CN102304040A - 一种大孔树脂制备高纯度冠菌酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大孔树脂制备冠菌酸的方法。该方法，包括如下步骤：将含有冠菌酸的微生物发酵液的上清液过以大孔吸附树脂为吸附剂的吸附柱进行吸附层析，洗脱得到冠菌酸；所述大孔吸附树脂为非极性大孔树脂；所述洗脱中采用的洗脱剂为能溶解冠菌酸的有机溶剂。本发明的方法具有冠菌酸提取得率高、操作简单、生产成本低和对环境污染低的特点，适合大量制备冠菌酸样品。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种利用大孔树脂从发酵液中提取冠菌酸的方法，该方法适合从大量发酵液中提取冠菌酸。
背景技术
冠菌酸(coronafacic acid，CFA)是植物生长调节物质冠菌素(coronatine，COR)合成的一个前体聚酮化合物，是茉莉酸(Jasmonic Acid JA)的结构类似物。冠菌酸在很多作物上能够引起与JA和COR类似的效果，研究表明20nmol的COR能够引起中等到重度的番茄叶片黄萎病，而冠菌酸和Me-JA没有引起失绿病斑的产生。在诱导拟南芥、番茄花青素积累和抑制根伸长的实验中表明，COR的效果更显著于Me-JA，而冠菌酸的作用效果介于COR与Me-JA之间。通过研究COR及其前体物质冠菌酸和CMA的作用反应基因来进一步确定各种物质的作用机理，Srinivasa等(2005)利用cDNA芯片技术研究番茄叶片在各种化合物处理后各个时间段的基因表达情况进行了比较，实验结果用Venn图显示COR、冠菌酸与冠烷酸(coronamic acid，CMA)诱导了不同数量基因表达的上调与下降。从这些结果显示出冠菌酸与COR有功能更大程度的重叠作用，但是COR较冠菌酸诱导更多基因的表达。同时研究表明冠菌酸在有些作用方面与COR有类似的效果，有些效果略低于COR的诱导效果，同时也有一些显著低于COR诱导效果的作用。随着研究的深入，特别是JA作用受体的发现，更多研究者开始重新关注冠菌酸的作用，包括冠菌酸的生理作用，以及它的作用形式和机理，目前关于COR的作用研究已经取得了一定的进展，在研究其作用机理时又主要集中在冠菌酸与CMA的作用机理，到底COR的作用是由冠菌酸还是CMA起主导作用，研究的还不是很清楚，近来有研究报道冠菌酸起主导作用，但是冠菌酸具体的作用效果以及机理还缺乏研究，COR对35％的Me-JA诱导的基因有调控作用，而冠菌酸对39.4％的COR调控基因有诱导效应，表明冠菌酸与COR重叠的诱导效果更显著(Srinivasa等2005)。因此人们推测冠菌酸是COR主要起作用的基团，也有研究证明JA与冠菌酸有着相同的诱导效果，研究表明在诱导马铃薯块茎形成，马铃薯块茎细胞伸长以及大豆愈伤组织的生长和诱导燕麦叶片的衰老等作用中，冠菌酸和JA有相同的诱导效果，即相同浓度的冠菌酸与JA诱导效果相似。
综上所述，故大量研究需要进行进一步验证冠菌酸的生理功能以及其作用形式，其中涉及到冠菌酸在作物抵抗逆境胁迫中的大量生理作用，例如冠菌酸是否可以调控植物生长、抑制衰老、促进细胞分化、提高叶绿素含量和植物抗逆性等生理功能，这就需要大量冠菌酸样品的获得。如果冠菌酸可以代替COR来应用于植物逆境胁迫，则冠菌酸有望作为又一种新的植物生长调节物质被广泛应用。因为发酵法获得冠菌酸要比COR的获得更容易，且发酵周期也明显缩短，丁香假单胞菌发酵前期就有冠菌酸的合成，且产量远大于COR，如果冠菌酸能够代替COR应用于作物抗逆调控，不仅能够节约能源，将低成本，同时，工业化生产冠菌酸将更能成为可能，因为冠菌酸的生物合成要比COR的合成更简单，工业化生产的工程菌的获得更为容易。
近年来，集中研究冠菌酸作用机理的研究越来越多，但苦于缺乏冠菌酸样品的获得，不仅发酵合成冠菌酸产量较低，同时冠菌酸的分离纯化工艺也较复杂，很难得到冠菌酸纯品。
大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物，是20世纪60年代发展起来的新型有机高聚物吸附剂，已在环保、食品、医药等领域得到了广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种分离纯化冠菌酸的方法，该方法工艺简单，收率高，可达80％以上，纯度90％以上，该方法生产成本低，对冠菌酸的结构和活性没有任何影响，而且耗能低，污染小，完全适应工业化生产的要求。
本发明所提供的提取冠菌酸的方法，包括如下步骤：将含有冠菌酸的微生物发酵液的上清液过以大孔吸附树脂为吸附剂的吸附柱进行吸附层析，洗脱得到冠菌酸；所述大孔吸附树脂为非极性大孔树脂，所述洗脱中采用的洗脱剂为能溶解冠菌酸的有机溶剂。
所述大孔吸附树脂具体可为HPD300、HZ818或YPRII。
所述有机溶剂选自下述7种物质中的至少一种：乙醇、乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、95％(体积百分浓度)乙醇水溶液和丙酮。
其中，所述含有冠菌酸的微生物发酵液的上清液的上柱吸附速度(就是吸附柱底部流出液的速度)为4升/小时-8升/小时。
为了节省洗脱剂用量，所述洗脱的流速(吸附柱底部流出液的速度)可为3升/小时-5升/小时。
所述含有冠菌酸的微生物发酵液的上清液的上柱量为具体可为3-200ml/g大孔吸附树脂(如100ml/g)。
所述含有冠菌酸的微生物发酵液的上清液可按照包括如下步骤的方法制备：在液体培养基中发酵冠菌酸产生菌3-4天，收集发酵液中的上清液。
所述方法在将含有冠菌酸的微生物发酵液的上清液过以大孔吸附树脂为吸附剂的吸附柱前，还包括将所述上清液的pH值调至2-5.5的步骤。
所述吸附层析中包括收集第3个以上柱体积(如第3个柱体积、第3-4个柱体积、第3-6个柱体积)的洗脱液，从所述洗脱液中得到冠菌酸的步骤。
所述冠菌酸产生菌可包括以下几种：丁香假单胞菌绛红致病变种(P.s.pv.atropurpruea)、丁香假单胞菌大豆致病变种(P.s.pv.glycinea)、丁香假单胞菌番茄致病变种(P.s.pv.tomato)、丁香假单胞菌李死致病变种(P.s.pv.morsprunorum)、丁香假单胞菌斑生致病变种(P.s.pv.maculicola)、丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(P.s.pv.actinidiae)、野油菜黄单胞菌栖新西兰麻致病变种(X.c.pv.Phormiicola)(Palmer D A，Bender C L.Effects of environmentaland nutritional factors on production of the polyketide phytotoxin coronatineby Pseudomonas syringae pv.glycinea.Appl.Environ.Microbiol.1993，59，1619-1626.)。
其中的丁香假单胞菌大豆致病变种(P.s.pv.glycinea)具体可为保藏号为CGMCC1412的丁香假单胞菌大豆致病变种，或为保藏号为CGMCC1276的丁香假单胞菌大豆致病变种，或为保藏编号为CGMCC No.2533的丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)MW123。
可用现有的培养丁香假单胞菌的液体培养基培养上述冠菌酸产生菌，如蔗糖15g，氯化铵1.0g，KH2PO44.1g，K2HPO43.6g，MgSO4·7H2O 0.2g，KNO30.3g，2mMFeCl310ml，用蒸馏水定容至1000ml，pH 7.0。
所述发酵中采用的温度为适宜丁香假单胞菌生长的温度，如18℃-23℃。
所述含有冠菌酸的微生物发酵液的上清液，是将含有冠菌酸的微生物发酵液进行离心，得到的去除沉淀的液体。
所述离心中，所采用的离心力可为3000-8000g，离心时间可为3-20分钟。
所述含有冠菌酸的微生物发酵液的上清液调节pH值为2-5.5后进行上柱。
本发明经过不断优化小量制备冠菌酸标准样品的技术，进而逐级放大，得到一种最优化的制备冠菌酸大量样品的技术，从而为进一步大量研究冠菌酸生理功能提供基础。本发明方法采用的大孔吸附树脂对冠菌酸的选择性良好、吸附快、解析也快、吸附容量较大、生产周期短；且大孔树脂物理化学稳定性高、机械强度好、再生容易；工艺简单，操作十分简便，一步即可达到分离目的，同时冠菌酸收率较高，纯度较好，溶剂皆可回收利用，成本低廉，适用于工业化生产。
附图说明
图1为冠菌酸的HPLC法测定标准曲线
图2为实施例1的HPLC测定冠菌酸标样(A)、冠菌酸粗提样品(B)及纯化后的冠菌酸样品(C)
具体实施方式
本发明具体是利用大孔树脂吸附层析的方法从发酵液中分离提取冠菌酸的方法，其特征是将成熟发酵液离心弃沉淀，用上清液作流动相，经大孔树脂柱分离，经优化的淋洗液洗脱，旋转蒸发仪干燥，得到冠菌酸。
具体工艺流程为：(1)将发酵3-4天的含冠菌酸的成熟发酵液室温条件下3000-8000g，离心3-20分钟，弃沉淀，收集上清液；
(2)将上述所得上清液以4升/小时-8升/小时的速度流经大孔吸附树脂；
(3)用大量水冲洗至流出液无色后，改用有机溶剂洗脱冠菌酸，所用的洗脱剂为3-6倍柱体积，洗脱液流量为3升/小时-5升/小时，所用的洗脱剂是乙醇、乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、95％(体积百分浓度)乙醇水溶液，或者之中任意两种或者三种的混合溶剂。
(4)将洗脱液在真空度0.07-0.09MPA下减压蒸发，收集冠菌酸，并回收溶剂。
下述实施例中所用的非极性大孔吸附树脂HPD300、HZ818或YPRII分别购自沧州宝恩吸附材料有限公司，上海华震科技有限公司，上海劲凯树脂有限公司。
实施例1、从微生物发酵液中提取冠菌酸
1、发酵
挑取冷冻保存的丁香假单胞菌大豆致病变种CGMCC MW1232533(记载在中国专利200810119153.2中)于斜面培养基(配方为2％蛋白胨，0.1％KH2PO40.05％NaCl 0.1％MgSO4·7H2O，1.3％的琼脂粉，溶剂为水；该培养基的pH 7.0)上，28℃培养48-60h使其活化，然后挑取一环活化好的菌体，接入含有10ug/ml的卡那霉素和30ug/ml的链霉素的液体培养基(配方为2％蛋白胨，0.1％KH2PO40.05％NaCl 0.1％MgSO4·7H2O；溶剂为水；该培养基的pH 7.0；121℃灭菌30min)中，28℃培养36-48h，到对数期时，取培养菌液按5％(体积比)接种量接入发酵培养基(蔗糖15g，氯化铵1.0g，KH2PO44.1g，K2HPO43.6g，MgSO4·7H2O 0.2g，KNO30.3g，2mM FeCl310ml，用蒸馏水定容至1000ml。该培养基的pH 7.0)中，在温度为18℃、转速为260rpm的条件下发酵3天。
2、纯化
取步骤1的发酵液5L在室温条件下5000g离心5分钟，收集上清液，调节pH值为2。将50克HPD300大孔吸附树脂用乙醇充分浸泡24h，待树脂充分溶胀后用蒸馏水洗涤至无乙醇，装入吸附柱中，用3倍柱体积的3-5％(体积百分比)的盐酸溶液以10L/小时的速度通过柱子，并浸泡3h，用水平衡至pH＝7.0；用3-5％(体积质量百分比)的NaOH溶液以10L/小时的速度通过柱子，并浸泡3h，用水平衡至pH＝7.0；用蒸馏水浸泡树脂备用。
将上述所得上清液5L加入吸附柱中吸附速率(吸附柱底部流出液的速度)为4升/小时；吸附完毕后用蒸馏水冲洗吸附柱直到流出液澄清，然后用4倍柱体积的丙酮洗脱，洗脱速率为3升/小时(吸附柱底部流出液的速度)，收集第3-4个柱体积的洗脱液。在室温下、真空度0.07-0.09MPA下减压浓缩该丙酮洗脱液得浸膏，在45℃干燥得冠菌酸产品。将该冠菌酸产品用色谱级甲醇进行溶解。冠菌酸标准品的制备和检测按照如下文献中的方法进行：Jones WT，Harvey D，Mitchell RE，Ryan GB，BenderCL，ReynoldsPHS(1997)Competitive ELISA employing monoclonal antibodies specificfor coronafacoyl amino acid conjugates.Food Agric Immunol 9：67-76。
根据标样浓度及峰面积建立冠菌酸检测线性曲线。如图1。
冠菌酸的纯度则由分析型高效液相色谱仪(流速：每分钟1毫升)给出。其中，分析型高效液相色谱仪的型号：岛津CBM-10A VP PULS，所采用的色谱柱的型号：Agela4.6*250mm C18。色谱操作条件：洗脱液是80％色谱甲醇溶液，时间10分钟。
根据纯化后冠菌酸含量浓度与纯化前样品中冠菌酸浓度的比值计算冠菌酸收率。其中，用于上样检测的纯化前样品中冠菌酸的上样液按照如下方法制备：取1mL步骤1的发酵液到离心管内，5000rpm离心3min，取0.5mL上清液到新的离心管内，每支离心管内加30μL 3M HCl，用等体积乙酸乙酯萃取3遍，收集有机相55℃水浴吹干所得物或自然风干。甲醇溶解高效液相色谱检测冠菌酸含量。
根据纯化后冠菌酸含量浓度与纯化前样品中冠菌酸浓度的比值计算冠菌酸收率为82％，根据冠菌酸峰面积所占全部样品总峰面积的比例，计算冠菌酸纯度为90％(见图2)。
图2为标准品(A)、冠菌酸粗提样品(B)和本实施例提取得到的冠菌酸纯度为90％产品的HPLC图谱。冠菌酸在该色谱条件下的保留时间是7分钟。图2的横坐标为保留时间(分钟)。
实施例2、从微生物发酵液中提取冠菌酸
1、发酵
挑取冷冻保存的丁香假单胞菌大豆致病变种CGMCC1276(记载在中国专利ZL200510011466.2中)于斜面培养基(配方为2％蛋白胨，0.1％KH2PO40.05％NaCl 0.1％MgSO4·7H2O，1.3％的琼脂粉，溶剂为水；该培养基的pH 7.0)上，28℃培养48-60h使其活化，然后挑取一环活化好的菌体，接入含有10ug/ml的卡那霉素和30ug/ml的链霉素的液体培养基(配方是2％蛋白胨，0.1％KH2PO40.05％NaCl 0.1％MgSO4·7H2O；溶剂为水。该培养基的pH 7.0；121℃灭菌30min)中，28℃培养36-48h，到对数期时，取培养菌液按5％(体积比)接种量接入发酵培养基(蔗糖15g，氯化铵1.0g，KH2PO44.1g，K2HPO43.6g，MgSO4·7H2O O.2g，KNO30.3g，2mM FeCl310ml，用蒸馏水定容至1000ml。该培养基的pH 7.0)中，在温度为21℃、转速为260rpm的条件下发酵4天。
2、纯化
取步骤1的发酵液4.8L在室温条件下3000g离心20分钟，收集上清液，调pH为3；将50克HZ818大孔吸附树脂用乙醇充分浸泡24h，待树脂充分溶胀后用蒸馏水洗涤至无乙醇，装入吸附柱中，用3倍柱体积的3-5％(体积百分含量)的盐酸溶液以10L/小时的速度通过柱子，并浸泡3h，用水平衡至pH＝7.0；用3-5％(质量百分含量)的NaOH溶液以10L/小时的速度通过柱子，并浸泡3h，用水平衡至ph＝7.0；用蒸馏水浸泡树脂备用。
将上述所得上清液(pH值3)4.8L加入吸附柱中吸附速率(吸附柱底部流出液的速度)8升/小时；吸附完毕后用蒸馏水冲洗吸附柱直到流出液澄清，然后用3倍柱体积的乙醇洗脱，洗脱速率(吸附柱底部流出液的速度)为5升/小时，收集第3个柱体积的洗脱液；在室温下、真空度0.07-0.09MPA下减压浓缩乙醇洗脱液得浸膏，在40℃干燥得冠菌酸产品。将该冠菌酸产品用色谱甲醇进行溶解。
用于定量的标准品及标准曲线同实施例1。
将冠菌酸标准品和该冠菌酸产品用实施例1的分析型高效液相色谱仪按照上述色谱条件进行纯度分析。
根据纯化后冠菌酸含量浓度与纯化前样品中冠菌酸浓度的比值计算冠菌酸收率为80％，根据冠菌酸峰面积所占全部样品总峰面积的比例，计算冠菌酸纯度为92％。
实施例3、从微生物发酵液中提取冠菌酸
1、发酵
挑取冷冻保存的丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)MW123(已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2533，已在中国专利ZL 200810119153.2得到授权)于斜面培养基(配方为2％蛋白胨，0.1％KH2PO40.05％NaCl 0.1％MgSO4·7H2O，1.3％的琼脂粉，溶剂为水；该培养基的pH 7.0)上，28℃培养48-60h使其活化，然后挑取一环活化好的菌体，接入含有10ug/ml的卡那霉素和30ug/ml的链霉素的液体培养基(配方是2％蛋白胨，0.1％KH2PO40.05％NaCl 0.1％MgSO4·7H2O；溶剂为水。该培养基的pH7.0；121℃灭菌30min)中，28℃培养36-48h，到对数期时，取培养菌液按5％(体积比)接种量接入发酵培养基(蔗糖15g，氯化铵1.0g，KH2PO4 4.1g，K2HPO4 3.6g，MgSO4·7H2O 0.2g，KNO3 0.3g，2mM FeCl3 10ml，用蒸馏水定容至1000ml。该培养基的pH 7.0)中，在温度为23℃、转速为260rpm的条件下发酵3天。
2、纯化
取步骤1的发酵液16L在室温条件下8000g离心3分钟，收集上清液，调pH为5.5；；将150克YPRII大孔吸附树脂用乙醇充分浸泡24h，待树脂充分溶胀后用蒸馏水洗涤至无乙醇，装入吸附柱中，用3倍柱体积的3-5％(体积百分含量)的盐酸溶液以10L/小时的速度通过柱子，并浸泡3h，用水平衡至pH＝7；用3-5％(质量百分含量)的NaOH溶液以10L/小时的速度通过柱子，并浸泡3h，用水平衡至pH＝7.0；用蒸馏水浸泡树脂备用。
将上述所得上清液(pH为5.5)16L加入吸附柱中吸附速率(吸附柱底部流出液的速度)为5升/小时；吸附完毕后用蒸馏水冲洗吸附柱直到流出液澄清，然后用6倍柱体积的95％乙醇水溶液洗脱，洗脱速率(吸附柱底部流出液的速度)为4升/小时，收集第3-6个柱体积的洗脱液；在室温下、真空度0.07-0.09MPA下减压浓缩该洗脱液得浸膏，在40℃干燥得冠菌酸产品。将该冠菌酸产品用色谱甲醇进行溶解。
用于定量的标准品及标准曲线同实施例1。
将冠菌酸标准品和该冠菌酸产品用实施例1的分析型高效液相色谱仪按照上述色谱条件进行纯度分析。
根据纯化后冠菌酸含量浓度与纯化前样品中冠菌酸浓度的比值计算冠菌酸收率为85％，根据冠菌酸峰面积所占全部样品总峰面积的比例，计算冠菌酸纯度为89％。
Claims (9)
1.一种提取冠菌酸的方法，包括如下步骤：将含有冠菌酸的微生物发酵液的上清液过以大孔吸附树脂为吸附剂的吸附柱进行吸附层析，洗脱得到冠菌酸；所述大孔吸附树脂为非极性树脂；所述洗脱中采用的洗脱剂为能溶解冠菌酸的有机溶剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂的型号为HPD300、HZ818或YPRII。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂选自下述7种物质中的至少一种：乙醇、乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、95％(体积百分浓度)乙醇水溶液和丙酮。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述含有冠菌酸的微生物发酵液的上清液的上柱吸附速率为4升/小时-8升/小时。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述含有冠菌酸的微生物发酵液的上清液的上柱量为3-200ml/g大孔吸附树脂。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：含有冠菌酸的微生物发酵液的上清液按照包括如下步骤的方法制备：在液体培养基中发酵冠菌酸产生菌3-4天，收集发酵液中的上清液。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述方法在将含有冠菌酸的微生物发酵液的上清液过以大孔吸附树脂为吸附剂的吸附柱前，包括将所述上清液的pH值调至2-5.5的步骤。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述含有冠菌酸的微生物发酵液的上清液，是将含有冠菌酸的微生物发酵液进行离心，得到的去除沉淀的液体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述离心中，所采用的离心力3000-8000g，离心时间是3-20分钟。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120104 |