JP4417127B2

JP4417127B2 - 細胞壁溶解酵素生産菌

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Publication number: JP4417127B2
Application number: JP2004022318A
Authority: JP
Inventors: 善雄中山; 輝久吉田; 誠司芝崎; 充美植田
Original assignee: Hitachi Plant Technologies Ltd
Current assignee: Hitachi Plant Technologies Ltd
Priority date: 2004-01-30
Filing date: 2004-01-30
Publication date: 2010-02-17
Anticipated expiration: 2024-01-30
Also published as: JP2005210977A

Description

本発明は、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）の細胞壁溶解活性を有するセルロサイマイクロビウム・セルランス（Cellulosimicrobium cellulans）や、かかる微生物による細胞壁溶解酵素粗精製物の製造方法や、この製造物である細胞壁溶解酵素粗精製物の利用等に関する。

微生物や高等植物の細胞壁は主に多糖類で構成されており、酵素による多糖類の分解は生物の生理的作用に重要な役割を果たしている。これら生理的作用として、例えば、高等植物の対病原菌機構や微生物の細胞分裂などを挙げることができる（例えば、非特許文献１参照）。このような細胞壁を分解する酵素については、現在までに数多くの研究がなされており、タンパク質等の菌体内物質の抽出、プロトプラスト調整による形質転換等の分子生物学的手法への利用、細胞壁構成物質の分離・解析及び資化などにかかる細胞壁分解酵素は応用されている。

酵母の細胞壁を溶解する酵素は、現在までに微生物由来のものが多数報告されており、糸状菌ではTrichoderma harzianum、Aspergillus carbonarius、放線菌ではStreptomyces thermodiastaticus、Streptomyces rochei、細菌ではBacillus circulans、Micromonospora chalceaに関するものなどがある（例えば、非特許文献２〜７参照）。また、酵母自身からも酵母細胞壁溶解酵素が単離されており、細胞壁タンパク間の相互作用の研究に用いられている（例えば、非特許文献８，９参照）。他には、大麦のような高等植物の葉からも酵母細胞壁を溶解する酵素が単離されている（例えば、非特許文献１０参照）。また、特許文献においても、アルスロバクター（Arthrobacter）属（例えば、特許文献１，２参照）、オエルスコフィア（Oerskovia）属（例えば、特許文献３〜５参照）、ストレプトミセス（Streptomyces）属（例えば、特許文献６，７参照）など多くの菌種が報告されている。さらに、ＹＬ−１５（天野製薬株式会社）、ツニカーゼ（大和化成株式会社）、ザイモリエイス（生化学工業株式会社）、キタラーゼ（和光純薬工業株式会社）などが上市されている。

特公昭４７−３２６７４号公報特公昭４８−２７９０号公報特公昭５２−４６３０８号公報特公昭６３−５１６７６号公報特開平０７−０３９３７１号公報特公昭５２−３１４２７号公報特公昭６０−２２９１６号公報 Beffa,R.,Meins,F.,Jr.,:Pathogenesis-related functions of plant β-1,3-glucanases investigated by antisense transformation-a review, Gene, Vol.179, pp97-103, 1996 Mansour,F.A.,Mohamedin,A.H.:Candida albicans cell wall lytic enzyme produced by Streptomyces thermodiastaticus,Microbios,Vol.105,pp87-101,2001 Yoshida,M.,Nishi,A.,Ohbuchi,K.,Hojo,T.,Matuzawa,A.,Hamachi,M.,Kumagai,C.:Screening of the lytic enzyme for the red yeast Phaffia rhodozyma cell wall and extraction of astaxanthin,生物工学会誌,Vol.７５,pp229-238,1997 Magnelli,P.,Cipollo,J.F.,Abeijon,C.,Anal.Biochem.:A refined method for the determination of Saccharomyces cerevisias cell wall composition and β-1,6-glucan fine struchure,Vol.301,pp136-150,2002 Ghareib,M.,Nour el Dein,M.M.:Lytic activity of enzyme preparation from Aspergillus carbonarius,Acta.Microbiol.Pol.,Vol.43,pp321-325,1994 Rombouts,F.M.,Phaff,H.J.:Lysis of yeast cell walls, Eur.J.Biochem., Vol.63, pp109-120, 1976 Gacto,M.,Vicente-Soler,J.,Cansado,J.,Villa,T.G.:Characterization of an extracellular enzyme system produced by Micromonospora chalcea with lytic activity on yeast cells,J.Appl.Microbiol.,Vol.88,pp961-967,2000 Mrsa,V.,Klebl,F.,Tanner,W.:Purification and characterization of the Saccharomyces cerevisiae BGL2 gene product, a cell wall endo-β-1,3-glucanase,J.Bacteriol.,Vol.175, pp2102-2106,1993 Mrsa,V.,Ugarkovic,T.,Barbaric,S:Binding of Saccharomyces cerevisiae extracellular proteins to glucane,Arch.Biochem.Biophys.,Vol.296,pp569-574,1992 Grenier,J.,Potvin,C.,Asselin,A.:Barley pathogenesis-related proteins with fungal cell wall lytic activity inhibit growth of yeasts,Plant Physiol.,Vol.103,pp1277-1283,1993

本発明の課題は、出芽酵母サッカロミセス・セレビッシェの細胞壁に対する溶解活性をもつ酵素及びその製造法、該酵素を生産する微生物、該酵素の利用方法などを提供することにある。

本発明者らは、酵母細胞壁溶解酵素を取得するため、日本各地の土壌からサッカロミセス・セレビッシェ細胞壁溶解酵素の産生能の高い微生物のスクリーニングを行った。選抜した菌株の生産酵素を粗精製し、生産酵素のβ−グルカン及びｐＮＰＧ（p-nitrophenyl-β-glucoside）の分解性について判定を行った。また、生産酵素における温度及びｐHの影響を検討した。そしてまた、酵母細胞壁溶解酵素生産菌のうち、ＫＨ−３株の同定を行い、それらがセルロサイマイクロビウム・セルランスに属することを見い出し、本発明を完成するに至った。セルロサイマイクロビウム・セルランスＫＨ−３株の菌学的性質は以下のとおりである。

１．形態的性質（Nutrient Agar培地３０℃)
細胞の形態：桿菌（０．５〜０．６×０．７〜０．８μｍ）
細胞の多形性の有無：−
運動性：＋
胞子の有無：−
２．培養的性質
（Nutrient Agar培地３０℃)
色：薄黄色
光沢：＋
色素産生：＋
（Nutrient Agar培地３０℃)
表面発育の有無：−
培地の混濁の有無：＋
（ゼラチン穿刺培養）
生育状態：＋
ゼラチン液化：−
（リトマス・ミルク）
凝固：−（酸化）
液化：−
３．生理学的性質
グラム染色性：＋
硝酸銀の還元：＋
脱窒反応：−
ＭＲテスト：＋
ＶＰテスト：−
インドール産生：−
硫化水素の生成：−
デンプンの加水分解：＋
クエン酸の利用（Koser）：−
（Christensen）：−
無機窒素源の利用硝酸銀：＋
アンモニウム塩：＋
ウレアーゼ活性：−
オキシダーゼ：−
カタラーゼ：＋
生育の範囲ＰＨ５：−
６：＋
９：＋
生育の範囲温度（℃）２５：＋
３７：＋
４５：＋
５０：−
生育条件（好気性／嫌気性）：＋／＋
Ｏ−Ｆテスト：−／−
４．糖類からの酸産生／ガス産生
Ｌ−アラビノース：＋／−
Ｄ−グルコース：＋／−
Ｄ−フラクトース：＋／−
マルトース：−／−
ラクトース：＋／−
Ｄ−ソルビトール：−／−
イノシトール：−／−
Ｄ−キシロース：＋／−
Ｄ−マンノース：＋／−
Ｄ−ガラクトース：＋／−
サークロース：＋／−
トレハロース：−／−
Ｄ−マンニトール：−／−
グリセリン：−／−
５．その他の生理学的性質
β−ガラクトシダーゼ活性：＋
アルギニンジヒドロラーゼ活性：−
リジンデカルボキシラーゼ活性：−
トリプトファンデアミナーゼ活性：−
ゼラチナーゼ活性：＋

すなわち本発明は、（１）サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）の細胞壁溶解活性を有し、運動性を有することを特徴とするセルロサイマイクロビウム・セルランス（Cellulosimicrobium cellulans）ＫＨ−３（ＦＥＲＭｐ−１９５４７）に関する。

また本発明は、（２）セルロサイマイクロビウム・セルランス（Cellulosimicrobium cellulans）ＫＨ−３（ＦＥＲＭｐ−１９５４７）を培地に培養し、培養物から、至適温度が３０〜４０℃、至適ｐＨが７．０〜９．０である細胞壁溶解活性を有する細胞壁溶解酵素を採取することを特徴とする細胞壁溶解酵素粗精製物の製造方法や、（３）上記（２）記載の製造方法により得られる細胞壁溶解酵素粗精製物に関する。

さらに本発明は、（４）上記（３）記載の細胞壁溶解酵素粗精製物を用いることを特徴とするプロトプラストの調製方法や、（５）上記（３）記載の細胞壁溶解酵素粗精製物を用いることを特徴とする細胞壁構成成分の分離・解析方法や、（６）上記（３）記載の細胞壁溶解酵素粗精製物を用いることを特徴とする菌体内成分の抽出方法に関する。

本発明によると、タンパク質等の菌体内物質の抽出、プロトプラスト調整による形質転換等の分子生物学的手法への利用、細胞壁構成物質の分離・解析及び資化などに応用できる細胞壁溶解酵素や該細胞壁溶解酵素生産菌を提供することができる。

本発明の対象となる微生物としては、サッカロミセス・セレビッシェの細胞壁溶解活性を有するセルロサイマイクロビウム・セルランス、すなわち、サッカロミセス・セレビッシェの細胞壁を溶解する酵素を生産する能力を有するセルロサイマイクロビウム・セルランスに属する微生物であれば特に制限されず、上記細胞壁溶解活性としてはβ−グルカン分解活性を挙げることができ、かかるβ−グルカン分解活性の中でも、β−１，３−グルカン分解活性及び／又はβ−１，６−グルカン分解活性を好適に例示することができる。

本発明のサッカロミセス・セレビッシェの細胞壁溶解活性を有するセルロサイマイクロビウム・セルランスの中でも、運動性を有するセルロサイマイクロビウム・セルランスに属する微生物が好ましい。具体的には、運動性を有するセルロサイマイクロビウム・セルランスＫＨ−３株を挙げることができ、これら微生物の菌学的性質や１６ＳｒＤＮＡの５'側の塩基配列については、実施例において詳述されている。また、セルロサイマイクロビウム・セルランスＫＨ−３は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭＰ−１９５４７として寄託されている。

本発明の細胞壁溶解酵素粗精製物の製造方法としては、セルロサイマイクロビウム（Cellulosimicrobium）属に属するサッカロミセス・セレビッシェの細胞壁溶解酵素生産菌を培地に培養し、培養物から前記細胞壁溶解酵素を採取する方法であれば特に制限されず、また、本発明の細胞壁溶解酵素粗精製物としては、本発明の製造方法により得られる酵素粗精製物であれば特に制限されず、上記セルロサイマイクロビウム属に属するサッカロミセス・セレビッシェ細胞壁溶解酵素生産菌としては、セルロサイマイクロビウム・セルランスに属する微生物、より具体的には、セルロサイマイクロビウム・セルランスＫＨ−３株（ＦＥＲＭｐ−１９５４７）を挙げることができる。

使用する培地としては、液体培地の方が固体培地より好ましく、また、細胞壁溶解酵素生産菌が資化できる炭素源、窒素源、無機塩類、その他微量栄養源を適当な濃度で含むことが望ましい。そして、細胞壁溶解酵素生産培地として、０．２％酵母細胞壁画分、０．７％ yeast nitrogen base、及び０．１％グルコース（ｐH６．８）からなる酵素生産基本培地を好適に例示することができ、上記酵母細胞壁画分としては、後述の実施例１記載のように調製してもよいが、ビール工場の余剰酵母や酵母エキス製造における残渣（ＹＣＷ）をそのまま利用することもできる。細胞壁溶解酵素の生産は、例えば、３０〜４０℃、ｐＨ６〜９の条件下、バッチ式、半連続式又は連続式に培養することにより行うことができる。細胞壁溶解酵素は、通常の酵素の精製法に従って精製して使用することができるし、培養上清をそのまま用いてもよい。

本発明の細胞壁溶解酵素粗精製物としては、細胞壁溶解酵素生産菌の培養物から何らかの人為的手段を施して精製度合いを高めた処理物であればどのようなものでもよく、例えば、培養物を遠心分離により菌体と分離した培養上清も本発明に含まれるが、通常、細胞壁溶解酵素生産菌の培養物から本発明の細胞壁溶解酵素粗精製物を得るには、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。

本発明の細胞壁溶解酵素粗精製物として、具体的には、セルロサイマイクロビウム・セルランスＫＨ−３を、上記酵素生産基本培地にて定常期まで３０℃で振とう培養した後、その遠心上清に硫酸アンモニウムを飽和濃度５０％まで加え、生じた沈殿を滅菌蒸留水に溶解し、分画分子量１０，０００及び１００，０００の濃縮フィルターを用いて濃縮し、遠心後、乾燥させた沈殿を粗精製物、より好ましくは、至適温度が３０〜４０℃、至適ｐＨが７．０〜９．０である細胞壁溶解活性を有する粗精製物として例示することができ、これらの酵素が、β１→３結合の主鎖にβ１→６結合の側鎖を有するグルカンであるラミナランを分解するラミナリナーゼ（laminarinase; 3.2.1.6）活性や、β１→３結合とβ１→４結合（約２：５）を有するグルカンであるリケナンを分解するリケナーゼ（lichenase；3.2.1.73；別名licheninase）活性や、β−１，３−グルカンを９０％以上含むカードランを分解するカードラナーゼ（curdlanase）活性を有することから、本発明の細胞壁溶解酵素粗精製物は、複合酵素を含むものであってもよい。

本発明は、また、上記本発明の細胞壁溶解酵素粗精製物を用いるプロトプラスト、好ましくは真菌類特に酵母のプロトプラストの調製方法や、細胞壁構成成分、好ましくは真菌類特に酵母の細胞壁構成成分の分離・解析方法や、菌体内成分、好ましくは真菌類特に酵母の菌体内成分の抽出方法に関する。上記プロトプラストの調製方法や、細胞壁構成成分の分離・解析方法や、菌体内成分の抽出方法の対象となる真菌類としては、酵母、担子菌、子のう菌を例示することができ、また、酵母としては、分類学上酵母に属するものであればどのような酵母を用いてもよく、例えば、サッカロミセス属、エンドミコープス属、サッカロミコーデス属、ネマトスポラ属、キャンディダ属、トルロプシス属、プレタノミセス属、ロドトルラ属、トルラ酵母等を挙げることができ、より具体的には、サッカロマイセス・セレビッシェ、サッカロマイセス・ルーキシ（Saccharomyces rouxii）、サッカロマイセス・カールスバーゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）等のサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・ウティリス（Candida utilis）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・リポリティカ（Candida lipolytica）、キャンディダ・フレーベリ（Candida flaveri）等のキャンディダ属の酵母などを例示することができる。

上記プロトプラストを調製する方法としては、公知のプロトプラスト調製法と同様に、標的となる酵母等の細胞を培養して集菌し、浸透圧を調節することが可能な物質（ショ糖、ソルビトールなど）を含む高張緩衝液に懸濁し、前記セルロサイマイクロビウム属に属する酵母細胞壁溶解酵素生産菌の培養液、あるいは前記細胞壁溶解酵素粗精製物を添加して、２０℃以下で緩やかに振盪することによって細胞壁を除去することができる。プロトプラスト化は菌体形状の変化、及び蒸留水で希釈し浸透圧を低下させることによる菌体破砕を光学顕微鏡で観察することもできる。また、グルカン、マンナン、キチンという多糖によって構成されている酵母等の細胞壁構成成分の分離・解析や、タンパク質や核酸といった酵母等の菌体内成分の抽出においては、本発明の細胞壁溶解酵素粗精製物と対象酵母等とを、３０℃前後の温度で３０分〜１時間反応させることができる。さらに、これらの細胞壁溶解酵素の作用を促進するために、従来酵母の細胞壁を溶解し、プロトプラスト化の際に用いられる薬剤、例えば０．２〜１重量％のメルカプトエタノールや１０〜１００ｍＭのＥＤＴＡ溶液等を、酵素処理前あるいは酵素処理と同時に添加してもよい。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

（酵母細胞壁の調製）
酵母細胞壁の調製は、文献（Takagi,M.,酵母の実験技術,pp179-201,1994）記載の方法に準じて行った。酵母細胞壁の調製の供試菌株として、サッカロミセス・セレビッシェEGY４８株（Invitrogenn社より購入）を使用した。ＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％グルコース、２％ポリペプトン）で３０℃、２０時間振とう培養したサッカロミセス・セレビッシェを遠心分離機で集菌し、５０ｍMリン酸緩衝液（５０ｍM KH₂PO₄，５０ｍM Na₂HPO₄，ｐＨ７．０）に懸濁し、ガラスビーズ（B.BRAUN BIOTECH INTERNATIONAL,Glasperlen ０．４５−０．５０ｍｍ）を用いて菌体を破砕後、９８％エタノールで洗浄し、乾燥させたものを酵母細胞壁画分とした。

（スクリーニング用寒天プレートの調製）
実施例１で調製した酵母細胞壁画分を用いて、細胞壁溶解酵素生産菌をスクリーニングするための寒天プレートを文献（Yoshida,M., Nishi,A., Ohbuchi,K., Hojo,T., Matuzawa,A., Hamachi,M., Kumagai,C.:Screening of the lytic enzyme for the red yeast Phaffia rhodozyma cell wall and extraction of astaxanthin,生物工学会誌,Vol.７５,pp229-238,1997））記載の方法に準じて調製した。スクリーニング用寒天プレートは、具体的には、シャーレに選択培地（０．２％酵母細胞壁分画、０．７％イーストナイトロジェンベース（Yeast Nitrogen Base）ｗ／ｏ Amino Acids、１．８％寒天；ｐH６．８）を用いて作製した。

（細胞壁溶解酵素生産菌の分離と培養）
土壌試料は、日本各地（主に近畿地方）の山林・草原・川原などから採取し、減菌した蒸留水で１０³〜１０⁵倍希釈し、スクリーニング用寒天プレートに塗沫した。プレートを３７℃で２〜３日間静置後、培地中の細胞壁成分を溶解し、コロニーの周りに大きな透明帯（ハロー）を形成した菌株を分離した。分離した菌株はスクリーニング用寒天プレート上で培養し、４℃にて保存した。

（ハローアッセイ）
分離した菌株の生産酵素の細胞壁溶解活性測定には、ハローアッセイ（Yoshida,M.,Nishi,A.,Ohbuchi,K.,Hojo,T.,Matuzawa,A.,Hamachi,M.,Kumagai,C.:Screening of the lytic enzyme for the red yeast Phaffia rhodozyma cell wall and extraction of astaxanthin,生物工学会誌,Vol.７５,pp229-238,1997）を利用し、実施例１で調製したサッカロミセス・セレビッシェ細胞壁画分を基質として用いた。土壌試料から分離した菌株を酵素生産基本培地（０．２％酵母細胞壁分画、０．７％０．７％イーストナイトロジェンベース（Yeast Nitrogen Base）ｗ／ｏ Amino Acids、０．１％グルコース；ｐH６．８）に植菌し、３７℃で４８時間振とう培養した後、その遠心上清を粗酵素液とした。スクリーニング用寒天プレートにコルクボーラーで直径５．０ｍｍの孔をあけ、粗酵素液３０μｌを注ぎ、３７℃で２４時間保温後に生じるハローの径を測定した。酵素活性は、酵素希釈系列によって作成した式（１）によって算出した。なお、式中ｄはハローの直径（ｍｍ）を表す。式（１）での１単位は、市販酵素Westase（TAKARA社製）１ｍｇ／ｍｌが形成するハロー径に相当する。

（酵素活性）＝０．１１６９ｅ^0.2851d …（１）

（粗酵素粉末の調製）
分離した菌株を、酵素生産基本培地にて定常期まで３０℃で振とう培養した。培養後、その遠心上清に硫酸アンモニウムを飽和濃度５０％まで加えた。生じた沈殿を滅菌蒸留水に溶解し、分画分子量１０，０００及び１００，０００の濃縮フィルター（MILLIPORE,Microcon）を用いて濃縮した。遠心後、乾燥させた沈殿を粗酵素粉末とした。粗酵素粉末は滅菌蒸留水に溶解し、取得酵素のβ−Ｄ−グルカン、ｐＮＰＧの分解活性測定及び至適条件、安定性の検討に用いた。

（ｐＮＰＧの分解活性試験）
５０ｍMリン酸緩衡液に２ｍM ｐＮＰＧを溶解したものを基質溶液とした。基質溶液２００μｌに酵素液３０μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、０．２M Ｎａ₂ＣＯ₃を１ｍｌ加えて反応を停止させた。反応を停止後、蒸留水２ｍｌを加え、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。活性は、１分間に１μｍｏｌのp-ニトロフェノール相当量を遊離する酵素量を１Uと定義した。

（β−グルカンの分解活性試験）
β−グルカン分解活性は、基質溶液（４００ｍｇ／ｍｌ，ｐＨ７．０）２４０μｌに酵素液１０μｌを加え、３７℃における２０時間反応後の遊離還元糖量より求めた。遊離した還元糖量はSomogyi-Nelson法（Nelson,N.,J.Biol.Chem:A photometric adaptation of the somogyi method for the determination of glucose, Vol. 153, pp375-380, 1944；Somogyi,M.:Notes on sugar determination ,J.Biol.Chem, Vol. 195, pp19-23,1952）により測定した。すなわち、反応後の溶液に銅試薬を加え、沸騰湯浴中で１０分間放置後、Nelson試薬を加えて６００ｎｍにおける吸光度を測定した。活性は、1分間に１μｍｏｌのグルコース相当量を遊離する酵素量を１Ｕと定義した。

（粗酵素の至適条件、安定性試験）
ｐHの影響検討に際し、Macllvaine緩衡液（０．１M Ｃ₆Ｈ₈Ｏ₇，０．２ＭＮａ₂ＨＰＯ₄；ｐＨ２．２〜９．０）及びGlycin-NaOH緩衡液（０．２M glycin，０．２M ＮａＯＨ，ｐＨ１０．０〜１２．０）を用いた。基質として実施例１で調製したサッカロミセス・セレビッシェ細胞壁画分を用いた。ｐH安定性においては、４℃で一晩、温度安定性においてはｐH６．８で一晩放置後の酵素溶液を用いて、ハローアッセイにより残存活性を比較した。

（スクリーニング結果）
日本各地より採取した土壌試料２３２点からスクリーニング用寒天プレート上に生育した８６１５コロニーのうち、２２．１％にあたる１９０１コロニーが、培地中のサッカロミセス・セレビッシェ細胞壁画分を溶解してハローを形成し、酵母細胞壁溶解活性を示した（図１）。細胞壁溶解活性をもつ菌株の分布に地域的な偏りはみられなかった。分離した細胞壁溶解酵素生産菌の培養液上清を用いたハローアッセイにおいて、２４時間以内にハローを形成したサンプルは５０４サンプル中１３５サンプルであり、全体の３７％であった（図２）。このハローアッセイで、酵素活性の強いＫＨ−３株を酵素学的解析のために選抜した。

（分離菌株の特徴）
選抜したＫＨ−３株は、桿状細菌で、長さは０．６〜０．８μｍ、幅は０．５〜０．６μｍであった（図３）。スクリーニング用寒天プレート上では最初は白色を呈し、徐々に黄色のコロニーへと変化した。この分離したＫＨ−３株はグラム陽性菌であり、増殖上限温度は４５℃であった。なお、分離した菌株の観察と写真撮影には、オリンパス写真顕微鏡（OLYMPUS,AHBS３）を用いた。

（粗酵素の細胞壁溶解活性）
選抜されたＫＨ−３株を酵素生産基本培地及びＬＢ培地（０．５％酵母エキス、１％トリプトン、１％ＮａＣｌ）で培養し、その培養上清のハローアッセイによる酵素活性を測定したところ、細胞壁溶解活性が認められた。ＬＢ培地では定常期到達前後に最大の酵素活性を示した。

粗酵素粉末を調製するため、ＫＨ−３株をＬＢ培地４００ｍｌで定常期まで培養し、硫安分画（硫安飽和度５０％）及び限外濾過による濃縮処理を行い、３８．０ｍｇの粗酵素粉末を得た。硫安分画を硫安飽和度９０％でも試みたが、析出した沈殿の酵素活性が硫安飽和度５０％の場合と比較して向上しなかったため、硫安飽和度５０％にて塩析操作をおこなった。塩析後、濃縮フィルターで分画した結果、１００，０００Ｄａ以上の画分に強まった酵素活性が認められた。この画分の沈殿を乾燥させ粗酵素粉末とした。粗酵素粉末の細胞壁溶解活性は、濃縮前の培養上清と比較して、ハローアッセイで約２７倍向上した。基質として酵母（S. cerevisiae）細胞壁を用い、市販の酵母細胞壁溶解酵素であるWestase（TAKARA社製）のサッカロミセス・セレビッシェ細胞壁溶解活性とＫＨ−３株の生産酵素の活性とを比較したところ、約４倍の活性を示した。

（粗酵素の基質特異性）
取得した酵素の各種基質分解活性の測定結果を表１に示す。ＫＨ−３株から取得した酵素はｐNPGase，ラミナリナーゼ、リケナーゼ、カードラナーゼ活性を有していた。特に、ＫＨ−３株の生産酵素は強いβ−グルカナーゼ活性を示した。サッカロミセス・セレビッシェ細胞壁画分には、β−１，３−グルカン、β−１，６−グルカン、キチンなどが含まれており、主鎖のβ−１，３−グルカンに側鎖のβ−１，６−グルカンが付加する構造を主としている（Hrmova,M.,Fincher,G.B.: Purification and properties of three(1-3)-β-D-glucanase isoenzymes from young leaves of barley,Biochem.J., Vol.289, pp453-461, 1993；Montijin,R.C., Vink,E., Muller,W.H., Verkleij,A.J., Ende,H.V.D., Henrissat,B., Klis,F.M.: Localization of synthesis of β-1,6-glucan in Saccharomyces cerevisiae, J.Bacteriol., Vol.181, pp7414-7420, 1999）。今回取得したＫＨ−３株由来の酵素はこのような構造に対して分解活性があると考えられるが、ハローアッセイにおいて透明度の異なる二重の円を生じたことから、複合酵素である可能性が示唆される。

（粗酵素の至適条件、安定性）
ＫＨ−３株由来の酵素のS. cerevisiae細胞壁画分に対する至適温度は３０℃〜４０℃、至適ｐＨは７．０〜９．０にあった（図４ａ，４ｂ）。スクリーニングをおこなった条件が、３７℃、ｐＨ６．８であったため、その付近が至適条件となったと考えられる。また、温度安定性では、ｐＨ６．８に調製した酵素溶液を２５〜５０℃で２４時間放置後、３７℃で反応させたところ、３０℃までは溶解活性を維持していたが３５℃以上では活性の低下が著しかった（図４ｃ）。ｐＨ安定性ではｐＨ２．２−１２．０の範囲でそれぞれ４℃にて２４時間放置後、ｐＨ６．８に再調整し３７℃で反応させたところ、ｐＨ６．５を中心に残存活性の安定が見られた（図４ｄ）。

（分離菌株の同定；１６ＳｒＤＮＡ）
選抜したＫＨ−３株の同定を行った。１６ＳｒＤＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子）の部分塩基配列約５００ｂｐをもちいて検体の帰属分類群を推定した。ＫＨ−３株の５'末端側約５００ｂｐの塩基配列を配列番号１に示す。その結果、ＫＨ−３株の１６ＳｒＤＮＡ部分塩基配列は、セルロサイマイクロビウム・セルランスの１６ＳｒＤＮＡに対し最も高い相同性を示すことがわかった。

（分離菌株の同定；形態及び生理学試験）
選抜したＫＨ−３株の形態学的及び生理学試験結果を表２及び表３に示す。その結果、ＫＨ−３株は、グラム染色陽性、桿菌、芽胞非形成、運動性、コロニー色彩で黄白色、カタラーゼ反応陽性、ブドウ糖の分解による酸産生等の性状を示し、また生化学試験や発酵性試験の結果から、その性状は多くの点でセルロサイマイクロビウム・セルランスの性状と一致することがわかった。一方、現在報告されているセルロサイマイクロビウム・セルランス（SCHUMANN (P.), WEISS (N.) and STACKEBRANDT (E.): Reclassification of Cellulomonascellulans (Stackebrandt and Keddie 1986) as Cellulosimicrobium cellulans gen. nov., comb.nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2001, 51, 1007-1010.）やセルロサイマイクロビウム・バリアビレ（BAKALIDOU (A.), KAMPFER (P.), BERCHTOLD (M.), KUHNIGK (T.), WENZEL (M.)and KONIG (H.): Cellulosimicrobium variabile sp. nov., a cellulolytic bacterium from the hindgut of the termite Mastotermes darwiniensis. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2002, 52,1185-1192.）は非運動性として報告されており、この点でＫＨ−３株の性状は報告されているセルロサイマイクロビウム属微生物とは異なっている。

（ＫＨ−３株のＧＣ含量）
ＫＨ−３株の培養菌体から河村らの方法（河村好章,江崎孝行細菌の系統分類と同定方法第18 回日本細菌学会技術講習会テキスト日本細菌学雑誌 55(3):545-584. 2000.）によりDNA を抽出し、抽出したDNAは多糖質由来と思われる粘性を生じていたため、田村らの方法（田村朋彦，中川恭好，川崎浩子: DNA の調製，日本放線菌学会編放線菌の分類と同定）によりHexadecyltrimethyl ammonium bromide(CTAB)を用いて精製し、ＧＣ含量測定のためのＤＮＡを取得した。測定の主な手法は成書（鈴木健一朗：ＤＮＡ塩基組成、鈴木健一朗、平石明、横田明編微生物の分類・同定実験法分子遺伝学・分子生物学的手法を中心に 28-33pp. シュプリンガー・フェアラーク東京. 2001.）によった。高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を用いた測定法は文献（KATAYAMA-FUJIMURA (Y.), KOMATSU (Y.), KURAISHI (H.) and KANEKO (T.):Estimation of DNA base composition by high performance liquid chromatography of its nuclease P1 hydrolysate. Agric. Biol. Chem., 1984, 48, 3169-3172.）記載の方法により行った。

ＫＨ−３株のＧＣ含量について、ヌクレオチドとしたＤＮＡを高速液体クロマトグラフにて測定した結果、ＫＨ−３株のＧＣ含量は、７４．４％であった。この値は、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列による系統解析の結果、ＫＨ−３株と最も相同率の高いセルロサイマイクロビウム・セルランスのＧＣ含量の値７４％（SCHUMANN (P.), WEISS (N.) and STACKEBRANDT (E.): Reclassification of Cellulomonas cellulans (Stackebrandt and Keddie 1986) as Cellulosimicrobium cellulans gen. nov., comb. nov.Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2001, 51, 1007-1010.）ともほぼ一致していた。

（ＫＨ−３株と基準株とのＤＮＡ−Ｄハイブリッド形成試験）
ＫＨ−３株とセルロサイマイクロビウム・セルランス基準株（ＮＢＲＣ１５５１６）とのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成試験を行い、種の異同を決定した。ＫＨ−３株と基準株の培養菌体から前記河村の方法によりＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡ多糖質由来と思われる粘性を生じていたため、前記田村らの方法によりHexadecyltrimethyl ammonium bromide(CTAB)を用いて精製し、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成試験に用いた。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成試験の主な手法は河村の方法（河村好章,江崎孝行細菌の系統分類と同定方法第18 回日本細菌学会技術講習会テキスト日本細菌学雑誌 55(3):545-584. 2000.）及び成書（（鈴木健一朗：ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、鈴木健一朗、平石明、横田明編微生物の分類・同定実験法分子遺伝学・分子生物学的手法を中心に 34-47pp. シュプリンガー・フェアラーク東京. 2001.）により、マイクロプレート法を用いて行った。結果（３回の試験の平均）を表４に示す。

表４に示されるように、ＫＨ−３株と基準株は互いに７０％以上の高い相同値を示した。現在、細菌の種はＤＮＡ−ＤＮＡ相同値の比較の結果、７０％以上の相同値を示す菌株同士を同種とすると定義されている（Wayne (L.G.), Brenner (D.J.), Colwell (R.R.), Grimont (P.A.D.), Kandler (O.), Krichevsky (L.), Moore (L.H.), Moore (W.C.), Murray (R.G.E.), Stackebrandt (E.), Starr (M.P.) , Truper (H.G.) Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics. Int. J.Syst. Bacteriol., 1987, 37, 463-464.）ことから、ＫＨ−３株をセルロサイマイクロビウム・セルランスに属する微生物と同定した。

スクリーニング用寒天プレート上に生育した土壌試料由来の微生物を示す図である。ハローが矢印で示されている。ハローアッセイにおける(ａ)ハロー非形成及び(ｂ)ハロー形成をそれぞれ示す図である。本発明の細胞壁溶解酵素生産微生物ＫＨ−３株の顕微鏡写真を示す図である。本発明の細胞壁溶解酵素粗精製物の溶解活性におけるｐＨと温度の影響を示す図である。図中、●はＫＨ−３株由来の酵素を示す。

Claims

サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）の細胞壁溶解活性を有し、運動性を有することを特徴とするセルロサイマイクロビウム・セルランス（Cellulosimicrobium cellulans）ＫＨ−３（ＦＥＲＭｐ−１９５４７）。
セルロサイマイクロビウム・セルランス（Cellulosimicrobium cellulans）ＫＨ−３（ＦＥＲＭｐ−１９５４７）を培地に培養し、培養物から、至適温度が３０〜４０℃、至適ｐＨが７．０〜９．０である細胞壁溶解活性を有する細胞壁溶解酵素を採取することを特徴とする細胞壁溶解酵素粗精製物の製造方法。
請求項２記載の製造方法により得られる細胞壁溶解酵素粗精製物。
請求項３記載の細胞壁溶解酵素粗精製物を用いることを特徴とするプロトプラストの調製方法。
請求項３記載の細胞壁溶解酵素粗精製物を用いることを特徴とする細胞壁構成成分の分離・解析方法。
請求項３記載の細胞壁溶解酵素粗精製物を用いることを特徴とする菌体内成分の抽出方法。