CN104372041A

CN104372041A - 一种全细胞催化制备(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法

Info

Publication number: CN104372041A
Application number: CN201310348621.4A
Authority: CN
Inventors: 陈令伟
Original assignee: NANJING LANG'EN BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: NANJING LANG'EN BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-08-12
Filing date: 2013-08-12
Publication date: 2015-02-25
Anticipated expiration: 2033-08-12
Also published as: CN104372041B

Abstract

本发明公开了一种全细胞催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其中以4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）为底物，利用生物催化剂在以异丙醇为氢供体的条件下，然后加入CaCl₂、重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞，于温度25℃～40℃下搅拌，在pH为6.0～8.0的水相中不对称还原反应生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；利用细胞本身的辅酶再生体系，无需添加外源性的辅酶，解决了传统生物法中催化效率低以及成本高的问题，该方法反应条件温和、反应效率高、操作简便，特别是催化反应过程不用加还原性辅酶因子，大大提高了效率和降低了反应的成本，具有广阔的工业生产应用前景。

Description

一种全细胞催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法

技术领域

本发明涉及药物合成领域，尤其涉及一种全细胞催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法。

背景技术

(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（(S)-CHBE）是一种重要的有机合成中间体，可用于很多活性药物的合成，如他汀类降血脂药HMG-CoA还原酶抑制剂类、Slagenins B和C以及p-1,4-二氢吡啶型钙离子通道阻断剂等。他汀类药物是目前最畅销的降血脂类药物，随着阿托伐他汀专利的到期，市场对其中间体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的需求量会进一步加大。

以4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）为底物合成(S)-CHBE是非常有效经济的制备途径，COBE易于合成且价格低廉。目前关于COBE不对称手性还原制备(S)-CHBE以进行了很多的研究报道，概括起来主要有化学法和生物法。化学法催化的不对称还原，所用的催化剂包括铑、钌等昂贵金属，最关键的是采用化学法合成的(S)-CHBE立体选择性不够高，催化还原反应需要很高的氢气压，耗能高，污染尤其严重，对环境影响很大。

生物法以其所具有的反应条件温和、立体专一性强、转化率高等特点被广泛地研究和应用。中国发明专利申请例如申请号200810124754.2、201010213724.6、201110225388.1等公开了数种酮还原酶生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，然而这些方法的酶和辅因子用量较高，并需要添加葡萄糖作为氢供体。国内专利申请号201210465009.0公开了一种异丙醇作为氢供体的催化方法，所用的为酮还原酶冻干粉，酶冻干粉的生产成本较高，而且在反应中也需加入价格昂贵的辅因子，反应体系中添加了有机溶剂，不仅成本较高，不符合绿色化学催化的理念。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种反应步骤简单、成本较低、产品光学纯度高、的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种全细胞催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其中以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，利用生物催化剂在以异丙醇为氢供体的条件下，在水相中不对称还原反应生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，所述不对称还原反应在pH为6.0～8.0 的水相缓冲液中进行，在反应容器中加入配制好的所述水相缓冲液，然后依次加入底物COBE、异丙醇、CaCl₂、重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞，于温度25℃～40℃下搅拌反应，利用气相色谱方法检测反应进程，至转化率达到80％～100％，分批加入底物COBE；继续进行反应，至反应转化率达到95%～100％时结束反应，加入二氯甲烷多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；本发明的催化方法绿色无污染，无需添加有机溶剂和还原性辅因子，效率高、成本低、步骤少，简便易操作。

本发明所述的底物COBE和其他基本的化学试剂由市售购得，所述的含有重组酮还原酶的大肠杆菌由本公司专利201310345823.3中所制得。

本发明所述含有重组酮还原酶的大肠杆菌细胞的制备方法为：

1）将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养4～8小时；

2）将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至OD₆₀₀值达到0.8～1.2时，加入诱导剂，于22～32℃下继续培养16～20小时；

3）培养完成后在4℃下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体两遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞；

本发明所述的反应体系中底物COBE的终浓度为20％～30％(w/v)，重组酮还原酶的大肠杆菌细胞的用量为底物质量的1.0％～4.0％(w/w)，异丙醇的浓度为8％～13％(w/v)；反应起始时的反应体系中，反应中无需添加辅酶因子。

本发明所述的水相缓冲液可以为磷酸盐缓冲液，所述的水相缓冲液浓度为50～200mM，pH6.2～6.8。

本发明所述的反应体系中所用的为CaCl₂，浓度为2.0-20mM，在反应体系中加入的Ca²⁺、Mg²⁺等二价金属离子，不仅可以增加大肠杆菌细胞的通透性，而且这些离子还是酮还原酶的增强剂。

本发明所述底物COBE根据反应情况分1～5批加入，每批次加入量为反应体积的3%-15%；高浓度的底物COBE会影响其转化率和产物的立体选择性。

本发明所述的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，其诱导终浓度为0.2～1.0mM。

由于以上技术方案的实施，本发明与已有技术相比具有如下优势：本发明通过全细胞催化合成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，不需破碎细胞，反应体系无需加入有机溶剂，采用分批加入底物，提高了底物转化率和产物的ee值；利用细胞本身的辅酶再生体系，无需添加外源性的辅酶，解决了传统生物法中催化效率低以及成本高的问题，该方法反应条件温和、反应效率高、操作简便，特别是催化反应过程不用加还原性辅酶因子，大大提高了效率和降低了反应的成本，具有广阔的工业生产应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的描述。

实施例1：从转化平板将含有酮还原酶(KRED)基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于37℃下，摇床200rpm振荡培养7小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于37℃下，摇床200rpm振荡培养，培养至OD₆₀₀值达到1.0时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至浓度为0.2mM，于28℃下继续培养20小时，4℃下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞。

实施例2：从转化平板将含有酮还原酶(KRED)基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于38℃下，摇床220rpm振荡培养4小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于38℃下，摇床220rpm振荡培养，培养至OD₆₀₀值达到1.2时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至浓度为1.0mM，于32℃下继续培养16小时，4℃下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞。

实施例3：在100mL三口烧瓶中依次加入0.29g KH₂PO₄，0.24g K₂HPO₄·3H₂O，32mL去离子水，配制浓度为100mM，调节pH为6.5的磷酸盐缓冲液，然后依次加入4.8g 异丙醇，6.3g底物COBE，0.4g 重组酮还原酶的大肠杆菌细胞，0.028g 无水CaCl₂，30 ℃下磁力搅拌开始计时反应，4h取样，GC分析监测转化率98.2%，再加入6.3g底物COBE继续反应，10h取样，GC分析监测转化率99.3%，产物的光学ee为99.7%，其中底物及产物的具体分析条件为：色谱柱为0.3mm 毛细管柱30m(DIKMA)，FID 检测器。色谱柱温度208 ℃，气化和检测温度均为230 ℃，载气流量20-30ml/min，进样量0.3-0.5μL，载气为N₂。产物ee 值的分析条件为：色谱柱为CP-Chirasil-DEX CB手性毛细管柱，其余条件同上。反应结束后，加入等体积二氯甲烷萃取两次，合并有机相并蒸发脱去溶剂，得到产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯10.8g。

（说明：实施例3中的反应液的实际体积为50ml，包括32ml缓冲液，COBE 10ml（12.6g），6ml异丙醇（4.8g），加上菌体等，反应终体积在50ml左右。COBE浓度为12.6/50=25.2%，异丙醇4.8/50=9.6%，细胞0.4/12.6=3.2%。氯化钙的浓度（0.028×1000）/（111×0.05L）=5mM，其他实施例按此计算）

实施例4：在100mL的反应器中依次加入0.11g KH₂PO₄，0.10g K₂HPO₄·3H₂O，32mL去离子水，配制浓度为50mM，调节pH为6.2的磷酸盐缓冲液，然后依次加入3.6g 异丙醇，5.0g底物COBE，0.1g 重组酮还原酶的大肠杆菌细胞，0.010 g 无水CaCl₂，30℃下磁力搅拌开始计时反应，4h取样，GC分析监测转化率95.2%，再加入5.0g底物COBE继续反应，10h取样，GC分析监测转化率98.6%，产物的光学ee为99.6%。反应结束后，加入等体积二氯甲烷萃取两次，合并有机相并蒸发脱去溶剂，得到产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯8.78g。

实施例5：在100mL的反应器中依次加入0.58g KH₂PO₄，0.48g K₂HPO₄·3H₂O，32mL去离子水，配制浓度为200mM，调节pH为8.0的磷酸盐缓冲液，然后依次加入6.5g 异丙醇，7.5g底物COBE，0.5g 重组酮还原酶的大肠杆菌细胞，0.102g 无水CaCl₂，30℃下磁力搅拌开始计时反应，4h取样，GC分析监测转化率96.2%，再加入5.0g底物COBE继续反应，10h取样，GC分析监测转化率99.2%，产物的光学ee为99.8%。反应结束后，加入等体积二氯甲烷萃取两次，合并有机相并蒸发脱去溶剂，得到产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯12.97g。

实施例6：在1000mL的反应器中依次加入4.06g KH₂PO₄，3.36g K₂HPO₄·3H₂O，450mL去离子水，配制浓度为100mM，调节pH为6.5的磷酸盐缓冲液，然后依次加入80g 异丙醇，55g底物COBE，5.0g重组酮还原酶的大肠杆菌细胞，0.36g 无水CaCl₂，30℃下机械搅拌开始计时反应，4h取样，GC分析监测转化率95.3%，再加入55g底物COBE继续反应，10h取样，GC分析监测转化率97.5%，第三次加入55g底物COBE继续反应，18h取样，GC分析监测转化率99.3%，产物的光学ee为99.7%。反应结束后，加入等体积二氯甲烷萃取两次，合并有机相并蒸发脱去溶剂，得到产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯150.3g。

需要说明的是，上述仅仅是本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的保护范围，在上述实施例的基础上所作出的等同变换均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种全细胞催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其中以4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）为底物，利用生物催化剂在以异丙醇为氢供体的条件下，在水相中不对称还原反应生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，其特征在于：所述不对称还原反应在pH为6.0 ～8.0 的水相缓冲液中进行，在反应容器中加入配制好的所述水相缓冲液，然后依次加入底物COBE、异丙醇、CaCl₂、重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞，于温度25℃～40℃下搅拌反应，利用气相色谱方法检测反应进程，至转化率达到80％～100％，分批加入底物COBE；继续进行反应，至反应转化率达到95%～100％时结束反应，加入二氯甲烷多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

2.根据权利要求1所述的一种全细胞催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述含有重组酮还原酶的大肠杆菌细胞的制备方法为：

3）培养完成后在4℃下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体两遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞。

3.根据权利要求1和所述的一种全细胞催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述的反应体系中底物COBE的终浓度为20％～30％(w/v)，重组酮还原酶的大肠杆菌细胞的用量为底物质量的1.0％～4.0％(w/w)，异丙醇的浓度为8％～13％(w/v)。

4.根据权利要求1所述的一种全细胞催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述的水相缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述的水相缓冲液浓度为50～200mM，pH6.2～6.8。

5.根据权利要求1所述的一种全细胞催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述的反应体系中所用的为CaCl₂，浓度为2.0-20mM。

6.根据权利要求1所述的一种全细胞催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述底物COBE根据反应情况分1～5批补加，每批次补加量为反应体积的3%-15%。

7.根据权利要求1所述的一种全细胞催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，其诱导终浓度为0.2～1.0mM。