CN109913430A - 一种来源于黄曲霉的单胺氧化酶用于手性胺中间体的制备 - Google Patents

Abstract

发明名称：一种来源于黄曲霉的单胺氧化酶用于手性胺中间体的制备摘要：本发明属于生物技术领域，涉及基因工程、生物转化和生物催化、有机合成技术，公开了一种来源于黄曲霉的单胺氧化酶基因及其在催化不对称氧化反应制备手性胺中间体中的应用。本发明单胺氧化酶AfMAO6‑3基因为1419 bp，编码由470个氨基酸组成的单胺氧化酶。本发明单胺氧化酶基因构建的重组菌单胺氧化酶表达后，全细胞或者酶用于转化顺式‑7‑氮杂双环[3,3,0]辛烷，生成特拉瑞韦（Telaprevir）的关键手性中间体。本发明具有反应条件温和，立体选择性高，易于工业化等优点。

Description

一种来源于黄曲霉的单胺氧化酶用于手性胺中间体的制备

技术领域

本发明属于应用微生物与酶工程领域，具体涉及一株黄曲霉及其基因组编码的一种新型单胺氧化酶，并利用来源于该菌株的单胺氧化酶作为生物催化剂制备若干手性胺中间体。

背景技术

手性胺是重要和关键的药物结构单元，目前约40%的药物含有手性胺结构，手性胺高效制造技术是手性药物制造工业进步与发展所必须的关键技术。目前，手性胺的制备主要以化学不对称拆分和合成为主，生物催化制造手性胺则主要采用脂肪酶和转氨酶作为催化剂，对单胺氧化酶（MAO）的研究和使用较少。

光学活性Δ¹-吡咯烷类化合物是制备很多药物的关键手性中间体，这些分子中包含多个手性中心，合成难度极高。例如，(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-羧酸是治疗丙型肝炎药物特拉瑞韦（Telaprevir）的关键手性中间体，该药物由Vertex公司与强生公司联合开发。

采用手性酸试剂通过非对应异构体结晶成盐的拆分方法仍是目前获得光学纯手性胺的主要方法,但理论收率仅有50%成为这一技术的最大弊端。利用过渡金属催化亚胺不对称氢化还原是获得手性胺的另一重要途径，然而这一方法也存在很多不足：如需要活化的亚胺底物；需要使用过渡金属，如Rh，Ru，Ir和Ti，但昂贵的价格限制了它们在工业化中的应用。

近年来，随着生物催化技术的不断发展，研究者们积极探索发现和挖掘新酶作为生物催化剂用于手性胺的合成。采用单胺氧化酶不对称氧化消旋胺底物来获得光学纯手性胺的研究目前还主要停留在实验室研发阶段，成果主要集中在国外几个课题组，如英国的turner小组。

为获得高效的手性胺催化工艺，首先应解决单胺氧化酶来源极其有限的问题，迄今为止成功应用的只有黑曲霉单胺氧化酶。从环境中筛选新型微生物菌株作为催化剂是常用的有效途径之一。然而原始菌株直接转化可能存在安全性、遗传稳定性问题，原始菌株内的其他酶可能对底物作用生成副产物等问题，因此将原始菌株的关键单胺氧化酶基因克隆并异源表达，以重组菌或者酶用于生物转化则可避免上述问题，且这种催化体系较为简单，稳定，产物分离提纯容易，易于工业化。

发明内容

本发明的目的是公开一个产自新筛选的黄曲霉（Aspergillus flavus 12）的高对映选择性单胺氧化酶AfMAO6-3，并利用该酶与化学磺化反应相偶联，一锅法反应构建含三个手性中心且水溶性和稳定性更好的光学纯(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-磺酸钠中间体，再通过化学腈化和水解，得到高光学纯度的特拉瑞韦（Telaprevir）关键手性中间体(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-羧酸。

基于上述发明目的，本发明首先提供一种单胺氧化酶AfMAO6-3。该酶是从一株黄曲霉（Aspergillus flavus 12）中通过基因狩猎法克隆调取出来的。该菌从果园土壤中富集、分离并经过多轮筛选后获得。

本发明还提供一种上述单胺氧化酶AfMAO6-3作为生物催化剂转化底物顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷，并与化学磺化反应相偶联，一锅法反应生成光学纯(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-磺酸钠中间体，再通过化学氰化和水解，得到高光学纯度的特拉瑞韦（Telaprevir）关键手性中间体(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-羧酸的应用。

其中，从上述黄曲霉（Aspergillus flavus 12）中关键单胺氧化酶基因AfMAO6-3的调取和转化包括以下步骤：

（1）基因狩猎法克隆扩增AfMAO6-3基因：

采用CTAB法提取黄曲霉（Aspergillus flavus 12）的基因组DNA。通过对已报道对单胺氧化酶基因进行序列对比和同源分析，根据N端和C端保守序列设计兼并引物，以提取的黄曲霉（Aspergillus flavus 12）基因组DNA为模板进行PCR，将其中的单胺氧化酶基因克隆扩增出来。

其中，上述步骤中涉及的AfMAO6-3基因 PCR扩增所用引物为：

正向5ˊ- GGA TCC ATG GCA CCA CCT TCA AAC GAA-3ˊ（酶切位点Bam H I），反向 5ˊ- GAA TTC TCA AAG CCT CGA TCG CAA CGT TTC -3ˊ（酶切位点EcoR I）；

PCR条件为，95℃预变性5 分钟，95℃ 变性30 秒，55 ℃退火30 秒，72 ℃延伸90 秒，30个循环，最后72 ℃延伸10 分钟。PCR产物连入pMD19T载体构建TA克隆，测序结果显示含有两段分别由61和60个核苷酸组成的内含子序列。

AfMAO6-3 基因（含内含子）碱基数为1553 bp，其序列为（SEQ ID No.1）

ATGGCACCACCTTCAAACGAAGGCTTTTTATGGACTCCACATGGAAGTACGAGTGGCCTCGAAACTGACGCTGTGCAGGAAAGCTCACCAGTTATCCATGACAGCTATGACGTGGTGGTTATAGGGGCTGGGTTCACTGGTCTTATCGCCGCACGAGAATTGAGTCAGAGACATGATCTGAAGGTGTTACTATTAGAGGCAAGAGATCGGATCGGTGGTCGTACATGGACGGCAAGAGCTCTAGGGGAAGAGCTAGAGATGGGAGGAACTTGGGTGCATTGGGCTCAACCTCACCTTTATAGCGAACTTCGCCGGTACGGACTACATATCAATTTAAAGACTTCCGCAGGCACTGCTGCACCTACCAAGCAGATGTTCAAACAGGGAAAGGCAACCCCATGTGAGATATCGATCGAGGAGACTGGTGATATTTTGGAGCGCATTGCCCAATCTTTCTTCACGATCGACGGAAGCAGCAGTCGTGAGCTCATGCCATACCCTCACGATCCCTTCAAGCGACCAGCTTTGTGGATGAAATATGATCATTTGTCAGTGCAAGACCGACTGGACAATCTTCGTGGGTTTTCAAGTTGGGAGAAAGATTTGTTCGAATCAAACACGAGCACCTTCGGTAGTGCTCCTGGAAAGGATATCGCATTTACCGAAGCACTTCGGTGGTACGCCTTAGGTGGACACAACATGAAGGGAGTGTTCGAACTCGCTGGAGTCTACAAAATTGGGAATGGGGGCATGACTTCGTTTTGCGCGAGCAGTCTTGGGTGACTACACGGGGCATATGCTTTTTTGGGGCCACTGTGAAGGAAGTCGCGCAGACCAAGTTAGGAGTCAGGGTTACCACAAGGCTTGGGCAAGAGATCAATGCAAAATATGTAGTTTCTACTATTCCTTTGTACGACCACTCTTCCTGAGCCTCTCTCAATTCGAAGTTCTCAAAGCTAATCCTCAGCAGGAACTGTTTAGCGGATGTGAAATTCTACCCCCCAATATCTTCCATTCGACAGTCTGCGATGACGAAAGGACATATCAATAAGGGCGCAAAGATCCACTTCAAGCTCAAGGCAGCGGAGCCGGGCTGGTTTGTAACCGCAAATTCGAGCGACTCGGCCTATGTTTTTGCCTTCTCCGACCACAACGGCACTCGGGAATCAGAACCATCCGGCACTTGGTGCATTGGATTTGGATACAATGGAAGATTGGATGATAAGAACAACCACCGTCATATTATCGATCGCTTCCGAAAGGATATTTATCCAACCGGTGACGTTGAAGCTTACGTGACTCACGACTGGGTGAATGACCCGTACGCGAAAGGAGCTTGGGCTTGTTGGGGGCCTGGATGTGCGACAGCCTATCTCCAAGAACTCCAGAAGCCCCATGGGAGGGTCATTTTTGCCAGTGCCGATTGGGCTGACGGGTGGAGGGGGTTCGTTGATGGAGCCATCGAACAGGGTCACCAAGCATCTCAATGTGTCGTGGCATCTCTCAAGTCAGAGACTGAAACGTTGCGATCGAGGCTTTGA

采用重叠PCR除去AfMAO6-3基因中的内含子。重叠PCR所用第一段引物为正向5ˊ-TGACTTCGTTTGCGCGAGCAACCAAGTTAGGAGTCAGGGT -3ˊ，反向 5ˊ-ACCCTGACTCCTAACTTGGTTGCTCGCGCAAACGAAGTCA -3ˊ；所用第二段引物为正向5ˊ-TAGTTTCTACTATTCCTTTGAACTGTTTAGCGGATGTGAA -3ˊ，反向 5ˊ-TTCACATCCGCTAAACAGTTCAAAGGAATAGTAGAAACTA -3ˊ；

PCR条件为，50ul反应体系，变性95℃ 30秒，退火55℃ 30秒，延伸72℃ 1分30秒，共30个循环，采用Pfu DNA polymerase。PCR产物连入pMD19T载体构建TA克隆，测序结果显示已正确除去内含子序列。

AfMAO6-3 基因（除去内含子）碱基数为1419 bp，其序列为（SEQ ID No.2）

ATGGCACCACCTTCAAACGAAGGCTTTTTATGGACTCCACATGGAAGTACGAGTGGCCTCGAAACTGACGCTGTGCAGGAAAGCTCACCAGTTATCCATGACAGCTATGACGTGGTGGTTATAGGGGCTGGGTTCACTGGTCTTATCGCCGCACGAGAATTGAGTCAGAGACATGATCTGAAGGTGTTACTATTAGAGGCAAGAGATCGGATCGGTGGTCGTACATGGACGGCAAGAGCTCTAGGGGAAGAGCTAGAGATGGGAGGAACTTGGGTGCATTGGGCTCAACCTCACCTTTATAGCGAACTTCGCCGGTACGGACTACATATCAATTTAAAGACTTCCGCAGGCACTGCTGCACCTACCAAGCAGATGTTCAAACAGGGAAAGGCAACCCCATGTGAGATATCGATCGAGGAGACTGGTGATATTTTGGAGCGCATTGCCCAATCTTTCTTCACGATCGACGGAAGCAGCAGTCGTGAGCTCATGCCATACCCTCACGATCCCTTCAAGCGACCAGCTTTGTGGATGAAATATGATCATTTGTCAGTGCAAGACCGACTGGACAATCTTCGTGGGTTTTCAAGTTGGGAGAAAGATTTGTTCGAATCAAACACGAGCACCTTCGGTAGTGCTCCTGGAAAGGATATCGCATTTACCGAAGCACTTCGGTGGTACGCCTTAGGTGGACACAACATGAAGGGAGTGTTCGAACTCGCTGGAGTCTACAAAATTGGGAATGGGGGCATGACTTCGTTTGCGCGAGCAACCAAGTTAGGAGTCAGGGTTACCACAAGGCTTGGGCAAGAGATCAATGCAAAATATGTAGTTTCTACTATTCCTTTGAACTGTTTAGCGGATGTGAAATTCTACCCCCCAATATCTTCCATTCGACAGTCTGCGATGACGAAAGGACATATCAATAAGGGCGCAAAGATCCACTTCAAGCTCAAGGCAGCGGAGCCGGGCTGGTTTGTAACCGCAAATTCGAGCGACTCGGCCTATGTTTTTGCCTTCTCCGACCACAACGGCACTCGGGAATCAGAACCATCCGGCACTTGGTGCATTGGATTTGGATACAATGGAAGATTGGATGATAAGAACAACCACCGTCATATTATCGATCGCTTCCGAAAGGATATTTATCCAACCGGTGACGTTGAAGCTTACGTGACTCACGACTGGGTGAATGACCCGTACGCGAAAGGAGCTTGGGCTTGTTGGGGGCCTGGATGTGCGACAGCCTATCTCCAAGAACTCCAGAAGCCCCATGGGAGGGTCATTTTTGCCAGTGCCGATTGGGCTGACGGGTGGAGGGGGTTCGTTGATGGAGCCATCGAACAGGGTCACCGAGCATCTCAATGTGTCGTGGCATCTCTCAAGTCAGAGACTGAAACGTTGCGATCGAGGCTTTGA

AfMAO6-3 基因（除去内含子）编码470个氨基酸，序列为（SEQ ID No.3）：

MAPPSNEGFLWTPHGSTSGLETDAVQESSPVIHDSYDVVVIGAGFTGLIAARELSQRHDLKVLLLEARDRIGGRTWTARALGEELEMGGTWVHWAQPHLYSELRRYGLHINLKTSAGTAAPTKQMFKQGKATPCEISIEETGDILERIAQSFFTIDGSSSRELMPYPHDPFKRPALWMKYDHLSVQDRLDNLRGFSSWEKDLFESNTSTFGSAPGKDIAFTEALRWYALGGHNMKGVFELAGVYKIGNGGMTSFARATKLGVRVTTRLGQEINAKYVVSTIPLNCLADVKFYPPISSIRQSAMTKGHINKGAKIHFKLKAAEPGWFVTANSSDSAYVFAFSDHNGTRESEPSGTWCIGFGYNGRLDDKNNHRHIIDRFRKDIYPTGDVEAYVTHDWVNDPYAKGAWACWGPGCATAYLQELQKPHGRVIFASADWADGWRGFVDGAIEQGHQASQCVVASLKSETETLRS

而后将测序正确的质粒以Bam H I和EcoR I酶切，将其连入以同样酶消化的pET 28a（+）空载体中，构建重组质粒，并转入大肠杆菌BL21（DE3）中，构建重组菌，中以常规方法过量表达。后文涉及生物转化和应用的基因及酶均指去除内含子后的序列及蛋白表达产物。

（2）重组菌生物催化：

挑取单克隆至LB（含卡那霉素50 μg/ml）培养基中，37℃ 过夜培养，以1%的接种量转接至LB（含卡那霉素50 μg/ml）培养基中，37 ℃培养3 h，加入0.2 mM IPTG诱导后，30 ℃继续培养至20~36 h。8000 rpm，4 ℃离心收集菌体，用pH值为8.0、0.1 M浓度的磷酸钾缓冲溶液洗涤2次，获得湿菌体。

取上述新鲜培养的湿菌体重悬于pH值为8.0、1 M浓度的磷酸钾缓冲液，加入底物顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷，反应过程中向反应体系中通入氧气，转化体系中菌体浓度为50~150 g/L，底物终浓度为1~20 g/L，转化温度为30 ℃，转速为230 rpm，转化时间为1~24 h。反应过程中采用TLC检测反应情况,展开剂比例为石油醚：乙酸乙酯：三乙胺=15:1:0.1，碘显显色。

（3）AfMAO6-3酶的蛋白纯化

AfMAO6-3酶的纯化采用镍柱亲和层析（Bio-Rad）。将上述步骤（2）诱导培养20~36 h后的菌体以13, 000rpm，4 ℃离心收集，重悬于Buffer A（50 mM磷酸盐缓冲液，pH 8.0，300mM NaCl，10 mM咪唑），超声破碎（超声10 s，间隔30 s，30次），之后以13, 000rpm，4 ℃离心20 分钟，将上清液加入已用Buffer A平衡的柱料中，轻微混匀30 分钟，用含有20 mM咪唑的Buffer A漂洗杂蛋白，再用含250 mM咪唑的Buffer A的缓冲液洗脱目的蛋白，最后电泳鉴定纯度，并用BCA Protein Assay kit 测定蛋白浓度。

（4）单胺氧化酶AfMAO6-3不对称氧化与亲核加成磺化偶联反应：

表达AfMAO6-3酶的大肠杆菌重组菌的菌体培养、获得湿菌体的步骤同步骤（2）。

生物转化条件：在三口圆底反应烧瓶中分别加入磷酸盐缓冲液（pH 8.0，0.1M）,底物和湿菌体/酶，其中顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷终浓度为20 g/L，湿菌体终浓度为50g/L， 过氧化氢酶（CAT，30KU/mg）终浓度为1000 KU/L，在37°C, 250 rpm条件下开始反应24小时，反应过程中保持通入氧气。反应过程中滴加NaHSO₃溶液(NaHSO₃摩尔物质的量为底物顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷的1.2倍)，不对称氧化生成的亚胺中间体随即与NaHSO₃发生反式亲核加成反应，生成水溶性和稳定性更好的含3个手性中心的(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-磺酸钠产物，反应过程中滴加3N NaOH调节反应体系pH维持在8.0左右。

（5）氰化反应制备(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-腈

氰化反应条件：环戊基甲醚（CPME）50mL加入到步骤（4）的反应液中，溶液降温至10°C。缓慢滴加15mL NaCN水溶液(NaCN摩尔物质的量为底物顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷的1.2倍)，于半小时滴加完毕。10°C继续反应1小时，过滤除去不溶物，取有机相，水相用CPME 3×20mL萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后减压蒸馏除去溶剂，残留物即为(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-腈。

（6）水解反应制备(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-羧酸

水解反应条件：将步骤（5）得到的(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-腈与10mL浓盐酸（33%）分别加入到50 mL圆底烧瓶中，加热回流过夜。降温至室温后向圆底烧瓶中加入氨水条件体系pH至7.0。采用离子交换层析法进行纯化，已填好的阳离子交换树脂柱先用1N HCl洗涤，后用纯水洗涤至pH中性为止。将反应液上柱，用纯水洗涤3~5个柱体积后用5%的氨水洗涤，接收洗脱产物，洗脱过程用茚三酮显色进行监测，减压蒸馏除去溶剂所得类白色固体即为(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-羧酸的铵盐。步骤（4）~（6），反应总收率约47%，产物(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-羧酸光学纯度为91%ee值。产物在乙醇-甲基叔丁基醚混合液中重结晶后总收率38%，光学纯度提高到95%ee值。此氨基酸产物的光学纯度采用手性高效液相色谱（HPLC）分析法来确定。手性HPLC条件: 手性柱Chirex 3126 (D)-Penicillamine（50 mm× 4.6 mm,5 micron），流动相 H₂O : CH₃CN = 90: 10, 2 mM CuSO₄, 流速 0.8 mL / min,，柱温25 °C, 监测波长247nm，产物保留时间 Tr= 6.4 分钟和9.6分钟。

本发明涉及的黄曲霉（Aspergillus flavus 12）其关键单胺氧化酶基因AfMAO6-3可高立体选择性转化顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷生成亚胺中间体(3AR,6AS)-六氢环戊二烯并[C]吡咯啉，并可与化学磺化反应相偶联，一锅法反应构建 (1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-磺酸钠中间体，再通过化学腈化和水解，得到高光学纯度的特拉瑞韦（Telaprevir）关键手性中间体(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-羧酸。目前国内外还未有专利及文献报道从黄曲霉（Aspergillus albicans）中挖掘单胺氧化酶以及将其用于特拉瑞韦（Telaprevir）关键手性中间体(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-羧酸的制备。AfMAO6-3与已报道的功能蛋白MAO-N-D5（PDB数据库ID：2VVM）的最高相似度为30.9%，为(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-羧酸生物催化合成提供了可供选择的新型酶源。

目前，国内外还未有专利及文献报道采用单胺氧化酶不对称氧化与化学磺化反式亲核加成反应相偶联，一锅法反应生成光学纯(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-磺酸钠中间体用于制备特拉瑞韦（Telaprevir）关键手性中间体(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-羧酸。

凡是与AfMAO6-3氨基酸相似度高于70%且具有催化顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷生成(3AR,6AS)-六氢环戊二烯并[C]吡咯啉功能的酶均属于本发明的保护范围。另外，采用单胺氧化酶不对称氧化与化学磺化反式亲核加成反应相偶联，一锅法反应生成光学纯(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-磺酸钠的合成方法也在本发明的保护范围。

附图说明

图1是AfMAO6-3蛋白纯化后SDS-PAGE图。

具体实施方式

以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。

实施例1：基因组DNA提取

采用CTAB法提取基因组DNA操作方法如下：

菌株培养：将少量黄曲霉（Aspergillus flavus 12）斜面种子接种于曲霉培养基中，30℃，230 rpm培养24~36 h制备种子液，以0.5%~2%的接种量转接至曲霉培养基中扩大培养，培养条件：30 ℃，230 rpm， 48~72 h。曲霉培养基成分：0.3% KH₂PO₄；0.15% MgSO₄•7H₂O；0.1% 酵母膏；0.06% 蛋白胨；2% 葡萄糖；20% 土豆。

取0.5~1.0g菌丝体至研钵中，加石英砂液氮研磨粉碎。将该粉末转移到2.0 ml的EP管中，加入600 ul的DNA抽提液 （每50mg菌体加500μl），振荡，混匀，55℃保温60 分钟。用4 mol/L NaCl调整溶液NaCl浓度为1.4 mol/L，然后加入1/10体积的10% CTAB溶液，混匀，65℃保温10 分钟。加入等体积氯仿/异戊醇，颠倒混匀，冰浴30 分钟。4℃，15000 r/分钟离心10 分钟。将上清液转移到另一EP管中，加入等体积的异丙醇混匀，冰浴30 分钟。取出EP管，10000 r/分钟，4℃离心10分钟，弃上清液，75%乙醇洗涤两次，空气干燥，加入150 ulddH₂O溶解沉淀即得基因组总DNA。DNA抽提液组成：0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0），0.01mol/L EDTA， 2% SDS，100 μg/ml Proteinase K，0.5% β-mercaptoethanol。

实施例2：基因狩猎法克隆扩增AfMAO6-3基因

通过对已报道对单胺氧化酶基因进行序列对比和同源分析，根据N端和C端保守序列设计兼并引物，以实施例1中获得的基因组DNA为模板进行PCR，将其中的单胺氧化酶基因克隆扩增出来。

PCR反应体系为50ul，分别由5 ul ×10 pfu DNA polymerase buffer(含Mg²⁺)，1ul primer F，1 ul primer R，4 ul dNTP，1 ul 基因组DNA，0.5 ul Pfu DNA polymerase和37.5 ul ddH₂O组成。其中， PCR扩增所用引物为：

primer F： 5ˊ- GGA TCC ATG GCA CCA CCT TCA AAC GAA -3ˊ（酶切位点Bam H I），primer R： 5ˊ- GAA TTC TCA AAG CCT CGA TCG CAA CGT TTC-3ˊ（酶切位点EcoR I）；

PCR条件为，95 ℃预变性5 分钟，95 ℃变性30 秒，55 ℃退火30 秒，72 ℃延伸90 秒，30个循环，最后72 ℃延伸10 分钟。PCR产物连入pMD19T载体构建TA克隆，测序结果显示含有两段分别由61和60个核苷酸组成的内含子序列。。AfMAO6-3 基因（含内含子）碱基数为1553 bp，其序列为（SEQ No.1）。

采用重叠PCR除去AfMAO6-3基因中的内含子。重叠PCR所用第一段引物Fm1为正向5ˊ- TGACTTCGTTTGCGCGAGCAACCAAGTTAGGAGTCAGGGT -3ˊ，Rm1为反向 5ˊ-ACCCTGACTCCTAACTTGGTTGCTCGCGCAAACGAAGTCA -3ˊ；所用第二段引物Fm2为正向5ˊ-TAGTTTCTACTATTCCTTTGAACTGTTTAGCGGATGTGAA -3ˊ，Rm2为反向 5ˊ-TTCACATCCGCTAAACAGTTCAAAGGAATAGTAGAAACTA -3ˊ；

第一轮PCR：将之前提取的质粒pMD19T-AfMAO6-3作为模板，进行PCR，反应体系(50 ul)如下：

前段基因(a)：5 ul ×10 pfu buffer(含Mg²⁺)，1 ul primer F，1 ul primer Rm1，4ul dNTP，1 ul pMD19T-AfMAO6-3，0.5 ul Pfu DNA polymerase， 37.5 ul ddH₂O。

中段基因(b)：5 ul ×10 pfu buffer(含Mg²⁺)，1 ul primer Fm1，1 ul primerRm2 ，4 ul dNTP，1 ul pMD19T-AfMAO6-3，0.5 ul Pfu DNA polymerase， 37.5 ul ddH₂O。

后段基因(c)：5 ul ×10 pfu buffer(含Mg²⁺)，1 ul primer Fm2，1 ul primerR，4 ul dNTP，1 ul pMD19T-AfMAO6-3，0.5 ul Pfu DNA polymerase， 37.5 ul ddH₂O。

PCR条件为，95 ℃预变性5 分钟，95 ℃变性30 秒，55 ℃退火30 秒，72 ℃延伸90秒，30个循环，最后72 ℃延伸10 分钟。

采用凝胶回收试剂盒回收3段PCR产物，回收产物编号：6-3-a、6-3-b和6-3-c。

第二轮PCR：将之前回收的PCR产物6-3-a、6-3-b和6-3-c作为模板，进行PCR，反应体系(50 ul)如下：5 ul ×10 pfu buffer(含Mg²⁺)，1 ul primer F，1 ul primer R，4 uldNTP，1 ul 6-3-a，1 ul 6-3-b，1 ul 6-3-c，0.5 ul Pfu DNA polymerase，35.5 ulddH₂O。

采用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，并与pMD19-T载体连接，转化到感受态细胞E.coli DH5α中，LB平板（含氨苄青霉素100 ug/mL）培养，通过蓝白斑筛选选出阳性克隆进行培养，提取质粒和测序。

10 ul 连接体系： 1 ul pMD19-T载体，5 ul NEB solution I，4 ul PCR回收产物，16℃下过夜连接。

转化：将连接片段4ul转化到E. coli DH5α中，LA平板（含10 ul ×5 X-gal，7 ul1M IPTG）37℃培养。

蓝白斑筛选：挑取白色单克隆菌落(每个平板挑2个菌)到3ml LB液体培养基（含氨苄青霉素100 ug/mL）的试管中，37℃，180rpm下培养17小时。

采用细菌质粒小提试剂盒提取质粒pMD19T-AfMAO6-3。质粒测序结果显示已正确除去内含子序列。AfMAO6-3基因（除去内含子）碱基数为1419 bp，其序列为（SEQ No.2）

实施例3：将AfMAO6-3基因构建在基因工程菌株中

对质粒pMD19T-AfMAO6-3进行双酶切。酶切体系40 ul， 由33 ul pMD19T-AfMAO6-3，1.0 ul BSA，1.0 ul BamH I，4 ul NEB Buffer 3组成，37℃酶切3小时后补加1.0 ul EcoRI，继续于37℃酶切3小时。

对载体pET28a进行双酶切。酶切体系40 ul， 由33 ul pET28a，1.0 ul BSA，1.0ul BamH I，4 ul NEB Buffer 3组成，37℃酶切3小时后补加1.0 ul EcoR I，继续于37℃酶切3小时。

酶切产物采用凝胶回收试剂盒进行回收和纯化。

连接：10 ul 体系，6 ul AfMAO6-3（BamH I / EcoR I)，2 ul pET28a (BamH I /EcoR I)，1 ul T4 DNA ligase Buffer，1 ul T4 DNA ligase。16℃下连接过夜。

转化与培养：将连接的10 ul载体 pET28-AfMAO6-3转化到感受态细胞E. coliDH5α中，涂布在LB平板（含卡那霉素50 μg/ml），于37℃培养箱培养过夜。从生长含有pET28-AfMAO6-3的E. coli DH5α平板上挑取单克隆菌落，于含卡那霉素（Kan）抗性的LB液体培养基中培养，37℃，180rpm。采用细菌质粒小提试剂盒提取质粒pET28-AfMAO6-3。

转化到基因工程菌中与培养：将2ul质粒pET28-AfMAO6-3转化到感受态细胞E.coli BL21中，涂布在LB平板（含卡那霉素50 μg/ml），于37℃培养箱培养过夜。从生长含有pET28-AfMAO6-3的E. coli BL21平板上挑取单克隆菌落，于含Kan抗性的LB液体培养基中培养，180rpm，37℃，培养过夜。以1%的接种量转接至LB（含卡那霉素50 μg/ml）培养基中，37℃培养3 小时，加入0.2 mM IPTG诱导后，30 ℃继续培养至16~20小时。8000 rpm，4 ℃离心收集菌体，用pH值为8.0、0.1 M浓度的磷酸钾缓冲溶液洗涤2次，获得湿菌体可用于后续生物转化反应。

实施例4：单胺氧化酶AfMAO6-3重组菌全细胞生物催化

单胺氧化酶AfMAO6-3重组菌的培养方法和菌体收集方法见说明书发明内容部分。

（1）取菌体1.0 g，重悬于10 ml磷酸盐缓冲液（pH 8.0，0.1M），加入底物10 mg，30℃，230 rpm转化3h。以10 ml乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到产物(3AR,6AS)-六氢环戊二烯并[C]吡咯啉，经TLC薄层层析色谱分析，底物的转化率为26%。

（2）取菌体1.0g，重悬于10 ml磷酸盐缓冲液（pH 8.0，0.1M），加入底物10 mg，反应瓶中通入纯氧，30℃，230 rpm转化3 h。以10 ml乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到产物(3AR,6AS)-六氢环戊二烯并[C]吡咯啉，经TLC薄层层析色谱分析，底物的转化率为32%。

（3）取菌体1.0 g，重悬于10 ml磷酸盐缓冲液（pH 8.0，0.1M），加入底物10 mg，过氧化氢酶（CAT，30KU/mg）1 ul，反应瓶中通入纯氧，30℃，230 rpm转化3 h。以10 ml乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到产物(3AR,6AS)-六氢环戊二烯并[C]吡咯啉，经TLC薄层层析色谱分析，底物的转化率为45%。

（4）取菌体1.0 g，重悬于10 ml磷酸盐缓冲液（pH 8.0，0.1M），加入底物10 mg，过氧化氢酶（CAT，30KU/mg）1 ul，反应瓶中通入纯氧，37℃，230 rpm转化24 h。以10 ml乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到产物(3AR,6AS)-六氢环戊二烯并[C]吡咯啉，经TLC薄层层析色谱分析，底物的转化率为81%。

（5）取菌体1.5 g，重悬于10 ml磷酸盐缓冲液（pH 8.0，0.1M），加入底物500 mg，过氧化氢酶（CAT，30KU/mg）1 ul，反应瓶中通入纯氧，37℃，230 rpm转化24 h。以10 ml乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到产物(3AR,6AS)-六氢环戊二烯并[C]吡咯啉，经TLC薄层层析色谱分析，底物的转化率为46%。

实施例5：单胺氧化酶AfMAO6-3纯酶生物催化

转化体系：磷酸钾缓冲液（0.1M，pH 8.0），纯酶浓度2 g/L，底物顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷，过氧化氢酶（CAT，30KU/mg）1 ul，反应瓶中通入纯氧，30 ℃生物转化3h。以10 ml乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到产物(3AR,6AS)-六氢环戊二烯并[C]吡咯啉，经TLC薄层层析色谱分析，底物的转化率为23%。

实施例6：单胺氧化酶AfMAO6-3不对称氧化与磺化反应偶联

单胺氧化酶AfMAO6-3重组菌的培养方法和菌体收集方法见说明书发明内容部分。

在100 mL圆底三口反应烧瓶中分别加入10 mL重悬菌液（用0.1M，pH 8.0磷酸钾缓冲液重悬1.5g湿菌体），2克顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷，过氧化氢酶（CAT，30KU/mg）5ul，反应瓶中持续通入氧气，反应开始后缓慢滴加5 mL NaHSO₃溶液(NaHSO₃ 2.2g)，于1h内加毕，随后继续在37°C, 230 rpm条件下反应24小时，反应过程中滴加3N NaOH调节反应体系pH维持在8.0左右。反应结束后用10 ml乙酸乙酯萃取，除去有机相，水相加入3N HCl调节pH＜2，用3×10 ml 甲基叔丁基醚（MTBE）萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏后得类白色固体即为(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-磺酸，收率81%。

序列表

<110> 成都渊源生物科技有限公司

<120> 一种来源于黄曲霉的单胺氧化酶用于手性胺中间体的制备

<130> 说明书

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1541

<212> DNA

<213> Aspergillus flavus

<400> 1

atggcaccac cttcaaacga aggcttttta tggactccac atggaagtac gagtggcctc 60

gaaactgacg ctgtgcagga aagctcacca gttatccatg acagctatga cgtggtggtt 120

ataggggctg ggttcactgg tcttatcgcc gcacgagaat tgagtcagag acatgatctg 180

aaggtgttac tattagaggc aagagatcgg atcggtggtc gtacatggac ggcaagagct 240

ctaggggaag agctagagat gggaggaact tgggtgcatt gggctcaacc tcacctttat 300

agcgaacttc gccggtacgg actacatatc aatttaaaga cttccgcagg cactgctgca 360

cctaccaagc agatgttcaa acagggaaag gcaaccccat gtgagatatc gatcgaggag 420

actggtgata ttttggagcg cattgcccaa tctttcttca cgatcgacgg aagcagcagt 480

cgtgagctca tgccataccc tcacgatccc ttcaagcgac cagctttgtg gatgaaatat 540

gatcatttgt cagtgcaaga ccgactggac aatcttcgtg ggttttcaag ttgggagaaa 600

gatttgttcg aatcaaacac gagcaccttc ggtagtgctc ctggaaagga tatcgcattt 660

accgaagcac ttcggtggta cgccttaggt ggacacaaca tgaagggagt gttcgaactc 720

gctggagtct acaaaattgg gaatgggggc atgacttcgt tttgcgcgag cagtcttggg 780

tgactacacg gggcatatgc ttttttgggg ccactgtgaa ggaagtcgcg cagaccaagt 840

taggagtcag ggttaccaca aggcttgggc aagagatcaa tgcaaaatat gtagtttcta 900

ctattccttt gtacgaccac tcttcctgag cctctctcaa ttcgaagttc tcaaagctaa 960

tcctcagcag gaactgttta gcggatgtga aattctaccc cccaatatct tccattcgac 1020

agtctgcgat gacgaaagga catatcaata agggcgcaaa gatccacttc aagctcaagg 1080

cagcggagcc gggctggttt gtaaccgcaa attcgagcga ctcggcctat gtttttgcct 1140

tctccgacca caacggcact cgggaatcag aaccatccgg cacttggtgc attggatttg 1200

gatacaatgg aagattggat gataagaaca accaccgtca tattatcgat cgcttccgaa 1260

aggatattta tccaaccggt gacgttgaag cttacgtgac tcacgactgg gtgaatgacc 1320

cgtacgcgaa aggagcttgg gcttgttggg ggcctggatg tgcgacagcc tatctccaag 1380

aactccagaa gccccatggg agggtcattt ttgccagtgc cgattgggct gacgggtgga 1440

gggggttcgt tgatggagcc atcgaacagg gtcaccaagc atctcaatgt gtcgtggcat 1500

ctctcaagtc agagactgaa acgttgcgat cgaggctttg a 1541

<210> 2

<211> 1419

<212> DNA

<213> Aspergillus flavus

<400> 2

atggcaccac cttcaaacga aggcttttta tggactccac atggaagtac gagtggcctc 60

gaaactgacg ctgtgcagga aagctcacca gttatccatg acagctatga cgtggtggtt 120

ataggggctg ggttcactgg tcttatcgcc gcacgagaat tgagtcagag acatgatctg 180

aaggtgttac tattagaggc aagagatcgg atcggtggtc gtacatggac ggcaagagct 240

ctaggggaag agctagagat gggaggaact tgggtgcatt gggctcaacc tcacctttat 300

agcgaacttc gccggtacgg actacatatc aatttaaaga cttccgcagg cactgctgca 360

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actggtgata ttttggagcg cattgcccaa tctttcttca cgatcgacgg aagcagcagt 480

cgtgagctca tgccataccc tcacgatccc ttcaagcgac cagctttgtg gatgaaatat 540

gatcatttgt cagtgcaaga ccgactggac aatcttcgtg ggttttcaag ttgggagaaa 600

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gggttcgttg atggagccat cgaacagggt caccgagcat ctcaatgtgt cgtggcatct 1380

ctcaagtcag agactgaaac gttgcgatcg aggctttga 1419

<210> 3

<211> 470

<212> PRT

<213> Aspergillus flavus

<400> 3

Met Ala Pro Pro Ser Asn Glu Gly Phe Leu Trp Thr Pro His Gly Ser

1 5 10 15

Thr Ser Gly Leu Glu Thr Asp Ala Val Gln Glu Ser Ser Pro Val Ile

20 25 30

His Asp Ser Tyr Asp Val Val Val Ile Gly Ala Gly Phe Thr Gly Leu

35 40 45

Ile Ala Ala Arg Glu Leu Ser Gln Arg His Asp Leu Lys Val Leu Leu

50 55 60

Leu Glu Ala Arg Asp Arg Ile Gly Gly Arg Thr Trp Thr Ala Arg Ala

65 70 75 80

Leu Gly Glu Glu Leu Glu Met Gly Gly Thr Trp Val His Trp Ala Gln

85 90 95

Pro His Leu Tyr Ser Glu Leu Arg Arg Tyr Gly Leu His Ile Asn Leu

100 105 110

Lys Thr Ser Ala Gly Thr Ala Ala Pro Thr Lys Gln Met Phe Lys Gln

115 120 125

Gly Lys Ala Thr Pro Cys Glu Ile Ser Ile Glu Glu Thr Gly Asp Ile

130 135 140

Leu Glu Arg Ile Ala Gln Ser Phe Phe Thr Ile Asp Gly Ser Ser Ser

145 150 155 160

Arg Glu Leu Met Pro Tyr Pro His Asp Pro Phe Lys Arg Pro Ala Leu

165 170 175

Trp Met Lys Tyr Asp His Leu Ser Val Gln Asp Arg Leu Asp Asn Leu

180 185 190

Arg Gly Phe Ser Ser Trp Glu Lys Asp Leu Phe Glu Ser Asn Thr Ser

195 200 205

Thr Phe Gly Ser Ala Pro Gly Lys Asp Ile Ala Phe Thr Glu Ala Leu

210 215 220

Arg Trp Tyr Ala Leu Gly Gly His Asn Met Lys Gly Val Phe Glu Leu

225 230 235 240

Ala Gly Val Tyr Lys Ile Gly Asn Gly Gly Met Thr Ser Phe Ala Arg

245 250 255

Ala Thr Lys Leu Gly Val Arg Val Thr Thr Arg Leu Gly Gln Glu Ile

260 265 270

Asn Ala Lys Tyr Val Val Ser Thr Ile Pro Leu Asn Cys Leu Ala Asp

275 280 285

Val Lys Phe Tyr Pro Pro Ile Ser Ser Ile Arg Gln Ser Ala Met Thr

290 295 300

Lys Gly His Ile Asn Lys Gly Ala Lys Ile His Phe Lys Leu Lys Ala

305 310 315 320

Ala Glu Pro Gly Trp Phe Val Thr Ala Asn Ser Ser Asp Ser Ala Tyr

325 330 335

Val Phe Ala Phe Ser Asp His Asn Gly Thr Arg Glu Ser Glu Pro Ser

340 345 350

Gly Thr Trp Cys Ile Gly Phe Gly Tyr Asn Gly Arg Leu Asp Asp Lys

355 360 365

Asn Asn His Arg His Ile Ile Asp Arg Phe Arg Lys Asp Ile Tyr Pro

370 375 380

Thr Gly Asp Val Glu Ala Tyr Val Thr His Asp Trp Val Asn Asp Pro

385 390 395 400

Tyr Ala Lys Gly Ala Trp Ala Cys Trp Gly Pro Gly Cys Ala Thr Ala

405 410 415

Tyr Leu Gln Glu Leu Gln Lys Pro His Gly Arg Val Ile Phe Ala Ser

420 425 430

Ala Asp Trp Ala Asp Gly Trp Arg Gly Phe Val Asp Gly Ala Ile Glu

435 440 445

Gln Gly His Gln Ala Ser Gln Cys Val Val Ala Ser Leu Lys Ser Glu

450 455 460

Thr Glu Thr Leu Arg Ser

465 470

Claims (3)

1. 一种单胺氧化酶AfMAO6-3，其特征在于其核苷酸序列为SEQ No.2所示，其氨基酸序列为SEQ No.3所示。

2.权利要求1所述的单胺氧化酶AfMAO6-3作为生物催化剂在转化

底物顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷生成(3AR,6AS)-六氢环戊二烯并[C]吡咯啉中的应用。

3.权利要求1所述的单胺氧化酶AfMAO6-3与化学亲核试剂通过不对称氧化与磺化反应相偶联，一锅法反应转化底物顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷生成(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-磺酸钠中间体的应用。