CN1281738C - 一种基因工程菌、其构建方法和其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基因工程菌(丁香假单胞菌大豆致病变种CGMCC 1276)、其构建方法及其用途。该工程菌是利用Tn5转座子S17-1插入到出发菌的基因组中，使其温度控制基因失活而获得的。该菌株可在发酵温度为26℃-28℃的条件下用于工业化发酵生产冠菌素。产量与出发菌(发酵温度为18℃)相近，可达35mg/l-40mg/l。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域。具体来说，本发明涉及一种基因工程菌、其构建方法和其用途。
背景技术
冠菌素C18H25NO4，分子量为319，由一个含氨基酸的冠烷酸(coronamic acid)和一个聚酮结构的冠菌酸(coronafacic acid)两个组分以酰氨键连结而成。最初的文献报到它是一种植物毒素。但最近研究发现冠菌素与植物生长调节物质脱落酸、茉莉酸有类似的功能，而且活性是后两者的数千倍，可作为后两者(较为昂贵，生产上很难推广开)的替代物。冠菌素属纯天然品，在生产上应用不会对环境造成污染，是一种环境友好型生物调节剂。但目前对于冠菌素的研究一直停留在实验室阶段。原因是它的发酵生产成本太高，国际上没有产品，只是个别实验室为了研究需要，纯化了少量样品。限制其产业化的最重要因素就是缺少常温(26℃-28℃)下高产的优良菌株。
有关研究表明丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonassyringae pv.glycinea)产生冠菌素的量与温度密切相关，在18℃时产量最高，约20mg/l，24℃产量仅为25％，到28℃时几乎检测不到冠菌素(David，1993)。Ullrich等认为合成冠菌素的酶系受温度控制的(budde et.al 1998；Ullrich et.al 1993；Bender et.al 1996：Rangaswamyet.al 1997；Ullrich，2000)。
目前，要生产冠菌素只能用18℃的低温发酵，这样则要消耗大量的电、水等资源用于控温。这与我国资源亏乏的国情不相应。也极大地提高了生产成本。
发明内容
本发明的目的在于获得一种能够用于在常温下发酵生产冠菌素的基因工程菌株。
本发明的另一目的是提供该菌株的构建方法。
本发明的再一个目的是提供该基因工程菌的用途。
本发明发明人经过深入研究，获得了一种温度控制基因突变失活的丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)菌株，从而完成了本发明。该菌株已于2004年12月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC 1276。
构建本发明的丁香假单胞菌大豆致病变种CGMCC 1276的方法包括如下步骤：
1、将Tn5转座子S17-1插入到出发菌的基因组中；
2、筛选温度控制基因突变失活的菌株获得所述菌株，获得所述菌株。
所述方法详述如下：
1、将Tn5转座子S17-1插入到出发菌的基因组中；
选取质粒载体pRL1063a，其中具有Tn5转座子S17-1(如图1)。将质粒载体pRL1063a和出发菌株(丁香假单胞菌大豆致病变种(Psyringae pv.glycinea))分别在含有卡那霉素的培养基上培养；将培养的好的质粒载体pRL1063a和出发菌株混合，在摇床上培养，使Tn5转座子S17-1插入到出发菌株的基因组中；离心，弃去上清液，将所得菌体沉淀进行培养。
得到的培养物为质粒载体pRL1063a、出发菌株、插入转座子S17-1的突变菌株的混合物。
本步骤优选的是将质粒载体pRL1063a和出发菌株分别在含有浓度为5μg/L-15μg/L卡那霉素的LB培养基上培养；按体积比1∶1-2取质粒载体pRL1063a和出发菌株混合，在温度为26℃-32℃，转速为150rpm/min-300rpm/min摇床上作用20-40分钟，以10000r/min-20000r/min离心5-15分钟，弃去上清液，将菌体沉淀接种到LB固体培养基上，在温度为26℃-32℃条件下培养12-48小时。
本步骤更优选的是将质粒载体pRL1063a和出发菌株分别在含有浓度为10μg/L卡那霉素的LB培养基上培养；按体积比1∶1.2取生长对数期的质粒载体pRL1063a和出发菌株混合，在温度为30℃，转速为200rpm/min摇床上作用30分钟，以12000r/min离心10min，用生理盐水洗涤两次，弃去上清夜，将菌体沉淀接种到LB固体培养基上，在温度为30℃条件下培养24小时。
2、筛选温度控制基因突变失活的菌株，该步骤包括以下三个阶段：
(1)将步骤1所得培养物用液体培养基悬浮，涂布到同时含有卡那霉素和链霉素的固体培养基上培养；将长出的单菌落转接到新的同时含有卡那霉素和链霉素的固体培养基上培养。
得到的培养物为质粒载体pRL1063a和插入转座子S17-1的突变菌株。
本步骤优选的是将步骤1所得培养物用MG液体培养基悬浮，涂布到MG固体培养基(卡那霉素浓度为5μg/L-15μg/L、链霉素浓度为20μg/L-40μg/L)上，在温度为26℃-32℃条件下培养5-10天，将长出的单菌落转接到新的MG固体培养基(卡那霉素浓度为5μg/L-15μg/L、链霉素浓度为20μg/L-40μg/L)上，在温度为26℃-32℃条件下培养24-36小时。
本步骤更优选的是将步骤1所得培养物用MG液体培养基悬浮，涂布到MG固体培养基(Keane PJ，KerrA，New PB.1970)(卡那霉素浓度为10μg/L、链霉素浓度为30μg/L)平板上，在温度为30℃条件下培养7-8天，将长出的单菌落转接到新的MG固体培养基(卡那霉素浓度为10μg/L、链霉素浓度为30μg/L)平板上，在温度为30℃条件下培养48小时。
(2)将步骤(1)所得培养物以luxAB基因为目的基因进行PCR扩增。扩增基因为luxAB，引物P1：5′-TTT GTT CGG CTT GGT ATCGC-3′；P2：5′-ATT GCT TAG GTC CAT TCT CA-3′。选取能扩出目的基因片段的菌落(如图2)进行培养；
所得培养物为插入转座子S17-1的突变菌株。
本步骤优选的是将步骤(1)所得培养物以luxAB基因为目的基因进行PCR扩增，选取能扩出目的基因片段的菌落，在温度为26℃-32℃条件下培养12-48小时；
本步骤更优选的是将步骤(1)所得培养物以luxAB基因为目的基因进行PCR扩增，选取能扩出目的基因片段的菌落，接种在MG固体培养基上，在温度为30℃条件下培养(12-48小时)。
(3)将步骤(2)所得培养物接种到同时含有卡那霉素和链霉素的液体培养基中，在摇床上培养，转接到新培养基中，在温度26℃-28℃发酵培养，选取可生产冠菌素的菌株。
本步骤优选的是将步骤(2)所得培养物接种到MG液体培养基(卡那霉素浓度为5μg/L-15μg/L、链霉素浓度为20μg/L-40μg/L)中，在温度26℃-30℃，转速150rpm/min-300rpm/min摇床上培养到OD值达到0.6-0.8时，按接种量的1％-3％转接到HSC(David，1993)培养基中，在温度26℃-28℃，转速150rpm/min-300rpm/min摇床上培养2-10天，选取可生产冠菌素的菌株。
本步骤更优选的是将步骤(2)所得培养物接种到MG液体培养基(卡那霉素浓度为10μg/L、链霉素浓度为30μg/L)中，在温度为28℃，转速260rpm/min摇床上培养到OD值达到0.7时，按接种量的2％转接到HSC培养基中，在温度28℃，转速260rpm/min摇床上培养5天，选取可生产冠菌素的菌株。
本发明选用的质粒载体pRL1063a，其优点是含有luxAB基因(细菌没有)，并含有多个选择标记及插入位点等。
本发明选用的Tn5转座子S17-1含有卡那霉素抗性基因和链霉素抗性基因，且该转座子对环境是安全的。
本发明提供的温控基因突变失活的基因工程菌可用于常温发酵生产冠菌素。
在用本发明提供的菌株发酵生产冠菌素的不同阶段，可以采用以下不同的培养基：A培养基、B固体培养基、B液体培养基、C培养基，其具体组成如下：
A培养基：
蛋白胨 1％
酵母浸膏 0.5％
NaCl 0.5％
琼脂 1.5％
pH 7.0
B液体培养基：
甘露醇 1％
谷氨酸钠 0.2％
KH2PO4 0.05％
NaCl 0.02％
MgSO4·7H2O 0.02％
pH 7.0
B固体培养基：
B液体培养基加1.5％的琼脂。
C培养基：
NH4Cl 1.0g
MgSO4·7H2O 0.2g
KH2PO4 4.1g
K2HPO4 3.6g
KNO3 0.3g
2mMFeCl3 10ml
H2O 890ml
pH 6.8
本发明通过Tn5转座子突变法将转座子S17-1插入到出发菌株的温度调控基因上，使该基因突变失活，从而使突变的新菌株丁香假单胞菌大豆致病变种CGMCC 1276可以在常温(26℃-28℃)下产生冠菌素，并且高产稳产，产量可达35mg/L-40mg/L，从而解决了18℃低温发酵的高成本问题。
生物材料保藏说明
丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringaepv.glycinea)CGMCC 1276，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC1276，保藏日期：2004年12月21日。
附图说明
图1为质粒PRL1063a结构示意图。
图2为PCR结果图。泳道M为DNA分子量标记，泳道1为pRL1063a为质粒载体，泳道2-10为插入转座子S17-1的突变菌株。
具体实施方式
实施例1
将质粒载体pRL1063a和出发菌株分别在含有浓度为10μg/L卡那霉素的LB培养基上培养；按体积比1∶1.2取生长对数期的质粒载体pRL1063a和出发菌株混合，在温度为30℃，转速为200rpm/min摇床上作用30分钟，12000r/min离心10min，用生理盐水洗涤两次，弃去上清夜，将菌体沉淀接种到LB固体培养基上，在温度为30℃条件下培养24小时。得到的培养物为质粒载体pRL1063a、出发菌株、插入转座子S17-1的突变菌株的混合物。
将培养好的菌体沉淀用牙签刮下，用MG液体培养基悬浮，涂布到MG固体培养基(卡那霉素浓度为10μg/L、链霉素浓度为30μg/L)平板上，在温度为30℃条件下培养7-8天，将长出的单菌落转接到新的MG固体培养基(卡那霉素浓度为10μg/L、链霉素浓度为30μg/L)平板上，在温度为30℃条件下培养48小时。得到的培养物为质粒载体pRL1063a、插入转座子S17-1的突变菌株的混合物。
以luxAB基因为目的基因进行PCR扩增，引物P1：5′-TTT GTTCGG CTT GGTATC GC-3′；P2：5′-ATT GCT TAG GTC CAT TCTCA-3′，选取能扩出目的基因片段的菌落(如图2)，在温度为30℃条件下培养24小时。所得培养物为插入转座子S17-1的突变菌株。
接种培养好的菌落到MG液体培养基(卡那霉素浓度为10μg/L、链霉素浓度为30μg/L)中，在温度为28℃，转速260rpm摇床上培养到OD值达到0.7时，按接种量的2％转接到HSC培养基中，在温度28℃，转速260rpm/min摇床上培养5天，提取冠菌素。提取出的冠菌素用色谱淋洗剂甲醇溶解，进行高效液相色谱检测。冠菌素产量为37.5mg/l。
实施例2
将质粒载体pRL1063a和出发菌株分别在含有浓度为5μg/L卡那霉素的LB培养基上培养；按体积比1∶1取生长对数期的质粒载体pRL1063a和出发菌株混合，在温度为26℃，转速为150rpm/min摇床上作用20分钟，以20000r/min离心5min，用生理盐水洗涤一次，弃去上清夜，将菌体沉淀接种到LB固体培养基上，在温度为26℃条件下培养12小时。得到的培养物为质粒载体pRL1063a、出发菌株、插入转座子S17-1的突变菌株的混合物。
将培养好的菌体沉淀用牙签到下，用MG液体培养基悬浮，涂布到MG固体培养基(卡那霉素浓度为5μg/L、链霉素浓度为20μg/L)平板上，在温度为26℃条件下培养5天，将长出的单菌落转接到新的MG固体培养基(卡那霉素浓度为5μg/L、链霉素浓度为20μg/L)平板上，在温度为26℃条件下培养24小时。得到的培养物为质粒载体pRL1063a、插入转座子S17-1的突变菌株的混合物。
以luxAB基因为目的基因进行PCR扩增，选取能扩出目的基因片段的菌落(如图2)，在温度为26℃条件下培养12小时；所得培养物为插入转座子S17-1的突变菌株。
接种培养好的菌落到MG液体培养基(卡那霉素浓度为5μg/L、链霉素浓度为20μg/L)中，在温度为26℃，转速150rpm/min摇床上培养到OD值达到0.6时，按接种量的1％转接到HSC培养基中，在温度26℃，转速150rpm/min摇床上培养2天，提取冠菌素。提取出的冠菌素用色谱淋洗剂甲醇溶解，进行高效液相色谱检测。冠菌素产量为35mg/l。
实施例3
将质粒载体pRL1063a和出发菌株分别在含有浓度为15μg/L卡那霉素的LB培养基上培养；按体积比1∶2取生长对数期的质粒载体pRL1063a和出发菌株混合，在温度为32℃，转速为300rpm/min摇床上作用40分钟，10000r/min离心15min，弃去上清夜，将菌体沉淀接种到LB固体培养基上，在温度为32℃条件下培养48小时。得到的培养物为质粒载体pRL1063a、出发菌株、插入转座子S17-1的突变菌株的混合物。
将培养好的菌体沉淀用牙签刮下，MG用液体培养基悬浮，涂布到MG固体培养基(卡那霉素浓度为15μg/L、链霉素浓度为40μg/L)平板上，在温度为32℃条件下培养10天，将长出的单菌落转接到新的MG固体培养基(卡那霉素浓度为15μg/L、链霉素浓度为40μg/L)平板上，在温度为32℃条件下培养36小时。得到的培养物为质粒载体pRL1063a、插入转座子S17-1的突变菌株的混合物。
以luxAB基因为目的基因进行PCR扩增，选取能扩出目的基因片段的菌落(如图2)，在温度为32℃条件下培养48小时；所得培养物为插入转座子S17-1的突变菌株。
接种培养好的菌落到MG液体培养基(卡那霉素浓度为15μg/L、链霉素浓度为40μg/L)中，在温度为30℃，转速300rpm/min摇床上培养到OD值达到0.8时，按接种量的3％转接到HSC培养基中，在温度28℃，转速300rpm/min摇床上培养10天，提取冠菌素。提取出的冠菌素用色谱淋洗剂甲醇溶解，进行高效液相色谱检测。冠菌素产量为40mg/l。
实施例4
接种丁香假单胞菌大豆致病变种CGMCC 1276的单菌落到装有B液体培养基(卡那霉素浓度为10μg/L、链霉素浓度为30μg/L)的试管中，在温度26℃，转速260rpm/min摇床上培养种子液。当种子液OD值达到0.7时，取1ml转接到500ml三角瓶、内装50mlC培养基(卡那霉素浓度为10μg/L、链霉素浓度为30μg/L)中，在温度26℃，转速260rpm/min摇床上培养5天，提取冠菌素。进行三个重复处理。进行高效液相色谱检测，确认是冠菌素，产量达37.5mg/l。
实施例5
接种丁香假单胞菌大豆致病变种CGMCC 1276的单菌落到装有B液体培养基(卡那霉素浓度为10μg/L、链霉素浓度为30μg/L)的试管中，在温度28℃，转速260rpm/min摇床上培养36-48小时，为一级种子液。
将250ml B液体培养基分装于三个500ml三角瓶中。将培养好的一级种子液按1-2％接种量分别接种于上述三个500ml三角瓶中，在温度28℃，转速260rpm/min摇床上培养36-48小时，为二级种子液。
用7升的发酵罐内装5升的C培养基，用常规高压热蒸汽灭菌发灭菌后，按1-2％接种量接种二级种子液，通气搅拌。发酵温度28℃，发酵pH5.5-6.8。
发酵时间达到5天时下罐。下罐发酵液以大网格树脂吸附法回收产品，并用乙醇洗脱，经重结晶，得到无色结晶状冠菌素产品，产量为37.3mg/l。
Claims (2)
1.一种基因工程菌，该菌株为丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)CGMCC 1276。
2.权利要求1所述的基因工程菌的用途，其特征在于将所述菌株用于冠菌素的发酵生产中。
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