CN107653190A - 一种能在培养基上简单高效筛选产绿原酸菌株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于次级代谢产物‑绿原酸研究技术领域，具体涉及一种能在培养基上简单、快速、高效筛选产绿原酸菌株的方法。本发明选取红薯、杜仲、金银花、山茶花、红腺忍冬、薄荷、腺叶桂樱等植物作为主要研究对象，利用该方法在不同植物中筛选，共获得了内生菌11株，其中，能产生绿原酸等次生代谢物10株，筛选效率为91％。此方法与高效液相色谱法对比，具有省时省力、简单、快速、低成本、高效率等优点。本发明原理可以类推到其他产生次生代谢物菌株的筛选中，应用前景广泛。

Description

一种能在培养基上简单高效筛选产绿原酸菌株的方法

技术领域

本发明属于次级代谢产物-绿原酸研究技术领域，涉及一种能在培养基上简单高效筛选产绿原酸菌株的方法。

背景技术

1891年，Kossel明确提出植物次生代谢物的概念，以初生代谢的中间产物作为起始物，释放能量。植物次生代谢产物种类繁多，结构迥异，根据结构式及其性质主要分为酚类、萜类以及含氮化合物。虽然次生代谢产物并不是细胞生命活动或植物生长发育所必需的，但在植物生长过程中却有助于提高植物适应外界环境的能力，比如在植物抗病害、抗逆境和抗动物危害等方面发挥着关键作用。

绿原酸(Chlorogenic acid，CGA)是植物体有氧呼吸过程中经过莽草酸及苯丙酸途径产生的重要的次生代谢物，广泛存在于高等双子叶植物和蕨类植物中。它是由咖啡酸(Caffeic acid)和奎宁酸(Quinic acid)脱水缩合成3-O- 咖啡酰奎宁酸(3-O-caffeoylquinic acid)，分子式为C₆H₁₈O₉，属于多酚有机酸。绿原酸的药效功能突出，主要涉及抗氧化清除自由基，显著提高谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)的活性；抑菌、抗肿瘤，明显抑制人乳腺癌细胞系(MCF-7)增殖，使细胞停滞于G0/G1期。此外，绿原酸还是一种新型高效抗氧化剂，且抗氧化稳定性强、增香保色效果明显。因此，在食品行业中已部分取代了人工合成的抗氧化剂及防腐剂。由于绿原酸具有光化学活性，易发生光降解反应，紫外吸收能力强，较多应用在化妆品防晒领域。

鉴于绿原酸在医药保健、食品保鲜、日用化工等方面具有的广泛应用价值，市场对于绿原酸的需求量越来越大，而目前主要从杜仲、金银花等药用植物中提取获得。由于植物中绿原酸含量受植物种类、组织、生产季节、外界环境等条件的影响。因此，绿原酸的生产受到限制性因素较多，产量不稳定。在真菌和细菌中也存在莽草酸途径，从微生物中筛选高效产绿原酸的菌株，优化条件后采用发酵的方法生产绿原酸是一种具有潜在应用前景的方法。目前，绿原酸的定性定量技术主要包括分光光度法，其操作简便，对仪器要求低，易受其它结构类似物的干扰，检测结果不够准确；薄层－紫外分光光度法，结合显色剂使绿原酸在特定波长下有荧光吸收，以此定性定量，较好的排除杂质干扰，检测结果较为准确；高效液相色谱法，其分离效果显著、线性关系好、检测极限低、回收率与精密度高，耗费较高；气相色谱法，灵敏度高，重现性好，但酯化温度太高，操作繁琐，费用较高；以上方法适用于少量绿原酸菌株的验证工作，不适于大量的筛选工作，但从环境中发掘产绿原酸菌株涉及的筛选工作量大、工作耗时多、实验耗费高，因此，急需开发一种简单、快速、低成本筛选产绿原酸菌株的方法。

多酚类化合物含有多个酚羟基，具有较强的酸碱缓冲能力，且还原性强，可作为多基配体与金属离子如Fe³⁺，Al³⁺，Pb²⁺，Cu²⁺等络合，形成环状螯合络合物。绿原酸属于多酚类化合物，且结构式中存在邻二酚羟基，理论上可以与金属离子发生显色螯合反应。据报道，在酸性土壤中的铝离子和入侵植物根系分泌的绿原酸形成的复合物能够抑制其它植物的生长；在碱性条件下，绿原酸与铝离子形成稳定的紫红色复合物，并在530nm波长下，产生特征吸收光谱。

基于这几点，本发明利用绿原酸特殊化学结构，根据特有基团之间的反应设计和选择新的培养基配方，使其可以直接在培养基上进行显色筛选，提高筛选效率。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种能在培养基上简单、高效筛选产绿原酸菌株的新方法，该方法是一种新型、简单、快速、高效的筛选方法，大幅度降低筛选成本及时间，可应用于产植物次生代谢物绿原酸的菌株筛选。

本发明所提供的技术方案是：

一种能在培养基上简单高效筛选产绿原酸植物内生菌的方法，包括如下步骤：

(1)取样：采集植物样本，做好标记，分装于样品袋中，于4℃冰箱保存；

(2)初筛：采用组织块法，取采集的植物叶片样品在75％酒精中灭菌 60～90s数次，用无菌水冲洗多次，再在5％次氯酸钠溶液中表面消毒30s，消毒处理后的样品用无菌剪刀剪切至3-5cm大小方块，将其分别接种到改良培养基的平板上，于恒温培养箱中培养。培养期间，观察培养基颜色变化，如有菌落将培养基染成紫红色，则初步认为该菌株是产生绿原酸的菌株。

作为优选，步骤(2)中所述的改良牛肉膏蛋白胨固体培养基(下称①号培养基)为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、Al³⁺0.75mmol，用蒸馏水定容到1L，pH值调为7.2-7.4。

作为优选，步骤(2)中所述的改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基(下称②号培养基)为：马铃薯浸出粉300g、葡萄糖20g、氯霉素0.1g、琼脂15g、 Al³⁺0.75mmol，用蒸馏水定容到1L，pH值调为6.0-7.0。

本发明还提供了所述的能在培养基上简单高效筛选产绿原酸植物内生菌的方法在筛选土壤微生物产绿原酸菌株中的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明方法采用的植物样本来自广西壮族自治区广西中医药大学、药用植物园和广西大学校内。将采集的不同植物样本，按组织块法进行筛选分离，得到具有产绿原酸的微生物。

(2)本发明的方法与高效液相色谱法对比，具有省时省力、简单、低成本、高效率等优点。本发明的原理可以类推到其他产次生代谢物的菌株的筛选中，应用前景广泛。

(3)本发明还提供一种显色筛选产绿原酸的菌株的培养基配方，具体如下：

①号培养基(牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、Al³⁺0.75 mmol，用蒸馏水定容到1L，pH 7.2-7.4)；

②号培养基(马铃薯浸出粉300g、葡萄糖20g、氯霉素0.1g、琼脂15 g、Al³⁺0.75mmol，用蒸馏水定容到1L，pH 6.0-7.0)；

③号培养基(牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、Al³⁺0.75mmol，用蒸馏水定容到1L，pH7.2-7.4)；

④号培养基(马铃薯浸出粉300g、葡萄糖20g、氯霉素0.1g、Al³⁺0.75 mmol，用蒸馏水定容到1L，pH 6.0-7.0)。

附图说明

图1为绿原酸与Al³⁺反应机理；

图2为不同Al³⁺浓度对改良培养基凝固状态的影响；

图3为不同Al³⁺浓度对显色圈直径大小的影响；

图4为产绿原酸菌株在改良液体培养基中的显色反应；

图5为部分筛选菌株的薄层层析(TLC)色谱分析；

图6为部分筛选菌株(N2-1、S2-16)的高效液相色谱分析和部分筛选菌株(N2-1、S2-16)加标高效液相色谱分析；

其中：a和d均为绿原酸标准品；b-菌株N2-1；c-菌株S2-16；e-菌株 N2-1(加标)；f-菌株S2-16(加标)；

图7为绿原酸标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：产绿原酸(Chlorogenic acid，CGA)菌株的分离

产绿原酸(Chlorogenic acid，CGA)菌株的分离包括培养基配制，取样，初筛，复筛四个步骤，具体如下：

1.1培养基配制

牛肉膏蛋白胨培养基和改良牛肉膏蛋白胨培养基的①号、③号培养基配方(表1，)，马铃薯葡萄糖琼脂培养基和改良马铃薯培养基的②号、④号培养基配方(表2)如下，且实验所用培养基均用蒸馏水配制，用高压湿热灭菌法 121℃，20min。

表1牛肉膏蛋白胨培养基和改良的①号、③号培养基配方

表2马铃薯葡萄糖琼脂培养基和改良的②号、④号培养基配方

1.2取样

本发明用于分离产绿原酸的植物样品来自广西壮族自治区广西中医药大学、药用植物园和广西大学校内，采集植物样本，做好标记，分装于样品袋中，于4℃冰箱保存。

1.3初筛

取植物叶片用无菌水清洗，无菌滤纸擦拭干净，紫外照射30min，之后用75％酒精无菌消毒60s-90s，无菌水清洗酒精残留，5.0％次氯酸钠消毒30 s，无菌水清洗次氯酸钠残留，无菌滤纸擦拭干净，吹干剪切成3～5cm大小小块，切口接触培养基均匀平铺于①号培养基和②号培养基上，分别于37℃的培养箱中倒置培养24h和28℃的培养箱中倒置培养5d，然后观察培养基颜色变化，若有菌落将培养基染成紫红色，则认为该菌株可能是产生绿原酸的菌株。

选取将培养基染成紫红色的菌落，分别在①号培养基和②号培养基连续划线分离，传几代之后，再次分别在①号培养基和②号培养基上进行三点培养，确定产绿原酸的稳定性，选取产绿原酸较为稳定的菌株，按1:1比例加入 50％甘油于-80℃保藏。

1.4复筛

将①号培养基初筛的各菌株用接种环分别接种到③号液体培养基中， 37℃，200rpm，培养24h；②号培养基初筛的各菌株用接种环分别接种到④号液体培养基中，28℃，140rpm，培养5d；再各取菌液1mL接种到装有 100mL的③号液体培养基的三角瓶中，每个菌株设置三个重复摇瓶，不接种任何菌的设为对照，置于37℃摇床200rpm培养24h；同时取菌液1mL接种到装有100mL的④号液体培养基的三角瓶中，每个菌株设置三个重复摇瓶，不接种任何菌的设为对照，置于28℃摇床140rpm培养5d；观察各菌株液体培养颜色变化，并取各菌株样品测定发酵液中绿原酸的含量，从中筛选出产绿原酸能力较强的菌株。

实施例2：高效筛选产绿原酸(Chlorogenic acid，CGA)菌株的方法比较

2.1高效筛选方法建立

绿原酸属于有机羧酸类物质，在碱性条件下，其与铝离子可以产生稳定的紫红色络合物。利用绿原酸化学结构中特殊基团反应，改进筛选培养基，通过培养基上特殊颜色反应筛选产绿原酸的菌株，本发明设计一种新型的筛选培养基，通过颜色反应筛选产生绿原酸的菌株；同时，薄层层析法(TLC) 初步定性，高效液相色谱法精确定性定量。

本发明对铝离子添加量及培养基凝固状态进行探索，结果表明，Al³⁺浓度过高会对培养基凝固状态产生影响(见表3、图2)，即对培养基pH产生影响；低浓度Al³⁺添加量培养基呈现乳白色固体状态，筛选过程中培养基会产生紫红色变化，且不同添加量颜色反应速率不同，高浓度Al³⁺添加量培养基呈现半凝固或不凝固状态(见表3、图2)，故选择0.05mg/L和0.1mg/L Al³⁺添加量进行下一步研究。

表3不同Al³⁺浓度对改良培养基凝固状态的影响

注：“--”表示无颜色反应。

选择含0.05mg/L和0.1mg/L浓度的Al³⁺培养基筛选产绿原酸的菌株。结果表明：筛选过程中显色速率及颜色变化有较大差异，在0.05mg/L浓度的 Al³⁺培养基上显色较慢且颜色较浅，而在0.1mg/L浓度的Al³⁺培养基上显色较快且颜色较深(见图3)；且在含有不同Al³⁺浓度的改良培养基中，菌株显色扩散直径不同，即速率有差异，这可能与菌株产生绿原酸的量有关(见表 4)。

表4不同Al³⁺浓度对不同培养时期的菌株显色圈直径(cm)大小的影响

注：“--”表示无颜色反应。

为进一步确定筛选的菌株与改良培养基发生颜色反应，将筛选的微生物接种到改良液体培养基中，结果表明：筛选获得的微生物在改良液体培养基中培养4天后，呈现出紫红色颜色反应(见图4)，这说明改良的培养基可以应用到后续研究中。

2.2绿原酸的浸提

选取筛选到的菌株进行摇床培养，发酵培养5d，调节发酵液的pH至4.0 ～5.0，以保持绿原酸的稳定性。再利用细胞破碎仪，超声破碎细胞30min，以释放细胞内容物，之后离心取上清液1mL，按照1：1比例加入75％乙醇静置5h，用旋转蒸发仪45℃真空浓缩30min，以加快液质转化从而加快提取效率。再加入等体积乙酸乙酯萃取3次，每次取乙酸乙酯层真空浓缩至几乎干，加入色谱甲醇完全溶解，用0.22μm有机滤膜过滤，除去样品中的不溶物制备成待测样品溶液。

2.3薄层色谱(TLC)初步定性

将制备的待测样品溶液利用薄层层析法初步定性及高效液相色谱法准确定性。取硅胶薄层板数块，贮于干燥器中备用；绿原酸分子中含有羧基和邻二酚羟基，具有极强的酸性，调整展开剂配比，按照乙酸乙酯：水：甲酸：甲苯80:10:9:5比例配置好展开剂，倒入长方形层析缸中，盖好，来回振荡后放置于通风橱中，用微量注射器取1.0mg/mL绿原酸甲醇溶液和待测样品溶液3μL点样于同一硅胶薄层板上，将其放于层析缸中展开，若展开剂的前沿达到硅胶薄层板上沿约2cm时取出薄层板，自然晾干其表面的展开剂溶液，用显色剂(1％铁氰化钾和1％三氯化铁溶液)喷雾显色，至斑点清晰。观察出现的蓝色斑点(图5)，并进行测量和计算斑点的R_f值(见表5)，用于定性分析。

标准曲线的绘制，分别吸取1mg/mL的绿原酸标准溶液储藏液0、100、 200、400、500、600、800μL于2mL比色管中，分别加入NaOH调节pH，甲醇定容到1mL。静置5-10mim显色后，即得0，0.1，0.2，0.4，0.5，0.6， 0.8μg/mL绿原酸标准溶液，与待测溶液同时在高效液相色谱仪测定峰面积，读出数值。以测得峰面积S为纵坐标，保留时间Time为横坐标，在Excel中绘制成标准曲线。根据标准曲线和样品的峰面积和峰高，即可获得菌株培养液中绿原酸的含量。

表5产绿原酸菌株发酵液的比移值R_f

2.4高效液相色谱准确定性

样品按照绿原酸浸提方法制备成待测样品溶液。

HPLC：色谱柱：Waters C18column(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：0.5％甲酸：乙腈(90：10，V/V)；流速：1.0mL/min；检测波长：327nm；柱温：35℃；进样量：10μL。进一步准确对筛选菌株产绿原酸定性，选择高效液相色谱技术。高效色谱法性能较佳，选择性专一，灵敏度较高，测定样品的准确度较高；按照以上方法进行HPLC测定，其精密度实验中计算绿原酸峰面积得RSD 2.34％，表明仪器的精密度良好；稳定性实验中计算绿原酸峰面积得RSD1.37％，表明该溶液在24h内是稳定的；重复性实验峰面积 RSD 1.18％，即该方法重复性良好；加标回收率达到96.98％，RSD 3.2％；准确制作绿原酸标准品标准曲线(见图7)，样品按照上述浸提方法浸提绿原酸，制备成待测样品溶液，进行高效液相色谱法测定(见图6)。

高效液相色谱法测定结果表明，绿原酸标准品保留时间为13.3761min，样品B1-4保留时间为13.2601min，样品N2-20保留时间为13.6687min，样品N2-1保留时间为13.2743min，样品S2-16保留时间为13.2578min；样品保留时间与绿原酸标准品保留时间基本一致，故样品可能产生绿原酸。为避免高效液相色谱仪因环境、操作、流动相等因素产生较大误差及假阳性情况，本发明在样品测定结束，重新加标(加入一定量绿原酸标准品)测定，样品加标后高效液相色谱结果进一步说明利用改良培养基筛选到的菌株产生绿原酸(见图6)。

接下来，利用七种植物的组织样品，对建立的改良培养基的筛选方案进行验证，评价建立的筛选方案的可靠性。

选择基础培养基和改良培养基分别进行产绿原酸内生菌的筛选，将筛选到的菌株分别利用高效液相色谱法进行定性分析。结果表明：设计的改良培养基特异性强、灵敏度高，筛选到的菌株几乎全部为产绿原酸的菌株，在不同植物中平均筛选效率达到了95.24％(见表6)。而基础培养基上筛选到的菌株较多，将其逐一进行高效液相色谱分析，平均筛选效率只有3.98％(见表6)。因此，本发明建立的筛选培养基具有简单、快速、高效、低成本等优点，该方法的建立将推动微生物发酵法产生绿原酸的研究和应用。

表6利用改良培养基筛选产绿原酸菌株的效率分析

实施例3：微生物生产绿原酸含量的测定

3.1高效液相色谱定量

根据以上建立的筛选方案，利用高效液相色谱法建立绿原酸标准曲线(图 7)，再对筛选获得的部分菌株分别定量分析，结果发现获得菌株产生绿原酸的量分别为0.70mg/L、0.67mg/L、1.87mg/L、2.16mg/L、5.43mg/L、13.04mg/L 等。这些菌株产生绿原酸的量相对之前报道过的产绿原酸菌株来说，产量相对较高。通过发酵条件及产物浸取方法优化，提高产量，为后期的工业化生产提供可能。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (4)

1.一种能在培养基上简单高效筛选产绿原酸菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取样：采集植物样本，做好标记，分装于样品袋中，于4℃冰箱保存；

(2)初筛：采用组织块法，取采集的植物叶片样品在75％酒精中灭菌60～90s数次，用无菌水冲洗多次，再在5％次氯酸钠溶液中表面消毒30s，消毒处理后的样品用无菌剪刀剪切至3-5cm大小方块，将其分别接种到改良的牛肉膏蛋白胨固体培养基和马铃薯固体培养基的平板上，再分别将其置于37℃恒温培养箱中培养12h和28℃恒温培养箱中培养5d，培养期间，观察培养基颜色变化，如有菌落将培养基染成紫红色，则初步认为该菌株为产生绿原酸的菌株。

2.根据权利要求1所述的能在培养基上简单高效筛选产绿原酸植物内生菌的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的改良牛肉膏蛋白胨固体培养基为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂20g、Al³⁺0.75mmol，用蒸馏水定容到1L，pH值调为7.2-7.4。

3.根据权利要求1所述的能在培养基上简单高效筛选产绿原酸植物内生菌的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基为：马铃薯浸出粉300g、葡萄糖20g、氯霉素0.1g、琼脂15g、Al³⁺0.75mmol，用蒸馏水容到1L，pH值调为6.0-7.0。

4.根据权利要求1所述的能在培养基上简单高效筛选产绿原酸植物内生菌的方法在筛选土壤微生物产绿原酸菌株中的用途。