CN113801903B - 一种西他列汀中间体的生物合成方法 - Google Patents

一种西他列汀中间体的生物合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种西他列汀中间体的生物合成方法，属于药物中间体合成技术领域。为了解决现有的不易处理和污染大的问题，提供一种西他列汀中间体的生物合成方法，包括在无机碱存在下，在非水溶性溶剂中使式Ⅱ化合物4‑(2,4,5‑三氟苯基)‑5‑氧代丁酸与式Ⅲ化合物3‑(三氟甲基)‑5,6,7,8‑四氢‑[1,2,4]三唑并[4,3‑a]吡嗪或其盐酸盐在催化量的酰胺合酶(蛋白序列如SEQ ID NO.1的催化作用下进行酶催化反应，得到产物式Ⅰ化合物西他列汀中间体。本发明具有产物的转化率高，且高产物收率。

Description

一种西他列汀中间体的生物合成方法
技术领域
本发明涉及一种西他列汀中间体的生物合成方法，属于药物中间体合成技术领域。
背景技术
西他列汀，分子式为C16H15F6N5O,CAS号为4486460-32-6,是默沙东公司研制的第一个用于治疗Ⅱ型糖尿病的二肽基肽酶(DPP-IV)抑制剂，它通过提高糖尿病患者自身胰岛β细胞产生的胰岛素的能力，在血糖升高时增加胰岛的分泌，从而控制糖尿病患者的血糖水平，且耐受性好、不增加体重，也不会出现低血糖的风险。随着人民生活水平的提高和人口老龄化速度的加快，全球糖尿病患者正在以非常惊人的速度增加，对糖尿病的治疗具有很大的意义，尤其是当前市场上占有巨大份额的II型糖尿病治疗的药物。
在西他列汀的合成路线中中间体(2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮是关键的西他列汀中间体的合成。如现有的有公开的通过烯胺中间体经过不对称还原得到西他列汀，其合成的关键在于烯胺中间体的不对称氢化还原，由于反应过程中所用到的金属铑、二茂铁基双磷配体的价格都十分昂贵，且后续不易处理，不利于环境保护，不适合工业化的放大生产。
发明内容
本发明针对以上现有技术中存在的缺陷，提供一种西他列汀中间体的生物合成方法，解决的问题是如何提供一种新的绿色工艺，且具有较高的产物收率。
本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的，一种西他列汀中间体的生物合成方法，该方法包括以下步骤：
在无机碱存在下，在非水溶性溶剂中使式Ⅱ化合物4-(2,4,5-三氟苯基)-5-氧代丁酸与式Ⅲ化合物3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪或其盐酸盐在催化量的酰胺合酶的催化作用下进行酶催化反应，得到产物式Ⅰ化合物西他列汀中间体：
所述酰胺合酶的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。
通过采用酶法并在特定的酰胺合酶的作用下，能够使式Ⅱ化合物中的羧基与式Ⅲ化合物中的亚氨基进行键合有效的形成酰胺化结构，产物的转化率高，具有高产物收率的效果，且在非水溶性溶剂中，也能够有效的使原料充分参与反应，反应条件温和，能够更好的避免副反应的产生，进一步的保证产物的纯度质量；同时，由于采用酶法生物合成，只需要在反应结束后，进行过滤，不会造成严重的环境污染，具有对环境友好的优点，更有利于工业化生产。
在上述西他列汀中间体的生物合成方法中，作为优选，所述酰胺合酶的加入量为80g/L～100g/L。相当于是反应体系中每升含有80g～100g的酰胺合酶。目的使更有效的催化活化反应，促进反应向正反应进行，提高反应的效率和产物的收率质量，同时，又能够减少酰胺合酶的浪费，有利于更好的控制生产成本。这里的酰胺合酶可以是以大肠杆菌为载体的工程菌，如商业可购买到的大肠杆菌(DE3)；或将工程菌进行破壁处理后形成含有酰胺合酶的菌泥用于反应的酶催化物质。这里的酰胺合酶可以是以菌体、菌体破壁后的菌液、菌泥或将酰胺合酶进行固定化均可。对于上述工程菌的构建按照常规的重组工程菌的方式即可。
在上述西他列汀中间体的生物合成方法中，作为优选，所述酶催化反应的温度为35℃～45℃。通过采用本发明的特定酰胺合酶进行酶催化反应，能够使反应在较低的温度下进行温和的反应，避免温度过高而产生其它不必要的副产物，更进一步的保证产物的纯度。
在上述西他列汀中间体的生物合成方法中，作为优选，所述酶催化反应的过程中控制反应体系的pH值为8.0～8.5。有利于更好的保证酰胺合酶的活性，更有利于促进反应进行，提高反应的转化效率。对于反应体系的pH值的控制还可以在加入无机碱的同时，加入Tris-HCl缓冲液，使反应能够很好的保持体系的pH值所需的范围内，保证反应稳定均匀的性能，且加入缓冲液后能使反应体系中存在水和非水溶性溶剂形成的两相体系，而产物在有机相内，反应过程中的无机盐形成的水相中，更有利于除去，更好的提高产物的纯度质量。对于Tris-HCl缓冲液的pH值在7.5～7.8范围内均可，最好是使其pH值为7.6。
在上述西他列汀中间体的生物合成方法中，作为优选，所述无机碱选自氢氧化钠或氢氧化钾。使反应在碱性条件下，能够促进反应的进行，提高产物的收率和纯度质量的效果。
在上述西他列汀中间体的生物合成方法中，作为优选，所述非水溶性溶剂选自乙酸乙酯、二甲基叔丁基醚、二氯甲烷和氯仿中的一种或几种。
在上述西他列汀中间体的生物合成方法中，作为优选，所述式Ⅲ化合物3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并
[4,3-a]吡嗪或其盐酸盐与式Ⅱ化合物4-(2,4,5-三氟苯基)-5-氧代丁酸的摩尔比为1：1.0～1.25。更好的保证原料充分的反应，减少原料的浪费，也能够避免原料过剩影响产物质量的优点。
在上述西他列汀中间体的生物合成方法中，作为优选，所述酶催化反应还可添加辅酶，促进反应的进行，辅酶可以是NAD+、NADP+等。
本发明的西他列汀中间体的生物合成方法，具体的化学反应合成可通过以下反应方程式表示：
上述反应方程式中对应的式Ⅲ化合物3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪也可以是其对应的盐酸盐。
综上所述，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
在特定蛋白序列的酰胺合酶的作用下，能够使式Ⅱ化合物中的羧基与式Ⅲ化合物中的亚氨基进行键合有效的形成酰胺化结构，产物的转化率高，具有高产物收率的效果；且采用酶法生物合成，具有对环境友好的优点，更有利于工业化生产。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。
实施例1
本实施例是针对酰胺合酶的培养：
配制TB培养基：
配方为：磷酸二氢钾：2.31g/L；磷酸氢二钾：16.43g/L；酵母膏：24g/L；蛋白胨：12g/L；以及甘油：5g/L，再加入适量的去离子水溶解，最后用去离子水定容至500mL，得到相应的TB培养基。
配制完后，分装至5支250mL锥形瓶中，每瓶100mL培养基，121℃灭菌30min，当种子培养基冷却至室温后，向每支锥形瓶中移入酰胺合酶的基因工程大肠杆菌保藏液100μL，酰胺合酶的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，于37℃、200rpm的条件下培养8h后取至无菌操作台上，加入300μL的IPTG溶液(浓度为28g/L)，再于200rpm、28℃的条件下培养16h，最后进行高速离心，转速为10000rpm，离心10min后，收集菌泥，用于酶催化反应的酰胺合酶，酰胺合酶的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2
如下式I化合物(2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮的合成：
向500mL的圆底烧瓶中投入130mL的乙酸乙酯溶剂，再加入24g的4-(2,4,5-三氟苯基)-5-氧代丁酸和18g的3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪盐酸盐，然后，加入170mL的Tris-HCl(PH＝7.6)缓冲溶液，再加入一定量的氢氧化钠，使反应体系的pH值在8.0左右，按照反应液的体系，加入80g/L的来源于大肠杆菌的基因工程菌全细胞含有酰胺合酶(实施例1得到的菌泥)，控制温度为40℃，进行酶催化反应24h后，取样检测确认反应完全，过滤，收集滤液进行减压蒸馏除去溶剂，得到剩余物西他列汀中间体(2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮，产物收率94.5％，HPLC纯度达到99.5％。
实施例3
如下式I化合物(2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮的合成：
向500mL的圆底烧瓶中投入130mL的乙酸乙酯溶剂，再加入24g的4-(2,4,5-三氟苯基)-5-氧代丁酸和18g的3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪盐酸盐，然后，加入170mL的Tris-HCl(PH＝7.6)缓冲溶液，再加入一定量的氢氧化钠，使反应体系的pH值在8.0左右，按照反应液的体系，加入100g/L的来源于大肠杆菌的基因工程菌全细胞含有酰胺合酶(实施例1得到的菌泥)，控制温度为45℃，进行酶催化反应24h后，取样检测确认反应完全，过滤，收集滤液进行减压蒸馏除去溶剂，得到剩余物西他列汀中间体(2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮，产物收率95.5％，HPLC纯度达到99.6％。
实施例4
如下式I化合物(2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮的合成：
向500mL的圆底烧瓶中投入130mL的乙酸乙酯溶剂，再加入22g的4-(2,4,5-三氟苯基)-5-氧代丁酸和18g的3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪盐酸盐，然后，加入170mL的Tris-HCl(PH＝7.6)缓冲溶液，再加入一定量的氢氧化钠，使反应体系的pH值在8.0左右，按照反应液的体系，加入90g/L的来源于大肠杆菌的基因工程菌全细胞含有酰胺合酶(实施例1得到的菌泥)，控制温度为40℃，进行酶催化反应26h后，取样检测确认反应完全，过滤，收集滤液进行减压蒸馏除去溶剂，得到剩余物西他列汀中间体(2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮，产物收率94.4％，HPLC纯度达到99.4％。
实施例5
本实施例的如下式I化合物(2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮的合成基本同实施例1相一致，区别仅在于，将其中的原料3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪盐酸盐采用3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪进行代替，其它同实施例1一致，这里不再赘述，最终产物的收率为94.2％，HPLC纯度达到99.1％。：
实施例6
如下式I化合物(2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮的合成：
向500mL的圆底烧瓶中投入130mL的乙酸乙酯溶剂，再加入24g的4-(2,4,5-三氟苯基)-5-氧代丁酸和18g的3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪盐酸盐，辅酶NAD+0.01g，异丙醇30mL，然后，加入170mL的Tris-HCl(PH＝7.6)缓冲溶液，再加入一定量的氢氧化钠，使反应体系的pH值在8.0左右，按照反应液的体系，加入90g/L的来源于大肠杆菌的基因工程菌全细胞含有酰胺合酶(实施例1得到的菌泥)，控制温度为40℃，进行酶催化反应19h后，取样检测确认反应完全，过滤，收集滤液进行减压蒸馏除去溶剂，得到剩余物西他列汀中间体(2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮，产物收率94.2％，HPLC纯度达到99.2％。
上述的溶剂也可采用二甲基叔丁基醚代替乙酸乙酯溶剂进行相应的反应。
本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
序列表
<110> 江苏八巨药业有限公司
<120> 一种西他列汀中间体的生物合成方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 287
<212> PRT
<213> 酰胺合酶(人工序列)
<400> 1
Met Thr Pro Ser Pro Leu Pro Leu Ser Pro Leu Arg Ser His Ile Ile
1 5 10 15
Arg Glu Leu His Val Gln Pro Asp Ile Asp Pro Gly Ala Glu Val Glu
20 25 30
Arg Arg Val Ala Phe Leu Cys Asp Tyr Leu Gln Ser Thr Pro Thr Lys
35 40 45
Gly Phe Val Leu Gly Ile Ser Gly Gly Gln Asp Ser Thr Leu Ala Gly
50 55 60
Arg Leu Cys Gln Leu Ala Val Glu Arg Arg Arg Ser Gln Gly His Gly
65 70 75 80
Ala Thr Phe Leu Ala Val Arg Leu Pro Tyr Gly Val Gln Ala Asp Glu
85 90 95
Ala Asp Ala Gln Gln Ala Leu Asp Phe Ile Gln Ala Asp Arg Glu Val
100 105 110
Thr Val Asn Ile Lys Glu Ala Ala Asp Ala Ser Val Ala Ala Ala Gln
115 120 125
Ala Ala Leu Gly Ser Glu Val Arg Asp Phe Val Arg Gly Asn Val Lys
130 135 140
Ala Arg Glu Arg Met Val Ala Gln Tyr Ala Leu Ala Gly Gln Glu Asn
145 150 155 160
Leu Leu Val Val Gly Thr Asp His Ala Ala Glu Ala Leu Thr Gly Phe
165 170 175
Tyr Thr Lys Tyr Gly Asp Gly Gly Val Asp Leu Thr Pro Leu Ser Gly
180 185 190
Leu Thr Lys Arg Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ala His Leu Gly Ala Pro
195 200 205
Glu Gly Thr Trp Arg Lys Val Pro Thr Ala Asp Leu Glu Asp Asp Arg
210 215 220
Pro Gly Leu Pro Asp Glu Val Ala Leu Gly Val Thr Tyr Ala Gln Ile
225 230 235 240
Asp Ala Tyr Leu Glu Gly Arg Glu Val Ser Asp Glu Ala Ala Ala Arg
245 250 255
Leu Glu Arg Leu Phe Leu Asn Ser Arg His Lys Arg Ala Leu Pro Val
260 265 270
Thr Pro Phe Asp Gly Trp Trp Gln Pro Gly Glu Gln Lys Gln Ser
275 280 285

Claims (5)

1.一种西他列汀中间体的生物合成方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
在无机碱存在下，在非水溶性溶剂中使式Ⅱ化合物4-(2,4,5-三氟苯基)-5-氧代丁酸与式Ⅲ化合物3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪或其盐酸盐在辅酶和催化量的酰胺合酶的催化作用下并控制温度在35℃～45℃下进行酶催化反应，所述酶催化反应的过程中控制反应体系的pH值为8.0～8.5，所述辅酶选自NAD+或NADP+，得到产物式Ⅰ化合物西他列汀中间体：
所述酰胺合酶的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述西他列汀中间体的生物合成方法，其特征在于，所述酰胺合酶的加入量为80g/L～100g/L。
3.根据权利要求1或2所述西他列汀中间体的生物合成方法，其特征在于，所述无机碱选自氢氧化钠或氢氧化钾。
4.根据权利要求1或2所述西他列汀中间体的生物合成方法，其特征在于，所述非水溶性溶剂选自乙酸乙酯、二甲基叔丁基醚、二氯甲烷和氯仿中的一种或几种。
5.根据权利要求1或2所述西他列汀中间体的生物合成方法，其特征在于，所述式Ⅲ化合物3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪或其盐酸盐与式Ⅱ化合物4-(2,4,5-三氟苯基)-5-氧代丁酸的摩尔比为1：1.0～1.25。
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