CN101338291A - 一种制备冠菌素的方法及其专用菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备冠菌素的方法及其专用菌株。本发明所提供的菌株为丁香假单胞菌大豆致病变种MW123，保藏编号为CGMCC No.2533。本发明菌株MW123(保藏编号为CGMCC No.2533)是一株高产冠菌素的优良菌株。实验结果表明，用本发明菌株MW123(保藏编号为CGMCC No.2533)制备冠菌素的方法，具有高产稳产的优点，产量可达180mg/L发酵液－200mg/L发酵液，与出发菌株相比，产量提高了3－4倍。因此，本发明制备冠菌素的方法解决了目前发酵生产冠菌素产量低的难题，适于工业推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备冠菌素的方法及其专用菌株。
背景技术
冠菌素是由一个含氨基酸的冠烷酸(coronamic acid)和一个聚酮结构的冠菌酸(coronafacic acid)以酰氨键连结而成，其分子式为C18H25NO4，分子量为319。研究表明冠菌素与植物生长调节物质脱落酸、茉莉酸等有类似的功能，而且其活性是后两者的数千倍，可作为后两者(较为昂贵，生产上很难推广开)的替代物。冠菌素属纯天然品，在生产上应用不会对环境造成污染，是一种环境友好型生物调节剂。
至今国际上还没有冠菌素的批量产品，只是个别实验室为了研究需要，才纯化得到少量样品。限制其产业化应用的主要原因就是目前冠菌素的发酵生产成本太高，缺乏优良高产的菌株。
许多丁香假单胞菌属的一些致病变种能够产生冠菌素，如丁香假单胞菌绛红致病变种、丁香假单胞菌大豆致病变种、丁香假单胞菌番茄致病变种等。目前国际上报道的冠菌素最高产量约为40mg/L。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株冠菌素产量高的菌株。
本发明所提供的菌株是丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)MW123，其保藏编号为CGMCC No.2533。
该菌株已于2008年5月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.2533。
本发明的另一个目的是提供一种制备冠菌素的方法。
本发明所提供的制备冠菌素的方法，是用上述菌株MW123(保藏编号为CGMCC No.2533)进行发酵，得到冠菌素。
其中，发酵过程中所用的培养基可以由终浓度为0.8-1.2g/L的NH4Cl、终浓度为0.15-0.25g/L的MgSO4·7H2O、终浓度为3.8-4.5g/L的KH2PO4、终浓度为3.0-4.0g/L的K2HPO4、终浓度为0.2-0.4g/L的KNO3、终浓度为10-20g/L的葡萄糖、终浓度为0.01-0.02mM的FeCl3组成，用水定容；所述培养基的pH值为6.0-7.0。
所述培养基最佳的组成如下：所述NH4Cl的终浓度为1.0g/L、所述MgSO4·7H2O的终浓度为0.2g/L、所述KH2PO4的终浓度为4.1g/L、所述K2HPO4的终浓度为3.6g/L、所述KNO3的终浓度为0.3g/L、所述葡萄糖的终浓度为20g/L、所述FeCl3的终浓度为0.02mM；所述培养基的pH值为6.8。
所述发酵的温度可以为18-28℃。
所述发酵的温度具体可为18-21℃。
所述发酵的过程中还可进行振荡，所述振荡的转速可以为150-300rpm。
所述振荡的转速具体可为260rpm。
本发明选用的Tn5转座子含有链霉素抗性基因，且该转座子对环境是安全的。
本发明的构建高产冠菌素重组菌的方法，是通过将Tn5转座子插入到出发菌株丁香假单胞菌大豆致病变种的基因组上，可能使基因组中产量控制基因突变失活，从而得到冠菌素产量高的重组菌。
本发明菌株MW123(保藏编号为CGMCC No.2533)是一株高产冠菌素的优良菌株。实验结果表明，用本发明菌株MW123(保藏编号为CGMCC No.2533)制备冠菌素的方法，具有高产稳产的有点，产量可达180mg/L发酵液-200mg/L发酵液，与出发菌株相比，产量提高了3-4倍。因此，本发明制备冠菌素的方法解决了目前发酵生产冠菌素产量低的难题，适于工业推广应用。
附图说明
图1为以luxAB基因为目的基因的PCR筛选结果图。
图2为冠菌素标准品的液相色谱图。
图3为实验样品的液相色谱图。
图4为质粒pRL1063a的结构图谱。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
下述实施例中所使用的培养基组成如下：
1、MG固体培养基：百分含量为质量百分含量
甘露醇 1％
谷氨酸钠 0.2％
KH2PO4 0.05％
MgSO4·7H2O 0.02％
NaCl 0.02％
pH 7.0
固体培养基加琼脂 1.5％
2、LB液体培养基：百分含量为质量百分含量
NaCl 1％
蛋白胨 1％
酵母粉 0.5％
pH 7.0
固体培养基加琼脂 1.5％
3、HSC培养基：
A液：
NH4Cl 1.0g
MgSO4·7H2O 0.2g
KH2PO4 4.1g
K2HPO4 3.6g
KNO3 0.3g
2mM FeCl3 10ml
H2O 890ml
pH 6.8
B液：
葡萄糖 20g
蒸馏水定容到 100ml
用前将A、B液体混合，得到HSC培养基，该培养基的pH值调为6.8。
实施例1、丁香假单胞菌大豆致病变种重组菌的构建
一、含有质粒载体pRL1063a的大肠杆菌的构建
通过电击转化法，将质粒载体pRL1063a(Cloning and functional analysis ofcysI gene involved in siderophores biosynthesi s in Pseudomonas mossel ii E1，Huang WH，Ding YQ，Yao LT，Du ZB，Du BH，Department of Microbiology，Collegeof life sciences，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China.hwh7252@163.com)(中国农业大学)导入大肠杆菌S17-1中，再用链霉素进行筛选，得到含有质粒载体pRL1063a的阳性重组大肠杆菌，将其命名为大肠杆菌S17-1/pRL1063a。
质粒pRL1063a的结构如图4所示。
二、制备重组菌
以丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas.syringae pv.glycinea)(CarolBender，David Palmer，Alejandro
-Vázquez，Vi dhya Rangaswamy，Matthias Ullrich.Biosynthesis of coronatine，a thermoregulated phytotoxinproduced by the phytopathogen Pseudomonas syringae.Arch Microbiol.1996，166：71-75.)(中国农业大学)为出发菌株。
1、重组：
将上述重组大肠杆菌S17-1/pRL1063a在含有终浓度为30μg/L的链霉素的LB液体培养基上培养，至对数生长期；将出发菌株丁香假单胞菌大豆致病变种在含有终浓度为10μg/L的卡那霉素的MG(mainnitol glutamate)液体培养基(Keane PJ，Kerr A，New P B.1970)中培养，至对数生长期。
将上述两种菌的培养液调至相同浓度，然后按照重组大肠杆菌S17-1/pRL1063a：丁香假单胞菌大豆致病变种＝6∶1(体积比)的比例，将对数生长期的重组大肠杆菌S17-1/pRL1063培养液和对数生长期的丁香假单胞菌大豆致病变种培养液混合，在摇床上培养(转速为280rpm)7天后，以8000rpm的速度离心4min，收集菌体沉淀，并用生理盐水洗涤两次；将菌体沉淀接种到MG固体培养基上，在30℃条件下培养24小时，得到的培养物为重组大肠杆菌S17-1/pRL1063a、出发菌株丁香假单胞菌大豆致病变种和插入转座子Tn5的丁香假单胞菌大豆致病变种突变菌株的混合物。
2、筛选：
将上述培养得到的各单菌落分别用MG液体培养基悬浮，再分别涂布到含有终浓度为10μg/L的卡那霉素和终浓度为30μg/L的链霉素的MG固体培养基上，在30℃条件下培养3天；将长出的单菌落再分别转接到新的含有终浓度为10μg/L的卡那霉素和终浓度为30μg/L的链霉素的MG固体培养基平板上，在30℃条件下培养48小时；
PCR扩增筛选：以luxAB基因为目的基因进行PCR扩增，以各个单菌落为模板，用引物P 1：5’-TTTGTTCGGCTTGGTATCGC-3’和P2：5’-ATTGCTTAGGTCCATTC TCA-3’进行扩增，挑选出能够扩增出目的基因(1.6kb)的阳性单菌落(图1，泳道M为DNA分子量标记，泳道1为pRL1063a质粒载体即阳性对照结果，泳道2为筛选的阳性菌落的结果图，泳道3为阴性对照)；初步筛选得到插入转座子Tn5的突变菌株；再将筛选得到的阳性单菌落接种至MG固体培养基上，在30℃条件下培养24小时，以备进一步筛选；
发酵产物含量筛选：将上述阳性单菌落接种至含有终浓度为10μg/L的卡那霉素和终浓度为30μg/L的链霉素的MG液体培养基中，在温度为28℃，转速为260rpm的摇床上培养至发酵液的OD600值达到0.6；按2％(体积比)的接种量将上述发酵液转接到HSC发酵培养基中，在温度18℃，转速为260rpm的摇床上培养5天，提取冠菌素；提取出的冠菌素用色谱淋洗剂甲醇溶解，然后进行高效液相色谱检测，通过测量产生的冠菌素的量来筛选阳性菌株，将其中的一株冠菌素产量为204mg/L发酵液的菌株定名为丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)MW123。该菌株已于2008年5月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.2533。
实施例2、发酵制备冠菌素
一、用三角瓶进行发酵
1、发酵
将丁香假单胞菌大豆致病变种MW123(保藏号CGMCC No.2533)接种至含有终浓度为10μg/L的卡那霉素和终浓度为30μg/L的链霉素的MG液体培养基中，在温度为26℃，转速260rpm的摇床上培养，至培养液的OD600值达到0.7，得到种子液。
按2.5％(体积比)的接种量，将上述种子液接种到装有200ml发酵培养基的500ml三角瓶中，在温度为21℃，转速为260rpm的摇床上培养5天；
发酵培养基为含有终浓度为10μg/L的卡那霉素和终浓度为30μg/L的链霉素的HSC培养基。
2、高效液相色谱检测
取步骤1中得到的发酵液1000ml，在4℃条件下离心20min，收集上清液，并用1M的盐酸将上清液的pH值调到2.5；将得到的上清液用乙酸乙酯萃取3遍(120mL乙酸乙酯∶100mL上清液)，弃掉水相，收集有机相；将有机相在35℃下浓缩至15mL，将浓缩液用pH 10.5的50mM的碳酸钠溶液萃取3次(15mL碳酸钠溶液∶15mL浓缩液)，弃掉有机相，收集水相；将水相调至pH2.5，然后用乙酸乙酯萃取3次(15mL水相∶15mL乙酸乙酯)，弃掉水相，收集有机相；将有机相浓缩蒸干，用20mL甲醇悬浮，取0.5mL用于HPLC检测。
高效液相色谱检测中用到的流动相由0.05％的三氟乙酸(pH2.9)和乙腈按1∶9的比例配制成。待测样品在检测波长208nm处、2mL·min-1的速度、进样量25μL、每个样保留10min的条件下进行。根据冠菌素标准品保留时间确定提取液中是否含有冠菌素，并通过与冠菌素标准品峰面积比较确定冠菌素的含量。
在以上检测条件下，冠菌素的保留时间是7.7分钟，冠菌素标准品(广州伟伯化工有限公司)的图谱如图2所示，实验样品的图谱如图3所示。
实验设3次重复。结果表明，冠菌素的平均产量为185mg/L发酵液。
二、用发酵罐进行发酵
将重组菌丁香假单胞菌大豆致病变种MW123(保藏号CGMCC No.2533)接种至含有终浓度为10μg/L的卡那霉素和终浓度为30μg/L的链霉素的MG液体培养基中，在温度为28℃，转速260rpm的摇床上培养36-48小时，得到一级种子液。
将600mlMG液体培养基分装于三个500ml三角瓶中，即每瓶含有200ml培养基；将培养得到的一级种子液按1％-2.5％接种量分别接种于上述三个500ml三角瓶中，在温度为28℃，转速260rpm的摇床上培养36-48小时，得到二级种子液。
将经常规高压热蒸汽灭菌方法灭菌的5升HSC培养基装于7升的发酵罐中，，按1％-2.5％接种量向其中接入二级种子液，通气搅拌，在温度为18℃、初始pH值为6.0-7.0的条件下进行发酵，发酵时间达到7天时下罐。将下罐发酵液按照实验一中所述方法进行高效液相色谱检测。
实验设3次重复，结果表明，冠菌素的平均产量为200mg/L发酵液。
Claims (8)
1、丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)MW123，保藏编号为CGMCC No.2533。
2、一种制备冠菌素的方法，是用权利要求1所述菌进行发酵，得到冠菌素。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵中用到的培养基是由终浓度为0.8-1.2g/L的NH4Cl、终浓度为0.15-0.25g/L的MgSO4·7H2O、终浓度为3.8-4.5g/L的KH2PO4、终浓度为3.0-4.0g/L的K2HPO4、终浓度为0.2-0.4g/L的KNO3、终浓度为10-20g/L的葡萄糖、终浓度为0.01-0.02mM的FeCl3组成，用水定容；所述培养基的pH值为6.0-7.0。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述NH4Cl的终浓度为1.0g/L、所述MgSO4·7H2O的终浓度为0.2g/L、所述KH2PO4的终浓度为4.1g/L、所述K2HPO4的终浓度为3.6g/L、所述KNO3的终浓度为0.3g/L、所述葡萄糖的终浓度为20g/L、所述FeCl3的终浓度为0.02mM；所述培养基的pH值为6.8。
5、根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵的温度为18-28℃。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述发酵的温度为18-21℃。
7、根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵的过程中进行振荡，所述振荡的转速为150-300rpm。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述振荡的转速为260rpm。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102239876A (zh) * | 2011-05-18 | 2011-11-16 | 中国农业大学 | 冠菌素作为新型棉花脱叶剂的应用 |
| CN102250975A (zh) * | 2011-06-21 | 2011-11-23 | 江苏科技大学 | 用于发酵产冠菌素的红糖培养基 |
| CN102304040A (zh) * | 2011-05-27 | 2012-01-04 | 中国农业大学 | 一种大孔树脂制备高纯度冠菌酸的方法 |
| CN101948764B (zh) * | 2010-05-13 | 2012-07-18 | 江苏科技大学 | 产冠菌素桑丁香假单胞菌株及其发酵生产冠菌素的方法 |
| CN103396965A (zh) * | 2013-08-05 | 2013-11-20 | 中国农业大学 | 一种发酵培养基及其在制备冠菌素中的应用 |
| CN116004473A (zh) * | 2023-02-14 | 2023-04-25 | 成都新朝阳作物科学股份有限公司 | 一株冠菌素高产菌株、发酵方法及其应用 |
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Cited By (7)
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|---|---|---|---|---|
| CN101948764B (zh) * | 2010-05-13 | 2012-07-18 | 江苏科技大学 | 产冠菌素桑丁香假单胞菌株及其发酵生产冠菌素的方法 |
| CN102239876A (zh) * | 2011-05-18 | 2011-11-16 | 中国农业大学 | 冠菌素作为新型棉花脱叶剂的应用 |
| CN102239876B (zh) * | 2011-05-18 | 2013-09-04 | 中国农业大学 | 冠菌素作为棉花脱叶剂的应用 |
| CN102304040A (zh) * | 2011-05-27 | 2012-01-04 | 中国农业大学 | 一种大孔树脂制备高纯度冠菌酸的方法 |
| CN102250975A (zh) * | 2011-06-21 | 2011-11-23 | 江苏科技大学 | 用于发酵产冠菌素的红糖培养基 |
| CN103396965A (zh) * | 2013-08-05 | 2013-11-20 | 中国农业大学 | 一种发酵培养基及其在制备冠菌素中的应用 |
| CN116004473A (zh) * | 2023-02-14 | 2023-04-25 | 成都新朝阳作物科学股份有限公司 | 一株冠菌素高产菌株、发酵方法及其应用 |
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