CN101892218A - 一种醛缩酶的微波辅助固定化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固定化醛缩酶的制备方法，特别是醛缩酶的微波辅助固定化方法，所述的方法是：(1)对载体进行活化处理；(2)取步骤(1)得到的活化的载体液，按50mg醛缩酶自由酶/gMCFs-NH2的加酶量再加入醛缩酶自由酶得到混合液；(3)将步骤(2)得到的混合溶液在5℃，10-50W微波条件下照射1.5-7.5分钟，离心，取沉淀用pH 7.0，0.01M的PBS溶液洗涤，得到微波固定化醛缩酶。通过本发明方法制得的固定化醛缩酶在70℃保温条件下表现出的温度稳定性较醛缩酶自由酶有提高，特别是通过微波固定的微波固定化醛缩酶在低底物浓度下的催化效果可以达到醛缩酶自由酶和常规固定化方法获得的固定化醛缩酶在高底物浓度作用下的催化效果。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种生物化工中对酶进行固定化的工艺，具体是在单模微波辐射下、氨基功能化的介孔泡沫硅中的醛缩酶高效共价固定化方法。
(二)背景技术
酶作为一种生物催化剂，因其具有高选择性、催化反应条件温和、无污染等特点，广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业。但天然酶稳定性差、易失活、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。此外，分离和提纯酶以及它们的一次性使用也大大增加了其作为催化剂的成本。在此条件下，固定化酶的概念和技术得以提出和发展，并成为近几年酶工程研究的重点。
酶的固定化，即用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。依据酶的性质及用途，可分为吸附法、共价结合法、交联法、包埋法这几种。
醛缩酶作为可以催化碳碳原子立体成键的酶，可以广泛的应用在有机化学合成中，它可以方便的从起点小分子向大的复杂分子方向进行不对称催化合成，这个过程在碳水化合物为底物的反应中意义更为突出，应用酶的高区域选择性，能够容易避开对碳水化合物中的活泼的羟基的保护，更为突出的是在催化碳碳键合成的同时醛缩酶可以引入新的手性中心。正是这种能够高效引入手性碳原子的能力，使得醛缩酶在药物分子合成领域中有着广泛的应用，尤其值得一提的是醛缩酶可以用于2，4，6-三脱氧己糖化合物的合成，该化合物是多种他汀类药物合成的关键中间体，采用酶催化此中间体的合成，与化学工艺相比，具有明显优势，如：避免了有毒有害催化剂的使用，减少了有机溶剂的使用量，使反应由原来的苛刻-70℃变为常温条件进行，从替代传统化学合成工艺催化剂的角度，该酶催化的反应具有很强的绿色属性，对传统化学工艺的绿色化学改造有着重要意义，因而该酶具有广阔的应用前景。
固定化能够改善酶的性质，使固定化酶比游离酶具有更好的稳定性和更高的使用效率，并且使酶能够回收利用，极大节约生产成本。固定化技术是酶能够应用于工业生产的关键技术之一。经过几十年的研究和发展，先后开发了多种性能多样的固定化载体和方法，固定化技术取得了长足的进步，然而仍不能满足理想生物催化剂的所有要求，真正能投入工业应用的固定化酶却不多，主要原因是固定化使用的试剂盒载体成本高，其次是固定化效率低，稳定性差；并且出于商业保密，很多工艺过程细节没有公开。我国相关工作起步较晚，尚需依靠进口来满足半合成抗生素的生产，因此研究高效的固定化醛缩酶具有重要意义。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、超快的醛缩酶共价固定化方法，该共价固定化是通过对苯醌交联剂与酶及载体的共价连接实现的，最终获得固定化酶产品。获得了性能比醛缩酶自由酶大为改善的醛缩酶固定化酶。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种醛缩酶固定化酶，是醛缩酶自由酶通过对苯醌交联剂而共价连接于MCFs-NH2上，并保存于磷酸钠缓冲液中，酶与MCFs-NH2的质量比为50mg/g，所述的磷酸钠缓冲液PH为8.0，浓度为0.1M。
本发明所述的固定化醛缩酶的制备方法，所述的方法包括如下步骤进行：
(1)对载体进行活化处理：将氨基化的介孔泡沫硅MCFs-NH2浸渍在0.75-40mM的对苯醌溶液中活化，在20℃的恒温水浴摇床中150rpm的条件下振荡活化2小时，离心，取沉淀用pH 7.0，0.01M的PBS溶液洗涤，因离心后固液分离，故后续计算皆默认载体无损失，洗涤后的沉淀重新分散于pH 8.0，0.1M的PBS溶液中，得活化的载体液，活化时所述的对苯醌溶液与MCFs-NH2的体积质量比为3ml∶20mg；所述的重新分散时所用的pH 8.0，0.1M的PBS溶液与MCFs-NH2的体积质量比为2.445ml∶20mg；
(2)取步骤(1)得到的活化的载体液，按50醛缩酶自由酶/gMCFs-NH2的加酶量再加入醛缩酶自由酶得到混合液。
(3)取步骤(2)的混合液进行固定化处理，所述的固定化处理方法为下列之一：
(a)将混合液在20℃恒温水浴摇床中150rpm的条件下振荡20小时，离心，取沉淀用pH 7.0，0.01M的PBS溶液洗涤，得到固定化醛缩酶；
(b)将混合溶液在5℃，10-50W微波条件下照射1.5-7.5分钟，离心，取沉淀用pH 7.0，0.01M的PBS溶液洗涤，得到微波固定化醛缩酶。
为了将微波辅助固定化与常规方法进行比较，本发明实施了醛缩酶的常规固定化(a)和微波条件下固定化方法(b)，两种固定化方法都能醛缩酶温度稳定性提高，还能让固定化醛缩酶的在低底物浓度下的催化效果可以达到醛缩酶自由酶在高底物浓度作用下的催化效果。微波条件下固定化方法得到的微波固定化醛缩酶效果更明显。
本发明所述的醛缩酶自由酶可以是市售或是自制，如可以用中国专利公开号CN 101565697A中的SEQ ID NO 2，或是用中国专利公开号CN101565697A中的SEQ ID NO 1来制得。均推荐以醛缩酶自由酶的磷酸钠盐缓冲液的形式加入，所述的醛缩酶自由酶的磷酸钠盐缓冲液的浓度为1.8mg/ml。
本发明推荐所述的醛缩酶自由酶按如下方法制得：取重组菌株E.coli BL21(DE3)(pET303-DERA027)，即中国专利公开号CN 101565697A中的SEQ ID NO 1，在100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基培养，在30-37℃下培养10-20小时，得种子液，以1∶100的体积比将种子液加入到100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中在30-37℃下扩大培养，直到菌液OD600达到0.6-0.8时加入诱导剂IPTG，并使诱导剂IPTG终浓度为0.5mM，再在30-37℃诱导4-6h后，离心收集菌体，对菌体进行细胞破碎，再用镍柱对蛋白进行纯化处理，得到醛缩酶自由酶。所述的100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基培养是指含100ug/mL氨苄青霉素LB液体培养基，本发明的含100ug/mL氨苄青霉素LB液体培养基为实验室内采用购进的氨苄青霉素和LB培养基配制而成，氨苄青霉素DH022-2购自Sigma公司，LB培养基LP0021Yeast Extract购自OxoidLTD.，Basingstoke，Hampshire，England。
本发明最优选固定化处理方法为超低温单模微波辅助法：将混合溶液在5℃，10-50W微波条件下照射1.5-7.5分钟，离心，取沉淀用pH7.0，0.01M的PBS溶液洗涤，通常洗涤三次，得到微波固定化醛缩酶。
本发明所述的醛缩酶自由酶可来于市售或自制，本发明或使用醛缩酶自由酶可选自中国专利公开号CN 101565697A中的SEQ ID NO 2，或是由中国专利公开号CN 101565697A中的SEQ ID NO 1制得。
具体的，本发明所述的方法按如下步骤进行：
A、制备醛缩酶自由酶：取重组菌株E.coli BL21(DE3)(pET303-DERA027)，即中国专利公开号CN 101565697A中的SEQ ID NO 1，在100ug/ml氨苄青霉素的LB体培养基培养，在30-37℃下培养10-20小时，得种子液，以1∶100的体积比将种子液加入到100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中在30-37℃下扩大培养，直到菌液OD600达到0.6-0.8时加入诱导剂IPTG，并使诱导剂IPTG终浓度为0.5mM，再在30-37℃诱导4-6h后，离心收集菌体，对菌体进行细胞破碎，用镍柱对蛋白进行纯化处理，得到醛缩酶自由酶，测量酶浓度，测活，把醛缩酶自由酶用PH6.5，浓度是0.01M磷酸钠盐缓冲液调整成醛缩酶自由酶浓度为1.8mg/ml的醛缩酶自由酶的磷酸钠盐缓冲液。为了检测本发明方法的技术效果，本发明还通过醛缩酶自由酶与最终测定的醛缩酶固定化酶的活力比较来判断固定化技术的先进性。用PH6.5、浓度0.01M的磷酸钠盐缓冲液保存醛缩酶自由酶，使其自由酶醛缩酶浓度为1.8mg/ml醛缩酶自由酶的磷酸钠盐缓冲液；
B、将醛缩酶自由酶制成固定化醛缩酶：
(1)对载体进行活化处理：选用1.5mM的对苯醌溶液和MCFs-NH2在20℃的恒温水浴摇床中150rpm的条件下振荡2小时，离心，取沉淀用pH7.0，0.01M的PBS溶液洗涤，洗涤后的沉淀，用pH 8.0，0.1M的PBS溶液对洗涤后的沉淀进行溶解，得活化的载体液，所述的对苯醌溶液与MCFs-NH2的体积质量比为3ml∶20mg；所述的pH 8.0，0.1M的PBS溶液与MCFs-NH2的体积质量比为2.445ml∶20mg；
(2)取步骤(1)得到的活化的载体液，再加入步骤A制得的醛缩酶自由酶的磷酸钠盐缓冲液，混匀得混合液，所述的固定化醛缩酶制备过程中加酶量为50mg醛缩酶自由酶/g MCFs-NH2；
(3)取步骤(2)的混合液进行超低温单模微波辅助法固定化处理：将混合溶液在5℃，20W微波条件下照射3分钟，离心，取沉淀用pH 7.0，0.01M的PBS溶液洗涤三次，得到微波固定化醛缩酶，并以2-脱氧-D-核糖-5-磷酸(DRP)为底物进行的酶促裂解反应测定醛缩酶催化活性，同时将固定化酶的酶蛋白比活与游离酶进行比较，以考察和分析醛缩酶的共价固定化效果。
步骤(3)对混合液的固定化处理还可以用如下方法替代，将步骤(2)制得的混合液在20℃恒温水浴摇床中150rpm的条件下振荡20小时，离心，用pH 7.0，0.01M的PBS溶液洗涤，得到固定化醛缩酶。不过该方法固定化时间较长，效果略逊色于用上述超低温单模微波辅助法，但对醛温度稳定性、对低底物浓度下的催化效果较自由酶效果要好。
本发明的有益效果体现在，通过本发明方法制得的固定化醛缩酶在70℃保温条件下表现出的温度稳定性较醛缩酶自由酶有提高，特别是通过微波固定的微波固定化醛缩酶在低底物浓度下的催化效果可以达到醛缩酶自由酶和常规固定化方法获得的固定化醛缩酶在高底物浓度作用下的催化效果。
(四)附图说明
图1为活化载体的对苯醌浓度对固定醛缩酶的影响
■固定化负载率；◆固定化酶的比活力。
图2为微波固定化功率对载体固定化醛缩酶的影响。
▲固定化负载率；
微波固定化酶比活力
图3为微波固定化时间对载体固定化醛缩酶的影响。
◆固定化负载率；■微波固定化酶比活力
图4为温度对自由酶和常规固定化酶及微波固定化酶的活性影响。
■醛缩酶自由酶，▲常规固定化酶，●微波固定化酶
图5为PH对自由酶和常规固定化酶及微波固定化酶的活性影响。
▲微波固定化酶，
醛缩酶自由酶，◆常规固定化酶
图6为自由酶和载体微波固定化酶及常规固定化酶的温度稳定性。
◇醛缩酶自由酶；■微波固定化条件为20W，3分钟时所得的微波固定化醛缩酶；●微波固定化条件为20W，5分钟的微波固定化醛缩酶；
表示微波固定化条件为30W，1.5分钟的微波固定化醛缩酶；□表示微波固定化条件为30W，5分钟的微波固定化醛缩酶；◆表示为微波固定化条件为30W，3分钟的微波固定化醛缩酶；○常规固定化酶。
图7为自由酶和微波固定化酶及常规固定化酶的储存稳定性。
■醛缩酶自由酶，▲常规固定化酶，●微波固定化酶
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1
制备醛缩酶自由酶：
取我们课题组内重组菌株E.Coil BL21/pET 303CT/DERA thermo菌，即中国专利公开号CN 101565697A中的SEQ ID NO 1，在100ug/ml氨苄青霉素(sigma)的LB液体培养基(Oxoid LTD.，Basingstoke，Hampshire，England)培养，在37℃下培养20小时，得种子液，将10ml种子液加入到1L 100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中在37℃下扩大培养，直到菌液OD600达到0.6时加入诱导剂IPTG，并使诱导剂IPTG终浓度为0.5mM，再在30C诱导4h后，离心收集菌体，对菌体进行细胞破碎，用镍柱对蛋白进行纯化处理，得到醛缩酶自由酶，测量酶浓度，把醛缩酶自由酶用PH6.5、浓度是0.01M的磷酸钠盐缓冲液进行保存，测定醛缩酶自由酶磷酸钠盐缓冲液保存的自由酶为103mg，其醛缩酶自由酶终浓度为1.8mg/ml，其自由酶活性为1.51U/mg，备用；
实施例2
将醛缩酶自由酶制成固定化醛缩酶：
(1)对载体进行活化处理：选用对苯醌溶液3ml使其在反应液的终浓度为1.5mM和20mg的MCFs-NH2在20℃的恒温水浴摇床中150rpm的条件下振荡2小时，离心，取沉淀用用pH 7.0，0.01M的PBS溶液洗涤，洗涤后的沉淀重新分散于2.445mL的pH 8.0、0.1M的PBS溶液中，其中因离心过程中固液实现分离，故认为载体重量保持不变，仍为20mg。
(2)取步骤(1)得到的活化的载体液2.445ml，再按照50mg酶/g载体的质量比加入实施例1得到的1.8mg/ml的醛缩酶自由酶磷酸钠缓冲液0.55mL，混合均匀得混合液；
(3)取步骤(2)的混合液在20℃恒温水浴摇床中150rpm的条件下振荡20小时，离心，取沉淀用pH 7.0，0.01M的PBS溶液洗涤，得到固定化醛缩酶。
实施例3
将醛缩酶自由酶用微波法制成固定化醛缩酶：
(1)对载体进行活化处理：选用对苯醌溶液3ml，使其终浓度为1.5mM和20mg MCFs-NH2在20℃的恒温水浴摇床中150rpm的条件下振荡2小时，离心，取沉淀用pH 7.0，0.01M的PBS溶液洗涤，洗涤后的沉淀重新分散于2.445mL的pH 8.0、0.1M的PBS溶液中，其中因离心过程中固液实现分离，故认为载体重量保持不变，仍为20mg。
(2)向步骤(1)得到的活化的载体混合液中，按照50mg酶/g载体的质量比，加入实施例1得到的1.8mg/ml的醛缩酶自由酶磷酸钠盐缓冲液0.55mLml，混匀得混合液。
(3)取步骤(2)的混合液在5℃，10-50W微波条件下照射1.5分钟，离心，pH 7.0，0.01M的PBS溶液洗涤，得到微波固定化醛缩酶。
实施例4
活化载体的对苯醌浓度对载体MCFs-NH2固定醛缩酶的影响。用3ml终浓度分别为0.75mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM、5.0mM、20.0mM和40.0mM的对苯醌溶液分别对20mg的MCFs-NH2进行活化处理，将经活化处理后的载体用pH 8.0，0.1M的PBS溶液2.445ml溶解。按照50mg酶/g载体的质量比，加入实施例1得到的1.8mg/ml的醛缩酶自由酶磷酸钠盐缓冲液0.55mL，混匀得混合液，并在20℃恒温水浴摇床中150rpm的条件下振荡20小时，离心，用pH 7.0，0.01M的PBS溶液洗涤，得到固定化醛缩酶。对7个对苯醌浓度活化载体的酶分别进行活力测定，对应各组所得固定化醛缩酶的比活力为1.11、1.33、1.44、0.87、0.56、0.47、0.43U/mg，结果见图1，对苯醌浓度为1.5mM时其固定化酶比活力为1.44U/mg，为几组实验的最优结果，因而后续微波固定化醛缩酶的制备中对苯醌终浓度选定为1.5mM。
实施例5
微波固定化温度及功率对载体固定化醛缩酶的影响。
用3ml终浓度为1.5mM的对苯醌溶液对20mg的MCFs-NH2进行活化2小时，用pH 7.0，0.01M的PBS溶液离心洗涤三次，洗涤后的沉淀重新分散于2.445mL的pH 8.0、0.1M的PBS溶液中，按照50mg酶/g载体的质量比，加入实施例1得到的1.8mg/ml的醛缩酶溶液0.55mL，并将盛有该混合液的容器置于微波反应系统中。为了防止微波辐射下热效应对酶组织结构的损伤，影响酶的活性，本实施例中通过冷却系统的作用控制微波反应系统内温度，最终选择的温度为5℃。
微波功率是微波固定化酶的关键点，微波功率越高，所需微波照射时间越短，本实施例中固定时间为3分钟，通过选用功率10W、20W、30W、40W、50W进行微波照射后对其进行活力测定，结果分别为1.73、1.87、2.25、1.98、1.43U/mg，结果见图2，在微波功率为30W时其酶活2.25U/mg为最优。
实施例6
微波固定化时间对载体固定化醛缩酶的影响。
用3ml终浓度为1.5mM的对苯醌溶液对20mg的MCFs-NH2进行活化2小时，用pH 7.0，0.01M的PBS溶液离心洗涤三次，洗涤后的沉淀重新分散于2.445mL的pH 8.0、0.1M的PBS溶液中，按照50mg酶/g载体的质量比，加入实施例1得到的1.8mg/ml的醛缩酶溶液0.55mL，并将盛有该混合液的容器置于微波反应系统中。考虑到过高功率下微波辐射对酶蛋白结构和活力的损伤，固本实施例中采用20W的功率辐射，通过考察辐射时间的影响来优化微波辐射条件。在5℃温度下分别将不同上述混合液经过微波辐射处理1.5分钟、2.0分钟、3.0分钟、5.0分钟、7.5分钟，结果见图3，各时间条件下微波固定化酶的比活力分别为1.50、1.82、1.87、1.98、1.71U/mg，通过酶活测定的结果显示在微波照射5.0分钟时，酶比活力1.98U/mg为几组数据的最优值，故后续微波照射时间选用5.0分钟。
实施例7
醛缩酶自由酶、固定化醛缩酶、微波固定化醛缩酶性能比较：
取实施例1制得的醛缩酶自由酶(简称自由酶)，实施例2制得的固定化醛缩酶(简称常规固定化酶)，实施例3制得的微波固定化醛缩酶(简称微波固定化酶)进行如下实验：
(1)最适温度及最适合PH
通过在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃温度下测定自由酶及固定化酶的活力，结果见图4，结果显示自由酶、常规固定化酶及微波固定化酶在60℃时其活性最优。通过在PH为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5的缓冲液中对自由酶、常规固定化酶及微波固定化酶反应进行活力测定的结果显示，，自由酶、常规固定化酶及微波固定化酶的最适PH均为6.5，结果见图5。
(2)温度稳定性
在工业中采用较高的反应温度，有以下一些优势：较高的反应速率、变反应平衡、更好的底物溶解性、较低的反应介质粘度以及微生物污染可能性降低等。因此热稳定性的酶对于工业应用具有重要意义。自由酶、常规固定化酶及微波固定化酶在不同温度分别保温20分钟、40分钟、60分钟、80分钟、100分钟和120分钟后，测定其残余活力，和未保温的样品相比，评价其温度稳定性。微波20W、照射5分钟条件下的固定化酶在70℃保温2小时后其残余活力仍有38.88％，较自由酶及其他固定化酶其温度稳定性有很大提高，结果见图6。
(3)储存稳定性
将经微波固定后的固定化酶、常规固定化酶及自由酶取样保存在4℃冰箱里，每隔10天测定其残余活力，在保存64天后，微波固定化酶的残余活性仍有83.98％，较自由酶和常规固定化酶其储存稳定性有很很好改善，结果见图7。
(4)固定化酶的动力学性能
将自由酶、经微波固定化的酶及常规固定化酶在不同底物浓度下反应，测试其酶的催化活性。结果显示，微波固定化酶在低底物浓度下的催化效果可以达到自由酶和常规固定化酶在高底物浓度作用下的催化效果。结果见表1
表1微波辅助固定化醛缩酶的相关动力学常数
在醛缩酶的共价固定化中，加酶量为50mg酶/g载体，常规固定化中固定化时间为20小时，微波辅助固定化中功率为20W，时间为5分钟。
Claims (7)
1.一种固定化醛缩酶的制备方法，其特征在于所述的方法包括如下步骤进行：
(1)对载体进行活化处理：将氨基化的介孔泡沫硅载体MCFs-NH2浸渍在0.75-40mM的对苯醌溶液中活化，在20℃的恒温水浴摇床中150rpm的条件下振荡活化2小时，离心，取沉淀用pH7.0，0.01M的PBS溶液洗涤，洗涤后的沉淀并将其重新分散于pH8.0，0.1M的PBS溶液，活化时所用的对苯醌溶液与MCFs-NH2的体积质量比为3ml∶20mg；重新分散时所用的pH8.0，0.1M的PBS溶液与MCFs-NH2的体积质量比为2.445ml∶20mg；
(2)取步骤(1)得到的活化的载体液，按50mg醛缩酶自由酶/gMCFs-NH2的加酶量再加入醛缩酶自由酶得到混合液；
(3)取步骤(2)的混合液进行固定化处理，所述的固定化处理方法为下列之一：
(a)将步骤(2)得到的混合液在20℃恒温水浴摇床中150rpm的条件下振荡20小时，离心，用pH7.0，0.01M的PBS溶液洗涤，得到固定化醛缩酶；
(b)将步骤(2)得到的混合溶液在5℃，10-50W微波条件下照射1.5-7.5分钟，离心，取沉淀用pH7.0，0.01M的PBS溶液洗涤，得到微波固定化醛缩酶。
2.如权利要求1所述的固定化醛缩酶的制备方法，其特征在于所述的醛缩酶自由酶以醛缩酶自由酶磷酸钠盐缓冲液的形式加入，所述的醛缩酶自由酶磷酸钠盐缓冲液的浓度为1.8mg/ml。
3.如权利要求1所述的固定化醛缩酶的制备方法，其特征在于所述的醛缩酶自由酶按如下方法制得：重组菌株E.Coil BL21/pET 303 CT/DERAthermo菌，即中国专利公开号CN 101565697A中的SEQ ID NO 1，在100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基培养，在30-37℃温度条件下培养10-20小时，得种子液，以1∶100的体积比将种子液加入到100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30-37℃温度条件下扩大培养，直到菌液OD600达到0.6-0.8时加入诱导剂IPTG，并使诱导剂IPTG终浓度为0.5mM，再在30-37℃诱导4-6h后，离心收集菌体，对菌体进行细胞破碎，再运用镍柱对蛋白进行纯化，得到醛缩酶自由酶。
4.如权利要求1所述的方法，所述的步骤(3)所述的固定化处理方法为：将混合溶液在5℃，10-50W微波条件下照射1.5-7.5分钟，离心，取沉淀用pH7.0，0.1M的PBS溶液洗涤三次，得到微波固定化醛缩酶。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的醛缩酶自由酶为中国专利公开号CN 101565697A中的SEQ ID NO 2。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法按如下步骤进行：A、制备醛缩酶自由酶：取重组菌株E.Coil BL21/pET 303 CT/DERAthermo菌，即中国专利公开号CN 101565697A中的SEQ ID NO 1，在100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基培养，在30-37℃温度条件下培养10-20小时，得种子液，以1∶100的体积比将种子液加入到100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中在30-37℃温度条件下扩大培养，直到菌液OD600达到0.6-0.8时加入诱导剂IPTG，并使诱导剂IPTG终浓度为0.5mM，再在30-37℃诱导4-6h后，离心收集菌体，对菌体进行细胞破碎，运用镍柱对蛋白进行纯化，得到醛缩酶自由酶，测量酶浓度，把醛缩酶自由酶用PH6.5，浓度是0.01M磷酸钠盐缓冲液调整成醛缩酶自由酶浓度为1.8mg/ml的醛缩酶自由酶的磷酸钠盐缓冲液。
B、将醛缩酶自由酶制成固定化醛缩酶：
(1)对载体进行活化处理：选用1.5mM的对苯醌溶液和MCFs-NH2在20℃的恒温水浴摇床中150rpm的条件下振荡2小时，离心，取沉淀用pH7.0，0.01M的PBS溶液洗涤，洗涤后的沉淀重新分散于pH8.0，0.1M的PBS溶液中，活化时所述的对苯醌溶液与MCFs-NH2的体积质量比为3ml∶20mg；重新分散时所用的pH8.0，0.1M的PBS溶液与MCFS-NH2的体积质量比为2.445ml∶20mg。
(2)取步骤(1)得到的活化的载体液，再加入步骤A制得的醛缩酶自由酶的磷酸钠盐缓冲液，混均得混合液，所述的固定化醛缩酶制备过程中加酶量为50mg醛缩酶自由酶/g MCFs-NH2.
(3)取步骤(2)的混合液进行固定化处理：将混合溶液在5℃，20W微波条件下照射3分钟，离心，取沉淀用pH7.0，0.1M的PBS溶液洗涤，得到微波固定化醛缩酶。
7.如权利要求1所述方法，其特征在于所述的方法按如下步骤进行：
A、制备醛缩酶自由酶：取我们课题组内重组菌株E.Coil BL21/pET 303CT/DERA thermo菌(专利公开号CN 101565697A)菌在100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基培养，在30-37℃温度条件下培养10-20小时，得种子液，以1∶100的体积比将种子液加入到100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中在30-37℃温度条件下扩大培养，直到菌液OD600达到0.6-0.8时加入诱导剂IPTG，并使诱导剂IPTG终浓度为0.5mM，再在30-37℃诱导4-6h后，离心收集菌体，对菌体进行细胞破碎，运用镍柱对蛋白进行纯化，得到醛缩酶自由酶，测量酶浓度，把醛缩酶自由酶用PH6.5，浓度是0.01M磷酸钠盐缓冲液调整成醛缩酶自由酶浓度为1.8mg/ml的醛缩酶自由酶的磷酸钠盐缓冲液。
B、将醛缩酶自由酶制成固定化醛缩酶：
(1)对载体进行活化处理：选用1.5mM的对苯醌溶液和MCFs-NH2在20℃的恒温水浴摇床中150rpm的条件下振荡2小时，离心，取沉淀用pH7.0，0.01M的PBS溶液洗涤，洗涤后的沉淀重新分散于用pH8.0，0.1M的PBS溶液中得到活化的载体液，活化时对苯醌溶液与MCFs-NH2的体积质量比为3ml∶20mg；洗涤后载体重新分散时所用的pH8.0，0.1M的PBS溶液与MCFs-NH2的体积质量比为2.445ml∶20mg；
(2)取步骤(1)得到的活化的载体液，再加入步骤A制得的醛缩酶自由酶的磷酸钠盐缓冲液，混均得混合液，所述的固定化醛缩酶制备过程中加酶量为50mg醛缩酶自由酶/g MCFS-NH2.
(3)将步骤(2)制得的混合液在20℃恒温水浴摇床中150rpm的条件下振荡20小时，离心，用pH7.0，0.01M的PBS溶液洗涤，得到固定化醛缩酶。
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|---|---|
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102133431A (zh) * | 2011-03-18 | 2011-07-27 | 上海理工大学 | 一种骨形态发生蛋白-2与脱钙骨基质固定的方法 |
| CN102433317A (zh) * | 2011-11-16 | 2012-05-02 | 杭州师范大学 | 一种嗜热菌蛋白酶的固定化方法 |
| CN104988132A (zh) * | 2015-06-19 | 2015-10-21 | 杭州师范大学 | 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法 |
| CN108410852A (zh) * | 2018-03-16 | 2018-08-17 | 浙江理工大学 | 一种高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶的制备方法与应用 |
| CN108559742A (zh) * | 2018-05-11 | 2018-09-21 | 浙江理工大学 | 一种改性硅藻土固定化醛缩酶的制备方法与应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101565697A (zh) * | 2009-06-08 | 2009-10-28 | 杭州师范大学 | 一种耐高温和有机溶剂的醛缩酶及其制备方法和应用 |
| CN101705221A (zh) * | 2009-11-23 | 2010-05-12 | 江南大学 | 一种固定化酒用酸性脲酶的制备方法及应用 |
-
2010
- 2010-06-23 CN CN 201010206718 patent/CN101892218A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101565697A (zh) * | 2009-06-08 | 2009-10-28 | 杭州师范大学 | 一种耐高温和有机溶剂的醛缩酶及其制备方法和应用 |
| CN101705221A (zh) * | 2009-11-23 | 2010-05-12 | 江南大学 | 一种固定化酒用酸性脲酶的制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 《Bioprocess Biosyst Eng》 20080104 Anming Wang et al An efficient immobilizing technique of penicillin acylase with combining mesocellular silica foams support and p -benzoquinone cross linker 第31卷, 第5期 2 * |
| 《JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING》 20080930 Anming Wang et al Improving enzyme immobilization in mesocellular siliceous foams by microwave irradiation 第106卷, 第3期 2 * |
| 《Journal of Bioscience and Bioengineering》 20090331 Anming Wang et al Enhancement of microwave-assisted covalent immobilization of penicillin acylase using macromolecular crowding and glycine quenching 第107卷, 第3期 2 * |
| 《中国农业科技导报》 20091231 李菊芳等 微波/超声波及固定化酶技术在食品蛋白质高效水解中的应用研究进展 第11卷, 第6期 2 * |
| 《化学学报》 20081231 王华等 微波辐射高效共价固定青霉素酞化酶 第66卷, 第2期 2 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102133431A (zh) * | 2011-03-18 | 2011-07-27 | 上海理工大学 | 一种骨形态发生蛋白-2与脱钙骨基质固定的方法 |
| CN102133431B (zh) * | 2011-03-18 | 2013-08-28 | 上海理工大学 | 一种骨形态发生蛋白-2与脱钙骨基质固定的方法 |
| CN102433317A (zh) * | 2011-11-16 | 2012-05-02 | 杭州师范大学 | 一种嗜热菌蛋白酶的固定化方法 |
| CN102433317B (zh) * | 2011-11-16 | 2013-08-07 | 杭州师范大学 | 一种嗜热菌蛋白酶的固定化方法 |
| CN104988132A (zh) * | 2015-06-19 | 2015-10-21 | 杭州师范大学 | 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法 |
| CN104988132B (zh) * | 2015-06-19 | 2018-05-22 | 杭州师范大学 | 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法 |
| CN108410852A (zh) * | 2018-03-16 | 2018-08-17 | 浙江理工大学 | 一种高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶的制备方法与应用 |
| CN108559742A (zh) * | 2018-05-11 | 2018-09-21 | 浙江理工大学 | 一种改性硅藻土固定化醛缩酶的制备方法与应用 |
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