CN101948764B

CN101948764B - 产冠菌素桑丁香假单胞菌株及其发酵生产冠菌素的方法

Info

Publication number: CN101948764B
Application number: CN2010101713385A
Authority: CN
Inventors: 吴福安; 王俊; 梁垚; 陈明胜; 方水琴; 吕荣斌
Original assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Current assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Priority date: 2010-05-13
Filing date: 2010-05-13
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2030-05-13
Also published as: CN101948764A

Abstract

本发明公开了一种产冠菌素桑丁香假单胞菌株及其发酵生产冠菌素的方法。发明中涉及的一株桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13菌已保藏，保藏日期为2010年2月1日，保藏登记号为CGMCC No.3621。桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13的高温(32℃)产冠菌素活性。

Description

产冠菌素桑丁香假单胞菌株及其发酵生产冠菌素的方法

一、技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株产冠菌素桑丁香假单胞菌株M4-13及其发酵生产冠菌素的方法。

二、背景技术

现有技术：冠菌素(Coronatine，COR，C₁₈H₂₅NO₄)于1977年首次由Ichihara等从丁香假单胞菌绛红致病变种(Pseudomonas syingaepv.atropurpurea)的培养液中分离获得。冠菌素由两个特殊的部分构成，即：双环羧酸，称为冠面酸(Coronafacicacid，简称CFA)和环丙基氨基酸，称为冠氨酸(Coronamic acid，简称CMA)。

冠菌素作为新型的多功能复合型植物激素，具有着极其广泛的功能与应用前景。不仅与生长发育有关，并且与植物自身防御系统有着重大的关联。它能够调控生长、抑制衰老、促进细胞分化、提高叶绿素含量和植物抗逆性(提高抗旱性、抗寒性、抗盐性)，生物活性比茉莉酸C₁₂H₁₈O₃(jasmonic acid，JA)高100～10000倍。还可以促进多种植物次级代谢产物的生产，如大豆抗毒素和类黄酮，水稻田灭草(提高水稻叶中的樱花素和二萜内酯A含量，它们对稻田杂草有较高的抑制活性)，抗肿瘤药物红豆杉紫杉醇的产生，改善烟草品质等，总之，COR应用浓度低，并且诱导次生物质产量大大提高，具有其他生长调节物质所无法比拟的优势，有进一步研究的价值和开发潜力。

目前对于冠菌素的生产研究大多集中于发酵法生产，早期人们虽然建立了化学合成冠菌素的方法，取得了冠菌素生产研究历史上里程碑式的成功，不过除了理论研究上的意义之外，其极低的产率与高昂的代价，使得人们对于通过化学合成法获得大量冠菌素的设想落空，因此人们开始关注发酵法获得大量冠菌素的研究，进展迅速。如日本北海道大学市原狄民等(1998)用发酵法从250升发酵液中得到冠菌索、冠菌酸和冠烷酸共200毫克(其中冠菌素60毫克)；张国栋(2003)发酵两次共得到发酵液约300升，提取获得结晶成品1克左右和部分母液，总数约1.3克(母液折成成品计)。其他少有大规模发酵的报道，吴晓玉等在培养基中添加适量锰离子可促进菌株的生长及其冠毒素产量提高。吴慧玲等诱变得2株在常温下产生冠菌素的突变株MFB132和MFB141。该突变株发酵温度由18℃上升到28℃，MFB141的冠菌素产量达到37.66mg/L。因此，采用发酵法生产冠菌素是工业化生产的可行方法。

不过，以往报道的产冠菌素菌株生产COR的发酵过程均需在低温(＜28℃)下进行，因此低温发酵成为其工业化生产的瓶颈。因为利用大规模发酵法发酵生产COR就必定会产生大量热量，而降温设备造成成本昂贵，利用化学法合成又无法满足大规模应用的需求，因此，寻找合适的耐高温产冠菌素菌株是工业化大规模生产冠菌素的基础。本专利首次从桑树的桑疫病组织中分离致病菌桑丁香假单胞菌，并在高温培养条件(32℃)下检测到冠菌素产生，说明了其高温条件下的产冠菌素活性。一方面，传统的产冠菌素菌株报道的产冠菌素活性范围在28℃以下，本菌株首次突破了这一温度限制，虽然产量不高，但作为良好的出发菌株，有助于突破长期以来困扰冠菌素大规模发酵的低温限制性因素，为相关的应用于研究奠定的基础；另一方面，本专利提供的菌种作为桑树的桑疫病致病菌，其产冠菌素特性的发现对于揭示桑疫病传播和流行机理提供了重大线索，对于我国蚕桑产业的健康发展有着至关重要的意义。

三、发明内容

技术问题：针对以上问题，本发明分离筛选桑疫病致病菌桑丁香假单胞菌，并分别在首次从发酵液中分离检测到冠菌素，经过发酵条件优化，可使之表现稳定的产冠菌素能力。

技术方案：一株桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13菌株，保藏日期为2010年2月1日，保藏登记号为CGMCC No.3621。桑丁香假单胞菌M4-13的筛选和发酵条件的优化。在温度25～40℃的培养基中接菌，摇瓶培养1～14天得发酵液，所述培养基的pH 7.5～8.0，培养基质量百分比为：磷酸氢二钾0.2％～0.6％、磷酸二氢钾0.05％～0.6％、氯化铵0.01％～0.5％、七水合硫酸镁0.001～0.1％、葡萄糖0.1％～5％，氯化高铁1～15μM；18℃下7天(32℃下3天)取发酵液，NaOH调节发酵液PH至9～12，乙酸乙酯反复萃取两次，取水相，再调节PH至2～5，乙酸乙酯萃取两次，取有机相，减压蒸馏致结晶，以甲醇溶解，得冠菌素甲醇溶液。

有益效果：本发明的微生物分类命名为桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringaepv.mori)M4-13菌株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏单位地址：中国北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。保藏编号是：CGMCC No.3621，保藏时间是2010年2月1日。

本发明首次从桑疫病组织中分离致病菌桑丁香假单胞菌，并发现其产冠菌素特性，且在高温(32℃)下检测到冠菌素产生，说明了其高温条件下的产冠菌素活性。一方面，传统的产冠菌素菌株报道的产冠菌素活性范围在28℃以下，本菌株首次突破了这一温度限制，为大规模工业化生产提供了一种新的出发菌株，有助于突破长期以来困扰冠菌素大规模发酵的低温限制性因素，为相关的应用研究奠定了基础；另一方面，作为桑疫病致病菌，其产冠菌素特性的发现对于揭示桑疫病传播和流行机理提供了重大线索，对于我国蚕桑产业的健康发展有着至关重要的意义。

本发明菌株桑丁香假单胞菌系从桑疫病发病部位中分离得到，观察分析了该菌形态特征、培养特征、生理特性及代谢特征，结果表明该菌株具有以下特征：(1)形态学特征：生长迅速，长成的菌落白色，正反面颜色均一，呈圆形，鼻涕状(见附图1)，革兰氏染色为阴性(见附图2)；(2)培养特征：利用标准LB培养基，与优化HSC培养基均能正常生长，(3)生理特征：对碳源、氮源及温度有广泛的适应性，易培养；(4)代谢特征：将该菌液体扩大培养后应用HPLC分析发现，其在18℃和32℃条件下均有冠菌素产生。

四、附图说明

图1为桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13菌株经培养的形态学特征；

图2为桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13菌株经革兰氏染色结果。

五、具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

本实施例说明桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13菌株的筛选过程。

采集染桑疫病桑枝和叶片，捣碎放入50mL无菌水的锥形瓶中，加入20颗左右的玻璃珠，剧烈震荡20min，使组织完全捣碎，静置。在每只50mL无菌水的三角瓶中加入1mL土壤样品悬浮液，放入恒温振荡培养箱培养，37℃下培养2天。

取悬液涂布于初筛MG平板培养基上，进行产酶菌株的初筛。每升初筛培养基的组分为：蛋白胨5.0g，甘露醇5.0g，谷氨酸钠1.15g，生物素0.0001g，磷酸氢二钾0.25g，氯化钠0.1g，七水合硫酸镁0.1g，琼脂11g。温度32℃，培养时间1～6天。挑选产生菌落较大的菌株20株，接种到King’B斜面培养基。King’B培养基基本配方，每升组分为：蛋白胨20.0g，磷酸氢二钾1.5g，七水合硫酸镁1.5g，琼脂15g，ph7.2±0.2；使用方法：称取基本配方38g，加入蒸馏水1L，并加入10ml甘油，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管，每管5ml，制成斜面。32℃斜面培养过夜，接种至HSC培养基，HSC培养基基本配方，每升组分为：磷酸氢二钾4.1g、磷酸二氢钾3.6g、氯化铵1g、七水合硫酸镁0.2g、氯化高铁2μM、葡萄糖20g，18度培养七天，取发酵液经HPLC检测。

HPLC法的检测条件为：

色谱柱：Alltima C₁₈(150mm×4.6mm)；流动相：0.5g/L磷酸∶甲醇(40∶60，V/V)；检测波长：230nm；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL。

实施例2

本实施例说明桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13菌株利用标准LB培养基于18℃下的产冠菌素活性。

每升培养基组成：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，氯化钠10g，将桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13以1％的接种量接种于培养基中，于温度18℃好气培养7天，取发酵液经HPLC检测，浓度为0.54mg/L。

实施例3

本实施例的方法与实施例2相同，改用优化HSC培养基培养，检测其产冠菌素活性。

每升培养基组成：磷酸氢二钾4.1g、磷酸二氢钾3.6g、氯化铵1g、七水合硫酸镁0.2g、氯化高铁2μM、葡萄糖20g，将桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringaepv.mori)M4-13以1％的接种量接种于培养基中，于温度18℃好气培养7天，取发酵液经HPLC检测，浓度为2mg/L。

实施例4

本实施例的方法与实施例3相同，改变温度至32度，检测其产冠菌素活性。

每升培养基组成：磷酸氢二钾4.1g、磷酸二氢钾3.6g、氯化铵1g、七水合硫酸镁0.2g、氯化高铁2μM、葡萄糖20g，将桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringaepv.mori)M4-13以1％的接种量接种于培养基中，于温度32℃好气培养3天，取发酵液经HPLC检测，浓度为0.003mg/L。

实施例5

本实施例的方法与实施例3相同，改变温度及发酵时间，检测其产冠菌素活性。

每升培养基组成：磷酸氢二钾4.1g、磷酸二氢钾3.6g、氯化铵1g、七水合硫酸镁0.2g、氯化高铁2μM、葡萄糖20g，将桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringaepv.mori)M4-13以1％的接种量接种于培养基中，于温度32℃好气培养1天，变温至18℃发酵2天，取发酵液经HPLC检测，浓度为3.5mg/L。

Claims

1.一株桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13菌株，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2010年2月1日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.3621。

2.利用权利要求1所述的桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13菌株发酵生产冠菌素的方法，其特征在于：利用桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13菌株进行发酵产冠菌素培养：在温度25～40℃的培养基中接菌，摇瓶培养1～14天得发酵液，发酵培养基的pH 7.5～8.0，培养基质量百分比为：磷酸氢二钾0.2％～0.6％、磷酸二氢钾0.05％～0.6％、氯化铵0.01％～0.5％、七水合硫酸镁0.001～0.1％、葡萄糖0.1％～5％，氯化高铁1～15μM；在18℃下培养，发酵5～14天所得发酵液，经HPLC均检测到冠菌素生成或在32℃下培养，发酵3天所得发酵液，经HPLC检测到冠菌素生成。

3.利用权利要求1所述的桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13菌株发酵生产冠菌素的方法，其特征在于：在温度25～40℃的培养基中接菌，所述培养基的pH 7.5～8.0，培养基质量百分比为：磷酸氢二钾0.2％～0.6％、磷酸二氢钾0.05％～0.6％、氯化铵0.01％～0.5％、七水合硫酸镁0.001～0.1％、葡萄糖0.1％～5％，氯化高铁1～15μM，于温度32℃好气培养1天，变温至18℃发酵2天，取发酵液经HPLC检测到冠菌素生成。