múltiple (MCS, por sus siglas en inglés) . El pUC19 (American Type Culture Collection, Manassas, VA; ATCC núm. 37254) contiene el replicón pMBl y un gen que codifica para beta-lactamasa para replicación y selección en Escherichia coli. Adicionalmente a la secuencia codificante para URA3, las secuencias corriente arriba (250 pb) y corriente abajo (150 pb) de este gen están presentes para expresión del gen URA3 en levaduras. El vector puede usarse para los fines de clonación y, además, como vector de integración en levaduras .

El ADN que abarca la región codificante de URA3 junto con 250 pb corriente arriba y 150 pb corriente abajo de la región codificante de URA3 del ADN genómico de Saccaro yces cerevisiae CEN.PK 113 -7D (CBS 8340; Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre, Países Bajos) se amplificó con los cebadores ???438 (sec. con núm. de ident . : 1033), que contiene los sitios de restricción Ba HI, AscI, Pmel y Fsel, y ???439 (sec. con núm. de ident.: 1034), que contiene los sitios de restricción Xbal, Pací y IVotl . El ADN genómico se preparó con el conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen) . El producto de la PCR y el pUC19 se ligaron con T4 ADN ligasa después de digerirse con BamHI y Xjal para crear el vector pUCl9-URA3MCS. El vector se confirmó por PCR y secuenciación con los cebadores OBP264 (sec. con núm. de ident. :1031) y ???265 (sec. con núm. de ident.: 1032) .

El Fragmento A de YPRCA15 se amplificó a partir del ADN genómico, preparado como se mencionó anteriormente, con el cebador OBP622 (sec. con núm. de ident.: 973), que contenía un sitio de restricción pnl, y el cebador oBP623 (sec. con núm. de ident.: 974), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 5' del Fragmento B de YPRCA15. El Fragmento B de YPRCA15 se amplificó a partir del ADN genómico con el cebador oBP624 (sec. con núm. de ident. : 975) , que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 3' del Fragmento A de YPRCA15, y el cebador oBP625 (sec. con núm. de ident.: 976) , que contenía un sitio de restricción Fsel. Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) . YPRCA15, Fragmento A - YPRCA15, Fragmento B se creó por PCR de traslapamiento al mezclar los productos de la PCR YPRCA15, Fragmento A, con YPRCA15, Fragmento B, y amplificar con los cebadores oBP622 (sec. con núm. de ident.: 973) y ???625 (sec. con núm. de ident . : 976) . El producto resultante de la PCR se digirió con Kpnl y Fsel y se ligó con T4 ADN ligasa en los sitios correspondientes de pUC19-URA3MCS después de la digestión con las enzimas apropiadas. El Fragmento C de YPRCA15 se amplificó a partir del ADN genómico con el cebador oBP626 (sec. con núm. de ident.: 977), que contenía un sitio de restricción Notl, y el cebador ???627 (sec. con núm. de ident.: 978), que contenía un sitio de restricción Pací. El producto de la PCR YPRCA15, Fragmento C, se digirió con Notl y Pací y se ligó con T4 ADN ligasa en los sitios correspondientes del plásmido que contenía los Fragmentos AB de YPRCA15. AFT1-L99A, junto con las regiones nativas del promotor (800 pb) y del terminador (800 pb) de AFT1, se amplificó al usar pRS411 -AFT1 (L99A) (descrito anteriormente en el Ejemplo 4) como plantilla con el cebador oBP744 (sec. con núm. de ident. : 979) , que contenía un sitio de restricción AscI, y el cebador oBP745 (sec. con núm. de ident.: 980), que contenía un sitio de restricción Pmel . El producto de la PCR se digirió con AscI y Pmel y se ligó con T4 ADN ligasa en los sitios correspondientes del plásmido que contenía los Fragmentos ABC de YPRCA15. Todo el cásete de integración se amplificó a partir del plásmido resultante con los cebadores OBP622 (sec. con núm. de ident.: 973) y OBP627 (sec. con núm. de ident . : 978) .

Se prepararon células competentes de PNY1503 y se transformaron con el cásete producto de la PCR con la supreción de YPRCAl5/integración de AFT1-L99A al usar un conjunto de reactivos para transformación de levaduras "Frozen-EZ Yeast Transformation II" (Zymo. Research). Las mezclas de transformación se cultivaron en placas sobre medios sintéticos completos sin uracilo suplementados con 1 % de etanol a 30 °C. Los transformantes se cultivaron en YPE (1 % de etanol) y se colocaron en placas sobre medio sintético completo suplementado con EtOH al 1 % y que contenía ácido 5 - fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador URA3. La supreción de YPRCA15 y la integración de AFT1L99A se confirmaron por PCR con los cebadores externos ???636 (sec. con núm. de ident.: 981) y oBP637 (sec. con núm. de ident.: 982), y con el cebador específico para AFT1-L99A, HY840 (sec. con núm. de ident.: 983), y el cebador externo oBP637 (sec. con núm. de ident.: 982) al. usar el ADN genómico preparado con el conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen) y por PCR de colonias. Los aislados independientes correctos de CEN.PK 113-7D MATa ura3A::loxP his3A pdc6A pdclA : : P [ PDC1 ] -DHADIilvD_Sm-PDClt pdc5A: : P [PDC5] -ADH | sadB_Ax-PDCSt gpd2A::loxP yprcA15A : : AFT1L99A se designaron como cepas PNY1541 y PNY1542.

Tabla 17. Cebadores usados en la supreción de YPRCA15 e integración de AFT1-L99A Ejemplo 13. Construcción de la cepa BP1064 (PNY1503) de Saccharomyces cerevisiae .

La cepa BP1064 se derivó de CEN.PK 113-7D (CBS 8340; Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre, Países Bajos) y contiene deleciones de los siguientes genes: URA3 , HIS3, PDCl, PDC5 , PDC6 y GPD2.

Las deleciones ; que eliminaron completamente toda la secuencia codificante, se crearon por recombinación homologa con fragmentos de PCR que contenían regiones de homología corriente arriba y corriente abajo del gen objetivo y un marcador de resistencia G418 o el gen URA3 para la selección de transformantes. El marcador de resistencia G418, flanqueado por sitios loxP, se eliminó con recombinasa Cre. El gen URA3 se eliminó por recombinación homologa para crear una supreción sin marcas o, en el caso de estar flanqueado por sitios loxP, se eliminó con recombinasa Cre! El procedimiento de supreción sin marcas se adaptó de Akada et al. 2006 Yeast v23 pág. 399. Generalmente, el cásete de PCR para cada supreción sin marcas se preparó al combinar cuatro fragmentos, A-B-U-C, por PCR de. traslapamiento . El cásete de la PCR contenía un marcador seleccionable/contraseleccionable, URA3 (Fragmento U) , que consistía en el gen nativo CEN.PK 113-7D URA3 , junto con el promotor (250 pb corriente arriba del gen URA3) y terminador (150 pb corriente abajo del gen URA3) . Los Fragmentos A y C, de 500 pb de longitud cada uno, correspondieron a los 500 pb inmediatamente corriente arriba del gen objetivo (Fragmento A) y los 500 pb de 3' del gen objetivo (Fragmento C) . Los fragmentos A y C se usaron para integración del cásete en el cromosoma por recombinación homologa. El Fragmento B (500 pb de longitud) correspondió a los 500 pb inmediatamente corriente abajo del gen objetivo y se usó para la extracción del marcador URA3 y el Fragmento C del cromosona por recombinación homologa, ya que una repetición directa de la secuencia correspondiente al Fragmento B se creó después de la integración del cásete en el cromosoma. Al usar el cásete ABUC producto de la PCR, el marcador URA3 se integró primero en el cromosoma y, después, se extrajo del cromosoma por recombinación homóloga. La integración inicial suprimió el gen y excluyó los 500 pb de 3'. Después de la escisión, se suprimió, además, la región 3' de 500 pb del gen. Para integrar genes con este método, el gen por integrarse se incluyó en el cásete de. la PCR entre los Fragmentos A y B. Supreción de URA3 Para suprimir la región codificante del gen endógeno URA3, un cásete ura3 : :loxP-kanMX-loxP se amplificó por PCR a partir de la plantilla de ADN pLA54 (sec. con núm. de ident.: 986) . El pLA54 contiene el promotor TEF1 de K. lactis y el marcador kanMX, y está flanqueado por sitios loxP para permitir la recombinación con recombinasa Cre y la eliminación del marcador. Se realizó la PCR con ADN polimerasa Phusion y los cebadores BK505 y BK506 (sec. con núms. de ident.: 987 y 988, respectivamente). La porción de URA3 de cada cebador se derivó de la región 5' corriente arriba del promotor de URA3 y la región 3' corriente abajo de la región codificante para que la integración del marcador loxP-kanMX-loxP produjera el reemplazo de la región codificante de URA3. El producto de la PCR se transformó en CEN.PK 113 -7D mediante el uso de técnicas genéticas estándar {Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202) , y los transformantes se seleccionaron sobre YPD que contenía G418 -(100 µ?/p??) a 30 °C. Se seleccionaron transformantes para verificar la integración correcta por PCR al usar los cebadores LA468 y LA492 (sec. con núms . de ident . : 989 y 990, respectivamente), y se designó CEN.PK 113-7D Aura3: : kanMX.

Supreción de HIS3 Los cuatro fragmentos del cásete de la PCR para la supreción sin marcas de HIS3 se amplificaron con la mezcla para PCR de alta fidelidad "Phusion High Fidelity PCR Master Mix" (New England BioLabs; Ipswich, MA) y el ADN genómico de CEN.PK 113-7D como plantilla, preparado con un conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen; Valencia, CA) . El Fragmento A de HIS3 se amplificó con el cebador ???452 (sec. con núm. de ident.: 991) y el cebador ???453 (sec. con núm. de ident.: 992), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 5' del Fragmento B de HIS3. El Fragmento B de HIS3 se amplificó con el cebador ???454 (sec. con núm. de ident.: 993), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 3' del Fragmento A de HIS3, y el cebador ???455 (sec. con núm. de ident . : 994), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 5' del Fragmento U de HIS3. El Fragmento U de HIS3 se amplificó con el cebador ???456 (sec. con núm. de ident.: 995), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 3' del Fragmento B de HIS3, y el cebador ???457 (sec. con núm. de ident..- 996), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 5' del Fragmento C de HIS3. El Fragmento C de HIS3 se amplificó con el cebador OBP458 (sec. con núm. de ident.: 997), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 3' del Fragmento U de HIS3, y el cebador oBP459 (sec. con núm. de ident.: 998). Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) . El Fragmento AB de HIS3 se creó por PCR de traslapamiento al mezclar el Fragmento A de HIS3 y el Fragmento B de HIS3 y amplificar con los cebadores OBP452 (sec. con núm. de ident.: 991) y ???455 (sec. con núm. de ident.: 994). El Fragmento UC de HIS3 se creó por PCR de traslapamiento al mezclar el Fragmento U de HIS3 con el Fragmento C de HIS3 y amplificar con los cebadores oBP456 (sec. con núm. de ident.: 995) y OBP459 (sec. con núm. de ident.: 998). Los productos resultantes de la PCR se purificaron sobre un gel de agarosa y, después, se usó un conjunto de reactivos para extracción en gel (Qiagen) . El cásete ABUC con HIS3 se creó por PCR de traslapamiento al mezclar el Fragmento AB de HIS3 con el Fragmento UC de HIS3 y amplificar con los cebadores ???452 (sec. con núm. de ident . : 991) y OBP459 (sec. con núm. de ident.: 998). El producto de la PCR se purificó con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) .

Se prepararon células competentes de CEN.PK 113 -7D Aura3 : : kanMX y se transformaron con el cásete de PCR ABUC con HIS3 al usar un conjunto de reactivos para transformación de levaduras "Frozen-EZ Yeast Transformation II" (Zyrao Research; Orange, CA) . Las mezclas para la transformación se cultivaron en placas sobre medios sintéticos completos sin uracilo suplementados con 2 % de glucosa a 30 °C. Los transformantes con una inactivación génica de his3 se seleccionaron por PCR con los cebadores OBP460 (sec. con núm. de ident.: 999) y oBP461 (sec. con núm. de ident.: 1000) al usar ADN genómico preparado con el conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen) . Se seleccionó un transformante correcto como cepa CEN.PK 113-7D Aura3 :: kanMX Ahis3 : : URA3.

Eliminación del marcador KanMX del sitio Aura3 y eliminación del marcador URA3 del sitio Ahis3 Se eliminó el marcador KanMX al transformar CEN.PK 113-7D Aura3:: kanMX ñhis3::URA3 con pRS423 : : PGALl-cre (sec. con núm. de ident.: 1011, descrito en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 61/290,639) con el conjunto de reactivos para transformación de levaduras "Frozen-EZ Yeast Transformation II" (Zymo Research) y el cultivo en placas sobre medios sintéticos completos sin histidina ni uracilo suplementados con 2 % de glucosa a 30 °C. Los transformantes se cultivaron en YP suplementado con 1 % de galactosa a 30 °C por ~6 horas para inducir la recombinasa Cre y la escisión del marcador KanMX y se cultivaron en placas sobre YPD (2 % de glucosa) a 30 °C para recuperación. Se cultivó un aislado durante toda la noche en YPD y se colocó en placas sobre medio sintético completo que contenía ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador URA3. Los aislados resistentes al 5-FOA se cultivaron y colocaron en placas sobre YPD para eliminar el plásmido pRS423 : :PGMjl-cre. Se verificaron los aislados para determinar la pérdida del marcador KanMX, el marcador URA3 y el plásmido pRS423 :: PQALI- re al evaluar el crecimiento sobre placas con YPD+G418, placas con medio sintético completo sin uracilo y placas con medio sintético completo sin histidina. Un aislado correcto sensible al G418 y auxotrófico para uracilo e histidina se seleccionó como cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 y se designó BP857. Las deleciones y la eliminación del marcador se confirmaron por PCR y secuenciación con los cebadores OBP450 (sec. con núm. de ident.: 1001) y OBP451 (sec. con núm. de ident. : 1002) para Aura3 y los cebadores ???460 (sec. con núm. de ident.: 999) y OBP461 (sec. con núm. de ident.: 1000) para Ahis3 al usar el ADN genómico preparado con un conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen) .

Supreción de PDC6 Los cuatro fragmentos del cásete de PCR para la supreción sin marcas de PDC6 se amplificaron al usar la mezcla para PCR de alta fidelidad "Phusion High Fidelity PCR Master Mix" (New England BioLabs) y el ADN genómico CEN.PK 113-7D como plantilla, preparado con un conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen) . El Fragmento A de PDC6 se amplificó con el cebador oBP440 (sec. con núm. de ident . : 1003) y el cebador OBP441 (sec. con núm. de ident.: 1004), que contenía una cola 5' con homología con el extremo 5' del Fragmento B de PDC6. El Fragmento B de PDC6 se amplificó con el cebador OBP442 (sec. con núm. de ident.: 1005), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 3' del Fragmento A de PDC6, y el cebador OBP443 (sec. con núm. de ident.: 1006), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 5' del Fragmento U de PDC6. El Fragmento U de PDC6 se amplificó con el cebador OBP444 (sec. con núm. de ident.: 1007), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 3' del Fragmento B de PDC6, y el cebador OBP445 (sec. con núm. de ident.: 1008), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 5' del Fragmento C de PDC6. El Fragmento C de PDC6 se amplificó con el cebador OBP446 (sec. con núm. de ident. : 1009), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 3' del Fragmento U de PDC6, y el cebador oBP447 (sec. con núm. de ident.: 1010) . Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) . El Fragmento AB de PDC6 se creó por PCR de traslapamiento al mezclar el Fragmento A de PDC6 con el Fragmento B de PDC6 y amplificar con los cebadores OBP440 (sec. con núm. de ident.: 1003) y OBP443 (sec. con núm. de ident.: 1006). El Fragmento UC de PDC6 se creó por PCR de traslapamiento al mezclar el Fragmento U de PDC6 con el Fragmento C de PDC6 y amplificar con los cebadores ???444 (sec. con núm. de ident.: 1007) y OBP447 (sec. con núm. de ident.: 1010). Los productos resultantes de la PCR se purificaron sobre un gel de agarosa y, después, se usó un conjunto de reactivos para extracción en gel (Qiagen) , El cásete ABUC con PDC6 se creó por PCR de traslapamiento al mezclar el Fragmento AB de PDC6 con el Fragmento UC de PDC6 y amplificar con los cebadores OBP440 (sec. con núm. de ident.: 1003) y OBP447 (sec. con núm. de ident.: 1010). El producto de la PCR se purificó con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) .

Se prepararon células competentes de CEN.PK 113 -7D Aura3 : : loxP Ahis3 y se transformaron con el cásete ABUC con PDC6 preparado por PCR al usar el conjunto de reactivos para transformación de levaduras "Frozen-EZ Yeast Transformation II" (Zymo Research) . Las mezclas para la transformación se cultivaron en placas sobre medios sintéticos completos sin uracilo suplementados con 2 % de glucosa a 30 °C. Los transformantes con una inactivación génica en pdc6 se seleccionaron por PCR con los cebadores OBP448 (sec. con núm. de ident . : 1012) y oBP449 (sec. con núm. de ident.: 1013) al usar el ADN genómico preparado con el conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen) . Se seleccionó un transformante correcto como cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6::URA3.

La cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6::URA3 se cultivó durante toda la noche en YPD y se colocó en placas sobre medio sintético completo que contenía ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador URA3. La supreción y la eliminación del marcador se confirmó por PCR y secuenciación con los cebadores OBP448 (sec. con núm. de ident.: 1012) y OBP449 (sec. con núm. de ident.: 1013) al usar el ADN genómico reparado con el conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen) . La ausencia del gen PDC6 del aislado se demostró con un resultado negativo de la PCR al usar cebadores específicos para la secuencia codificante de PDC6 , oBP554 (sec. con núm. de ident.: 1014) y OBP555 (sec. con núm. de ident.: 1015) . El aislado correcto se seleccionó como cepa CEN.PK 113 -7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 y se designó BP891.

Supreción de PDCl e integración de ilvDSm Se suprimió el gen PDCl y se reemplazó con la región codificante de ilvD de Streptococcus mutans ATCC núm. 700610. El Fragmento A seguido de la región codificante de ilvD de Streptococcus mutans del cásete de PCR para la supreción de PDCl- integración de ilvDSm se amplificó con la mezcla para PCR de alta fidelidad "Phusion High Fidelity PCR Master Mix" (New England BioLabs) y el ADN genómico NYLA83 (descrito en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 61/246709) como plantilla, preparado con un conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen) . El Fragmento A de PDCl-ilvDSm (sec. con núm. de ident . : 1053) se amplificó con el cebador OBP513 (sec. con núm. de ident.: 1016) y el cebador OBP515 (sec. con núm. de ident.: 1017), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 5' del Fragmento B de PDCl. Los fragmentos B, U y C del cásete de PCR para la supreción de PDCl-integración de ilvDSm se amplificaron con la mezcla para PCR de alta fidelidad "Phusion High Fidelity PCR Master Mix" (New England BioLabs) y el ADN genómico CEN.PK 113 -7D como plantilla, preparado con el conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen) . El Fragmento B de PDCl se amplificó con el cebador OBP516 (sec. con núm. de ident.: 1018) que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 3' del Fragmento A de PDCl-ilvDSm, y el cebador OBP517 (sec. con núm. de ident.: 1019), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 5' del Fragmento U de PDCl. El Fragmento U de PDCl se amplificó con el cebador OBP518 (sec. con núm. de ident.: 1020), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 3' del Fragmento B de PDCl, y el cebador OBP519 (sec. con núm. de ident.: 1021) , que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 5' del Fragmento C de PDCl. El Fragmento C de PDCl se amplificó con el cebador OBP520 (sec. con núm. de ident.: 1022) , que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 3' del Fragmento U de PDCl, y el cebador oBP521 (sec. con núm. de ident. : 1023) . Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) . El Fragmento A de PDCl-ilvDSm-B se creó por PCR de traslapamiento al mezclar el Fragmento A de PDC1-ilvDSm y el Fragmento B de PDCl y amplificar con los cebadores OBP513 (sec. con núm. de ident.: 1016) y oBP517 (sec. con núm. de ident.: 1019). El Fragmento UC de PDCl se creó por PCR de traslapamiento al mezclar el Fragmento U de PDCl y el Fragmento C de PDCl y amplificar con los cebadores OBP518 (sec. con núm. de ident.: 1020) y OBP521 (sec. con núm. de ident.: 1023) . Los productos resultantes de la PCR se purificaron sobre un gel de agarosa y, después, se usó un conjunto de reactivos para extracción en gel (Qiagen) . El cásete PDC1 A-ilvDSm-BUC (sec. con núm. de ident . : 1054) se creó por PCR de traslapamiento al mezclar el Fragmento A-ilvDSm-B de PDC1 y el Fragmento UC de PDC1 y amplificar con los cebadores OBP513 (sec. con núm. de ident.: 1016) y OBP521 (sec. con núm. de ident.: 1023). El producto de la PCR se purificó con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) .

Se prepararon células competentes de CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 y se transformaron con el cásete PDC1 A-ilvDSm-BUC preparado por PCR al usar el conjunto de reactivos para transformación de levaduras "Frozen-EZ Yeast Transformation II" (Zymo Research) . Las mezclas para la transformación se cultivaron en placas sobre medios sintéticos completos sin uracilo suplementados con 2 % de glucosa a 30 °C. Los transformantes con una inactivación génica en pdcl e integración de ilvDSm se seleccionaron por PCR con los cebadores oBP511 (sec. con núm. de ident.: 1024) y oBP512 (sec. con núm. de ident.: 1025) al usar el ADN genómico preparado con un conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen) . La ausencia del gen PDC1 del aislado se demostró con un resultado negativo de la PCR al usar cebadores específicos para la secuencia codificante de PDC1, oBP550 (sec. con núm. de ident.: 1026) y oBP551 (sec. con núm. de ident.: 1027). Se seleccionó un transformante correcto como cepa CEN.PK 113 -7D ñura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm-URA3.

La cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm-URA3 se cultivó durante toda la noche en YPD y se colocó en placas sobre medio sintético completo que contenía ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador URA3. La supreción de PDC1, la integración de ilvDSm y la eliminación del marcador se confirmaron por PCR y secuenciacion con cebadores oBP511 (sec. con núm. de ident.: 1024) y oBP512 (sec. con núm. de ident.: 1025) al usar el ADN genómico preparado con un conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen) . El aislado correcto se seleccionó como cepa CEN.PK 113 -7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm y se designó BP907.

Supreción de PDC5 e integración de sadB Se suprimió el gen PDC5 y se reemplazó con la región codificante de sadB de Achromobacter xylosoxidans . Un segmento del cásete de PCR para la supreción de PDC5-integración de sadB se clonó primero en el plásmido pUC19-URA3MCS .

El pUC19-URA3MCS toma como base pUC19 y contiene la secuencia del gen URA3 de Saccaromyces cerevisiae situado dentro de un sitio de clonación múltiple (MCS) . El pUC19 contiene el replicón pMBl y un gen que codifica para beta-lactamasa para replicación y selección en Escherichia coli. Adicionalmente a la secuencia codificante para URA3 , las secuencias corriente arriba y corriente abajo de este gen se incluyeron para expresión del gen URA3 en levadura. El vector puede usarse para los fines de clonación y, además, como vector de integración en levaduras .

El ADN que abarca la región codificante de URA3 junto con los 250 pb corriente arriba y 150 pb corriente abajo de la región codificante de URA3 del ADN genómico CEN.PK 113-7D de Saccaromyces cerevisíae se amplificó con los cebadores oBP438 (sec. con núm. de ident . : 1033), que contenía los sitios de restricción BamHI, AscI, Pmel y Fsel, y OBP439 (sec. con núm. de ident.: 1034), que contenía los sitios de restricción Xbal, Pací y Notl, al usar la mezcla para PCR de alta fidelidad "Phusion High-Fidelity PCR Master Mix" (New England BioLabs) . El ADN genómico se preparó con el conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen) . El producto de la PCR y pUC19 (sec. con núm. de ident.: 1056) se ligaron con T4 ADN ligasa después de la digestión con BamHI y Xbal para crear el vector pUC19-URA3MCS . El vector se confirmó por PCR y secuenciación con cebadores OBP264 (sec. con núm. de ident.: 1031) y OBP265 (sec. con núm. de ident.: 1032).

La secuencia codificante de sadB y el Fragmento B de PDC5 se clonaron en pUC19-URA3MCS para crear la porción sadB-BU del cásete PDC5 A-sadB-BUC creado por PCR. La secuencia codificante de sadB se amplificó al usar pLH468-sadB (sec. con núm. de ident.: 1051) como plantilla con el cebador OBP530 (sec. con núm. de ident.: 1035), que contenía un sitio de restricción AscI y el cebador OBP531 (sec. con núm. de ident.: 1036) , que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 5' del Fragmento B de PDC5. El Fragmento B de PDC5 se amplificó con el cebador OBP532 (sec. con núm. de ident. : 1037) , que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 3' de sadB, y el cebador oBP533 (sec. con núm. de ident.: 1038), que contenía un sitio de restricción Pmel. Los productos de PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) . SadB-Fragmento B de PDC5 se creó por PCR de traslapamiento al mezclar los productos de PCR sadB y Fragmento B de PDC5 y se amplificó con los cebadores OBP530 (sec. con núm. de ident.: 1035) y oBP533 (sec. con núm. de ident.: 1038). El producto resultante de la PCR se digirió con AscI y Pmel y se ligó con T4 ADN ligasa en los sitios correspondientes de pUC19-URA3MCS después de la digestión con las enzimas apropiadas. El plásmido resultante se usó como plantilla para amplificación de sadB-Fragmento B-Fragmento U al usar los cebadores oBP536 (sec. con núm. de ident.: 1039) y oBP546 (sec. con núm. de ident.: 1040), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 5' del Fragmento C de PDC5. El Fragmento C de PDC5 se amplificó con el cebador oBP547 (sec. con núm. de ident.: 1041) que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 3' de sadB-Fragmento B-Fragmento U de PDC5 , y el cebador OBP539 (sec. con núm. de ident.: 1042). Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) . SadB-Fragmento B-Fragmento U-Fragmento C de PDC5 se creó por PCR de traslapamiento al mezclar sadB-Fragmento B-Fragmento U de PDC5 y el Fragmento C de PDC5 y amplificar con los cebadores OBP536 (sec. con núm. de ident . : 1039) y OBP539 (sec. con núm. de ident.: 1042). El producto resultante de la PCR se purificó sobre un gel de agarosa y, después, se usó un conjunto de reactivos para extracción en gel (Qiagen) . Se creó el cásete PDC5 A-sadB-BUC (sec. con núm. de ident.: 1055) al amplificar sadB-Fragmento B-Fragmento U-Fragmento C de PDC5 con los cebadores OBP542 (sec. con núm. de ident.: 1043), que contenía una cola en 5' con homología con los 50 nucleótidos inmediatamente corriente arriba de la secuencia codificante nativa de PDC5 , y ???539 (sec. con núm. de ident.: 1042). El producto de la PCR se purificó con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) .

Se prepararon células competentes de CEN.PK 113 -7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm y se transformaron con el cásete PDC5 A-sadB-BUC preparado por PCR al usar el conjunto de reactivos para transformación de levaduras "Frozen-EZ Yeast Transformation II" (Zymo Research) . Las mezclas de transformación se cultivaron en placas sobre medios sintéticos completos sin uracilo suplementados con 1 % de etanol (sin glucosa) a 30 °C. Los transformantes con una inactivación génica en pdc5 e integración de sadB se seleccionaron por PCR con los cebadores OBP540 (sec. con núm. de ident . : 1044) y oBP541 (sec. con núm. de ident.: 1045) al usar el ADN genómico preparado con el conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen) La ausencia del gen PDC5 del aislado se demostró con un resultado negativo de la PCR al usar cebadores específicos para la secuencia codificante de PDC5, OBP552, (sec. con núm. de ident.: 1046) y oBP553 (sec. con núm. de ident.: 1047) . Un transformante correcto se seleccionó como cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5 : : sadB-URA3.

La cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5 : : sadB-URA3 se cultivó durante toda la noche en YPE (1 % de etanol) y se colocó en placas sobre medio sintético completo suplementado con etanol (sin glucosa) y que contenía ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador URA3. La suprecion de PDC5 , la integración de sa.dB y la eliminación del marcador se confirmaron por PCR con los cebadores OBP540 (sec. con núm. de ident.: 1044) y oBP541 (sec. con núm. de ident.: 1045) al usar el ADN genómico preparado con el conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen) El aislado correcto se seleccionó como cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl :: ilvDSm Apdc5::sadB y se designó BP913. 2 Supreción de GPD2 Para suprimir la región codificante del gen endógeno GPD2 , un cásete gpd2 : : loxP-URA3-loxP (sec. con núm. de ident . : 1057) se amplificó por PCR al usar el producto de PCR loxP-URA3-loxP (sec. con núm. de ident.: 1052) como plantilla de ADN. El loxP-URA3-loxP contiene el marcador URA3 (de ATCC núm. 77107) flanqueado por sitios loxP para recombinasa. Se realizó la PCR con ADN polimerasa Phusion y los cebadores LA512 y LA513 (sec. con núms . de ident.: 1029 y 1030, respectivamente) . La porción de GPD2 de cada cebador se derivó de la región 5' corriente arriba de la región codificante de GPD2 y la región 3' corriente abajo de la región codificante para que la integración del marcador loxP-URA3-loxP produjera el reemplazo de la región codificante de GPD2. El producto de la PCR se transformó en BP913, y los transformantes se seleccionaron en medios sintéticos completos sin uracilo suplementados con 1 % de etanol (sin glucosa) . Se seleccionaron transformantes para verificar la integración correcta por PCR al usar los cebadores OBP582 y AA270 (sec. con núms. de ident.: 1048 y 1049, respectivamente).

El marcador URA3 se recicló por transformación con pRS423 :: PGAI,i-ere (sec. con núm. de ident.: 1011) y se cultivó en placas sobre medios sintéticos completos sin histidina suplementados con 1 % de etanol a 30 °C. Los transformantes se sembraron con técnica de estriado en placas sobre medio sintético completo suplementado con 1 % de etanol y que contenía ácido 5- fluoro-orótico (5-FOA) (0.1 %) e incubaron a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador URA3. Los aislados resistentes al 5-FOA se cultivaron en YPE (1 $ de etanol) para eliminar el plásmido pRS423:: PGALI - e e . La supreción y eliminación del marcador se confirmaron por PCR con los cebadores pBP582 (sec. con núm. de ident.: 1048) y OBP591 (sec. con núm. de ident.: 1050). Se seleccionó el aislado correcto como cepa CEN.PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5::sadB Agpd2::loxP, y se designó BP1064.

Ejemplo 14. Experimento de agitación de matraces para determinar la acumulación de 2 , 3 -dihidroxiisovalerato y la producción de isobutanol.

El propósito de este ejemplo fue mostrar el efecto sobre la acumulación del producto intermedio 2,3-dihidroxiisovalerato (DHIV) de la ruta biosintética de isobutanol y mostrar la producción de isobutanol en cepas con genes para isobutanol con una copia integrada del gen AFT1-L99A o una supreción de FRA2 en comparación con la cepa parental. Las cepas se transformaron con los plásmidos de la ruta de isobutanol pYZ090 (sec. con núm. de ident..- 984; que se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 61/368,436, (incorporada en la presente descripción como referencia) y pLH468 (sec. con núm. de ident . : 985 ; que se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 61/246,844, incorporada en la presente descripción como referencia). Además, estos plásmidos se describen, brevemente, a continuación.

El plásmido pYZ090 (sec. con núm. de ident.: 984) se construyó para contener un gen quimérico que tiene la región codificante del gen alsS de Bacillus subtilis (posiciones de nucleótidos (nt) 457-2172) expresado a partir del promotor CUP1 de levadura (nt 2-449) y seguido por el terminador CYC1 (nt 2181-2430) para expresión de ALS, y un gen quimérico que tiene la región codificante del gen ilvC de Lactococcus lactis (nt 3634-4656) expresado a partir del promotor ILV5 de levadura (2433-3626) y seguido por el terminador ILV5 (nt 4682-5304) para expresión de KARI .

El plásmido pLH468 (sec. con núm. de ident.: 985) se construyó para contener: un gen quimérico que tiene la región codificante del gen ilvD de Streptococcus mutans (posiciones de nt 3313-4849) expresado a partir del promotor FBA1 (nt 2109 - 3105) de S. cerevisiae seguido por el terminador FBA1 (nt 4858 - 5857) para expresión de la DHAD; un gen quimérico que tiene la región codificante de la alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo optimizada por codón (nt 6286-7413) expresado a partir del promotor GPM1 (nt 7425-8181) de S. cerevisiae seguido por el terminador ADH1 (nt 5962-6277) para expresión de la ADH; y un gen quimérico que tiene la región codificante del gen kivD optimizado por codón de Lactococcus lactis (nt 9249-10895) expresado a partir del promotor TDH3 (nt 10896-11918) seguido por el terminador TDH3 (nt 8237-9235) para expresión de KivD.

Un transformante de PNY1503 (cepa parental) se designó PNY1504. Un transformante de PNY1505 (cepa con supreción de fra2) se designó PNY1506. Los transformantes de PNY1541 y PNY1542 (cepas de integración de AFT1-L99A) se designaron PNY1543 y PNY1544, para PNY1541, y PNY1545 y PNY1546, para PNY1542.

Las cepas se cultivaron en medio sintético (base nitrogenada para levaduras sin aminoácidos ( Sigma-Aldrich, St. Louis, O) y suplemento de medios sintéticos selectivos para levaduras sin uracilo ni histidina (Clontech, Mountain View, CA) ) suplementado con MES 100 mM, pH de 5.5, 0.2 % de glucosa y 0.2 % de etanol . Los cultivos de toda una noche se cultivaron en 15 mi de medio en matraces Erlenmeyer ventilados de 125 mi a 30 °C, 225 RPM, en un agitador New Brunswick Scientific 124. Se inoculó 18 mi de medio en los matraces Erlenmeyer de 125 mi herméticamente cerrados con el cultivo de toda una noche a una OD60o de 0.5 y se cultivó durante seis horas a 30 °C, 225 RPM, en un agitador New Brunswick Scientific 124. Después de seis horas, se agregó glucosa al 2.5 %, se agregó extracto de levadura a 5 g/1, y se agregó peptona a 10 g/1 (tiempo 0 horas) . Después de 24 y 48 horas, los sobrenadantes del cultivo (recolectados al usar unidades de filtro para tubos de centrífuga Spin-X, Costar cat . núm. 81S9) se analizaron por HPLC (método descrito en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0092957, incorporada en la presente descripción como referencia) y LC/MS (cromatografía líquida/espectrometría de masas, por sus siglas en inglés) . Las concentraciones de glucosa e isobutanol se determinaron por HPLC. Se separó el DHIV y se cuantificó por LC/MS en un sistema AcquityTQD de Waters (Milford, MA) al usar una columna Atlantis T3 (núm. de parte 186003539) . La columna se mantuvo a 30 °C, y la velocidad de flujo fue de 0.5 ml/min. La fase móvil A fue ácido fórmico al 0.1 % en agua, y la fase móvil B fue ácido fórmico al 0.1 % en acetonitrilo . Cada ejecución consistió en 1 min a 99 % de A, un gradiente lineal en 1 minuto para 25 % de B, seguido de 1 min a 99 % de A. Se supervisó el efluente de la columna para picos a m/z=133 (ESI negativo) , con voltaje de cono de 32.5 V, con el detector de espectrometría de masas de ACQ_TQD (s/n QBA688) de Waters. El DHIV emergió, típicamente, a 1.2 min. Se obtuvo la separación de referencia, y se convirtieron las áreas pico para el DHI a concentraciones en µ? del DHIV por referencia a análisis de soluciones estándar preparadas a partir de soluciones madre acuosas de 1 M.

La Tabla 18 muestra el rendimiento molar del DHIV (moles de DHIV por moles de glucosa consumida) y el título de isobutanol de las cepas con AFT1-L99A (PNY1543, PNY1544, PNY1545 y PNY1546) y la cepa con supreción de FRA2 (PNY1506) en comparación con el valor de fondo de la cepa parental (PNY1504) a 24 y 48 horas. La expresión de AFT1 -L99A o la supreción de FRA2 produjeron, ambas, una. disminución de aproximadamente 50 % en la acumulación de DHIV.

Tabla 18. Producción molar de DHIV y título de isobutanol.

Los datos son el promedio de dos matraces independientes, para PNY1504 y PNY1506, y dos transformantes independientes para las cepas con AFT1-L99A (PNY1543-PNY1544 y PNY1545 - PNY1546 ) .

La descripción anterior de las modalidades específicas revela tan integralmente la naturaleza general de la invención que otros, al aplicar el conocimiento dentro de la experiencia en la técnica, podrán modificar y/o adaptar fácilmente estas modalidades específicas para aplicaciones diversas sin experimentación excesiva y sin apartarse del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, estas adaptaciones y modificaciones están previstas para estar dentro del significado y alcance de los equivalentes de las modalidades descritas al tomar como base las enseñanzas y la guía presentadas en la presente descripción. Debe comprenderse que la terminología o el conjunto de expresiones usadas en la presente descripción se usan con fines descriptivos y no limitantes, de manera tal que la terminología o las expresiones usadas en la presente descripción deben ser interpretadas por el técnico experimentado a la luz de estas enseñanzas y guía.

TABLA 12 5 10 15 in LD O Lf) TABLA 12 TABLA 12 TABLA 12 TABLA 12 TABLA 12 5 10 15 TABLA 12 TABLA 12 TABLA 12 TABLA 12 TABLA 12 TABLA 12 o H o TABLA 12 O LD LO H H TABLA 12 TABLA 12 5 10 15 TABLA 12 o ?? i-1 o TABLA 12 10 15 TABLA 12 5 10 15 O in H H TABLA 12 TABLA 12 5 10 15 TABLA 12 TABLA 12 TABLA 12 10 15 5 10 15 TABLA 12 10 15 o 1/1 H TABLA 12 5 10 15 O O LO Lfl H H TABLA 12 TABLA 12 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una célula huésped recombinante caracterizada porque comprende : (a) por lo menos un polinucleótido heterologo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa; y (b) (i) por lo menos una supreción, mutación y/o sustitución en un gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S; y/o (ii) por lo menos un polinucleótido heterologo que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe- S .

2. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos un polinucleótido heterologo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa: (a) comprende un plásmido con un número alto de copias o un plásmido con un número de copias que se puede regular; o (b) se integra al menos una vez en el ADN recombinante de la célula huésped.

3. Una célula huésped recombinante que comprende por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa, caracterizada porque al menos un polinucleótido heterólogo comprende un plásmido con un número alto de copias o un plásmido que tiene un número de copias que se puede regular.

4. Una célula huésped recombinante que comprende por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa, caracterizada porque al menos un polinucleótido heterólogo se integra al menos una vez en el ADN recombinante de la célula huésped.

5. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S está codificado por un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes de las Tablas 8 y 9.

6. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S está codificado por un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes de la Tabla 7.

7. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 5 o 6, caracterizada porque el polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S está codificado por un gen seleccionado del grupo que consiste en AFTl, AFT2, FRA2 , GRX3 , CCC1, y combinaciones de estos.

8. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el polipéptido está codificado por un polinucleótido que es un mutante constitutivo .

9. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 8 , caracterizada porque el mutante constitutivo se selecciona del grupo que consiste en AFTl L99A, AFTl L102A, AFTl C291F, AFTl C293F, y combinaciones de estos.

10. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S es AFTl, AFT2, FRA2, GRX3 o CCC1.

11. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S es AFTl, AFT2, FRA2 o CCC1.

12. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque al menos una supreción, mutación y/o sustitución en un gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S se selecciona del grupo que consiste en FRA2, GRX3, CCC1, y combinaciones de estos.

13. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque al menos un polinucleótido heterólogó que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S se selecciona del grupo que consiste en AFT1, AFT2, y combinaciones de estos.

14. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos un polinucleótido heterólogó que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa se expresa en múltiples copias.

15. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque al menos un polinucleótido heterólogó comprende un plásmido con un número alto de copias o un plásmido que tiene un número de copias que se puede regular.

16. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque al menos un polinucleótido heterólogó se integra al menos una vez en el ADN recombinante de la célula huésped.

17. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1,2, o 5-16, caracterizada porque la biosíntesis de centros Fe-S se incrementa en comparación con una célula huésped recombinante que tiene biosíntesis de centros Fe-S endógenos.

18. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizada porque la célula huésped es una célula de levaduras.

19. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la célula huésped de levaduras se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces, SchizoSaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyvero yces, Yarrowia, Issatchenkia y Pichia.

20. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque el polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa se expresa en el citosol de la célula huésped.

21. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizada porque el polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tiene una secuencia de aminoácidos que coincide con el Perfil HMM de la Tabla 12 con un valor E de < 10-5, en donde el polipéptido comprende, además, las tres cisteínas conservadas correspondientes a las posiciones 56, 129 y 201 en las secuencias de aminoácidos de la enzima DHAD de Streptococcus mutans que corresponde a la sec. con núm. de ident.:168.

22. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizada porque el polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tiene una secuencia de aminoácidos con por lo menos aproximadamente 90 % de identidad con la sec. con núm. de ident.: 168 o sec. con núm. de ident.: 232.

23. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-22, caracterizada porque el polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tiene una actividad específica seleccionada del grupo que consiste en una actividad específica: (a) mayor que aproximadamente 5 veces con respecto a una célula huésped de control que comprende por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa; (b) mayor que aproximadamente 8 veces con respecto a una célula huésped de control que comprende por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa; y (c) mayor que aproximadamente 10 veces con respecto a una célula huésped de control que comprende por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa.

24. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-22, caracterizada porque el polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tiene una actividad específica seleccionada del grupo que consiste en una actividad (a) mayor que aproximadamente 0.25 U/mg; (b) mayor que aproximadamente 0.3 U/mg; (c) mayor que aproximadamente 0.5 U/mg; (d) mayor que aproximadamente 1.0 U/mg; (e) mayor que aproximadamente 1.5 U/mg; (f) mayor que aproximadamente 2.0 U/mg; (g) mayor que aproximadamente 3.0 U/mg; (h) mayor que aproximadamente 4.0 U/mg; (i) mayor que aproximadamente 5.0 U/mg; (j) mayor que aproximadamente 6.0 U/mg; (k) mayor que aproximadamente 7.0 U/mg; (1) mayor que aproximadamente 8.0 U/mg; (m) mayor que aproximadamente 9.0 U/mg; (n) mayor que aproximadamente 10.0 U/mg; (o) mayor que aproximadamente 20.0 U/mg; y (p) mayor que aproximadamente 50.0 U/mg.

25. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, caracterizada porque recombinante produce isobutanol.

26. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque recombinante comprende una ruta biosintética de isobutanol.

27. Un método para fabricar un producto caracterizado porque comprende (a) proporcionar la célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24; (b) poner la célula huésped recombinante de (a) en contacto con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en condiciones en las que se produce el producto; en donde el producto se selecciona del grupo que consiste en aminoácidos de cadena ramificada, ácido pantoténico, 2-metil-l-butanol, 3-metil-l-butanol, isobutanol, y combinaciones de estos.

28. Un método para fabricar isobutanol; caracterizado porque comprende: (a) proporcionar la célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24; (b) poner la célula huésped recombinante de (a) en contacto con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en condiciones en las que se produce isobutanol.

29. Un método para la conversión de 2,3-dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato; caracterizado porque comprende : (a) proporcionar la célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24; y (b) cultivar la célula huésped recombinante de (a) en condiciones en las que el 2 , 3 -dihidroxiisovalerato se convierte a -cetoisovalerato en donde el 2 , 3-dihidroxiisovalerato se convierte a - cetoisovalerato .

30. Un método para incrementar la actividad específica de un polipéptido heterologo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa en una célula huésped recombinante ; caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una célula huésped recombinante de conformidad cualquiera con las reivindicaciones 1-24; y (b) cultivar la célula huésped recombinante de (a) en condiciones mediante las cuales el polipéptido heterologo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa se expresa en una forma funcional que tiene una actividad específica mayor que una célula huésped igual que carece de ese polipéptido heterologo.

31. Un método para incrementar el flujo en una ruta de biosíntesis de centros Fe-S en una célula huésped; caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3- 24; y (b) cultivar la célula huésped recombinante de (a) en condiciones mediante las cuales se incrementa el flujo en la ruta de biosíntesis de centros Fe-S en la célula huésped.

32. Un método para incrementar la actividad de una proteína que requiere centros Fe-S en una célula huésped recombinante ; caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una célula huésped recombinante que comprende una proteína que requiere centros Fe-S; (b) modificar la expresión o la actividad de un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S en la célula huésped; y (c) cultivar la célula huésped recombinante de (b) en condiciones mediante las cuales se incrementa la actividad de la proteína que requiere centros Fe-S.

33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el incremento en actividad se selecciona del grupo que consiste en una cantidad: (a) mayor que aproximadamente 10 %; (b) mayor que aproximadamente 20 %; (c) mayor que aproximadamente 30 %; (d) mayor que aproximadamente 40 o. s / (e) mayor que aproximadamente 50 ; mayor que aproximadamente 60 %; (g) mayor que aproximadamente 70 %; (h) mayor que aproximadamente 80 %; (i) mayor que aproximadamente 90 %; Y (j) mayor que aproximadamente 95 %.

34. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el incremento en actividad se selecciona del grupo que consiste en una cantidad: (a) mayor que aproximadamente 5 veces; (b) mayor que aproximadamente 8 veces; y (c) mayor que aproximadamente 10 veces.

35. Un método para identificar polipéptidos que incrementan el flujo en una ruta de biosíntesis de centros Fe-S en una célula huésped; caracterizado porque comprende: (a) modificar la expresión o la actividad de un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S; (b) determinar la actividad de una proteína heteróloga que requiere centros Fe-S; y (c) comparar la actividad de la proteína heteróloga que requiere centros Fe-S determinada en presencia de la modificación en la expresión o la actividad de un polipéptido de la etapa (a) con respecto a la actividad de una proteína heteróloga que requiere centros Fe-S determinada en ausencia de la modificación en la expresión o la actividad de un polipéptido de la etapa (a) , en donde un incremento en la actividad de la proteína heteróloga que requiere centros Fe-S indica un incremento en el flujo de la ruta de biosíntesis de centros Fe-S.

36. Un método para identificar polipéptidos que incrementan el flujo en una ruta de biosíntesis de centros Fe-S en una célula huésped; caracterizado porque comprende: (a) modificar la expresión o la actividad de un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S; (b) determinar la actividad de un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa; y (c) comparar la actividad del polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa determinada en presencia de la modificación en la expresión o la actividad de un polipéptido de la etapa (a) con respecto a la actividad de un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa determinada en ausencia de la modificación en la expresión o la actividad de un polipéptido de la etapa (a) , en donde un incremento en la actividad del polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa indica un incremento en el flujo de la ruta de biosíntesis de centros Fe-S.

37. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30-36, caracterizado porque la modificación de la expresión o la actividad de un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S comprende suprimir, mutar, sustituir, expresar, regular ascendentemente , regular descendentemente, alterar la localización celular, alterar el estado de la proteína, y/o adicionar un cofactor.

38. El . método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32-37, caracterizado porque la proteína que requiere centros Fe-S tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa y en donde la proteína que requiere centros Fe-S que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tiene una secuencia de aminoácidos que coincide con el perfil HMM de la Tabla 12 con un valor E de< 10-5, en donde las tres cisteínas conservadas, correspondientes a las posiciones 56, 129 y 201 en las secuencias de aminoácidos de la enzima DHAD de Streptococcus mutans que corresponde a la sec. con núm. de ident. :168.

39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32-38, caracterizado porque el polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S está codificado por un gen seleccionado del grupo que consiste en AFT1, AFT2, FRA2, GRX3 , CCC1, y combinaciones de estos.

40. Una célula huésped recombinante caracterizada porque comprende por lo menos un polinucleotido que codifica un polipéptido identificado por lo métodos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35-37.

41. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque la célula huésped comprende, además, por lo menos un polinucleotido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa.

42. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque el polinucleótido heterologo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa se expresa en múltiples copias .

43. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque el polinucleótido heterólogo comprende un plásmido con un número alto de copias o un plásmido con un número de copias que se puede regular.

4 . La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque el polinucleótido heterólogo se integra al menos una vez en el ADN recombinante de la célula huésped.

45. El método de conformidad con la reivindicación 35 o 36, caracterizado porque la célula huésped es una célula huésped de levaduras.

46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la célula huésped de levaduras se selecciona del grupo que consiste en Saccharoyces, SchizoSaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, Issatchenkia y Pichia.

47. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28-39, caracterizado porque la célula huésped es una célula huésped de levaduras .

48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la célula huésped de levaduras se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces, SchizoSaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, Issatchenkia y Pichia.

49. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-44, caracterizada porque la célula huésped recombinante es una célula huésped de levaduras .

50. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque la célula huésped de levaduras se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces, SchizoSaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, Issatchenkia y Pichia.

51. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-44 o 49-50, caracterizada porque el polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa se expresa en el citosol de la célula huésped.

52. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-44 o 49-50, caracterizada porque el polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tiene una secuencia de aminoácidos que coincide con el Perfil HMM de la Tabla 12 con un valor E de < 10-5, en donde el polipéptido comprende, además, las tres cisteínas conservadas, correspondientes a las posiciones 56, 129 y 201 en las secuencias de aminoácidos de la enzima DHAD de Streptococcus mutans que corresponde a la sec. con núm. de ident. :168.

53. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-44 o 49-50, caracterizada porque la célula huésped recombinante produce un producto seleccionado del grupo que consiste en aminoácidos de cadena ramificada, ácido pantoténico, 2-metil-l-butanol, 3-metil-l-butanol, isobutanol, y combinaciones de estos.

54. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque la célula huésped recombinante produce isobutanol.

55. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque la célula huésped recombinante comprende una ruta biosintética de isobutanol.

56. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-22, caracterizada porque el polipéptido heterólogo que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tiene una actividad específica seleccionada del grupo que consiste en una actividad específica: (a) mayor que aproximadamente 3 veces con respecto a una célula huésped de control que comprende por lo menos un polinucleótido heterólogo -que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa; y (b) mayor que aproximadamente 6 veces con respecto a una célula huésped de control que comprende por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa.

57. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el incremento en actividad se selecciona del grupo que consiste en una cantidad: (a) mayor que aproximadamente 3 veces; y (b) mayor que aproximadamente 6 veces.

58. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-22, 40-44, o 49-50, caracterizada porque los monómeros del polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa tienen una carga de centros Fe-S seleccionada del grupo que consiste en: (a) por lo menos aproximadamente 10 %; (b)por lo menos aproximadamente 15 %; (c) por lo menos aproximadamente 20 %; (d) por lo menos aproximadamente 25 %; (e) por lo menos aproximadamente 30 %; (f) por lo menos aproximadamente 35 %; (g) por lo menos aproximadamente 40 %; (h) por lo menos aproximadamente 45 %; (i) por lo menos aproximadamente 50 %; (j)por lo menos aproximadamente 60 %; (k) or lo menos aproximadamente 70 %; (1) por lo menos aproximadamente 80 %; (m) or lo menos aproximadamente 90 %; y (n) por lo menos aproximadamente 95 %.

59. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la conversión de 2, 3-dihidroxiisovalerato a oí-cetoisovalerato en comparación con una célula huésped de control que contiene por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa se incrementa en una cantidad seleccionada del grupo que consiste en: (a) por lo menos aproximadamente 5 %; (b) por lo menos aproximadamente 10 %; (c) por lo menos aproximadamente 15 ; (d) por lo menos aproximadamente 20 %; (e) por lo menos aproximadamente 25 %; (f) por lo menos aproximadamente 30 %; (g) por lo menos aproximadamente 35 %; (h) or lo menos aproximadamente 40 %; (i) por lo menos aproximadamente 45 %; (j)por lo menos aproximadamente 50 %; (k) por lo menos aproximadamente 60 %; (l)por lo menos aproximadamente 70 %; (m) por lo menos aproximadamente 80 %; (n) por lo menos aproximadamente 90 %; y (o) por lo menos aproximadamente 95 % .

60. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, o 5-26, caracterizada porque el polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S está codificado por A N1, AR 2, ATX1, CCC2 , COTI, E B1, FET3 , FET5, FIT1, FIT2, FIT3 , FREI, FRE2 , FRE3 , FRE4 , FRE5 , FRE6 , FTH1, FTR1 , HMX1, SIT1, SMF3 , TIS11, VHTl, AFT1, AFT2 , AIM1, ARH1, ATM1 , BUD32 , CAD1, CCC1, CFD1, CIA1, CMK1, CTH1, CTI6 , CYC8 , DAP1, DRE2, ERV1, ESA1, FET4 , FRA1 , FRA2 , GEF1, GGC1, GRX1, GRX2, GRX4, GRX5, HDA1, IBA57, ISA1, ISA2, ISU1, ISU2 , JAC1, MGE1, MRS3, MRS4 , MSN5, NAR1 , NFS1, NFU1, NHP6a, NHP6b, PSE1, SMF1, SNF1, SNF2 , SNF3 , SNF4 , SSQ1, TIM12, TUPI, NP_011911.1, VPS41 , YAP5, YFH1, YRA1 , ZPR1, iscAnif, nifU, nifS, cysEl, cysE2, iscS, iscu, iscA, hscB, hscA, Fdx, sufS, sufE, cysE3, sufS2, iscA2, Nfu, nfuA, nfuV, nfu, sufA, sufB, sufC, sufD, sufEl, sufS2, o sufE2.

61. Un método para determinar la concentración de formas de un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa; caracterizado porque comprende: (a) separar las fracciones que contienen el polipéptido de un extracto crudo al usar un primer procedimiento cromatográfico; (b) separar las fracciones que contienen una forma del polipéptido de (a) al usar un segundo procedimiento cromatográfico; y (c) determinar la concentración de las formas del polipéptido obtenido en (b) .