CN104988132A - 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法 - Google Patents

一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104988132A
CN104988132A CN201510350573.1A CN201510350573A CN104988132A CN 104988132 A CN104988132 A CN 104988132A CN 201510350573 A CN201510350573 A CN 201510350573A CN 104988132 A CN104988132 A CN 104988132A
Authority
CN
China
Prior art keywords
enzyme
aldehyde ketone
ketone reductase
microwave
phosphate dehydrogenase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510350573.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104988132B (zh
Inventor
谢恬
殷晓浦
马转转
谌容
庞潇卿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Normal University
Original Assignee
Hangzhou Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Normal University filed Critical Hangzhou Normal University
Priority to CN201510350573.1A priority Critical patent/CN104988132B/zh
Publication of CN104988132A publication Critical patent/CN104988132A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104988132B publication Critical patent/CN104988132B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Abstract

本发明公开了一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法，所述方法为：将载体交联剂混合活化，离心，取沉淀用PBS溶液洗涤，离心，沉淀重新分散于PBS溶液中；向分散液中加入醛酮还原酶及葡萄糖脱氢酶，混合液在0～10℃，20～45W微波条件下照射1～5min，离心，取沉淀用PBS溶液洗涤，得到共固定化酶；与游离酶相比，本发明制备的共固定化酶在催化活力、热稳定性、pH稳定性方面都有所提高；葡萄糖脱氢酶作为其辅酶再生系统可提供反应所需NAD(P)H，降低成本，有利于工业化生产。

Description

一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法
(一)技术领域
本发明涉及一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶双酶的微波辅助共固定化方法。
(二)背景技术
酶作为一种生物催化剂，因其专一性强、催化效率高和作用条件温和等特性，广泛应用于医药、食品、化工等方面。但天然酶稳定性差，除了一些耐高温的酶及少数可以耐受较低pH条件的酶以外，大多数酶在高温、强酸、强碱条件下都容易变性失活；反应结束后酶与产物混合，不能重复利用，产物分离纯化困难；同时，酶的一次性使用，大大提高了生产成本，不利于连续化生产，限制了酶在工业上更广泛的应用。基于上述情况，固定化酶的概念得以提出，近年来，酶的固定化技术得到了不断发展，在综合不同固定化技术的基础上，又出现了酶的共固定化技术，目前，酶的共固定化技术在临床诊断、发酵过程控制及生物传感器制备等方面都发挥着重要作用。
酶的固定化，是指采用物理或化学方法，将酶与水不溶性载体相结合的技术。固定化之后酶既保持了其催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有稳定性增强，可反复或连续使用及易于和产物分离的显著优点。酶的共固定化即将不同来源的几种酶或酶与某一完整细胞同时固定在同一个载体上，不仅使不同酶及细胞的各自优势得到充分发挥，而且将不同酶与细胞的生物催化性能结合起来。酶的固定化方法分为四类：吸附法，包埋法，结合法以及交联法。
醛酮还原酶作为一类NAD(P)H依赖的氧化还原酶，具有广泛的底物特异性，可将脂肪族醛酮、芳香族醛酮、类固醇等很多羰基化合物还原成相应的醇类，在手性药物及药物中间体合成领域发挥着重要作用。利用醛酮还原酶催化4-氯-3-羰基乙酸乙酯(Ethyl4-chloro-3-oxobutanoate,COBE)不对称还原合成的(R)-或(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(Ethyl4-chloro-3-hydroxybutanoate,CHBE)，是多种药物活性成分如(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯、L-肉毒碱、大环内酯A和(R)-γ-氨基-β-羟基丁酸(GABOB)等合成的关键中间体，具有重要的应用价值。
在醛酮还原酶的催化反应中，都需要辅酶NAD(P)H的参与以提供反应持续进行所需电子。因此，在反应体系中维持一定浓度的NAD(P)H，是保持反应连续进行的关键因素。葡萄糖脱氢酶作为其辅酶再生系统可在将葡萄糖氧化为葡萄糖酸内酯的同时，将NADP+不断转化为NADPH，通过其与醛酮还原酶的协同作用，共同完成CHBE的生物转化过程。采用醛酮还原酶催化CHBE的合成具有高度的化学、区域和对映选择性，与化学工艺相比，具有明显优势，如：避免了有毒有害催化剂的使用，减少了有机溶剂的使用量，反应可在常温下进行等，相对传统化学合成工艺催化剂来说，该酶催化的反应具有很强的绿色环保概念，具有广阔的应用前景。
(三)发明内容
目前催化反应使用的酮还原酶多是游离酶或全细胞，虽操作简单，但催化过程中所需辅因子NAD(P)H价格比较昂贵，且酶无法重复利用，生产成本偏高，限制了酶催化方法的大规模工业化应用。
为了克服游离酶稳定性差、不能重复利用等不足，本发明提供了一种简单、快速的醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶双酶的共价固定化方法，对苯二醌作为交联剂通过与酶上的亲核基团(如氨基或羟基)及MCFs-NH2载体上的氨基反应，将酶共价固定化于载体上，最终获得性能改善的共固定化酶。
本发明所采用的技术方案是：
本发明提供一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法，所述方法包括：
(1)将载体与交联剂混合，在25℃、160～180rpm条件下活化1～2h，离心，取沉淀用pH 7.0的PBS缓冲液(具体为pH 7.0、0.1M PBS)洗涤，离心，取沉淀重新分散于pH 7.0的PBS缓冲液中制成分散液；所述载体为氨基化的二氧化硅介孔泡沫，所述交联剂为对苯二醌；
(2)向步骤(1)分散液中加入醛酮还原酶及葡萄糖脱氢酶，混合后在0～10℃，20～45W微波条件下照射1～5min，离心，取沉淀用pH 7.0的PBS缓冲液洗涤后，得到共固定化酶。
进一步，步骤(1)所述对苯二醌以0.5mM～2.5mM对苯二醌溶液的形式加入，所述对苯二醌溶液所用溶剂为体积浓度50％乙醇水溶液，所述对苯二醌溶液体积用量以载体重量计为100～150ml/g。
进一步，步骤(2)所述醛酮还原酶与载体质量比为0.1～0.2:1。
进一步，步骤(2)所述葡萄糖脱氢酶与载体质量比为0.1～0.2:1。
进一步，步骤(2)所述醛酮还原酶是以醛酮还原酶酶液形式加入，所述酶液是指将含醛酮还原酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体进行超声破碎，破碎混合液经镍柱分离后的酶液；所述醛酮还原酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
进一步，步骤(2)所述葡萄糖脱氢酶是以葡萄糖脱氢酶酶液形式加入，所述酶液是指将含葡萄糖脱氢酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体进行超声破碎，破碎混合液经镍柱分离后的酶液；所述葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
进一步，步骤(2)所述微波条件为：0～8℃，25～40W照射2～4min。
进一步，步骤(2)所述醛酮还原酶酶液按如下方法制得：将含SEQ ID NO.1所示醛酮还原酶基因的重组基因工程菌接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，获得菌液；按体积浓度1％接种量将菌液转接于含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养至OD600达0.6，加入终浓度0.1mM的IPTG，25℃、150rpm诱导表达12～16h，离心收集菌体，超声破碎，离心收集上清并用镍柱对其进行纯化，得到醛酮还原酶的酶液。
本发明所述含SEQ ID NO.1所示醛酮还原酶基因的重组基因工程菌构建方法为：将SEQID NO.1所述核苷酸序列与载体pET28a连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑单菌落PCR验证获得阳性克隆，利用质粒提取试剂盒得到pET28a-Lek质粒。然后将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)，获得重组菌pET28a-Lek-E.coli BL21(DE3)。
进一步，步骤(2)所述的葡萄糖脱氢酶酶液按如下方法制得：将含SEQ ID NO.2所示葡萄糖脱氢酶基因的重组基因工程菌接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，获得菌液；按体积浓度1％接种量将菌液转接于含100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600达0.6，向培养液中加入终浓度0.1mM的IPTG，25℃、150rpm诱导表达12～16h，离心收集菌体，超声破碎，离心收集上清并用镍柱进行纯化，得到葡萄糖脱氢酶的酶液。
本发明所述含SEQ ID NO.2所示葡萄糖脱氢酶基因的重组基因工程菌构建方法为：将SEQ ID NO.2所述核苷酸序列与载体pET22b连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑单菌落PCR验证获得阳性克隆，利用质粒提取试剂盒得到pET22b-GDH104质粒。然后将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)，获得工程菌pET22b-GDH104-E.coli BL21(DE3)。
本发明所述氨基化的二氧化硅介孔泡沫载体(MCFs-NH2载体)，MCFs是一种无机固定化载体，具有统一的介孔直径、表面积大、容积大、热稳定性高且表面极易被功能化等优点。而微波辐射因可加快物质传递过程，使反应速度和反应产率大幅提高，在许多合成反应中发挥着重要作用，近年来常被应用于酶的固定化研究中。本发明所述载体的制备方法参考：AWang,M Wang,Q Wang,F Chen,F Zhang,H Li,Z Zeng,T Xie.Stable and efficientimmobilization technique of aldolase under consecutive microwave irradiation at lowtemperature.Bioresour Technol,2011,102(2):469–474.
本发明所述LB培养基组成如下：1％NaCl、1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物，溶剂为去离子水，pH 7.0。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：本发明选用新型载体材料MCFs同时固定醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶，属双酶共固定化，反应体系涉及COBE和葡萄糖两种底物，与以往的单酶固定化相比，双酶共固定化体系中辅酶循环系统的构建，可降低生产成本，为工业化应用奠定理论基础。另一方面，MCFs与其它载体材料相比，具有以下优点：1.表面富含羟基基团，可与酶分子发生氢键作用，加强载体与酶分子的作用力；2.具有较高的比表面积，理论负载量较高；3.在酶催化反应过程中呈惰性，不影响催化反应；此外，利用微波辐射辅助固定化过程，可加快反应速率，缩短反应时间。
通过本发明制备的共固定化酶与游离醛酮还原酶相比，催化活性提高了1.40倍，热稳定性、pH稳定性等方面也有所改善，同时，共固定化酶的重复使用一定程度降低了成本。
(四)附图说明
图1是对苯二醌浓度对共固定化酶酶活影响的曲线图。
图2是微波辐射功率对共固定化酶酶活影响的曲线图。
图3是微波辐射时间对共固定化酶酶活影响的曲线图。
图4是温度对游离双酶和共固定化酶酶活影响的曲线图，◆：微波辅助MCFs共固定化酶；■：游离醛酮还原酶；▲：游离葡萄糖脱氢酶。
图5是pH对游离双酶和共固定化酶酶活影响的曲线图，◆：微波辅助MCFs共固定化酶；■：游离醛酮还原酶；▲：游离葡萄糖脱氢酶。
图6是游离双酶和共固定化酶的热稳定性影响曲线图，◆：微波辅助MCFs共固定化酶；■：游离醛酮还原酶；▲：游离葡萄糖脱氢酶。
图7是游离双酶和共固定化酶的pH稳定性影响的曲线图，◆：微波辅助MCFs共固定化酶；■：游离醛酮还原酶；▲：游离葡萄糖脱氢酶。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1 制备醛酮还原酶
将SEQ ID NO.1所示核苷酸序列与载体pET28a连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑单菌落PCR验证获得阳性克隆，利用质粒提取试剂盒得到pET28a-Lek质粒。然后将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)，获得pET28a-Lek-E.coli BL21(DE3)菌株。
将pET28a-Lek-E.coli BL21(DE3)菌株接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养。按体积浓度1％接种量将菌液转接于1L含卡那霉素(100μg/mL)的LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至OD600达0.6，向培养液中加入IPTG使其终浓度为0.1mM，25℃、150rpm诱导表达12～16h。4℃、8000rpm离心15min收集菌体，用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤后重悬于50mL的相同缓冲液中，将重悬混合液置于冰水混合物中，利用超声破碎仪进行破壁(工作3s，间隔3s，工作时间45min)。破碎结束后，4℃、12000rpm离心30min，收集上清并用琼脂糖凝胶CL-6B镍柱对其进行纯化，最终得到浓度为7.7mg/mL的纯醛酮还原酶液。
在醛酮还原酶催化的反应过程中，还原型辅酶NAD(P)H被氧化，从而引起340nm处吸光度的明显下降，可利用紫外可见分光光度计测定醒酮还原酶的酶活。
醛酮还原酶活力测定方法如下：在离心管中加入30μL二甲基亚砜(DMSO)、1μL COBE、终浓度50mM的PBS(pH7.4)缓冲液和10μL纯酶液，30℃下温育5min，加入5μL 10mg/mLNADPH，混匀后吸至比色皿中，测定340nm下吸光度的下降值。醛酮还原酶的酶活定义为：在一定条件下，每分钟消耗1μmol NADPH所需酶量为一个酶活单位(U)。酶比活力则为每毫克蛋白所含酶的催化活力(U/mg)。根据340nm处吸光度变化值测得醛酮还原酶的活力为0.32U，酶比活力为4.16U/mg。
实施例2 制备葡萄糖脱氢酶
将SEQ ID NO.2所示核苷酸序列与载体pET22b连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑单菌落PCR验证获得阳性克隆，利用质粒提取试剂盒得到pET22b-GDH104质粒。然后将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)，获得pET22b-GDH104-E.coli BL21(DE3)菌株。
将成功构建的pET22b-GDH104-E.coli BL21(DE3)菌株接种于含氨苄霉素(100μg/mL)的液体LB培养基中，37℃、220rpm过夜培养。取10mL菌液转接于1L LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至OD600达0.6，向培养液中加入IPTG使其终浓度为0.1mM，25℃、150rpm诱导表达12～16h。离心收集菌体，用pH 8.0的PBS溶液洗涤后重悬于50mL的相同缓冲液中，重悬混合液置于冰水混合物中超声破碎(工作3s，间隔3s，工作时间45min)。破碎结束后，4℃、12000rpm离心30min，收集上清并用琼脂糖凝胶CL-6B镍柱进行纯化，最终得到浓度为6.25mg/mL的纯葡萄糖脱氢酶液。
葡萄糖脱氢酶催化的反应过程中，氧化型辅酶NAD(P)被还原生成NAD(P)H，从而引起340nm处吸光度的明显上升。
葡萄糖脱氢酶活力测定方法如下：在离心管中加入10μL1.5M葡萄糖、PBS(pH7.4)缓冲液和10μL纯酶液，37℃下温育5min，加入5μL 10mg/mLNADP，混匀后吸至比色皿中，测定340nm下吸光度的动力学变化。定义每分钟消耗1μmol NADP所需酶量为一个酶活单位(U)，酶比活力则为每毫克蛋白所含酶的催化活力(U/mg)。根据340nm处吸光度变化值测得GDH的酶活力和酶比活力分别为0.24U和3.84U/mg。
实施例3 将双酶制成共固定化酶
(1)载体的活化：将20mgMCFs-NH2粉末溶解于3mL 1.0mM的对苯二醌溶液(溶剂为体积浓度50％乙醇水溶液)中，25℃、160rpm条件下，恒温水浴摇床振荡2h，离心，取沉淀用3mL、pH 7.0、0.1M的PBS溶液洗涤，离心，沉淀重新分散于2.42mL、pH 7.0、0.1M PBS溶液中。按照100mg酶/g载体的质量比，依次向混合液中加入实施例1得到的7.7mg/mL的醛酮还原酶液0.26mL及实施例2得到的6.25mg/mL的葡萄糖脱氢酶液0.32mL，混匀；
(2)双酶共固定化：取步骤(1)混合液在0～10℃，30W微波条件下照射4min，离心，取沉淀用pH 7.0、0.1M PBS溶液洗涤，得到共固定化酶。
表1 共固定化酶催化反应参数
共固定化酶活力测定方法如下：用纯水将表1中反应体系补齐至1mL，30℃、180r/min反应1h，反应结束后用等体积的乙酸乙酯萃取3次，取上层有机相在真空干燥箱中抽干，1mL异丙醇溶解，经滤膜处理后气相色谱法(GC)检测样品。
共固定化酶活定义为：每毫克干重固定化酶每分钟转化底物的量为一个活力单位，即一定条件下，1min催化1μmol底物(COBE)转化为产物(CHBE)所需酶量，表示为μmol·min-1·mg-1。
通过优化固定化条件获得的微波辅助MCFs共固定化酶的催化活力为9.98U/mg，其中每毫克固定化酶含0.045mg醛酮还原酶，相当于221.8U/mg醛酮还原酶，与游离醛酮还原酶的4.16U/mg相比，提高了52倍。
实施例4 对苯二醌浓度对MCFs-NH2载体共固定化醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的影响
分别用3mL终浓度为0.5mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM和2.5mM的对苯二醌溶液(溶剂为体积浓度50％乙醇水溶液)对20mgMCFs-NH2载体进行活化处理(方法同实施例3)，结束后载体重新分散于2.42mLpH 7.00.1M PBS溶液中。按照100mg酶/g载体的质量比，依次向混合液中加入实施例1得到的7.7mg/mL的醛酮还原酶液0.26mL及实施例2得到的6.25mg/mL的葡萄糖脱氢酶液0.32mL，混匀后混合液于0～10℃，30W微波条件下照射3min(为了防止高功率及长时间微波辐射产生的高热量影响酶的活性，本实施例中微波功率及时间分别选为30W和3min)。离心，取沉淀用pH 7.00.1M PBS溶液洗涤，得到共固定化酶。对利用不同浓度对苯二醌活化载体后制备的共固定化酶分别进行相对酶活检测，结果见图1。对苯二醌浓度为1.0mM时，固定化酶比活力为几组实验的最优结果，因此选用该浓度制备后续微波共固定化双酶。
实施例5 微波辐射功率对共固定化酶酶活的影响
用3mL终浓度为1.0mM的对苯二醌溶液(溶剂为体积浓度50％乙醇水溶液)对20mgMCFs-NH2载体进行活化处理(方法同实施例3)，结束后载体重新分散于2.42mLpH 7.00.1M PBS溶液中。按照100mg酶/g载体的质量比，依次向混合液中加入实施例1得到的7.7mg/mL的醛酮还原酶液0.26mL及实施例2得到的6.25mg/mL的葡萄糖脱氢酶液0.32mL，混匀后混合液在0-10℃条件下，分别于20W、25W、30W、35W、40W微波功率下照射3min，离心，取沉淀依次用pH 7.00.1M PBS溶液洗涤，得到共固定化酶。相对酶活检测结果见图2，微波功率30W时共固定化酶活性最高，为游离酮还原酶的1.4倍。
实施例6 微波辐射时间对共固定化酶酶活的影响
用3mL终浓度为1.0mM的对苯二醌溶液(溶剂为体积浓度50％乙醇水溶液)对20mgMCFs-NH2载体进行活化处理(方法同实施例3)，结束后载体重新分散于2.42mLpH 7.00.1M PBS溶液中。按照100mg酶/g载体的质量比，依次向混合液中加入实施例1得到的7.7mg/mL的醛酮还原酶液0.26mL及实施例2得到的6.25mg/mL的葡萄糖脱氢酶液0.32mL，混匀后混合液于0-10℃，30W微波条件下分别照射1min、2min、3min、4min、5min，离心，取沉淀依次用pH 7.00.1M PBS溶液洗涤，得到共固定化酶。不同时间下相对酶活检测结果见图3，微波辐射4min时酶活最佳。
实施例7 游离醛酮还原酶、游离葡萄糖脱氢酶、微波辅助共固定化酶性能比较
取实施例1得到的游离醛酮还原酶、实施例2得到的游离葡萄糖脱氢酶及实施例3得到微波辅助共固定化酶进行如下实验：
(1)通过优化固定化条件获得的微波辅助MCFs共固定化酶的催化活力为9.98U/mg，其中每毫克固定化酶含0.045mg醛酮还原酶，相当于221.8U/mg醛酮还原酶，与游离醛酮还原酶的4.16U/mg相比，提高了52倍。
(2)最适温度
分别在25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃条件下测定游离酶及共固定化酶的活力，结果见图4，结果表明游离醛酮还原酶、游离葡萄糖脱氢酶、微波辅助共固定化酶分别在35℃、40℃、37℃时活性最高。
(3)最适pH
分别在pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的缓冲液中测定游离酶及共固定化酶的活力，结果见图5，微波辅助共固定化酶的最适pH7.5介于游离醛酮还原酶最适pH6.0及游离葡萄糖脱氢酶最适pH8.0之间。
(4)热稳定性
将游离醛酮还原酶、游离葡萄糖脱氢酶、微波辅助共固定化酶分别于25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃保温30min，测定不同温度条件下酶的相对活力，结果见图6。结论：游离醛酮还原酶在温度低于35℃时热稳定较好，保温30min后，剩余活力仍可达70％，随着温度不断升高，剩余活力大幅下降，50℃时酶完全失活。游离葡萄糖脱氢酶则在25～50℃温度范围内都保持较好的热稳定性，剩余活力保持在60％以上。在相同的温度条件下，微波辅助共固定化酶的热稳定性较游离酮还原酶高。
(5)pH稳定性
将游离醛酮还原酶、游离葡萄糖脱氢酶、微波辅助共固定化酶分别置于pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的缓冲液中，各自最适温度条件下保温60min，测定酶的相对活力，结果见图7。结论：在pH 6.0-8.5的范围内，微波辅助共固定化酶的活性保持在80％以上，较游离酮还原酶来说，稳定性提高。

Claims (9)

1.一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法，其特征在于所述方法包括：
（1）将载体与交联剂混合，在25℃、160rpm～180rpm条件下活化1～2h，离心，取沉淀用pH 7.0的PBS缓冲液洗涤，离心，取沉淀重新分散于pH 7.0的PBS缓冲液中制成分散液；所述载体为氨基化的二氧化硅介孔泡沫，所述交联剂为对苯二醌；
（2）向步骤（1）分散液中加入醛酮还原酶及葡萄糖脱氢酶，混合后在0～10℃，20～45W微波条件下照射1～5min，离心，取沉淀用pH 7.0的PBS缓冲液洗涤后，得到共固定化酶。
2.如权利要求1所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法，其特征在于步骤（1）所述对苯二醌以0.5mM～2.5mM对苯二醌溶液的形式加入，所述对苯二醌溶液所用溶剂为体积浓度50%乙醇水溶液，所述对苯二醌溶液体积用量以载体重量计为100～150ml/g。
3.如权利要求1所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法，其特征在于步骤（2）所述醛酮还原酶与载体质量比为0.1～0.2:1。
4.如权利要求1所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法，其特征在于步骤（2）所述葡萄糖脱氢酶与载体质量比为0.1～0.2:1。
5.如权利要求1所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法，其特征在于步骤（2）所述醛酮还原酶是以醛酮还原酶酶液形式加入，所述酶液是指将含醛酮还原酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体进行超声破碎，破碎混合液经镍柱分离后的酶液；所述醛酮还原酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
6.如权利要求1所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法，其特征在于步骤（2）所述葡萄糖脱氢酶是以葡萄糖脱氢酶酶液形式加入，所述酶液是指将含葡萄糖脱氢酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体进行超声破碎，破碎混合液经镍柱分离后的酶液；所述葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
7.如权利要求1所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法，其特征在于步骤（2）所述微波条件为：0～8℃，25～40W照射2～4min。
8.如权利要求5所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法，其特征在于步骤（2）所述醛酮还原酶酶液按如下方法制得：将含SEQ ID NO.1所示醛酮还原酶基因的重组基因工程菌接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，获得菌液；按体积浓度1%接种量将菌液转接于含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养至OD600达0.6，加入终浓度0.1mM的IPTG，25℃、150rpm诱导表达12～16h，离心收集菌体，超声破碎，离心收集上清并用镍柱对其进行纯化，得到醛酮还原酶的酶液。
9.如权利要求6所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法，其特征在于步骤（2）所述葡萄糖脱氢酶酶液按如下方法制得：将含SEQ ID NO.2所示葡萄糖脱氢酶基因的重组基因工程菌接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，获得菌液；按体积浓度1%接种量将菌液转接于含100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600达0.6，向培养液中加入终浓度0.1mM的IPTG，25℃、150rpm诱导表达12～16h，离心收集菌体，超声破碎，离心收集上清并用镍柱进行纯化，得到葡萄糖脱氢酶的酶液。
CN201510350573.1A 2015-06-19 2015-06-19 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法 Active CN104988132B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510350573.1A CN104988132B (zh) 2015-06-19 2015-06-19 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510350573.1A CN104988132B (zh) 2015-06-19 2015-06-19 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104988132A true CN104988132A (zh) 2015-10-21
CN104988132B CN104988132B (zh) 2018-05-22

Family

ID=54300027

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510350573.1A Active CN104988132B (zh) 2015-06-19 2015-06-19 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104988132B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105925558A (zh) * 2016-05-17 2016-09-07 河北周酶生物科技有限公司 一种用于制备他汀类药物的复合固定化酶及其制备方法
CN108285908A (zh) * 2017-12-26 2018-07-17 杭州师范大学 一种固定化双酶催化合成(s)-1-(2,6-二氯-3-氟-苯基)乙醇的方法
CN110669753A (zh) * 2019-11-05 2020-01-10 杭州师范大学 一种基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法
CN111321133A (zh) * 2020-02-07 2020-06-23 山东省科学院生物研究所 一种nad+-琼脂糖复合物及其制备方法和在葡萄糖酸生产中的应用
CN113337546A (zh) * 2021-06-04 2021-09-03 上海启讯医药科技有限公司 一种(s)-1，2，4-丁三醇的制备方法
CN114908127A (zh) * 2022-06-14 2022-08-16 杭州师范大学 一种利用酶-TiO2纳米管-量子点共组装催化合成的方法
CN115011574A (zh) * 2022-06-24 2022-09-06 杭州师范大学 一种位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101892218A (zh) * 2010-06-23 2010-11-24 杭州师范大学 一种醛缩酶的微波辅助固定化方法
CN102433317A (zh) * 2011-11-16 2012-05-02 杭州师范大学 一种嗜热菌蛋白酶的固定化方法
WO2012154626A1 (en) * 2011-05-06 2012-11-15 Solazyme, Inc. Genetically engineered microorganisms that metabolize xylose
CN103320403A (zh) * 2013-06-18 2013-09-25 杭州师范大学 酮还原酶lek突变体及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101892218A (zh) * 2010-06-23 2010-11-24 杭州师范大学 一种醛缩酶的微波辅助固定化方法
WO2012154626A1 (en) * 2011-05-06 2012-11-15 Solazyme, Inc. Genetically engineered microorganisms that metabolize xylose
CN102433317A (zh) * 2011-11-16 2012-05-02 杭州师范大学 一种嗜热菌蛋白酶的固定化方法
CN103320403A (zh) * 2013-06-18 2013-09-25 杭州师范大学 酮还原酶lek突变体及应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANMING WANG 等: "Stable and efficient immobilization technique of aldolase under consecutive microwave irradiation at low temperature", 《BIORESOURCE TECHNOLOGY》 *
JUN LI 等: "Amino-functionalized mesostructured cellular foams as carriers of glucose oxidase", 《JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING》 *
MARÍA FERNÁNDEZ-FERNÁNDEZ 等: "Recent developments and applications of immobilized laccase", 《BIOTECHNOLOGY ADVANCES》 *
QIUYAN WANG 等: "Characterization and site-directed mutation of a novel aldo–keto reductase from Lodderomyces elongisporus NRRL YB-4239 with high production rate of ethyl (R)-4-chloro-3-hydroxybutanoate", 《J IND MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
叶婷婷: "R型醛酮还原酶的克隆、鉴定及其催化制备(R)-CHBE的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *
胡燚 等: "介孔材料固定化酶", 《化学进展》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105925558A (zh) * 2016-05-17 2016-09-07 河北周酶生物科技有限公司 一种用于制备他汀类药物的复合固定化酶及其制备方法
CN105925558B (zh) * 2016-05-17 2019-06-28 河北周酶生物科技有限公司 一种用于制备他汀类药物的复合固定化酶及其制备方法
CN108285908A (zh) * 2017-12-26 2018-07-17 杭州师范大学 一种固定化双酶催化合成(s)-1-(2,6-二氯-3-氟-苯基)乙醇的方法
CN108285908B (zh) * 2017-12-26 2021-02-09 杭州师范大学 一种固定化双酶催化合成(s)-1-(2,6-二氯-3-氟-苯基)乙醇的方法
CN110669753A (zh) * 2019-11-05 2020-01-10 杭州师范大学 一种基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法
CN111321133A (zh) * 2020-02-07 2020-06-23 山东省科学院生物研究所 一种nad+-琼脂糖复合物及其制备方法和在葡萄糖酸生产中的应用
CN111321133B (zh) * 2020-02-07 2022-03-15 山东省科学院生物研究所 一种nad+-琼脂糖复合物及其制备方法和在葡萄糖酸生产中的应用
CN113337546A (zh) * 2021-06-04 2021-09-03 上海启讯医药科技有限公司 一种(s)-1，2，4-丁三醇的制备方法
CN113337546B (zh) * 2021-06-04 2023-09-12 上海启讯医药科技有限公司 一种(s)-1，2，4-丁三醇的制备方法
CN114908127A (zh) * 2022-06-14 2022-08-16 杭州师范大学 一种利用酶-TiO2纳米管-量子点共组装催化合成的方法
CN114908127B (zh) * 2022-06-14 2024-01-30 杭州师范大学 一种利用酶-TiO2纳米管-量子点共组装催化合成的方法
CN115011574A (zh) * 2022-06-24 2022-09-06 杭州师范大学 一种位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN104988132B (zh) 2018-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104988132A (zh) 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法
CN104988133B (zh) 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法
CN101591681B (zh) 一种微生物转化生产二羟基丙酮的方法
CN110423741A (zh) 羰基还原酶-辅酶nadp+共固定化酶及其制备与应用
CN109609426B (zh) 一种以甲醇/甲醛和葡萄糖为共底物生产1,3-丙二醇的方法
Kratzer et al. Whole-cell bioreduction of aromatic α-keto esters using Candida tenuis xylose reductase and Candida boidinii formate dehydrogenase co-expressed in Escherichia coli
CN101857887B (zh) 一种利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的方法
CN106047950A (zh) 一种(s)‑1‑(2,6‑二氯‑3‑氟苯基)乙醇的生物制备方法
CN105734092B (zh) 一种酶法制备d-塔格糖的方法
Soni et al. Enantioselective reduction of acetophenone and its derivatives with a new yeast isolate Candida tropicalis PBR‐2 MTCC 5158
CN105063010A (zh) 一种聚乙烯亚胺金属配位固定化的多酶体系及其制备方法
CN101333554B (zh) 一种酶法拆分外消旋乳酸生产d-乳酸的方法
CN101368168B (zh) 羰基还原酶和嘧啶核苷酸转氢酶偶联制备(s)-苯基乙二醇的方法
CN104830744A (zh) 利用sd-as序列偶联(r)-羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶制备(r)-苯乙二醇的方法
Hugo et al. Coenzyme specificity of dehydrogenases and fermentation of pyruvate by clostridia
CN103789388A (zh) 一种以甘油为原料发酵-生物催化耦合合成体系生产3-羟基丙酸的方法
CN103305495A (zh) 一种制备谷氨酸脱羧酶的方法
CN106754829A (zh) 一种利用芽孢杆菌hs17发酵生产壳聚糖酶的方法及其应用
CN1280418C (zh) 一种利用乳酸氧化酶或含该酶的完整细胞转化乳酸钠制备丙酮酸的方法
WO1981001012A1 (en) Production of solvents by immobilized cells of clostridium
CN114410619B (zh) 一种固定化生物催化剂合成(S)-N-Boc-羟基哌啶的方法
CN101386878B (zh) 利用整细胞生物转化再生氧化型辅酶i的方法
CN117737149B (zh) 一种酶催化合成高纯度s-玻色因的方法
CN114875106B (zh) 一种在微流场中利用烯还原酶生成（s）-2-甲基环己酮的方法
JPH02190187A (ja) 生物触媒及びその製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant