CN103396965A - 一种发酵培养基及其在制备冠菌素中的应用 - Google Patents
一种发酵培养基及其在制备冠菌素中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103396965A CN103396965A CN2013103368913A CN201310336891A CN103396965A CN 103396965 A CN103396965 A CN 103396965A CN 2013103368913 A CN2013103368913 A CN 2013103368913A CN 201310336891 A CN201310336891 A CN 201310336891A CN 103396965 A CN103396965 A CN 103396965A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- solute
- substratum
- syringae
- coronatine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种发酵培养基及其在制备冠菌素中的应用。本发明提供的培养基，由溶质和水组成，所述溶质及其在所述培养基中的浓度如下：甘油10-20g/L，氮源1-2g/L，磷酸二氢钾6-10g/L，硫酸镁0.1-0.2g/L和三氯化铁。本发明提供的培养基用于发酵生产冠菌素，具有如下优势：（1）以甘油作为碳源，可与其他组成成分共同灭菌，减少了对碳源进行单独灭菌的设备及将单独灭菌的碳源注入发酵罐的步骤，在保证冠菌素产量的前提下降低了对发酵设备的要求并排除了碳源注入步骤中可能出现的交叉污染；（2）大大提高了冠菌素的产量。本发明对于冠菌素的工业化发酵生产有重要的促进作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵培养基及其在制备冠菌素中的应用。
背景技术
冠菌素(Coronatine，COR）由一个含α－氨基酸的冠烷酸(Coronamic acid，CMA)和一个含聚酮结构的冠菌酸(Coronafacic acid，CFA)以酰胺键联结而成，其分子式为C18H25NO4，分子质量为319。
冠菌素最早从丁香假单胞菌绛红致病变种(Pseudomonas syingaepv.atropurpurea)的培养液中首次分离得到，以后陆续从一些丁香假单胞致病菌变种被发现，是一种非寄主专一性毒素。冠菌素是脱落酸、茉莉酸甲酯的功能类似物，具有调节植物生长、诱导乙烯和叶绿素酶的产生、抑制根的生长、抑制依赖水杨酸的防卫机制等作用，可以有效地提高植物的抗逆性，提高植物的抗旱性、耐盐性。作为一种新型高效的环境友好型植物生长调节剂，冠菌素获得了广泛的关注，具有极高的研究价值和实用前景。
目前冠菌素主要由冠菌素产生菌发酵产生，经典的冠菌素发酵培养基为Hoitink和Sinden描述的HSC培养基，包括（每升水中含有）：氯化铵1.0g、七水合硫酸镁0.2g、磷酸二氢钾4.1g、三水合磷酸氢二钾3.6g、D-葡萄糖10g、三氯化铁2μM。HSC培养基中的D-葡萄糖需单独灭菌，主要是由于混合灭菌时葡萄糖会发生焦糖反应，生成的物质不利于冠菌素产生。因此应用HSC培养基发酵生产冠菌素时，需要对葡糖糖进行单独灭菌后再注入发酵罐与其他成分混合，这就需要额外配置葡萄糖灭菌罐，提高了冠菌素生产的设备要求并容易造成交叉污染，不利于冠菌素的工业化发酵生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵培养基及其在制备冠菌素中的应用。
本发明提供的培养基，由溶质和水组成，所述溶质及其在所述培养基中的浓度如下：甘油10-20g/L（如10g/L-12g/L、12g/L-15g/L、15g/L-16g/L、16g/L-18g/L、18g/L-20.0g/L、10g/L、12g/L、15g/L、16g/L、18g/L或20.0g/L），氮源1-2g/L（如1g/L-1.3g/L、1.3g/L-1.8g/L、1.8g/L-2g/L、1g/L、1.3g/L、1.8g/L或2g/L），磷酸二氢钾6-10g/L（如6g/L-7g/L、7g/L-8g/L、8g/L-9g/L、9g/L-10g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L或10g/L），硫酸镁0.1-0.2g/L（如0.1g/L-0.12g/L、0.12g/L-0.15g/L、0.15g/L-0.18g/L、0.18g/L-0.2g/L、0.1g/L、0.12g/L、0.15g/L、0.18g/L或0.2g/L）和三氯化铁10-20μM/L（如10μM/L-12μM/L、12μM/L-15μM/L、15μM/L-18μM/L、18μM/L-20μM/L、10μM/L、12μM/L、15μM/L、18μM/L或20μM/L）。
所述氮源可为硝酸钾和/或氯化铵。所述氮源为硝酸钾和氯化铵时，硝酸钾的浓度可为0.3-1.0g/L，氯化铵的浓度可为0.8-1g/L。
所述培养基的pH可为6.5-7.0（如pH6.5-6.6、pH6.6-6.8、pH6.8-6.9、pH6.9-7.0、pH6.5、pH6.6、pH6.8、pH6.9或pH7.0）。
本发明还保护以上任一所述培养基在制备冠菌素中的应用。所述应用中，所述培养基作为冠菌素产生菌的发酵培养基。所述冠菌素产生菌为丁香假单胞菌。所述丁香假单胞菌具体可为保藏编号为CGMCC No.1276的菌株。
本发明还保护一种制备冠菌素的方法，包括如下步骤：采用以上任一所述的培养基发酵冠菌素产生菌，得到冠菌素。所述冠菌素产生菌为丁香假单胞菌。所述丁香假单胞菌具体可为保藏编号为CGMCC No.1276的菌株。
所述发酵的参数如下：18-20℃（如18℃-19℃、19℃-20℃、18℃、19℃或20℃）、150-200rpm（如150rpm-175rpm、175rpm-180rpm、180rpm-190rpm、190rpm-200rpm、150rpm、175rpm、180rpm、190rpm或200rpm）。
所述发酵的过程中，通气比可为1:0.5-1（如1:0.5-0.7、1:0.7-0.8、1:0.8-0.9、1:0.9-1、1:0.5、1:0.7、1:0.8、1:0.9或1:1）。
所述发酵的时间具体可为96小时。
所述冠菌素产生菌可以以种子液的形式接种至所述培养基；所述种子液中所述冠菌素产生菌的浓度为5×108-10×108cfu/mL（如5×108cfu/mL-6×108cfu/mL、6×108cfu/mL-7×108cfu/mL、7×108cfu/mL-8×108cfu/mL、8×108cfu/mL-10×108cfu/mL、5×108cfu/mL、6×108cfu/mL、7×108cfu/mL、8×108cfu/mL或10×108cfu/mL），所述接种的接种量可为1%-2%（如1%-1.5%、1.5%-1.8%、1.8%-2%、1%、1.5%、1.8%或2%）。所述接种量数据中的%代表体积比。
本发明提供的培养基用于发酵生产冠菌素，具有如下优势：（1）以甘油作为碳源，可与其他组成成分共同灭菌，减少了对碳源进行单独灭菌的设备及将单独灭菌的碳源注入发酵罐的步骤，在保证冠菌素产量的前提下降低了对发酵设备的要求并排除了碳源注入步骤中可能出现的交叉污染；（2）大大提高了冠菌素的产量。本发明对于冠菌素的工业化发酵生产有重要的促进作用。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。冠菌素标准品购自sigma公司。实施例中所用的各个发酵培养基均灭菌后使用，即将配制好的发酵培养基115℃灭菌30分钟。
实施例中所用的丁香假单胞菌为丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas.syringae pv.glycinea)，已于2004年12月21日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1276。见专利ZL200510011466.2。
种子培养基（MG培养基）的制备方法：将10g甘露醇、2.0g L-谷氨酸钠、0.5g磷酸二氢钾，0.2g氯化钠和0.2g七水合硫酸镁溶于水并用水定容至1L，pH7.0。
实施例1、发酵培养基的制备和应用
一、发酵培养基（GC培养基）的制备
发酵培养基的pH为6.5，由溶质和水组成，所述溶质及其在所述发酵培养基中的浓度如下：甘油10.0g/L，硝酸钾1.0g/L，磷酸二氢钾6.0g/L，硫酸镁0.1g/L和三氯化铁10μM/L。
二、发酵培养基的应用
1、将丁香假单胞菌接种至种子培养基，28℃、150rpm振荡培养，得到菌浓度为5×108cfu/mL的种子液。
2、将步骤1得到的种子液以1%（体积比）的接种量接种至装有步骤一制备的发酵培养基的发酵罐进行发酵；发酵参数：18℃、150rpm、通气比1:0.5、96小时。
3、步骤2的发酵完成后，取发酵上清进行HPLC检测。
使用带紫外检测器的高效液相色谱仪（美国Agilent公司，1200）进行，Angilent1200液相色谱仪，Eclipse Plus C18色谱柱，粒径5μm，4.6×250mm；取发酵上清1.0ml，过0.45μm滤膜后上样于高效液相色谱仪，进样体积为20μl；柱温为25℃；流动相由65体积份甲醇和35体积份5‰（体积比）乙酸水溶液组成，流速为1ml/min；检测波长为220nm；冠菌素标准品出峰对应的保留时间为6.67min。
以冠菌素标准品为外标，制作标准曲线，以冠菌素浓度（mg/L）为横坐标，冠菌素峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得线性方程为y=14.34x+50.623，其线性相关系数为0.9995。
根据线性方程计算发酵上清中冠菌素的浓度。
发酵上清中冠菌素的浓度为60.2mg/L。
实施例2、发酵培养基的制备和应用
一、发酵培养基的制备
发酵培养基的pH为7.0，由溶质和水组成，所述溶质及其在所述发酵培养基中的浓度如下：甘油20.0g/L，氯化铵2.0g/L，磷酸二氢钾10.0g/L，硫酸镁0.2g/L和三氯化铁20μM/L。
二、发酵培养基的应用
1、将丁香假单胞菌接种至种子培养基，28℃、150rpm振荡培养，得到菌浓度为10×108cfu/mL的种子液。
2、将步骤1得到的种子液以2%（体积比）的接种量接种至装有步骤一制备的发酵培养基的发酵罐进行发酵；发酵参数：20℃、200rpm、通气比1:1、96小时。
3、步骤2的发酵完成后，取发酵上清进行HPLC检测，方法同实施例1的步骤二的3。
发酵上清中冠菌素的浓度为86.5mg/L。
实施例3、发酵培养基的制备和应用
一、发酵培养基的制备
发酵培养基的pH为6.8，由溶质和水组成，所述溶质及其在所述发酵培养基中的浓度如下：甘油15.0g/L，硝酸钾0.3g/L，氯化铵1.0g/L，磷酸二氢钾7.0g/L，硫酸镁0.15g/L和三氯化铁15μM/L。
二、发酵培养基的应用
1、将丁香假单胞菌接种至种子培养基，28℃、150rpm振荡培养，得到菌浓度为8×108cfu/mL的种子液。
2、将步骤1得到的种子液以1%（体积比）的接种量接种至装有步骤一制备的发酵培养基的发酵罐进行发酵；发酵参数：18℃、180rpm、通气比1:0.8、96小时。
3、步骤2的发酵完成后，取发酵上清进行HPLC检测，方法同实施例1的步骤二的3。
发酵上清中冠菌素的浓度为110.6mg/L。
实施例4、发酵培养基的制备和应用
一、发酵培养基的制备
发酵培养基的pH为6.6，由溶质和水组成，所述溶质及其在所述发酵培养基中的浓度如下：甘油16.0g/L，硝酸钾1.0g/L，氯化铵0.8g/L，磷酸二氢钾10.0g/L，硫酸镁0.15g/L和三氯化铁12μM/L。
二、发酵培养基的应用
1、将丁香假单胞菌接种至种子培养基，28℃、150rpm振荡培养，得到菌浓度为6×108cfu/mL的种子液。
2、将步骤1得到的种子液以1.5%（体积比）的接种量接种至装有步骤一制备的发酵培养基的发酵罐进行发酵；发酵参数：19℃、175rpm、通气比1:0.7、96小时。
3、步骤2的发酵完成后，取发酵上清进行HPLC检测，方法同实施例1的步骤二的3。
发酵上清中冠菌素的浓度为67.8mg/L。
实施例5、发酵培养基的制备和应用
一、发酵培养基的制备
发酵培养基的pH为6.9，由溶质和水组成，所述溶质及其在所述发酵培养基中的浓度如下：甘油18.0g/L，硝酸钾2.0g/L，磷酸二氢钾8.0g/L，硫酸镁0.12g/L和三氯化铁18μM/L。
二、发酵培养基的应用
1、将丁香假单胞菌接种至种子培养基，28℃、150rpm振荡培养，得到菌浓度为7×108cfu/mL的种子液。
2、将步骤1得到的种子液以1.8%（体积比）的接种量接种至装有步骤一制备的发酵培养基的发酵罐进行发酵；发酵参数：20℃、190rpm、通气比1:0.9、96小时。
3、步骤2的发酵完成后，取发酵上清进行HPLC检测，方法同实施例1的步骤二的3。
发酵上清中冠菌素的浓度为90.6mg/L。
实施例6、发酵培养基的制备和应用
一、发酵培养基的制备
发酵培养基的pH为6.8，由溶质和水组成，所述溶质及其在所述发酵培养基中的浓度如下：甘油12.0g/L，氯化铵2.0g/L，磷酸二氢钾9.0g/L，硫酸镁0.18g/L和三氯化铁12μM/L。
二、发酵培养基的应用
1、将丁香假单胞菌接种至种子培养基，28℃、150rpm振荡培养，得到菌浓度为8×108cfu/mL的种子液。
2、将步骤1得到的种子液以1.8%（体积比）的接种量接种至装有步骤一制备的发酵培养基的发酵罐进行发酵；发酵参数：20℃、190rpm、通气比1:1、96小时。
3、步骤2的发酵完成后，取发酵上清进行HPLC检测，方法同实施例1的步骤二的3。
发酵上清中冠菌素的浓度为73.4mg/L。
对比例、HSC培养基的制备和应用
1、将丁香假单胞菌接种至种子培养基，28℃、150rpm振荡培养，得到菌浓度为8×108cfu/mL的种子液。
2、将步骤1得到的种子液以1%（体积比）的接种量接种至装有HSC培养基的发酵罐进行发酵；发酵参数：18℃、180rpm、通气比1:0.8、96小时。
3、步骤2的发酵完成后，取发酵上清进行HPLC检测，方法同实施例1的步骤二的3。
发酵上清中冠菌素浓度为38mg/L。
Claims (9)
1.一种培养基，由溶质和水组成，所述溶质及其在所述培养基中的浓度如下：甘油10-20g/L，氮源1-2g/L，磷酸二氢钾6-10g/L，硫酸镁0.1-0.2g/L和三氯化铁10-20μM/L。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述氮源为硝酸钾和/或氯化铵。
3.如权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：所述培养基的pH为6.5-7.0。
4.权利要求1至3中任一所述培养基在制备冠菌素中的应用。
5.一种制备冠菌素的方法，包括如下步骤：采用权利要求1至3中任一所述的培养基发酵冠菌素产生菌，得到冠菌素。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述冠菌素产生菌为丁香假单胞菌。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述发酵的参数如下：18-20℃、150-200rpm 。
8.如权利要求5至7中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵的过程中，通气比为1:0.5-1。
9.如权利要求5至8中任一所述的方法，其特征在于：所述冠菌素产生菌以种子液的形式接种至所述培养基；所述种子液中所述冠菌素产生菌的浓度为5×108-10×108cfu/mL，所述接种的接种量为1%-2%。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310336891.3A CN103396965B (zh) | 2013-08-05 | 2013-08-05 | 一种发酵培养基及其在制备冠菌素中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310336891.3A CN103396965B (zh) | 2013-08-05 | 2013-08-05 | 一种发酵培养基及其在制备冠菌素中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103396965A true CN103396965A (zh) | 2013-11-20 |
| CN103396965B CN103396965B (zh) | 2015-12-23 |
Family
ID=49560685
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310336891.3A Active CN103396965B (zh) | 2013-08-05 | 2013-08-05 | 一种发酵培养基及其在制备冠菌素中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103396965B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116004473A (zh) * | 2023-02-14 | 2023-04-25 | 成都新朝阳作物科学股份有限公司 | 一株冠菌素高产菌株、发酵方法及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101033457A (zh) * | 2007-02-16 | 2007-09-12 | 江西农业大学 | 一种伯克霍尔德菌生产冠毒素的方法及其发酵培养基 |
| CN101338291A (zh) * | 2008-08-28 | 2009-01-07 | 中国农业大学 | 一种制备冠菌素的方法及其专用菌株 |
| CN102229543A (zh) * | 2011-06-07 | 2011-11-02 | 中国农业大学 | 一种从发酵液中纯化提取冠菌素的方法 |
-
2013
- 2013-08-05 CN CN201310336891.3A patent/CN103396965B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101033457A (zh) * | 2007-02-16 | 2007-09-12 | 江西农业大学 | 一种伯克霍尔德菌生产冠毒素的方法及其发酵培养基 |
| CN101338291A (zh) * | 2008-08-28 | 2009-01-07 | 中国农业大学 | 一种制备冠菌素的方法及其专用菌株 |
| CN102229543A (zh) * | 2011-06-07 | 2011-11-02 | 中国农业大学 | 一种从发酵液中纯化提取冠菌素的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 仪宏等: "含葡萄糖培养基高温灭菌变色及其防范措施的研究", 《酿酒》 * |
| 徐志南等: "重组大肠杆菌生产hEGF发酵条件的研究", 《浙江大学学报（工学版）》 * |
| 梁垚: "桑疫病的分子检测及其病原菌发酵生产冠菌素的研究", 《江苏科技大学硕士学位论文》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116004473A (zh) * | 2023-02-14 | 2023-04-25 | 成都新朝阳作物科学股份有限公司 | 一株冠菌素高产菌株、发酵方法及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103396965B (zh) | 2015-12-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103966274A (zh) | 一种以水产品及其加工下脚料为原料生物转化生产γ-氨基丁酸的方法 | |
| CN102936252B (zh) | 一类二倍半萜类化合物及其制备方法与应用 | |
| CN108251462A (zh) | 一种厌氧发酵液中己酸回收处理的方法 | |
| CN102078799A (zh) | 一种用于吸附金属离子的细菌-麸皮复合颗粒料的制备方法 | |
| CN86105166A (zh) | 生产人参皂甙-Rd的一种方法 | |
| CN107974412B (zh) | 一种用于制备抗炎活性化合物peniroquesine A的娄地青霉及其应用 | |
| CN112322673B (zh) | 一种谷氨酸的发酵方法 | |
| CN102168034A (zh) | 一种海洋链霉菌以及利用该菌制备替达霉素a和b的方法 | |
| CN103396965B (zh) | 一种发酵培养基及其在制备冠菌素中的应用 | |
| CN101205523B (zh) | 一种酿酒酵母及其在制备β-羟基苯丙酸乙酯中的应用 | |
| CN1699585A (zh) | 一种生物抗菌剂的制备方法 | |
| CN105580638A (zh) | 一种促进牛樟芝液态发酵生长和三萜合成的方法 | |
| WO2024027251A1 (zh) | 一种利用狐粪青霉菌发酵生产7-羟基丁苯酞的方法 | |
| JPS5878594A (ja) | 抗生物質ｂ−４１ｄ、ｅ及びｇの製造法 | |
| CN100372926C (zh) | 恶臭假单胞菌及其在拆分扁桃酸外消旋体中的应用 | |
| JPS606629B2 (ja) | 発酵法によるアブサイジン酸の製造法 | |
| CN101270376B (zh) | 一种酶法合成l-茶氨酸的方法 | |
| CN105177065B (zh) | 一种生物转化法合成α-酮戊二酸的方法 | |
| CN107954839A (zh) | 一种抗炎活性化合物peniroquesine A及其制备方法和应用 | |
| CN103509840B (zh) | 一种提高阿尼芬净前体化合物Echinocandin B产量的方法 | |
| CN104152384B (zh) | 一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法 | |
| CN106748151A (zh) | 微生物增效螯合肥及其制备方法 | |
| CN101921822A (zh) | S-腺苷甲硫氨酸发酵生产方法及d-甲硫氨酸分离方法 | |
| CN108300740B (zh) | 一种制备l-苹果酸的方法 | |
| Wood et al. | Studies on The Nitrogen Metabolism of Plants VII. Toxicity of Some Oximes and Oximino· Acids to Azotobacter and Their Utilization |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200706 Address after: 611630 No. five, No. 35 Industrial Road, Heshan Town, Pujiang County, Sichuan, Chengdu Patentee after: Chengdu new Chaoyang Crop Science Co.,Ltd. Address before: 100193 Beijing Old Summer Palace West Road, Haidian District, No. 2 Patentee before: CHINA AGRICULTURAL University |
|
| TR01 | Transfer of patent right |