CN102605011A - 一种(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法 - Google Patents
一种(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及
一种
(S)-4-
氯
-3-
羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其以
4-
氯
-3-
羰基丁酸乙酯为底物，使该底物在生物催化剂和氢供体的存在下发生不对称还原反应生成
(S)-4-
氯
-3-
羟基丁酸乙酯，特别是，所述生物催化剂为酮还原酶
KRED102
，所述氢供体为异丙醇，所述不对称还原反应在
pH
为
5.0~9.0
的水相缓冲液中进行，并且反应体系中添加有聚乙二醇
400
作为底物分散剂以及二价金属离子作为酶活力增强剂。
本发明方法通过添加廉价且来源广泛的辅料，有效地改进了传统酶催化生产过程中底物浓度低、酶反应耗时长等缺点，且
操作简单，特别适合
在制药工业中推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法。
背景技术
(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯是制备羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂如他汀类药物的关键手性中间体。他汀类药物是目前世界上最为畅销的降胆固醇和降血脂药物，因此，作为他汀类药物关键手性中间体的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯具有较高的需求量和广泛的应用范围。
目前，利用还原法生产4-氯-3-羰基丁酸乙酯的方法可以分为化学法和生物法，其中生物法以其所具有的反应条件温和、立体专一性强、转化率高等特点被广泛地研究和应用。在生物法过程所选取的还原酶中，又以NAD依赖型和可以以异丙醇作为氢供体者为最佳。因为NAD较NADP廉价，而异丙醇相较于葡萄糖，氧化后不会产生酸性物质，且不易造成反应液乳化，有利于下一步的提取过程。在该过程反应体系的选择中，又以单一水相反应体系为较好。生产中大量使用有机溶剂，可能增加环境和安全风险。在单一水相反应体系获得较高的底物浓度，是目前该项研究中的热点。
中国发明专利申请例如申请号200810124754.2、201010213724.6、201110225388.1等公开了数种酮还原酶生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，然而这些方法采用的辅因子均为昂贵的NADP，并需要添加葡萄糖作为氢供体。其底物浓度虽然可以达到30％，但是必须添加大量有机溶剂形成两相体系，并且需要分批补料加入底物，操作繁琐。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
一种(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其以4-氯-3-羰基丁酸乙酯为底物，使该底物在生物催化剂和氢供体的存在下发生不对称还原反应生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，特别是，所述生物催化剂为酮还原酶KRED102，所述氢供体为异丙醇，所述不对称还原反应在pH为5.0～9.0的水相缓冲液中进行，并且反应体系中添加有聚乙二醇400作为底物分散剂以及二价金属离子作为酶活力增强剂。
根据本发明的进一步实施方案：反应起始时的反应体系中，4-氯-3-羰基丁酸乙酯的浓度为1％～30％(w/v)，酮还原酶KRED102的浓度为0.01％～0.8％(w/v)，异丙醇的浓度为1％-20％，聚乙二醇400的浓度为10％～70％(v/v)，所述二价金属离子的浓度为10～500mM。其中：反应起始时的反应体系中，4-氯-3-羰基丁酸乙酯的浓度优选为10％～20％(w/v)例如为16％(w/v)，酮还原酶KRED102的浓度优选为0.02％～0.1％(w/v)例如为0.04％(w/v)，异丙醇的浓度优选为5％～10％(v/v)例如为8％(v/v)，聚乙二醇400的浓度为40％～60％(v/v)例如为50％(v/v)，二价金属离子的浓度优选为0.5～2mM例如为1mM，二价金属离子可以以其无机盐例如盐酸盐、硫酸盐等形式引入到反应体系中。
所述的水相缓冲溶液优选为磷酸盐缓冲液或Tri-HCl缓冲液。
根据本发明的一个具体方面，所述制备方法的实施过程如下：在反应容器中加入水相缓冲溶液，依次加入底物4-氯-3-羰基丁酸乙酯，异丙醇，酮还原酶KRED102，聚乙二醇400，含有所述二价金属离子的无机盐，于温度20℃～40℃下，搅拌反应，利用气相色谱监测反应的转化率，至转化率达到80％～100％，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸干，即得(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯产品。其中，反应温度进一步优选为25℃～37℃。通过该实施过程获得的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯产品已经达到应用的要求，无需再进一步纯化。
优选地，所述的二价金属离子为钙离子或镁离子，含有所述二价金属离子的无机盐为氯化钙或氯化镁。
根据本发明，所用的原料4-氯-3-羰基丁酸乙酯、酮还原酶KRED102、聚乙二醇400均可商购获得。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
由于以上技术方案的实施，本发明与已有技术相比具有如下优势：
本发明方法通过添加廉价且来源广泛的辅料，有效地改进了传统酶催化生产过程中底物浓度低、酶反应耗时长等缺点，实现高效、低成本制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；并且，添加的辅料不会影响产物的分离和纯化，底物和其它物质可一次投入，也无需使用其它机溶剂，操作简单，特别适合在制药工业中推广应用。
附图说明
图1为实施例1中不加聚乙二醇400以及聚乙二醇400加入量分别为占反应体系总体积的10％、30％和50％的聚乙二醇400时，反应转化率随反应时间的变化图；
图2为实施例2中不加钙离子以及钙离子加入量分别为0.1mM、1mM和5mM时，反应转化率随反应时间的变化图。
具体实施方式
本发明提供的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其是在pH为5.0～9.0的磷酸盐缓冲液或Tri-HCl缓冲液中，加入0.1～0.8％(w/v)的酮还原酶KRED102作为生物催化剂，采用10％～70％(v/v)的聚乙二醇400作为底物分散剂，采用10～500mM的钙离子或其它二价金属离子作为酶活力增强剂，不对称还原浓度为1％～30％(w/v)的4-氯-3-羰基丁酸乙酯，加入1.2至1.5当量的异丙醇作为氢供体，以80％～100％的转化率，在2～24小时内生成目的产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，其反应式如下所示：
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
取四只20ml三口烧瓶，各加入2.37ml磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH为6.5)，并各依次加入底物4-氯-3-羰基丁酸乙酯1.33ml，异丙醇1.3ml，酮还原酶KRED(商业购买)1020.067g，向其中的三个烧瓶中分别加入反应体系总体积(10mL)的10％、30％和50％的聚乙二醇400，最后向各烧瓶中加磷酸盐缓冲溶液补足10ml，于30℃下，200rpm搅拌反应，利用气相色谱监测反应的转化率。各烧瓶中的反应转化率随时间的变化图如图1所示。从图1可见，当聚乙二醇加入量为50％时，反应的转化速率最大。
实施例2
取四只20ml三口烧瓶，分别加入2.37ml磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH为6.5)，并各分别依次加入底物4-氯-3-羰基丁酸乙酯1.33ml，异丙醇1.3ml，酮还原酶KRED102(商业购买)0.067g和聚乙二醇4005ml，向其中的三个烧瓶中还分别加入0.1mM、1mM和5mM的无水氯化钙，于30℃下，200rpm搅拌反应，利用气相色谱监测反应的转化率。各烧瓶中的反应转化率随反应时间的变化图如图2所示。从图2可见，当钙离子加入量为1mM时，反应转化速率最大。
实施例3
在20mL三口烧瓶中加入2.37ml磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH为6.5)，依次加入底物4-氯-3-羰基丁酸乙酯1.33ml，异丙醇1.30ml，酮还原酶KRED102(商业购买)0.02g，聚乙二醇4005ml，无水氯化钙1mM，于30℃下，200rpm搅拌反应，利用气相色谱监测反应的转化率。24小时后转化率达到85.7％。
实施例4
在20mL三口烧瓶中加入2.37ml磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH为6.5)，依次加入底物4-氯-3-羰基丁酸乙酯1.33ml，异丙醇1.30ml，酮还原酶KRED102(商业购买)0.05g，聚乙二醇4005ml，无水氯化钙1mM，于30℃下，200rpm搅拌反应，利用气相色谱监测反应的转化率。22小时后转化率达到99.9％。
实施例5
在2L三口烧瓶中加入237ml磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH为6.5)，依次加入底物4-氯-3-羰基丁酸乙酯133ml，异丙醇130ml，酮还原酶KRED102(商业购买)67g，聚乙二醇400500ml，无水氯化钙1mM，于30℃下，200rpm搅拌反应，利用气相色谱监测反应的转化率。24小时后转化率达到99.9％，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相并蒸干，得到产品160g，纯度＞98％。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其以4-氯-3-羰基丁酸乙酯为底物，使该底物在生物催化剂和氢供体的存在下发生不对称还原反应生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，其特征在于：所述生物催化剂为酮还原酶KRED102，所述氢供体为异丙醇，所述不对称还原反应在pH为5.0~9.0的水相缓冲液中进行，并且反应体系中添加有聚乙二醇400 作为底物分散剂以及二价金属离子作为酶活力增强剂。
2.根据权利要求1所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于：反应起始时的反应体系中，4-氯-3-羰基丁酸乙酯的浓度为1%~30% (w/v)，酮还原酶KRED102的浓度为0.01%~0.8% (w/v)，异丙醇的浓度为1%-20%，聚乙二醇400的浓度为10%~70% (v/v)，所述二价金属离子的浓度为0.1~20 mM。
3.根据权利要求2所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于：反应起始时的反应体系中，4-氯-3-羰基丁酸乙酯的浓度为10%~20%(w/v)。
4.根据权利要求2所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于：反应起始时的反应体系中，酮还原酶KRED102的浓度为0.02%~ 0.1%(w/v)。
5.根据权利要求2所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于：反应起始时的反应体系中，异丙醇的浓度为5%~10%(v/v)。
6.根据权利要求2所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于：反应起始时的反应体系中，聚乙二醇400的浓度为40%~60%(v/v)。
7.根据权利要求2所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于：反应起始时的反应体系中，二价金属离子的浓度为0.5~2 mM。
8.根据权利要求1或2所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于：所述的水相缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或Tri-HCl缓冲液。
9.根据权利要求1或2所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于：所述制备方法的实施过程如下：在反应容器中加入水相缓冲溶液，依次加入底物4-氯-3-羰基丁酸乙酯，异丙醇，酮还原酶KRED102，聚乙二醇400，含有所述二价金属离子的无机盐，于温度20℃~40℃下，搅拌反应，利用气相色谱监测反应的转化率，至转化率达到80%~100%，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸干，即得(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯产品。
10.根据权利要求9所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于：所述的二价金属离子为钙离子或镁离子，含有所述二价金属离子的无机盐为氯化钙或氯化镁。
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