CN108410852A - 一种高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶的制备方法与应用 - Google Patents
一种高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶的制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108410852A CN108410852A CN201810217951.2A CN201810217951A CN108410852A CN 108410852 A CN108410852 A CN 108410852A CN 201810217951 A CN201810217951 A CN 201810217951A CN 108410852 A CN108410852 A CN 108410852A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aldolase
- chitosan
- acetaldehyde
- solution
- tolerance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 70
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 title claims abstract description 60
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 title claims abstract description 60
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 claims abstract description 19
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims abstract description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims abstract description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims abstract 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 48
- GJMPSRSMBJLKKB-UHFFFAOYSA-N 3-methylphenylacetic acid Chemical compound CC1=CC=CC(CC(O)=O)=C1 GJMPSRSMBJLKKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229940117957 triethanolamine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 16
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 16
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 11
- ALQNUOMIEBHXQG-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose 5-phosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ALQNUOMIEBHXQG-CRCLSJGQSA-N 0.000 claims description 10
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 claims description 9
- 102000003677 Aldehyde-Lyases Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000072 Aldehyde-Lyases Proteins 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 9
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 9
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 claims description 9
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 9
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 9
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 claims description 9
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 9
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 claims description 8
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 102000000587 Glycerolphosphate Dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010041921 Glycerolphosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 3
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 3
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 claims description 2
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- ADAMEOZKZQRNKP-UHFFFAOYSA-N n'-propylmethanediimine Chemical compound CCCN=C=N ADAMEOZKZQRNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 abstract description 8
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 abstract description 8
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 abstract description 8
- 238000004064 recycling Methods 0.000 abstract description 3
- IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N acetaldehyde Chemical compound [14CH]([14CH3])=O IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 abstract description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 abstract 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 abstract 2
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- LMOIEPYPVQOZCT-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxypropanal;phosphoric acid Chemical class OP(O)(O)=O.OCC(O)C=O LMOIEPYPVQOZCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 abstract 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 abstract 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 abstract 1
- 101000928995 Caenorhabditis elegans Putative deoxyribose-phosphate aldolase Proteins 0.000 description 13
- 102100037802 Deoxyribose-phosphate aldolase Human genes 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 6
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N glycerol 1-phosphate Chemical compound OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 6
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 6
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 2
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 2
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 2
- -1 2-deoxy-D-ribose -5- phosphoric acid Aldehyde Chemical class 0.000 description 1
- 108700016241 Deoxyribose-phosphate aldolases Proteins 0.000 description 1
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 1
- PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose 5-phosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 102000030794 deoxyribose-phosphate aldolase Human genes 0.000 description 1
- 239000002471 hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P9/00—Preparation of organic compounds containing a metal or atom other than H, N, C, O, S or halogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/02—Aldehyde-lyases (4.1.2)
- C12Y401/02004—Deoxyribose-phosphate aldolase (4.1.2.4)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶的制备方法：包括以下步骤：1)取一定量的壳聚糖溶乙酸溶液中，形成胶状溶液，滴加到凝结剂(1mol/L的NaOH)中形成球形颗粒，2)将纯化脱盐后的2‑脱氧‑d‑核糖‑5‑磷酸醛缩酶与1)中制备的壳聚糖载体在室温下水浴中进行固定。采用该壳聚糖固定化醛缩酶为催化剂催化2‑脱氧‑D‑核糖‑5‑磷酸，得到3‑磷酸甘油醛和乙醛，对底物乙醛的耐受性显著提高，同时酶的回收利用操作得到简化。
Description
技术领域
本发明涉及通过固定化提高酶的乙醛耐受性的方法，具体涉及一种高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶的制备方法与应用。
背景技术
2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA,EC 4.1.2.4)属于裂解酶(lyases)的一种，其可以有效地催化供体酮对受体醛的立体选择性加成反应生成C-C键，且反应可逆。由于反应在水溶液、中性pH下进行，无需基团保护，且在催化生成C-C键的同时，可形成两个手性中心，在手性合成方面，尤其是多羟基化合物制备中，比如在制备用于降血脂的他汀类药物中，具有较大的应用前景，因而引起了研究人员的广泛关注。
相比其他生物酶催化剂，DERA能连续形成两个手性中心，减少了反应步骤，尤其在以乙醛作为供体的催化反应中，缩合得到的产物可以作为新的受体底物，继续缩合反应从而生成多个手性中心，用于多羟基化合物的制备，然而在以醛类作为底物的反应中，高浓度的底物乙醛往往导致DERA酶活力降低，甚至使DERA失活，导致催化效率达不到预期目标，这个瓶颈限制了DERA在工业生物催化领域中的应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足和缺陷，提供一种高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶的制备方法与应用。
本发明采用以下技术方案：一种高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶的制备方法，它的步骤如下：
(1)取0.5g天然多糖物质溶于30ml，1wt％-3wt％的乙酸溶液中，静置2.0h，充分溶解，形成胶状溶液，用针形注射器将胶状溶液滴加到凝结剂(1mol/L的NaOH)中形成球形颗粒，注射器的针头距离凝结剂液面5cm，速度40-60滴/分钟，用去离子水洗至中性，干燥备用；
(2)取步骤(1)中制备的固定颗粒0.5g，加入至15,0ml pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中，加入2.0-10.0mg的活化剂，活化10-60min，再加入2.0-8.0ml浓度为0.05wt％戊二醛溶液，交联0.5-2.0h，获得载体；
(3)配置1.0mg/ml的醛缩酶蛋白溶液，加入载体，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:1～1:10，室温下，pH调整至7.0，固定0.5-2.0h，离心后，用去离子水洗涤固定化酶，得到高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶。
进一步地，所述天然多糖物质为壳聚糖(脱乙酰度>98％，分子量1.05×106)。
进一步地，所述活化剂为1-乙基-3-(3-甲基氨基)丙基碳二亚胺(简称EDC)。
进一步地，所述的醛缩酶为来源于Escherichia coli K12AB200068的2‐脱氧‐D‐核糖‐5‐磷酸醛缩酶。
壳聚糖固定化醛缩酶在催化2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，以获得3-磷酸甘油醛和乙醛中的应用。具体为：(4)将10mg固定化醛缩酶在300mM的乙醛浓度下孵育1h-6h，再加入到1.0ml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液中，25℃下反应。所述三乙醇胺盐酸盐溶液pH为7.5，含0.1mmol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0.4mmol的底物2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙酮异构酶，11U/ml甘油磷酸脱氢酶。
本发明将壳聚糖固定化醛缩酶用于催化2-脱氧-D-核糖-5-磷酸得到3-磷酸甘油醛和乙醛，其对底物乙醛的耐受性显著提高，同时简化了酶的回收和重复利用，具有极大的工业应用前景。
具体实施方式
实施例1
(1)取0.5g壳聚糖(脱乙酰度>98％，分子量1.05×106)溶于30ml，1％的乙酸溶液中，静置2h，充分溶解，形成胶状溶液，用针形注射器将胶状溶液滴加到凝结剂(1mol/L的NaOH)中形成球形颗粒，注射器的针头距离凝结剂液面5cm，速度40滴/分钟，用去离子水洗至中性，干燥备用，得到壳聚糖球形颗粒。
(2)取步骤(1)中制备的固定颗粒0.5g，加入至15ml pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中，加入2mg的活化剂EDC，活化10min，再加入2ml戊二醛溶液(浓度为0.05wt％)，交联0.5h，获得载体；
(3)配置1mg/ml的醛缩酶蛋白溶液(醛缩酶为来源于Escherichia coliK12AB200068的2‐脱氧‐D‐核糖‐5‐磷酸醛缩酶)，加入载体，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1：1，室温下，pH调整至7.0，固定0.5h，离心后，用去离子水洗涤固定化酶，得到高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶，用Bradford法检测固定化反应剩余上清液中的蛋白浓度。载体的吸附量为11.9％。
(4)将10mg固定化2‐脱氧‐D‐核糖‐5‐磷酸醛缩酶在300mM的乙醛浓度下孵育1h，再加入到1.0ml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液，三乙醇胺盐酸盐溶液的pH为7.5，含0.1mmol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0.4mmol的底物2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙酮异构酶，11U/ml甘油磷酸脱氢酶，在25℃下反应后检测340nm处吸光度的变化。2‐脱氧‐D‐核糖‐5‐磷酸醛缩酶的比活力为2.27U/mg。
实施例2
(1)取0.5g壳聚糖(脱乙酰度>98％，分子量1.05×106)溶于30ml，3wt％的乙酸溶液中，静置2h，充分溶解，形成胶状溶液，用针形注射器将胶状溶液滴加到凝结剂(1mol/L的NaOH)中形成球形颗粒，注射器的针头距离凝结剂液面5cm，速度60滴/分钟，用去离子水洗至中性，干燥备用，得到壳聚糖球形颗粒。
(2)取步骤(1)中制备的固定颗粒0.5g，加入至15ml pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中，加入10mg的活化剂EDC，活化60min，再加入8ml戊二醛溶液(浓度为0.05％)，交联2h，获得载体；
(3)配置1mg/ml的醛缩酶蛋白溶液(醛缩酶为来源于Escherichia coliK12AB200068的2‐脱氧‐D‐核糖‐5‐磷酸醛缩酶)，加入载体，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:10，室温下，pH调整至7.0，固定2h，离心后，用去离子水洗涤固定化酶，得到高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶，用Bradford法检测固定化反应剩余上清液中的蛋白浓度。载体的吸附量为36.9％。
(4)将10mg固定化醛缩酶在300mM的乙醛浓度下孵育6h，再加入到1.0ml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液，三乙醇胺盐酸盐溶液的pH为7.5，含0.1mmol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0.4mmol的底物2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙酮异构酶，11U/ml甘油磷酸脱氢酶，在25℃下反应后检测340nm处吸光度的变化。2‐脱氧‐D‐核糖‐5‐磷酸醛缩酶的比活力为0.91U/mg。
实施例3
(1)取0.5g壳聚糖(脱乙酰度>98％，分子量1.05×106)溶于30ml，2wt％的乙酸溶液中，静置2h，充分溶解，形成胶状溶液，用针形注射器将胶状溶液滴加到凝结剂(1mol/L的NaOH)中形成球形颗粒，注射器的针头距离凝结剂液面5cm，速度40滴/分钟，用去离子水洗至中性，干燥备用，得到壳聚糖球形颗粒。
(2)取步骤(1)中制备的固定颗粒0.5g，加入至15ml pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中，加入6mg的活化剂EDC，活化30min，再加入5ml戊二醛溶液(浓度为0.05％)，交联1h，获得载体；
(3)配置1mg/ml的醛缩酶蛋白溶液(醛缩酶为来源于Escherichia coliK12AB200068的2‐脱氧‐D‐核糖‐5‐磷酸醛缩酶)，加入载体，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:4，室温下，pH调整至7.0，固定1h，离心后，用去离子水洗涤固定化酶，得到高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶，用Bradford法检测固定化反应剩余上清液中的蛋白浓度。载体的吸附量为41.4％。
(4)将10mg固定化醛缩酶在300mM的乙醛浓度下孵育1h，再加入到1.0ml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液，三乙醇胺盐酸盐溶液的pH为7.5，含0.1mmol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0.4mmol的底物2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙酮异构酶，11U/ml甘油磷酸脱氢酶，在25℃下反应后检测340nm处吸光度的变化。2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶的比活力为3.56U/mg。
实施例4
(1)取0.5g壳聚糖(脱乙酰度>98％，分子量1.05×106)溶于30ml，2wt％的乙酸溶液中，静置2h，充分溶解，形成胶状溶液，用针形注射器将胶状溶液滴加到凝结剂(1mol/L的NaOH)中形成球形颗粒，注射器的针头距离凝结剂液面5cm，速度40滴/分钟，用去离子水洗至中性，干燥备用，得到壳聚糖球形颗粒。
(2)取步骤(1)中制备的固定颗粒0.5g，加入至15ml pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中，加入6mg的活化剂EDC，活化30min，再加入6ml戊二醛溶液(浓度为0.05％)，交联2h，获得载体；
(3)配置1mg/ml的醛缩酶蛋白溶液(醛缩酶为来源于Escherichia coliK12AB200068的2‐脱氧‐D‐核糖‐5‐磷酸醛缩酶)，加入载体，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:6，室温下，pH调整至7.0，固定1h，离心后，用去离子水洗涤固定化酶，得到高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶，用Bradford法检测固定化反应剩余上清液中的蛋白浓度。载体的吸附量为30.4％。
(4)将10mg固定化醛缩酶在300mM的乙醛浓度下孵育12h，再加入到1.0ml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液，三乙醇胺盐酸盐溶液的pH为7.5，含0.1mmol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0.4mmol的底物2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙酮异构酶，11U/ml甘油磷酸脱氢酶，在25℃下反应后检测340nm处吸光度的变化。2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶的比活力为0.35U/mg。
实施例5
(1)取0.5g壳聚糖(脱乙酰度>98％，分子量1.05×106)溶于30ml，3wt％的乙酸溶液中，静置2h，充分溶解，形成胶状溶液，用针形注射器将胶状溶液滴加到凝结剂(1mol/L的NaOH)中形成球形颗粒，注射器的针头距离凝结剂液面5cm，速度50滴/分钟，用去离子水洗至中性，干燥备用，得到壳聚糖球形颗粒。
(2)取步骤(1)中制备的固定颗粒0.5g，加入至15ml pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中，加入6mg的活化剂EDC，活化30min，再加入2ml戊二醛溶液(浓度为0.05％)，交联1h，获得载体；
(3)配置1mg/ml的醛缩酶蛋白溶液(醛缩酶为来源于Escherichia coliK12AB200068的2‐脱氧‐D‐核糖‐5‐磷酸醛缩酶)，加入载体，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:8，室温下，pH调整至7.0，固定1h，离心后，用去离子水洗涤固定化酶，得到高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶，用Bradford法检测固定化反应剩余上清液中的蛋白浓度。载体的吸附量为27.1％。
(4)将10mg固定化醛缩酶在300mM的乙醛浓度下孵育4h，再加入到1.0ml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液，三乙醇胺盐酸盐溶液的pH为7.5，含0.1mmol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0.4mmol的底物2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙酮异构酶，11U/ml甘油磷酸脱氢酶，在25℃下反应后检测340nm处吸光度的变化。2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶的比活力为1.58U/mg。
实施例6
(1)取0.5g壳聚糖(脱乙酰度>98％，分子量1.05×106)溶于30ml，3wt％的乙酸溶液中，静置2h，充分溶解，形成胶状溶液，用针形注射器将胶状溶液滴加到凝结剂(1mol/L的NaOH)中形成球形颗粒，注射器的针头距离凝结剂液面5cm，速度50滴/分钟，用去离子水洗至中性，干燥备用，得到壳聚糖球形颗粒。
(2)取步骤(1)中制备的固定颗粒0.5g，加入至15ml pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中，加入6mg的活化剂EDC，活化30min，再加入2ml戊二醛溶液(浓度为0.05％)，交联1h，获得载体；
(3)配置1mg/ml的醛缩酶蛋白溶液(醛缩酶为来源于Escherichia coliK12AB200068的2‐脱氧‐D‐核糖‐5‐磷酸醛缩酶)，加入载体，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:8，室温下，pH调整至7.0，固定1h，离心后，用去离子水洗涤固定化酶，得到高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶，用Bradford法检测固定化反应剩余上清液中的蛋白浓度。载体的吸附量为18.2％。
(4)将10mg固定化醛缩酶在300mM的乙醛浓度下孵育4h，再加入到1.0ml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液，三乙醇胺盐酸盐溶液的pH为7.5，含0.1mmol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0.4mmol的底物2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙酮异构酶，11U/ml甘油磷酸脱氢酶，在25℃下反应后检测340nm处吸光度的变化。2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶的比活力为1.04U/mg。
实施例7
(1)取0.5g壳聚糖(脱乙酰度>98％，分子量1.05×106)溶于30ml，3wt％的乙酸溶液中，静置2h，充分溶解，形成胶状溶液，用针形注射器将胶状溶液滴加到凝结剂(1mol/L的NaOH)中形成球形颗粒，注射器的针头距离凝结剂液面5cm，速度50滴/分钟，用去离子水洗至中性，干燥备用，得到壳聚糖球形颗粒。
(2)取步骤(1)中制备的固定颗粒0.5g，加入至15ml pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中，加入6mg的活化剂EDC，活化50min，再加入8ml戊二醛溶液(浓度为0.05％)，交联1h，获得载体；
(3)配置1mg/ml的醛缩酶蛋白溶液(醛缩酶为来源于Escherichia coliK12AB200068的2‐脱氧‐D‐核糖‐5‐磷酸醛缩酶)，加入载体，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:5，室温下，pH调整至7.0，固定1h，离心后，用去离子水洗涤固定化酶，得到高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶，用Bradford法检测固定化反应剩余上清液中的蛋白浓度。载体的吸附量为25.1％。
(4)将10mg固定化醛缩酶在300mM的乙醛浓度下孵育6h，再加入到1.0ml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液，三乙醇胺盐酸盐溶液的pH为7.5，含0.1mmol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0.4mmol的底物2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙酮异构酶，11U/ml甘油磷酸脱氢酶，在25℃下反应后检测340nm处吸光度的变化。2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶的比活力为1.27U/mg。
Claims (6)
1.一种高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶的制备方法，其特征在于，它的步骤如下：
(1)取0.5g天然多糖物质溶于30ml，1wt％-3wt％的乙酸溶液中，静置2.0h，充分溶解，形成胶状溶液，用针形注射器将胶状溶液滴加到凝结剂(1mol/L的NaOH)中形成球形颗粒，注射器的针头距离凝结剂液面5cm，速度40-60滴/分钟，用去离子水洗至中性，干燥备用；
(2)取步骤(1)中制备的固定颗粒0.5g，加入至15,0ml pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中，加入2.0-10.0mg的活化剂，活化10-60min，再加入2.0-8.0ml浓度为0.05wt％戊二醛溶液，交联0.5-2.0h，获得载体；
(3)配置1.0mg/ml的醛缩酶蛋白溶液，加入载体，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:1～1:10，室温下，pH调整至7.0，固定0.5-2.0h，离心后，用去离子水洗涤固定化酶，得到高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶。
2.根据权利要求1所述的一种高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶的制备方法，其特征在于，所述的天然多糖物质为壳聚糖(脱乙酰度>98％，分子量1.05×106)。
3.根据权利要求1所述的一种高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶的制备方法，其特征在于，所述的活化剂为1-乙基-3-(3-甲基氨基)丙基碳二亚胺(简称EDC)。
4.根据权利要求1所述的一种高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶的制备方法，其特征在于，所述的醛缩酶为来源于Escherichia coli K12AB200068的2‐脱氧‐D‐核糖‐5‐磷酸醛缩酶。
5.权利要求1所述方法制备得到的壳聚糖固定化醛缩酶在催化2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，以获得3-磷酸甘油醛和乙醛中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，具体为：(4)将10mg固定化醛缩酶在300mM的乙醛浓度下孵育1h-6h，再加入到1.0ml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液中，25℃下反应。所述三乙醇胺盐酸盐溶液pH为7.5，含0.1mmol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0.4mmol的底物2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙酮异构酶，11U/ml甘油磷酸脱氢酶。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810217951.2A CN108410852A (zh) | 2018-03-16 | 2018-03-16 | 一种高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶的制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810217951.2A CN108410852A (zh) | 2018-03-16 | 2018-03-16 | 一种高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶的制备方法与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108410852A true CN108410852A (zh) | 2018-08-17 |
Family
ID=63131687
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810217951.2A Pending CN108410852A (zh) | 2018-03-16 | 2018-03-16 | 一种高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶的制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108410852A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101892218A (zh) * | 2010-06-23 | 2010-11-24 | 杭州师范大学 | 一种醛缩酶的微波辅助固定化方法 |
| CN102212516A (zh) * | 2011-03-26 | 2011-10-12 | 山东大学威海分校 | 壳聚糖微球固定化琼脂糖酶的方法 |
| CN102517276A (zh) * | 2011-12-14 | 2012-06-27 | 浙江大学 | 高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶的制备方法 |
-
2018
- 2018-03-16 CN CN201810217951.2A patent/CN108410852A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101892218A (zh) * | 2010-06-23 | 2010-11-24 | 杭州师范大学 | 一种醛缩酶的微波辅助固定化方法 |
| CN102212516A (zh) * | 2011-03-26 | 2011-10-12 | 山东大学威海分校 | 壳聚糖微球固定化琼脂糖酶的方法 |
| CN102517276A (zh) * | 2011-12-14 | 2012-06-27 | 浙江大学 | 高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶的制备方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| FABIANA SUBRIZI等: "Versatile and Efficient Immobilization of 2-Deoxyribose-5-phosphate Aldolase (DERA) on Multiwalled Carbon Nanotubes", 《ACS CATAL.》 * |
| HUI FEI等: "Improvement of the thermal stability and aldehyde tolerance of deoxyriboaldolase via immobilization on nano-magnet material", 《JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS B: ENZYMATIC》 * |
| TAKAYUKI Y. NARAA等: "Improvement of aldehyde tolerance and sequential aldol condensation activity of deoxyriboaldolase via immobilization on interparticle pore type mesoporous silica", 《JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS B: ENZYMATIC》 * |
| 徐璐琳: "2-脱氧-D-核糖-5磷酸醛缩酶的固定化制备工艺研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 * |
| 胡文静等: "改性壳聚糖固定化脂肪酶的研究", 《生物工程学报》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chen et al. | The effect of glutaraldehyde cross-linking on the enzyme activity of immobilized β-galactosidase on chitosan bead | |
| Mayer et al. | Continuous production of lactulose by immobilized thermostable β-glycosidase from Pyrococcus furiosus | |
| Danial et al. | Characteristics of immobilized urease on grafted alginate bead systems | |
| Vaillant et al. | Co-immobilized pectinlyase and endocellulase on chitin and nylon supports | |
| Arica et al. | Immobilization of glucoamylase onto activated pHEMA/EGDMA microspheres: properties and application to a packed-bed reactor | |
| CN108384767A (zh) | 转氨酶突变体及其应用 | |
| CN106520747A (zh) | 一种新型固定化酶制剂及其制备方法与应用 | |
| CN104988132A (zh) | 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法 | |
| Milosavić et al. | Immobilization of glucoamylase via its carbohydrate moiety on macroporous poly (GMA-co-EGDMA) | |
| CN104988133A (zh) | 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法 | |
| CN105063010A (zh) | 一种聚乙烯亚胺金属配位固定化的多酶体系及其制备方法 | |
| CN112980827A (zh) | 一种金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法和应用 | |
| CN107287183A (zh) | 一种以石墨烯/氧化钛复合多孔微球为载体的固定化α‑淀粉酶的制备方法 | |
| CN102517351B (zh) | 一种双固定化多酶体系生产l-2-氨基丁酸的方法 | |
| CN102453707A (zh) | 一种固定化纤维素酶的制备方法 | |
| CN106400466A (zh) | 一种碳纤维改性方法制备固定化载体材料 | |
| CN108410852A (zh) | 一种高乙醛耐受性的壳聚糖固定化醛缩酶的制备方法与应用 | |
| Jin et al. | Immobilization of recombinant Escherichia coli cells expressing glucose isomerase using modified diatomite as a carrier for effective production of high fructose corn syrup in packed bed reactor | |
| JP3117092B2 (ja) | セファロスポリン誘導体をグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体に連続転化する方法 | |
| Su et al. | Cellulase immobilization properties and their catalytic effect on cellulose hydrolysis in ionic liquid | |
| CN102517276A (zh) | 高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶的制备方法 | |
| Shousha | Novel application of Luffa cylindrica in production of fructose | |
| JPS5974984A (ja) | 固定化酵素もしくは固定化微生物の製造方法 | |
| Bankar et al. | Co-immobilization of glucose oxidase-catalase: optimization of immobilization parameters to improve the immobilization yield | |
| JP3042691B2 (ja) | 生物触媒及びその製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180817 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |