CN102329764A - 一种重组耐热醛缩酶基因工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种耐热醛缩酶的基因工程菌株及其构建方法,并优化其高密度培养生产方法,所述重组耐热醛缩酶基因工程菌,由如下方法获得:构建含有醛缩酶基因(Dera)序列的重组质粒,将重组质粒转化至宿主细胞中,筛选阳性克隆,获得重组耐热醛缩酶基因工程菌;采用本发明方法,可提高酶蛋白的生产速率,降低其生产成本,为耐热醛缩酶的工业化生产提供了基础。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种重组耐热醛缩酶基因工程菌,及其在发酵制备耐热醛缩酶中的应用。
(二)背景技术
醇醛缩合反应(Aldol condensations)可以形成新的C-C化学键,增长碳链,是一类重要的有机合成反应。在有机合成中,此反应需要低温诱导(-70℃),且需要大量的有机溶剂参与,对环境和安全造成潜在的危害。生物酶催化的不对称醇醛缩合反应可以在中性pH值和室温条件下进行,其替代有机反应的应用越来越得到研究者的关注。醛缩酶(Aldolase)作为该反应的关键酶,可以小分子化合物为底物,不对称合成复杂的大分子。同时,生物酶具有高度区域选择的特性,能够容易避开对碳水化合物中的活泼的羟基的保护,更为突出的特性是在催化C-C键合成的同时醛缩酶可以引入新的手性中心。醛缩酶是生物代谢途径中关键酶,其中一类醛缩酶(DERA),可以乙醛为底物,连续催化醇醛缩合反应。此醛缩酶可以用于2,4,6-三脱氧己糖化合物的合成,该化合物是多种他汀类药物合成的关键中间体。醛缩酶催化的缩合反应具有很强的绿色属性,对传统化学工艺的绿色化学改造有着重要意义,具有广阔的应用前景。
目前,生物酶催化工艺的应用得到全世界政府和研究者的普遍关注,但是现阶段缺乏高效的商品生物酶制剂限制了该工业的发展。这种状况主要体现在两方面:高效的生物酶和经济可行的酶制剂生产工艺。另外,生物酶在有机催化反应中最突出的缺点是其稳定性较差,即对有机溶剂的耐受性较低,易变性失活。研究工作已证明,大量来源于嗜热微生物的生物酶蛋白显示出较高的热稳定性,对有机溶剂具有较高的耐受力。大肠杆菌(E.coli)是目前最常用的宿主细胞,大量的生物蛋白质已通过基因工程手段在其细胞内得到异源过量表达。由于大肠杆菌的生理特性,大部分重组蛋白总是在其细胞质或周质间合成,其总生产速率与菌体密度密切相关。因此,高细胞密度培养技术有利于提高目的蛋白的表达量和生产速率,已在重组蛋白的生产工艺中得到广泛应用。
目前,国外已有关于不同醛缩酶基因的发现,以及在药物合成中应用的报道。美国科学家Wong C.H.等人主要集中于醛缩酶(DERA)的研究,包括基因序列、蛋白质定向进化等方面,还未涉及到来源于嗜热微生物醛缩酶(DERA)的研究。在国内,还没有关于耐热醛缩酶(DERA)的研究报道,只有极少数研究者或机构进行其它醛缩酶的研究。另外,中国专利检索目录关于各种醛缩酶的研究,申请者几乎全是国外研究机构。因此,利用我国丰富的环境资源自主开发新型的耐热醛缩酶具有重要的意义。
(三)发明内容
本发明的目的是构建一种耐热醛缩酶的基因工程菌株,并优化其高密度培养生产方法,提高酶蛋白的生产速率,降低其生产成本。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是:
一种重组耐热醛缩酶基因工程菌,由如下方法获得:构建含有醛缩酶基因(Dera)序列的重组质粒,将重组质粒转化至宿主细胞中,筛选阳性克隆,获得重组耐热醛缩酶基因工程菌。
具体的,所述醛缩酶基因(Dera)序列如下:
ATGTCCGAAAGCTTCTTCTGTCGCTTCGGCGTGTCTGAAATCGCGTCCCGTATCGACCACGCCGTTCTGAAACCGTGGAGCTCCGTTTCTGAACTGGAAAAAGCAATCCGTGAGCTGGAGGAACTGAACCTGCGTTGCCTGATCATCAGCCCAACTCATCTGCGTCTGGCTCGCGAAAAAACTAATAAATGTCTGGGCGTTGTGGTAGGTTTCCCATTTGGTTATTCTACTATCGAGGCGAAAATCAAGGAACTGGAAGATTCTATCGCACTGGGTGCTCAGGAAATCGACTACGTGGCCAACACTCAGCTGCTGCTGGCAGGCCGTACCGAAGAATACCTGAACGAAATTCGCGCTGCGATCACCATTTGCCGTGACTCCGGCGTTAAATGCAAGGTAATCATTGAGGCTCCGGCGCTGCCGCGTAACCTGCTGGTTGAAATCGTAGAGAAAATTGCAATGATGGATCCGCACCCAGATTACATTAAAACCAGCACCGGTTACGGTCCGCGTCCGACCTATGTTGAGGATGTTTACCTGATCGATCAAACCCTGCGTCGTATCGGCAAGCGCGACGAAATCGGTATCAAAGCGGCTGGTGGCATTCGCGAAGGCCTGCAGGCAGCTGCGATGCTGCTGGCGGGTGCCGACGTTATCGGTACCTCTACCCCGCGCCAGGTGATTGAAACCTATAAAGAACTGTGCCGTATTTAA。
具体的,所述基因工程菌由如下方法获得:对醛缩酶基因(Dera)进行修饰(添加双限制性酶切位点),获得带有双限制性酶切位点的目的序列,将该目的序列连接到表达载体中,获得重组质粒,将重组质粒转化至宿主细胞中,筛选阳性克隆,获得重组耐热醛缩酶基因工程菌;所述目的序列如下,下划线部分为酶切位点(XbaI和XhoI):
TCTAGAATGTCCGAAAGCTTCTTCTGTCGCTTCGGCGTGTCTGAAATCGCGTCCCGTATCGACCACGCCGTTCTGAAACCGTGGAGCTCCGTTTCTGAACTGGAAAAAGCAATCCGTGAGCTGGAGGAACTGAACCTGCGTTGCCTGATCATCAGCCCAACTCATCTGCGTCTGGCTCGCGAAAAAACTAATAAATGTCTGGGCGTTGTGGTAGGTTTCCCATTTGGTTATTCTACTATCGAGGCGAAAATCAAGGAACTGGAAGATTCTATCGCACTGGGTGCTCAGGAAATCGACTACGTGGCCAACACTCAGCTGCTGCTGGCAGGCCGTACCGAAGAATACCTGAACGAAATTCGCGCTGCGATCACCATTTGCCGTGACTCCGGCGTTAAATGCAAGGTAATCATTGAGGCTCCGGCGCTGCCGCGTAACCTGCTGGTTGAAATCGTAGAGAAAATTGCAATGATGGATCCGCACCCAGATTACATTAAAACCAGCACCGGTTACGGTCCGCGTCCGACCTATGTTGAGGATGTTTACCTGATCGATCAAACCCTGCGTCGTATCGGCAAGCGCGACGAAATCGGTATCAAAGCGGCTGGTGGCATTCGCGAAGGCCTGCAGGCAGCTGCGATGCTGCTGGCGGGTGCCGACGTTATCGGTACCTCTACCCCGCGCCAGGTGATTGAAACCTATAAAGAACTGTGCCGTTTTAACTCGAG。
优选的,所述表达载体为pET303/CT-His,所述宿主细胞为感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
本发明还涉及所述的基因工程菌在发酵制备耐热醛缩酶中的应用。
具体的,所述应用为:将所述基因工程菌接种至发酵培养基,在37~45℃、pH7.0~8.0、溶氧≥30%、摇床转速200rpm~1000rpm(其依据培养过程的溶解氧水平自动调节,获得高细胞密度的培养菌液)条件下进行发酵培养10~26h,获得所述耐热醛缩酶。
本发明中,耐热醛缩酶的表达由T7启动子控制,需添加诱导剂进行诱导。所述发酵培养过程中可添加IPTG或乳糖作为诱导剂,添加量为:IPTG 10~100μmol/g菌体干重,乳糖0.2~10g/g菌体干重。当微生物生长到对数生长期的中期时,一次性添加诱导剂IPTG,其添加标准为10~100μmol/g菌体干重。更进一步,为了降低嗜热醛缩酶制剂规模化制备的生产成本,可用乳糖替代IPTG作为诱导剂。乳糖与补料培养基混合,随补料过程添加,其添加标准为0.2~1.0g/g菌体干重(以预测最终的菌体干重为基准进行计算)。
本发明的发酵培养基选择国内一种工业副产物——酵母抽提物作为氮源,并通过Plackett-Burman设计和相应面方法进行组分的选择和优化。这种培养基成本较低,有利于规模化制备的工业应用。所述发酵培养基终浓度组成如下:葡萄糖(Glucose)20.0~60.0g/L,酵母抽提物(Yeast extract)15.0~40.0g/L,K2HPO4 5.0~20.0g/L,KH2PO43.0~15.0g/L,MgSO4·7H2O1.0~4.0g/L,EDTA-Na2 0.01~0.1g/L,氨苄青霉素(Ampicillin)0.1~2.0mM,痕量盐溶液(Trace element solution)2.0~10.0mL/L,溶剂为水;所述痕量盐溶液组成如下:CoCl2·6H2O1.3g/L,MnCl2·4H2O6.2g/L,CuC12·2H2O0.6g/L,H3BO31.2g/L,Na2MoO4·2H2O1.1g/L,Zn(II)acetate·2H2O5.2g/L,Fe(III)citrate40.2g/L,溶剂为水。
所述发酵工艺采用分批补料方式,于发酵过程中添加补料培养基,补料速度依据公式(1)计算:
其中:
F为连续补料速度(L/h);
μset为细胞比生长速率(h-1)
X0为补料时的细胞浓度(g DCW/L)
V0为补料时的培养物体积(L)
Sf为补料液中葡萄糖浓度(g/L)
YX/S为细胞得率(g DCW/g,即消耗1g葡萄糖生成细胞的克数)
随着培养过程的进行,菌体浓度不断增加,当补料阶段大约进行12~18h时,菌体密度OD600达到110以上。
所述补料培养基终浓度组成如下:
葡萄糖(Glucose)200~600g/L,MgSO4·7H2O 10.0~20.0g/L,酵母抽提物(Yeast extract)10.0~100g/L,氨苄青霉素(Ampicillin)0.1~2.0mM,痕量盐溶液(Trace element solution)20~100mL/L,溶剂为水;所述痕量盐溶液组成如下:CoCl2·6H2O1.3g/L,MnCl2·4H2O6.2g/L,CuC12·2H2O0.6g/L,H3BO3 1.2g/L,Na2MoO4·2H2O 1.1g/L,Zn(II)acetate·2H2O5.2g/L,Fe(III)citrate40.2g/L,溶剂为水。
本发明中,采用分批-补料方式进行大肠杆菌的高细胞密度培养,实现耐热醛缩酶的过量表达。该补料方式采用对数式补料策略,在本发明中,采用梯度式补料模拟连续式补料。在高密度培养过程中,当分批培养阶段结束时,菌体密度OD600达到28左右,补料培养基开始控制添加。
所述发酵培养8~10h后,添加补料培养基,继续培养4~6h后,添加诱导剂IPTG或乳糖,添加量为:IPTG 10~100μmol/g菌体干重,乳糖0.2~10g/g菌体干重。
本发明实现了重组耐热醛缩酶在E.coli细胞中的高效表达,目的蛋白的表达水平占菌体总蛋白的45%以上,蛋白浓度和容积产率分别达到了5.01g/L和0.25g/L/h。
本发明中,培养过程中乙酸的检测采用气相色谱(GC)法:气相色谱仪(Shimadzu,Japan),FID检测器和Thermon300色谱柱。样品需要进行预处理:离心所得的上清液经过20~50%硫酸的酸化,再用乙醚抽提,吸取乙醚上层液体作为气相色谱的待检样品。
本发明中,菌体总蛋白含量采用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定:首先,需配置不同浓度的牛血清蛋白,检测595nm下的吸光度,绘制标准曲线;然后,依据标准曲线方程,由测定OD595值计算样品的蛋白浓度。而耐热醛缩酶的表达量需结合目的蛋白表达水平计算得到。
本发明的有益效果主要体现在:提供了一种耐热醛缩酶的基因工程菌株及其构建方法,并优化其高密度培养生产方法,提高酶蛋白的生产速率,降低其生产成本,为耐热醛缩酶的工业化生产提供了基础。
(四)附图说明
图1为表达载体pET303-DERA008的构建示意图;
图2为重组菌株BL21(pET303-DERA008)酶蛋白表达电泳图;
1:Markers;2:BL21(DE3)原始菌株;3:BL21(pET303-DERA008)未诱导;4:BL21(pET303-DERA008)IPTG诱导;5:诱导表达后总上清蛋白;6:Ni-柱纯化后的目的蛋白DERA;
图3为实施例1发酵的时间过程曲线图;
图4为实施例2发酵的时间过程曲线图;
图5为实施例3发酵的时间过程曲线图;
图6为实施例6乙酸检测气相色谱图;
A:溶剂;B:乙酸标准品;C:样品(乙酸的保留时间约为7.0min)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1:重组菌株pET303-DERA008的构建和鉴定
将质粒载体pET303/CT-His(InvitrogenTM)经XbaI和XhoI双酶切,与醛缩酶(DERA_8)基因合成片段(SEQ ID No.2,由上海生工合成)混合,用T4DNA连接酶16℃连接过夜,得到质粒重组质粒pET303-DERA008(如示意图1)。然后,将重组质粒转化入感受态E.coliBL21(DE3)中。再将转化后的菌液涂布于含氨苄青霉素(Ampicillin)的LB平板上,经37℃静止培养,挑取单菌落,验证工程菌种酶蛋白的表达情况(图2)。从图2中可以看出,所构建的基因工程菌株pET303-DERA008在IPTG的诱导下可以表达活性耐热醛缩酶,并由Ni-亲和柱一步实现目的蛋白的纯化。
实施例2:耐热醛缩酶的分批发酵培养
发酵培养基(半合成培养基):葡萄糖(Glucose)20g/L,酵母抽提物(Yeast extract,微生物培养基专用,中国西王)30g/L,K2HPO4 15g/L,KH2PO4 10g/L,MgSO4·7H2O 2.63g/L,EDTA-Na20.018g/L,氨苄青霉素(Ampicillin)1.0mM,痕量盐溶液(Trace element solution)2.5mL/L,溶剂为水;
所述痕量盐溶液组成如下:CoCl2·6H2O 1.3g/L,MnCl2·4H2O 6.2g/L,CuC12·2H2O 0.6g/L,H3BO31.2g/L,Na2MoO4·2H2O 1.1g/L,Zn(II)acetate(醋酸锌)·2H2O 5.2g/L,Fe(III)citrate(柠檬酸铁)40.2g/L,溶剂为水。
生物反应器:BIOENGINEERING L1523bioreactor(比欧,瑞士)。
接种物培养:接种物采用二级培养模式,挑取选择培养基上生长的单克隆于15mL LB培养基中,37℃,180rpm摇床培养12h;然后,将培养菌液接种于250mL半合成培养基中,37℃,180rpm摇床培养,当OD600达到1.5以上,此培养物作为发酵实验的接种物。
分批培养过程:接菌体积为5%,发酵温度为37℃,发酵系统控制自动添加25%的氨水维持pH值7.0,溶解氧水平≥30%,溶解氧水平由通气速率、搅拌速度和容器压力联合控制调解。经4h培养后,OD600≥3.0,添加2mmol IPTG进行诱导表达。分批培养结束时,葡萄糖消耗完全,总发酵周期为11h,菌体密度OD600≥26,目的蛋白的最大表达水平为34%,最终的酶蛋白浓度和总容积生产速率分别达到0.47g/L和0.043g/L/h(如图3)。
实施例3:耐热醛缩酶的分批-补料发酵培养
发酵培养基:同实施例2。
补料培养基:葡萄糖(Glucose)600g/L,MgSO4·7H2O 15.2g/L,酵母抽提物(Yeast extract)30g/L,氨苄青霉素(Ampicillin)1.0mM,痕量盐溶液(Trace element solution)76.2mL/L,溶剂为水;
所述痕量盐溶液组成如下:CoCl2·6H2O 1.3g/L,MnCl2·4H2O 6.2g/L,CuC12·2H2O 0.6g/L,H3BO31.2g/L,Na2MoO4·2H2O 1.1g/L,Zn(II)acetate·2H2O 5.2g/L,Fe(III)citrate 40.2g/L,溶剂为水。。
生物反应器:BIOENGINEERING L1523bioreactor(比欧,瑞士)。
接种物培养:如实施例2。
分批-补料培养过程:接菌体积为5%,发酵温度为37℃,发酵系统控制自动添加25%的氨水维持pH值7.0,溶解氧水平≥30%,溶解氧水平由通气速率、搅拌速度和容器压力联合控制调解。经8h培养后,分批培养结束,OD600达到28左右。此时,葡萄糖消耗完全,过程以pH值不断上升和溶氧突然升高的现象作为分批培养阶段结束的重要标志。然后,开始进入补料培养阶段,控制比生长速率(μset)为0.15h-1,补料速率依据公式(1)计算,由调速泵自动控制完成。补料培养进行4h时,菌体密度OD600为约为60,添加19mmol IPTG,其标准依据61.7μmol/g菌体干重(预计发酵结束时菌体密度OD600大约为120)。总发酵周期为22h,最终菌体密度OD600≥110,目的蛋白的表达水平维持在45%以上,最终的酶蛋白浓度和总容积生产速率分别为5.0g/L和0.25g/L/h(如图4)。
实施例4:乳糖诱导的醛缩酶分批-补料发酵培养
发酵培养基:同实施例2。
补料培养基:同实施例3。
生物反应器:BIOENGINEERING L1523bioreactor(比欧,瑞士)。
接种物培养:如实施例2。
培养过程:接菌体积为5%,发酵温度37℃,发酵系统控制自动添加25%的氨水控制pH值7.0,溶解氧浓度≥30%,溶解氧浓度由通气速率、搅拌速度和容器压力联合控制调解。经8h培养后,OD600达到28左右,分批培养结束。此时,葡萄糖消耗完全,pH值不断上升和溶氧突然升高作为分批培养阶段的重要标志。然后,开始进入补料培养阶段,控制比生长速率(μset)为0.15h-1,补料速率依据公式(1)计算,由蠕动泵自动控制完成。在补料液中,添加50g/L乳糖作为诱导剂,连续诱导目的蛋白的表达。总发酵周期为20~26h,最终实际菌体密度OD600≥110,目的蛋白的表达水平维持在30%以上,最终的酶蛋白浓度和总容积生产速率分别为4.0g/L和0.17g/L/h(如图5)。
实施例5:醛缩酶含量的确定
发酵过程中,定时从培养体系中取样品15~20mL,8000rpm离心5min,4℃冰箱中保存上清液,沉淀用15mL的0.9%NaCl缓冲液洗涤一次,然后重悬于15mL的0.9%NaCl缓冲液中。发酵后期样品,需经适当稀释,调整OD600在10左右。菌体细胞采用超声破碎方法,破碎条件为:6sec/6sec,总时间为2~4min。可溶性的蛋白浓度采用考马斯亮蓝法检测:首先,配置不同浓度的牛血清蛋白,检测595nm下的吸光值,绘制标准曲线;然后,依据标准曲线方程,由样品的OD595测定值计算其蛋白浓度。
同时,分别取500μL样品,离心,SDS-PAGE电泳分析,浓度为15%,采用凝胶成像系统分析目的蛋白在宿主细胞中的表达情况,以其占总蛋白的比例表示其表达水平。醛缩酶的表达量由总蛋白浓度与表达水平相乘计算得到。实验结果证明了该方法可以对发酵过程中活性DERA量进行定量。
实施例6:乙酸含量的检测
在实施例5中,样品处理后获得的上清液用于检测乙酸的含量。乙酸含量的检测采用气相色谱法(GC):气相色谱仪(Shimadzu,Japan),FID检测器,Thermon 300色谱柱;注射器和色谱柱温度分别为180和100℃;氮气作为载气,其流速为1.0mL/min;FID检测器的温度为200℃;乙酸峰的保留时间为6.7min。气相色谱图如图6所示。
首先,配制不同浓度的乙酸标准样品,GC检测积分得到峰面积,根据面积绘制标准曲线。然后,检测和计算样品中的乙酸浓度。样品需要预处理:20~50%硫酸进行酸化,等体积乙醚萃取。实验结果证明了该方法可以用于发酵过程中乙酸的检测。
Claims (10)
1.一种重组耐热醛缩酶基因工程菌,由如下方法获得:构建含有醛缩酶基因(Dera)序列的重组质粒,将重组质粒转化至宿主细胞中,筛选阳性克隆,获得重组耐热醛缩酶基因工程菌。
2.如权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于所述醛缩酶基因(Dera)序列如下:
ATGTCCGAAAGCTTCTTCTGTCGCTTCGGCGTGTCTGAAATCGCGTCCCGTATCGACCAC
GCCGTTCTGAAACCGTGGAGCTCCGTTTCTGAACTGGAAAAAGCAATCCGTGAGCTGGA
GGAACTGAACCTGCGTTGCCTGATCATCAGCCCAACTCATCTGCGTCTGGCTCGCGAAAA
AACTAATAAATGTCTGGGCGTTGTGGTAGGTTTCCCATTTGGTTATTCTACTATCGAGGCG
AAAATCAAGGAACTGGAAGATTCTATCGCACTGGGTGCTCAGGAAATCGACTACGTGGC
CAACACTCAGCTGCTGCTGGCAGGCCGTACCGAAGAATACCTGAACGAAATTCGCGCTG
CGATCACCATTTGCCGTGACTCCGGCGTTAAATGCAAGGTAATCATTGAGGCTCCGGCGC
TGCCGCGTAACCTGCTGGTTGAAATCGTAGAGAAAATTGCAATGATGGATCCGCACCCAG
ATTACATTAAAACCAGCACCGGTTACGGTCCGCGTCCGACCTATGTTGAGGATGTTTACCT
GATCGATCAAACCCTGCGTCGTATCGGCAAGCGCGACGAAATCGGTATCAAAGCGGCTGG
TGGCATTCGCGAAGGCCTGCAGGCAGCTGCGATGCTGCTGGCGGGTGCCGACGTACG
GTACCTCTACCCCGCGCCAGGTGATTGAAACCTATAAAGAACTGTGCCGTATTTAA。
3.如权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于所述基因工程菌由如下方法获得:对醛缩酶基因(Dera)进行修饰,获得带有双限制性酶切位点的目的序列,将该目的序列连接到表达载体中,获得重组质粒,将重组质粒转化至宿主细胞中,筛选阳性克隆,获得重组耐热醛缩酶基因工程菌;所述目的序列如下,下划线部分为酶切位点:
TCTAGAATGTCCGAAAGCTTCTTCTGTCGCTTCGGCGTGTCTGAAATCGCGTCCCGTATCG
ACCACGCCGTTCTGAAACCGTGGAGCTCCGTTTCTGAACTGGAAAAAGCAATCCGTGAG
CTGGAGGAACTGAACCTGCGTTGCCTGATCATCAGCCCAACTCATCTGCGTCTGGCTCGC
GAAAAAACTAATAAATGTCTGGGCGTTGTGGTAGGTTTCCCATTTGGTTATTCTACTATCG
AGGCGAAAATCAAGGAACTGGAAGATTCTATCGCACTGGGTGCTCAGGAAATCGACTAC
GTGGCCAACACTCAGCTGCTGCTGGCAGGCCGTACCGAAGAATACCTGAACGAAATTCG
CGCTGCGATCACCATTTGCCGTGACTCCGGCGTTAAATGCAAGGTAATCATTGAGGCTCC
GGCGCTGCCGCGTAACCTGCTGGTTGAAATCGTAGAGAAAATTGCAATGATGGATCCGCA
CCCAGATTACATTAAAACCAGCACCGGTTACGGTCCGCGTCCGACCTATGTTGAGGATGT
TTACCTGATCGATCAAACCCTGCGTCGTATCGGCAAGCGCGACGAAATCGGTATCAAAGC
GGCTGGTGGCATTCGCGAAGGCCTGCAGGCAGCTGCGATGCTGCTGGCGGGTGCCGACG
TTATCGGTACCTCTACCCCGCGCCAGGTGATTGAAACCTATAAAGAACTGTGCCGTATTTA
ACTCGAG。
4.如权利要求3所述的基因工程菌,其特征在于所述表达载体为pET303/CT-His,所述宿主细胞为感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
5.如权利要求1~4之一所述的基因工程菌在发酵制备耐热醛缩酶中的应用。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述应用为:将所述基因工程菌接种至发酵培养基中,在37~45℃、pH7.0~8.0、溶氧≥30%、转速200rpm~1000rpm条件下进行发酵培养10~26h,获得所述耐热醛缩酶。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述发酵培养过程中添加IPTG或乳糖作为诱导剂,添加量为:IPTG 10~100μmol/g菌体干重,乳糖0.2~10g/g菌体干重。
8.如权利要求6或7所述的应用,其特征在于所述发酵培养基终浓度组成如下:葡萄糖20.0~60.0g/L,酵母抽提物15.0~40.0g/L,K2HPO45.0~20.0g/L,KH2PO43.0~15.0g/L,MgSO4·7H2O 1.0~4.0g/L,EDTA-Na20.01~0.1g/L,氨苄青霉素0.1~2.0mM,痕量盐溶液2.0~10.0mL/L,溶剂为水;所述痕量盐溶液组成如下:CoCl2·6H2O 1.3g/L,MnCl2·4H2O 6.2g/L,CuC12·2H2O 0.6g/L,H3BO31.2g/L,Na2MoO4·2H2O 1.1g/L,Zn(II)acetate·2H2O 5.2g/L,Fe(III)citrate 40.2g/L,溶剂为水。
9.如权利要求6或7所述的应用,其特征在于所述发酵采用分批补料方式,于发酵过程中添加补料培养基,补料速度依据公式(1)计算:
其中:
F为连续补料速度,L/h;
μset为细胞比生长速率,h-1;
X0为补料时的细胞浓度,g DCW/L;
V0为补料时的培养物体积,L;
Sf为补料液中葡萄糖浓度,g/L;
YX/S为细胞得率,g DCW/g;
所述补料培养基终浓度组成如下:
葡萄糖200~600g/L,MgSO4·7H2O 10.0~20.0g/L,酵母抽提物10.0~100g/L,氨苄青霉素0.1~2.0mM,痕量盐溶液20~100mL/L,溶剂为水;所述痕量盐溶液组成如下:CoCl2·6H2O 1.3g/L,MnCl2·4H2O 6.2g/L,CuC12·2H2O 0.6g/L,H3BO31.2g/L,Na2MoO4·2H2O 1.1g/L,Zn(II)acetate·2H2O 5.2g/L,Fe(III)citrate 40.2g/L,溶剂为水。
10.如权利要求9所述的应用,其特征在于所述发酵培养8~10h后,添加补料培养基,继续培养4~6h后,添加诱导剂IPTG或乳糖,添加量为:IPTG 10~100μmol/g菌体干重,乳糖0.2~10g/g菌体干重。
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