CN103665105A - 普那霉素ⅰa晶体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了普那霉素IA晶体及其制备方法和用途、以及含有治疗有效量的所述普那霉素IA晶体的药物组合物，所述晶体在X射线衍射图谱中的下述2θ角有特征峰：3.9、9.0、14.5、14.9、16.0、16.4、16.8、18.3、20.0、24.2，并且所述晶体的熔点为276℃～285℃。本发明的普那霉素IA晶体纯度高、稳定性好，有助于提高普那霉素的生物利用度。

Description

普那霉素ⅠA晶体

技术领域

本发明涉及普那霉素IA晶体，更具体地说，涉及普那霉素IA晶体及其制备方法和用途、以及含有治疗有效量的所述普那霉素IA晶体的药物组合物。 

背景技术

普那霉素是由始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)产生的一种链阳性菌素类抗生素，由两类化学性质不同的物质组成，即属于B族链阳性菌素的普那霉素I(主要为PIA)和属于A族链阳性菌素的普那霉素II(主要为PIIA)组成，两者的组合比例大约是30∶70。两者联合使用的体外抗菌活性至少是单一组分活性的10倍，这种协同作用同时也扩大了两组分的抗菌谱，使之对细菌表现为杀菌作用，而各组分单独使用则表现为抑菌作用。同时，由于存在两种结构完全不同的组分，耐药性获得较缓慢。这是该新药区别于其他抗耐药菌药物的显著特点之一，它是唯一的口服给药抗耐药菌药物。 

普那霉素主要作用于细菌核糖体，抑制蛋白质的合成。但是由于普那霉素水溶性极差，不易制成肠外制剂，因此其临床应用受到限制。天然的普那霉素IA和IIA经化学修饰可以得到水溶性衍生物RP59500解决该问题，它是由奎奴普汀与达福普汀以30∶70(W/W)比例混合制成的。 

现在上市的普那霉素是由sanofi aventis生产的，主要由普那霉素IA和普那霉素IIA组成的，商品名为PYOSTACINE的口服普那霉素片。 

目前普那霉素(pristinamycins)、奎奴普汀(quinupristin)/达福普汀(dalfopristin)在欧洲已经有一定的市场。普那霉素在欧洲的用量与销量分别为40吨、1.2亿美元，奎奴普汀(quinupristin)/达福普汀(dalfopristin)的用量和销量分别为3吨、约3亿美元。 

作为药效优良的抗生素，对普那霉素纯化工艺的研究和开发具有重要意义。普那霉素中的两个组分可以分别用于合成奎奴普汀、达福普汀，因此有必要对两个组分分别进行纯化，得到精品，用于后期合成。其中的奎奴普汀是由本发明的普那霉素IA经化学修饰而得。 

现今存在的关于普那霉素的工艺专利中，得到的普那霉素IA是无定型的，而且包括专利药在内，其纯度都比较低，如工业化生产的普那霉素经纯化后还含有20％的杂质，迄今所进行的纯化努力总是以失败而告终，常常导致各组成分中的一种降解，这是由于许多操作导致不稳定产物中环形结构的打开或A组成分的脱水。由于这一事实，多年来认为纯度提高是不可能达到的。这种局面造成的结果是普那霉素的销售被严格限制在诸如法国和比利时的一些国家中，导致某些地区人口失去了对革兰氏阳性球菌严重感染的一种治疗，特别是对其它抗生素具有耐受性的病人的治疗[2]。 

普那霉素由I组分和II组分组成，它是通过连接到核糖体上从而抑制蛋白的合成来抑制细菌的生长。普那霉素I和II都作用在细菌核糖体50S亚基上，并在链延伸阶段抑止mRNA的转译。普那霉素II使肽基转移酶的供体和受体部位失活，从而干扰该酶的功能。它们在两处阻断了肽链的延伸：核糖体A位点的氨酰tRNA(tRNA)和肽基-tRNA在P位点形成肽键。 

普那霉素I干扰肽基-tRNA在P位点的正确定位；继而抑制肽键 形成，导致产生一条不完全肽链。后一过程具有模板依赖性，即选择性地影响mRNA对碱性氨基酸和脯氨酸的编码。现在已经有人提出了一种普那霉素的作用机制模型来解释普那霉素I和II的协同作用。 

普那霉素I和II两者之间协同作用与两者的比例关系无关，但由于普那霉素II A在体内较弱的吸收性，所以在小鼠体内试验时普那霉素II的量要多于普那霉素I才能使协同作用明显。一般两者联合使用时的体外抗菌活性至少是单一组分活性的10倍。而且这种协同作用也扩大了两组分的抗菌谱，如拮抗耐红霉素的金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林菌株)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产气夹膜梭状芽孢杆菌(Clostredium perfringens)和淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)。另外当每一组分有抑菌作用时，联合使用的协同作用表现出混合杀菌性。小鼠体内试验显示，对于金黄色葡萄球菌感染，普那霉素I和普那霉素II联合使用CD50为50mg/kg，而单独使用时CD50分别为75～150mg/kg及300mg/kg^[1]

细菌对普那霉素产生耐药性存在三种不同机制：改变靶位点结构、存在药物灭活酶和增加药物泵出。普那霉素最常见的耐药性为erm基因编码的甲基化酶催化23S rRNA甲基化，从而使大环内脂类抗生素、lincosamides及普那霉素I组分(MLSB)与rRNA亲和力下降，表现为MLSB耐药性[3]，但是这种甲基化不影响普那霉素II组分的的抗菌活性，普那霉素对组成型及诱导型MLSB耐药金黄色葡萄球菌仍有抗菌作用[4]。普那霉素的灭活酶如普那霉素I水解酶和普那霉素II乙酰基转移酶，它们能分别灭活普那霉素I和II，但由于这两种酶同时出现在同一菌株中的几率相对较小，故普那霉素耐药性获得较缓慢^[5]。此外在某些葡萄球菌中发现一种ATP结合蛋白，能将普那霉素和大环内脂类抗生素泵出细胞外而产生耐药性。 

普那霉素在体外对众多的革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌、厌氧菌具有很强的抑制杀菌作用。普那霉素对金葡球菌(MRSA，MSSA)、表葡球菌(MRSE，MSSE)、溶血葡球菌、肺炎链球菌等均有很强的抗菌活性^[6，7]。体内试验中，普那霉素对于对红霉素敏感或耐药的MRSA疗效与万古霉素相当^[8]，它还能有效地预防对红霉素敏感或耐药地链球菌引起的心膜炎^[8]。另外，体外试验显示普那霉素与万古霉素有协同作用^[9]。普那霉素对普通病菌的杀菌活性见表1，对其他微生物的杀菌活性见表2和表3。但普那霉素对梅毒密螺旋体和布鲁氏菌却没有杀菌作用。 

表1普那霉素的抗菌活性 

表2普那霉素对厌氧微生物的抗菌活性 

表3普那霉素对胞内菌和非典型型菌的抗菌活性 

普那霉素还具有较长的抗生素后效应。普那霉素简短的作用细菌后，能使细菌在随后的15-20h内不能进行繁殖。这个现象在小鼠的胞内、胞外试验中已得到证实。 

高纯的普那霉素的制备对于普那霉素制剂的注册具有很大的意义，可以让更多的人群接受感染抗耐药菌的治疗。同时对后续衍生物的合成和纯度保证都有很大的好处。本工艺制备的普那霉素IA含量高达98％以上，为普那霉素的注册和后续的奎奴普汀等衍生物的合成提供良好的原料。 

本专利的普那霉素IA是由菌种经过二级发酵，经纯化分离得到普那霉素IA粗品，粗品再经精制结晶得到普那霉素成品。 

发明内容

本发明的目的就是提供一种普那霉素IA晶体，其纯度高，稳定性好，有助于提高普那霉素的生物利用度。 

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种如式I所示的普那霉素IA晶体，所述普那霉素IA晶体在下述2θ角有特征峰：：3.9、9.0、14.5、14.9、16.0、16.4、16.8、18.3、20.0、24.2。所述晶体的熔点为276℃～285℃。 

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种药物组合物，包括治疗有效量的普那霉素IA晶体及其药学上可接受的载体。所述治疗有效量为75mg。 

其中，所述药物组合物还包括选自由普那霉素IIA、普那霉素IB、普那霉素IC、普那霉素IIB、普那霉素IIC组成的组中的至少一种。 

本发明所涉及的药物制剂配方中的药学上可接受的辅料载体包括但不限于：乳糖、微粉硅胶、蔗糖、甘露醇、碳酸钙、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、糊精、淀粉、明胶、硬脂酸镁、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、交联聚乙烯吡咯烷酮、交聚羧甲基淀粉钠、聚乙二醇、二氧化钛等。 

本发明所涉及的药物制剂包括但不限于片剂、胶囊剂、颗粒剂及混悬剂。 

根据本发明的第五方面，本发明提供了一种普那霉素IA的晶体在 制备用于治疗抗耐药菌感染的药物中的应用。 

根据本发明的第六方面，本发明提供了一种制备的普那霉素IA晶体的方法，所述方法包括如下步骤： 

步骤a)：将普那霉素IA溶于C1～C4的一元醇或者C3～C6的酮的溶剂中，在0℃～70℃温度下搅拌溶解，过滤，得到滤液； 

步骤b)：在步骤a)所得的滤液中加0.5～10倍滤液体积的纯化水，或者将所得的溶液在常压或减压下加热至溶剂的沸点，蒸出溶剂至剩余体积为加入纯化水体积的0.5～2倍，得到含有结晶的悬浊液； 

步骤c)：将步骤a)所得的滤液或步骤b)所得的悬浊液冷却到-30℃～30℃，析出结晶，过滤得到普那霉素IA晶体。 

优选地，所述C1～C4的一元醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇。所述C3～C6的酮为丙酮、丁酮或环己酮。 

本发明的主要优点在于：本发明制备的晶体是采用特定的结晶法，有效地将杂质留在母液中，从而得到高纯度的结晶，相对于非结晶形态的普那霉素具有更好的化学和物理稳定性，所制备的制剂具有更好的生物利用度。 

附图说明

图1是本发明的普那霉素IA晶体的X射线粉末衍射图，所述纵坐标显示X射线计数，所述横坐标显示以2θ表示的衍射角； 

图2是本发明的普那霉素IA晶体的示差扫描量热图，所述纵坐标显示以单位质量的能量，所述横坐标显示的为温度。 

具体实施方式

以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。 

实施例1 

称取普那霉素IA粗品15g，溶解于200ml丙酮，50℃加热搅拌30min，然后热抽滤，滤液放置在50℃水浴锅中缓慢加入40ml纯化水，在搅拌下自然冷却到25℃后，将溶液静置于-18℃冰箱中16小时，过滤得到普那霉素IA结晶12.6g。收率84％，纯度99.2％。 

实施例2 

称取普那霉素IA粗品8g，溶解于800ml乙醇，70℃加热搅拌30min，然后热抽滤，滤液放置在70℃水浴锅中缓慢加入100ml纯化水，搅拌下降温至27℃后，将溶液静置于-18℃冰箱中16小时，过滤得到普那霉素IA结晶7.1g。收率88.8％，纯度98.8％。 

实施例3 

称取普那霉素IA粗品15g，溶解于400ml甲醇，50℃加热搅拌30min，然后热抽滤，滤液放置在50℃水浴锅中缓慢加入100ml纯化水降温至27℃后，，将溶液静置于-18℃冰箱中16小时，过滤得到普那霉素IA结晶11.8g。收率78.7％，纯度99.5％。 

实施例4 

称取普那霉素IA粗品10g，溶解于200ml丙酮，50℃加热搅拌30min，然后热抽滤，缓慢加入200ml纯化水，常压下加热蒸出丙酮，到剩余体积为220ml时停止浓缩，搅拌下缓慢冷却至2℃～5℃，并在此 温度下搅拌结晶6小时，过滤得到普那霉素IA结晶9.2g。收率92％，纯度98.7％。 

实施例5 

称取普那霉素IA粗品5g，溶解于800ml乙醇，70℃加热搅拌30min，然后热抽滤，缓慢加入100ml纯化水，在-0.08～-0.09MPa真空度下加热蒸出乙醇，至剩余体积为120ml时停止浓缩，在搅拌下缓慢冷却至20～25℃结晶5小时，过滤得到普那霉素IA结晶4.7g。收率94％，纯度98.5％。 

实施例6 

称取普那霉素IA粗品10g，溶解于400ml甲醇，60℃加热搅拌30min，然后热抽滤，缓慢加入400ml纯化水，在常压下加热蒸出甲醇，至剩余体积为450ml时停止浓缩，在搅拌下用冰水浴冷却至0～5℃结晶3小时，过滤得到普那霉素IA结晶9.1g。收率91％，纯度98.6％。 

实施例7 

称取普那霉素IA粗品10g，溶解于300ml正丙醇，70℃加热搅拌30min，然后热抽滤，搅拌下缓慢加入1000ml纯化水，用冰盐浴冷却至-5～0℃结晶3小时，过滤得到普那霉素IA结晶6.2g。收率62％，纯度98.9％。 

实施例8 

称取普那霉素粗品IA10g，溶解于300ml异丙醇，70℃加热搅拌30min，然后热抽滤，搅拌下缓慢加入1500ml纯化水，用冰盐浴冷却至 -5～0℃结晶3小时，过滤得到普那霉素IA结晶8.4g。收率84％，纯度98.5％。 

实施例9 

称取普那霉素IA粗品10g，溶解于300ml正丁醇，70℃加热搅拌30min，然后热抽滤，搅拌下缓慢加入1000ml纯化水，用液氮冷却至-25℃结晶3小时，过滤得到普那霉素IA结晶9.1g。收率91％，纯度98.3％。 

实施例10 

称取普那霉素IA粗品10g，溶解于300ml异丁醇，70℃加热搅拌30min，然后热抽滤，搅拌下缓慢加入1500ml纯化水，用液氮冷却至-30℃结晶3小时，过滤得到普那霉素IA结晶9.7g。收率97％，纯度98.0％。 

实施例11 

称取普那霉素IA粗品10g，溶解于200ml丁酮，70℃加热搅拌30min，然后热抽滤，搅拌下缓慢加入2000ml纯化水，自然冷却至25～30℃结晶3小时，过滤得到普那霉素IA结晶7.8g。收率78％，纯度98.9％。 

实施例12 

称取普那霉素IA粗品10g，溶解于200ml环己酮，70℃加热搅拌30min，然后热抽滤，搅拌下缓慢加入2000ml纯化水，自然冷却至25～30℃结晶3小时，过滤得到普那霉素IA结晶7.1g。收率71％，纯度 99％。 

实施例13 

将普那霉素IA15克、普那霉素IIA35克、微晶纤维素10克、交联羧甲基淀粉钠2.5克、碳酸钙2克、糊精10克分别过80目筛，混合均匀，用5％聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液制粒，干燥，整粒，加1克过100目的微粉硅胶和1克过100目的硬脂酸镁混合均匀压100片。(片重约770mg)。 

实施例14 

将普那霉素IA15克、普那霉素IIA35克、乳糖5克、交联羧甲基淀粉钠2.5克，分别过80目筛，混合均匀，用5％聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液制粒，干燥，整粒，加1克过100目的硬脂酸镁混合均匀填充胶囊100粒(每粒填充量约为590mg)。 

实施例15 

将普那霉素IA15克、普那霉素IIA35克、甘露醇5克、蔗糖30克、乳糖10克、交联羧甲基淀粉钠5克，分别过80目筛，混合均匀，用5％聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液制粒，干燥，整粒包装成100袋(每袋装量约为1g)。 

实施例16普那霉素IA晶体的分析表征方法 

1、普那霉素IA晶体的分析表征 

X射线粉末衍射是指当X光透过晶体可以产生一系列的衍射，在实验室中使用X射线衍射仪即可获得X射线衍射图谱，在图谱中，不同 的衍射线以及各衍射线的强度是由一定结构的原子团所决定的，不同结构的晶体所产生的衍射图谱各不相同，因此可以使用X射线衍射图谱来确定晶体的构造，即晶型。 

采用本领域常用方法进行测定普那霉素IA晶体的X衍射图谱。图1的普那霉素IA晶体的X射线粉末衍射图是使用Bruker D8 advanced型的X射线粉末衍射仪设定的，衍射2θ角范围为3°～45°，扫描步宽为0.02°，扫描速率2°/s、X射线波长λ为1.54056A。 

从图1可以看出，本发明的普那霉素IA晶体在X射线图谱中具有下述2θ角的特征峰：3.9、9.0、14.5、14.9、16.0、16.4、16.8、18.3、20.0、24.2。证实样品普那霉素IA晶体为结晶型态。 

2、热重-差热(TG-DSC)分析： 

对普那霉素IA晶体进行示差量热检测分析，所使用的仪器型号为NETZSH DSC204F1、环境条件(N2，20.0ml/min/N2，60.0ml/min)、升温速率10℃/min，由图2可见在279.6℃处有一强吸热峰，为本发明的普那霉素IA晶体的熔点。 

本发明经过研究发现，用本结晶工艺制备的普那霉素IA不仅纯度高，而且稳定性好。特别适用于用作普那霉素制剂药物的制备。 

本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由所附权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。 

参考文献： 

[1]Barriere J C et al.，Drugs Fut.1993，18(9)，833 

[2]P·安格B·伯纳瓦德等，CN1159197A，1997 

[3]Leclerq R et al.，Antimicrob Agents Chemother1991，35(7)，1267 

[4]Leclerq R et al.，Antimicrob Agents Chemother1992，30(suppl A)，67

[5]Chant C et al.，J Ann Pharmacother 1995，29，1022 

[6]Finch R G，Drugs，996，51(suppl1)，31

[7]名副周坚芬，国外医药抗生素分册，1996，17(6)，425 

[8]Entenza J M et al.，Antimicrob Agents Chemother，1995，39(7)，1419 

[9]Kang S L et al.，Antimicrob Agents Chemother，1995，39(7)，1505 

Claims (9)

1.一种如式I所示的普那霉素IA晶体，

其中，其具有与X射线粉末晶体衍射图谱图1基本相同的特征。

2.如权利要求1所述的普那霉素IA晶体，其中，所述晶体在X射线衍射图谱中的下述2θ角有特征峰：3.9、9.0、14.5、14.9、16.0、16.4、16.8、18.3、20.0、24.2，并且所述晶体的熔点为276℃～285℃。

3.一种药物组合物，包括治疗有效量的如权利要求1或2所述的普那霉素IA晶体及其药学上可接受的载体。

4.如权利要求3所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包括选自由普那霉素IIA、普那霉素IB、普那霉素IC、普那霉素IIB、普那霉素IIC组成的组中的至少一种。

5.如权利要求3或4所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、颗粒剂或混悬剂。

6.一种如权利要求1或2所述的普那霉素IA的晶体在制备用于治疗抗耐药菌感染的药物中的应用。

7.一种制备如权利要求1或2所述的普那霉素IA晶体的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤a)：将普那霉素IA溶于C1～C4的一元醇或者C3～C6的酮的溶剂中，在0℃～70℃温度下搅拌溶解，过滤，得到滤液；

步骤b)：在步骤a)所得的滤液中加0.5～10倍滤液体积的纯化水，或者将所得的溶液在常压或减压下加热至溶剂的沸点，蒸出溶剂至剩余体积为加入纯化水体积的0.5～2倍，得到含有结晶的悬浊液；

步骤c)：将步骤a)所得的滤液或步骤b)所得的悬浊液冷却到-30℃～30℃，析出结晶，过滤得到普那霉素IA晶体。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述C1～C4的一元醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述C3～C6的酮为丙酮、丁酮或环己酮。

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