CN114703091B - 一株高产绿原酸菌株及其应用 - Google Patents

一株高产绿原酸菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高产绿原酸菌株，命名为烟草肠杆菌(Enterobactertabaci)AU‑34，保藏号为CCTCC M 2022127。本发明通过紫外和ARTP对特定的烟草肠杆菌复合诱变获得烟草肠杆菌AU‑34，通过优化培养基，其中以玉米浆作为氮源，并且优化发酵条件，大大提高了绿原酸产量，其最高可达136.49mg/L，为后期工程菌的构建以及工业中的大规模生产提供了良好的基础。

Description

一株高产绿原酸菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一株高产绿原酸菌株及其应用。
背景技术
绿原酸(Chlorogenic acid，CGA)，是植物经过莽草酸途径产生的一种酚类化合物，由咖啡酸(Caffeic acid)和奎尼酸(Quinic acid)缩合而成。它主要存在于多种名贵的中药材中，例如金银花及杜仲等。因为绿原酸具有多种生物活性，如抑菌抗病毒、抗氧化、抗癌、降脂降糖等，被广泛应用于医药、化工、食品、农业等领域。
在医药领域中，大量的研究表明绿原酸对于肿瘤、癌症、神经退行性疾病、皮肤疾病、骨质疏松症、关节软骨缺损以及肥胖等疾病的治疗均表现出较好的疗效。在农业领域中，绿原酸既可以杀菌又可以作为杀虫剂。此外，绿原酸在化工领域中也表现出巨大的应用潜力，它通过调节谷胱甘肽等抗氧化酶基因的活性起到抗衰老及改变生理年龄的功能。并且近年来也发现绿原酸能够在植物以及海产品保存方面发挥作用。
目前绿原酸的主要来源是植物，主要存在于忍冬科，菊科蒿属等植物中，其中金银花和杜仲的绿原酸含量较高。但是从植物体提取绿原酸，其产量和质量难免会受到植物的遗传性、生长条件、收获时间及贮藏和运输等因素所影响，使得其应用于工业生产会面临巨大的挑战。近年来，随着第一株产紫杉醇的植物内生真菌被分离出来，利用微生物发酵产紫杉醇以及绿原酸等次生代谢产物受到了国内外的关注。但是一般从自然界分离的野生型菌株产量都比较低，因此通过诱变育种，发酵优化等手段提高微生物产绿原酸产量成为值得研究的问题。
发明内容
本发明是基于现有技术中野生型菌株绿原酸产量较低，通过诱导突变的方式得到一株提高绿原酸产量的菌株。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一株高产绿原酸菌株，命名为烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)AU-34，保藏号为CCTCC M 2022127，保藏日期：2022年02月18日，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号中国典型培养物保藏中心。
如上所述高产绿原酸的菌株在提高绿原酸产量中的应用。
如上所述高产绿原酸的菌株在提高绿原酸产量中的应用，操作方法为：将所述高产绿原酸的菌株置于基础培养基中培养至对数期，以体积百分比1％的接种量置于发酵培养基中175-200rpm，30-40℃条件下培养7天，所得发酵液加入浸提剂浸提，然后浓缩，即得，HPLC测定绿原酸产量。
作为优选，所述的发酵培养基为：果糖10-50g/L，玉米浆40-140g/L，MnSO4 0.2-0.4g/L，L-Tyr 0.2-2g/L，VB1 3-5g/L，CaCO3 1-9g/L，Tween800.02％-0.1％，蒸馏水作为溶剂，pH＝6.5-7.5，装液量75-85mL/250mL锥形瓶，即250mL锥形瓶加入75-85mL的相应液体培养基。
作为优选，所述的发酵培养基为：果糖31.06g/L，玉米浆124g/L，MnSO40.1g/L，L-Tyr 0.1g/L，VB1 3mg/L，CaCO3 3mg/L，Tween80 0.05％，蒸馏水作为溶剂，pH＝7，装液量80mL/250mL锥形瓶，即250mL锥形瓶加入80mL的相应液体培养基。
作为优选，所述的浸提剂为体积浓度为75％的乙醇溶液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益的技术效果：
本发明通过紫外和ARTP对特定的烟草肠杆菌复合诱变获得烟草肠杆菌AU-34，通过优化培养基，其中以玉米浆作为氮源，并且优化发酵条件，大大提高了绿原酸产量，其最高可达136.49mg/L，为后期工程菌的构建以及工业中的大规模生产提供了良好的基础。
保藏信息说明
烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)AU-34于2022年02月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2022127。
附图说明
图1为烟草肠杆菌菌株形态的扫描电镜图；其中(A)为出发菌株烟草肠杆菌N22，(B)为本发明诱变所得烟草肠杆菌AU-34，(A)和(B)放大倍数均为80000倍。
图2为烟草肠杆菌ARTP诱变致死曲线。
图3为烟草肠杆菌紫外诱变致死曲线。
图4为烟草肠杆菌AU-34遗传稳定性。
图5为不同培养条件对于绿原酸产量和菌体干重的影响图。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例中采用的出发菌株烟草肠杆菌为广西大学植物基因工程实验室保存的烟草肠杆菌N22菌株。
实施例中采用的基础培养基是牛肉膏蛋白胨培养基，配方组成为：牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，pH＝7.2-7.4；
筛选培养基为：牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 5.0g/L、琼脂20.0g/L、AlCl30.1g/L，pH＝7.2-7.4；
实施例1
烟草肠杆菌N22的诱变
1.1试验方法
(1)将出发菌株烟草肠杆菌N22(图1(A))接种于基础培养基中培养至对数中期，取1mL对数期菌液，离心取上清，无菌生理盐水洗涤3次，并悬浮于生理盐水，按照10倍梯度稀释法依进行稀释，制成菌体悬浮液；将菌体悬浮液与5％(v/v)甘油按体积比1:1的比例混合，取10uL涂布于诱变载片进行ARTP诱变，在功率130W、气流量参数10SLM的条件下进项诱变，处理时间为20s、50s、120s、180s、240s，诱变完成后将诱变载片置于等体积的生理盐水中，充分混匀，获得ARTP诱变菌液；将ARTP诱变菌液依次稀释至合适梯度涂布于筛选培养基，置于37℃恒温培养箱中培养48h，最后菌落计数，计算致死率，从而绘制诱变致死曲线，得到最佳致死时间，如图2所示；
(2)将出发菌株烟草肠杆菌N22置于基础培养基中培养至对数期，取1mL对数期菌液，离心取上清，无菌生理盐水洗涤3次，并悬浮于生理盐水，制成菌体悬浮液，按照10倍梯度稀释法依进行稀释，涂布于筛选培养基进行紫外诱变，具体参数为功率15W，距离30cm处，诱变时间为2s、4s、6s、8s、10s、12s、14s、16s，然后置于37℃恒温培养箱中培养48h，最后菌落计数，计算致死率，从而绘制诱变致死曲线，得到最佳致死时间，如图3所示；
(3)将经过紫外及ARTP诱变初筛得到的菌株置于基础发酵培养基中37℃，200rpm发酵七天进行复筛，取复筛所得发酵液20mL，设置细胞破碎仪的条件在20Hz，300W的条件下破胞20min，10000rpm离心10min；取上清液加入等体积的75％(体积浓度)乙醇溶液后调节pH至2-3，室温浸提5h，45℃真空浓缩至1mL，加入1mL色谱级甲醇溶解，离心，过膜至进样瓶，此时得到的是绿原酸粗提液，后续经过纯化即得纯绿原酸；利用高效液相色谱(HPLC)仪检测绿原酸粗提液中的绿原酸产量；将复筛后绿原酸产量明显提高的菌株传代培养5代，获得一株产量提高了1.81倍且遗传性稳定的产绿原酸菌株，命名为烟草肠杆菌AU-34(图1(B))。
1.2实验分析
选择的ARTP及紫外诱变致死曲线如图2和图3所示，其中ARTP诱变时间为180s，紫外诱变时间为8s，然后经过平板(筛选培养基)初筛和HPLC复筛，获得一株绿原酸产量明显提高的菌株，通过传代培养5代，测定绿原酸产量及菌体干重，发现菌株烟草肠杆菌AU-34遗传性能稳定，如图4所示。
上述“1.1试验方法”步骤(3)中测定本实施例所得烟草肠杆菌AU-34绿原酸的产量可达到4.7mg/L。将“1.1试验方法”步骤(3)中“经过紫外及ARTP诱变初筛得到的菌株”替换成“出发菌株烟草肠杆菌N22”，其余操作与步骤(3)相同，测定N22产绿原酸的量为1.67mg/L。说明本发明所得烟草肠杆菌AU-34在常规培育下，与出发菌株N22相比，绿原酸产量提高了1.81倍。
实施例2
烟草肠杆菌AU-34产绿原酸的应用
将烟草肠杆菌AU-34置于基础培养基中培养至对数期，取对数期的烟草肠杆菌AU-34菌液，以体积百分比1％的接种量置于发酵培养基中180rpm，37℃的条件下培养7天，取培养7天后所得发酵液20mL，设置细胞破碎仪的条件在20Hz，300W的条件下破胞20min，10000rpm离心10min；取上清液加入等体积的75％(体积浓度)乙醇溶液后调节pH至2-3，室温浸提5h，45℃真空浓缩至1mL，加入1mL色谱级甲醇溶解，离心，过膜至进样瓶，此时得到的是绿原酸粗提液，后续经过纯化即得纯绿原酸；利用高效液相色谱(HPLC)仪检测绿原酸粗提液中的绿原酸产量，检测结果为绿原酸产量达136.49mg/L；发酵培养基为：果糖31.06g/L，玉米浆124g/L，MnSO4 0.1g/L，L-Tyr 0.1g/L，VB1 3mg/L，CaCO33 mg/L，Tween80 0.05％，蒸馏水作为溶剂，pH＝7，装液量80mL/250mL锥形瓶。
实施例3
烟草肠杆菌AU-34产绿原酸的应用
将烟草肠杆菌AU-34置于基础培养基中培养至对数期，取对数期的烟草肠杆菌AU-34，以体积百分比1％的接种量置于发酵培养基中200rpm，37℃的条件下培养7天，取培养7天后所得发酵液20mL，设置细胞破碎仪的条件在20Hz，300W的条件下破胞20min，10000rpm离心10min；取上清液加入等体积的75％(体积浓度)乙醇溶液后调节pH至2-3，室温浸提5h，45℃真空浓缩至1mL，加入1mL色谱级甲醇溶解，离心，过膜至进样瓶，此时得到的是绿原酸粗提液，后续经过纯化即得纯绿原酸；利用高效液相色谱(HPLC)仪检测绿原酸粗提液中的绿原酸产量，检测结果为绿原酸产量达119.56mg/L；发酵培养基为：果糖31.06g/L，玉米浆124g/L，MnSO40.1 g/L，L-Tyr 0.1g/L，VB1 3mg/L，CaCO3 3mg/L，Tween80 0.05％，蒸馏水作为溶剂，pH＝7.2-7.4，装液量80mL/250mL锥形瓶。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (6)

1.一株高产绿原酸菌株，其特征在于：所述高产绿原酸菌株命名为烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)AU-34，保藏号为CCTCC No.M 2022127。
2.一株如权利要求1所述高产绿原酸的菌株在提高绿原酸产量中的应用。
3.根据权利要求2所述高产绿原酸的菌株在提高绿原酸产量中的应用，其特征在于，包含以下操作：将所述高产绿原酸的菌株置于基础培养基中培养至对数期，以体积百分比1％的接种量置于发酵培养基中175-200rpm，30-40℃条件下培养7天，所得发酵液加入浸提剂浸提，然后浓缩，即得。
4.根据权利要求3所述高产绿原酸的菌株在提高绿原酸产量中的应用，其特征在于，所述的发酵培养基为：果糖10-50g/L，玉米浆40-140g/L，MnSO4 0.2-0.4g/L，L-Tyr 0.2-2g/L，VB1 3-5g/L，CaCO3 1-9g/L，Tween80 0.02％-0.1％，水作为溶剂，pH＝6.5-7.5，装液量75-85mL/250mL锥形瓶。
5.根据权利要求3所述高产绿原酸的菌株在提高绿原酸产量中的应用，其特征在于，所述的发酵培养基为：果糖31.06g/L，玉米浆124g/L，MnSO4 0.1g/L，L-Tyr 0.1g/L，VB1 3mg/L，CaCO3 3mg/L，Tween80 0.05％，水作为溶剂，pH＝7，装液量80mL/250mL锥形瓶。
6.根据权利要求3所述高产绿原酸的菌株在提高绿原酸产量中的应用，其特征在于，所述的浸提剂为体积浓度为75％的乙醇溶液。
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