CN104178432A - 一种胶红酵母及其应用 - Google Patents
一种胶红酵母及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104178432A CN104178432A CN201410387866.2A CN201410387866A CN104178432A CN 104178432 A CN104178432 A CN 104178432A CN 201410387866 A CN201410387866 A CN 201410387866A CN 104178432 A CN104178432 A CN 104178432A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- concentration
- rhodotorula mucilaginosa
- rhodotorula
- methyl phenyl
- phenyl ketone
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种胶红酵母，它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCCNO:M2014255的胶红酵母WD-B5(Rhodotorula mucilaginosaWD-B5)。本发明还公开了利用前述胶红酵母将苯乙酮转化为(S)-苯乙醇的方法。本发明保藏号为CCTCC M2014255的胶红酵母WD-B5(Rhodotorula mucilaginosaWD-B5)可以高效地将苯乙酮转化为(S)-苯乙醇，克服了现有技术的缺陷，具有良好的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株胶红酵母及其应用，属于发酵领域。
背景技术
(S)-苯乙醇及其衍生物是合成多种手性药物如(S)-氟西汀、(S)-异丙肾上腺素等的重要中间体。为获得光学活性纯苯乙醇，应用最广的是化学催化不对称合成法，但是其存在反应条件剧烈，环境不友好的缺陷。近年来，生物催化法因反应条件温和、产物立体选择性高、对环境友好等优点成为获得光学活性产物的另一种有效途径。目前，生物催化法制备手性芳香酮的相关报道较多，但仍然无法实现工业化生产，主要原因是生产菌株催化活性不稳定、产物积累量不高及立体选择性较差。
朱冬眉等，“胶红酵母催化苯乙酮的不对称还原吸附树脂的促进作用”，《四川大学学报(自然科学版)》2009年06期中，报道了采用胶红酵母可以将苯乙酮转化为(S)-苯乙醇，产物纯度达99.0％，但是，转化率低，最高仅能达到75.5％。
发明内容
本发明提供了一种新的胶红酵母及其在将苯乙酮转化为(S)-苯乙醇中的应用。
本发明胶红酵母，它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCCNO:M 2014255的胶红酵母WD-B5(Rhodotorula mucilaginosaWD-B5)。
本发明胶红酵母WD-B5(Rhodotorula mucilaginosaWD-B5)，于2014年6月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其地址为：中国·武汉·武汉大学，保藏号为CCTCC M 2014255。
本发明将苯乙酮转化为(S)-苯乙醇的方法，包括如下步骤：
(1)取CCTCCNO:M 2014255的胶红酵母WD-B5(RhodotorulamucilaginosaWD-B5)，加水至菌体细胞的浓度达到0.2～0.3g/ml，调pH为6.8～7.2，加葡萄糖至浓度为1～3％(w/v)；
(2)加入底物苯乙酮至浓度为40～60mmol/L，在温度25～35℃的条件下反应至少24h，即可。
步骤(1)中，所述菌体细胞的浓度为0.25g/ml。
步骤(1)中，调节pH为7.0。
步骤(1)中，所述葡萄糖的浓度为2％(w/v)。
步骤(2)中，所述底物苯乙醇的浓度为50mmol/L。优选地，所述底物苯乙醇分两次添加，第一次添加的时间为反应0h时，添加的量为每1L溶液25mmol，第二次添加的时间为反应后第12h，添加的量为每1L溶液25mmol。
步骤(2)中，所述反应温度为30℃。
步骤(2)中，所述反应的时间为36h。
步骤(2)中，在添加底物苯乙酮时，同时添加助溶剂乙醇至浓度为1～3％(v/v)。优选地，所述乙醇浓度为2％(v/v)。
采用本发明胶红酵母在本发明转化条件下，能够高效地将苯乙酮转化成(S)-苯乙醇，转化率高达99％，转化获得的产物纯度(产物e.e.值)大于99％，工业应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1基于26S rDNA D1/D2区域序列构建的系统发育树
具体实施方式
实施例1 本发明胶红酵母WD-B5(Rhodotorula mucilaginosaWD-B5)的鉴定特征
1、鉴定方法
将5份微生物土壤及污水样品中分离得到的本发明菌株WD-B5，进行如下生理生化和分子生物鉴定。
(1)生理生化特征
利用显微镜及肉眼观察细胞及固体平板上的菌落形态，并根据《酵母菌的特征与鉴定手册》所列的酵母菌种鉴定方法进行生化特征分析。
(2)分子生物学鉴定
利用PCR技术，获得了酵母WD-B5的26SrDNA D1/D2区域基因的部分片断，利用BLAST软件将该序列与GenBank中收录的DNA序列进行比对，并与相关菌种构建进化树,初步鉴定菌株WD-B5的种属。
2、鉴定结果
(1)菌落特征和生理生化特征
菌落特征：粉红色、圆形、有光泽、边缘整齐、不透明、质地均匀、表面光滑、湿润。借助高倍荧光显微镜观察菌株WD-B5的革兰氏染色为阳性，未见菌丝体，细胞呈卵圆形。
生理生化特性见表1：
表1 菌株WD-B5的生理生化特性
(2)26SrDNA D1/D2区域序列分析
菌株WD-B5的26SrDNA D1/D2区域序列，见表2。由图1可知，菌株WD-B5与Rhodotorula mucilaginosa ATCC 32763(AF335986.1)的亲缘关系最近。
表2 菌株WD-B5的26SrDNA D1/D2区域序列
结合菌落特征、生理生化特征以及分子生物学鉴定结果，将本发明分离菌株WD-B5鉴定为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)，命名为胶红酵母WD-B5(Rhodotorula mucilaginosaWD-B5)，并于2014年6月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2014255。
实施例2 采用本发明胶红酵母WD-B5(Rhodotorula mucilaginosaWD-B5)将苯乙酮转化为(S)-苯乙醇的方法
1、实验材料
1、斜面培养基：
去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，ddH2O1000mL，pH自然。
2、种子培养基：
蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，ddH2O1000mL，pH7.0。
3、发酵培养基：
蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，(NH4)2SO45g，KH2PO42g，ddH2O1000mL，pH7.0。
4、实验菌株：本发明保藏号为CCTCC M 2014255的胶红酵母WD-B5(Rhodotorula mucilaginosaWD-B5)。
2、实验方法
(1)、菌体细胞的培养
种子培养：用无菌牙签从PDA斜面上挑取少量菌苔接种于20mL种子培养基中，30℃，170r/min，摇床培养24h。
发酵培养：按5％的接种量将种子液接入50mL发酵培养基中，30℃，170r/min，摇床培养48h。
收集菌体细胞：收集发酵液，于6000r/min，4℃，离心10min，将菌体沉淀用pH6.8的磷酸盐缓冲溶液洗1～2次后用于转化。
(2)、转化
a、取步骤(1)制得的胶红酵，加水至菌体细胞浓度为0.2g/ml，调pH为6.8，加葡萄糖至浓度为1％(v/v)；
b、往步骤a的溶液中加入底物苯乙酮在25℃的条件下反应24h，底物苯乙酮的添加方式：反应0h时，每1L溶液中加入20mmol苯乙酮，同时添加乙醇至浓度为1％(v/v)；反应12h时，每1L溶液中再加入20mmol苯乙酮。
实施例3 采用本发明胶红酵母WD-B5(Rhodotorula mucilaginosaWD-B5)将苯乙酮转化为(S)-苯乙醇的方法
1、实验材料
1、斜面培养基：
去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，ddH2O1000mL，pH自然。
2、种子培养基：
蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，ddH2O1000mL，pH7.0。
3、发酵培养基：
蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，(NH4)2SO45g，KH2PO42g，ddH2O1000mL，pH7.0。
4、实验菌株：本发明保藏号为CCTCC M 2014255的胶红酵母WD-B5(Rhodotorula mucilaginosaWD-B5)。
2、实验方法
(1)、菌体细胞的培养
种子培养：用无菌牙签从PDA斜面上挑取少量菌苔接种于20mL种子培养基中，30℃，170r/min，摇床培养24h。
发酵培养：按5％的接种量将种子液接入50mL发酵培养基中，30℃，170r/min，摇床培养48h。
收集菌体细胞：收集发酵液，于6000r/min，4℃，离心10min，将菌体沉淀用pH6.8的磷酸盐缓冲溶液洗1～2次后用于转化。
(2)、转化
a、取步骤(1)制得的胶红酵，加水至菌体细胞浓度为0.3g/ml，调pH为72，加葡萄糖至浓度为3％(v/v)；
b、往步骤a的溶液中加入底物苯乙酮在35℃的条件下反应48h，底物苯乙酮的添加方式：反应0h时，每1L溶液中加入30mmol苯乙酮，同时添加乙醇至浓度为3％(v/v)；反应12h时，每1L溶液中再加入30mmol苯乙酮。
实施例4 采用本发明胶红酵母WD-B5(Rhodotorula mucilaginosaWD-B5)将苯乙酮转化为(S)-苯乙醇的方法
1、实验材料
1、斜面培养基：
去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，ddH2O1000mL，pH自然。
2、种子培养基：
蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，ddH2O1000mL，pH7.0。
3、发酵培养基：
蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，(NH4)2SO45g，KH2PO42g，ddH2O1000mL，pH7.0。
4、实验菌株：本发明保藏号为CCTCC M 2014255的胶红酵母WD-B5(Rhodotorula mucilaginosaWD-B5)。
2、实验方法
(1)、菌体细胞的培养
种子培养：用无菌牙签从PDA斜面上挑取少量菌苔接种于20mL种子培养基中，30℃，170r/min，摇床培养24h。
发酵培养：按5％的接种量将种子液接入50mL发酵培养基中，30℃，170r/min，摇床培养48h。
收集菌体细胞：收集发酵液，于6000r/min，4℃，离心10min，将菌体沉淀用pH6.8的磷酸盐缓冲溶液洗1～2次后用于转化。
(2)、转化
a、取步骤(1)制得的胶红酵，加水至菌体细胞浓度为0.25g/ml，调pH为7.0，加葡萄糖至浓度为2％(v/v)；
b、往步骤a的溶液中加入底物苯乙酮在30℃的条件下反应36h，底物苯乙酮的添加方式：反应0h时，每1L溶液中加入25mmol苯乙酮，同时添加乙醇至浓度为2％(v/v)；反应12h时，每1L溶液中再加入25mmol苯乙酮。
(3)、转化率和纯度检测
按照体积比1:1的量向转化体系中加入乙酸乙酯，充分震荡后，静止2～3min，于6000r/min，4℃，离心10min，取上清液进行GC检测。
GC检测：使用GC-960气相色谱仪，HP Chiral 10％3-Cyclodextrin手性色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm)；检测条件：载气为氮气，进样器、色谱柱和FID检测器温度分别为220℃、110℃和200℃；分流比为1:100；进样量为0.1mL。分别以底物的转化率(Conversion)和产物的对映体过量值(e.e.value)表示反应的转化程度和立体选择性，其表达式如下：
Conversion(％)＝C苯乙醇/C0×100 (1)
e.e.(％)＝|(CR-Cs)|/(Cs+CR)×100 (2)
其中，C0为底物的初始浓度，C苯乙醇为反应终止时的产物浓度，CR和Cs分别为R-型和S-型产物的浓度。
3、实验结果
检测发现，采用本发明方法转化苯乙酮，最终获得的产物中，(S)-苯乙醇的e.e.值﹥99％，底物转化率为99％。
采用现有胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)转化苯乙酮，产物纯度达99.0％，但是，转化率低，最高仅能达到75.5％。
而采用本发明胶红酵母WD-B5(Rhodotorula mucilaginosaWD-B5)，在本发明转化条件下转化苯乙酮，产物纯度大于99％，转化率也高达99％，因此，在保证产物纯度的同时，有效提高了转化率。
综上，本发明胶红酵母WD-B5(Rhodotorula mucilaginosaWD-B5)可以高效转化苯乙酮，在制备得到纯度高的(S)-苯乙醇的同时，转化率也非常高，具有优良的应用前景。
Claims (10)
1.一种胶红酵母，其特征在于：它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCCNO:M2014255的胶红酵母WD-B5(RhodotorulamucilaginosaWD-B5)。
2.一种将苯乙酮转化为(S)-苯乙醇的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)取CCTCC NO:M2014255的胶红酵母WD-B5(RhodotorulamucilaginosaWD-B5)，加水至菌体细胞的浓度达到0.2～0.3g/ml，调pH为6.8～7.2，加葡萄糖至浓度为1～3％(w/v)；
(2)在步骤(1)的溶液中加入底物苯乙酮至浓度为40～60mmol/L，在温度25～35℃的条件下反应至少24h，即可。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述菌体细胞的浓度为0.25g/ml。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，调节pH为7.0。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述葡萄糖的浓度为2％(w/v)。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述底物苯乙醇的浓度为50mmol/L。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述底物苯乙醇分两次添加，第一次添加的时间为反应0h时，添加的量为每1L溶液25mmol，第二次添加的时间为反应后第12h，添加的量为每1L溶液25mmol。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
步骤(2)中，所述反应的温度为30℃；
步骤(2)中，所述反应的时间为36h。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，在添加底物苯乙酮时，同时添加乙醇至浓度为1～3％(v/v)。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述乙醇浓度为2％(v/v)。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410387866.2A CN104178432B (zh) | 2014-08-08 | 2014-08-08 | 一种胶红酵母及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410387866.2A CN104178432B (zh) | 2014-08-08 | 2014-08-08 | 一种胶红酵母及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104178432A true CN104178432A (zh) | 2014-12-03 |
| CN104178432B CN104178432B (zh) | 2017-01-11 |
Family
ID=51959783
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410387866.2A Active CN104178432B (zh) | 2014-08-08 | 2014-08-08 | 一种胶红酵母及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104178432B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111593044A (zh) * | 2019-02-20 | 2020-08-28 | 成都医学院 | 一种胶红酵母固定化细胞及其应用 |
| CN111621428A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-09-04 | 华南理工大学 | 一种高产苯乙醇的耐盐胶红酵母菌株及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101319194A (zh) * | 2007-10-24 | 2008-12-10 | 大连理工大学 | 具有新代谢特性的胶红酵母及其在生物降解中的应用 |
| CN102283280A (zh) * | 2011-06-21 | 2011-12-21 | 江苏大学 | 一种提高胶红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法 |
| CN102492633A (zh) * | 2011-12-02 | 2012-06-13 | 江南大学 | 具有降解氨基甲酸乙酯功能的胶红酵母及其在酒类及食品中的应用 |
| CN103409328A (zh) * | 2013-06-09 | 2013-11-27 | 江南大学 | 一株胶红酵母及其在染料降解脱色和类胡萝卜素生产中的应用 |
-
2014
- 2014-08-08 CN CN201410387866.2A patent/CN104178432B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101319194A (zh) * | 2007-10-24 | 2008-12-10 | 大连理工大学 | 具有新代谢特性的胶红酵母及其在生物降解中的应用 |
| CN102283280A (zh) * | 2011-06-21 | 2011-12-21 | 江苏大学 | 一种提高胶红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法 |
| CN102492633A (zh) * | 2011-12-02 | 2012-06-13 | 江南大学 | 具有降解氨基甲酸乙酯功能的胶红酵母及其在酒类及食品中的应用 |
| CN103409328A (zh) * | 2013-06-09 | 2013-11-27 | 江南大学 | 一株胶红酵母及其在染料降解脱色和类胡萝卜素生产中的应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 朱冬眉 等: ""不对称还原苯乙酮的酵母菌株筛选与分子鉴定"", 《微生物学通报》, vol. 35, no. 12, 31 December 2008 (2008-12-31) * |
| 朱冬眉 等: ""胶红酵母催化苯乙酮的不对称还原及吸附树脂的促进作用"", 《四川大学学报（自然科学版）》, vol. 46, no. 6, 30 November 2009 (2009-11-30) * |
| 李成 等: ""S-苯乙醇高产菌株的筛选及鉴定"", 《微生物学杂志》, vol. 33, no. 2, 30 April 2013 (2013-04-30) * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111593044A (zh) * | 2019-02-20 | 2020-08-28 | 成都医学院 | 一种胶红酵母固定化细胞及其应用 |
| CN111621428A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-09-04 | 华南理工大学 | 一种高产苯乙醇的耐盐胶红酵母菌株及其应用 |
| CN111621428B (zh) * | 2019-12-31 | 2022-02-22 | 华南理工大学 | 一种高产苯乙醇的耐盐胶红酵母菌株及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104178432B (zh) | 2017-01-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102791869A (zh) | 通过发酵的酸产生 | |
| CN103789368B (zh) | 一种n-保护哌啶醇的生产方法 | |
| CN101457211B (zh) | 一株肺炎克雷伯氏菌及其在制备2,3-丁二醇中的应用 | |
| CN107746861B (zh) | 一种(r)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的生物制备方法 | |
| CN102226159B (zh) | 一株阴沟肠杆菌及其在制备2，3-丁二醇中的应用 | |
| CN104946539A (zh) | 一株能够高产脂的卷枝毛霉及应用 | |
| CN103820346A (zh) | 一株酿酒酵母及其在发酵产乙醇中的应用 | |
| CN102080046A (zh) | 一株高产漆酶菌株及发酵产漆酶的方法 | |
| El-Dalatony et al. | Effect of sonication pretreatment on hydrogen and acetone-butanol-ethanol coproduction from Chlamydomonas mexicana biomass using Clostridium acetobutylicum | |
| CN103627698A (zh) | 乙偶姻高耐受性菌株的选育和用该菌株发酵生产乙偶姻 | |
| CN100558884C (zh) | 一种产酸克雷伯氏菌及其应用 | |
| CN104178432B (zh) | 一种胶红酵母及其应用 | |
| CN101597627B (zh) | 一种高分子γ-聚谷氨酸的生产方法 | |
| CN105969812A (zh) | 一种全细胞生物催化制备手性(s)-乙偶姻的方法 | |
| CN103525877B (zh) | 一种微生物发酵选择性生产3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇的方法 | |
| CN103781899B (zh) | 用酸预处理的生物质进行丁醇发酵 | |
| CN105274041A (zh) | 一株重组大肠杆菌及其在生产2-丁醇中的应用 | |
| CN104498510A (zh) | 产醛酮还原酶菌株、醛酮还原酶基因、载体、工程菌及应用 | |
| CN104711201A (zh) | 一种解脂耶氏酵母及其应用 | |
| CN105154411A (zh) | 微生物双加氧酶粗酶液及β-紫罗兰酮的制备方法 | |
| CN103589665A (zh) | 庆笙红球菌及其在制备(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用 | |
| CN107400646A (zh) | 一株高产丁醇梭菌及其筛选与应用 | |
| Mazaheri et al. | Bioethanol production performance in a packed bed solid-state fermenter: evaluation of operational factors and intermittent aeration strategies | |
| CN101824438A (zh) | 乙酰乙酸乙酯微生物转化制备(s)-3-羟基丁酸乙酯的方法 | |
| CN105018410A (zh) | 一种诱导三孢布拉氏霉老化菌株快速大量产孢的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |