CN105925558B - 一种用于制备他汀类药物的复合固定化酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药工业技术领域，主要涉及一种用于制备他汀类药物的复合固定化酶，其制备方法及应用。本发明所述的复合固定化酶，由活性酶以吸附、共价结合、包埋、微囊化或交联的固定方式固定于固定化酶载体中制备而成，其中，所述活性酶由酮基还原酶和/或卤醇脱卤酶组成，所述酮基还原酶占活性酶的质量百分比为0%~100%。该固定化酶产品应用于生产阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀等产品的中间体(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯和/或(R)‑4‑氰基‑3‑羟基丁酸乙酯的过程中。本发明的复合固定化酶与液酶相比，降低生产成本和劳动强度，提高酶的利用效率，减少三废排，绿色环保。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程和绿色制药领域，具体涉及一种复合固定化酶及其制备方法及用途。
背景技术
他汀类药物（statins）是羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，此类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶（HMG-CoA）还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面（主要为肝细胞）低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）受体数量和活性增加、使血清胆固醇清除增加、水平降低。他汀类药物还可抑制肝脏合成载脂蛋白B-100，从而减少富含甘油三酯AV、脂蛋白的合成和分泌。目前市售的他汀类药物主要有阿托伐他汀、瑞伐他汀和匹伐他汀等。
阿托伐他汀（atorvastatin，商品名立普妥，Lipitor）是世界上第一个年销售额超过百亿美元的药品，它通过抑制羟甲基戊二酰CoA还原酶，阻碍肝脏中胆固醇合成的限速步骤来降低血液中胆固醇的含量。瑞舒伐他汀(Crestor)，2015年阿斯利康销售额49.2亿美元。
阿托伐他汀等他汀类药物的生产工艺中，涉及两个重要的中间体，分别为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，该两个中间体在现有工艺中可以分别采用酮基还原酶和卤醇脱卤酶催化反应得到，且该两个反应为顺序反应，即，4-氯-3-羟基丁酸乙酯在酮基还原酶催化下生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯再作为底物，在卤醇脱卤酶的催化下生成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，这两步反应均为酶催化反应，生物催化具有明显的绿色、高效和专一等特点，利用酮基还原酶将酮基转化为手性醇，利用卤醇脱卤酶脱去卤基，是重要的生物转化反应之一，与使用固定化酶相比，每批反应必须换用新的酶液，分离困难，操作繁琐，且降低了酶的利用效率，废液不可回收，产生大量三废污染物，同时产品中可能含有蛋白等菌体杂质。
固定化酶技术属于新兴催化技术，至今仅有100多年的历史，到上个世纪70年代末，该技术在某些行业已有较为成熟的产业化成果，选择适当的固定化方法如包埋法、微囊化法、共价连接法、吸附法或组合方法，适当的载体如无机载体或有机载体、天然载体或合成载体、有孔载体或无孔载体、膜、颗粒、泡沫、胶囊等，以及适当的固定化条件如水相、有机溶剂、pH、温度等。随着科学技术的发展，固定化酶的技术也再不断的进步，通过固定化载体、固定化方法和酶的不断改进，提高了许多不具有工业化应用酶的性能，使其具有更高的选择性、活力和耐用性，其反应器设计较灵活，适用于多种不同反应介质和反应系统，方便过程开发和下游处理，尤其便于过程控制。但是，由于该技术出现时间短，有许多传统催化反应还没有尝试应用固定化酶技术，对于固定化酶技术应用于医药化工领域，缺少足够的实践经验，其中的技术可行性，相关参数的摸索还是空白。
现有技术中，尚未出现专门用于他汀类药物的生产的固定化酶产品，也没有出现将多种他汀类药物生产中需要的酶复合固定化于同一载体中制得的复合固定化酶产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于制备他汀类药物的复合固定化酶。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：
一种用于制备他汀类药物的复合固定化酶，其由活性酶以吸附、共价结合、包埋、微囊化或交联的固定方式固定于固定化酶载体中制备而成，其中，所述活性酶由酮基还原酶和/或卤醇脱卤酶组成，所述酮基还原酶占所述活性酶的质量百分比为0%~100%，所述活性酶占所述固定化酶载体的质量百分比为0.01%~5%。
本领域常见的，本发明所述酮基还原酶和卤醇脱卤酶可以选择野生型或突变型。
优选地，本发明所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶，其中，所述酮基还原酶占活性酶的质量百分比为20%~80%。
进一步优选地，本发明所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶，其中，所述酮基还原酶占活性酶的质量百分比为40%~60%。
进一步优选地，本发明所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶，其中，所述酮基还原酶占活性酶的质量百分比为50%。
优选地，本发明所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶，其中，所述活性酶占所述固定化酶载体的质量百分比为0.05%~2%。
进一步地，本发明所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶，其中，所述固定方式为共价结合，所述固定化酶载体选自环氧基固定化酶载体或氨基固定化酶载体。
进一步地，本发明所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶，其中，所述复合固定化酶的制备方法为：将活性酶和固定化酶载体分别加入缓冲溶液中，所述缓冲液的pH值为5~10，控制固定化反应温度为10~60℃，搅拌反应8~96小时，收集固体，干燥，即得。
作为本发明的优选方案，本发明所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶，其中，所述反应时间为16~48小时，优选24小时。
作为本发明的进一步优选方案，本发明所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶，其中，所述缓冲溶液的pH值为6~9，优选7.5~8.5，进一步优选8。
作为本发明的优选方案，本发明所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶，其中，所述固定化反应温度为15℃~40℃，优选20℃~30℃，进一步优选25℃。
作为本发明的优选方案，本发明所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶，其中，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCL缓冲溶液或三乙醇胺缓冲溶液，优选磷酸盐缓冲溶液。
作为本发明的优选方案，本发明所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶，其中，所述反应时间为16~48小时，优选24小时。
本发明的另一目的在于提供所述用于制备他汀类药物的复合固定化酶的用途。
本发明所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶在生产他汀类药物中间体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和/或(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯中的用途。
本发明的另一目的在于提供制备所述用于制备他汀类药物的复合固定化酶的方法。
制备本发明所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶的方法，其包括如下步骤：（1）将活性酶和固定化载体分别加入缓冲溶液中，所述缓冲溶液的pH值为5~10，（2）控制固定化反应温度为10~60℃，搅拌反应8~96小时，（3）收集固体，干燥，即得，其中，所述固定化酶载体选自环氧基固定化酶载体或氨基固定化酶载体，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCL缓冲溶液或三乙醇胺缓冲溶液。
优选地，上述制备本发明所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶的方法，其中，步骤（1）中缓冲溶液的pH值为6~9，优选7.5~8.5，进一步优选8。
优选地，上述制备本发明所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶的方法，其中，步骤（2）中所述固定化反应温度为20℃~30℃，优选25℃。
优选地，上述制备本发明所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶的方法，其中，步骤（2）中搅拌反应时间为16~48小时，优选24小时 。
优选地，上述制备本发明所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶的方法，其中，步骤（2）中搅拌转速为80~200rpm，优选120~160rpm。
另外，本领域技术人员所熟知的，所述氨基固定化酶载体使用前应当活化。
本发明技术方案中，所述的酮基还原酶、卤醇脱卤酶、固定化酶载体均可商购获得。
由于以上技术方案的实施，本发明与已有技术相比具有如下优势：
1、本发明技术方案的进步性在于，通过固定化酶的使用，方便了制备他汀类药物的顺序反应中反应混合物的分离，改进了目前液酶使用的缺点，与当前液酶反应相比提高了酶的利用效率，减少了三废排放，提高产品质量、降低生产成本和劳动强度，且便于过程控制，具有重要的工业应用价值和社会价值。
2、固定化酶技术应用于他汀类药物的生产，需要解决一系列的技术匹配问题，本发明首次将固定化酶技术应用于本发明所述反应，通过大量具体试验，对复合固定化酶的性能进行了优化，确定了本文所涉及的具体催化反应中的固定化反应类型，载体选择，缓冲液选择，完成了反应温度、时间、pH值等条件的优化，采用本发明提供的复合固定化酶，实现了他汀类药物制备过程中两步反应产物纯度98%以上，反应收率95%以上，适应工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明并不限于以下实施例所提供的技术方案。
实施例1
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值8.0），并依次加入0.4g酮基还原酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度25℃，转速120rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例2
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值8.0），并依次加入0.4g卤醇脱卤酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度30℃，转速150rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例3
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值8.0），并依次加入0.4g酮基还原酶，40g活化后的氨基固定化酶载体(sepabeads® EC-HA/M)，温度20℃，转速160rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例4
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值8.0），并依次加入0.4g酮基还原酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度25℃，转速120rpm，反应16小时，收集固定化酶。
实施例5
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值8.0），并依次加入0.4g酮基还原酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度25℃，转速120rpm，反应48小时，收集固定化酶。
实施例6
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值5.8），并依次加入0.4g卤醇脱卤酶，40g活化后的氨基固定化酶载体(sepabeads® EC-HA/M)，温度25℃，转速150rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例7
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值8.8），并依次加入0.4g卤醇脱卤酶，40g活化后的氨基固定化酶载体(sepabeads® EC-HA/M)，温度25℃，转速150rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例8
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值8.0），并依次加入0.02g酮基还原酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度25℃，转速120rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例9
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值8.0），并依次加入0.8g酮基还原酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度25℃，转速120rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例10
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值8.0），并依次加入0.004g酮基还原酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度25℃，转速120rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例11
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值8.0），并依次加入2g酮基还原酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度25℃，转速120rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例12
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值8.0），并依次加入0.02g卤醇脱卤酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度25℃，转速120rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例13
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值8.0），并依次加入0.8g卤醇脱卤酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度25℃，转速120rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例14
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值8.0），并依次加入0.004g卤醇脱卤酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度25℃，转速120rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例15
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值8.0），并依次加入2g卤醇脱卤酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度25℃，转速120rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例16
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值8.0），并依次加入0.2g酮基还原酶和0.2g卤醇脱卤酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度25℃，转速150rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例17
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值8.0），并依次加入0.08g酮基还原酶和0.32g卤醇脱卤酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度25℃，转速150rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例18
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值8.0），并依次加入0.32g酮基还原酶和0.08g卤醇脱卤酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度25℃，转速150rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例19
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值8.0），并依次加入0.16g酮基还原酶和0.24g卤醇脱卤酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度25℃，转速150rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例20
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（500mM，pH值8.0），并依次加入0.24g酮基还原酶和0.16g卤醇脱卤酶，40g环氧基固定化酶载体(sepabeads® EC-EP113-M)，温度25℃，转速150rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例21
在250mL三口烧瓶中加入120mL磷酸盐缓冲溶液（100mM，pH为7.0）依次加入底物4-氯-3-羟基丁酸乙酯12mL，异丙醇12mL，取实施例1的固定化酶5g，无水氯化钙1mM，0.02g辅酶I （NAD），于30℃下，200rpm搅拌反应，利用6M氨水控制pH值为7.0，利用气相色谱监测反应的转化率，24小时转化率达到99.9%以上，分离固定化酶，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相并蒸干，得到产品(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，纯度大于98%，收率98%。
实施例22
在250mL三口烧瓶中加入120mL磷酸盐缓冲溶液（100mM，pH为7.0）依次加入底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯12mL，异丙醇12mL，取实施例2的固定化酶5g，无水氯化钙1mM，0.02g辅酶I （NAD），于30℃下，200rpm搅拌反应，利用6M氨水控制pH值为7.0，利用气相色谱监测反应的转化率，24小时转化率达到99.9%以上，分离固定化酶，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相并蒸干，得到产品(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，纯度大于98%，收率97%。
实施例23
在250mL三口烧瓶中加入120mL磷酸盐缓冲溶液（100mM，pH为7.0）依次加入底物4-氯-3-羟基丁酸乙酯12mL，异丙醇12mL，取实施例16所得的固定化酶10g，无水氯化钙1mM，0.02g辅酶I （NAD），于35℃下，200rpm搅拌反应，反应开始后利用30%的氰化钠溶液控制pH值为7.0。利用气相色谱监测反应的转化率，18小时后转化率达到99.9%以上，分离固定化酶，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相并蒸干，得到产品(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，纯度大于98%，收率97%。
实施例24
在250mL三口烧瓶中加入120mL磷酸盐缓冲溶液（100mM，pH为7.0）依次加入底物4-氯-3-羟基丁酸乙酯12mL，异丙醇12mL，取实施例17所得的固定化酶10g，无水氯化钙1mM，0.02g辅酶I（NAD），于35℃下，200rpm搅拌反应，反应开始后利用30%的氰化钠溶液控制pH值为7.0。利用气相色谱监测反应的转化率，48小时后转化率达到99.9%以上，分离固定化酶，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相并蒸干，得到产品(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，纯度大于98%，收率95%。
Claims (7)
1.一种用于制备他汀类药物的复合固定化酶，其特征在于：由活性酶以共价结合的固定方式固定于固定化酶载体中制备而成，所述固定化酶载体选自环氧基固定化酶载体，其中，所述活性酶由酮基还原酶和卤醇脱卤酶组成，所述酮基还原酶占所述活性酶的质量百分比为20％～80％，所述活性酶占所述固定化酶载体的质量百分比为0.01％～5％；所述复合固定化酶的制备方法为：将活性酶和固定化酶载体分别加入缓冲溶液中，所述缓冲液的pH值为5～10，控制固定化反应温度为10～60℃，搅拌反应8～96小时，收集固体，干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶，其特征在于：所述酮基还原酶占活性酶的质量百分比为40％～60％。
3.根据权利要求1所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶，其特征在于：所述缓冲溶液的pH值为6～9。
4.根据权利要求1所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶，其特征在于：所述固定化反应温度为15℃～40℃。
5.根据权利要求1所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶，其特征在于：所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCL缓冲溶液或三乙醇胺缓冲溶液。
6.权利要求1～5中任一项所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶在生产他汀类药物中间体(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯中的用途。
7.制备根据权利要求1或2所述的用于制备他汀类药物的复合固定化酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将活性酶和固定化载体分别加入缓冲溶液中，所述缓冲溶液的pH值为5～10，(2)控制固定化反应温度为10～60℃，搅拌反应8～96小时，(3)收集固体，干燥，即得，其中，所述固定化酶载体选自环氧基固定化酶载体或氨基固定化酶载体，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCL缓冲溶液或三乙醇胺缓冲溶液。
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Citations (4)
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| 氨基功能载体固定化酶研究进展;许敬亮等;《化工进展》;20101231;第29卷(第3期);第494-497页 |
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