CN101649329A

CN101649329A - 一种快速多菌种间透膜发酵的方法

Info

Publication number: CN101649329A
Application number: CN200910070382A
Authority: CN
Inventors: 鲁梅芳; 曹小红; 王春玲; 侯丽华
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2009-09-08
Filing date: 2009-09-08
Publication date: 2010-02-17

Abstract

本发明涉及一种快速多菌种间透膜发酵的方法，步骤是：(1)目标菌种的选择、活化与扩大培养；(2)透膜发酵装置的建立；(3)多菌种的共酵。通过本发明的方法可以得到多菌种发酵过程中主要微生物的最佳添加(繁殖与衰减)时间、添加量，能够有效地控制pH的变化，掌握总酸和还原糖等的变化规律，进而合理调整酿造工艺，充分发挥酱醪中各种酶的生物作用，协调发酵产品的口味，形成更多的风味物质，使中国的传统发酵食品得到真正传承和发展。

Description

一种快速多菌种间透膜发酵的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，涉及多菌种的共同发酵，尤其一种快速多菌种间透膜发酵的方法。

背景技术

在许多传统发酵食品生产过程中，由微生物的群居形成多菌、多酶组成共酵体系，多菌种或酶进行随时更替，协同发酵，人工的方法很难达到其发酵效果。以酱油发酵生产为例，酱油因其独特、浑厚、浓郁的风味而著称，在食品加工与调理过程中起着调整色、香、味、体的作用，营养全面而丰富，酱油的生产是以植物蛋白和碳水化合物为主要原料，经过微生物酶的作用，发酵水解生成多种氨基酸及各种糖类，并以这些物质为基础，再经过复杂的生物化学变化，形成具有特殊色泽、香气、滋味和体态的调味品，虽然对酱油的生产已有数千年的历史，但是对其中各菌种的具体作用以及他们之间化学协同作用过程还处于不断的研究阶段。

目前，日本的酱油生产主要以高盐稀态工艺为主，产品分为浓口酱油、淡口酱油、白酱油、甘露酱油等，其中以浓口酱油产量最大，其具有浓郁的酱香味和独特的醇香，体态澄清，久置无沉淀。从上世纪70年代开始，日本在设备更新、微生物研究、技术开发以及工艺改革等方面都有很大的发展，就国际市场而言，日本已确立了其在高档酱油市场中的地位。中国的酱油市场经过几轮的行业整合和国内、国际资本整合之后，已经从一个相对滞后的行业，大跨越地转型为激烈的市场竞争行业。随着消费的不断升级，市场竞争的加剧，酱油表现出向高档化发展的趋势，中高档市场容量在进一步扩大，品牌产品的市场份额进一步提高，随着国家对调味品行业的不断规范，产品的技术含量日益增强，产品质量得到进一步提高，但是与日本相比还存在一定的差距。

发明内容

本发明的目的是提供一种根据透析培养原理建立的快速多菌种间透膜发酵的方法，本方法可用于探索和研究自然发生并存在的多菌共酵体系中的生物及化学变化，并具有操作简便、技术可靠的特点。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种快速多菌种间透膜发酵的方法，方法的步骤是：

(1)目标菌种的选择、活化与扩大培养；

(2)透膜发酵装置的建立

将经过处理和检测的透析膜制成透析袋，将透析袋一端封住，另一端接在去掉底部的有盖离心管上以制成小发酵室，选择一容器作为大发酵室，将小发酵室置于大发酵室中，制成透膜发酵装置；

(3)多菌种的共酵

在透膜发酵装置的大、小发酵室中分别装入发酵液，在小发酵室中分别接入不同的目标菌种，置于目标菌种的最适温度下继续进行发酵，通过测定不同透膜发酵装置中菌种数量及发酵物质理化动态指标，然后比较各指标得到各菌种在共酵过程中的最佳添加量和添加时间，进而确定最佳的发酵条件。

而且，所述透析膜为再生纤维素透析膜。

而且，所述透析膜的检测方法为：先用0.1％美蓝、0.1％玫瑰红B、0.1％水溶性苯胺蓝分别测试，单项比例为4∶1，10分钟后吸取透析膜内的溶液，观察色素透过情况，然后测定葡萄糖半数透析时间ET50。

而且，所述测定葡萄糖半数透析时间ET50步骤为：取5％葡萄糖溶液加入烧杯中，透析膜内为蒸馏水单项透析比为4∶1，间隔0.5小时测定一次葡萄糖浓度。

而且，所述透膜发酵装置的透析比4∶1。

而且，所述菌种数量的测定方法分别为：乳酸菌计数用双层平板稀释倾注计数法，酵母计数用普通平板计数法、乳酸菌计数或双层平板计数法。

而且，所述发酵物质理化指标的动态分析包括发酵物质的pH、还原糖含量、总酸含量、乙醇含量以及有机酸含量变化分析。

本发明的优点和有益效果为：

1、本发明可以得到多菌种发酵过程中主要微生物的最佳添加(繁殖与衰减)时间、添加量，能够有效地控制pH的变化，掌握总酸和还原糖等的变化规律，进而合理调整酿造工艺，充分发挥酱醪中各种酶的生物作用，形成更多的风味物质，协调发酵产品的口味，使中国的传统发酵食品得到真正传承和发展。

2、本发明在合理选择透析膜基础上建立透膜发酵装置，采用透过分子量适宜的再生纤维素透析膜制成若干小发酵室，各小发酵室置于一大发酵室中，小发酵室分别接入不同的微生物后置于大发酵室在适宜的条件下发酵，其优点是各菌种能单独发酵，不干扰其营养物质和代谢产物的自由流通和相互融合，该装置还可有效探明多菌种发酵体系的各种微生物之间的生物量和主要代谢物的产量变化，发现其中各种微生物间的拮抗和协同调节作用，进而优化生产工艺、提高产品质量和出品率。

3、采用本发明的方法得到了酱油发酵过程中耐盐乳酸菌和酵母菌的最佳添加时间与添加量，具体为在高盐稀态酱醪发酵前期添加耐盐乳酸菌和T酵母，中前期添加S酵母，前期乳酸菌可以促进T酵母的生长，后期可以与S酵母相互促进，添加耐盐乳酸菌能有效控制pH值的下降，有利于酱醪中蛋白酶对原料蛋白类的分解，其中还原糖的变化呈平缓下降的趋势、酒精含量呈平稳上升的趋势，经过调节最终得到风味丰富的成熟酱醪。

附图说明

图1为本发明耐盐乳酸菌细胞形态照片(20×40倍，放大800倍)；

图2为本发明T酵母细胞形态照片(20×40倍，放大800倍)；

图3为本发明S酵母细胞形态照片(20×40倍，放大800倍)；

图4为本发明多菌种透膜发酵装置；

图5为本发明空白对照气相色谱图；

图6为本发明添加耐盐乳酸菌气相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

需要首先说明的是：本实施例以生产酱油的过程为例来说明本多菌种间透膜发酵方法的实施，采用耐盐乳酸菌、T酵母和S酵母等优良菌株为发酵菌株，上述菌种均由天津科技大学菌种保藏中心提供，同时本方法不仅限于酱油生产，也适合其它多菌共酵的发酵生产，进行菌种间最佳发酵条件的探索。

一种快速多菌种间透膜发酵的方法：

(1)目标菌种的选择、活化与扩大培养

①耐盐乳酸菌的扩大培养

菌种→活化培养10mL/管30℃48h→扩大培养以5％的接种量200mL/300mL三角瓶30℃培养24h)，其形态见图1。

②耐盐酵母的扩大培养(包括T、S酵母)

试管菌种→斜面活化培养30℃48h)→一级培养10mLYEPD液体培养30℃培养24h→二级振荡培养100mL/250mL三角瓶，接种量为10％，30℃培养20h→三级振荡培养200mL/500mL三角瓶，接种量为10％，30℃培养16h，其形态见图2、3。

(2)透膜发酵装置的建立

①透析膜的处理

将分子量为8000-14000道尔顿的再生纤维素透析膜置于500mL含1mmol/LEDTA-Na₂(乙二胺四乙酸二钠pH8.0)的2％碳酸氢钠溶液中煮沸10min后，再经蒸馏水煮沸、漂洗后即可使用。

②透析膜(袋)通透性的测定

用0.1％美蓝(分子量373)，0.1％玫瑰红B(分子量479)，0.1％水溶性苯胺蓝(分子量737)分别测试，单项比例为4∶1，10分钟后吸取透析膜内的溶液，观察色素透过情况。

③葡萄糖半数透析时间(ET50)的测定

取5％葡萄糖溶液加入烧杯中，透析膜内为蒸馏水单项透析比为4∶1，间隔0.5小时测定一次葡萄糖浓度，经测定葡萄糖半数透析时间(ET50)为1小时40分钟。

④透膜发酵装置的制作

将透析袋一端封住，另一端接在去掉底部的有盖离心管上，制成小发酵室，选择适当的容器作为大发酵室，其中包含四个小发酵室，制成透析比4∶1的透膜发酵装置，见图4。

(3)多菌种的共酵

本实施例中为耐盐乳酸菌与S、T酵母菌的共酵

①在5组透膜发酵装置中分装入发酵酱醪汁后，在小发酵室内按照设定的时间分别接种目的菌，置于目的菌种的最适温度下继续进行发酵，通过以下方法有效评价与分析，得到各菌在发酵中的最佳添加量和添加时间。

将高盐稀态前期发酵酱醪，均匀分装5个容器中，模拟生产发酵条件，放到15℃的生化培养箱让其发酵，每天搅拌一次，到酱醪发酵的15d，添加菌种，其中耐盐酵母的加入量均为10⁶个/mL，耐盐乳酸菌的添加量均为10⁴个/mL。每周二、周五搅拌两次，此后，每天将温度提升1℃，到酱醪发酵30d温度达到并保持在30℃，到发酵90d左右酱醪发酵温度控制在25℃直到发酵结束，整个发酵周期为180d，添加的时间和顺序如下：

1号样品为发酵的第15d添加T酵母、发酵的第45d添加S酵母；2号※样品(注：※标记为最佳工艺)为发酵的第15d同时添加耐盐乳酸菌和T酵母、发酵的第45d添加S酵母；3号样品为发酵的第15d添加耐盐乳酸菌、第30d添加T酵母、发酵的第45d添加S酵母；4号样品为发酵的第15d添加T酵母、第30d添加耐盐乳酸菌、发酵的第45d添加S酵母；5号样品添加方法为发酵的第15d添加耐盐乳酸菌。

②酵母菌与乳酸菌生长速率评价

酵母计数以普通平板计数法；乳酸菌计数以双层平板稀释倾注计数法分别计数，酵母计数：普通平板计数法、乳酸菌计数、双层平板计数法。

③理化指标的检测及最佳工艺的生产条件的确定

pH的测定，还原糖含量的测定，总酸含量的测定，乙醇含量的测定均采用常规分析方法。

有机酸的测定采用高效液相色谱方法，条件为：色谱柱：Hydrosphere C18 250×4.6mmI.D，流动相：0.02mol/L KH₂PO₄(磷酸调pH为3.0)，检测波长：215nm，流速：0.5mL/min，进样量：20μL。

15种主要风味物质生成量比较：发酵结束后各样品主要风味物质的气相色谱测定，结果表明，各个样品检测出的主要风味物质略有不同，特色风味物质的含量差异较大，只有2号※样品中的这些物质比例相对协调合理，它不但含有突出的特色味道更赋予产品浓郁的酒香气和酯香气，统计图谱中已知峰和未知峰数量，也可以明显看出，香气总数也是2号※样品最多为127种，见附图5、6，以及表1、2。

(4)检测结果为：耐盐乳酸菌、S、T酵母菌在酱醪发酵中的生物量动态曲线及pH值、总酸、氨基态氮、还原糖、酒精、无盐固形物等理化指标的动态曲线均表明2号※样品为最佳，即菌种最佳添加时间为：在高盐稀态酱醪前期发酵15d添加耐盐乳酸菌和T酵母；中前期45d添加S酵母为最佳，最佳添加量为：发酵前期酱醪汁中添加耐盐乳酸菌为10⁴个/mL，分别添加耐盐T酵母和S酵母10⁶个/mL。

耐盐乳酸菌的添加有效控制了pH值的下降，且始终保持在4.8以上，还原糖的变化呈平缓下降的趋势、酒精含量呈平稳上升的趋势。

表1发酵结束的酱醪主要风味物质的含量(mg/100g)

表2发酵结束各样品产香气总数

Claims

1、一种快速多菌种间透膜发酵的方法，其特征在于：方法的步骤是：

(1)目标菌种的选择、活化与扩大培养；

(2)透膜发酵装置的建立

(3)多菌种的共酵

2、根据权利要求1所述的一种快速多菌种间透膜发酵的方法，其特征在于：所述透析膜为再生纤维素透析膜。

3、根据权利要求1所述的一种快速多菌种间透膜发酵的方法，其特征在于：所述透析膜的检测方法为：先用0.1％美蓝、0.1％玫瑰红B、0.1％水溶性苯胺蓝分别测试，单项比例为4∶1，10分钟后吸取透析膜内的溶液，观察色素透过情况，然后测定葡萄糖半数透析时间ET50。

4、根据权利要求3所述的一种快速多菌种间透膜发酵的方法，其特征在于：所述测定葡萄糖半数透析时间ET50步骤为：取5％葡萄糖溶液加入烧杯中，透析膜内为蒸馏水单项透析比为4∶1，间隔0.5小时测定一次葡萄糖浓度。

5、根据权利要求1所述的一种快速多菌种间透膜发酵的方法，其特征在于：所述透膜发酵装置的透析比4∶1。

6、根据权利要求1所述的一种快速多菌种间透膜发酵的方法，其特征在于：所述菌种数量的测定方法分别为：乳酸菌计数用双层平板稀释倾注计数法，酵母计数用普通平板计数法、乳酸菌计数或双层平板计数法。

7、根据权利要求1所述的一种快速多菌种间透膜发酵的方法，其特征在于：所述发酵物质理化指标的动态分析包括发酵物质的pH、还原糖含量、总酸含量、乙醇含量以及有机酸含量变化分析。