CN102229543A

CN102229543A - 一种从发酵液中纯化提取冠菌素的方法

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Publication number: CN102229543A
Application number: CN2011101505762A
Authority: CN
Inventors: 段留生; 吴慧玲; 李召虎; 岳跃森; 李茂营; 陈保桦; 张博; 谭伟明
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: Chengdu new Chaoyang Crop Science Co.,Ltd.
Priority date: 2011-06-07
Filing date: 2011-06-07
Publication date: 2011-11-02
Anticipated expiration: 2031-06-07
Also published as: CN102229543B

Abstract

本发明公开了一种从发酵液中纯化提取冠菌素的方法。本发明所提供的从发酵液中提取纯化冠菌素的方法，包括如下步骤：1)取发酵液的上清液；2)将步骤1)得到的上清液用大孔吸附树脂柱进行分离，得到粗提冠菌素；3)将粗提冠菌素用硅胶柱进行分离，得到纯化的冠菌素；所述发酵液为发酵菌制备冠菌素时产生的发酵液，所述发酵液为发酵容器内的所有物质。本发明方法工艺简单，收率高，生产成本低，对COR的结构和活性没有任何影响，而且耗能低，污染小，完全适应工业化生产的要求。

Description

一种从发酵液中纯化提取冠菌素的方法

技术领域

本发明涉及一种从发酵液中纯化提取冠菌素的方法。

背景技术

冠菌素(Coronatine，简称COR)20世纪70年代末发现的由植物病原菌丁香假单胞菌的几个致病变种产生的一种非寄主专化性毒素(Bender et al.，1999；Palmer et al.，1993)，它是茉莉酸甲酯(MeJA)的环戊烷结构和功能类似物。COR具有多种生理功能，它的活性是JA类物质的100-10000倍左右，在抗胁迫方面尤其显著，可作为一种新型的植物生长调节剂。冠菌素的高效制备具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种从发酵液中提取纯化冠菌素的方法。

本发明所提供的从发酵液中提取纯化冠菌素的方法，包括如下步骤：

1)取发酵液的上清液；

2)将步骤1)得到的上清液用大孔吸附树脂柱进行分离，得到粗提冠菌素；

3)将粗提冠菌素用硅胶柱进行分离，得到纯化的冠菌素；

所述发酵液为发酵菌制备冠菌素时产生的发酵液，所述发酵液为发酵容器内的所有物质。

上述方法中，所述步骤2)中，所述分离方法包括如下步骤：将所述上清液流过大孔吸附树脂柱以进行吸附，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；其中，所述上清液的速度为10升/小时-15升/小时；

上述任一方法中，所述步骤3)中，所述分离方法包括如下步骤：将所述粗提冠菌素流过硅胶柱以进行吸附，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；其中，所述洗脱缓冲液的流速为0.5ml/min。

上述任一方法中，所述步骤2)中，所述洗脱缓冲液的速度为8升/小时-12升/小时；

上述任一方法中，所述步骤3)中，所述粗提冠菌素的流速为0.5ml/min。

上述任一方法中，所述步骤2)中，所述洗脱缓冲液为如下中的至少一种：乙醇、丙酮、乙醚、石油醚、正己烷和乙酸乙酯；

上述任一方法中，所述步骤3)中，所述洗脱缓冲液为由乙酸乙酯∶甲醇∶水∶乙酸＝10∶2∶0.5∶0.5的体积比组成的混合物。

上述任一方法中，所述步骤2)中，所述洗脱缓冲液的体积用量为所述大孔吸附树脂柱体积的3-6倍；

上述任一方法中，所述步骤3)中，所述粗提冠菌素与硅胶的体积配比为1∶(30-50)。

上述任一方法中，所述步骤2)中，所述大孔吸附树脂为非极性的大孔吸附树脂，所述大孔吸附树脂的比表面积为500-920m².g^-1；

上述任一方法中，所述步骤3)中，所述硅胶的粒径为100-300目或100-200目或200-300目。

上述任一方法中，所述步骤2)中，所述大孔吸附树脂为HPD系列的大孔吸附树脂、YPRII型大孔吸附树脂或HZ系列的大孔吸附树脂；

所述HPD系列的大孔吸附树脂为HPD100型大孔吸附树脂、HPD200型大孔吸附树脂或HPD300型大孔吸附树脂；

所述HZ系列的大孔吸附树脂为HZ802型大孔吸附树脂、HZ803型大孔吸附树脂或HZ818型大孔吸附树脂。

上述任一方法中，所述步骤3)中，洗脱缓冲液的量3倍柱体积，收集第2个柱体积的洗脱液。

上述任一方法中，在所述步骤2)前，包括将所述上清液的pH值调至2.5-5.5的步骤。

上述任一方法中，所述步骤1)中，所述取发酵液的上清液的方法包括如下步骤：将所述发酵液静置放置5-10分钟，以使菌体沉淀，再取上清液。

上述任一方法中，所述步骤3)中，所述硅胶柱的柱高30.5cm；柱外径3.2cm，内径2.6cm。

所述发酵液无需高速离心和加热(可能引起COR降解)去除菌体，只需静置10分钟即可，从而省去高级仪器设备的配置和复杂工艺引起的人力和物力，也避免了COR降解。

硅胶柱层析所用洗脱液可以彻底将COR和发酵液中的杂质分开。

本发明方法采用的大孔吸附树脂对COR的选择性良好、吸附快、解析也快、吸附容量较大、生产周期短；且大孔树脂物理化学稳定性高、机械强度好、再生容易；工艺简单，操作十分简便，溶剂皆可回收利用，成本低廉，适用于大规模工业生产。

本发明省去大量发酵液离心去除菌体的步骤，从而使本提取工艺在没有大量超速离心机的情况下可以实施，同时静置10分钟左右后菌体自动沉积于容器底部，既不影响COR的性质，同时使得尽可能少的菌体量通过柱子，使大孔树脂更充分地吸附COR，同时也使洗脱变得简单，高效。

本发明方法工艺简单，收率高，生产成本低，对COR的结构和活性没有任何影响，而且耗能低，污染小，完全适应工业化生产的要求。

附图说明

图1为HPLC测定COR标样(A)、COR粗提样品(B)及纯化后的COR样品(C)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的非极性大孔吸附树脂HPD300、HZ818或YPRII分别购自沧州宝恩吸附材料有限公司，上海华震科技有限公司，上海劲凯树脂有限公司。

硅胶(型号ZCX.II，粒径100-200目)购自青岛海洋化工厂。硅胶(型号ZCX.II，粒径200-300目)购自青岛海洋化工厂。

可用现有方法发酵菌制备冠菌素，从而得到含有冠菌素的发酵液。下述实施例1-4中所述发酵液均按照现有的实施例5中所述方法制备得到。

本发明方法的基本步骤如下：

1、收集上清液：

将发酵液在室温条件下静置数分钟，待大量菌体自动沉积于盛发酵液的容器底部，收集上清液；并将容器底部的大约1-2L的含有大量菌体的发酵液4000rpm离心2分钟，收集所有上清液。

2、大孔吸附树脂柱层析分离

(1)大孔吸附树脂的预处理方法：将大孔吸附树脂用乙醇充分浸泡24h，待树脂充分溶胀后用蒸馏水洗涤至无乙醇，装入吸附柱中，用3倍柱体积的3-5％的盐酸水溶液以10L/小时的速度通过柱子，并浸泡3h，用水平衡至ph＝7；用3-5％的NaOH水溶液以10L/小时的速度通过柱子，并浸泡3h，用水平衡至ph＝7.0；用蒸馏水浸泡树脂备用。

(2)分离步骤如下：将上述所得上清液加入吸附柱中进行吸附，吸附完毕后用蒸馏水冲洗吸附柱，用大量水冲洗至流出液无色后，改用有机溶剂(即洗脱缓冲液)洗脱COR，收集洗脱液。其中，吸附和分离均在室温下进行。

(3)分离结果

将洗脱液减压浓缩(在30℃-45℃、真空度0.08-0.09MPA下减压蒸发)，得浸膏，干燥，得到COR粗品，HPLC检测，计算产品收率和纯度。

产品收率＝大孔树脂纯化后样品中冠菌素量/发酵液中冠菌素量；

纯度＝大孔树脂纯化后样品中冠菌素峰含量/大孔树脂纯化后样品总量。

3、硅胶柱层析分离

将COR粗品用洗脱缓冲液溶解，再流过硅胶柱以进行吸附，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，得到目的产物。HPLC检测，计算得率和纯度。其中，吸附和分离均在室温下进行。

纯度＝硅胶纯化后样品中冠菌素含量/硅胶纯化后样品总量。

得率＝硅胶纯化后样品中冠菌素量/硅胶纯化前样品中冠菌素量。

HPLC检测冠菌素COR含量的方法如下：

将纯化后的样品干燥后用色谱级甲醇溶解，再进行HPLC检测。

HPLC条件如下：色谱柱为Kromasil 5μm 100A的150×4.60mm C8色谱柱，流动相为80％的甲醇溶液。检测波长为208nm、流速2mL/min、进样量20μL、样品保留10min。

COR标准品购自sigma公司。

本发明方法的具体工艺条件如下实施例所述。

实施例1、分离COR

1、收集上清液：

发酵液10L，静置5分钟，收集上清液。

2、大孔吸附树脂柱层析分离

大孔吸附树脂：型号HPD300，非极性，孔径5-5.5nm，比表面积800-870m².g^-1；

吸附条件：10cm×1.5m玻璃柱；样品的流速10升/小时；样品的pH值2.5；样品的量10L发酵液，发酵液中冠菌素浓度为180-200mg/L；大孔吸附树脂的量100g；样品与大孔吸附树脂的配比10mg冠菌素/g大孔树脂；

洗脱条件：洗脱缓冲液的流速8升/小时；洗脱缓冲液的组成：无水乙醇；洗脱缓冲液的量：3倍柱体积；收集全部洗脱液。

产品收率为98％，纯度85％。

3、硅胶柱层析分离

硅胶：型号ZCX.II，粒径100-200目。

吸附条件：柱高30.5cm；柱外径3.2cm，内径2.6cm；样品的流速0.5ml/min；样品浓度1g/ml；硅胶的量180g；上样量与硅胶的体积配比1∶30；

洗脱条件：洗脱缓冲液的流速0.5ml/min；洗脱缓冲液的组成：乙酸乙酯∶甲醇∶水∶乙酸＝10∶2∶0.5∶0.5的体积比混合；洗脱缓冲液的量3倍柱体积；收集第2个柱体积处的样品，得到目的产物。

COR得率为88％，COR纯度为96％。

实施例1中HPLC测定COR标样(A)、COR粗提样品(B)及硅胶纯化后的COR样品(C)的图谱如图1所示。

实施例2、分离COR

1、收集上清液：

发酵液16L，静置10分钟，收集上清液。

2、大孔吸附树脂柱层析分离

大孔吸附树脂：型号HZ818，非极性，孔径7-8nm，比表面积880-920m².g^-1。

吸附条件：样品的流速12升/小时；样品的pH值3.5；样品的量16L发酵液，大孔吸附树脂的量160g，样品与大孔吸附树脂的配比15mg冠菌素/g大孔树脂；其余与实施例1中所述相同。

洗脱条件：洗脱缓冲液的流速10升/小时；洗脱缓冲液的组成：无水乙醇；洗脱缓冲液的量：4倍柱体积，收集全部洗脱液。其余与实施例1中所述相同。

产品收率为99％，纯度83.5％。

3、硅胶柱层析分离

硅胶：型号ZCX.II，粒径200-300目。

吸附条件：上样量与硅胶的体积配比1∶35；其余均与实施例1中相同。

洗脱条件：均与实施例1中相同。

得率为89％，纯度为97％。

实施例3、分离COR

1、收集上清液：

发酵液16L，静置7分钟，收集上清液。

2、大孔吸附树脂柱层析分离

大孔吸附树脂：型号YPRII，非极性，粒度0.315-1.25mm，比表面积500-550m²/g；

吸附条件：样品的流速14升/小时；样品的pH值4.5；其余与实施例1中所述相同。

洗脱条件：洗脱缓冲液的流速10升/小时；洗脱缓冲液的组成：丙酮；洗脱缓冲液的量：4倍柱体积；其余与实施例1中所述相同。

产品收率为99％，纯度84％。

3、硅胶柱层析分离

硅胶：型号及粒径与实施例2中相同。

吸附条件：上样量与硅胶的体积配比1∶50；其余均与实施例1中相同。

洗脱条件：均与实施例1中相同。

得率为90％，纯度为98％。

实施例4、分离COR

1、收集上清液：

发酵液60L，静置8分钟。

2、大孔吸附树脂柱层析分离

大孔吸附树脂：与实施例2中所述相同。

吸附条件：样品的流速15升/小时；样品的pH值5.5；样品的量60L发酵液，大孔吸附树脂的量600g；样品与大孔吸附树脂的配比20mg冠菌素/g大孔树脂；

洗脱条件：洗脱缓冲液的流速12升/小时；洗脱缓冲液的组成：无水乙醇；洗脱缓冲液的量：6倍柱体积，收集全部洗脱液。其余与实施例1中所述相同。

产品收率为99％，纯度85％。

3、硅胶柱层析分离

硅胶：型号及与粒径实施例2中所述相同。

吸附条件：与实施例1中相同；

洗脱条件：与实施例1中相同；

得率为92％，纯度为98％。

上述实施例1-4中，收集流过大孔吸附树脂柱后的发酵液，并将其用有机溶剂萃取法提取COR，HPLC检测COR含量，几乎没有检测到，说明COR全被吸附。用蒸馏水冲洗吸附COR后的大孔吸附树脂柱，并收集洗脱下来的液体，有机溶剂萃取法提取COR，HPLC检测COR含量，也检测不到COR，说明吸附稳定。

实施例5、发酵制备COR

挑取冷冻保存的丁香假单胞菌大豆致病变种MW123 CGMCC 2533(记载在中国专利200810119153.2中)于斜面培养基(溶质为甘露醇 1％，L-谷氨酸钠 0.2％，KH₂PO₄ 0.05％，NaCl 0.02％，MgSO₄·7H₂O 0.02％，1.3％的琼脂粉，溶剂为水；该培养基的pH 7.0)上，28℃培养48-60h使其活化，然后挑取一环活化好的菌体，接入含有10ug/ml的卡那霉素和30ug/ml的链霉素的液体培养基(含有甘露醇 1％，L-谷氨酸钠 0.2％，KH₂PO₄ 0.05％，NaCl 0.02％，MgSO₄·7H₂O 0.02％，pH 7.0；121℃灭菌30min)中，28℃培养36-48h，到对数期时，取培养菌液按2％(体积比)接种量接入发酵培养基(该发酵培养基由A液和B液混合而成。A液：氯化铵1.0g，KH₂PO₄ 4.1g，K₂HPO₄ 3.6g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，KNO₃ 0.3g，2mM FeCl₃ 10ml，蒸馏水 890ml，pH 6.8；B液：葡萄糖 20g，蒸馏水 100ml。A、B液分开进行115℃灭菌20min，接种前混合)中，在温度为18℃-24℃、转速为260rpm/min的条件下发酵7天，即得到成熟发酵液，经高效液相色谱法检测冠菌素产量达到180-200mg/L发酵液。

Claims

1.一种从发酵液中提取纯化冠菌素的方法，包括如下步骤：

1)取发酵液的上清液；

3)将粗提冠菌素用硅胶柱进行分离，得到纯化的冠菌素；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述分离方法包括如下步骤：将所述上清液流过大孔吸附树脂柱以进行吸附，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；其中，所述上清液的速度为10升/小时-15升/小时；

所述步骤3)中，所述分离方法包括如下步骤：将所述粗提冠菌素流过硅胶柱以进行吸附，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；其中，所述洗脱缓冲液的流速为0.5ml/min。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述步骤2)中，所述洗脱缓冲液的速度为8升/小时-12升/小时；

所述步骤3)中，所述粗提冠菌素的流速为0.5ml/min。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：

所述步骤2)中，所述洗脱缓冲液为如下中的至少一种：乙醇、丙酮、乙醚、石油醚、正己烷和乙酸乙酯；

所述步骤3)中，所述洗脱缓冲液为由乙酸乙酯∶甲醇∶水∶乙酸＝10∶2∶0.5∶0.5的体积比组成的混合物。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：

所述步骤2)中，所述洗脱缓冲液的体积用量为所述大孔吸附树脂柱体积的3-6倍；

所述步骤3)中，所述粗提冠菌素与硅胶的体积配比为1∶(30-50)。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：

所述步骤2)中，所述大孔吸附树脂为非极性的大孔吸附树脂，所述大孔吸附树脂的比表面积为500-920m².g^-1；

所述步骤3)中，所述硅胶的粒径为100-300目或100-200目或200-300目。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：

所述步骤2)中，所述大孔吸附树脂为HPD系列的大孔吸附树脂、YPRII型大孔吸附树脂或HZ系列的大孔吸附树脂；

所述步骤3)中，洗脱缓冲液的量3倍柱体积，收集第2个柱体积的洗脱液。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：在所述步骤2)前，包括将所述上清液的pH值调至2.5-5.5的步骤。

9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述取发酵液的上清液的方法包括如下步骤：将所述发酵液静置放置5-10分钟，以使菌体沉淀，再取上清液。

10.根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述硅胶柱的柱高30.5cm；柱外径3.2cm，内径2.6cm。