CN102517370B - 一种产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法，包括(1)菌株培养，(2)构建菌体浓度-温度生长曲线，(3)温度处理点生长速率，(4)温度速率模型选择与拟合。温度是产冠菌素菌株生长关键因素，也是生产上调控和优化发酵过程的关键因素。本发明提供菌种生长发育关键温度(生长起始温度、最适生长和高温致死临界温度)的测定方法，可以稳健地提供菌种种群温度特征，为今后冠菌素菌株选育提供稳健可靠的实用技术。

Description

一种产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及调控发酵生产植物生长物质的方法，尤其涉及一种产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法，可靠地确定描述产冠菌素菌株生长发育关键温度(生长起始温度、最适生长和高温致死临界温度)的方法。

背景技术

温度是生物生命活动不可缺少的因素，是影响生命进程的基本因子。像细菌一类的变温生物，本身产热量低，代谢热和环境热比起来所起的作用较小，菌株的体温随着外界环境温度变化而改变。在自然选择和人工选择压力下，大多数细菌不同生态菌株，在一定条件下，都有一个特定的温度适应范围。在一定时空范围内，细菌把这种对温度的适应性，表现为在种群水平上生态学参数的差异，可以通过实验室恒温培养、数学建模来量化菌株的温度特征。

目前，有许多数学模型可以用来作为这种量化的工具。与线性数学模型相比，“温度-发育速率”非线性模型由于在建模过程中，一般都具有较为坚实的生理、生化信息等基础，因而常常被广泛应用。但是在不同条件下，各种数学模型的适应性有着明显的差别。

冠菌素(Coronatine，COR，C₁₈H₂₅N0₄)是一种新型高效的生物源植物生长物质，多由丁香假单胞菌属的植物致病菌变种分泌于胞外，能有效促进植物次级代谢产物的生物合成，提高植物抗逆性，活性比茉莉酸高100～10000倍。因此，冠菌素合成有着广阔的市场前景。目前，获得冠菌素的途径主要有化学合成和生物合成。化学合成冠菌素的过程繁杂，得率仅有6.98％，合成费用高。生物合成冠菌素主要通过植物疫病的致病菌发酵产生。冠菌素产生菌株的经典菌株为Pseudomonas syringae pv.glycinea PG4180，早期研究表明经典菌株不能满足工业生产的需求。因此新菌株的选育成为后期研究的基础，但大部分产冠菌素菌株为植物病原菌，获得相对困难，因此对于经典菌株的诱变选育成为研究热点.

张国栋、李召虎和吴慧玲等利用紫外和亚硝基胍等物理化学诱变法提高传统菌株的冠菌素产量。焦睿利用了Tn5转座子对冠菌素产生菌株丁香假单胞菌大豆致病变种(P.syringae.pv.glycinea)PG4180进行诱变；Bender等向hRcC基因中加入抗卡那霉素基因，获得APV1菌种，它可以适应大规模生产冠菌素的温度(26℃)要求，并且菌种没有致病性；吴晓玉等分别以菌株对萘代谢的温度敏感性及对红霉素抗性为筛选标志，依次采用亚硝基胍、5-溴尿嘧啶、紫外线、吖啶橙与紫外线混合等诱变方式，经系列推理选育，获得产冠菌素能力为100μg/mL的突变菌株，比野生菌株产量提高了7.3倍。诚然，紫外诱变与亚甲基胍结合诱变使冠菌素产量得到了一定提高，然而也曝露出了工作量大、效率低的问题，这是传统诱变育种的共同问题，而且无论如何诱变选育，到目前为止，所获得的新菌株耐受温度仍然停留28℃(与野生菌株的冠菌素发酵极限温度一致)，因此要获得适宜工业应用的菌株，筛选耐温新型冠菌素产生菌株极为必要。

申请人前期成功筛选到一株桑丁香假单胞菌株(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13(CGMCC No.3621)具有产冠菌素特性，且在高温(32℃)下检测到冠菌素的产生(专利公开号CN 101948764A)。这表明温度不仅是冠菌素生物合成关键因素，也是菌株本身生长关键因子，对其温度特征描述、界定与保护成为这方面技术所必须部分，但目前未见确定产冠菌素菌株生长发育关键温度(生长起始温度、最适生长和高温致死临界温度)方法的报道与专利，而目前已经发表的这方面应用论文都没有考虑到模型参数在拟合后的显著性，以及生长起始温度、最适生长和高温致死临界温度获得的可靠性检测，这往往造成拟合获得的参数不切合实际。

发明内容

解决的技术问题：

针对以上问题，本发明的目的是为了便于调控和优化植物生长物质冠菌素的发酵过程，提供一种产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法。通过此方法，来描述桑丁香假单胞菌株(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13(CGMCC No.3621)生长起始温度、最适生长和高温致死临界温度。

技术方案：

一种产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法，步骤为：

(1)菌株培养

将菌株在LB固体平板上涂布，32℃培养1d，挑单菌落于LB液体培养基中32℃试管培养1d，将菌液稀释20000倍，再次涂布，挑单菌落于LB液体培养基中32℃试管培养1d，将菌液转移到含有200mL发酵培养基的500mL摇瓶内，在14℃～40℃范围内选取不同温度条件下，摇床280r/min培养。

(2)构建菌体浓度-温度生长曲线

每隔1h取3mL发酵液并回注液体培养基3mL，于550nm处分光光度计法测定菌液吸光度，绘制菌株在不同培养温度下的生长曲线，建立菌体浓度-温度生长曲线。

(3)温度处理点生长速率

以菌体浓度-温度生长曲线对数期的斜率m(菌体浓度由分光光度法测得，λ＝550)，下列公式：

$k=\frac{m}{\log 2}$

求得生长速率k。

(4)温度速率模型选择与拟合

选择Briere温度速率模型(Briere et al.，1998)作菌株生长发育关键温度(生长起始温度和高温致死临界温度)基本分析。该温度速率模型如下式所示：

$V\left(t\right)=\mathrm{at}(t-T_0){\left(\sqrt{T_L-t}\right)}^{\frac{1}{m}}$

其中：V(t)是细菌(菌株：M4-13)温度在t(t＝17.85，19.85，21.85，24.85，29.85，31.85，34.85，36.85，39.85℃)时的发育速率(1/天)；a为尺度参数，调节曲线达到最大值；m为形状参数，调节曲线的对称性；T₀为低温发育临界温度(℃)，低于此温度该菌就不生长；T_L为高温临界发育温度(℃)，高于此温度该菌也不能生长。

最适发育温度(℃)按Briere等(1998)方程求得：

$T_{\mathrm{opt}}=\frac{{2\mathrm{mT}}_L+(m+1)T_0)+\sqrt{{4m}^2{T}_L^2+{(m+1)}^2{T}_0^2-{4m}^2{T}_L{T}_0}}{4m+2}$

其中：T_opt为最适发育温度(℃)；T₀为低温发育临界温度(℃)，低于此温度该菌就不生长；T_L为高温临界发育温度(℃)，高于此温度该菌也不能生长；m为形状参数，调节曲线的对称性。

细菌只能在一个温度区段里才能生长，也就是：在非常低的温度区间里，它们不能生长；在非常高的温度区间里也不能生长，甚至会死亡。即使在细菌能生长的一段区间温度区域内，细菌也有三种生长表型：在一段适宜的温度区域，细菌的发育速率与温度关系的呈线形；在环境温度由细菌不能生长的低温向能生长温度过渡进程中存在一个温度门限，即发育临界温度，也叫低温发育临界温度，在此临界温度向适宜温度区间升高，细菌的发育速率是一个非线性加速上升过程；当温度高于适宜温度之后，随着环境温度升高，发育速率就会增大，当增大到一个最大值后，细菌发育速率呈非线性急速递减现象，当递减到一个高温临界点(T_L)就停止发育，这个临界点称为高温临界发育温度。

在整个细菌可以发育的温度区段内，发育速率曲线的上升部分(在低温区间内)与下降部分(在低温区间内)是呈非对称分布，而且整个曲线向低温部分偏斜，这种关系反映了细菌对环境温度变化的自我调节效应，是细菌在种群水平上表现出一种保守性，反映了该种株在种群水平上的一种内禀特性。

因此，本专利采用T_opt(最适发育温度)、T₀(低温发育临界温度)和T_L(高温临界发育温度)来描述细菌的特征。

(5)Briere温度速率模型参数拟合

采用上述(3)的生长速率k为上述(4)模型中的发育速率V(t)，在t＝14.85，17.85，19.85，21.85，24.85，29.85，31.85，34.85，36.85，39.85℃时，采用麦夸法(Levenberg-Marquardt，LM)结合通用全局方法，对上述(4)中B riere温度速率模型进行拟合来估计T_opt(最适发育温度)、T₀(低温发育临界温度)和T_L。

(6)温度参数统计推断

利用再抽样方法对T_opt(最适发育温度)、T₀(低温发育临界温度)和T_L(高温临界发育温度)进行统计推断：以获得M4-13(CGMCC No.3621)的T_opt、T₀和T_L点估计；和T_opt、T₀和T_L的置信区间估计。

其步骤为：首先，按上述(5)的方法，在t＝14.85，17.85，19.85，21.85，24.85，29.85，31.85，34.85，36.85，39.85℃时，来拟合T_opt、T₀和T_L的模型拟合值；然后，以14.85，17.85，19.85，21.85，24.85，29.85，31.85，34.85，36.85，39.85为顺序，每次移去去掉一个值及相应的坐标点，再按上述方法拟合T_opt、T₀和T_L的模型拟合值，这样顺序移动去掉至第10个值(39.85)，以构建T_opt、T₀和T_L的再抽样样本，然后按t分布估计T_opt、T₀和T_L的点及置信区间。

M4-13(CGMCC No.3621)温度描述采用该菌株生长发育关键温度的T_opt(最适发育温度)；T₀(低温发育临界温度)和T_L(高温临界发育温度)值。分别为：最适生长温度29.82℃(29.36-30.29℃)；高温致死临界温度39.74℃(39.28-40.21℃)和生长起始温度9.19℃(8.52-9.86℃)。

有益效果：

本发明提供的冠菌素菌株生长发育关键温度测定方法，可以稳健地提供菌株的种群温度特征。

温度是产冠菌素菌株生长关键因素，也是生产上优化和调控发酵过程的关键因素。本发明提供菌种关键温度(生长起始温度、最适生长和高温致死临界温度)测定方法，为今后冠菌素菌株选育提供了稳健可靠的实用技术。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

香假单胞菌株M4-13的最适发育温度(T_opt)；低温发育临界温度(T₀)和高温临界发育温度(T_L)是该菌株对环境温度变化的自我调节效应，是细菌在种群水平上表现出一种保守性，反映出该种株在种群水平上的一种内禀特性。进行统计推断：获得M4-13(CGMCC No.3621)的T_opt、T₀和T_L点估计；和T_opt、T₀和T_L的置信区间估计。

实施例1

菌株生长曲线

在一个具体温度条件控制下，将少量的单细胞微生物(桑丁香假单胞菌株M4-13)接种纯种到一定容积的液体培养基后，在适宜的条件下培养，定时取样测定细胞数量。以细胞增长数目的对数做纵坐标，以培养时间做横坐标，绘制一条曲线，即该菌株生长曲线。在此曲线上，显示菌株的生长繁殖的4个时期：迟缓期，对数期，稳定期，衰亡期。一般在对数期(又称指数期)，菌株个体以稳定的几何级数极快增长，可持续一段稳定时期。此期间细菌的形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，是研究细菌性状最好时期，也最具有典型代表特征，以此阶段的斜率代表这个温度条件下的菌株发育情况。

具体按下列步骤进行：

在灭菌条件下，在超净工作台里，将桑丁香假单胞菌株M4-13在LB固体平板上涂布，32℃预培养1d，挑单菌落于LB液体培养基中32℃试管在培养1d，然后，将菌液稀释20000倍，再次进行涂布，挑单菌落于LB液体培养基中32℃试管又培养1d。

取一定上述准备好的菌液转移到含有200mL发酵培养基的500mL摇瓶内，在温度为14.85，17.85，19.85，21.85，24.85，29.85，31.85，34.85，36.85和39.85℃条件下，摇床280r/min培养，每个温度处理重复3次，每隔1h取3mL发酵液并回注液体培养基3mL，于550nm处分光光度计法测定菌液吸光度。

根据各温度条件下的菌株生长曲线，以菌体浓度-温度生长曲线对数期的斜率m，按下式：

$k=\frac{m}{\log 2}$

求出温度为14.85，17.85，19.85，21.85，24.85，29.85，31.85，34.85，36.85和39.85℃条件下的各生长速率k。

用各k代表发育速率V(t)，(t＝14.85，17.85，19.85，21.85，24.85，29.85，31.85，34.85，36.85，39.85)，其相应的值分别依次为：0.19894、0.29403、0.36047、0.51275、0.62054、0.82439、0.97809、0.95461、0.82605和0.23926。

模型拟合与参数获得

采用麦夸法(Levenberg-Marquardt algorithm，LMA)进行Briere温度速率模型曲线进行拟合，获得如下结果：

然后按下列最适发育温度方程：

$T_{\mathrm{opt}}=\frac{{2\mathrm{mT}}_L+(m+1)T_0)+\sqrt{{4m}^2{T}_L^2+{(m+1)}^2{T}_0^2-{4m}^2{T}_L{T}_0}}{4m+2}$

求得最适发育温度为T_opt＝29.5870(℃)。

模型拟合的决定系数(R²)为0.9883，拟合误差为0.0398；F统计量169.6240，拟合显著性(p＞F，p＝0.05)0.0000；最大绝对误差为0.0596，总方差0.8165，说明拟合效果非常优良。

特别强调的，是模型参数拟合后的显著性检验，这在生物模型拟合领域中，国内没有过报导一个模型4参数同时能通过显著性检验。我们4个参数的p分别为0.0000、0.0008、0.0000、0.0003，均小于0.05，达到显著水平。

实施例2

此实施说明丁香假单胞菌株M4-13关键温度(生长起始温度、最适生长和高温致死临界温度)可靠性。

按实施例1中的方法，分别拟合以下10种情况下的Briere温度速率模型中各参数及最适生长温度值。具体如下：

以14.85，17.85，19.85，21.85，24.85，29.85，31.85，34.85，36.85，39.85为顺序，每次移去去掉一个值及相应的坐标点，再按上述方法拟合T_opt、T₀和T_L的模型拟合值，这样顺序移动去掉至第10个值(39.85)，以构建T_opt、T₀和T_L的10个再抽样样本，然后按t分布估计T_opt、T₀和T_L的点及置信区间：

特征描述	代表值	95％上限	95％下限
				最适生长温度	29.82	29.36	30.29
高温致死临界温度	39.74	39.28	40.21
				生长起始温度	9.19	8.52	9.86

这里强调的是这种再抽样方法，是模拟实验设计时的实验方案制定过程。在理论上，由于模型只有4个参数，在实验设计时只要设计5个数据对就可以进行该模型拟合。但考虑到生长与发育温度段细菌本身生存特征，先取5个点不能随机的选择，如果集中选择在某一个温度段，例如在适宜温度段，那用线性模型是为合适，不能反应其它几个温度特征描述变量，如最适生长温度和高温致死临界温度。

所以，本实施例首次在反复实验与统计比较后选择这种方法，且得出的结果与实际相近。

实施例3

此实施例说明诊断丁香假单胞菌株M4-13关键温度(生长起始温度、最适生长和高温致死临界温度)再抽样过程中可靠性。

在拟合以下10种情况下的Briere温度速率模型中各参数及最适生长温度值过程中，分别考察它们的显著性。这10种情况如下：

以14.85，17.85，19.85，21.85，24.85，29.85，31.85，34.85，36.85，39.85为序列，每次移去去掉一个值及相应的坐标点，再按上述方法拟合T_opt、T₀和T_L的模型拟合值，这样顺序移动去掉至第10个值(39.85)，以构建T_opt、T₀和T_L的10个再抽样样本，然后对各再抽样样本拟合的T₀和T_L的其它参数拟合参数和拟合度进行分析。

10个再抽样样本的拟合的决定系数分别为：R²＝0.9881、0.9869、0.9893、0.9888、0.9893、0.9902、0.9929、0.9866、0.9916、0.9919，在0.9866-0.9929之间，均大于显著水平0.95。说明均有很好地拟合效果。

10个再抽样样本的拟合的生长起始温度的p＞|t|概率值分别为：0.0013、0.0042、0.0031、0.0020、0.0017、0.0008、0.0021、0.0021、0.0105、0.0277，均小于显著水平0.05。说明这10个再抽样样本估计的生长起始温度有统计学意义，有较好的可靠性。

10个再抽样样本的拟合的高温致死临界温度的p＞|t|概率值分别为：0.0000、0.0000、0.0000、0.0000、0.0000、0.0000、0.0000、0.0000、0.0000、0.0000，均小于显著水平0.05。说明这10个再抽样样本估计的高温致死临界温度有统计学意义，有较好的可靠性。

由于最适生长温度是按下式算出：

$T_{\mathrm{opt}}=\frac{{2\mathrm{mT}}_L+(m+1)T_0)+\sqrt{{4m}^2{T}_L^2+{(m+1)}^2{T}_0^2-{4m}^2{T}_L{T}_0}}{4m+2}$

所以，T_opt(生长起始温度)在T₀(最适生长温度)和T_L(高温致死临界温度)都达到较好的可靠性后，只要参数m也达到可靠性，那么T_opt(生长起始温度)也有较好的可靠性。

10个再抽样样本的拟合的m的p＞|t|概率值分别为：0.0009、0.0012、0.0008、0.0010、0.0010、0.0006、0.0004、0.0010、0.0077、0.0374均小于显著水平0.05。说明这10个再抽样样本估计的m有统计学意义，即有较好的可靠性。

此外，在拟合过程中的控制参数a，在10个再抽样样本的拟合过程中的p＞|t|概率值分别为0.0001、0.0001、0.0001、0.0001、0.0001、0.0001、0.0000、0.0002、0.0002、0.0003，也均小于显著水平0.05。说明这10个再抽样样本估计的控制参数a也有统计学意义，即也有较好的可靠性。

实施例3

产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法，步骤为：

(1)菌株培养：

将M4-13菌株在LB固体平板上涂布，32℃培养1d，挑单菌落于LB液体培养基中32℃试管培养1d，将菌液稀释20000倍，再次涂布，挑单菌落于LB液体培养基中32℃试管培养1d，将菌液转移到含有200mL发酵培养基的500mL摇瓶内，在14℃～40℃范围内选取不同温度条件下，摇床280r/min培养；

(2)构建菌体浓度-温度生长曲线

每隔1h取3mL发酵液并回注液体培养基3mL，于550nm处分光光度计法测定菌液吸光度，绘制菌株在不同培养温度下的生长曲线，建立菌体浓度-温度生长曲线；

(3)温度处理点生长速率

以菌体浓度-温度生长曲线对数期的斜率m，菌体浓度由分光光度法测得，λ＝550，由下列公式：

$k=\frac{m}{\log 2}$

求得生长速率k；

(4)温度速率模型选择与拟合

选择Briere温度速率模型作菌株生长发育关键温度基本分析，该温度速率模型如下式所示：

$V\left(t\right)=\mathrm{at}(t-T_0){\left(\sqrt{T_L-t}\right)}^{\frac{1}{m}}$

其中：V(t)是细菌温度在t＝17.85，19.85，21.85，24.85，29.85，31.85，34.85，36.85，39.85℃时的发育速率，单位1/天；a为尺度参数，调节曲线达到最大值；m为形状参数，调节曲线的对称性；T₀为低温发育临界温度，低于此温度该菌就不生长；T_L为高温临界发育温度，高于此温度该菌也不能生长；最适发育温度按B riere方程求得：

$T_{\mathrm{opt}}=\frac{{2\mathrm{mT}}_L+(m+1)T_0)+\sqrt{{4m}^2{T}_L^2+{(m+1)}^2{T}_0^2-{4m}^2{T}_L{T}_0}}{4m+2}$

其中：T_opt为最适发育温度；T₀为低温发育临界温度，低于此温度该菌就不生长；T_L为高温临界发育温度，高于此温度该菌也不能生长；m为形状参数，调节曲线的对称性。

附表：表1-表10说明再抽样样本的各参数显著性检测，用于说明再抽样样本各样本点数据可靠性。

表1删除14.85温度点后M4-13菌株的Briere温度速率模型模型的T₀和T_L拟合值和T_opt值(R²＝0.9881)

表2删除17.85温度点后M4-13菌株的Briere温度速率模型模型的T₀和T_L拟合值和T_opt值(R²＝0.9869)

表3删除19.85温度点后M4-13菌株的Briere温度速率模型模型的T₀和T_L拟合值和T_opt值(R²＝0.9893)

表4删除21.85温度点后M4-13菌株的Briere温度速率模型模型的T₀和T_L拟合值和T_opt值(R²＝0.9888)

表5删除24.85温度点后M4-13菌株的Briere温度速率模型模型的T₀和T_L拟合值和T_opt值(R²＝0.9893)

表6删除29.85温度点后M4-13菌株的Briere温度速率模型模型的T₀和T_L拟合值和T_opt值(R²＝0.9902)

表7删除31.85温度点后M4-13菌株的Briere温度速率模型模型的T₀和T_L拟合值和T_opt值(R²＝0.9929)

表8删除34.85温度点后M4-13菌株的Briere温度速率模型模型的T₀和T_L拟合值和T_opt值(R²＝0.9866)

表9删除36.85温度点后M4-13菌株的Briere温度速率模型模型的T₀和T_L拟合值和T_opt值(R²＝0.9916)

表10删除39.85温度点后M4-13菌株的Briere温度速率模型模型的T₀和T_L拟合值和T_opt值(R²＝0.9919)

Claims (1)

1.一种产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法，其特征在于步骤为：

（1）菌株培养：

将保藏号CGMCC No.3621的桑丁香假单胞菌株（Pseudomonas syringae pv.mori）M4-13菌株在LB固体平板上涂布，32℃培养1d，挑单菌落于LB液体培养基中32℃试管培养1d，将菌液稀释20000倍，再次涂布，挑单菌落于LB液体培养基中32℃试管培养1d，将菌液转移到含有200mL发酵培养基的500mL摇瓶内，在14℃~40℃范围内选取不同温度条件下，摇床280r/min培养；

（2）构建菌体浓度-温度生长曲线

每隔1h取3mL发酵液并回注液体培养基3mL，于550nm处分光光度计法测定菌液吸光度，绘制菌株在不同培养温度下的生长曲线，建立菌体浓度-温度生长曲线；

（3）温度处理点生长速率

以菌体浓度-温度生长曲线对数期的斜率m，菌体浓度由分光光度法测得，λ=550，由下列公式：

$k=\frac{m}{\log 2}$

求得生长速率k；

（4）温度速率模型选择与拟合

选择Briere温度速率模型作菌株生长发育关键温度基本分析，该温度速率模型如下式所示：

$V\left(t\right)=\mathrm{at}(t-T_0){\left(\sqrt{T_L-t}\right)}^{\frac{1}{m}}$

其中：V（t）是细菌温度在t=17.85，19.85，21.85，24.85，29.85，31.85，34.85，36.85，39.85℃时的发育速率，单位1/天；a为尺度参数，调节曲线达到最大值；m为形状参数，调节曲线的对称性；T₀为低温发育临界温度，低于此温度该菌就不生长；T_L为高温临界发育温度，高于此温度该菌也不能生长；最适发育温度按Briere方程求得：

$T_{\mathrm{opt}}=\frac{{2\mathrm{mT}}_L+(m+1)T_0+\sqrt{{4m}^2{T}_L^2+{(m+1)}^2{T}_0^2-4m^2{T}_L{T}_0}}{4m+2}$

其中：T_opt为最适发育温度；T₀为低温发育临界温度，低于此温度该菌就不生长；T_L为高温临界发育温度，高于此温度该菌也不能生长；m为形状参数，调节曲线的对称性。