CN115011574A - 一种位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法及应用 - Google Patents

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CN115011574A CN202210729897.6A CN202210729897A CN115011574A CN 115011574 A CN115011574 A CN 115011574A CN 202210729897 A CN202210729897 A CN 202210729897A CN 115011574 A CN115011574 A CN 115011574A
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    • C12Y101/01001—Alcohol dehydrogenase (1.1.1.1)

Abstract

本发明涉及一种位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法及应用，采用遗传密码扩增方法制备了AKR‑pAzF突变体和ADH‑p‑PaF突变体，然后在细胞裂解液中一步反应交联得到位点可控和有序交联的双酶聚集体；并且通过蛋白标记，使双酶的有序方式得到验证。本发明有序交联双酶与无序交联方式相比，有较高的底物亲和力和酶活性；有序交联双酶有较好催化性能，在用于手性醇药物中间体的催化合成中，有远优于无序交联酶的催化率和稳定性；其次酶蛋白之间的有序共价连接和连接位点的灵活性使得双酶之间的距离又变成了一个可控因素，酶靠近引起的底物通道效应可明显提高级联反应中酶的催化效率，使得酶蛋白有序交联的研究变得更加有意义。

Description

一种位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种有序交联双酶聚集体的制备方法，具体的说是涉及一种位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法及应用。
背景技术
开发更清洁、更高效的化学工艺一直是化学研究的主要目标之一。有机化学合成在此方面进行了复杂的探索，但仍然有很大的改进空间，尤其是在“绿色化学”方面。用催化程序代替化学计量、在有机合成中使用酶或微生物以及在一锅中组合几个反应而不分离中间体(级联反应)被认为是建立环境友好和可持续化学过程的重要策略。在多酶级联系统中集成多种生物催化转化特别有吸引力，因为生物催化剂本质上是“绿色的、可持续的”(可生物降解的)、高度选择性的，而且最重要的是，它们在某些操作条件范围内相互兼容。事实上，活的有机体在常见的胞质溶胶中进行各种各样的酶促反应，并且保持酶催化过程的有序性和完整性。与体内催化过程相比，体外工程的灵活性可以避免细胞活力的复杂性、生理学以及细胞膜或细胞壁带来的问题。
然而，用于体外多酶反应的经典方法是在不同的阶段进行的。这种方法有几个缺点，例如产量低、操作成本高以及在分离步骤中使用许多化学品。为了解决这些问题，需要一种新的策略来提供诸如对映选择性、立体选择性、高产率、低成本、反应平衡转移以及实现多步骤而无需产物回收等优点。在自然界中，许多生化反应是由多酶级联系统(MECS)催化的，MECS由高度有序的酶组装而成。MECS可以高效地完成催化，中间体在酶的不同活性位点之间运输，消除反应中间体的繁琐分离和纯化。从自然界中的这些MECS中汲取灵感，研究人员致力于通过精确的设计在体外重建这些MECS。在多酶共固定化中，由于级联反应的有序性，需要通过选择合适的固定化策略来准确控制酶的定位和定向。
通过随机共固定的多酶固定可能是提高整体催化活性和稳定性的最简单策略。然而，为了控制固定模式，固定化酶的比例或表面酶附着的官能团分布可能会带来挑战。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明提供了一种位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法及应用；本发明从细胞裂解液中直接进行共价交联形成交联多酶，实现酶蛋白的有序交联；本发明可以提高催化活性和稳定性，并实现自我纯化。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，包括下述步骤：首先，用醛酮还原酶AKR和乙醇脱氢酶ADH作为模型酶蛋白，通过两种非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸(p-Azido-L-phenylalanine,pAzF)和对炔丙氧基-L-苯丙氨酸分子修饰(p-propargyloxy-L-phenylalanine,p-PaF)，得到的双酶突变体，即AKR-对叠氮基-L-苯丙氨酸(AKR-pAzF)突变体和ADH-对炔丙氧基-L-苯丙氨酸(ADH-p-PaF)突变体；然后，细胞裂解后，混合双酶上清液，在微波辐射辅助下，在细胞裂解上清混合液中直接进行共价交联，完成定点有序交联，得到双酶聚集体(有序交联双酶)。
首先，我们利用遗传密码扩展，构建非天然氨基酸蛋白表达系统；通过诱导表达，将对叠氮基-L-苯丙氨酸pAzF掺入醛酮还原酶(AKR)，产生AKR两点突变体；对炔丙氧基-L-苯丙氨酸p-PaF掺入乙醇脱氢酶(ADH)，产生ADH两点突变体；然后，细胞裂解后，混合双酶上清液，在微波辐射辅助下加速双酶蛋白之间的点击化学反应，从细胞裂解液中进行双酶有序交联。通过SEM以及CLSM对有序交联双酶的形貌进行表征，并进一步通过测定动力学参数和级联催化效率验证有序交联酶的催化效果。
选取远离活性中心的突变位点，得到了蛋白催化特异性和活性构象不变的双酶突变体；作为优选，分别选取远离AKR和ADH活性中心的四个位点，得到了两种不同空间距离的AKR两点突变体和ADH两点突变体。
作为优选，醛酮还原酶AKR与乙醇脱氢酶ADH的摩尔比为1：1。
作为优选，细胞裂解上清混合液中的蛋白质浓度为15mg·mL-1～25mg·mL-1。
作为优选，双酶交联反应时，细胞裂解上清混合液中加入0.4个当量的CuI。
作为优选，醛酮还原酶两点突变体分别为AKR-138Q-215E、AKR-49Y-266E；乙醇脱氢酶两点突变体分别为ADH-4Y-252E、ADH-156Y-190Y。突变位点的选择要使突变位点远离活性中心并突变为TAG密码子。
作为优选，微波温度为15℃，微波功率为12W，微波时间为4～5min。
作为优选，所述位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，具体包括下述步骤：
(1)选择对应对叠氮-L-苯丙氨酸(pAzF)的特异性酪氨酰-tRNA合成酶/tRNA对，对应对炔丙氧基-L-苯丙氨酸(p-PaF)的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)/吡咯赖氨酸tRNA，通过和pZE21-AKR突变体(AKR-138Q-215E、AKR-49Y-266E)，pZE21-ADH突变体(ADH-4Y-252E、ADH-156Y-190Y)分别进行共转化到E.coli C321.ΔA(MG1655)制得非天然氨基酸掺入蛋白表达体系；使大肠杆菌MG1655成为诱导醛酮还原酶AKR和乙醇脱氢酶ADH表达的宿主，将构建好的ADH和ADH突变体菌株接种到LB培养基中，培养基中抗生素及其浓度为氨苄青霉素50μg·mL-1，氯霉素34μg·mL-1和卡那霉素100μg·mL-1；并在振荡培养箱中34℃，220rpm培养生长；当菌液OD600达到0.6时，添加诱导剂L-Arabinose至终浓度为0.2％(w/v)；在OD600为0.8时，添加诱导剂aTc至终浓度为30ng·mL-1，并同时加入非天然氨基酸至终浓度为1mM；放入振荡培养箱中23℃，200rpm诱导酶蛋白表达，诱导时间为16h；
(2)诱导结束后，以离心获得的细胞沉淀，离心的转数为8000rpm，时间为5min，并用PBS缓冲液洗涤沉淀；沉淀重悬于PBS中并通过超声处理裂解细胞，其中PBS加入量为原菌液体积的1/5，超声破碎采用冰浴，功率400W，破碎时间10min，其中每10s设置破碎3s停7s；细胞破碎后的可溶性和不溶性部分通过离心分离得到细胞破碎液上清，离心的转数为10000rpm，时间为15min；
(3)细胞裂解后，混合双酶上清液，得到双酶上清混合液；将0.4个当量的CuI加入双酶上清混合液中；将装有上述混合物的容器放入配有冷却模块的微波反应器中，并在15℃和12W的功率下照射4min；
(4)分离酶蛋白组装体，使用离心的方法，离心的转数为12000xg，时间为10min，并用PBS洗涤，并使用Bradford法进行检测直到上清液中未检测到蛋白质；
(5)将得到的双酶聚集体(有序交联双酶)通过蛋白标记后，用CLSM来表征和确定其形貌；或在30℃真空干燥箱中过夜干燥，最后得到的干燥的双酶聚集体通过SEM来表征和确定其形貌。
本发明还提供了上述方法得到的双酶聚集体在级联催化中合成氯丙那林中间体(R)-1-(2-氯苯基)乙醇的应用。作为优选，具体催化合成的过程如下：用突变体AKR-49-266-pAzF和ADH-156-190-p-PaF制得的双酶聚集体投入到反应体系中；反应体系为：酶蛋白1mg，2-氯苯基乙酮2mg，NADP+10mg，异丙醇300μL，加PBS(20mM,pH 7.0)至2mL；反应均在30℃下进行，磁力搅拌12h；反应结束后，将酶蛋白从反应混合物中离心分离；用5mL正己烷萃取反应混合物，上清液用高效液相色谱法(HPLC,Agilent 1260)进行分析，Daicel IC色谱柱(250mm 4.6mm,5m粒径)进行色谱分离；正己烷(流动相A)与异丙醇(流动相B)的体积比为96：4；泵的流速为1mL/min，柱温保持在20℃，进样量为10L；在波长210nm处采集数据，用相应标准品的保留时间验证底物和目标产物，并根据标准曲线计算产率和异构体的比例(％)。
相同的催化体系还用于转换频率(Turnover frequency,TOF)的测试中。反应在30℃下进行，反应时间为6h；每次反应结束后，离心回收CLDEs投入到下一次的循环催化中，循环5次，HPLC检测每次的底物转化量。一般地，转换频率(Turnover frequency,TOF)定义为单位时间单位活性位上发生催化反应的次数或生成目标产物的数目或消耗反应物的数目。根据定义进行计算：TOF＝TON/t(其中TON为转换数turnover number)，TON＝底物转化数/活性位点数。
在转化率测试中，反应体系为10mL：酶量1mg，2-氯苯基乙酮10mg，NADP+50mg，异丙醇1.5mL，加PBS(20mM,pH 7.0)至10mL。反应在30℃下进行，磁力搅拌。在反应4h后开始取样，每两个小时一次，至反应24h。每次抽取反应液800μL，离心萃取，液相检测，根据标准曲线计算底物转化率。
本发明中，使用遗传密码扩展的方法将非天然氨基酸纳入酶蛋白中，再通过点击化学反应在细胞破碎上清液中直接获得无载体的定点交联双酶。将乙醇脱氢酶(ADH)的两个位点均替换为对叠氮-L-苯丙氨酸，通过交联剂环辛双炔分别与同样插入pAzF的醛酮还原酶(AKR)突变体发生应变促进炔烃-叠氮化物环加成反应。这样就得到了定点交联双酶。为了实现在级联反应中高效催化的多酶有序排列，利用非天然氨基酸基团的多样性，在酶蛋白中引入了另一种NSAAs-对炔丙氧-L-苯丙氨酸，使用NSAAs蛋白表达系统，分别表达出AKR突变体-pAzF和ADH突变体-p-PaF。AKR-pAzF和ADH-p-PaF从细胞破碎上清液中直接交联制得有序交联双酶，且通过蛋白标记和结构论证，使双酶的有序交联方式得到验证。其中引入酶蛋白的非天然氨基酸-p-PaF和pAzF使交联反应在酶分子间具有精准的靶向性。同时交联过程在微波辐射下辅助进行，从细胞破碎上清液中快速交联聚集的制备过程更大程度的保留酶的原始活性和选择性。其次酶蛋白之间的有序共价连接引起的底物通道效应可明显提高级联反应中酶的催化效率。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明通过利用插入非天然氨基酸的反应特异性，仅从细胞裂解液就制备了交联酶，避免了蛋白纯化带来的活性损失，可以很好地保留酶的初始活性，并节约了纯化过程的时间和经济成本；
(2)使用本发明的方法，使酶蛋白的共价连接位点得到精确控制，可以避免活性中心的破坏；通过共价交联后，酶蛋白的构象得以保留和还原，交联酶具有较高的催化活性和催化特异性；
(3)通过本发明得到的酶蛋白的尺寸可以达到um级别，在催化当中更加的利于分离；为了实现对蛋白质的完全控制，可以通过多点交联生产具有更高尺寸和更复杂结构的更大的蛋白质超级结构；
(4)本发明中用到了氧化还原酶双酶组合催化，在催化反应中，ADH通过脱氢作用再生昂贵的辅因子NADPH用于AKR的还原催化反应；双酶体系中，循环反应改变了不利的反应平衡并推动反应生成产物；特别是对于氧化还原辅因子依赖系统，追求高原子经济性和高分子选择性的自给自足一锅法反应显得更有意义；
(5)本发明中，双酶的定点交联和高度有序的特性，可以高效地完成催化，中间体在酶的不同活性位点之间运输，消除反应中间体的繁琐分离和纯化；其次酶蛋白之间的有序共价连接引起的底物通道效应可明显提高级联反应中酶的催化效率，使得酶蛋白有序交联的研究变得更加有意义。
附图说明
图1是本发明制备过程示意图；
图2为本发明双酶聚集体在级联催化中合成氯丙那林中间体(R)-1-(2-氯苯基)乙醇的过程图；
图3是本发明AKR-ADH两点突变体交联双酶的扫描电镜图；
图4是本发明AKR-ADH两点突变体交联双酶的荧光共聚焦显微镜图；
图5是本发明中有序交联酶与常规无序交联酶的辅因子再生效率和还原活性对比图；
图6是本发明中有序交联酶与常规无序交联酶在级联反应中的转化率和TOF随时间变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步的说明，这些实施例并非对本发明的限定，依照本领域现有的技术，本发明的实施方式并不限于此，凡依照本发明公开内容所做出的本领域的等同替换，均属本发明的保护内容。
实施例1
参照图1，一种位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)选择对应对叠氮-L-苯丙氨酸(pAzF)的特异性酪氨酰-tRNA合成酶/tRNA对，对应对炔丙氧基-L-苯丙氨酸(p-PaF)的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)/吡咯赖氨酸tRNA，通过和pZE21-AKR突变体(AKR-138Q-215E、AKR-49Y-266E)，pZE21-ADH突变体(ADH-4Y-252E、ADH-156Y-190Y)分别进行共转化到E.coli C321.ΔA(MG1655)制得非天然氨基酸掺入蛋白表达体系；使大肠杆菌MG1655成为诱导醛酮还原酶AKR和乙醇脱氢酶ADH表达的宿主，将构建好的ADH和ADH突变体菌株接种到LB培养基中，培养基中抗生素及其浓度为氨苄青霉素50μg·mL-1，氯霉素34μg·mL-1和卡那霉素100μg·mL-1；并在振荡培养箱中34℃，220rpm培养生长；当菌液OD600达到0.6时，添加诱导剂L-Arabinose至终浓度为0.2％(w/v)；在OD600为0.8时，添加诱导剂aTc至终浓度为30ng·mL-1，并同时加入非天然氨基酸至终浓度为1mM；放入振荡培养箱中23℃，200rpm诱导酶蛋白表达，诱导时间为16h；
(2)诱导结束后，以离心获得的细胞沉淀，离心的转数为8000rpm，时间为5min，并用PBS缓冲液(0.02mol·L-1，pH 7.0)洗涤沉淀；沉淀重悬于PBS中并通过超声处理裂解细胞，其中PBS加入量为原菌液体积的1/5，超声破碎采用冰浴，功率400W，破碎时间10min，其中每10s设置破碎3s停7s；细胞破碎后的可溶性和不溶性部分通过离心分离得到细胞破碎液上清，离心的转数为10000rpm，时间为15min，从而分离得到细胞破碎液上清；
(3)细胞裂解后，混合双酶上清液，得到双酶上清混合液；醛酮还原酶AKR与乙醇脱氢酶ADH的摩尔比为1：1，连接位点取决于插入的非天然氨基酸；醛酮还原酶AKR-对叠氮基-L-苯丙氨酸与乙醇脱氢酶ADH-对炔丙氧基-L-苯丙氨酸均为两点突变体：AKR-138Q-215E、AKR-49Y-266E；ADH-4Y-252E、ADH-156Y-190Y；将0.4个当量的CuI加入双酶的破碎上清混合液中(酶浓度为15-25mg/ml)；将装有上述混合物的容器放入配有冷却模块的微波反应器中，并在15℃和12W的功率下照射4min；
(4)分离酶蛋白组装体，使用离心的方法，离心的转数为12000xg，时间为10min，并用PBS(0.02mol·L-1，pH 7.0)洗涤，并使用Bradford法进行检测直到上清液中未检测到蛋白质；
(5)将得到的双酶聚集体(有序交联双酶)通过蛋白标记后，用CLSM来表征和确定其形貌；或在30℃真空干燥箱中过夜干燥，最后得到的干燥的交联酶通过SEM来表征和确定其形貌。
本发明用醛酮还原酶(AKR)和乙醇脱氢酶(ADH)作为模型酶，通过两种非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸(p-Azido-L-phenylalanine,pAzF)和对炔丙氧基-L-苯丙氨酸(p-propargyloxy-L-phenylalanine,p-PaF)分子修饰，得到AKR-pAzF突变体和ADH-p-PaF突变体；然后在微波的辅助下，双酶在细胞破碎上清液中发生点击化学反应，交联聚集得到双酶聚集体(有序交联双酶)。实验结果表明，酶的有序连接有更高的底物亲和力和催化效率，更好的循环催化稳定性和催化性能。
本发明得到的有序交联双酶可以应用于级联催化中合成氯丙那林中间体(R)-1-(2-氯苯基)乙醇。化学反应过程如图2所示。
具体催化合成的过程如下：用突变体AKR-49-266-pAzF和ADH-156-190-p-PaF制得的定点有序交联酶投入到反应体系中；反应体系为：酶蛋白1mg，2-氯苯基乙酮2mg，NADP+10mg，异丙醇300μL，加PBS(20mM,pH 7.0)至2mL；反应均在30℃下进行，磁力搅拌12h；反应结束后，将酶蛋白从反应混合物中离心分离；用5mL正己烷萃取反应混合物，上清液用高效液相色谱法(HPLC,Agilent 1260)进行分析，Daicel IC色谱柱(250mm 4.6mm,5m粒径)进行色谱分离；正己烷(流动相A)与异丙醇(流动相B)的体积比为96：4；泵的流速为1mL/min，柱温保持在20℃，进样量为10L；在波长210nm处采集数据，用相应标准品的保留时间验证底物和目标产物，并根据标准曲线计算产率和异构体的比例(％)。
相同的催化体系还用于转换频率(Turnover frequency,TOF)的测试中。反应在30℃下进行，反应时间为6h；每次反应结束后，离心回收CLDEs投入到下一次的循环催化中，循环5次，HPLC检测每次的底物转化量。一般地，转换频率(Turnover frequency,TOF)定义为单位时间单位活性位上发生催化反应的次数或生成目标产物的数目或消耗反应物的数目。根据定义进行计算：TOF＝TON/t(其中TON为转换数turnover number)，TON＝底物转化数/活性位点数。
在转化率测试中，反应体系为10mL：酶量1mg，2-氯苯基乙酮10mg，NADP+50mg，异丙醇1.5mL，加PBS(20mM,pH 7.0)至10mL。反应在30℃下进行，磁力搅拌。在反应4h后开始取样，每两个小时一次，至反应24h。每次抽取反应液800μL，离心萃取，液相检测，根据标准曲线计算底物转化率。
实施例2
有序交联和定点交联的形貌表征
在制备的定点交联酶中含有AKR和ADH两种酶，本发明AKR-ADH两点突变体交联双酶的扫描电镜图如图3所示：a,AKR-49-266-ADH156-190-定点交联酶；b,AKR-49-266-ADH156-190-有序交联酶；c,AKR-138-215-ADH156-190-定点交联酶；d,AKR-138-215-ADH156-190-有序交联酶。在电镜下扫描观察，并不能分辨出两种酶的交联情况，甚至不能分辨出是有序交联还是定点交联，如图2。为了进一步确认两种酶的交联，引入了使用短肽标签和小分子探针的互补识别对的标记策略。组氨酸标签(His-tag)最初开发是用作蛋白质纯化的亲和标签，但也已应用于选择性蛋白质标记。使用His标签和氮基三乙酸(NTA)-Ni探针的常规结合对是标记蛋白的简单灵敏的方法。又因为His-tag还可用于蛋白的纯化操作中，是本实验中酶蛋白已添加的标签，所以使用Cy5-BisNTA-Ni特异性结合His-tag的蛋白标记方法是首要选择。其次，短肽序列Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys，其中Xaa是一个非半胱氨酸氨基酸，在基因上融合或插入到蛋白质中，它可以被具有两个As(III)的透膜荧光素衍生物特异性识别取代基FlAsH，仅在砷与半胱氨酸硫醇结合后才会发出荧光。所以FlAsh-EDT2结合四半胱氨酸(CCXXCC)的标记方法也用于本实验中。在获得交联双酶OCLDEs和CLDEs后，一同加入两种荧光探针，其中AKR突变体-His-tag与Cy5-BisNTA-Ni特异性结合，同时ADH突变体-Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys与FlAsh-EDT2结合。本发明AKR-ADH两点突变体交联双酶的荧光共聚焦显微镜图如图4所示：a-c,分别为AKR-49-266-ADH-156-190-有序交联酶在波长577-492nm绿色图像，波长770-622nm红色图像和全波长组合图黄色图像。d-f,分别为AKR-49-266-ADH-156-190-定点交联酶在波长577-492nm绿色图像，波长770-622nm红色图像和全波长组合图黄色图像。用CLSM对其进行扫描观察，交联双酶中AKR突变体在波长770-622nm范围内观察到红色荧光，与此同时ADH突变体在波长577-492nm范围内呈现出绿色荧光(图4a-c)。图中可以看出，有序交联双酶呈现出的红色荧光和绿色荧光图案一致，且在全波长组合图中可以看到颜色均匀图案一致的黄色图像，可以说明在交联酶中，AKR突变体与ADH突变体的交联是有序交叉连接的，以致于他们散发出几乎叠合的荧光图案。而在定点交联酶的观察中，可观察到双酶无序交联的结果。AKR-突变体的红色荧光图案和ADH-突变体的绿色荧光图案明显不一致，且在全波长组合图案中随机交联的效果更加明显，有AKR红色荧光明显聚集的情况和ADH绿色荧光明显聚集的情况，当然交联均匀的情况也是其中一种(图4d-f)。
实施例3
交联酶的辅因子再生效率和还原活性
醛酮还原酶两点突变体分别为AKR-138Q-215E、AKR-49Y-266E；乙醇脱氢酶两点突变体分别为ADH-4Y-252E、ADH-156Y-190Y
测试了不同位点交联而得到的酶聚集体，其中每个位点的交联方式都分为有序、定点和随机交联，并在辅因子再生效率和还原活性方面进行对比分析，如图5。图5中：有序交联酶(OCLDEs),定点交联酶(CLDEs)和随机交联酶(RCLEAs)的NADPH生成率及还原活性结果(a,NADPH生成率；b,还原活性)。对比分析中，有序交联方式制备的酶聚集体比定点交联和随机交联表现出更好的还原活性及更高的NADPH生成率。一般在多酶组合的共固定体系中，辅因子再生率会远高于自由扩散体系，且会随着酶间距离的减小，辅因子再生效率提高。酶聚集体中ADH对NADPH的初始生成速率可以作为级联反应效率的衡量指标。
实施例4
交联酶的动力学测试
酶聚集体的Km值是低于游离酶的。这表明酶的聚集交联状态和底物具有更强的亲和力。此外酶聚集体在聚集交联后有了更高的催化效率和更好的催化性能。关于交联酶聚集体的催化效率提高，这可能是因为拥挤效应。拥挤诱导的构象变化直接影响活性位点，导致它们对底物的亲和力增加。在有序交联双酶、定点交联双酶和随机交联酶聚集体的动力学测试中，有序的交联双酶(Km为0.1130)比定点无序交联(Km为0.4588)和随机交联(Km为1.8183)显示出更低的Km值，更好的催化效率。其中，在AKR-49-266-ADH-156-190的交联中，有序交联酶的Kcat/Km值(106)是定点交联酶(24.65)的4.3倍，是随机交联酶聚集体(3.77)的28.12倍。这可能是因为酶蛋白的聚集因为酶的有序交叉排列使得底物在酶蛋白之间的穿插和转换变得更加容易，从而大大提高催化效率。此外，有序交联的靶向性特点使得交联在酶分子间无间距共价连接，这缩进了酶蛋白之间的距离。过于拥挤的大分子环境下，也可能改变对酶催化至关重要的构象灵活性和蛋白质动力学。
实施例5
级联催化中交联酶的转化率测试和性能研究
在适宜底物浓度的催化反应中，与随机交联酶聚集体相比，有序交联酶和定点交联酶均表现出高活性和高选择性，说明非天然氨基酸插入酶蛋白并采用点击化学交联方法的可行性。在级联催化的转化率检测中，反应体系为10mL：酶量1mg，2-氯苯基乙酮10mg，NADP+50mg，异丙醇1.5mL，加PBS(20mM,pH7.0)至10mL。反应在30℃下进行，磁力搅拌。在反应4h后开始取样，每两个小时一次，至反应24h。每次抽取反应液800μL，离心萃取，液相检测，根据标准曲线计算底物转化率。在相同的体系和条件下，得到了有序交联酶、定点交联酶及随机交联酶聚集体催化底物转化率随时间变化的关系如图6。图6中：a,OCLDEs,CLDEs及RCLEAs催化合成(R)-1-(2-氯苯基)乙醇转化率变化图；b,循环催化中的周转频率(TOF)变化图。a中可以看出有序交联酶在初始的催化效率中就远高于定点交联酶和随机交联酶聚集体，并在反应后14h使转化率迅速达到93.06％，最终使转化率达到96.7％。而定点交联酶和随机交联酶聚集体在14h时，转化率为54.81％和15.9％，最终能达到74.41％和25.76％。在14h时，有序交联酶的底物转化率是定点交联酶的1.69倍，是随机交联酶聚集体的5.85倍，在级联反应中表现出较高的催化效率。
为了进一步检测有序交联双酶和定点交联双酶的催化性能在级联反应中的变化，检测了在30h的连续催化中，有序交联双酶和定点交联双酶在级联催化体系中的周转频率(TOF)。图6，b中可以明显看出，有序交联双酶的TOF下降值(2.02至1.75)要小于定点交联双酶(1.96至1.5)和随机交联酶聚集体(0.98至0.57)，说明有序交联双酶的在持续催化过程中有高于定点交联双酶和随机交联酶聚集体的稳定性。所以可以推测为这是因为有序交联方式形成的蛋白聚集可以更好地保留高活性形态。有序交联酶的TOF值始终高于定点交联酶，这可能是因为TOF随着酶间距离的增加而降低。而随机交联酶聚集体的交联方式由于繁琐的纯化过程和非特异性的共价连接导致酶活性损失，催化性能下降。
本发明实现了双酶的有序固定，采用遗传密码扩增方法制备了AKR-pAzF突变体和ADH-p-PaF突变体，然后在细胞裂解液中一步反应交联得到有序交联双酶。并且通过蛋白标记，使双酶的有序方式得到验证。此外，有序交联双酶有与无序交联方式相比，有较高的底物亲和力和酶活性。
本发明产生的有序交联双酶有较好催化性能，在用于手性醇药物中间体(氯丙那林药物中间体(R)-1-(2-氯苯基)乙醇)的催化合成中，有远优于无序交联酶的催化率和稳定性；其次酶蛋白之间的有序共价连接和连接位点的灵活性使得双酶之间的距离又变成了一个可控因素，酶靠近引起的底物通道效应可明显提高级联反应中酶的催化效率，使得酶蛋白有序交联的研究变得更加有意义。
上述实施例仅例示性说明本发明的较佳方案，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不超出记载的技术方案的范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，其特征在于包括下述步骤：首先，用醛酮还原酶AKR和乙醇脱氢酶ADH作为模型酶蛋白，通过两种非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸和对炔丙氧基-L-苯丙氨酸分子修饰，得到的双酶突变体，即AKR-对叠氮基-L-苯丙氨酸突变体和ADH-对炔丙氧基-L-苯丙氨酸突变体；然后，细胞裂解后，混合双酶上清液，在微波辐射辅助下，在细胞裂解上清混合液中直接进行共价交联，完成定点有序交联，得到双酶聚集体。
2.根据权利要求1所述位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，其特征在于：分别选取远离AKR和ADH活性中心的四个位点，得到了两种不同空间距离的AKR两点突变体和ADH两点突变体。
3.根据权利要求1所述位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，其特征在于：醛酮还原酶AKR与乙醇脱氢酶ADH的摩尔比为1：1。
4.根据权利要求1所述位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，其特征在于：细胞裂解上清混合液中的蛋白质浓度为15mg·mL-1～25mg·mL-1。
5.根据权利要求1所述位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，其特征在于：双酶交联反应时，细胞裂解上清混合液中加入0.4个当量的CuI。
6.根据权利要求2所述位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，其特征在于：醛酮还原酶两点突变体分别为AKR-138Q-215E、AKR-49Y-266E；乙醇脱氢酶两点突变体分别为ADH-4Y-252E、ADH-156Y-190Y。
7.根据权利要求1所述位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，其特征在于：微波温度为15℃，微波功率为12W，微波时间为4～5min。
8.根据权利要求1所述位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，其特征在于具体包括下述步骤：
(1)使大肠杆菌MG1655成为诱导醛酮还原酶AKR和乙醇脱氢酶ADH表达的宿主，将构建好的ADH和ADH突变体菌株接种到LB培养基中，培养基中抗生素及其浓度为氨苄青霉素50μg·mL-1，氯霉素34μg·mL-1和卡那霉素100μg·mL-1；并在振荡培养箱中34℃，220rpm培养生长；当菌液OD600达到0.6时，添加诱导剂L-Arabinose至终浓度为0.2％；在OD600为0.8时，添加诱导剂aTc至终浓度为30ng·mL-1，并同时加入非天然氨基酸至终浓度为1mM；放入振荡培养箱中23℃，200rpm诱导酶蛋白表达，诱导时间为16h；
(2)诱导结束后，以离心获得的细胞沉淀，离心的转数为8000rpm，时间为5min，并用PBS缓冲液洗涤沉淀；沉淀重悬于PBS中并通过超声处理裂解细胞，其中PBS加入量为原菌液体积的1/5，超声破碎采用冰浴，功率400W，破碎时间10min，其中每10s设置破碎3s停7s；细胞破碎后的可溶性和不溶性部分通过离心分离得到细胞破碎液上清，离心的转数为10000rpm，时间为15min；
(3)细胞裂解后，混合双酶上清液，得到双酶上清混合液；将0.4个当量的CuI加入双酶上清混合液中；将装有上述混合物的容器放入配有冷却模块的微波反应器中，并在15℃和12W的功率下照射4min；
(4)分离酶蛋白组装体，使用离心的方法，离心的转数为12000xg，时间为10min，并用PBS洗涤，并使用Bradford法进行检测直到上清液中未检测到蛋白质；
(5)将得到的双酶聚集体通过蛋白标记后，用CLSM来表征和确定其形貌；或在30℃真空干燥箱中过夜干燥，最后得到的干燥的双酶聚集体通过SEM来表征和确定其形貌。
9.一种权利要求1所述方法得到的双酶聚集体在级联催化中合成氯丙那林中间体(R)-1-(2-氯苯基)乙醇的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于具体催化合成的过程如下：用突变体AKR-49-266-pAzF和ADH-156-190-p-PaF制得的双酶聚集体投入到反应体系中；反应体系为：酶蛋白1mg，2-氯苯基乙酮2mg，NADP+10mg，异丙醇300μL，加PBS至2mL；反应均在30℃下进行，磁力搅拌12h；反应结束后，将酶蛋白从反应混合物中离心分离；用5mL正己烷萃取反应混合物，上清液用高效液相色谱法进行分析，Daicel IC色谱柱进行色谱分离；正己烷与异丙醇的体积比为96：4；泵的流速为1mL/min，柱温保持在20℃，进样量为10μL；在波长210nm处采集数据，用相应标准品的保留时间验证底物和目标产物，并根据标准曲线计算产率和异构体的比例。
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