JP2009535062A - ４炭素アルコールの発酵生成 - Google Patents

４炭素アルコールの発酵生成 Download PDF

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Abstract

４炭素アルコールを発酵生成するための方法が提供される。詳細には、ブタノール、好ましくは２−ブタノールが２−ブタノール生合成経路を発現する組換え細菌の発酵成長により生成される。本発明の組換え微生物および方法はまた、本明細書で開示される２−ブタノール生合成経路内での中間体である２−ブタノンの生成に適合しうる。

Description

関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条の下で２００６年５月２日出願の米国仮特許出願第６０／７９６８１６号明細書および２００６年１２月２１日出願の米国仮特許出願第６０／８７１１５６号明細書の優先権を主張するものである。
本発明は、産業微生物学およびアルコールの生成の分野に関する。より詳細には、２−ブタノールが組換え微生物の工業用発酵を介して生成される。組換え微生物および本発明の方法はまた、本明細書で開示される２−ブタノール生合成経路における中間体である２−ブタノンの生成に適合しうる。
ブタノールは、燃料添加剤として、プラスチック産業における化学物質原料として、さらに食品および香料産業における食品等級の抽出剤として有用な重要な産業化学物質である。毎年、１００〜１２０億ポンドのブタノールが石油化学的手段により生産され、この汎用化学製品に対する需要は高まる可能性が高い。メチルエチルケトン（ＭＥＫ）とも称される２−ブタノンは汎用の溶媒であり、アセトンに次いで最も重要な商業生産されるケトンである。それは塗料、樹脂、および接着剤における溶媒とともに選択的抽出剤および酸化反応の活性化物質として使用される。
２−ブタノンの化学合成における方法については、例えば、２−ブタノールの脱水素によるもの、または液体ブタンの触媒的酸化によって２−ブタノンおよび酢酸が得られる場合のプロセスにおけるものが既知である（「Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第６版、２００３年、ワイリーＶＣＨフェアラーク（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ａｎｄ Ｃｏ．）、ドイツのバインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）、第５巻、７２７−７３２頁）。２−ブタノンはまた水素化により化学的に２−ブタノールに変換されうる（ブリーン（Ｂｒｅｅｎ）ら、Ｊ． ｏｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ２３６：２７０−２８１頁（２００５年））。２−ブタノールの化学合成方法については、例えばｎ−ブテンの水和などが既知である（「Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第６版、２００３年、ワイリーＶＣＨフェアラーク（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ａｎｄ Ｃｏ．）、ドイツのバインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）、第５巻、７１６−７１９頁）。これらのプロセスでは、石油化学製品に由来する出発原料が使用され、それは一般に高価であり、環境に優しいものではない。植物由来の原料からの２−ブタノンおよび２−ブタノールの生成の場合、温暖化ガスの排出が最小になり、それは当該技術分野でものとなる。
他の有機化学物質の生物変換によって２−ブタノールを生成するための方法も既知である。例えば、スタンファー（Ｓｔａｍｐｆｅｒ）ら（国際公開第０３／０７８６１５号パンフレット）が、ロドコッカス・ルバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ）から得られるアルコール脱水素酵素によって触媒されるケトンの還元による、第２級アルコール、例えば２−ブタノールの生成について記載している。同様に、コジマ（Ｋｏｊｉｍａ）ら（欧州特許第０６４５４５３号明細書）が、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）から得られる第２級アルコール脱水素酵素によって触媒されるケトンの還元による、第２級アルコール、例えば２−ブタノールを調製するための方法について記載している。さらに、キンリー（Ｋｕｅｈｎｌｅ）ら（欧州特許第１１４９９１８号明細書）が、ロドコッカス・ルバーの様々な株による炭化水素の酸化によって１−ブタノールおよび２−ブタノールの双方を生成するプロセスについて記載している。同プロセスでは、９３．８％の選択性での１−ブタノールの生成が好ましかった。
乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）の特定株による２−ブタノールの生成も既知である（スペランザ（Ｓｐｅｒａｎｚａ）ら、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．（１９９７年） ４５：３４７６−３４８０頁）。２−ブタノールは、メソ−２，３−ブタンジオールの形質転換により生成される。これらの乳酸桿菌株によるアセト乳酸塩およびアセトインからの２−ブタノールの生成についても実証された。しかし、２−ブタノールを生成するように設計された組換え微生物についての報告は全くなされていない。
したがって、２−ブタノールおよび２−ブタノンの生成において環境的責任を担う費用効果的なプロセスが必要とされる。本発明は、２−ブタノールおよび２−ブタノンの生合成経路を発現する組換え微生物の生成宿主の発見を通じてこの需要に対処している。
本発明は、設計された２−ブタノール生合成経路を有する組換え微生物を提供する。最終ステップが除かれた２−ブタノール生合成経路と同様の、設計された２−ブタノン生合成経路を有する組換え微生物も提供される。設計された微生物は、２−ブタノールまたは２−ブタノンの商用生産のために用いられうる。したがって、本発明は、
ｉ）ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへ、
ｉｖ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸塩へ、
ｖ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸塩から２−ブタノンへ、および
ｖｉ）２−ブタノンから２−ブタノールへ、
からなる群から選択される生成物の変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞であって、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が前記微生物の宿主細胞に対して異種であり、かつ前記微生物の宿主細胞が２−ブタノールを生成する、組換え微生物の宿主細胞を提供する。
同様に、本発明は、
ｉ）ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへ、
ｉｖ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸塩へ、
ｖ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸塩から２−ブタノンへ、
からなる群から選択される生成物の変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞であって、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が前記微生物の宿主細胞に対して異種であり、かつ前記微生物の宿主細胞が２−ブタノンを生成する、組換え微生物の宿主細胞を提供する。
別の実施形態では、本発明は、２−ブタノールを生成するための方法であって、
１）ｉ）ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへ、
ｉｖ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸塩へ、
ｖ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸塩から２−ブタノンへ、および
ｖｉ）２−ブタノンから２−ブタノールへ、
からなる群から選択される生成物の変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞を提供するステップと、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が前記微生物の宿主細胞に対して異種であり、
２）（１）の宿主細胞を２−ブタノールが生成される条件下の発酵培地内で発酵性炭素（ｆｅｒｍｅｎｔａｂｌｅ ｃａｒｂｏｎ）基質と接触させるステップと、
を含む、方法を提供する。
同様に、本発明は、２−ブタノンを生成するための方法であって、
１）ｉ）ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへ、
ｉｖ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸塩へ、および
ｖ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸塩から２−ブタノンへ、
からなる群から選択される生成物の変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞を提供するステップと、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が前記微生物の宿主細胞に対して異種であり、
２）（１）の宿主細胞を２−ブタノンが生成される条件下の発酵培地内で発酵性炭素基質（ｆｅｒｍｅｎｔａｂｌｅ ｃａｒｂｏｎ）と接触させるステップと、
を含む、方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、本発明の方法によって生成される、２−ブタノールまたは２−ブタノンを含有する発酵生成物培地（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｍｅｄｉｕｍ）を提供する。
本発明は、本願の一部を形成する、以下の詳細な説明、図面、および添付の配列記述からより十分に理解可能である。
以下の配列は、米国特許施行規則第１．８２１−１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を有する特許出願の要件−配列の規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（１９９８年）、ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則の第２０８節および付録Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データにおいて用いられる記号および形式は、米国特許施行規則第１．８２２条に示される規則に従う。
Figure 2009535062
Figure 2009535062
Figure 2009535062
配列番号１５〜６５は、実施例において用いられるオリゴヌクレオチドＰＣＲ、クローニング、スクリーニング、および配列決定プライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号６６は、実施例１１に記載の大腸菌株ＭＧ１６５５ ΔｙｑｈＣＤ内のｙｑｈＤ遺伝子の除去された領域のヌクレオチド配列である。
配列番号６７は、グルコースイソメラーゼプロモーター１．６ＧＩの変異体のヌクレオチド配列である。
配列番号６８は１．５ＧＩプロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号６９は、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）由来のジオールデヒドラターゼオペロンのヌクレオチド配列である。
配列番号７０は、クレブシエラ・オキシトカ由来のジオールデヒドラターゼ再活性化因子オペロンのヌクレオチド配列である。
配列番号７３は、実施例９に記載のｐＤＣＱ２のヌクレオチド配列である。
配列番号１２７〜１３２は、実施例にて用いられる追加的なオリゴヌクレオチドＰＣＲおよびクローニングプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１５５は、エルウィニア・カロトボーラ・サブエスピー・アトロセプチカ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ． ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）のアミノアルコールキナーゼにおけるコドンが最適化されたコード領域である。
配列番号１５６は、エルウィニア・カロトボーラ・サブエスピー・アトロセプチカのアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼにおけるコドンが最適化されたコード領域である。
配列番号１５７〜１６３は、実施例にて用いられる追加的なオリゴヌクレオチドＰＣＲおよびクローニングプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１６４は、エルウィニア・カロトボーラ・サブエスピー・アトロセプチカのオペロンのヌクレオチド配列である。
Figure 2009535062
本発明は、組換え微生物を用いて２−ブタノールを生成するための方法に関する。本発明は多数の商業的かつ産業的な需要を満たす。ブタノールは、種々の用途を有する重要な産業用商品の化学物質であり、その場合、燃料または燃料添加剤としてのその可能性は特に有意である。ブタノールは、４炭素アルコールにすぎなくても、ガソリンの含量に類似のエネルギー含量を有し、任意の化石燃料と混和されうる。ブタノールは、標準の内燃エンジン内で燃焼される場合にＣＯ２のみを生成し、ＳＯＸまたはＮＯＸをほとんど生成しないことから燃料または燃料添加剤として好まれる。さらにブタノールは、今日まで最も好ましい燃料添加剤であるエタノールよりも腐食性が少ない。
ブタノールは、生物燃料または燃料添加剤としてのその有用性に加え、新興の燃料電池産業における水素配給の問題に影響を与える可能性を有する。今日、燃料電池では水素の輸送および配給に関連した安全性の懸念が悩みの種となっている。ブタノールは、その水素含量において容易に改善可能であり、かつ、既存のガソリンスタンドによる、車両内の燃料電池または燃焼機関のいずれかで要求される純度での配給が可能である。
本発明は、最終的に、植物由来の炭素源から２−ブタノールを生成するものであり、ブタノール生成における標準の石油化学プロセスに伴う環境への負の影響を回避する。
本発明は、本明細書中に開示される２−ブタノール生合成経路内での中間体である２−ブタノンを生成するための組換え微生物および方法も提供する。メチルエチルケトン（ＭＥＫ）としても知られる２−ブタノンは、塗料および他のコーティングにおける溶媒として有用である。それは合成ゴム産業およびパラフィンろうの生成においても用いられる。
以下の定義および略語は、特許請求の範囲および明細書の解釈において用いられるものとする。
本明細書で用いられる「発明（ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」または「本発明（ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は非限定的用語であり、特定の発明の任意の単一の実施形態を示すように意図されていないが、明細書および特許請求の範囲に記載の考えられるあらゆる実施形態を包含する。
「２−ブタノール生合成経路」という用語は、ピルビン酸塩から２−ブタノールを生成するための酵素経路を示す。
「２−ブタノン生合成経路」という用語は、ピルビン酸塩から２−ブタノンを生成するための酵素経路を示す。
「アセトヒドロキシ酸シンターゼ」としても知られる「アセト乳酸シンターゼ」という用語は、ピルビン酸２分子からα−アセト乳酸１分子への変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。アセト乳酸シンターゼ（ＥＣ２．２．１．６［従来は４．１．３．１８］として知られる）（「Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ」 １９９２年、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）のアカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ））は、その活性については共同因子のチアミンピロリン酸に依存しうる。適切なアセト乳酸シンターゼ酵素は、多数の供給源、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２２２２２ ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））アミノ酸配列（配列番号７７）、Ｌ０４４７０ ＮＣＢＩヌクレオチド配列（配列番号７６）］、クレブシエラ・テリゲナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２５０５５（配列番号７９）、Ｌ０４５０７（配列番号７８）］、およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２５０７９（配列番号４）、Ｍ７３８４２（配列番号３）］から入手可能である。
「アセト乳酸デカルボキシラーゼ」という用語は、α−アセト乳酸からアセトインへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。アセト乳酸デカルボキシラーゼは、ＥＣ４．１．１．５として知られ、例えば枯草菌［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２２２２３（配列番号８１）、Ｌ０４４７０（配列番号８０）］、クレブシエラ・テリゲナ［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２５０５４（配列番号８３）、Ｌ０４５０７（配列番号８２）］およびクレブシエラ・ニューモニエ［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＵ４３７７４（配列番号２）、ＡＹ７２２０５６（配列番号１）］から入手可能である。
「アセトインアミナーゼ」または「アセトイントランスアミナーゼ」という用語は、アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。アセトインアミナーゼでは、共同因子のピリドキサル５’−リン酸またはＮＡＤＨ（還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）またはＮＡＤＰＨ（還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）が用いられうる。得られた生成物は３位で（Ｒ）または（Ｓ）の立体化学を有しうる。ピリドキサルリン酸依存性酵素では、アミノドナーとしてアラニンまたはグルタミン酸塩などのアミノ酸が用いられうる。ＮＡＤＨ−およびＮＡＤＰＨ依存性酵素では、第２の基質としてアンモニアが用いられうる。アミノアルコール脱水素酵素としても知られるＮＡＤＨ依存性のアセトインアミナーゼの適例が、イトウ（Ｉｔｏ）ら（米国特許第６，４３２，６８８号明細書）で記載されている。ピリドキサル依存性のアセトインアミナーゼの例が、シン（Ｓｈｉｎ）およびキム（Ｋｉｍ）（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：２８４８−２８５３頁（２００２年））で記載のアミン：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（アミン：ピルビン酸トランスアミナーゼとも称される）である。
「ブタノール脱水素酵素」という用語は、２−ブタノンおよび２−ブタノールの相互変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。ブタノール脱水素酵素はアルコール脱水素酵素の広範なファミリーのサブセットである。ブタノール脱水素酵素はＮＡＤ−またはＮＡＤＰ依存性でありうる。ＮＡＤ依存性酵素は、ＥＣ１．１．１．１として知られ、例えばロドコッカス・ルバー［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＤ３６４７５（配列番号１４）、ＡＪ４９１３０７（配列番号１３）］から入手可能である。ＮＡＤＰ依存性酵素は、ＥＣ１．１．１．２として知られ、例えばピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ２５５５６（配列番号９１）、ＡＦ０１３１６９（配列番号９０）］から入手可能である。さらに、ブタノール脱水素酵素が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ_４１７４８４（配列番号７５）、ＮＣ_０００９１３（配列番号７４）］から入手可能であり、シクロヘキサノール脱水素酵素がアシネトバクター・エスピー（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＧ１００２６（配列番号７２）、ＡＦ２８２２４０（配列番号７１）］から入手可能である。
「アセトインキナーゼ」という用語は、アセトインからホスホアセトイン（ｐｈｏｓｐｈｏａｃｅｔｏｉｎ）への変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。アセトインキナーゼでは、反応におけるリン酸供与体としてＡＴＰ（アデノシン３リン酸）またはホスホエノールピルビン酸が用いられうる。アセトインに対してこの反応を触媒する酵素についての報告は全くないが、類似の基質であるジヒドロキシアセトンに対する類似反応を触媒する酵素、例えばＥＣ２．７．１．２９として知られる酵素（ガルシア−アレス（Ｇａｒｃｉａ−Ａｌｌｅｓ）ら、（２００４年） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：１３０３７−１３０４６頁）が存在する。
「アセトインリン酸アミナーゼ」という用語は、ホスホアセトインから３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸への変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。アセトインリン酸アミナーゼでは、共同因子のピリドキサル５’−リン酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが用いられうる。得られた生成物は、３位で（Ｒ）または（Ｓ）の立体化学を有しうる。ピリドキサルリン酸依存性酵素では、アラニンまたはグルタミン酸塩などのアミノ酸が用いられうる。ＮＡＤＨ−およびＮＡＤＰＨ依存性酵素では、第２の基質としてアンモニアが用いられうる。ホスホアセトインに対してこの反応を触媒する酵素についての報告は全くないが、類似の基質であるセリノールリン酸塩（ｓｅｒｉｎｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ））に対する類似反応を行うものとして提示されているピリドキサルリン酸依存性酵素が存在する（ヤスタ（Ｙａｓｕｔａ）ら、（２００１年） Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６７：４９９９−５００９頁）。
「アミノアルコールＯ−リン酸リアーゼ」とも称される「アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼ」という用語は、３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸から２−ブタノンへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼでは共同因子のピリドキサル５’−リン酸が用いられうる。アミノブタノールリン酸塩に対してこの反応を触媒する酵素についての報告は過去にないが、類似の基質である１−アミノ−２−プロパノールリン酸塩に対する類似反応を触媒する酵素についていくつかの報告がある（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、（１９７３年） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１３４：１６７−１８２頁）。本発明は、生物のエルウィニア・カロトボラ由来の、本明細書中の実施例１５に示される活性を有する新規に同定されたアミノブタノールリン酸ホスホリアーゼ（配列番号１２６）について記載する。
「アミノブタノールキナーゼ」という用語は、３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸への変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。アミノブタノールキナーゼでは、リン酸供与体としてＡＴＰが用いられうる。３−アミノ−２−ブタノールに対してこの反応を触媒する酵素についての報告は全くないが、類似の基質であるエタノールアミンおよび１−アミノ−２−プロパノールに対する類似反応を触媒する酵素についていくつかの報告がある（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、上記）。本発明では、実施例１４において、エルウィニア・カロトボーラ・サブエスピー・アトロセプチカのアミノアルコールキナーゼ（配列番号１２４）が記載される。「アセトインレダクターゼ」としても知られる「ブタンジオール脱水素酵素」という用語は、アセトインから２，３−ブタンジオールへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。ブタンジオール脱水素酵素はアルコール脱水素酵素の広範なファミリーのサブセットである。ブタンジオール脱水素酵素は、アルコール生成物中で（Ｒ）または（Ｓ）の立体化学の生成に対して特異性を有しうる。（Ｓ）に特異的なブタンジオール脱水素酵素は、ＥＣ１．１．１．７６として知られ、例えばクレブシエラ・ニューモニエ（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＢＢＡ１３０８５（配列番号６）、Ｄ８６４１２（配列番号５））から入手可能である。（Ｒ）に特異的なブタンジオール脱水素酵素は、ＥＣ１．１．１．４として知られ、例えばセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿８３０４８１（配列番号８５）、ＮＣ_００４７２２（配列番号８４）；ＡＡＰ０７６８２（配列番号８７）、ＡＥ０１７０００（配列番号８６）］、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＫ０４９９５（配列番号８９）、ＡＥ００６３２３（配列番号８８）］から入手可能である。
「ジオールデヒドラターゼ」または「プロパンジオールデヒドラターゼ」としても知られる「ブタンジオールデヒドラターゼ」という用語は、２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。ブタンジオールデヒドラターゼでは共同因子のアデノシルコバラミン（ビタミンＢ１２）が用いられうる。アデノシルコバラミン依存性酵素は、ＥＣ４．２．１．２８として知られ、例えばクレブシエラ・オキシトカ［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＢＡＡ０８０９９（αサブユニット）（配列番号８）、Ｄ４５０７１（配列番号７）；ＢＡＡ０８１００（βサブユニット）（配列番号１０）、Ｄ４５０７１（配列番号９）；およびＢＢＡ０８１０１（γサブユニット）（配列番号１２）、Ｄ４５０７１（配列番号１１）（３つの全サブユニットは活性に必要とされることに注意のこと）］、ならびにクレブシエラ・ニューモニエ［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ９８３８４（αサブユニット）（配列番号１０５）、ＡＦ１０２０６４（配列番号１０４）；ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ９８３８５（βサブユニット）（配列番号１０７）、ＡＦ１０２０６４（配列番号１０６）、ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ９８３８６（γサブユニット）配列番号１０９］］、ＡＦ１０２０６４（配列番号１０８）］から入手可能である。他の適切なジオールデヒドラターゼが、限定はされないが、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＢ８４１０２（大型サブユニット）（配列番号９３）、ＡＦ０２６２７０（配列番号９２）；ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＢ８４１０３（中型サブユニット）（配列番号９５）、ＡＦ０２６２７０（配列番号９４）；ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＢ８４１０４（小型サブユニット）（配列番号９７）、ＡＦ０２６２７０（配列番号９６）］；およびラクトバチルス・コリノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）［ＧｅｎＢａｎｋ番号ＣＡＣ８２５４１（大型サブユニット）（配列番号９９）、ＡＪ２９７７２３（配列番号９８）；ＧｅｎＢａｎｋ番号ＣＡＣ８２５４２（中型サブユニット）（配列番号１０１）；ＡＪ２９７７２３（配列番号１００）；ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＤ０１０９１（小型サブユニット）（配列番号１０３）、ＡＪ２９７７２３（配列番号１０２）］から入手可能なＢ１２依存性のジオールデヒドラターゼ；ならびにブレビス乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（特にＣＮＲＺ７３４株およびＣＮＲＺ７３５株、スペランツァ（Ｓｐｅｒａｎｚａ）ら、上記）由来の酵素、ならびに対応する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む。ジオールデヒドラターゼの遺伝子単離の方法は当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，６８６，２７６号明細書）。
「グリセロールデヒドラターゼ」という用語は、グリセロールから３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。アデノシルコバラミン依存性のグリセロールデヒドラターゼはＥＣ４．２．１．３０として知られる。ＥＣ４．２．１．３０のグリセロールデヒドラターゼは、配列や３つのサブユニットを有することにおいてジオールデヒドラターゼと類似性がある。グリセロールデヒドラターゼを用い、２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換も可能である。ＥＣ４．２．１．３０のグリセロールデヒドラターゼのいくつかの例が、クレブシエラ・ニューモニエ（αサブユニット、配列番号１４５、コード領域および配列番号１４６、タンパク質；βサブユニット、配列番号１４７、コード領域および配列番号１４８、タンパク質；およびγサブユニット配列番号１４９、コード領域および配列番号１５０、タンパク質）；クロストリジウム・パスツーリアナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）［ＧｅｎＢａｎｋ番号３３６０３８９（αサブユニット、配列番号１３５）、３３６０３９０（βサブユニット、配列番号１３６）、および３３６０３９１（γサブユニット、配列番号１３７）］；エシェリヒア・ブラッタエ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｂｌａｔｔａｅ）［ＧｅｎＢａｎｋ番号６００９９６１３（αサブユニット、配列番号１３８）、５７３４０１９１（βサブユニット、配列番号１３９）、および５７３４０１９２（γサブユニット、配列番号１４０）］；ならびにシトロバクター・フロインディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）［ＧｅｎＢａｎｋ番号１１６９２８７（αサブユニット、配列番号１４１）、１２２９１５４（βサブユニット、配列番号１４２）、および１２２９１５５（γサブユニット、配列番号１４３）］に由来するものを含む。３つの全サブユニットは活性に必要とされることに注意のこと。さらなるグリセロールデヒドラターゼが表２に挙げられる。
ジオールおよびグリセロールデヒドラターゼは触媒作用の間に自殺反応による不活化を経る場合がある。本明細書中で「レアクティバーゼ（ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ）」とも称される再活性化因子タンパク質を用いると、不活性酵素の再活性化が可能である（モリ（Ｍｏｒｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３２０３４頁（１９９７年））。好ましくは、再活性化因子は用いられるジオールまたはグリセロールデヒドラターゼと同様の供給源から入手される。例えば、適切なジオールデヒドラターゼ再活性化因子が、クレブシエラ・オキシトカ［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ１５８７１（大型サブユニット）（配列番号１１１）、ＡＦ０１７７８１（配列番号１１０）；ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ１５８７２（小型サブユニット）（配列番号１１３）、ＡＦ０１７７８１（配列番号１１２）］；ネズミチフス菌［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＢ８４１０５（大型サブユニット）（配列番号１１５）、ＡＦ０２６２７０（配列番号１１４）、ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＤ３９００８（小型サブユニット）（配列番号１１７）、ＡＦ０２６２７０（配列番号１１６）］；およびラクトバチルス・コリノイデス［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＤ０１０９２（大型サブユニット）（配列番号１１９）、ＡＪ２９７７２３（配列番号１１８）；ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＤ０１０９３（小型サブユニット）（配列番号１２１）、ＡＪ２９７７２３（配列番号１２０）］から入手可能である。大型および小型サブユニットの双方が活性に必要とされる。例えば、適切なグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子がクレブシエラ・ニューモニエ（大型サブユニット、配列番号１５１、コード領域および配列番号１５２、タンパク質；および小型サブユニット、配列番号１５３、コード領域および配列番号１５４、タンパク質）から入手可能である。
「通性嫌気性生物」という用語は、好気性および嫌気性環境の双方で成長しうる微生物を示す。
「炭素基質」または「発酵性炭素基質」という用語は、本発明の宿主生物によって代謝可能な炭素源ならびに特に単糖、オリゴ糖、多糖、およびそれらの１炭素基質または混合物からなる群から選択される炭素源を示す。
「遺伝子」という用語は、場合によりコード配列の上流（５’非コード配列）および下流（３’非コード配列）の調節配列を含む、特定のタンパク質として発現可能な核酸断片を示す。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列を有する天然に見出される遺伝子を示す。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子でない任意の遺伝子を示し、天然に見出されることのない調節およびコード配列を含む。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列または同じ供給源に由来する調節配列およびコード配列を含みうるが、天然に見出されるものとは異なる様式で配列されている。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム内のその天然の位置における天然遺伝子を示す。「外来」または「異種」遺伝子は、通常は宿主生物内に見出されることはないが宿主生物に遺伝子導入によって導入される遺伝子を示す。外来遺伝子は、非天然の生物に導入される天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含みうる。「トランス遺伝子」は、形質転換手順によりゲノムに導入されている遺伝子である。
本明細書で用いられる「単離核酸断片」または「単離核酸分子」または「遺伝子コンストラクト」は同義に用いられ、かつ一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡの高分子を意味し、場合により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を有することになる。ＤＮＡの高分子の形態の単離核酸断片については、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡのうちの１つもしくは複数のセグメントから構成されうる。
核酸断片については、ある一本鎖形態の核酸断片が温度および溶液のイオン強度の適切な条件下で他方の核酸断片にアニール可能である場合、別の核酸断片、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子に対して「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件については周知であり、サムブルック Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．）、フリッツ Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８９年）、特に第１１章およびその中の表１１．１（全体として参照により本明細書中に援用される）に例示されている。温度およびイオン強度の条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件は、中程度に類似の断片（遠縁の生物由来の相同配列など）から高度に類似の断片（近縁の生物由来の機能酵素を複製する遺伝子など）にかけてスクリーニングするように調整されうる。ハイブリダイゼーション後の洗浄がストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件のセットでは、室温で１５分間の６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳの場合から開始し、次いで４５℃で３０分間の２×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳの場合を繰り返し、次いで５０℃で３０分間の０．２×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳの場合を２回繰り返すという一連の洗浄が用いられる。より好ましいストリンジェントな条件のセットではより高温が用いられ、ここでの洗浄は終わりの２回の０．２×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳにおける３０分の洗浄で温度が６０℃に高められた点を除いて上記の洗浄と同一である。別の好ましい高度にストリンジェントな条件のセットでは、６５℃での０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにおける２回の最終の洗浄が用いられる。さらなるストリンジェントな条件のセットでは、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーションおよび２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳとそれに続く０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの場合での洗浄が含まれる。
ハイブリダイゼーションでは、塩基間の不一致がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによりありうるとしても２つの核酸が相補配列を有することが必要である。核酸をハイブリダイズするのに適するストリンジェンシーは、当該技術分野での周知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存している。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きくなると、それらの配列を有する核酸のハイブリッドにおけるＴｍの値が増加する。核酸ハイブリダイゼーションの（より高いＴｍに対応する）相対的安定性は、以下の順、すなわちＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡで低下する。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドにおいては、Ｔｍを計算するための方程式が導かれている（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上記、９．５０〜９．５１を参照）。より短い核酸すなわちオリゴヌクレオチドの場合のハイブリダイゼーションにおいては、不一致の位置がより重要になり、オリゴヌクレオチド長がその特異性を決定する（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上記、１１．７〜１１．８を参照）。一実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸における長さは少なくとも約１０ヌクレオチド長である。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸における最小の長さは少なくとも約１５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長、および最も好ましくは長さは少なくとも約３０ヌクレオチド長である。さらに、当業者は、温度および洗浄溶液の塩濃度がプローブ長などの要素による必要性に応じて調整可能であることを理解するであろう。
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」は、当業者による配列のマニュアル評価またはコンピュータによる自動配列比較およびＢＬＡＳＴ（アルシュール Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０頁（１９９３年））などのアルゴリズムを用いる同定のいずれかによってポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む部分である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列を既知のタンパク質または遺伝子に対して相同性のあるものとして推定的に同定するのに、１０以上の隣接アミノ酸または３０以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、遺伝子同定の配列依存性の方法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチュ・ハイブリダイゼーション）では２０〜３０の隣接ヌクレオチドを含む遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが用いられうる。さらに、プライマーを含む特定の核酸断片を得るため、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドがＰＣＲにおける増幅プライマーとして用いられうる。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、同配列を含む核酸断片を特異的に同定するかつ／または単離するのに十分な配列を含む。本明細書では、特定の真菌タンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列について教示される。本明細書中で報告される配列において利益を有する当業者は、ここでは開示される配列の全部または実質的部分を当業者に既知の目的のために使用できる。したがって、本発明は、添付の配列表にて報告される完全な配列、ならびに上で定義された配列の実質的部分を含む。
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズ可能なヌクレオチド塩基間の関係性を記述するのに用いられる。例えばＤＮＡに関しては、アデノシンがチミンに対して相補的でありかつシトシンがグアニンに対して相補的である。
「相同性」および「相同性のある」という用語は、本明細書中で同義的に用いられる。それらは、１つもしくは複数のヌクレオチド塩基における変化が核酸断片の遺伝子発現を媒介するかまたは特定の表現型を生成する能力に作用することのない場合の核酸断片を示す。これらの用語は、初期の未修飾断片に対し、得られる核酸断片の機能的特性を実質的に改変することのない、１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸断片の修飾も示す。したがって、当業者が理解するように、本発明が特定の模範的な配列を超えるものを包含することが理解される。
さらに当業者は、本発明で包含される相同性のある核酸配列が中程度にストリンジェントな条件（例えば、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６０℃）下で、本明細書中で例示される配列あるいは本明細書で開示されるヌクレオチド配列および本明細書で開示される核酸配列のいずれかに対して機能的に等価なヌクレオチド配列の任意の部分とハイブリダイズするその能力によっても定義されることを理解している。
「コドン縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に作用することなくヌクレオチド配列の変異を可能にする遺伝子コードにおける性質を示す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの使用における特定の宿主細胞により示される「コドンバイアス」について十分理解している。したがって、宿主細胞内での改善された発現を意図して遺伝子を合成する場合、遺伝子をそのコドン使用の頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近づくように設計することが望ましい。
当該技術分野で既知のように、「同一性（％）」という用語は、配列の比較による判定からの、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係性である。当該技術分野では、「同一性」は、場合によっては、かかる配列の文字列の間の一致による判定からの、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列の関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、限定はされないが、１．）「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（レスク Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ Ａ．Ｍ．）編） ニューヨーク州のオックスフォード大学（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）（１９８８年）；２．）「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」（スミス Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ Ｄ．Ｗ．）編） ニューヨーク州のアカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）（１９９３年）；３．）「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ」（グリフィン Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ Ａ．Ｍ．）およびグリフィン Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ Ｈ．Ｇ．）編） ニュージャージー州のヒューマニア（Ｈｕｍａｎｉａ）（１９９４年）；４．）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（フォン・ハインヘ Ｇ．（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ Ｇ．）編） アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）（１９８７年）；ならびに５．）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ」（グリブスコフ Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ Ｍ．）およびデベルクス Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ Ｊ．）編） ニューヨーク州のストックトン（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ）（１９９１年）に記載の方法を含む既知の方法により容易に計算されうる。
同一性を判定するための好ましい方法が試験される配列間に最適な一致を与えるように設計される。同一性および類似性を判定するため方法は、公的に利用可能なコンピュータープログラム内にコード化される。配列アラインメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイート（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｓｕｉｔｅ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のディーエヌエースター（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．））を用いて行われうる。配列の複数のアラインメントが、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖと称されるアラインメント法に対応する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法」を含む数種類のアルゴリズムを包含する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法」を用いて行われ（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３頁（１９８９年）；ヒギンズ Ｄ．Ｇ．（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．）ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、８：１８９−１９１頁（１９９２年）で記載）、かつＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ディーエヌエースター（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）において見出される。複数のアラインメントにおいては、デフォルト値はギャップペナルティ＝１０およびギャップ長ペナルティ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いる、タンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび同一性パーセントの計算におけるデフォルトパラメータが、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ギャップペナルティ＝３、ウインドウ（ＷＩＮＤＯＷ）＝５およびダイアゴナルズセイブド（ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ）＝５である。核酸においては、これらのパラメータはＫＴＵＰＬＥ＝２、ギャップペナルティ＝５、ウインドウ＝４およびダイアゴナルズセイブド＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを用いての配列のアラインメント後、同じプログラム内の「配列距離（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｉｓｔａｎｃｅｓ）」表を見ることにより「同一性パーセント」を得ることが可能である。さらに、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗのアラインメント法」が利用可能あり、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗと称されるアラインメント法に対応し（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３頁（１９８９年）；ヒギンズ Ｄ．Ｇ．（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．）ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１頁（１９９２年）で記載）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）において見出される。複数のアラインメントにおけるデフォルトパラメータ（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．２、ディレイ・ディバージェン配列（Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ）（％）＝３０、ＤＮＡトランジション・ウェイト（Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ）＝０．５、タンパク質重み行列（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ）＝Ｇｏｎｎｅｔシリーズ（Ｓｅｒｉｅｓ）、ＤＮＡ重み行列（Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ）＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いての配列のアラインメント後、同じプログラム内の「配列距離」表を見ることにより「同一性パーセント」を得ることが可能である。
配列同一性の多数のレベルが、同一または類似の機能または活性を有するポリペプチドを他の種から同定するのに有用であることが当業者により十分に理解されている。同一性パーセントの有用な例が、限定はされないが、２４％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を含むか、あるいは２４％〜１００％の任意の整数の百分率、例えば、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が、本発明を記載する上で有用でありうる。適切な核酸断片が、上記の相同性を有するだけでなく、典型的には少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、および最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析にとって有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを示す。「配列分析ソフトウェア」は商業的に利用可能であるかまたは個別に開発される場合がある。典型的な配列分析ソフトウェアは、限定はされないが、１．）プログラムのＧＣＧスイート（ウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ）バージョン９．０、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のジェネティック・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ））；２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０頁（１９９０年））；３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のディーエヌエースター（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．））；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（ミシガン州アナーバー（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）のジーン・コード・コーポレーション（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））；および５．）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、会合日１９９２年、１１１−２０頁．スナイ（Ｓｕｈａｉ）編、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）のサンダー・プレナム（Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ））を組み入れたＦＡＳＴＡプログラムを含むことになる。本願における文脈の中で、配列分析ソフトウェアが分析に用いられる場合、分析の結果が、他に規定がない限り、参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解されるであろう。本明細書で用いられる「デフォルト値」は、最初に初期化される際に最初にソフトウェアが読み込む任意の値またはパラメータのセットを意味することになる。
本明細書で用いられる「コード配列」または「ＣＤＳ」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。「適切な調節配列」は、上流（５’非コード配列）またはコード配列の下流（３’非コード配列）内に位置するヌクレオチド配列を示し、関連のコード配列の転写、ＲＮＡのプロセシングまたは安定性あるいは翻訳に作用する。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含みうる。
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御可能なＤＮＡ配列を示す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、その全体として天然遺伝子に由来するか、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されるか、またはさらに合成ＤＮＡセグメントを含む場合がある。異なるプロモーターが異なる組織または細胞種における、あるいは発生の異なる段階で、あるいは異なる環境または生理的状態に応答して遺伝子の発現を誘導可能であることが当業者により理解されている。遺伝子における大部分の細胞種内でほぼ常に発現を誘導するプロモーターが一般に「構成プロモーター」と称される。さらに、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に規定されていないことから、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有しうると理解されている。
「作動可能に連結される」という用語は、一方の機能が他方により影響を受けるような核酸配列の単一の核酸断片上への結合を示す。例えば、プロモーターが、そのコード配列の発現に効果を及ぼすことが可能である（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、コード配列に作動可能に連結されている。コード配列は調節配列にセンスまたはアンチセンス方向に作動可能に連結されうる。
本明細書で用いられる「発現」という用語は、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を示す。発現はｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も示しうる。
本明細書で用いられる「形質転換」という用語は、核酸断片の宿主生物への転移を示し、遺伝的に安定な遺伝的形質をもたらす。形質転換された核酸断片を有する宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物と称される。
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞の中央代謝の一部でない、遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である余分な染色体要素を示す。かかる要素は、任意の供給源に由来する線状または環状の一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡにおける自己複製配列、ゲノム結合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）配列、ファージまたはヌクレオチド配列である場合があり、ここでは多数のヌクレオチド配列が適切な３’未翻訳配列を有する選択された遺伝子産物におけるプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞に導入可能な固有の作成物に連結されるかまたは組換えられている。「形質転換ベクター」は、外来遺伝子を有し、かつ特定の宿主細胞の形質転換を促進する、外来遺伝子に加わる要素を有する特定のベクターを示す。
本明細書で用いられる「コドン縮重」という用語は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に作用することなくヌクレオチド配列の変異を可能にする遺伝子コードにおける性質を示す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するための、ヌクレオチドコドンの使用時に特定の宿主細胞により示される「コドンバイアス」について十分に理解している。したがって、宿主細胞内での改善された発現のために遺伝子を合成する場合、遺伝子をそのコドン使用の頻度が宿主細胞での好ましいコドンの使用の頻度に近づくように設計することが望ましい。
「コドンが最適化された」という用語は、様々な宿主の形質転換における核酸分子の遺伝子またはコード領域を示すとき、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変することなく宿主生物の典型的なコドンの使用を反映するための核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの改変を示す。
「発酵生成物培地」という用語は、生成物が培地内に存在するように発酵が生じている培地を示す。
ここで用いられる標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、サムブルック Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．）、フリッツ Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）（１９８９年）（以後「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）；シルハヴィ Ｔ．Ｊ．（Ｓｉｌｈａｖｙ Ｔ．Ｊ．）、ベナン Ｍ．Ｌ．（Ｂｅｎｎａｎ Ｍ．Ｌ．）、およびエンキスト Ｌ．Ｗ．（Ｅｎｑｕｉｓｔ Ｌ．Ｗ．）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）（１９８４年）；ならびにアウスベル Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ウィレイ・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）発行（１９８７年）に記載されている。
２−ブタノールおよび２−ブタノンの生合成経路
炭水化物を使用する微生物が、中央代謝経路としてエムデン・マイヤーホフ・ パルナス（ＥＭＰ）経路、エントナー−ドドロフ経路およびペントースリン酸回路を用い、成長および維持のためにエネルギーおよび細胞前駆体を生成する。これらの経路は、共通に中間体のグリセルアルデヒド−３−リン酸を有し、最終的にピルビン酸塩が直接にかまたはＥＭＰ経路と相まって形成される。糖のピルビン酸塩への変換の組み合わされた反応により、エネルギー（例えばアデノシン−５’−３リン酸、ＡＴＰ）および還元等価物（例えば還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ＮＡＤＨ、および還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ＮＡＤＰＨ）が生成される。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨはそれらの酸化形態（各々、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋）に再循環されなければならない。無機の電子受容体（例えばＯ２、ＮＯ３ −およびＳＯ４ ２−）の存在下で還元等価物を用いるとエネルギープールが増大しうるか、あるいは還元された炭素副産物が形成されうる。
本発明は、組換え微生物を用い、ピルビン酸塩から２−ブタノンまたは２−ブタノールへの完全な生合成経路を提供することにより、炭水化物源からの２−ブタノンまたは２−ブタノールの生成を可能にする。３つの追加の経路が記載される。２−ブタノールが任意の細菌発酵の主要な生成物であることは知られていないが、既知の生化学的反応タイプを介する２−ブタノールの生成については多数の有望な経路が存在する。これらの経路は図１に示される。下記の文字およびローマ数字は、図１中の文字およびローマ数字（各々、変換ステップおよび生成物を表すために用いられる）に対応する。下記のように、２−ブタノンはこれらの２−ブタノール生合成経路のすべてにおける中間体である。
経路のすべてが、図１中の生成物の変換（ａ）に対する基質として示されるα−アセト乳酸（Ｉ）を生成する、２個のピルビン酸塩分子の初期反応から始まる。α−アセト乳酸からは、２−ブタノン（Ｖ）に向けて、本明細書中で２−ブタノン生合成経路と称される４つの有望な経路が存在する。
経路１）Ｉ−−−>ＩＩ−−−>ＩＩＩ−−−>ＩＶ−−−>Ｖ（生成物の変換ｂ、ｃ、ｄ、ｅに対する基質）これは本発明の経路である。
２）Ｉ−−−>ＩＩ−−−>ＶＩＩ−−−>ＩＶ−−−>Ｖ（生成物の変換ｂ、ｇ、ｈ、ｅに対する基質）
３）Ｉ−−−>ＩＩ−−−>ＶＩＩＩ−−−>Ｖ（生成物の変換ｂ、ｉ、ｊに対する基質）：
４）Ｉ−−−>ＩＸ−−−>Ｘ−−−>Ｖ（生成物の変換ｋ、ｌ、ｍに対する基質）
２−ブタノール生合成経路は２−ブタノン（Ｖ）から２−ブタノール（ＶＩ）への変換で完了する。各経路内での生成物の変換に対する基質に関する詳細な考察については下記に示される。
経路１：
（ａ）ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ
経路１における初期ステップは、ピルビン酸塩の２分子のα−アセト乳酸の１分子への変換（図１における化合物Ｉ）およびチアミンピロリン酸依存性酵素によって触媒される二酸化炭素の１分子への変換である。生成物の変換に対してこの基質を触媒する酵素（一般にアセト乳酸シンターゼまたはアセトヒドロキシ酸シンターゼのいずれかで称される；ＥＣ２．２．１．６［２００２年における４．１．３．１８から変更］）が周知であり、それらはタンパク質新生（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ）アミノ酸であるロイシンおよびバリンにおける生合成経路ならびに多数の生物における２，３−ブタンジオールおよびアセトインの発酵生成における経路に関与する。
当業者は、種々の供給源から単離されるアセト乳酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが本発明において配列相同性とは無関係に有用になることを理解するであろう。適切なアセト乳酸シンターゼ酵素のいくつかの例が、多数の供給源、例えば枯草菌［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２２２２２ ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））アミノ酸配列（配列番号７７）、Ｌ０４４７０ ＮＣＢＩのヌクレオチド配列（配列番号７６）］、クレブシエラ・テリゲナ［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２５０５５（配列番号７９）、Ｌ０４５０７（配列番号７８）］、およびクレブシエラ・ニューモニエ［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２５０７９（配列番号４）、Ｍ７３８４２（配列番号３）］から入手可能である。好ましいアセト乳酸シンターゼ酵素は、配列番号４、７７、および７９に対して少なくとも８０％〜８５％の同一性を有するものであり、ここでは少なくとも８５％〜９０％の同一性がより好ましく、かつギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗのアラインメント法に基づくと少なくとも９５％の同一性が最も好ましい。
（ｂ）α−アセト乳酸からアセトインへ
α−アセト乳酸（Ｉ）が、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．５）などの酵素の作用によってアセトイン（ＩＩ）に変換される。アセト乳酸シンターゼのように、この酵素はチアミンピロリン酸依存性であり、多数の生物による２，３−ブタンジオールおよびアセトインの生成にも関与する。異なる供給源由来の酵素は、大きさ（２５〜５０キロダルトン）、オリゴマー化（２量体〜６量体）、局在化（細胞外または細胞内）、およびアロステリック調節（例えば分岐鎖アミノ酸による活性化）においてかなり広範に変化する。本発明の目的としては、細胞内位置が細胞外位置よりも好ましいが、他の変化は一般に許容可能である。
当業者は、種々の供給源から単離されるアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドが本発明において配列相同性とは無関係に有用になることを理解するであろう。適切なアセト乳酸デカルボキシラーゼ酵素のいくつかの例が、多数の供給源、例えば枯草菌［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２２２２３（配列番号８１）、Ｌ０４４７０（配列番号８０）］、クレブシエラ・テリゲナ［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２５０５４（配列番号８３）、Ｌ０４５０７（配列番号８２）］およびクレブシエラ・ニューモニエ［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＵ４３７７４（配列番号２）、ＡＹ７２２０５６（配列番号１）］から入手可能である。
好ましいアセト乳酸デカルボキシラーゼ酵素は、配列番号２、８１および８３に対して少なくとも８０％〜８５％の同一性を有するものであり、ここでは少なくとも８５％〜９０％の同一性がより好ましく、かつギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗのアラインメント法に基づくと少なくとも９５％の同一性が最も好ましい。
（ｃ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへ
アセトイン（ＩＩ）から３−アミノ−２−ブタノール（ＩＩＩ）への生成物の変換に対して基質に効果をもたらしうる生化学的反応には、特に２つの既知のタイプ、すなわち付随するアミノ供与体を用いるピリドキサルリン酸依存性のアミノ基転移およびアンモニアを用いる直接還元的アミノ化（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ａｍｉｎａｔｉｏｎ）が存在する。後者では、還元等価物が還元されたニコチンアミド共同因子（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれか）の形態で供給される。基質としてのアセトインでこの反応を触媒するＮＡＤＨ依存性酵素の例が、イトウ（Ｉｔｏ）ら（米国特許第６，４３２，６８８号明細書）によって報告されている。この酵素の任意の立体特異性については評価がなされていない。アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの変換を触媒するピリドキサルリン酸依存性のトランスアミナーゼの例が、シン（Ｓｈｉｎ）およびキム（Ｋｉｍ）（上記）によって報告されている。この酵素は、本明細書中の実施例１３で、アセトインの（Ｒ）異性体を３−アミノ−２−ブタノールの（２Ｒ、３Ｓ）異性体に変換しかつアセトインの（Ｓ）異性体を３−アミノ−２−ブタノールの（２Ｓ、３Ｓ）異性体に変換することが示された。酵素のいずれかのタイプ（すなわちトランスアミナーゼまたは還元性アミナーゼ）がアセトインアミナーゼであると考えられ、かつ２−ブタノールの生成において用いられうる。この群における他の酵素については異なる立体特異性を有しうる。
当業者は、種々の供給源から単離されるアセトインアミナーゼ活性を有するポリペプチドが本発明において配列相同性とは無関係に有用になることを理解するであろう。この活性の一例が本明細書中に記載され、配列番号１２２であることが同定されている。したがって、好ましいアセトインアミナーゼ酵素は、配列番号１２２に対して少なくとも８０％〜８５％の同一性を有するものであり、ここでは少なくとも８５％〜９０％の同一性がより好ましく、かつギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗのアラインメント法に基づくと少なくとも９５％の同一性が最も好ましい。
（ｄ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸へ
３−アミノ−２−ブタノール（ＩＩＩ）から３−アミノ−２−ブタノールリン酸塩（ＩＶ）への生成物の変換に対して基質を触媒する当該技術分野で既知の酵素は全く存在しない。しかし、数種のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種およびエルウィニア種が、窒素源としてのエタノールアミンまたは１−アミノ−２−プロパノールの利用を可能にするＡＴＰ依存性のエタノールアミンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．８２）を発現することが示されている（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら （１９７３年） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． １３４：１６７−１８２頁）。この酵素が３−アミノ−２−ブタノールに対する活性も有するかまたは同活性を有するように設計可能であることから、アミノブタノールキナーゼがもたらされる可能性が高い。本発明では、実施例１４でタンパク質（配列番号２４）をコードするエルウィニア・カロトボーラ・サブエスピー・アトロセプチカの遺伝子（配列番号１２３）が記載される。これは、アミノアルコールキナーゼとして同定されている。この酵素を用い、３−アミノ−２−ブタノールを３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸に変換することが可能である。
当業者は、種々の供給源から単離されるアミノブタノールキナーゼ活性を有するポリペプチドが本発明において配列相同性とは無関係に有用になることを理解するであろう。この活性の一例が本明細書中に記載され、配列番号１２４であることが同定されている。したがって、好ましいアミノブタノールキナーゼ酵素は、配列番号１２４に対して少なくとも８０％〜８５％の同一性を有するものであり、ここでは、少なくとも８５％〜９０％の同一性がより好ましく、かつギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗのアラインメント法に基づくと少なくとも９５％の同一性が最も好ましい。
（ｅ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸塩から２−ブタノンへ
３−アミノ−２−ブタノールリン酸塩（ＩＶ）の２−ブタノン（Ｖ）への生成物の変換に対する基質を触媒することが報告されている酵素は全く存在しないが、基質は少数のシュードモナス種およびエルウィニア種において見出されている、ピリドキサルリン酸依存性のホスホエタノールアミンホスホ−リアーゼ酵素によって用いられるものに酷似している。これらの酵素は、ホスホエタノールアミンおよび２−ホスホ−１−アミノプロパンの両鏡像異性体に対する活性を有し（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら （１９７３年） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． １３４：１６７−１８２頁）、かつ３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸に対する活性も有しうる。本明細書では、クラスＩＩＩアミノトランスフェラーゼに対して相同性を有するタンパク質（配列番号１２６）をコードするエルウィニア・カロトボーラ・サブエスピー・アトロセプチカの遺伝子（配列番号１２５）が同定される。実施例１５は、この酵素がアミノプロパノールリン酸塩およびアミノブタノールリン酸塩の基質の双方において活性があることを示す。新規に同定され特徴づけられた酵素は、（Ｒ）−３−アミノ−（Ｓ）−２−ブタノールと（Ｓ）−３−アミノ−（Ｒ）-２−ブタノールＯ−リン酸の混合物、および（Ｒ）−３−アミノ−（Ｒ）−２−ブタノールと（Ｓ）−３−アミノ−（Ｓ）−２−ブタノールＯ−リン酸の混合物の２−ブタノンへの変換を触媒することができた。新規に同定され特徴づけられた酵素は、（Ｒ）−２−アミノ−１−プロパノールリン酸塩および（Ｓ）−２−アミノ−１−プロパノールリン酸塩の双方（（Ｓ）−２−アミノ−１−プロパノールリン酸塩の方が好ましい）のプロパノンへの変換も触媒することができた。最も高い活性が提示された天然基質のＤＬ−１−アミノ−２−プロパノールリン酸塩の場合に観察され、それはプロピオンアルデヒドに変換された。
当業者は、種々の供給源から単離されるアミノブタノールリン酸ホスホリアーゼ活性を有するポリペプチドが本発明において配列相同性とは無関係に有用になることを理解するであろう。アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼ酵素の一例が、本明細書中で配列番号１２６として記載される。したがって、好ましいアミノブタノールリン酸ホスホリアーゼ酵素は、配列番号１２６に対して少なくとも８０％〜８５％の同一性を有するものであり、ここでは少なくとも８５％〜９０％の同一性がより好ましく、かつギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗのアラインメント法に基づくと少なくとも９５％の同一性が最も好ましい。
（ｆ）２−ブタノンから２−ブタノールへ
ピルビン酸から２−ブタノールを生成するための全経路における最終ステップが２−ブタノン（Ｖ）から２−ブタノール（ＶＩ）への還元である。生成物の変換に対するこの基質は、ブタノール脱水素酵素と称されうるアルコール脱水素酵素（酵素に応じ、水素化物の供給源としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかを利用するタイプ）の広範なクラスの一部のメンバーによって触媒される。２−ブタノンの還元を触媒する各タイプの酵素は、上記のブタノール脱水素酵素における定義において周知である。
当業者は、種々の供給源から単離されるブタノール脱水素酵素活性を有するポリペプチドが本発明において配列相同性とは無関係に有用になることを理解するであろう。適切なブタノール脱水素酵素のいくつかの例が、多数の供給源、例えばロドコッカス・ルバー［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＤ３６４７５（配列番号１４）、ＡＪ４９１３０７（配列番号１３）］から入手可能である。ＮＡＤＰ依存性酵素はＥＣ１．１．１．２として既知であり、例えばピロコッカス・フリオサス［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ２５５５６（配列番号９１）、ＡＦ０１３１６９（配列番号９０）］から入手可能である。さらに、ブタノール脱水素酵素が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１７４８４（配列番号７５）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号７４）］から入手可能であり、シクロヘキサノール脱水素酵素がアシネトバクター・エスピー（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＧ１００２６（配列番号７２）、ＡＦ２８２２４０（配列番号７１）］から入手可能である。好ましいブタノール脱水素酵素は、配列番号１４、９１、７５、および７２に対して少なくとも８０％〜８５％の同一性を有するものであり、ここでは少なくとも８５％〜９０％の同一性がより好ましく、かつギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗのアラインメント法に基づくと少なくとも９５％の同一性が最も好ましい。
経路２：
（ａ）ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ
生成物の変換に対するこの基質は経路１における上記のものと同様である。
（ｂ）α−アセト乳酸からアセトインへ
生成物の変換に対するこの基質は経路１における上記のものと同様である。
（ｇ）アセトインからホスホアセトインへ
アセトイン（ＩＩ）のホスホアセトイン（ＶＩＩ）への生成物の変換に対して基質を触媒する酵素が記載されていないが、基質であるアセトインの構造はジヒドロキシアセトンの構造に酷似していることから、アセトインはジヒドロキシアセトンのリン酸化を触媒する酵素であるジヒドロキシアセトンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．２９）に対して許容できる基質でありうる。酵素の基質特異性の改変におけるタンパク質工学技術は周知であり（アンチカイネン（Ａｎｔｉｋａｉｎｅｎ）およびマーチン（Ｍａｒｔｉｎ）（２００５年） Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． １３：２７０１−２７１６頁）、それを用い、要求される特異性を有する酵素の生成が可能である。この変換では、リン酸塩部分は任意の高エネルギーの生物学的リン酸供与体により供給可能であり、ここでの共通の基質はホスホエノールピルビン酸（大腸菌のジヒドロキシアセトンキナーゼなどの場合）およびＡＴＰ（シトロバクター・フロインディイのジヒドロキシアセトンキナーゼなどの場合）である（ガルシア−アレス（Ｇａｒｃｉａ−Ａｌｌｅｓ）ら（２００４年） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：１３０３７−１３０４５頁）。
（ｈ）ホスホアセトインから３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸へ
ホスホアセトイン（ＶＩＩ）から３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸（ＩＶ）への生成物の変換に対して基質を触媒する酵素についての記載がなされていないが、基質の構造は、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の一部の種におけるｒｔｘＡ遺伝子の５’部分によってコードされる提示されたセリノールリン酸アミノトランスフェラーゼにおける基質であるジヒドロキシアセトンリン酸の構造に酷似している（ヤスタ（Ｙａｓｕｔａ）ら、上記）。したがって、セリノールリン酸アミノトランスフェラーゼはこのステップにおいて機能的でありうる。
（ｅ）３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸から２−ブタノンへ
生成物の変換に対するこの基質は経路１における上記のものと同様である。
（ｆ）２−ブタノンから２−ブタノールへ
生成物の変換に対するこの基質は経路１における上記のものと同様である。
経路３：
（ａ）ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ
生成物の変換に対するこの基質は経路１における上記のものと同様である。
（ｂ）α−アセト乳酸からアセトインへ
生成物の変換に対するこの基質は経路１における上記のものと同様である。
（ｉ）アセトインから２，３−ブタンジオールへ
アセトイン（ＩＩ）から２，３−ブタンジオール（ＶＩＩＩ）への生成物の変換に対する基質は、還元時に還元等価物の供給源としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかを用いうるブタンジオール脱水素酵素により触媒されうる。アセトインに対する活性を有する酵素が、２，３−ブタンジオールを生成する、生物内の同化合物の生成のための経路に関与する。報告された酵素（例えば、クレブシエラ・ニューモニエ由来のＢｕｄＣ（ウイ（Ｕｉ）ら（２００４年） Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３９：５３３−５３７頁））は一般にＮＡＤＨを用いる。いずれかの共同因子がこの経路による２−ブタノールの生成における使用として許容できる。
（ｊ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへ
２，３−ブタンジオール（ＶＩＩＩ）から２−ブタノン（Ｖ）への生成物の変換に対する基質は、ジオールデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．２８）およびグリセロールデヒドラターゼ酵素（ＥＣ４．２．１．３０）により触媒されうる。最もよく特徴づけられたジオールデヒドラターゼは補酵素であるＢ１２依存性のクレブシエラ・オキシトカの酵素であるが、類似の酵素が多数の腸内細菌内に見出される。クレブシエラ・オキシトカの酵素は、基質としてメソ−２，３−ブタンジオールを許容し（バチョブチン（Ｂａｃｈｏｖｃｈｉｎ）ら（１９７７年） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６：１０８２−１０９２頁）、所望の生成物である２−ブタノンを生成することが示されている。実施例１７は、クレブシエラ・ニューモニエのグリセロールデヒドラターゼによりメソ−２，３−ブタンジオールを２−ブタノンに変換できたことを示している。クレブシエラ・ニューモニエのグリセロールデヒドラターゼの３つのサブユニット（α：配列番号１４５（コード領域）および１４６（タンパク質）；β：配列番号１４７（コード領域）および１４８（タンパク質）；ならびにγ：配列番号１４９（コード領域）および１５０（タンパク質））を、クレブシエラ・ニューモニエのグリセロールデヒドラターゼのレアクティバーゼ（ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ）の２つのサブユニット（大型サブユニット、配列番号１５１（コード領域）および１５２（タンパク質）；ならびに小型サブユニット、配列番号１５３（コード領域）および１５４（タンパク質））と併せて発現させることで活性がもたらされた。
クロストリジウム・グリコリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ）由来のＢ１２に独立性のジオールデヒドラターゼに関する文献においてもいくつかの報告がある（ハートマニス（Ｈａｒｔｍａｎｉｓ）ら、（１９８６年） Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２４５：１４４−１５２頁）。この酵素は２，３−ブタンジオールに対する活性を有し、この活性はエタンジオールに対する活性の１％未満であるが、酵素をその活性の改善を意図して設計することが可能である。より十分に特徴づけられたＢ１２に独立性のデヒドラクターゼがクロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）由来のグリセロールデヒドラターゼであり（オブライエン（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ）ら、（２００４年） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：４６３５−４６４５頁）、それは１，２−プロパンジオールおよびグリセロールに対して高い活性を有する。この酵素はアデノシル基の供給源としてＳ−アデノシルメチオニンを用いている。２，３−ブタンジオールに対する活性についての報告は全くないが、かかる活性は既存でない場合に設計可能であると思われる。
（ｆ）２−ブタノンから２−ブタノールへ
生成物の変換に対するこの基質は経路１における上記のものと同様である。
経路４：
（ａ） ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ
生成物の変換に対するこの基質は経路１における上記のものと同様である。
（ｋ）α−アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシ−２−メチル酪酸へ
アセト乳酸塩（Ｉ）から２，３−ジヒドロキシ−２−メチル酪酸（ＩＸ）への生成物の変換に対する基質は当該技術分野で未知である。しかし、この変換の生成物は発酵液の成分として報告されているが（ジアディ（Ｚｉａｄｉ）ら、（１９７３年）「Ｃｏｍｐｔｅｓ Ｒｅｎｄｕｓ ｄｅｓ Ｓｅａｎｃｅｓ ｄｅ ｌ’Ａｃａｄｅｍｉｅ ｄｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｅｒｉｅ Ｄ：Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｎａｔｕｒｅｌｌｅｓ」 ２７６：９６５−８頁）、形成の機序は未知である。有望な形成の機序は、アセト乳酸塩の電子供与体としてのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨによる還元である。２−ブタノールの生成におけるこの経路を用いるため、この反応を触媒する酵素が同定または設計される必要がある。しかし、ケトンからアルコールへの酵素還元における先行技術は十分に確立されている。
（ｌ）２，３−ジヒドロキシ−２−メチル酪酸から２−ヒドロキシ−２−メチル−３−ホスホブタン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）へ
２，３−ジヒドロキシ−２−メチル酪酸（ＩＸ）から２−ヒドロキシ−２−メチル−３−ホスホブタン酸（Ｘ）への生成物の変換に対して基質を触媒する既知の酵素は全く存在しない。しかし、天然には様々な特異性を有する多数のキナーゼが存在する。したがって、酵素がこの活性を用いて単離または設計されうる可能性が高い。
（ｍ）２−ヒドロキシ−２−メチル−３−ホスホブタン酸から２−ブタノンへ
２−ヒドロキシ−２−メチル−３−ホスホブタン酸（Ｘ）から２−ブタノン（Ｖ）への生成物の変換に対して基質を触媒する既知の酵素は全く存在しない。この反応と先の反応との組み合わせはメバロン酸５−ピロリン酸（Ｍ５ＰＰ）デカルボキシラーゼにより触媒される多段階ステップの反応に酷似し、それはＭ５ＰＰから３−ホスホメバロン酸５−ＰＰへの初期リン酸化と、それに続くリン酸塩の脱炭酸化依存性の除去からなる（アルベア（Ａｌｖｅａｒ）ら、（１９８２年） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：４６４６−４６５０頁）。
（ｆ）２−ブタノンから２−ブタノールへ
生成物の変換に対するこの基質は経路１における上記のものと同様である。
したがって、ピルビン酸塩から２−ブタノールへの複数の組換え経路を提供する上で個々の変換ステップを実行するための多数の選択肢が存在し、当業者は公的に使用可能な配列および本明細書中に開示される配列を使用して関連経路を構築することができるであろう。当該技術分野で既知でありかつ２−ブタノール生合成経路の構築において有用な遺伝子の代表的番号のリストが上記の表１および２に示される。
２−ブタノールおよび２−ブタノンの生成における微生物宿主
２−ブタノールまたは２−ブタノンの生成における微生物宿主が、細菌、シアノバクテリア（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、糸状菌および酵母から選択されうる。２−ブタノールまたは２−ブタノンの生成において用いられる微生物宿主は、収量が生成される生成物の宿主に対する毒性により制限されないように、生成物に対して耐性を有する必要がある。２−ブタノールの生成における微生物宿主の選択が下記に詳細に記載される。同様の基準が、２−ブタノンの生成における宿主の選択に適用される。
２−ブタノールの高い滴定レベルで代謝活性のある微生物については当該技術分野で周知である。ブタノールに耐性がある突然変異体がソルベントジェニック（ｓｏｌｖｅｎｔｏｇｅｎｉｃ）のクロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）から単離されているが、他の潜在的に有用な細菌株のブタノール耐性に関して入手可能な情報はほとんどない。細菌におけるアルコール耐性の比較についての大部分の研究によると、ブタノールがエタノールよりも毒性が高いことが示唆されている（デ・カバリョ（ｄｅ Ｃａｖａｌｈｏ）ら、Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ． ６４：２１５−２２頁（２００４年）およびカベリッツ（Ｋａｂｅｌｉｔｚ）ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ． ２２０：２２３−２２７頁（２００３年））。トマス（Ｔｏｍａｓ）ら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２００６−２０１８頁（２００４年））は、クロストリジウム・アセトバティリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）における発酵の間での１−ブタノールの収量がブタノール毒性により制限されうることを報告している。クロストリジウム・アセトバティリカムに対する１−ブタノールの主な効果は膜機能の破壊である（ヘルマン（Ｈｅｒｍａｎｎ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５０：１２３８−１２４３頁（１９８５年））。
２−ブタノールの生成において選択される微生物宿主は、２−ブタノールに対して耐性があり、かつ導入された生合成経路を用いて炭水化物を２−ブタノールに変換可能である必要がある。適切な微生物宿主の選択における基準は、２−ブタノールに対する本質的な耐性、高率の炭水化物の利用、遺伝子操作における遺伝子ツールの利用可能性、および安定な染色体改変をもたらす能力を含む。
２−ブタノールに対する耐性を有する適切な宿主株が、株の本質的耐性に基づくスクリーニングにより同定されうる。２−ブタノールに対する微生物の本質的耐性は、最少培地内で成長する場合、成長率の５０％の阻害（ＩＣ５０）を担う２−ブタノールの濃度を判定することにより測定されうる。ＩＣ５０値は当該技術分野で既知の方法を用いて判定可能である。例えば、目的の微生物は様々な量の２−ブタノールの存在下で成長可能であり、成長率が６００ナノメーターでの光学密度の測定により監視可能である。倍加時間は、成長曲線の対数部分から計算可能であり、成長率の測定値として使用可能である。成長の５０％の阻害をもたらす２−ブタノールの濃度は、成長の阻害率パーセント対２−ブタノール濃度のグラフから判定可能である。好ましくは、宿主株は約０．５％を超える２−ブタノールにおいてＩＣ５０を有する必要がある。約１．５％を超える２−ブタノールにおけるＩＣ５０を有する宿主株がより適切である。約２．５％を超える２−ブタノールにおけるＩＣ５０を有する宿主株が特に適切である。
２−ブタノールの生成における微生物宿主は、グルコースおよび／または他の炭水化物も高率で利用する必要がある。大部分の微生物が炭水化物を使用可能である。しかし、特定の環境微生物については炭水化物を効率的に使用できず、それ故に適切な宿主にならないことになる。
宿主を遺伝的に改良する能力は組換え微生物の生成にとって必須である。利用可能な遺伝子導入技術は、エレクトロポレーション、複合、形質導入または自然形質転換を含む。広範囲の宿主との複合プラスミドおよび薬剤耐性マーカーが使用可能である。生物で用いられるクローニングベクターは、宿主生物内で機能しうる抗生物質耐性マーカーの性質に基づいて宿主生物に適合される。
微生物宿主はまた、様々な遺伝子の不活性化により炭素フローにおける競合経路を不活性化するように操作されうる。これには不活化を誘導するためのトランスポゾンまたは染色体組込みベクターのいずれかが使用できることが求められる。さらに、化学的突然変異誘発に従順な生成宿主が、化学的突然変異誘発および突然変異体のスクリーニングを通じて本質的な２−ブタノールの耐性における改善を受ける可能性がある。
上記の基準に基づき、２−ブタノールおよび２−ブタノンの生成に適する微生物宿主は、限定はされないが、クロストリジウム属、ザイモモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、バチルス属、乳酸桿菌属、腸球菌属、ペディオコッカス属、アルカリゲネス属、クレブシエラ属、パエニバチルス属、アースロバクター属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ピキア属、カンジダ属、ハンセヌラ属およびサッカロミセス属のメンバーを含む。好ましい宿主は、大腸菌、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、プランタラム菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナリウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、枯草菌およびサッカロミケスセレビシエを含む。
生成宿主の作成
２−ブタノールまたは２−ブタノンに対する発酵性炭素基質の変換における酵素経路をコードする必須遺伝子を有する組換え生物が、当該技術分野で周知の技術を用いて作成可能である。本発明では、２−ブタノール生合成経路１：アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、アセトインアミナーゼ（またはアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ、およびブタノール脱水素酵素；またはブタノール脱水素酵素を除外した２−ブタノン生合成経路１における酵素をコードする遺伝子が、上記の様々な供給源から単離されうる。
細菌ゲノムから所望の遺伝子を得る方法については一般的であり、かつ分子生物学の技術分野で周知である。例えば、遺伝子の配列が既知である場合、プライマーを設計し、所望の配列をポリメラーゼ連鎖反応などの標準のプライマー特異的増幅方法（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）を用いて増幅することで、発現ベクターへのクローニングに対して適量のＤＮＡを得ることが可能である。既知の配列に対して異種の遺伝子が単離されることになる場合、適切なゲノムライブラリーが制限エンドヌクレアーゼ消化により生成され、所望の遺伝子配列に対して相補配列を有するプローブを用いてスクリーニングされうる。一旦配列が単離されると、ＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応などの標準のプライマー特異的増幅方法（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）を用いて増幅することで発現ベクターへのクローニングに対して適量のＤＮＡを得ることが可能であり、それは次いで適切な宿主細胞に形質転換される。
さらに、所望の酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を仮定すると、コード配列はタンパク質配列を逆翻訳することにより確認されうる。コード配列を有するＤＮＡ断片が、合成的に調製され、発現ベクターにクローニングされ、次いで所望の宿主細胞に形質転換されうる。
コード配列を有する合成ＤＮＡ断片の調製においては、この配列は標的の宿主細胞内での発現において最適化されうる。異種宿主内での発現におけるコドン最適化のためのツールは容易に利用可能である。利用可能なコドン最適化のためのツールには、宿主生物のＧＣ含量に基づくものもある。一部の典型的な微生物宿主のＧＣ含量が表３に示される。
Figure 2009535062
一旦、関連経路の遺伝子が同定されかつ単離されると、それらは当該技術分野で周知の手段により適切な発現宿主に形質転換されうる。種々の宿主細胞の形質転換にとって有用なベクターについては一般的であり、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）（カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（カリフォルニア州ラホヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ））、およびニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）（マサチューセッツ州ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ））などの企業から市販されている。典型的には、ベクターは、選択可能マーカーおよび所望の宿主内での自己複製または染色体組込みを可能にする配列を有する。さらに、適切なベクターは転写開始制御を内在するプロモーター領域および転写終結制御領域を含み、それらの間にコード領域のＤＮＡ断片が挿入されることで挿入されたコード領域の発現がもたらされうる。両方の制御領域は形質転換された宿主細胞に対して相同な遺伝子から誘導されうるが、かかる制御領域が生成宿主として選択される特定の種に対して天然でない遺伝子からも誘導されることが理解されるべきである。
所望の宿主細胞内でのコード領域の関連経路の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターについては極めて多数存在し、当業者には知られている。限定はされないが、以下の遺伝子、すなわちＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ、ＣＵＰ１、ＦＢＡ、ＧＰＤ、およびＧＰＭ（サッカロミセスにおける発現に有用）；ＡＯＸ１（ピキアにおける発現に有用）から誘導されるプロモーター；ならびにｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ＩＰＬ、ＩＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃプロモーター（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス、およびシュードモナスにおける発現に有用）；ａｍｙ、ａｐｒ、およびｎｐｒプロモーター、ならびに枯草菌、バチルス・リケニフォルミス、およびパエニバチルス・マセランスにおける発現に有用な様々なファージプロモーター；ｎｉｓＡ（グラム陽性菌における発現に有用、エイケンバウム（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６４（８）：２７６３−２７６９頁（１９９８年））；ならびに合成Ｐ１１プロモーター（プランタラム菌における発現に有用、ルド（Ｒｕｄ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５２：１０１１−１０１９頁（２００６年））を含む、これらの遺伝的因子を駆動可能な事実上任意のプロモーターが本発明にとって適切である。
終結制御領域についても好ましい宿主に対して天然の様々な遺伝子から誘導されうる。場合により終結部位は不要でありうるが、含められる場合が最も好ましい。
特定のベクターが広範囲の宿主細菌内で複製可能であり、かつ複合により導入可能である。ｐＲＫ４０４および３つの関連ベクター：ｐＲＫ４３７、ｐＲＫ４４２、およびｐＲＫ４４２（Ｈ）の完全でかつアノテートされた配列が利用可能である。これらの誘導体はグラム陰性菌における遺伝子操作にとって有用なツールであることが判明している（スコット（Ｓｃｏｔｔ）ら、Ｐｌａｓｍｉｄ ５０（１）：７４−７９頁（２００３年））。広範な宿主範囲のＩｎｃ Ｐ４プラスミドＲＳＦ１０１０における数種のプラスミド誘導体についても、グラム陰性菌の範囲内で機能しうるプロモーターとともに利用可能である。プラスミドｐＡＹＣ３６およびｐＡＹＣ３７が複数のクローニング部位とともに活性プロモーターを有し、グラム陰性菌内での異種の遺伝子発現が可能である。
染色体遺伝子の置換ツールもまた幅広く利用可能である。例えば、広範な宿主範囲のレプリコンｐＷＶ１０１の感熱性の変異体を改良し、遺伝子置換をグラム陽性菌の範囲内で有効にするのに用いられうるプラスミドｐＶＥ６００２が作成されている（マグイン（Ｍａｇｕｉｎ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７４（１７）：５６３３−５６３８頁（１９９２年））。さらに、インビトロではトランスポゾンがＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）などの商業的供給元から入手可能であり、それから種々のゲノム内でランダム変異体が生成される。
様々な好ましい微生物宿主内での２−ブタノール生合成経路の発現は下記により詳細に記載される。２−ブタノン生合成経路の発現においては同様の記載が適用されるが、２−ブタノンから２−ブタノールへの生成物の変換における最終の基質は除かれる。
大腸菌内での２−ブタノールまたは２−ブタノン生合成経路の発現
大腸菌の形質転換にとって有用なベクターについては一般的であり、先に挙げた企業から市販されている。例えば、２−ブタノール生合成経路の遺伝子は、実施例６および７に記載のように、上記の様々な供給源から単離され、改良されたｐＵＣ１９ベクター上にクローニングされ、かつ大腸菌ＮＭ５２２に形質転換されうる。あるいは、２−ブタノール生合成経路をコードする遺伝子は、実施例９、１０、および１１に記載のように、複数のオペロンに分けられ、発現ベクター上にクローニングされ、かつ様々な大腸菌株に形質転換されうる。２−ブタノン生合成経路は同様に発現可能であり、ブタノール脱水素酵素は除かれる。
ロドコッカス・エリスロポリス内での２−ブタノールまたは２−ブタノン生合成経路の発現
限定はされないがｐＲｈＢＲ１７およびｐＤＡ７１を含むロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）内での発現においては、一連の大腸菌−ロドコッカスのシャトルベクターが使用可能である（コスティッカ（Ｋｏｓｔｉｃｈｋａ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６２：６１−６８頁（２００３年））。さらにロドコッカス・エリスロポリス内での異種の遺伝子発現においては、一連のプロモーターが使用可能である（例えば、ナカシマ（Ｎａｋａｓｈｉｍａ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７０：５５５７−５５６８頁（２００４年）、およびタオ（Ｔａｏ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５年、ＤＯＩ１０．１００７／ｓ００２５３−００５−００６４を参照）。ロドコッカス・エリスロポリスの染色体遺伝子における標的遺伝子の破壊が、タオ（Ｔａｏ）ら、上記、およびブランズ（Ｂｒａｎｓ）ら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６６：２０２９−２０３６頁（２０００年））で記載の方法を用いてもたらされうる。
上記の２−ブタノールの生成において必要とされる異種遺伝子は、最初にｐＤＡ７１またはｐＲｈＢＲ７１にクローニングされ、大腸菌に形質転換されうる。次いでベクターは、コスティッカ（Ｋｏｓｔｉｃｈｋａ）ら、上記に記載のようにエレクトロポレーションによりロドコッカス・エリスロポリスに形質転換されうる。組換え体は、グルコースを含有する合成培地内で成長され、それに続いて２−ブタノールの生成が当該技術分野で既知の発酵方法を用いて行われうる。２−ブタノン生合成経路は同様に発現可能であり、ブタノール脱水素酵素は除かれる。
枯草菌内での２−ブタノールまたは２−ブタノン生合成経路の発現
枯草菌内での遺伝子発現および変異体の生成のための方法もまた当該技術分野で周知である。例えば、２−ブタノール生合成経路の遺伝子は、実施例８に記載のように、上記の様々な供給源から単離され、改良された大腸菌−バチルスのシャトルベクターにクローニングされ、かつ枯草菌ＢＥ１０１０に形質転換されうる。所望の遺伝子は、バチルスの発現ベクターにクローニングされ、株に形質転換されることで生成宿主が作製されうる。あるいは、遺伝子は、当業者に既知の条件付きのレプリコンまたは自殺ベクターを用いてバチルスの染色体に組み込まれうる。例えば、バチルス・ジェネティック・ストック・センター（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）は極めて多数の組込みベクターを有している。２−ブタノン生合成経路は同様に発現可能であり、ブタノール脱水素酵素は除かれる。
バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）内での２−ブタノールまたは２−ブタノン生合成経路の発現
枯草菌内で複製するプラスミドおよびシャトルベクターの大部分を用い、プロトプラスト形質転換またはエレクトロポレーションのいずれかによりバチルス・リケニフォルミスの形質転換が可能である。２−ブタノールの生成において必要とされる遺伝子をプラスミドのｐＢＥ２０またはｐＢＥ６０誘導体にクローニング可能である（ナガラジャン（Ｎａｇａｒａｊａｎ）ら、Ｇｅｎｅ １１４：１２１−１２６頁（１９９２年））。バチルス・リケニフォルミスを形質転換するための方法が当該技術分野で既知である（例えばフレミング（Ｆｌｅｍｉｎｇ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６１（１１）：３７７５−３７８０頁（１９９５年）を参照）。枯草菌内での発現のために作製されたプラスミドをバチルス・リケニフォルミスに形質転換することで、２−ブタノールを生成する組換え微生物宿主の生成が可能である。２−ブタノン生合成経路は同様に発現可能であり、ブタノール脱水素酵素は除かれる。
パエニバチルス・マセランス内での２−ブタノールまたは２−ブタノン生合成経路の発現
プラスミドを、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内での発現にて記載のように作製し、それを用いてパエニバチルス・マセランスをプロトプラスト形質転換により形質転換し、２−ブタノールを生成する組換え微生物宿主を生成することが可能である。２−ブタノン生合成経路は同様に発現可能であり、ブタノール脱水素酵素は除かれる。
アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ））ユートロファス（ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）内での２−ブタノールまたは２−ブタノン生合成経路の発現
アルカリゲネス・ユートロファス内での遺伝子発現および変異体の生成のための方法は当該技術分野で既知である（例えばタガビ（Ｔａｇｈａｖｉ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６０（１０）：３５８５−３５９１頁（１９９４年）を参照）。２−ブタノール生合成経路における遺伝子を、上記の広範な宿主範囲のベクターのいずれかにクローニングし、アルカリゲネス・ユートロファスにエレクトロポレートすることで２−ブタノールを生成する組換え体を生成することが可能である。アルカリゲネス内でのポリ（ヒドロキシ酪酸）経路は詳細な記載がなされており、アルカリゲネス・ユートロファスのゲノムを改良するための種々の遺伝子技術が既知であり、それらのツールは２−ブタノール生合成経路の設計において適用されうる。２−ブタノン生合成経路は同様に発現可能であり、ブタノール脱水素酵素は除かれる。
シュードモナス・プチダ内での２−ブタノールまたは２−ブタノン生合成経路の発現
シュードモナス・プチダ内での遺伝子発現のための方法は当該技術分野で既知である（例えば、参照により本明細書中に援用されるベン−バサット（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ）ら、米国特許第６，５８６，２２９号明細書を参照）。２−ブタノール生合成経路の遺伝子をｐＰＣＵ１８に挿入し、このライゲートされたＤＮＡをエレクトロコンピテントなシュードモナス・プチダのＤＯＴ−Ｔ１ Ｃ５ａＡＲ１細胞にエレクトロポレートすることで２−ブタノールを生成する組換え体を生成することが可能である。２−ブタノン生合成経路は同様に発現可能であり、ブタノール脱水素酵素は除かれる。
プランタラム菌内での２−ブタノールまたは２−ブタノン生合成経路の発現
乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属はラクトバチルス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）の科に属し、かつ枯草菌および連鎖球菌の形質転換で用いられる多数のプラスミドおよびベクターが乳酸桿菌において用いられうる。適切なベクターの非限定例には、ｐＡＭβ１およびその誘導体（ルノー（Ｒｅｎａｕｌｔ）ら、Ｇｅｎｅ １８３：１７５−１８２頁（１９９６年）；およびオサリバン（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら、Ｇｅｎｅ １３７：２２７−２３１頁（１９９３年））；ｐＭＢＢ１およびｐＨＷ８００、ｐＭＢＢ１の誘導体（ウィコッフ（Ｗｙｃｋｏｆｆ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６２：１４８１−１４８６頁（１９９６年））；ｐＭＧ１、複合プラスミド（タニモト（Ｔａｎｉｍｏｔｏ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８４：５８００−５８０４頁（２００２年））；ｐＮＺ９５２０（クレールベゼム（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６３：４５８１−４５８４頁（１９９７年））；ｐＡＭ４０１（フジモト（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：１２６２−１２６７頁（２００１年））；ならびにｐＡＴ３９２（アーサー（Ａｒｔｈｕｒ）ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ３８：１８９９−１９０３頁（１９９４年））が含まれる。プランタラム菌由来の数種のプラスミドが報告されている（ヴァン・クラネンバーグ（ｖａｎ Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７１（３）：１２２３−１２３０頁（２００５年））。
２−ブタノール生合成経路における様々な遺伝子は、上記のベクターなどの任意の適切なベクターに構築可能である。コドンは、プランタラム菌またはラクトバチルス・アリゾネンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｉｚｏｎｅｎｓｉｓ）のゲノム配列から推定されるコドンインデックス（ｃｏｄｏｎ ｉｎｄｅｘ）に基づいて発現のために最適化されうる。プラスミドは、当該技術分野で既知の方法、例えばエレクトロポレーション（クルス−ロッズ（Ｃｒｕｚ−Ｒｏｄｚ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２２４：１２５２−１５４頁（１９９０年）、ブリンゲル（Ｂｒｉｎｇｅｌ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３３：６６４−６７０頁（１９９０年）、アレグレ（Ａｌｅｇｒｅ）ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ２４１：７３−７７頁（２００４年））、および複合（シュラゴ（Ｓｈｒａｇｏ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５２：５７４−５７６（１９８６年））を用いて宿主細胞に導入可能である。２−ブタノール生合成経路の遺伝子はまた、組込みベクターを用いて乳酸桿菌の染色体に組込み可能である（ホルス（Ｈｏｌｓ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６０：１４０１−１４０３頁（１９９０年）、ジャン（Ｊａｎｇ）ら、Ｍｉｃｒｏ．Ｌｅｔｔ． ２４：１９１−１９５（２００３年））。２−ブタノン生合成経路は同様に発現可能であり、ブタノール脱水素酵素は除かれる。
エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・ガリナリウム、およびエンテロコッカス・フェカーリスにおける２−ブタノールまたは２−ブタノン生合成経路の発現
腸球菌属はラクトバチルス目の科に属し、かつ上記の乳酸桿菌、枯草菌、および連鎖球菌の形質転換において用いられる多数のプラスミドおよびベクターが腸球菌において用いられうる。ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来のｎｉｓＡ遺伝子を用いたエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）における発現ベクターも用いられうる（エイケンバウム（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６４：２７６３−２７６９頁（１９９８年））。さらに、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の染色体における遺伝子置換用のベクターが用いられうる（ナラーパレディ（Ｎａｌｌａａｐａｒｅｄｄｙ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７２：３３４−３４５頁（２００６年））。
２−ブタノール生合成経路における様々な遺伝子は、上記のベクターなどの任意の適切なベクターに構築可能である。コドンは、エンテロコッカス・フェカーリスまたはエンテロコッカス・フェシウムのゲノム配列から推定されるコドンインデックスに基づいて発現のために最適化されうる。プラスミドは、当該技術分野で既知の方法、例えばクルス−ロッズ（Ｃｒｕｚ−Ｒｏｄｚ）ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２２４：１２５２−１５４頁（１９９０年））に記載のエレクトロポレーションまたはタニモト（Ｔａｎｉｍｏｔｏ）ら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８４：５８００−５８０４頁（２００２年））およびグローマン（Ｇｒｏｈｍａｎｎ）ら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ． ６７：２７７−３０１頁（２００３年））に記載の複合を用いて宿主細胞に導入可能である。２−ブタノン生合成経路は同様に発現可能であり、ブタノール脱水素酵素は除かれる。
ペディオコッカス・ペントサセウスおよびペディオコッカス・アシディラクティシにおける２−ブタノールまたは２−ブタノン生合成経路の発現
ペディオコッカス属はラクトバチルス目の科に属し、かつ上記の枯草菌および連鎖球菌の形質転換で用いられる多数のプラスミドおよびベクターがペディオコッカスにおいて用いられうる。適切なベクターの非限定例には、ｐＨＰＳ９（バクチヤロヴァ（Ｂｕｋｈｔｉｙａｒｏｖａ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６０：３４０５−３４０８頁（１９９４年））が含まれる。ペディオコッカス由来の数種のプラスミドが報告されている（アレグレ（Ａｌｅｇｒｅ）ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ． ２５０：１５１−１５６頁（２００５年）；シャレック（Ｓｈａｒｅｃｋ）ら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２４：１５５−２０８頁（２００４年））。
２−ブタノール生合成経路における遺伝子は、上記のベクターなどの任意の適切なベクターに構築可能である。コドンは、ペディオコッカス・ペントサセウスのゲノム配列から推定されるコドンインデックスに基づいて発現のために最適化されうる。プラスミドは、当該技術分野で既知の方法、例えばエレクトロポレーション（例えばオスマナガオグル（Ｏｓｍａｎａｇａｏｇｌｕ）ら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４０：２３３−２４１頁（２０００年）；アレグレ（Ａｌｅｇｒｅ）ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ． ２５０：１５１−１５６頁（２００５年）を参照）ならびに複合（ゴンザレス（Ｇｏｎｚａｌｅｚ）およびクンカ（Ｋｕｎｋａ）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４６：８１−８９頁（１９８３年））を用いて宿主細胞に導入可能である。２−ブタノール生合成経路の遺伝子はまた、組込みベクターを用いてペディオコッカスの染色体に組込み可能である（ダヴィッドソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）ら、Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ ７０：１６１−１８３頁（１９９６年））。２−ブタノン生合成経路は同様に発現可能であり、ブタノール脱水素酵素は除かれる。
発酵培地
本発明における発酵培地は、適切な炭素基質を含有する必要がある。適切な基質が、限定はされないが、グルコースおよびフルクトースなどの単糖、乳糖またはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンまたはセルロースなどの多糖、あるいはそれらの混合物、ならびに乳清透過液、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ）、砂糖液（ｓｕｇａｒ ｂｅｅｔ ｍｏｌａｓｓｅｓ）、および大麦モルト（ｂａｒｌｅｙ ｍａｌｔ）などの再生可能な原料由来の未精製混合物を含みうる。さらに、炭素基質はまた二酸化炭素または主要な生化学的中間体への代謝変換が実証されているメタノールなどの１炭素基質でありうる。メチロトローフ（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）生物が、１炭素基質および２炭素基質に加え、メチルアミン、グルコサミンおよび代謝活性における種々のアミノ酸などの化合物を含有する他の多数の炭素を用いることでも知られている。例えば、メチロトローフ酵母がメチルアミン由来の炭素を用いてトレハロースまたはグリセロールを形成することで知られている（ベリオン（Ｂｅｌｌｉｏｎ）ら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｄ．、［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］、７ｔｈ（１９９３年）、４１５−３２頁、マレル Ｊ．コリン（Ｍｕｒｒｅｌｌ Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ）；ケリー・ドン Ｐ．（Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ Ｐ．）編、英国アンドーバー（Ａｎｄｏｖｅｒ）のインターセプト（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）発行）。同様に、カンジダの様々な種がアラニンまたはオレイン酸を代謝することになる（サルター（Ｓｕｌｔｅｒ）ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １５３：４８５−４８９頁（１９９０年））。それ故、本発明で用いられる炭素源が基質を有する多種多様な炭素を包含する場合があり、生物の選択によってのみ限定されうると考えられる。
上記の炭素基質およびそれらの混合物のすべてが本発明において適切であると考えられるが、好ましい炭素基質は、グルコース、フルクトース、およびスクロース、ならびにこれらの糖類のいずれかの混合物である。スクロースは、サトウキビ、甜菜、キャッサバ、およびさとうもろこし（Ｓｗｅｅｔ ｓｏｒｇｈｕｍ）などの原料から得られうる。グルコースおよびデキストロースは、とうもろこし、小麦、ライムギ、大麦、およびオートなどのデンプンベースの穀物を含む原料の糖化を通じて得られうる。
さらに、発酵性糖が、セルロース系およびリグノセルロース系のバイオマスから、例えば共同所有および同時係属の米国特許出願第２００７００３１９１８Ａ１号明細書（参照により本明細書中に援用される）中に記載の前処理および糖化のプロセスを通じて得られうる。バイオマスは、任意のセルロース系またはリグノセルロース系の原料を示し、セルロースを含有し、かつ場合により、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖および／または単糖をさらに含有する原料を含む。バイオマスは、追加成分、例えばタンパク質および／または脂質も含有しうる。バイオマスは単一の供給源から誘導されうるか、またはバイオマスは２つ以上の供給源から誘導される混合物を含有しうる。バイオマスは、例えばトウモロコシ穂軸（ｃｏｒｎ ｃｏｂ）およびコーンストーバーの混合物または草および葉の混合物を含有しうる。バイオマスは、限定はされないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、地方自治体の固体廃棄物、産業固体廃棄物、製紙から排出される汚泥、庭ごみ、廃材および林業廃棄物を含む。バイオマスの例として、限定はされないが、トウモロコシ粒、トウモロコシ穂軸、トウモロコシの皮などのトウモロコシ残渣、コーンストーバー、草、小麦、麦かん（ｗｈｅａｔ ｓｔｒａｗ）、大麦、麦かん（ｂａｒｌｅｙ ｓｔｒａｗ）、干し草、稲わら、スイッチグラス、紙くず、サトウキビバガス、サトウモロコシ、大豆、穀物、木、枝、根、葉、木片、おがくず、シュラブおよびブッシュのミリングから得られる成分、野菜、果物、花ならびに家畜糞尿が挙げられる。
発酵培地は、適切な炭素源に加え、２−ブタノールまたは２−ブタノンの生成に必要な培養物の成長および酵素経路の促進に適する、当業者に既知の、適切なミネラル、塩、共同因子、緩衝液および他の成分を含有する必要がある。
培養条件
典型的には細胞が、適切な培地内、約２５℃〜約４０℃の範囲内の温度で成長される。本発明における適切な成長培地は、ルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培養液、サブロー・デキストロース（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）（ＳＤ）培養液または酵母培地（ＹＭ）の培養液などの一般的な商業的に調製された培地である。他の限定または合成された成長培地が用いられる場合があり、かつ特定の微生物の成長に適した培地について微生物学または発酵科学に関する当業者は知っているであろう。異化代謝産物抑制を直接的または間接的に調節することで知られる作用物質、例えば環状アデノシン２’：３’一リン酸の使用についても発酵培地内に取り込まれうる。
発酵に適するｐＨ範囲はｐＨ５．０〜ｐＨ９．０であり、初期条件としてはｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が好ましい。
発酵は好気性または嫌気性条件下で実施可能であり、嫌気性または微好気性条件が好ましい。
工業用バッチおよび連続発酵
本プロセスには、発酵のバッチ方法が用いられる。従来のバッチ発酵は、培地の組成物が発酵開始時に設定され、発酵の間に人工的な改変が施されることがない閉鎖系である。したがって、発酵開始時に培地に望ましい生物が接種され、系に何も添加しなくても発酵の生成が可能である。しかし、典型的には「バッチ」発酵は炭素源の添加に関連したバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの要素を制御する試みがなされることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物およびバイオマス組成物は、最大で発酵が停止する時間まで常時変化する。バッチ培養物内では、細胞が、変化のない誘導期（ｌａｇ ｐｈａｓｅ）から高成長の対数期（ｌｏｇ ｐｈａｓｅ）、最終的に成長率が減少または停止する定常期（ｓｔａｔｉｏｎａｙ ｐｈａｓｅ）にかけて抑制される。定常期における細胞が、未処理の場合、最終的に死滅することになる。対数期における細胞が、一般に最終生成物または中間体の生成の大部分に関与する。
標準のバッチシステムに対する変形がフェドバッチシステムである。フェドバッチ発酵プロセスは本発明においても適切であり、基質が発酵プロセスごとに添加されること以外では典型的なバッチシステムを含む。フェドバッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合や培地内に限られた量の基質を有することが望ましい場合に有用である。フェドバッチシステム内での実際の基質濃度の測定は困難であることから、それはｐＨ、溶解酸素およびＣＯ２などの排ガスの分圧などの測定可能な要素の変化に基づいて評価される。バッチおよびフェドバッチ発酵は一般的で、当該技術分野で周知であり、例がトーマス Ｄ．（Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．）「Ｂｒｏｃｋｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版（１９８９年） マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）のシナウアー・アソシエーツ（Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）またはデシュパンデ・ムクンド Ｖ．（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：２２７頁（１９９２年）（参照により本明細書中に援用される）において見出されうる。
本発明はバッチモードで実施されるが、本方法は連続発酵方法に適合可能であろうことが考えられる。連続発酵は、限定された発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加されかつ等量の条件培地が処理と同時に除去される場合の開放系である。連続発酵では、一般に一定の高密度で培養物が維持される。
連続発酵では、細胞成長または最終生成物濃度に作用する１つの要素またはいくつかの要素の調節が可能になる。例えば、１つの方法では、炭素源などの限られた栄養素または一定速度での窒素レベルが維持され、あらゆる他のパラメータの抑制が可能になる。他のシステムでは、培地の濁度により測定される細胞濃度が一定に保持される間、成長に作用する多数の要素を連続的に改変することが可能である。連続システムでは、恒常的成長条件を維持するように試みることで、培地の除去（ｄｒａｗｎ ｏｆｆ）に起因する細胞欠損を発酵における細胞成長率に対して均衡させなければならない。連続発酵プロセス用の栄養素および成長因子を調節する方法ならびに生成物形成の速度を最大化するための技術については産業微生物学における当該技術分野で周知であり、かつ種々の方法がＢｒｏｃｋ、上記で詳述されている。
本発明がバッチ、フェドバッチまたは連続プロセスのいずれかを用いて実施可能であり、かつ発酵における既知のモードであればいずれであっても適することが考えられる。さらに、細胞が細胞触媒全体として基質上に固定化され、かつ２−ブタノールまたは２−ブタノンの生成における発酵条件に従いうることが考えられる。
２−ブタノールおよび２−ブタノンを発酵培地から単離するための方法
生物学的に生成された２−ブタノールは、ＡＢＥ発酵における当該技術分野で既知の方法を用いて発酵培地から単離されうる（例えば、デュレ（Ｄｕｒｒｅ）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６３９−６４８頁（１９９８年）、グルート（Ｇｒｏｏｔ）ら、Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６１−７５頁（１９９２年）、およびその中の参考文献を参照）。例えば、固体が遠心分離、濾過、デカンテーション、または同様のものにより発酵培地から除去されうる。次いで、２−ブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液体−液体抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、または浸透気化法などの方法を用いて発酵培地から単離されうる。これらの同じ方法は、生物学的に生成された２−ブタノンの発酵培地からの単離に適合しうる。
本発明はさらに以下の実施例にて定義される。これらの実施例が本発明の好ましい実施形態を示す一方であくまで例示目的で与えられることは理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴により、その趣旨および範囲から逸脱することなく本発明に対して様々な変更および改良を行うことで、本発明の様々な利用および条件への適合が可能であることが確認できる。
一般的方法
実施例に記載の標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、サムブルック Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッツ Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」；ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）（１９８９年）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））、Ｔ．Ｊ．シルハヴィ（Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベナン（Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ）、およびＬ．Ｗ．エンキスト（Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ）、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ」、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）（１９８４年）、ならびにアウスベル Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、グリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ウィレイ−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）発行（１９８７年）により記載されている。
細菌培養物の維持および成長に適する材料および方法については当該技術分野で周知である。以下の実施例における使用に適する技術が、「Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（フィリップ・ゲアハート（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレイ（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ Ｎ．コスチロウ（Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージン Ｗ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス Ａ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエル Ｒ．クリーグ（Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、ワシントンＤＣ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）のアメリカ微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）（１９９４年））またはトーマス Ｄ．（Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．）「Ｂｒｏｃｋ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）のシナウアー・アソシエーツ（Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）（１９８９年）に示されるように見出されうる。細菌細胞の成長および維持について記載のすべての試薬、制限酵素および材料は、他に特に規定がなければ、アルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ））、ＢＤダイアグノスティック・システムズ（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（メリーランド州スパークス（Ｓｐａｒｋｓ））、ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（メリーランド州ロックヴィル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ））、またはシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））から入手した。細菌株は、他に特に規定がなければ、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ））から入手した。
以下の実施例で記載のオリゴヌクレオチドプライマーを表４に示す。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーがシグマ−ジェノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）（テキサス州ウッドランズ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ））によって合成された。
Figure 2009535062
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培地内の２−ブタノールおよび２−ブタノンの濃度を判定するための方法
培地内の２−ブタノールおよび２−ブタノンの濃度は、当該技術分野で既知の多数の方法により判定可能である。例えば、特定の高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法では、屈折率（ＲＩ）の検出を伴い、ショーデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）のＳＨ−Ｇガードカラムとともにショーデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）のＳＨ−１０１１カラム（双方ともウォーターズ・コーポレーション（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（マサチューセッツ州ミルフォード（Ｍｉｌｆｏｒｄ））から購入）を用いた。クロマトグラフ分離を、移動相として０．０１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用い、０．５ｍＬ／分の流速および５０℃のカラム温度で行った。使用条件下で、２−ブタノンおよび２−ブタノールにおける保持時間は各々３９．５分および４４．３分であった。あるいは、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法の使用が可能である。例えば、特定のＧＣ法では、炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を伴い、ＨＰ−ＩＮＮＯＷａｘカラム（３０ｍ×０．５３ｍｍの内径、１μｍの膜厚、デラウェア州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）のアジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いた。キャリアガスは、一定の上部圧力下、１５０℃での測定によると４．５ｍＬ／分の流速でのヘリウムであり、インジェクタースプリットは２００℃で１：２５であり、オーブン温度は１分間で４５℃、１０℃／分で４５〜２２０℃、および５分間で２２０℃であり、ＦＩＤ検出を、２６ｍＬ／分のヘリウム補給気体（ｍａｋｅｕｐ ｇａｓ）を用い、２４０℃で用いた。２−ブタノンおよび２−ブタノールの保持時間は各々３．６１分および５．０３分であった。
２−ブタノンは３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）を用いる誘導体化によっても検出可能である。２−ブタノンを含有する水溶液を３７５ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）中の等容量の６ｍｇ／ｍＬ ＭＢＴＨの水溶液と混合し、１００℃で３分間インキュベートする。得られたＭＢＴＨで誘導体化された試料を、水中の５５％アセトニトリルの１ｍＬ／分の流速での移動相を用い、２５ｃｍ×４．６ｍｍ（内径）のＳｕｐｅｌｏｓｉｌ ＬＣ−１８−Ｄ５の５μｍカラム（スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ））上で分析する。２−ブタノン誘導体は、約１２．３分および１３．３分の保持時間および最大で２３０ｎｍおよび３０７ｎｍの吸光度での２つのピーク（シスおよびトランス異性体）として見られる。
略語の意味は以下の通りである。「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｐｓｉ」はポンド毎平方インチ意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍの波長で測定された光学密度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し、「％ｗ／ｖ」は重量／容量パーセントを意味し、「％ｖ／ｖ」は容量／容量パーセントを意味し、「ｗｔ％」は重量パーセントを意味し、「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィーを意味し、「ＧＣ」はガスクロマトグラフィーを意味する。「モル選択性」という用語は、消費される糖基質の１モル当たりに生成される生成物のモル数であり、パーセントとして報告される。
実施例１
アセト乳酸シンターゼのクローニングおよび発現
この実施例の目的は、大腸菌内でアセト乳酸シンターゼ酵素をコードするｂｕｄＢ遺伝子のクローニングおよび発現を行うことであった。ＰＣＲを用い、ｂｕｄＢ遺伝子をクレブシエラ・ニューモニエ株ＡＴＣＣ２５９５５のゲノムＤＮＡから増幅した。
アセト乳酸シンターゼをコードするｂｕｄＢ配列を、プライマー対のＢ１（配列番号１５）およびＢ２（配列番号１６）を用いるＰＣＲにより、クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ２５９５５）のゲノムＤＮＡから増幅した。他のＰＣＲ増幅試薬（例えばＫｏｄ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のノヴァゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．）；カタログ番号７１８０５−３））は製造業者のキットで供給されたものであり、それらを製造業者のプロトコルに準じて使用した。クレブシエラ・ニューモニエのゲノムＤＮＡをＧｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｐｕｒｅｇｅｎｅキット（ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）のジェントラ・システムズ（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）；カタログ番号Ｄ−５０００Ａ）を用いて調製した。増幅をＤＮＡ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ９７００（カリフォルニア州フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ）のＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））で行った。酵素のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列および予測されたアミノ酸配列は各々、配列番号３および配列番号４として示される。
発現試験においては、Ｇａｔｅｗａｙクローニング技術（カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）のインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．））を用いた。エントリーベクターｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯは定方向クローニングを可能にし、目的の遺伝子に対してＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を提供した。デスティネーションベクターｐＤＥＳＴ１４では、タグを全く有しない遺伝子の発現のためにＴ７プロモーターを用いた。翻訳開始コドンに隣接する４つの塩基（ＣＡＣＣ）を組み込んだフォワードプライマーにより、ｂｕｄＢアセト乳酸シンターゼのコード領域のＰＣＲ産物のｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））への定方向クローニングが可能になり、プラスミドｐＥＮＴＲＳＤＤ−ＴＯＰＯｂｕｄＢが生成された。ｐＥＮＴＲコンストラクトを大腸菌Ｔｏｐ１０（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））細胞に形質転換し、製造業者の推奨に準じてプレーティングした。形質転換体を一晩成長させ、プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）のキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）；カタログ番号２７１０６）を用い、製造業者の推奨に準じて調製した。発現クローンを作製するため、ｐＥＮＴＲＳＤＤ−ＴＯＰＯｂｕｄＢからのｂｕｄＢコード領域を、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅミックス（カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）のインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．））を用いるインビトロでの組換えによりｐＤＥＳＴ１４ベクターに導入した。得られたベクターｐＤＥＳＴ１４ｂｕｄＢをＢＬ−２１−ＡＩ細胞（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．））に形質転換した。ＢＬ−２１−ＡＩ細胞は、アラビノース誘導性のａｒａＢＡＤプロモーターの制御下でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの染色体コピーを保有する。
形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンが補充されたＬＢ培地に接種し、一晩成長させる。一定分量の一晩培養物を用い、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンが補充されたＬＢ培地５０ｍＬに接種する。培養物を振とう下、３７℃でＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまでインキュベートする。培養物を２５ｍＬの分量ずつ２つに分離し、アラビノースをフラスコの一方に添加し、最終濃度を０．２％ ｗ／ｖにする。負の対照フラスコはアラビノースで誘導されない。フラスコを振とう下、３７℃で４時間インキュベートする。細胞を遠心分離により収集し、細胞ペレットを５０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０緩衝液中に再懸濁する。細胞を超音波処理またはフレンチプレッシャーセル（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｅｌｌ）の通過のいずれかにより破壊する。各細胞溶解液を遠心分離することで、上清およびペレットまたは不溶性画分を生成する。一定分量の各画分（誘導細胞および対照細胞由来の全細胞溶解液）をＳＤＳ（ＭＥＳ）負荷緩衝液（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中に再懸濁し、８５℃に１０分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（ＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％ ビス−トリスゲル、カタログ番号ＮＰ０３２２Ｂｏｘ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を施した。核酸配列から推定した予想分子量のタンパク質については誘導された培養物中に存在するが、誘導されなかった対照の中には存在しない。
細胞を含有しない抽出物中でのアセト乳酸シンターゼ活性をバウエール（Ｂａｕｅｒｌｅ）ら（バウエール（Ｂａｕｅｒｌｅ）ら、（１９６４年） Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９２：１４２−１４９頁）で記載の方法を用いて測定する。タンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）のバイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を用い、ブラッドフォード法またはＢｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ Ｋｉｔ（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のシグマ（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号ＢＣＡ−１）のいずれかにより測定する。
実施例２
アセト乳酸デカルボキシラーゼのクローニングおよび発現
この実施例の目的は、大腸菌内でアセト乳酸デカルボキシラーゼ酵素をコードするｂｕｄＡ遺伝子のクローニングおよび発現を行うことであった。ＰＣＲを用い、ｂｕｄＡ遺伝子をクレブシエラ・ニューモニエ株ＡＴＣＣ２５９５５のゲノムＤＮＡから増幅した。
アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードするｂｕｄＡ配列を、ＰＣＲ増幅に用いられるプライマーがＢ３（配列番号１７）およびＢ４（配列番号１８）であること以外では、実施例１でのｂｕｄＢにおける記載と同様にクローニングした。酵素のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列は各々、配列番号１および配列番号２として示される。得られたプラスミドはｐＥＮＴＲＳＤＤ−ＴＯＰＯｂｕｄＡと称されるものであった。
細胞を含有しない抽出物中でのアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性をバウエール（Ｂａｕｅｒｌｅ）ら、上記で記載の方法を用いて測定する。
実施例３（予想）
ブタンジオール脱水素酵素のクローニングおよび発現
この予想実施例の目的は、大腸菌内でブタンジオール脱水素酵素をコードするｂｕｄＣ遺伝子のクローニングおよび発現を行う方法を記載することである。ＰＣＲを用い、ｂｕｄＣ遺伝子をクレブシエラ・ニューモニエ株ＩＡＭ１０６３のゲノムＤＮＡから増幅する。
ブタンジオール脱水素酵素をコードするｂｕｄＣ配列を、ＰＣＲ増幅に用いられるプライマーがＢ５（配列番号１９）およびＢ６（配列番号２０）であること以外では、実施例１でのｂｕｄＡにおける記載と同様にクローニングし発現し、ゲノム鋳型ＤＮＡは（日本国東京の東京大学分子細胞生物学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手される）クレブシエラ・ニューモニエのＩＡＭ１０６３から得られる。クレブシエラ・ニューモニエＩＡＭ１０６３のゲノムＤＮＡをＧｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｐｕｒｅｇｅｎｅキット（ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）のジェントラ・システムズ（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）；カタログ番号Ｄ−５０００Ａ）を用いて調製する。酵素のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列は各々、配列番号５および配列番号６として示される。
細胞を含有しない抽出物中でのブタンジオール脱水素酵素活性を以下の３４０ｎｍの吸光度でのＮＡＤＨの消費により分光学的に測定する。
実施例４（予想）
ブタンジオールデヒドラターゼのクローニングおよび発現
この予想実施例の目的は、大腸菌内でブタンジオールデヒドラターゼをコードするｐｄｄＡ、ｐｄｄＢおよびｐｄｄＣ遺伝子のクローニングおよび発現を行う方法を記載することである。ＰＣＲを用い、ｐｄｄＡ、ｐｄｄＢおよびｐｄｄＣ遺伝子をクレブシエラ・オキシトカＡＴＣＣ８７２４のゲノムＤＮＡから増幅する。
ブタンジオールデヒドラターゼをコードするｐｄｄＡ、ｐｄｄＢおよびｐｄｄＣ配列を、ゲノム鋳型ＤＮＡがクレブシエラ・オキシトカＡＴＣＣ８７２４から得られかつプライマーがＢ７（配列番号２１）およびＢ８（配列番号２２）であること以外では、実施例１でのｂｕｄＡにおける記載と同様にクローニングし発現する。クレブシエラ・オキシトカのゲノムＤＮＡをＧｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｐｕｒｅｇｅｎｅキット（ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）のジェントラ・システムズ（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）；カタログ番号Ｄ−５０００Ａ）を用いて調製する。全３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む単一のＰＣＲ産物を、３つすべてのコード領域が発現プラスミド上の単一のプロモーター由来のオペロンとして発現されるようにクローニングする。３つのサブユニットにおけるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列は各々、配列番号７、９、および１１で与えられ、３つの酵素サブユニットの予測されるアミノ酸配列は各々、配列番号８、１０、および１２として示される。
細胞を含有しない抽出物中でのブタンジオールデヒドラターゼ活性を、ケトン生成物を２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）で誘導体化することにより測定する。つまり、反応混合物１００μＬ、約０．０００５単位の酵素を含有する細胞抽出物、４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、２μｇのアデノシルコバラミン、５μｇの２，３−ブタンジオール、および１μｇのウシ血清アルブミンを１．０Ｎ ＨＣｌ中の等容量の０．０５ｗｔ％ ＤＮＰＨの添加により急冷する。室温で１５分後、４Ｎ ＮａＯＨ１００μＬの添加により発色させる。生成物の量を、最終溶液の５５０ｎｍでの吸光度から２−ブタノンで調製された標準曲線と比較して判定する。すべての反応を暗赤色光下、３７℃で行う。
実施例５（予想）
ブタノール脱水素酵素のクローニングおよび発現
この予想実施例の目的は、大腸菌内でブタノール脱水素酵素をコードするｓａｄｈ遺伝子のクローニングおよび発現を行う方法を記載することである。ＰＣＲを用い、ｓａｄｈ遺伝子をロドコッカス・ルバー株２１９のゲノムＤＮＡから増幅する。
ブタノール脱水素酵素をコードするｓａｄｈ配列を、ゲノム鋳型ＤＮＡがロドコッカス・ルバー株２１９（ミーンズ、インスティトゥート・フュア・マイクロバイオロギー（Ｍｅｅｎｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ）、ドイツ、ハノーバー（Ｈａｎｎｏｖｅｒ）のハノーバー大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｈａｎｎｏｖｅｒ））から得られかつプライマーがＢ９（配列番号２３）およびＢ１０（配列番号２４）であること以外では、実施例１でのｂｕｄＡにおける記載と同様にクローニングし発現する。ロドコッカス・ルバーのゲノムＤＮＡを、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ（商標） Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）のエムオー・バイオ・ラボラトリーズ（ＭＯ ＢＩＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．））を用い、製造業者のプロトコルに準じて調製する。酵素のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列は各々、配列番号１３および配列番号１４として示される。
細胞を含有しない抽出物中でのブタノール脱水素酵素活性を、酵素をＮＡＤおよび２−ブタノールとともにインキュベートする際でのＮＡＤからＮＡＤＨへの変換に起因する３４０ｎｍでの吸光度の増加を追跡することにより測定する。
実施例６（予想）
２−ブタノール生合成経路内での遺伝子における形質転換ベクターの作成
この予想実施例の目的は、２−ブタノール生合成経路（すなわち上記の経路３）内での遺伝子における形質転換ベクターの調製について記載することである。大腸菌は、大部分の生物のようにグルコースを最初にピルビン酸に変換する。酵素は経路３に従ってピルビン酸を２−ブタノールに変換する必要があった、すなわち、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、ブタンジオール脱水素酵素、ブタンジオールデヒドラターゼ、およびブタノール脱水素酵素は、ｂｕｄＡ、ｂｕｄＢ、ｂｕｄＣ、ｐｄｄＡ、ｐｄｄＢ、ｐｄｄＣおよびｓａｄｈ遺伝子によってコードされる。組換え生物内での２−ブタノール生合成経路の構築を簡素化するため、経路内での５ステップをコードする遺伝子は２つのオペロンに分かれる。上流経路は、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、およびブタンジオール脱水素酵素により触媒される最初の３つのステップを含む。下流経路は、ブタンジオールデヒドラターゼおよびブタノール脱水素酵素により触媒される最後の２つのステップを含む。
コード配列は後のクローニング用の制限部位を組み込むプライマーによるＰＣＲにより増幅され、かつフォワードプライマーは最適化された大腸菌のリボソーム結合部位（ＡＡＡＧＧＡＧＧ）を有する。ＰＣＲ産物が、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにＴＯＰＯクローニングされかつＴｏｐ１０細胞（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に形質転換される。プラスミドＤＮＡをＴＯＰＯクローンから調製し、クローン化ＰＣＲ断片の配列を検証する。制限酵素およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（マサチューセッツ州ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）のニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））を製造業者の推奨に準じて用いる。クローニング実験においては、制限断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いてゲル精製する。
配列の確認後、コード領域をクローニングプラットフォームとして修飾されたｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングする。ｐＵＣ１９ベクターをＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｐＩ消化により修飾した後、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼで処理して末端を埋める。２．４ｋＢベクター断片をゲル精製し、再ライゲートしてｐＵＣ１９ｄＨＳを生成する。あるいは、ｐＵＣ１９ベクターをＳｐｈＩ／ＳａｐＩ消化により修飾した後、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼで処理して末端を平滑化する。２．４ｋＢベクター断片をゲル精製し、再ライゲートしてｐＵＣ１９ｄＳＳを生成する。消化物はＭＣＳ（複数のクローニング部位）に隣接するｌａｃプロモーターを除去し、オペロンのベクターからの転写が阻止される。
上流経路
ｂｕｄＡＢＣコード領域を、プライマー対のＢ１１およびＢ１２（各々、配列番号２５および２６として与えられる）（表４）を用いるＰＣＲにより、クレブシエラ・ニューモニエのゲノムＤＮＡから増幅する。フォワードプライマーにはＥｃｏＲＩ制限部位およびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を組み込む。リバースプライマーにはＳｐｈＩ制限部位を組み込む。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにクローニングし、ｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｂｕｄＡＢＣが生成される。
上流経路を作成するため、オペロンｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｂｕｄＡＢＣをＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩで消化することで３．２ｋｂｐのｂｕｄＡＢＣ断片が放出される。ｐＵＣ１９ｄＳＳベクターもまた、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩで消化することで２．０ｋｂｐのベクター断片が放出される。ｂｕｄＡＢＣ断片およびベクター断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））を用いて共にライゲートし、ｐＵＣ１９ｄＳＳ−ｂｕｄＡＢＣが形成される。
下流経路
ｐｄｄＡＢＣコード領域を、プライマーのＢ１３およびＢ１４（各々、配列番号２７および２８として与えられる）（表４）を用いるＰＣＲによりクレブシエラ・オキシトカＡＴＣＣ８７２４のゲノムＤＮＡから増幅し、２．９ｋｂｐの産物が生成される。フォワードプライマーにはＥｃｏＲＩおよびＰｍｅＩ制限部位およびＲＢＳを組み込む。リバースプライマーにはＢａｍＨＩ制限部位を組み込む。ＰＣＲ産物をｐＣＲＢｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯにクローニングし、ｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ−ｐｄｄが生成される。
ｓａｄｈ遺伝子を、プライマーＢ１５およびＢ１６（各々、配列番号２９および３０として与えられる）（表４）を用いるＰＣＲによりロドコッカス・ルバー株の２１９ゲノムＤＮＡから増幅し、１．０ｋｂｐの産物が生成される。フォワードプライマーにはＢａｍＨＩ制限部位およびＲＢＳを組み込む。リバースプライマーにはＸｂａＩ制限部位を組み込む。ＰＣＲ産物をｐＣＲＢｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯにクローニングし、ｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ−ｓａｄｈが生成される。
下流経路のオペロンを作成するため、ｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ−ｐｄｄ由来の２．９ｋｂｐのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ断片、ｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ−ｓａｄｈ由来の１．０ｋｂｐのＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ断片、ならびにｐＵＣ１９ｄＨＳのＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ消化物由来の大きい断片を共にライゲートする。三者のライゲーションによりｐＵＣ１９ｄＨＳ−ｐｄｄ−ｓａｄｈが生成される。
ｐＵＣ１９ｄＳＳ−ｂｕｄＡＢＣベクターをＰｍｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、大腸菌−枯草菌のシャトルベクターのｐＢｅｎＢＰにクローニングされた３．２ｋｂｐ断片が放出される。プラスミドｐＢｅｎＢＰがｐＢＥ９３ベクターの修飾により生成され、それはナガラジャン（Ｎａｇａｒａｊａｎ）（国際公開第９３／２４６３号パンフレット、実施例４）により記載されている。ｐＢｅｎＢＰを生成するため、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の中性プロテアーゼプロモーター（ＮＰＲ）のシグナル配列およびｐｈｏＡ遺伝子をＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を用いてｐＢＥ９３から除去する。ＮＰＲプロモーターをプライマーのＢｅｎＦおよびＢｅｎＢＰＲ（各々、配列番号３１および３２で示される）によりｐＢＥ９３からＰＣＲ増幅する。プライマーＢｅｎＢＰＲにはプロモーターの下流にＢｓｔＥＩＩ、ＰｍｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を組み込む。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、断片をベクターｐＢＥ９３における対応する部位にクローニングすることでｐＢｅｎＢＰが生成される。上流のオペロン断片をｐＢｅｎＢＰにおけるＰｍｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングし、ｐＢｅｎ−ｂｕｄＡＢＣが生成される。
ｐＵＣ１９ｄＨＳ−ｐｄｄ−ｓａｄｈベクターをＰｍｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することで、ｐＢｅｎＢＰのＰｍｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされた３．９ｋｂｐ断片が放出され、ｐＢｅｎ−ｐｄｄ−ｓａｄｈが生成される。
実施例７（予想）
大腸菌内での２−ブタノール生合成経路の発現
この予想実施例の目的は、大腸菌内で２−ブタノール生合成経路の発現を行う方法を記載することである。
実施例６に記載のように調製したプラスミドｐＢｅｎ−ｂｕｄＡＢＣおよびｐＢｅｎ−ｐｄｄ−ｓａｄｈを別々に大腸菌ＮＭ５２２（ＡＴＣＣ番号４７０００）に形質転換し、各オペロンにおける遺伝子の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および酵素アッセイにより監視する。すべての遺伝子の発現の確認後、ｐＢｅｎ−ｂｕｄＡＢＣをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＮＰＲプロモーター−ｂｕｄＡＢＣ断片が放出される。断片を、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、カタログ番号Ｍ０２１０Ｓ）を用いて平滑末端化する。プラスミドｐＢｅｎ−ｐｄｄ−ｓａｄｈをＥｃｏＲＩで消化し、同様に平滑化することで、線状化、平滑末端化されたベクター断片が生成される。ベクターおよびＮＰＲ−ｂｕｄＡＢＣ断片をライゲートし、ｐ２ＢＯＨが生成される。このプラスミドを大腸菌ＮＭ５２２に形質転換することで大腸菌ＮＭ５２２／ｐ２ＢＯＨが得られ、遺伝子の発現を上記のように監視する。
大腸菌ＮＭ５２２／ｐ２ＢＯＨを培地５０ｍＬを含有する２５０ｍＬの振とうフラスコに接種し、２５０ｒｐｍおよび３５℃で振とうする。培地は、デキストロース、５ｇ／Ｌ；ＭＯＰＳ、０．０５Ｍ；硫酸アンモニウム、０．０１Ｍ；第一リン酸カリウム、０．００５Ｍ；Ｓ１０金属混合物、１％（ｖ／ｖ）；酵母抽出物、０．１％（ｗ／ｖ）；カザミノ酸、０．１％（ｗ／ｖ）；チアミン、０．１ｍｇ／Ｌ；プロリン、０．０５ｍｇ／Ｌ；およびビオチン０．００２ｍｇ／Ｌから構成され、ＫＯＨでｐＨ７．０に滴定される。Ｓ１０金属混合物は、ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ；ＣａＣｌ２、７０ｍＭ；ＭｎＣｌ２、５ｍＭ；ＦｅＣｌ３、０．１ｍＭ；ＺｎＣｌ２、０．１ｍＭ；塩酸チアミン、０．２ｍＭ；ＣｕＳＯ４、１７２μＭ；ＣｏＣｌ２、２５３μＭ；およびＮａ２ＭｏＯ４、２４２μＭを含有する。１８時間後、２−ブタノールを、例えば上記の一般的方法の項に記載の当該技術分野で周知の方法を用いてＨＰＬＣまたはＧＣ分析により検出する。
実施例８（予想）
枯草菌内での２−ブタノール生合成経路の発現
この予想実施例の目的は、枯草菌内で２−ブタノール生合成経路の発現を行う方法を記載することである。
実施例６に記載のように調整したプラスミドｐＢｅｎ−ｂｕｄＡＢＣおよびｐＢｅｎ−ｐｄｄ−ｓａｄｈを別々に枯草菌ＢＥ１０１０（「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．」１７３：２２７８−２２８２頁（１９９１年））に形質転換し、各オペロンにおける遺伝子の発現を実施例７に記載のように監視する。プラスミドｐＢｅｎ−ｂｕｄＡＢＣをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＮＰＲプロモーター−ｂｕｄＡＢＣ断片が放出される。断片を、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、カタログ番号Ｍ０２１０Ｓ）を用いて平滑末端化する。プラスミドｐＢｅｎ−ｐｄｄ−ｓａｄｈをＥｃｏＲＩで消化し、同様に平滑化することで、線状化され平滑末端化されたベクター断片が生成される。ベクターおよびＮＰＲ−ｂｕｄＡＢＣ断片をライゲートし、ｐ２ＢＯＨが生成される。このプラスミドを枯草菌ＢＥ１０１０に形質転換することで枯草菌ＢＥ１０１０／ｐ２ＢＯＨが得られ、遺伝子の発現を上記のように監視する。
枯草菌ＢＥ１０１０／ｐ２ＢＯＨを培地５０ｍＬを含有する２５０ｍＬの振とうフラスコに接種し、２５０ｒｐｍおよび３５℃で１８時間振とうする。培地は、デキストロース、５ｇ／Ｌ；ＭＯＰＳ、０．０５Ｍ；グルタミン酸、０．０２Ｍ；硫酸アンモニウム、０．０１Ｍ；第一リン酸カリウム緩衝液、０．００５Ｍ；Ｓ１０金属混合物（実施例７に記載のもの）、１％（ｖ／ｖ）；酵母抽出物、０．１％（ｗ／ｖ）；カザミノ酸、０．１％（ｗ／ｖ）；トリプトファン、５０ｍｇ／Ｌ；メチオニン、５０ｍｇ／Ｌ；およびリジン、５０ｍｇ／Ｌから構成され、ＫＯＨでｐＨ７．０に滴定される。１８時間後、２−ブタノールを、例えば上記の一般的方法の項に記載の当該技術分野で周知の方法を用いてＨＰＬＣまたはＧＣ分析により検出する。
実施例９
２−ブタノール生合成経路内での遺伝子における形質転換ベクターの作成
この実施例の目的は、２−ブタノール生合成経路（すなわち上記の経路３）内で遺伝子を保有する組換え大腸菌宿主を調製することであった。大腸菌は、大部分の生物のようにグルコースを最初にピルビン酸に変換する。酵素は経路３においてピルビン酸を２−ブタノンに変換する必要があった、すなわち、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、ブタンジオール脱水素酵素、およびブタンジオールデヒドラターゼは、ｂｕｄＡ、ｂｕｄＢ、ｂｕｄＣ、ｐｄｄＡ、ｐｄｄＢ、およびｐｄｄＣ遺伝子によってコードされる。経路の最終ステップでは、ブタノール脱水素酵素は２−ブタノンを２−ブタノールに変換する。この最終ステップを行う脱水素酵素は不定（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）であり、多数の生物内に見出されうる。組換え生物内での２−ブタノール生合成経路の構築を簡素化するため、経路内での５ステップをコードする遺伝子は複数のオペロンに分かれた。上流経路のオペロンは、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、およびブタンジオール脱水素酵素により触媒される最初の３つのステップを含み、それを発現ベクター上にクローニングした。下流経路は、再活性化因子（モリ（Ｍｏｒｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３２０３４頁（１９９７年））を含むブタンジオールデヒドラターゼおよびブタノール脱水素酵素により触媒される最後の２つのステップを含んだ。ジオールデヒドラターゼは触媒反応中に自殺による不活化を被る可能性がある。ｄｄｒＡおよびｄｄｒＢによってコードされる再活性化因子タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０１７７８１、配列番号７０）は不活性酵素を再活性化する。ｄｄｒＡおよびｄｄｒＢ遺伝子はジオールデヒドラターゼのオペロンに隣接する。デヒドラターゼ／再活性化因子およびブタノール脱水素酵素に対するオペロンのいずれかを別の発現ベクター上にクローニングするか、またはデヒドラターゼ／再活性化因子のオペロンを別の発現ベクター上に単独にクローニングし、かつ最終ステップをデモンストレーションとしての宿主内での内因性の活性により提供した。
ベクターｐＴｒｃ９９ａ−ｂｕｄＡＢＣの作成
ｂｕｄＡＢコード領域を、プライマー対のＢＡＢＣ ＦおよびＢＡＢ Ｒ（各々、配列番号３３および３４として与えられる）（表４を参照）を用いるＰＣＲによりＫ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ２５９５５のゲノムＤＮＡから増幅し、２．５ｋｂｐの産物が生成された。フォワードプライマーにはＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位ならびにリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を組み込んだ。リバースプライマーにはＳｐｅＩ制限部位を組み込んだ。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにクローニングし、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｂｕｄＡＢが生成された。プラスミドＤＮＡをＴＯＰＯクローンから調製し、遺伝子の配列をプライマーのＭ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号３５）、Ｍ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号３６）、Ｎ８３ ＳｅｑＦ２（配列番号３７）、Ｎ８３ ＳｅｑＦ３（配列番号３８）およびＮ８４ ＳｅｑＲ４（配列番号３９）を用いて検証した（表５を参照）。
ｂｕｄＣコード領域をプライマー対のＢＣ ＳｐｅＦおよびＢＣ Ｘｂａ Ｒ（各々、配列番号４０および４１として与えられる）を用いるＰＣＲによりＫ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ２５９５５のゲノムＤＮＡから増幅し、０．８ｋｂｐの産物が生成された。フォワードプライマーにはＳｐｅＩ制限部位、ＲＢＳを組み込み、ＡＡＡからＡＡＧへ第２および第３のコドンを変更することによりＣＤＳが修飾された。リバースプライマーにはＸｂａＩ制限部位を組み込んだ。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにクローニングし、ｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｂｕｄＣが生成された。プラスミドＤＮＡをＴＯＰＯクローンから調製し、遺伝子の配列をプライマーＭ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号３５）およびＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号３６）を用いて検証した。
ｂｕｄＡＢＣオペロンを作成するため、ｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｂｕｄＣをＳｎａＢＩおよびＸｂａＩで消化することで１．０ｋｂｐのｂｕｄＣ断片が放出された。ベクターｐＴｒｃ９９ａ（アマン（Ａｍａｎｎ）ら、Ｇｅｎｅ ６９（２）：３０１−３１５頁（１９８８年））をＳｍａＩおよびＸｂａＩで消化し、４．２ｋｂｐの線状化ベクター断片が生成された。ベクターおよびｂｕｄＣ断片をライゲートすることでｐＴｒｃ９９ａ−ｂｕｄＣが生成され、大腸菌Ｔｏｐ１０細胞（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に形質転換した。形質転換体における１．２ｋｂｐの産物を、プライマーのＴｒｃＦ（配列番号４２）およびＴｒｃＲ（配列番号４３）を用いるＰＣＲ増幅により分析し、ｂｕｄＣ挿入物の存在を確認した。ｂｕｄＡＢ遺伝子を２．５ｋｂｐのＥｃｏＲＩ／ＳｐｅＩ断片としてｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｂｕｄＡＢからサブクローニングした。ベクターｐＴｒｃ９９ａ−ｂｕｄＣをＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られた５．０ｋｂｐのベクター断片をゲル精製した。精製したベクターおよびｂｕｄＡＢ挿入物をライゲートし、大腸菌Ｔｏｐ１０細胞に形質転換した。形質転換体を、プライマーのＴｒｃ Ｆ（配列番号４２）およびＮ８４ Ｓｅｑ Ｒ２（配列番号６５）を用いるＰＣＲ増幅によりスクリーニングし、ｐＴｒｃ９９ａ−ｂｕｄＡＢＣの生成を確認した。このプラスミドでは、ｂｕｄＡ、Ｂ、およびＣのコード領域は、ＴｒｃプロモーターとｒｒｎＢ終結配列との間で、この順に互いに隣接する。
結果
大腸菌Ｔｏｐ１０／ｐＴｒｃ９９ａ−ｂｕｄＡＢＣの３種の独立の単離物におけるブタンジオールの生成について負の対照として大腸菌Ｔｏｐ１０／ｐＣＬ１９２５−Ｋｏｄｄ−ｄｄｒ（下記）を用いて試験した。株を、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有するＬＢ培地内で成長させた。得られた細胞を用い、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを有するＴＭ３ａ／グルコース培地１２５ｍＬを含有する振とうフラスコ（約１７５ｍＬの全容量）に接種した。さらに、ｐＴｒｃ９９ａ−ｂｕｄＡＢＣを保有する株が接種されたフラスコは０．４ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有した。ＴＭ３ａ／グルコース培地は、（１リットル当たり）１０ｇグルコース、１３．６ｇ ＫＨ２ＰＯ４、２．０ｇクエン酸一水和物、３．０ｇ （ＮＨ４）２ＳＯ４、２．０ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３３ｇクエン酸鉄アンモニウム、１．０ｍｇチアミン・ＨＣｌ、０．５０ｇ酵母抽出物、および微量元素溶液１０ｍＬを含有し、ＮＨ４ＯＨでｐＨ６．８に調整されている。微量元素の溶液は、クエン酸・Ｈ２Ｏ（４．０ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ（３．０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（１．０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．１０ｇ／Ｌ）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．１０ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．１０ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．０１０ｇ／Ｌ）、Ｈ３ＢＯ３（０．０１０ｇ／Ｌ）、およびＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．０１０ｇ／Ｌ）を含有した。空気抜きキャップで覆ったフラスコに約０．０３単位の初期ＯＤ６００で接種し、３００ｒｐｍの振とう下、３４℃でインキュベートした。
誘導の約２３時間後、一定分量の培養液を、２−ブタノールおよび２−ブタノンについての一般的方法の項に記載された同様の方法を用い、ＨＰＬＣ（ショーデックス（Ｓｈｏｄｅｘ） Ｓｕｇａｒ ＳＨ１０１１カラム）およびＧＣ（ＨＰ−ＩＮＮＯＷａｘ）により分析した。分析の結果を表６に示す。３つの大腸菌クローンにより、グルコースが所望の経路の中間体であるアセトインおよびメソ−２，３−ブタンジオールに１４％のモル選択性で変換された。この選択性は、ｂｕｄＡＢＣを有しない大腸菌の対照株で観察される場合よりも約３５倍高かった。
Figure 2009535062
ベクターｐＣＬ１９２５−ＫｏＤＤ−ｄｄｒの作成
ジオールデヒドラターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄ４５０７１、配列番号６９）および再活性化因子（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０１７７８１、配列番号７０）オペロンを、プライマーＤＤｏ Ｆｏｒ（配列番号４４）およびＤＤｏ Ｒｅｖ（配列番号４５）を用い、単一の単位としてクレブシエラ・オキシトカＡＴＣＣ８７２４からＰＣＲ増幅した。フォワードプライマーには最適化された大腸菌ＲＢＳおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を組み込んだ。リバースプライマーにはＸｂａＩ制限部位を組み込んだ。５３１８ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにクローニングし、得られたｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−Ｋｏｄｄ−ｄｄｒのクローンを、プライマーのＭ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号３５）、Ｍ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号３６）、ＤＤｋｏ ｓｅｑ Ｆ２（配列番号４６）、ＤＤｋｏ ｓｅｑ Ｆ５（配列番号４７）、ＤＤｋｏ ｓｅｑ Ｆ７（配列番号４８）、ＤＤｋｏ ｓｅｑ Ｆ９（配列番号４９）、ＤＤｋｏ ｓｅｑ Ｒ１（配列番号５０）、ＤＤｋｏ ｓｅｑ Ｒ３（配列番号５１）、ＤＤｋｏ ｓｅｑ Ｒ７（配列番号５２）、およびＤＤｋｏ ｓｅｑ Ｒ１０（配列番号５３）を用いて配列決定した。予想配列を有する挿入物を有するクローンを同定した。
発現においては、ジオールデヒドラターゼ／再活性化因子遺伝子を、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来のグルコースイソメラーゼプロモーターを保有するローコピープラスミドｐＣＬ１９２５（米国特許第７，０７４，６０８号明細書）にサブクローニングした。ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−Ｋｏｄｄ−ｄｄｒをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化し、得られた５．３ｋｂｐのＫｏｄｄ−ｄｄｒ断片をゲル精製した。ベクターｐＣＬ１９２５をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化し、得られた４５３９ｂｐのベクター断片をゲル精製した。ベクターおよびＫｏｄｄ−ｄｄｒ断片をライゲートし、大腸菌Ｔｏｐ１０に形質転換した。形質転換体を、プライマーＤＤｋｏ ＳｅｑＦ７（配列番号４８）およびＤＤｋｏ ＳｅｑＲ７（配列番号５２）を用いるＰＣＲによりスクリーニングした。挿入物を保有するプラスミド（ｐＣＬ１９２５−Ｋｏｄｄ−ｄｄｒ）の増幅の結果、約７９７ｂｐの産物が得られた。
メソ−２，３−ブタンジオールに対するジオールデヒドラターゼの活性を、細胞抽出物（タンパク質全体が約０．８ｍｇ／ｍＬ）を８０ｍＭヘペス（ｐＨ８．２）中の１０ｍＭブタンジオールおよび１２ｍＭ補酵素Ｂ１２と室温で１７時間インキュベートすることにより測定した。予想産物である２−ブタノンの形成について、一般的方法に記載のＨＰＬＣにより判定した。
ベクターｐＣＬ１９２５−ＫｏＤＤ−ｄｄｒ：：Ｔ５ ｃｈｎＡ ｔｅｒの作成
異種のアルコール脱水素酵素活性をもたらすため、アシネトバクター・エスピー由来のシクロヘキサノール脱水素酵素をコードするｃｈｎＡ遺伝子（チャン（Ｃｈｅｎｇ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：４７４４−４７５１頁（２０００年））を、ジオールデヒドラターゼオペロン、ｐＣＬ１９２５−Ｋｏｄｄ−ｄｄｒを用いてｐＣＬ１９２５ベクターにクローニングした。配列番号７１（Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＡＦ２８２２４０、配列番号７３）として与えられるｃｈｎＡ遺伝子を、プライマーのＣｈｎＡＦ（配列番号５４）およびＣｈｎＡＲ（配列番号５５）を用い、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に由来するシクロヘキサノールの遺伝子クラスターを保有するコスミドｐＤＣＱ２、から増幅した。得られた８２８ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにクローニングすることでｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｃｈｎＡが生成され、形質転換体を、プライマーのＭ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号３５）およびＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号３６）を用いるコロニーＰＣＲによりスクリーニングした。正確なクローニングにより約１ｋｂｐのＰＣＲ産物が生成され、プライマーのＭ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号３５）およびＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号３６）を用いる配列決定を行った。
ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｃｈｎＡの配列決定を行って正確な配列を確認してから、ｃｈｎＡ遺伝子を８１３ｂｐのＭｆｅＩ／ＳｍａＩ断片としてプラスミドからサブクローニングした。発現ベクターｐＱＥ３０（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））をＭｆｅＩおよびＳｍａＩで消化し、得られた３３５０ｂｐのベクター断片をゲル精製した。ｃｈｎＡ断片および精製したベクターをライゲートし、大腸菌Ｔｏｐ１０細胞に形質転換した。４９４ｂｐのＰＣＲ産物については、形質転換体を、プライマーのｃｈｎＳｅｑＦ１（配列番号５６）およびｃｈｎｓｅｑＲ１（配列番号５７）を用いてコロニーＰＣＲによりスクリーニングした。このクローニングでは、ｃｈｎＡ遺伝子をプラスミドｐＱＥ３０−ｃｈｎＡ内でＴ５プロモーターの制御下に置いた。
２つのオペロンを保有するｐＣＬ１９２５ベクターを調製するため、ターミネーターをベクターに付加した。ｔｏｎＢターミネーター−ｍｃｓ−ｔｒｐＡターミネーター断片を、オリゴヌクレオチドとプライマーのＴｏｐ ｔｅｒ Ｆ１（配列番号５８）、Ｔｏｐ ｔｅｒ Ｆ２（配列番号５９）、Ｂｏｔ ｔｅｒ Ｒ１（配列番号６０）およびＢｏｔ ｔｅｒ Ｒ２（配列番号６１）とのアニーリングにより調製した。アニールされたＤＮＡを６％ ＰＡＧＥゲル（カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）のエンビ−テック（Ｅｍｂｉ−ｔｅｃ））上でゲル精製した。ベクターｐＣＬ１９２５をＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化し、ゲル精製した。アニールされたＤＮＡおよびベクター断片をライゲートし、ｐＣＬ１９２５−ｔｅｒが生成された。約４００ｂｐのＰＣＲ産物の存在については、形質転換体を、プライマーのｐＣＬ１９２５ ｖｅｃ Ｆ（配列番号６２）およびｐＣＬ１９２５ ｖｅｃ Ｒ１（配列番号６３）を用いるコロニーＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ＰＣＲスクリーニングから得られた陽性クローンを同じプライマーを用いて配列決定した。
ベクターｐＣＬ１９２５−ｔｅｒをＸｈｏＩおよびＰｍｅＩで消化し、得られた４６２２ｂｐの断片をゲル精製した。ｐＱＥ３０−ｃｈｎＡをＮｃｏＩで消化し、ＤＮＡをＫｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼで処理して末端を平滑化した。次いで、ｐＱＥ３０−ｃｈｎＡをＸｈｏＩで消化し、得られた１．２ｋｂｐのＴ５プロモーター−ｃｈｎＡ断片をゲル精製した。ｐＣＬ１９２５−ｔｅｒベクターおよびｃｈｎＡオペロンの断片を共にライゲートすることでｐＣＬ１９２５−ｔｅｒ−Ｔ５ｃｈｎＡが得られ、大腸菌Ｔｏｐ１０に形質転換した。約１ｋｂｐの産物については、形質転換体を、プライマーのｐＣＬ１９２５ ｖｅｃ Ｆ（配列番号６４）およびｃｈｎｓｅｑ Ｒ１（配列番号５９）を用いるコロニーＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。
経路ベクターの構築を完了するため、ｐＣＬ１９２５−ＫｏＤＤ−ｄｄｒプラスミドをＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化し、得られた９５０４ｂｐのベクター断片をゲル精製した。ｐＣＬ１９２５−ｔｅｒ−Ｔ５ｃｈｎＡからの、ｃｈｎＡコード配列の３’側のｔｒｐＡターミネーター（コイチ（Ｋｏｉｃｈｉ）ら、（１９９７年） 第２７２巻、第５１号、３２０３４−３２０４１頁）とともにターミネーターに隣接するｃｈｎＡオペロンを、１２７１ｂｐのＸｂａＩ／ＳａｃＩ断片としてゲル精製した。断片のライゲーションおよび大腸菌Ｔｏｐ１０への形質転換の後、形質転換体をコロニーＰＣＲによりスクリーニングした。プライマーのｃｈｎＳｅｑ Ｆ１（配列番号５８）およびｐＣＬ１９２５ ｖｅｃ Ｒ２（配列番号６４）により、１１０７ｂｐの予想ＰＣＲ産物が得られたプラスミドｐＣＬ１９２５−ＫｏＤＤ−ｄｄｒ：：ｔｅｒ−Ｔ５ｃｈｎＡにおいて増幅された。
実施例１０
過剰発現された内因性アルコール脱水素酵素を用いる大腸菌内での２−ブタノール生合成経路の発現
この実施例の目的は、数種の大腸菌株内で２−ブタノール生合成経路を発現させることであった。
ｙｑｈＤを構成的に発現する大腸菌株の作成
大腸菌は、１，３−プロパンジオール脱水素酵素として同定された天然遺伝子（ｙｑｈＤ）を有する（米国特許第６，５１４，７３３号明細書）。配列番号７４で与えられるｙｑｈＤ遺伝子は、ＮＡＤＨ依存性のブタノール脱水素酵素であり得るクロストリジウム内の遺伝子ａｄｈＢに対して４０％の同一性を有する。ｙｑｈＤ遺伝子を、λＲｅｄ技術（ダツェンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：６６４０頁（２０００年））を用い、大腸菌株ＭＧ１６５５１．６ｙｑｈＤ：：Ｃｍ（国際公開第２００４／０３３６４６号パンフレット）内のグルコースイソメラーゼのプロモーター１．６ＧＩ（配列番号６７）の変異体の構成的発現下に置いた。同様に、天然プロモーターを１．５ＧＩプロモーター（国際公開第２００３／０８９６２１号パンフレット）（配列番号６８）と置換することでＭＧ１６５５１．５ｙｑｈＤ：：Ｃｍ株が生成されたことから、ＭＧ１６５５ １．６ｙｑｈＤ：：Ｃｍの１．６ＧＩプロモーターが１．５ＧＩプロモーターと置換された。１．５ＧＩおよび１．６ＧＩのプロモーターが−３５領域内で１ｂｐだけ異なることにより、プロモーターの強度が改変される（国際公開第２００４／０３３６４６号パンフレット）。天然ｙｑｈＤプロモーターを１．５ＧＩまたは１．６ＧＩのいずれかのプロモーターと置換する間、ｙｑｈオペロンにおける推定上の転写調節因子をコードするｙｑｈＣ遺伝子が除去された。ブタノール脱水素酵素活性を当該技術分野で周知の方法を用いる酵素アッセイにより確認した。
大腸菌株の形質転換
実施例９に記載の経路のプラスミドのｐＣＬ１９２５−Ｋｏｄｄ−ｄｄｒおよびｐＴｒｃ９９ａ−ｂｕｄＡＢＣを大腸菌株ＭＧ１６５５のＭＧ１６５５ １．６ｙｑｈＤおよびＭＧ１６５５ １．５ｙｑｈＤに同時形質転換した。後者２つの株は、ブタノール脱水素酵素活性も有する１，３−プロパンジオール脱水素酵素ＹｑｈＤを過剰発現する。本質的には上記のように、株における２−ブタノンおよび２−ブタノールの生成について試験した。細胞を、（０．１ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２、適切な抗生物質およびＩＰＴＧを有する）５０ｍＬもしくは１５０ｍＬのいずれかのＴＭ３ａ／グルコース培地（各々、中程度の酸素条件および低い酸素条件を表す）を有する振とうフラスコ（約１７５ｍＬの全容量）に接種した。スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびカルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を各々、プラスミドのｐＣＬ１９２５−Ｋｏｄｄ−ｄｄｒおよびｐＴｒｃ９９ａ−ｂｕｄＡＢＣに対して用いた。フラスコに０．０４単位以下の初期ＯＤ６００で接種し、フラスコを３００ｒｐｍの振とう下、３４℃でインキュベートした。培地５０ｍＬを有するフラスコを空気抜きキャップで覆う一方、培地１５０ｍＬを有するフラスコを密封キャップで覆って換気を最小限にした。ＩＰＴＧは時刻０では０ｍＭもしくは０．０４ｍＭの濃度で存在した。２−ブタノンおよび２−ブタノールの生成における分析結果を表７に示す。２−ブタノール生合成経路を含むすべての大腸菌株が、低い酸素条件下および中程度の酸素条件下で２−ブタノンを生成し、低い酸素条件下で２−ブタノールを生成した。
Figure 2009535062
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実施例１１
大腸菌内での異種のアルコール脱水素酵素による２−ブタノール生合成経路の発現
実施例９に記載のプラスミドのｐＣＬ１９２５−ＫｏＤＤ−ｄｄｒ：：ｔｅｒ−Ｔ５ｃｈｎＡおよびｐＴｒｃ９９ａ−ｂｕｄＡＢＣを、２−ブタノールの生成の実証のため、大腸菌株のＭＧ１６５５およびＭＧ１６５５ ΔｙｑｈＣＤに形質転換した。
ＭＧ１６５５ ΔｙｑｈＣＤは、ダツェンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）の方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７（１２）：６６４０−６６４５頁（２０００年））を用いて作製されたｙｑｈＣＤの不活化を保有する。同領域とｐＫＤ３のＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴカセットとの置換後、クロラムフェニコール耐性マーカーをＦＬＰ組換え酵素を用いて除去した。欠失させた領域の配列は配列番号６６として与えられる。
本質的には上記のように、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ−ｂｕｄＡＢＣ／ｐＣＬ１９２５ＫｏＤＤ−ｄｄｒ：：ｔｅｒ−Ｔ５ ｃｈｎＡ株およびＭＧ１６５５ ΔｙｑｈＣＤ／ｐＴｒｃ９９ａ−ｂｕｄＡＢＣ／ｐＣＬ１９２５ＫｏＤＤ−ｄｄｒ：：ｔｅｒ−Ｔ５ ｃｈｎＡ株における２−ブタノンおよび２−ブタノールの生成について試験した。ＭＧ１６５５ ΔｙｑｈＣＤ／ｐＣＬ１９２５株を負の対照として用いた。細胞を、（０．１ｍｇ／ＬビタミンＢ１２および適切な抗生物質を有する）５０ｍＬもしくは１５０ｍＬのＴＭ３ａ／グルコース培地（各々、中程度の酸素条件および低い酸素条件を表す）を有する振とうフラスコ（約１７５ｍＬの全容量）に接種した。スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を各々、ｐＣＬ１９２５に基づくプラスミドおよびｐＴｒｃ９９ａ−ｂｕｄＡＢＣに対して用いた。ｐＴｒｃ９９ａ−ｂｕｄＡＢＣから誘導される酵素活性を、ＩＰＴＧ誘導物質の不在下（したがってＩＰＴＧは培地に添加されなかった）で酵素アッセイにより検出した。フラスコに０．０１単位以下の初期ＯＤ６００で接種し、３００ｒｐｍの振とう下、３４℃で２４時間インキュベートした。培地５０ｍＬを有するフラスコを空気抜きキャップで覆う一方、培地１５０ｍＬを有するフラスコを密封キャップで覆って換気を最小限にした。２−ブタノンおよび２−ブタノールの生成における分析結果を表８に示す。２−ブタノール生合成経路を含む両方の大腸菌株が低い酸素条件下および中程度の酸素条件下で２−ブタノンを生成し、低い酸素条件下で２−ブタノールを生成した一方、負の対照株は２−ブタノンまたは２−ブタノールのいずれにしても検出可能なレベルで生成することはなかった。
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実施例１２
アミノ：ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＡＰＴ）のクローニング
ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ Ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）ＪＳ１７由来のアミノ：ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＡＰＴ）がシン（Ｓｈｉｎ）らにより同定された（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３年）６１：４６３−４７１頁）。アミノ酸配列（配列番号１２２）がω−アミノ酸：ピルビン酸トランスアミナーゼと有意な相同性を有することが見出された（シン（Ｓｈｉｎ）およびキム（Ｋｉｍ）（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：２８４８−２８５３頁（２００２年））。ビブリオ・フルビアリスＡＰＴがアセトインに対するトランスアミナーゼ活性を有することが示された。
大腸菌内でのＡＰＴ酵素の発現においては、コドンが最適化されたＡＰＴコード領域（配列番号１４４）を、コドンのバランスおよびｍＲＮＡの安定性などのさらなる検討を加えた好ましい大腸菌のコドンを用いて設計し、（ＤＮＡ２．０；カリフォルニア州レッドウッド・シティ（Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ）により）合成した。コード領域ＤＮＡ断片をｐＢＡＤ．ＨｉｓＢベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にサブクローニングし、得られたプラスミド（以下、ｐＢＡＤ．ＡＰＴ１と称される）をＴＯＰ１０細胞に形質転換した。
実施例１３
ビブリオ・フルビアリスＡＰＴのアラニン：アセトインアミノトランスフェラーゼ活性の特徴づけ
容量５ｍＬのＬＢ培養液＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリンにＴＯＰ１０／ｐＢＡＤ：ＡＰＴ１細胞の新しいコロニーを接種した。培養物を振とう下（２２５ｒｐｍ）、３７℃で約１６時間インキュベートした。この培養物の一定分量３００μＬを用い、同じ培地３００ｍＬに接種し、それを振とう下（２２５ｒｐｍ）、３７℃でインキュベートした。培養物が０．８のＯＤ６００に達した際、Ｌ−アラビノースを添加して最終濃度を０．２％（ｗ／ｖ）にした。培養物をさらに１６時間インキュベートし、次いで収集した。細胞を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で１回洗浄し、次いで−８０℃で凍結保存した。
酵素を単離するため、細胞ペレットを解凍し、０．２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸塩、１ｍＭのジチオトレイトールおよび１タブレットのプロテアーゼ阻害剤カクテル（インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）のロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を含有する１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）８ｍＬ中に再懸濁した。細胞を９００ｐｓｉのフレンチプレッシャーセル（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）に２回通過させることによって溶解し、得られた溶解液を１７０００×ｇでの３０分間の遠心分離により清澄化した。硫酸アンモニウムを３５％の飽和物に添加し、溶液を室温で３０分間撹拌し、その時点で沈殿した固体を遠心分離（３０分、１７０００×ｇ）により除去した。さらに硫酸アンモニウムを上清に添加することで５５％の飽和状態が得られ、溶液を再び室温で３０分間撹拌した。沈殿した固体を遠心分離（３０分、１７０００×ｇ）により除去し、次いで１０μＭのピリドキサル５’−リン酸および１ｍＭのジチオトレイトールを含有する１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）５ｍＬ中に再懸濁した。この溶液を、緩衝液Ａ（１０μＭピリドキサル５’−リン酸および１ｍＭジチオトレイトールを含有する５０ｍＭビス−トリスプロパン緩衝液（ｐＨ６））で平衡化したＰＤ１０カラムに通過させることによって脱塩した。次いで、脱塩抽出物を緩衝液Ａで予め平衡化した２０ｍＬ Ｑ−Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム上に装填した。ＡＰＴを緩衝液Ａ中に線形勾配０〜０．１ＭのＮａＣｌで溶出した。酵素を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析時での約５０ｋＤの大きさのタンパク質バンドの存在および４１８ｎｍでの特徴的な吸光度により、溶出画分中に検出した。酵素を含有する画分を約０．３Ｍ ＮａＣｌで溶出させた。これらの画分をプールすることで５．４５ｍｇ／ｍＬの酵素溶液が全部で６ｍＬ生成され、それはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による判断では９０％を超えて純粋であった。
ＡＰＴのアラニン：アセトインアミノトランスフェラーゼ活性を、乳酸脱水素酵素との共役アッセイを用いてアッセイした。反応混合物は、１００ｍＭのビス−トリスプロパン（ｐＨ９．０）、１０μＭのピリドキサル５’−リン酸、０〜５０ｍＭのアセトイン、０〜５ｍＭのＬ−アラニン、０．１４もしくは０．２８ｍｇ／ｍＬの精製酵素、２００μＭのＮＡＤＨおよび２０Ｕ／ｍＬの乳酸脱水素酵素（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のシグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有した。反応後、３４０ｎｍでの吸光度における変化を測定し、それはＮＡＤＨの酸化を示した。これらの条件下で、アセトインにおけるｋｃａｔ／Ｋｍは１０Ｍ−１ｓ−１であり、かつＬ−アラニンにおけるｋｃａｔ／Ｋｍは４００Ｍ−１ｓ−１であった。
予想される生成物３−アミノ−２−ブタノールの同一性を合成標準との比較により確認した。（Ｒ，Ｒ）−および（Ｓ，Ｓ）−３−アミノ−２−ブタノールの混合物をディッキー（Ｄｉｃｋｅｙ）らの方法［Ｊ Ａｍｅｒ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ７４：９４４（１９５２年）］により合成し、５ｇのトランス−２，３−エポキシブタンを冷温（４℃）のＮＨ４ＯＨ１５０ｍＬ中にゆっくり撹拌した。反応物を室温にゆっくり温め、密封し、室温でさらに１０日間撹拌した。この時点で、過剰なアンモニア、水および残留エポキシブタンを、４０℃、真空下で回転蒸発により除去した。得られた透明な油（２．９ｇ）を水中に再懸濁して１０％（ｗ／ｖ）の濃度にした。所望の生成物の生成を、ＮＭＲ分析およびスペクトルのレヴィー（Ｌｅｖｙ）らによって報告されたもの［Ｏｒｇ．Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ １４：２１４頁（１９８０年）］との比較により確認した。対応する（２Ｒ，３Ｓ）−および（２Ｓ，３Ｒ）−異性体の混合物を、出発原料が２，３−エポキシブタンのシス異性体であること以外では同一の方法を用いて生成した。
３−アミノ−２−ブタノールを検出するための分析方法を、ロス（Ｒｏｔｈ）により報告されたアミノ酸決定におけるｏ−フタルジアルデヒド誘導体化法［Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．４３：８８０頁（１９７１年）］に基づいて開発した。１ｍＭの３−アミノ−２−ブタノール（異性体の混合物）の一定分量２００μＬをホウ酸塩の５０ｍＭ溶液２００μＬ（ｐＨ９．５）と混合し、それに対してエタノール中の５μＬ／ｍＬの２−メルカプトエタノール１０μＬおよびエタノール中の１０ｍｇ／ｍＬのｏ−フタルジアルデヒド１０μＬを添加した。溶液を室温で１０分間インキュベートし、その時点で誘導体をヘキサン２００μＬに抽出した。ヘキサンをデカンティングにより水溶液から分離し、１０μＬをＣｈｉｒａｃｅｌ ＯＤ ＨＰＬＣカラム（ニュージャージー州フォートリー（Ｆｏｒｔ Ｌｅｅ）のダイセル・ケミカル・インダストリーズ（Ｄａｉｃｅｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ））上に注入した。カラムは、９０：１０のヘキサン：イソプロパノールの移動相により１ｍＬ／分の速度で一定組成を維持しながら（ｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙ）動かした。３−アミノ−２−ブタノールの誘導体化された異性体を、約１５．７分および約１６．８分［（２Ｓ，３Ｓ）および（２Ｒ，３Ｒ）］ならびに約１８．４分および約２１．９分［（２Ｒ，３Ｓ）および（２Ｓ，３Ｒ）］の保持時間で３４０ｎｍの吸光度により検出した。第１の混合物中で鏡像異性体を区別するため、純粋な（２Ｒ，３Ｒ）異性体（ミシガン州ヴィクスバーグ（Ｖｉｃｋｓｂｕｒｇ）のブリッジ・オーガニクス（Ｂｒｉｄｇｅ Ｏｒｇａｎｉｃｓ））についても同一の条件下で行い、１６．８分でピークであることを見出した。第２の混合物中で鏡像異性体を区別するため、混合物をまず動力学的にアラニン：アセトインアミノトランスフェラーゼを用いて溶解し、０．２８ｍｇの精製酵素を１００ｍＭのビス−トリスプロパン１ｍＬ（ｐＨ９．０）中の１０ｍＭのピルビン酸塩および１０ｍＭの３−アミノ−２−ブタノール［（２Ｒ，３Ｓ）および（２Ｓ，３Ｒ）異性体の１：１混合物］とともにインキュベートした。室温で２４時間後、一定分量を除去し、上記のように分析した。分析によると、１８．４分のピークが９５％損なわれる一方、２１．９分のピークが９０％超保持されることが示された。残留する反応混合物の一定分量１００μＬを、２０ｍＭのＮＡＤＨ５０μＬおよび実施例９に記載のＴＯＰ１０／ｐＴｒｃ９９ａ−ＢｕｄＣ株からの抽出物１０μＬと混合した。ＢｕｄＣ酵素は、（Ｒ）−アセトインをメソ−２，３−ブタンジオールに、かつ（Ｓ）−アセトインを（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールに還元することが知られている［ウイ（Ｕｉ）ら、（２００４年） Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３９：５３３−５３７頁］。３時間後、試料を反応物から採取し、アセトインおよびブタンジオールについて上記のように分析した。分析によると、還元の一次生成物がメソ−２，３−ブタンジオールであることが示され、それはアミノトランスフェラーゼ反応の生成物が（Ｒ）−アセトインであることから、消費された３−アミノ−２−ブタノール異性体が（２Ｒ，３Ｓ）異性体であることが示された。したがって、保持時間では１８．４分をこの異性体にかつ２１．９分を（２Ｓ，３Ｒ）異性体に指定することが可能である。
ＡＰＴで触媒されるアラニン：アセトインアミノトランスフェラーゼ反応の生成物が３−アミノ−２−ブタノールであることを確認するため、０．２８ｍｇの精製酵素を１００ｍＭビス−トリスプロパン１ｍＬ（ｐＨ９．０）中の１０ｍＭアセトイン、１０ｍＭ Ｌ−アラニン、５０Ｕ乳酸脱水素酵素および２００μＭ ＮＡＤＨとともにインキュベートした。反応混合物を室温で２０時間インキュベートした後、一定分量２００μＬを除去し、上記のように誘導体化した。誘導体化された生成物の保持時間は、１５．８分（主な生成物）および１８．５分（わずかな生成物）であり、（２Ｓ，３Ｓ）−および（２Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−２−ブタノールの標準の保持時間に一致した。
実施例１４
エルウィニア・カロトボーラ・サブエスピー・アトロセプチカのアミノアルコールキナーゼおよびアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼにおける同定およびクローニング
この実施例の目的は、エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）細菌に由来するアミノアルコールキナーゼおよびアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼをコードする配列の同定およびクローニングについて記載することである。これら２種の酵素は、図１に示される、３−アミノ−２−ブタノールから２−ブタノンへの中間体３−アミノ−２−ブタノールリン酸塩を介する変換における経路１の一部である。
エルウィニアのアミノアルコールキナーゼおよびアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼの予測
ＡＴＰ依存性のアミノアルコールキナーゼおよびアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼの活性が、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｐ６（ＮＣＩＢ１０４３１）、シュードモナス・プチダＮＣＩＢ １０５５８（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、（１９７３年） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３４：１６７−１８２頁）、エルウィニア・カロトボーラ、エルウィニア・アマナス（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍａｎａｓ）、エルウィニア・ミレティエ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｍｉｌｌｅｔｉａｅ）、およびエルウィニア・アトロセプチカ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、（１９７３年） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３４：９５９−９６８頁）を含むいくつかのシュードモナス種およびエルウィニア種において検出されている。これらの研究では、上記の種の抽出物が、アミノプロパノールＯ−リン酸からプロピオンアルデヒドを通じてのアミノプロパノールの酵素変換およびエタノールアミンＯ−リン酸からアセトアルデヒドを通じてのエタノールアミンの変換における活性を有することが示された。
これらの活性が存在することが報告されたエルウィニア・アトロセプチカ株のゲノム配列（現在、エルウィニア・カロトボーラ・サブエスピー・アトロセプチカ株ＳＣＲＩ１０４３（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−６７２）と表される）が、サンガー・インスティチュート（Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で決定されている（ベル（Ｂｅｌｌ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３０）：１１１０５−１１１１０頁）。エルウィニア・カロトボーラ・サブエスピー・アトロセプチカのゲノムにおける推定上のキナーゼの分析によると、オペロン配列（配列番号１６４）は、リゾビウムロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）のホモセリンキナーゼに対して３９％同一である推定上のタンパク質（ＥＣＡ２０５９；配列番号１２４）およびリゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）由来の推定上のアミノトランスフェラーゼに対して５８％同一である推定上のクラスＩＩＩのピリドキサルリン酸（ＰＬＰ）依存性のアミノトランスフェラーゼ（ＥＣＡ２０６０；配列番号１２６）をコードすることが示された。上記に基づき、ＥＣＡ２０５９がアミノアルコールキナーゼでありかつＥＣＡ２０６０がＰＬＰを共同因子として用いるアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼであることが予想された。
エルウィニア・カロトボーラ・サブエスピー・アトロセプチカ由来の推定上のアミノアルコールキナーゼおよび推定上のアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼのクローニング
エルウィニア・カロトボーラ・サブエスピー・アトロセプチカ（ＡＴＣＣ番号：ＢＡＡ−６７２Ｄ）のゲノムＤＮＡをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）から入手した。推定上のアミノアルコールキナーゼ（ＫＡ）およびアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼ（ＡＴ）をコードするオペロン配列はＫＡ−ＡＴ（配列番号１６４）と称された。このオペロンを、プライマーＯＴ８７２（配列番号１２７）およびＯＴ８７３（配列番号１２８）を用い、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザイム（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）；マサチューセッツ州イプスウィッチ（Ｉｐｓｗｉｃｈ）のニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）による）により、エルウィニアのゲノムＤＮＡから増幅した。２．４ｋｂのＤＮＡ断片をＰＣＲ反応により得て、それはＫＡ−ＡＴオペロンの大きさに対応する。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ制限酵素で消化し、ベクターｐＫＫ２２３−３（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）のアマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））にクローニングし、それを同じ制限酵素で消化した。これにより、ｔａｃプロモーターの制御下で推定上のエルウィニアアミノアルコールキナーゼ−リアーゼのオペロンを有するプラスミドｐＫＫ２２３．ＫＡ−ＡＴが生成された。同様に、プラスミドのｐＫＫ２２３．ＫＡおよびｐＫＫ２２３．ＡＴを作製し、それら別々のベクター内に推定上のエルウィニアキナーゼおよび推定上のエルウィニアリアーゼのコード領域が各々ｔａｃプロモーターの制御下で配置された。ＫＡコード領域（配列番号１２３）のＰＣＲクローニングにおいてはプライマーのＯＴ８７２（配列番号１２７）およびＯＴ８７９（配列番号１２９）を用いる一方、ＡＴコード領域（配列番号１２５）のＰＣＲクローニングにおいてはプライマーのＯＴ８７３（配列番号１２８）およびＯＴ８８０（配列番号１３０）をＰＣＲ増幅において用い、それにより１．１ｋｂおよび１．３ｋｂのＰＣＲ産物が各々生成された。各ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、ベクターｐＫＫ２２３−３にライゲートすることでｐＫＫ２２３．ＫＡおよびｐＫＫ２２３．ＡＴが生成された。
エルウィニア・カロトボーラ・サブエスピー・アトロセプチカ由来の推定上のアミノアルコールキナーゼおよび推定上のアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼのインビボ活性
プラスミドのｐＫＫ２２３．ＫＡ−ＡＴ、ｐＫＫ２２３．ＫＡ、ｐＫＫ２２３．ＡＴおよびｐＫＫ２２３−３を大腸菌ＭＧ１６５５株に形質転換した。形質転換体を、１％グルコース、単独の窒素源としての０．５％アミノプロパノール、１ｍＭのＩＰＴＧおよび１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＭＯＰＳ最少培地プレート上に再ストリークした。ＫＡ−ＡＴ、ＫＡおよびＡＴ遺伝子の発現をＩＰＴＧにより誘導した。対照プレートにはＩＰＴＧが全く含まれなかった。プレートを３７℃で７日間インキュベートした。ＩＰＴＧを有するプレート上で、ＭＧ１６５５／ｐＫＫ２２３．ＫＡ−ＡＴ株のみが成長した一方、他の３つの株全部が成長しなかった。ＩＰＴＧの添加を伴わないプレート上で、ＭＧ１６５５／ｐＫＫ２２３．ＫＡ−ＡＴ株が成長したが、コロニーはＩＰＴＧを有するプレート上でのコロニーよりも有意に小さく、それはＫＡおよびＡＴにおける未誘導細胞内でのより低い発現レベルに対応する。他の３つの株の中でこのプレート上で成長したものは全くなかった。これは、推定上のエルウィニアのＫＡおよびＡＴ遺伝子の同時発現により大腸菌株ＭＧ１６５５／ｐＫＫ２２３．ＫＡ−ＡＴにおける単独の窒素源としてのアミノプロパノールの利用を可能にする十分な酵素活性がもたらされたことを示す。ＫＡまたはＡＴのいずれかの各個別の酵素の発現が、インビボでかかる酵素活性をもたらすのに十分ではなかった。
実施例１５
エルウィニアの推定上のアミノアルコールキナーゼおよびアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼのインビトロ活性
エルウィニアのＫＡ−ＡＴオペロンのｐＢＡＤ．ＨｉｓＢベクターへのサブクローニングおよびタンパク質発現の誘導
ｐＫＫ２２３．ＫＡ−ＡＴベクターからＭＧ１６５５細胞内で発現されたエルウィニアの推定上のＫＡおよびＡＴ酵素のタンパク質発現レベルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。エルウィニアのＡＴ酵素の発現レベルは比較的低く、ここで新しいタンパク質バンドが細胞抽出物の可溶性画分中で４６ｋＤの正確な分子量で検出された一方、ＫＡ酵素において予測された大きさでは新しいタンパク質バンドが全く検出されなかった。
エルウィニアの推定上のＫＡおよびＡＴ遺伝子の発現を改善する目的で、ＫＡ−ＡＴオペロンをベクターｐＢＡＤ．ＨｉｓＢ−ＥｃｏＲＩのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングした。プライマーのＯＴ９０９（配列番号１３１）およびＯＴ９１０（配列番号１３２）を用い、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位に特異的な突然変異誘発（カリフォルニア州ラホヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）のストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を介してｐＢＡＤ．ＨｉｓＢ内のＮｃｏＩ部位をＥｃｏＲＩ部位と置換することにより、ｐＢＡＤ．ＨｉｓＢ−ＥｃｏＲＩをｐＢＡＤ．ＨｉｓＢベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））から誘導した。作成されたプラスミドｐＢＡＤ．ＫＡ−ＡＴでは、ＫＡ−ＡＴオペロンをａｒａＢプロモーター（Ｈｉｓタグを含まない）の制御下に直接配置した。
ｐＢＡＤ．ＫＡ−ＡＴプラスミドを大腸菌ＴＯＰ１０株に形質転換した。ＴＯＰ１０／ｐＢＡＤ．ＫＡ−ＡＴ株の培養物５０ｍＬを、ＬＢの１００μｇ／ｍＬのアンピシリン培地内で、２５０ｒｐｍの振とう下、３７℃で対数期中期（ＯＤ６００＝０．６）まで成長させた。培養物をＬ−アラビノースの添加により誘導し、最終濃度を０．１％（ｗ／ｖ）にし、それを、遠心分離により収集する前に、さらに３７℃で５時間インキュベートした。細胞ペレットをｐＨ８．０の氷冷した５０ｍＭトリス−ＨＣｌ中に再懸濁し、Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｏｎｉｃ Ｍｏｄｅｌ ３００ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（ペンシルバニア州ピッツバーグ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）のフィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ））を５０％出力で用いる超音波処理により氷上で破壊し、３０秒の超音波処理で４サイクル分（各サイクル間に６０秒の休止を伴う）繰り返した。超音波処理した各試料を遠心分離した（１５，０００×ｇ、４分、４℃）。清澄化した細胞を含有しない抽出物におけるタンパク質発現レベルおよびアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼ活性について分析した。
アミノブタノールＯ−リン酸およびアミノプロパノールＯ−リン酸の化学合成
（Ｒ，Ｒ）−３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸の基質をホスホエタノールアミンについてのフェラーリ（Ｆｅｒｒａｒｉ）およびフェラーリ（Ｆｅｒｒａｒｉ）によって報告された方法（米国特許第２７３０５４２号明細書［１９５６年］）に基づく方法により合成した。すなわち、５０％（ｗ／ｖ）水溶液中の１０ｍｍｏｌのＨ３ＰＯ４を、 ３−アミノ−２−ブタノール（約２０：１（Ｒ，Ｒ）：（Ｓ，Ｓ）異性体；（ミシガン州ヴィクスバーグ（Ｖｉｃｋｓｂｕｒｇ）のブリッジ・オーガニクス（Ｂｒｉｄｇｅ Ｏｒｇａｎｉｃｓ））の５０％（ｗ／ｖ）溶液と氷上で撹拌しながら混合させた。混合後、溶液を室温にゆっくりと温め、次いで真空下で撹拌し、７０℃に加熱した。７０℃で１時間後、温度を１８５℃にゆっくりと上昇させ、そこでさらに２時間維持した。その時点で反応物を室温まで冷却し、真空を開放した。残留原料を水中に溶解し、ＮＭＲによる分析によると、出発原料の８０％が２０％が未反応のままの生成物に変換させることが示された。さらに生成物が観察されることはなかった。
追加の基質として（２Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸および（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸を、出発原料として（実施例１３に記載のように合成された）（２Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−２−ブタノールと（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノ−２−ブタノールの１：１混合物を用いる同じ手順により合成した。ＤＬ−１−アミノ−２−プロパノールＯ−リン酸、（Ｓ）−２−アミノ−１−プロパノールＯ−リン酸、および（Ｒ）−２−アミノ−１−プロパノールＯ−リン酸を、出発原料としてＤＬ−１−アミノ−２−プロパノール、（Ｒ）−２−アミノ−１−プロパノール、または（Ｓ）−２−アミノ−１−プロパノールを用いる同じ手順により合成した。
推定上のエルウィニアのＫＡ−ＡＴオペロンによってコードされるアミノプロパノールＯ−リン酸リアーゼ活性の分析
アミノプロパノールＯ−リン酸リアーゼのアッセイをジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら（１９７３年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． １３４：１６７−１８２頁）およびＧ．ゴリ（Ｇ．Ｇｏｒｉ）ら（１９９５年、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ ４０：３３６頁）で記載のように実施した。アミノプロパノールＯ−リン酸からのプロピオンアルデヒドの形成をＭＢＴＨを用いて比色分析でアッセイした。それによりアルデヒド形成の検出が可能である。反応を以下のように行った。反応物１ｍＬ中で、大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＢＡＤ．ＫＡ−ＡＴの１００μｇの細胞を含有しない抽出物を、０．１ｍＭ ＰＬＰとともにｐＨ７．８の１００ｍＭトリス−ＨＣｌ中の１０ｍＭ ＤＬ−１−アミノ−２−プロパノールＯ−リン酸に添加した。反応物を３７℃で１０分間および３０分間インキュベートするとともに、反応混合物の一定分量１００μＬを各時点で除去し、３７５ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７中の６ｍｇ／ｍＬのＭＢＴＨ１００μＬと混合した。この混合物を１００℃で３分間インキュベートし、氷上で１５〜３０秒間冷却し、３．３ｍｇ／ｍＬ ＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏ１ｍＬ（１０ｍＭ ＨＣｌ中）を添加した後、室温で３０分間インキュベートした。アルデヒド−ＭＢＴＨ付加体を含有する反応混合物の吸光度を６７０ｎｍで測定した。アッセイの結果を表９に挙げる。アミノプロパノールリン酸塩基質、ＰＬＰおよび細胞を含有しない抽出物の存在下で、０．３以下の対照のバックグラウンドよりも高いＡｂｓ６７０により示されるようにアルデヒドの形成を検出した。基質または細胞を含有しない抽出物のいずれかの不在下で、アルデヒドの形成が全く検出されなかった。添加されたＰＬＰの不在下で、おそらくは細胞を含有しない抽出物中でのＰＬＰの存在に起因し、やや少量のアルデヒドが検出された。未誘導のＴＯＰ１０／ｐＢＡＤ．ＫＡ−ＡＴ−培養物の細胞を含有しない抽出物から、反応物中で任意の検出可能なアルデヒドが生成されなかった。これらの結果によると、推定上のエルウィニアアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼがアミノプロパノールＯ−リン酸からプロピオンアルデヒドへの変換を触媒しないことが示された。
Figure 2009535062
アミノブタノールＯ−リン酸基質に対するエルウィニアのアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼの活性の分析
アミノブタノールＯ−リン酸基質に対するアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼの活性を、上記と同じ条件下で試験した。反応を、大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＢＡＤ．ＫＡ−ＡＴの１００μｇの細胞を含有しない抽出物、０．１ｍＭ ＰＬＰとともにｐＨ７．８の１００ｍＭトリス−ＨＣｌ中の１０ｍＭのアミノブタノールＯ−リン酸（実施例１５に記載の（Ｒ，Ｒ）＋（Ｓ，Ｓ）の混合物または（Ｒ，Ｓ）＋（Ｓ，Ｒ）異性体の混合物のいずれか）を含有する反応物１ｍＬ中で３７℃で一晩行った。反応混合物の一定分量１００μＬを除去し、２−ブタノン生成物を一般的方法に記載のＭＢＴＨ誘導体化方法を用いて検出した。誘導体化された２−ブタノン異性体を表す２つのピークが観察された。したがって、エルウィニアのアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼは、アミノプロパノールリン酸ホスホリアーゼに加えてアミノブタノールリン酸ホスホリアーゼである。
アミノプロパノールＯ−リン酸およびアミノブタノールＯ−リン酸の立体異性体に対するエルウィニアのアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼの活性の分析
アミノプロパノールＯ−リン酸およびアミノブタノールＯ−リン酸の様々な立体異性体に対するエルウィニアのアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼの活性を上記と同じ条件下で試験した。エルウィニアのアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼの存在下で、（Ｒ）および（Ｓ）−２−アミノ−１−プロパノールＯ−リン酸の双方を酵素によりプロパノンに変換したが、生成物収量は（Ｓ）異性体の場合に著しく多かった。酵素は３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸異性体の両混合物からブタノンも生成し、より多量の生成物収量が（Ｒ，Ｓ）および（Ｓ，Ｒ）基質異性体を有する反応物中に見出された。プロパノンおよびブタノン生成物の双方を、一般的方法に記載のようにＭＢＴＨにより誘導体化してＨＰＬＣにより検出した。
エルウィニアのアミノアルコールキナーゼおよびアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼにおける遺伝子発現レベルの最適化
エルウィニアのアミノアルコールキナーゼおよび大腸菌内でのアミノアルコールＯ−リン酸リアーゼにおける発現レベルを改善するため、両酵素（各々、ＥＫＡ：配列番号１５５およびＥＡＴ：配列番号１５６と称される）におけるコドンが最適化されたコード領域をＤＮＡ２．０（カリフォルニア州レッドウッド・シティ（Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ））により合成した。各コード領域をクローニングにおける制限部位（ＥＫＡは５’ＢｂｓＩおよび３’ＥｃｏＲＩを有する）、ＨｉｎｄＩＩＩ部位（ＥＡＴは５’ＥｃｏＲＩを有する）および３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む５’および３’テール（ｔａｉｌｓ）とともに合成した。ＥＫＡおよびＥＡＴのコード領域は、ＤＮＡ２．０のｐＪ５１ベクター内に存在するプラスミドのｐＥＫＡおよびｐＥＡＴとしてＤＮＡ２．０から提供された。ＥＫＡの最適化されたコード領域をｐＥＫＡのＢｂｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化された断片をＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間のｐＢＡＤ．ＨｉｓＢベクターにライゲートすることによりサブクローニングすることで、プラスミドｐＢＡＤ．ＥＫＡが生成された。得られたプラスミドでは、コード領域がＨｉｓタグの５’側であることから、エルウィニアのアミノアルコールキナーゼに融合されたＮ末端Ｈｉｓ６タグにおけるコード領域を、プライマー配列番号１５７および配列番号１５８を用いるＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発反応を行うことにより作成し、ベクターｐＢＡＤ．Ｈｉｓ−ＥＫＡが生成された。
ｐＢＡＤ．Ｈｉｓ−ＥＫＡを大腸菌株ＢＬ２１−ＡＩ（Ｆ−ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ ｄｃｍ ａｒａＢ：：Ｔ７ＲＮＡＰ−ｔｅｔＡ；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に形質転換し、ＢＬ２１−ＡＩ／ｐＢＡＤ．ＨｉｓＡ−ＥＫＡ株を生成した。ＢＬ２１−ＡＩ／ｐＢＡＤ．ＨｉｓＡ−ＥＫＡの培養物５０ｍＬを対数増殖期中期（ＯＤ６００＝０．６）まで成長させ、０．１％アラビノースで誘導し、さらに３０℃で一晩インキュベートした。細胞を含有しない抽出物を超音波処理により調製した。エルウィニアのアミノアルコールキナーゼのＨｉｓ６で標識された融合タンパク質を、非変性の精製条件下でＰｒｏＢｏｎｄ（商標）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用い、製造業者の使用説明書に準じて精製した。
予想結果
Ｈｉｓ６で標識されたエルウィニアのアミノアルコールキナーゼのキナーゼ活性を、ＡＤＰ Ｑｕｅｓｔアッセイ（カリフォルニア州フレモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ）のディスカバーエックス（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ））により製造業者の使用説明書に準じて分析する。これは基質としてアミノプロパノールまたはアミノブタノールのいずれかを用いるアミノアルコールキナーゼ反応の生成物であるＡＤＰの蓄積を測定する生化学的アッセイである。１０ｍＭの基質を、反応物０．２ｍＬ中で、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＡＴＰの中でＨｉｓ６で標識されたエルウィニアのアミノアルコールキナーゼと混合し、３７℃で１時間インキュベートする。ＡＤＰ試薬Ａ（１００μＬ）およびＡＤＰ試薬Ｂ（２００μＬ）を添加し、混合物を室温で３０分間インキュベートする。活性を示す蛍光シグナルを５３０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの放射波長で測定する。
実施例１６
経路３全体の発現
ベクターｐＣＬＢｕｄＡＢ−ｔｅｒ−Ｔ５ｃｈｎＡの作成
ベクターｐＴｒｃ９９ａ：：ＢｕｄＡＢＣ（実施例９に記載）をＥｃｏＲＩで消化し、ＤＮＡをＫｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼで処理して末端を平滑化する。次いで、平滑化されたベクターをＳｐｅＩで消化することでｂｕｄＡおよびｂｕｄＢ遺伝子を有する２．５ｋｂの断片が生成される。ベクターｐＣＬ１９２５−ｔｅｒ−Ｔ５ｃｈｎＡ（実施例９に記載）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＤＮＡをＫｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼで処理して末端を平滑化する。次いで、平滑化されたベクターをＸｂａＩで消化することで４．６ｋｂの断片が生成され、次いでそれをｐＴｒｃ９９ａ：：ＢｕｄＡＢＣ由来のｂｕｄＡＢ断片にライゲートする。ｐＣＬＢｕｄＡＢ−ｔｅｒ−Ｔ５ｃｈｎＡと称される得られたプラスミドを用いて大腸菌Ｔｏｐ１０細胞を形質転換し、単一のコロニーにおける適切なプラスミド構造について、プライマーのｐＣＬ１９２５ｖｅｃＦ（配列番号６２）およびＮ８４ｓｅｑＲ３（配列番号１５９）を用いるＰＣＲによりスクリーニングする。プラスミドを、１．４ｋｂの予想サイズのＰＣＲ産物を生成する単一のコロニーから調製する。
ベクターｐＫＫ２２３．ＫＡ−ＡＴ−ＡＰＴの作成
ＡＰＴ遺伝子を、プライマーのＡＰＴｆｏｒ（配列番号１６２；５’がＲＢＳおよびＳｍａＩ部位を含む）およびＡＰＴｒｅｖ（配列番号１６３；３’にＳｍａＩ部位が付加）を用いるＰＣＲによりベクターｐＢＡＤ．ＡＰＴ（実施例１２に記載）から増幅する。１．７ｋｂｐの予想サイズの産物をゲル精製し、ＳｍａＩで消化し、平滑末端を生成する。ベクターｐＫＫ２２３．ＫＡ−ＡＴ（実施例１４に記載）をＰｓｔＩで消化し、ＤＮＡをＫｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼで処理して末端を平滑化する。得られたＤＮＡ断片をＳｍａＩで消化したＰＣＲ産物とライゲートし、ライゲーション産物を用いて大腸菌Ｔｏｐ１０細胞を形質転換する。アンピシリンに耐性がある各コロニーをプライマーのＯＴ８７２（配列番号１２７）およびＡＰＴｒｅｖ（配列番号１６３）を用いるＰＣＲによりスクリーニングする。４．１ｋｂｐの予想サイズのＰＣＲ産物の存在が、ＡＰＴをコードする遺伝子が存在しかつＫＡおよびＡＴをコードする遺伝子と同じ方向に方向付けられていることを示す。挿入物の配列をプライマーのＡＰＴｓｅｑＲｅｖ（配列番号１６０）およびＡＰＴｓｅｑＦｏｒ（配列番号１６１）を用いて検証する。このプラスミドはｐＫＫ２２３．ＫＡ−ＡＴ−ＡＰＴと称される。全部で３つの遺伝子の適切な発現について、ＬＢ＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリン内のＴｏｐ１０／ｐＫＫ２２３．ＫＡ−ＡＴ−ＡＰＴの培養物５ｍＬを振とう下、３７℃で成長させることにより検証する。ＯＤ６００が約０．８に達する場合、プラスミド上での遺伝子の発現が、ＩＰＴＧの添加で０．４ｍＭにすることにより誘導される。発現を上記のＳＤＳ ＰＡＧＥおよび活性についてのアッセイにより評価する。
２−ブタノール生成株の作成および２−ブタノンおよび２−ブタノールの生成
大腸菌株ＭＧ１６５５をｐＫＫ２２３．ＫＡ−ＡＴ−ＡＰＴおよびｐＣＬＢｕｄＡＢ−ｔｅｒ−Ｔ５ｃｈｎＡの双方を用いて形質転換し、形質転換体を、プラスミドの存在を示すアンピシリンおよびスペクチノマイシン耐性に対して選択する。細胞を、（適切な抗生物質を有する）５０ｍＬもしくは１５０ｍＬのＴＭ３ａ／グルコース培地（各々、中程度の酸素条件および低い酸素条件を表す）を有する振とうフラスコ（約１７５ｍＬの全容量）に接種する。ＩＰＴＧを０．４ｍＭに添加し、ｐＫＫ２２３．ＫＡ−ＡＴ−ＡＰＴからの遺伝子の発現を誘発する。負の対照としてＭＧ１６５５細胞を抗生物質を含有しない同じ培地内で成長させる。フラスコに０．０１以下の初期ＯＤ６００で接種し、フラスコを３００ｒｐｍの振とう下、３４℃で２４時間インキュベートする。培地５０ｍＬを有するフラスコを空気抜きキャップで覆う一方、培地１５０ｍＬを有するフラスコを密封キャップで覆って換気を最小限にする。２−ブタノール生合成経路を含むＭＧ１６５５／ｐＫＫ２２３．ＫＡ−ＡＴ−ＡＰＴ／ｐＣＬＢｕｄＡＢ−ｔｅｒ−Ｔ５ｃｈｎＡ株が低い酸素条件下および中程度の酸素条件下で２−ブタノンおよび２−ブタノールの双方を生成する一方、負の対照株は２−ブタノンまたは２−ブタノールのいずれにしても検出可能なレベルで生成することはない。
実施例１７
グリセロールデヒドラターゼおよびブタンジオールデヒドラターゼ活性の特徴づけ
グリセロールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）およびジオールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）は構造的に関連性がある一方、当該技術分野では基質特異性を含む様々な差異に基づいて区別されることが多い。この実施例では、グリセロールデヒドラターゼがメソ−２，３−ブタンジオールを２−ブタノンに変換することを示す。グリセロールデヒドラターゼの複数のサブユニット（α：配列番号１４５（コード領域）および１４６（タンパク質）；β：配列番号１４７（コード領域）および１４８（タンパク質）；およびγ：配列番号１４９（コード領域）および１５０（タンパク質））をコードするクレブシエラ・ニューモニエ遺伝子、ならびにグリセロールデヒドラターゼレアクティバーゼの複数のサブユニット（大型サブユニット、配列番号１５１（コード領域）および１５２（タンパク質）；および小型サブユニット、配列番号１５３（コード領域）および１５４（タンパク質））をコードするクレブシエラ・ニューモニエ遺伝子を含む組換え大腸菌株ＫＬＰ２３／ｐＳＹＣＯ１２が、エムプテージ（Ｅｍｐｔａｇｅ）ら、米国特許第６，５１４，７３３号明細書および国際公開第２００３０８９６２１号パンフレット（これらは参照により本明細書中に援用される）にて記載されている。ＫＬＰ２３／ｐＳＹＣＯ１２の細胞を含有しない粗抽出物を当業者に既知の方法により調製した。酵素アッセイを、光の不在下、１２μＭの補酵素Ｂ１２および１０ｍＭのメソ−２，３−ブタンジオールを有するｐＨ８．２の８０ｍＭヘペス緩衝液中、３７℃で行った。２−ブタノンの形成をＨＰＬＣ（屈折率検出を有するショーデックス（Ｓｈｏｄｅｘ） ＳＨ−１０１１カラムおよびＳＨ−Ｇガードカラム；０．５ｍＬ／分の流速および５０℃のカラム温度での移動相として０．０１Ｍ Ｈ２ＳＯ４；２−ブタノンの保持時間＝４０．２分）により監視した。グリセロールデヒドラターゼの調製による２−ブタノン形成の速度が粗タンパク質に対して０．４ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであると判断した。
２−ブタノンおよび２−ブタノールの生合成における４つの異なる経路を示す。

Claims (35)

  1. ｉ）ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
    ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
    ｉｉｉ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへ、
    ｉｖ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸へ、
    ｖ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへ、および
    ｖｉ）２−ブタノンから２−ブタノールへ、
    からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞であって、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物の宿主細胞に対して異種であり、かつ該微生物の宿主細胞が２−ブタノールを生産する、組換え微生物の宿主細胞。
  2. ｉ）ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
    ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
    ｉｉｉ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへ、
    ｉｖ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸へ、および
    ｖ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへ、
    からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞であって、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物の宿主細胞に対して異種であり、かつ該微生物の宿主細胞が２−ブタノンを生産する、組換え微生物の宿主細胞。
  3. ピルビン酸からα−アセト乳酸への生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセト乳酸シンターゼである、請求項１または２に記載の宿主細胞。
  4. α−アセト乳酸からアセトインへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセト乳酸デカルボキシラーゼである、請求項１または２に記載の宿主細胞。
  5. アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセトインアミナーゼである、請求項１または２に記載の宿主細胞。
  6. ３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸塩への生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアミノブタノールキナーゼである、請求項１または２に記載の宿主細胞。
  7. ３−アミノ−２−ブタノールリン酸塩から２−ブタノンへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアミノブタノールリン酸ホスホリアーゼである、請求項１または２に記載の宿主細胞。
  8. ２−ブタノンから２−ブタノールへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがブタノール脱水素酵素である、請求項１に記載の宿主細胞。
  9. 細胞が、細菌、シアノバクテリア、糸状菌および酵母からなる群から選択される、請求項１または２に記載の宿主細胞。
  10. 細胞が、クロストリジウム属、ザイモモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、バチルス属、ラクトバチルス属、腸球菌属、ペディオコッカス属、アルカリゲネス属、クレブシエラ属、パエニバチルス属、アースロバクター属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ピキア属、カンジダ属、ハンセヌラ属およびサッカロミセス属からなる群から選択される属のメンバーである、請求項８に記載の宿主細胞。
  11. アセト乳酸シンターゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号４、配列番号７７、および配列番号７９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の宿主細胞。
  12. アセト乳酸デカルボキシラーゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号２、配列番号８１、および配列番号８３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の宿主細胞。
  13. アセトインアミナーゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０のシリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１２２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の宿主細胞。
  14. アミノブタノールキナーゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０のシリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１２４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の宿主細胞。
  15. アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０のシリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１２６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の宿主細胞。
  16. ブタノール脱水素酵素が、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１４、配列番号７２、配列番号７５、および配列番号９１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の宿主細胞。
  17. ２−ブタノールを生産させるための方法であって、
    １）ｉ）ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
    ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
    ｉｉｉ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへ、
    ｉｖ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸へ、
    ｖ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへ、および
    ｖｉ）２−ブタノンから２−ブタノールへ、
    からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞を提供し、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物宿主細胞に対して異種であり、そして
    ２）（１）の宿主細胞を２−ブタノールが生産される条件下の発酵培地内で発酵可能な炭素基質と接触させる、
    ことを含む、上記方法。
  18. ２−ブタノンを生産させるための方法であって、
    １）ｉ）ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
    ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
    ｉｉｉ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへ、
    ｉｖ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸へ、および
    ｖ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへ、
    からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞を提供し、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物宿主細胞に対して異種であり、そして
    ２）（１）の宿主細胞を２−ブタノンが生産させる条件下の発酵培地内で発酵可能な炭素基質と接触させる、
    ことを含む、上記方法。
  19. 発酵可能な炭素基質が単糖、オリゴ糖、および多糖からなる群から選択される、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. ピルビン酸からα−アセト乳酸への生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセト乳酸シンターゼである、請求項１７または１８に記載の方法。
  21. α−アセト乳酸からアセトインへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセト乳酸デカルボキシラーゼである、請求項１７または１８に記載の方法。
  22. アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセトインアミナーゼである、請求項１７または１８に記載の方法。
  23. ３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸への生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアミノブタノールキナーゼである、請求項１７または１８に記載の方法。
  24. ３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアミノブタノールリン酸ホスホリアーゼである、請求項１７または１８に記載の方法。
  25. ２−ブタノンから２−ブタノールへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがブタノール脱水素酵素である、請求項１７に記載の方法。
  26. 細胞が細菌、シアノバクテリア、糸状菌、および酵母からなる群から選択される、請求項１７または１８に記載の方法。
  27. 細胞が、クロストリジウム属、ザイモモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、バチルス属、ラクトバチルス属、腸球菌属、ペディオコッカス属、アルカリゲネス属、クレブシエラ属、パエニバチルス属、アースロバクター属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ピキア属、カンジダ属、ハンセヌラ属およびサッカロミセス属からなる群から選択される属のメンバーである、請求項２６に記載の方法。
  28. アセト乳酸シンターゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号４、配列番号７７、および配列番号７９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載の方法。
  29. アセト乳酸デカルボキシラーゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号２、配列番号８１、および配列番号８３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載の方法。
  30. アセトインアミナーゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０のシリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１２２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２２に記載の方法。
  31. アミノブタノールキナーゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０のシリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１２４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の方法。
  32. アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０のシリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１２６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の方法。
  33. ブタノール脱水素酵素が、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１４、配列番号７２、配列番号７５、および配列番号９１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２５に記載の方法。
  34. 請求項１７に記載の方法により生産される、２−ブタノールを含有する発酵生産物培地。
  35. 請求項１８に記載の方法により生産される、２−ブタノンを含有する発酵生産物培地。
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