CN102465164B - 普那霉素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种普那霉素的制备方法，发酵液经酸化后，固液分离得到滤液；滤液经大孔树脂脱色；脱色液用大孔吸附树脂富集后解析；解析液再用活性炭脱色后浓缩、萃取、碱洗；结晶，碱洗液结晶得到普那霉素粗品；粗品再经过重结晶得到普那霉素精粉。本方法可有效从普那霉素发酵液中分离纯化得到普那霉素，工序简单、易操作、溶剂消耗少、易回收、成本低，适用于工业化生产。

Description

普那霉素的制备方法

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，涉及药品原料的制备方法，具体地说是属于普那霉素制备方法。

背景技术

普那霉素属链阳性菌素类抗生素，系始旋链霉菌(Streptomycespristinaespiralis)产生，由普那霉素I(PI_A，PI_B，PI_C)和普那霉素II(PII_A，PII_B)组成，两者的组合比例大约是由约30％的普那霉素I(PI)和约70％的普那霉素II(PII)，普那霉素I为环六肽内酯，普那霉素II为多不饱和环内酯，其中PI_A和PII_A是普那霉素的主要组分。化学结构式如下：

此产品外观为非结晶结构的淡黄色粉末状物质，其熔点为151-153℃。普那霉素在0.5mol/L甲醇中的旋光度为[a]_D ²⁵＝-130°，在1mol/L三氯甲烷中的旋光度为[a]_D ²⁵＝-150°。普那霉素能溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙脂以及三氯甲烷，微溶于水，难溶于石油醚。它在Tollens试剂、Millon试剂、Seliwanoff试剂、Fehling试剂以及在水合荀三酮中反应时能发生氧化反应，而在氯化铁溶液、Ehrlich试剂和Folin-Denis试剂中反应时却发生还原反应。

普那霉素是由法国安万特公司开发生产，世界范围内只有安万特公司生产，普那霉素作为抗葡萄球菌口服制剂已经在法国应用了20多年，然而对普那霉素耐药的葡萄球菌、肠球菌却少于5％，到目前为止，还没有发现革兰氏阳性球菌对普那霉素耐药的报道。普那霉素作为一种万古霉素替代药物，是目前治疗由耐药的革兰氏阳性菌引起的感染的最有效的抗生素之一。

现有的技术当中，美国专利US3154475(1964)和英国专利GB998195(1965)中描述了普那霉素的传统提取方法。发酵液调pH至3，过滤分离得到滤液，用稀碱调滤液PH至7，然后用有机溶剂二氯甲烷直接萃取滤液，得到含有目的物的萃取液，真空浓缩，用石油醚处理即得到普那霉素粗品，粗品用二氯甲烷溶解，上粉末状活性炭柱层析，二氯甲烷洗脱，收集中央部分，石油醚处理得到沉淀，洗涤干燥后得到纯品，提取总收率约50％。该提取方法存在很多缺点(1)过滤时间长，滤液浑浊，过滤收率低；(2)用有机溶剂直接去萃取滤液，溶剂消耗量大，且乳化严重，不利于操作，设备利用率低。(3)浓缩量大，能耗高。(4)工序复杂，处理周期长，过程损失大，总收率低，成本偏高，不适用规模化生产。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，研究设计一种制备普那霉素的新方法，该方法可有效从普那霉素发酵液中分离纯化得到普那霉素，该制备方法工序简单、易操作、溶剂消耗少、易回收、成本低，适用于工业化生产。

下面对本发明进行具体描述：

本发明的目的是这样实现的：将普那霉素发酵液酸化，加入助滤剂，搅拌均匀，过滤，脱色，吸附、解析、脱色、浓缩、溶剂萃取、结晶，重结晶，干燥得到普那霉素纯品。

具体地，本发明涉及一种普那霉素的制备方法，包括下述步骤：

1)在常温条件下将普那霉素发酵液加入酸性物质调节pH值至3.0-4.0，然后加入助滤剂，搅拌50分钟-1.5小时至助滤剂分散均匀，过滤；

2)滤液使用大孔脱色树脂脱色；

3)脱色液导入大孔树脂进行吸附和解吸；

4)解吸液中加入一定量的粉末状活性炭搅拌脱色30分钟-90分钟；

5)浓缩、萃取、碱洗；

6)结晶，固液分离普那霉素结晶液得到普那霉素粗品；

7)粗品重结晶；

其中，步骤1)中调节发酵液pH值所用的酸类为盐酸、硫酸或有机酸，优选为盐酸；调发酵液PH值至3.0-4.0，优选pH值为3.5-3.8；助滤剂为珍珠岩或硅藻土，优选为珍珠岩；助滤剂用量为发酵液体积的1％-5％(w/v)，优选为2％-4％；搅拌时间为50分钟-1.5小时；过滤时可以采用传统的板框过滤，也可以采用比较先进的膜过滤技术，优选设备占地面积小、劳动强度小、收率高、滤液质量好的陶瓷膜过滤技术。

步骤2)中的大孔脱色树脂为D301、D330、D311、D293、D315树脂，优选为D293树脂。

步骤3)中的大孔吸附树脂为HZ816、XAD-16、HZ801、D1300、CAD-40、X-5树脂，优选为D1300树脂。解吸剂为甲醇、丙酮或乙醇的水溶液。优选为乙醇的水溶液。本工艺采用非连续梯度解吸法进行树脂解吸，解吸液的浓度优选为40％乙醇/水(V/V)溶液、80％(V/V)乙醇/水溶液，进行非连续梯度解吸。

步骤4)所述的粉末活性炭的用量为2‰-6‰(W/V)，优选为3‰(W/V)，脱色时间为30分钟-90分钟，优选为60分钟。

步骤5)所述的浓缩、萃取、碱洗，要求收集的解吸液在50℃-55℃条件下真空浓缩，浓缩后的体积为解吸液体积的1/8-1/12，浓缩液再加入一定体积的醋酸乙酯、二氯甲烷中的一种萃取，优选为醋酸乙酯，萃取完毕后，采用碳酸钠/水溶液、醋酸钠/水溶液、醋酸铵/水溶液，碳酸氢铵/水溶液中的一种对萃取液进行碱洗，优选为醋酸铵/水溶液，浓度为5％(W/V)，然后用纯化水洗涤有机相，至水相PH值至6-7时即可。

步骤6)所述的结晶，结晶浓度控制100g/l-120g/l，结晶温度为-5℃-0℃，结晶时间10小时以上。结晶液经传统的固液分离过程如离心、抽滤等方式得到普那霉素滤饼后，用石油醚洗涤滤饼1-2次，50℃-55℃条件下真空干燥，得到普那霉素粗品。

步骤7)所述的重结晶，重结晶溶剂可以是异丙醇、甲苯，丙酮中的一种，优选为异丙醇。结晶浓度控制120g-150g/l，结晶温度为2℃-8℃，结晶时间10小时以上。结晶液经传统的固液分离过程如离心、抽滤等方式得到普那霉素滤饼后，用预冷好的2℃-8℃的异丙醇洗涤滤饼1-2次，50℃-55℃条件下真空干燥，得到淡黄色的普那霉素纯品。

本发明所得产品可供药品使用，普那霉素效价大于8000u/mg，样品提取总收率大于70％。

本发明有如下优点：1.通过调节发酵液的pH值后在发酵液中加入助滤剂，然后进行固液分离，可有效去除其中的菌丝体、未用完的培养基、杂蛋白和金属离子，提高了过滤速度，缩短了工艺周期，并得到澄清的滤液。2.大孔脱色树脂及吸附树脂的应用，去除了大部分色素和极性大的杂质，提高了滤液的澄清度和质量。3.解吸过程采用非连续梯度解吸法，低浓度的乙醇冲洗树脂柱可除去树脂吸附上的大部分多糖、色素和强极性杂质，之后采用高浓度的乙醇解吸，解吸液质量大副提高，避免了后续萃取过程中，乳化严重不分层的现象。4.对萃取液进行碱洗，去除了其中的脂肪酸和油性杂质，有利于后续的结晶。5.首次采用树脂结合结晶的工艺使普那霉素得到了行之有效的提取分离，所得产品纯度高，效价大于8000u/mg，有效降低了色素比值，为生产药用级原料提供了更加安全的技术保障。6、工艺简单、易操作、溶媒消耗量少，溶媒易回收，样品收率高，全程总收率达到70％以上，提取成本低，适用于工业化生产。

附图说明

附图1：普那霉素纯品的HPLC图谱。

具体实施方式

下述实施例仅用于阐述实现本发明的方法，不应理解为对本发明的限制。

本发明所使用的普那霉素发酵液均为华北制药集团新药研究开发有限责任公司用微生物培养手段，得到的普那霉素发酵液。大孔树脂HZ816、HZ801、D293、D315，上海华震公司生产；大孔树脂D301、D311、D330、D1300、CAD-40、X-5，安徽三星树脂厂生产；XAD-16，罗门哈斯公司生产；盐酸、硫酸、醋酸钠、乙醇、醋酸乙酯、异丙醇等试剂均为市售。本发明使用的高效液相色谱仪为996型检测器，515泵(Waters公司)。

实施例1

取普那霉素发酵液80L，发酵单位6400u/ml。用盐酸调节发酵液PH至3.5然后在发酵液中加入1.6Kg珍珠岩，搅拌50分钟后板框过滤，滤液以1-2BV/h的流速通过大孔树脂D293柱进行脱色，脱色液以1BV/h-2BV/h的流速导入大孔树脂D1300柱进行普那霉素吸附富集，吸附后用40％乙醇/水溶液和80％的乙醇/水溶液非连续梯度解吸，解吸流速控制在0.5BV/h-1BV/h，HPLC检测有普那霉素流出时开始收集解吸液，解吸完毕后，在解吸液中加入3‰(W/V)活性炭搅拌脱色60分钟，过滤，真空浓缩滤液，醋酸乙酯萃取，静置分层，弃去水相，然后用5％的醋酸铵洗涤醋酸乙酯相，静置分层，弃去水相，用纯化水洗有机相至PH＝6-7，无水硫酸钠脱水，真空浓缩萃取液至普那霉素浓度100g/l-120g/l，缓慢降温到-5-0℃，结晶12小时，抽滤、洗涤、干燥，得到粗品62.7g，粗品采用异丙醇重结晶，结晶浓度控制120g/l-130g/l，缓慢降温到2℃-8℃，结晶12小时，过滤、洗涤、干燥，得到淡黄色的普那霉素纯品48.3g(见附图)，纯品效价为8120u/mg，收率为76.6％。

实施例2

取普那霉素发酵液800L，发酵单位8050u/ml。用盐酸调节发酵液PH至3.2然后在发酵液中加入6.0Kg珍珠岩，搅拌50分钟后板框过滤，滤液以1BV/h-2BV/h的流速通过大孔树脂D330柱进行脱色，脱色液以1-2BV/h的流速导入大孔树脂HZ801柱进行普那霉素吸附富集，吸附后用40％乙醇/水溶液和80％的乙醇/水溶液非连续梯度解吸，解吸流速控制在0.5BV/h-1BV/h，HPLC检测有普那霉素流出时开始收集解吸液，解吸完毕后，在解吸液中加入5‰(W/V)活性炭搅拌脱色60分钟，过滤，真空浓缩滤液，醋酸乙酯萃取，静置分层，弃去水相，然后用5％的醋酸铵洗涤醋酸乙酯相，静置分层，弃去水相，用纯化水洗有机相至PH＝6-7，无水硫酸钠脱水，真空浓缩萃取液至普那霉素浓度100g/l-120g/l，缓慢降温到-5℃-0℃，结晶12小时，抽滤、洗涤、干燥，得到粗品789.2g，粗品采用丙酮重结晶，结晶浓度控制140g/l-150g/l，缓慢降温到2℃-8℃，结晶12小时，过滤、洗涤、干燥，得到淡黄色的普那霉素纯品594.8g，纯品效价为8045u/mg，收率为74.3％。

实施例3

取普那霉素发酵液10000L，发酵单位8800u/ml。用盐酸调节发酵液PH至3.8然后在发酵液中加入40Kg硅藻土，搅拌1小时后板框过滤，滤液以1-2BV/h的流速通过大孔树脂D315柱进行脱色，脱色液以1BV/h-2BV/h的流速上大孔树脂XAD-16柱进行普那霉素吸附富集，吸附完毕后用40％乙醇水溶液和80％的乙醇水溶液非连续梯度解吸，解吸流速控制在0.5BV/h-1BV/h，HPLC检测有普那霉素流出时开始收集解吸液，解吸完毕后，在解吸液中加入5‰(W/V)活性炭搅拌脱色60分钟，过滤，真空浓缩滤液，二氯甲烷萃取，静置分层，弃去水相，然后用5％的醋酸铵洗涤二氯甲烷相，静置分层，弃去水相，用纯化水洗有机相至PH＝6-7，无水硫酸钠脱水，真空浓缩萃取液至普那霉素浓度100g/l-120g/l，缓慢降温到-5-0℃，结晶12小时，抽滤、洗涤、干燥，得到粗品10.7Kg，粗品采用甲苯重结晶，结晶浓度控制120g/l-130g/l，缓慢降温到2℃-8℃，结晶12小时，过滤、洗涤、干燥，得到淡黄色的普那霉素纯品8.2Kg，纯品效价为8098u/mg，收率为75.5％。

Claims (6)

1.一种普那霉素的制备方法，包括下述步骤：

1)在常温条件下将普那霉素发酵液加入酸性物质调节pH值至3.0-4.0，然后加入助滤剂，搅拌50分钟-1.5小时至助滤剂分散均匀，过滤；

2)滤液使用大孔脱色树脂脱色；

3)脱色液导入大孔吸附树脂进行吸附和解吸；

4)解吸液中加入一定量的粉末状活性炭搅拌脱色30分钟-90分钟；

5)浓缩、萃取、碱洗；

6)结晶，固液分离结晶液得到普那霉素粗品；

7)粗品重结晶；

其中步骤5)所述的浓缩、萃取、碱洗，先将解吸液在50℃-55℃条件下真空浓缩，浓缩后的体积为解吸液体积的1／8-1／12；浓缩液中加入醋酸乙酯、二氯甲烷之一进行萃取；萃取液用碳酸钠水溶液、醋酸钠水溶液、醋酸铵水溶液、碳酸氢氨水溶液之一进行碱洗，然后用纯化水洗涤有机相，至水相PH7；

其中步骤6)所述的结晶，是将步骤5)的萃取液在30℃-55℃条件下真空浓缩，浓缩后结晶液浓度控制在100g／l-120g／l，然后缓慢降温到-5℃-0℃，结晶10小时以上；固液分离结晶液得到普那霉素滤饼后，用石油醚洗涤滤饼1-2次，在50℃-55℃条件下真空干燥滤饼，干燥时间4h-6h，得到普那霉素粗品；

其中步骤7)所述的重结晶，普那霉素粗品加入结晶溶剂异丙醇、甲苯、丙酮之一，在30℃-55℃下加热溶解粗品，控制结晶液浓度为120g／l-150g／l，然后缓慢降温到2℃-8℃，结晶10小时以上；固液分离结晶液得到普那霉素滤饼后，用预冷好的2℃-8℃的异丙醇、甲苯、丙酮之一洗涤滤饼1-2次，30℃-55℃条件下真空干燥，得普那霉素纯品。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1)所述的酸性物质为盐酸、硫酸或有机酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1)所述的助滤剂为珍珠岩或硅藻土；用量为1-5％(W／V)。

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)所述的大孔脱色树脂为D301、D330、D311、D293、D315树脂。

5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3)所述的大孔吸附树脂为HZ816、XAD-16、HZ801、D1300、CAD-40、X-5树脂，解吸剂为甲醇、丙酮或乙醇的水溶液。

6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤4)所述的粉末状活性炭的用量为2‰-6‰(w／v)。

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