KR101153871B1 - 알긴산 분해 효소를 생산하는 신규 미생물, 바실러스 에스피 n7151-b - Google Patents
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Abstract
본 발명은 알긴산 분해 효소를 생산하는 신규 미생물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알긴산 분해 효소를 생산하는 신규 미생물 바실러스 에스피. N7151-B (Bacillus sp. N7151-B)에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 신규 미생물 바실러스 에스피. N7151-B를 이용하면 해조류에 포함된 다당류인 알긴산을 효소적으로 가수분해함으로써 알긴산 저분자화물을 경제적으로 대량생산할 수 있는 알긴산 분해효소를 제공한다.
바실러스, 알긴산, 분해효소
Description
본 발명은 알긴산 분해 효소를 생산하는 미생물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 알긴산 분해 효소를 생산하는 신규 미생물, 바실러스 에스피. N7151-B에 관한 것이다.
알긴산은 해초산(海草酸)이라고도 하며, 2종의 우론산의 중합체로 중합도 80, 분자량 1,500 정도로, 묽은 황산으로 씻은 갈조를 묽은 알칼리성의 더운 물에서 추출하여 추출액을 산성으로 만들면 생기는 침전이다. 알긴산은 분자 속에 우론산의 카르복시기(基)가 있으므로 산의 성질을 나타내는데, 보통은 나트륨염으로 다룬다. 알긴산의 칼슘염은 물에 녹지 않으므로 혈액 속의 칼슘 이온과 반응하여 불용성 염을 만들고, 그것이 혈관을 막기 때문에 경구투여(經口投與)로는 독성이 없으나 혈액 속에 주사하면 유독하다. 포유류는 알긴산을 분해하는 효소가 없으므로 알긴산을 영양으로 이용할 수 없다.
알긴산은 1957년까지는 만뉴론산만으로 되어 있다고 생각하였으나, 최근에 와서 글루론산도 알긴산의 구성성분인 것이 밝혀졌다. 구조는 만뉴론산과 글루론산이 β-1, 4결합으로 수백 개가 연결된 것이다. 또, 분자 중에는 만뉴론산만, 또는 글루론산만이 길게 결합 된 곳이 있다. 만뉴론산과 글루론산의 존재량 비는 해조의 종류에 따라 다르다. 알긴산은 불용성이지만 나트륨염은 물에 녹으며 점성도가 매우 높기 때문에 용도가 넓다. 나트륨염은 잘게 부순 갈조를 바람에 건조시킨 것을 묽은 산 또는 묽은 알칼리로 처리하여 침강법, 공기부유법, 원심분리법 등으로 단백질, 섬유질 등의 불순물을 제거하고 알코올을 사용하여 탈수, 건조시킨 후 분말로 만들어, 직물풀, 수성도료, 에멀션화제[乳化劑] 외에 식품에서는 아이스크림, 잼, 마요네즈 등의 점성도(粘性度)를 증가시키는 데 이용한다.
또한, 알긴산(도 1)은 혈청 및 간장 지질의 콜레스테롤 농도를 감소시키고, 지방세포분화억제 효과와 세포 내 지방세포유전인자 단백질인 렙틴(leptin)의 함량을 감소시키는 것으로 보고되는 등, 알긴산의 약학적 효능 또한 우수한 것으로 알려져 있다. 여러 연구자들에 의해 만뉴론산과 글루론산의 중합으로 되어 있는 거대분자인 알긴산을 폴리만뉴론산(polymannuronate)과 폴리글루론산(polyguluronate)으로 저분자화하면, 그 기능성이 월등히 높게 나타나고 있음이 보고되고 있다. 하지만 다당류인 알긴산의 분해의 어려움 및 기존의 분해 방법은 산 또는 염기 가수분해 방법을 쓰기 때문에 정제에 어려움이 있었다. 알긴산 분해 효소를 이용한 방법으로 최근 신규 미생물과 효소를 이용한 방법 등이 국내외적으로 보고가 되고 있으나 알긴산 분해효소를 고효율로 생산하는 미생물을 분리하는 연구 보고는 거의 없는 실정이다.
현재 알긴산 분해효소를 생산하는 것으로 알려진 미생물로는 Pseudomonas aeruginosa(Franklin et al., J. Bacteriol., 186: 4759-4773; 2004), Streptomyces sp.(Cao et al., J. Agric. Food Chem., 55: 5113-5117; 2007), Bacillus sp. ATB-1015(Nakagawa et al., J. Appl. Microbiol., 84: 328-335) Alteromonas sp. strain no. 272(Iwamoto et al., Biosci Biotechnol Biochem., 65: 133-142. 2001)이 알려져 있다. 그러나, 자연계에는 다양한 미생물이 존재하기 때문에, 알긴산 분해 효소를 생산하는 신규 미생물을 분리, 동정하고, 상기 미생물을 이용하여 알긴산을 저분자화 하려는 연구는 계속 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 알긴산 분해 효소를 생산하는 신규 미생물을 분리, 동정하고, 상기 미생물을 이용하여 알긴산을 저분자화 하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 신규 미생물 바실러스 에스피. N7151-B를 이용하면 해조류에 포함된 다당류인 알긴산을 효소적으로 가수분해함으로써 알긴산 저분자화물을 경제적으로 대량생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 해조류에 포함된 다당류인 알긴산을 효소적으로 가수분해함으로써 알긴산 저분자화물을 경제적으로 대량생산할 수 있는 신규 미생물 바실러스 에스피. N7151-B를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 신규미생물, 바실러스 에스피. N7151-B을 이용하여 알긴산 분해효소를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 국립농업과학원 농업유전자원센터 한국농업미생물자원센터에 기탁번호 KACC91428P로 기탁된 신규 미생물, 바실러스 에스피. N7151-B(Bacillus sp. N7151-B)을 제공한다.
본 발명의 신규 미생물에서, 상기 바실러스 에스피. N7151-B는 알긴산 분해 효소를 생산한다.
본 발명의 신규 미생물에서, 상기 바실러스 에스피. N7151-B는 서열번호 3의 16S rDNA를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 신규미생물, 바실러스 에스피. N7151-B를 1차 배양하는 단계; 상기 1차 배양 후 배양액을 수득하는 단계; 및 상기 배양액에서 알긴산 분해 효소를 분리하는 단계를 포함하는 알긴산 분해효소의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 신규미생물, 바실러스 에스피. N7151-B의 분리 동정과 배양 및 배양액에서 알긴산 분해 효소를 분리하는 공정을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 해조류로부터 알긴산 분해효소 활성이 뛰어난 미생물을 분리하기 위하여 지속적인 연구를 수행한 결과 알긴산 분해효소 생산성이 뛰어난 신규 미생물을 분리하였으며, 이를 최적 조건에서 배양하여 알긴산 분해효소를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하게 되었다.
상기 미생물은 동해안에서 미역을 채취하여 미역 표면을 긁어, 채취한 샘플로부터 분리하였다. 분리된 본 발명의 균주에 대한 생리학적 특성을 조사하였다. 본 발명에 따른 균주의 생장 온도는 바람직하게는 4 내지 48℃이고, 최적 생장 온도는 16℃였다(도 2 참조). 생장을 위한 염화나트륨(NaCl)의 농도는 바람직하게는 0% 내지 10%이고, 최적 염화나트륨(NaCl)의 농도는 2%(w/w)였다(도 4 참조). 또한 생장을 위한 pH 농도는 바람직하게는 pH 3 내지 pH 7이고, 최적 생장 pH는 6인 것으로 조사되었다(도 6 참조).
본 발명에 따른 균주는 생장을 위한 탄소- 및 에너지원으로 D-글루코스(D-glucose), D-플루토스(D-fructose), 글리세롤(glycerol), 트레할로스(trehalose), 리보스(ribose), 살리신(salicin), 셀로바이오즈(cellobiose)를 이용하는 것으로 확인되었다. 탄수화물로 람노스(rhamnose), 만니톨(mannitol), 갈락토스(galctose), 자일로스(xylose), 이눌린(inulin), 말토스(maltose), 아라비노스(arabinose), 라피노스(raffinose), 멜리바이오즈(melibiose), 멜레키노 스(melezitose), 솔비톨(sorbitol), 락토스(lactose), D-만노즈(D-mannose)를 이용하지 않는 것으로 확인되었다. 본 발명에 따른 균주의 대사는 호기성(aerobic)인 것으로 조사되었다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 균주를 보다 구체적으로 동정하기 위하여 16S rDNA의 서열을 분석하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 균주의 16S rDNA의 염기서열은 바실러스(Bacillus) 속으로 조사되었다. 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 튜린겐시스 (Bacillus thuringiensis)와 16S rDNA 염기서열과 매우 높은 상동성을 나타내었다. 이로부터 본 발명자들은 본 발명에 따른 균주가 신규한 바실러스 속 미생물임을 확인하였으며, 상기 균주를 '바실러스 에스피. N7151-B(Bacillus sp. N7151-B)'라 명명하였다.
본 발명에 따른 슈도모나스 에스피. N7151-B의 알긴산 분해 효소 생성 유무를 조사한 결과, 본 발명에 따른 균주는 알긴산을 분해하는 효소를 생산하는 것을 확인하였다(도 5 참조). 본 발명자들은 본 발명에 따른 바실러스 에스피. N7151-B를 2008년 12월 23일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터 한국농업미생물자원센터에 기탁하였다(기탁번호: KACC91428P).
본 발명에 따른 바실러스 에스피. N7151-B은 알긴산 분해 효소를 생산하여 알긴산을 저분자화에 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 미생물을 이용하여 알긴산 분해 효소를 생산하는 방법은 본 발명의 바실러스 에스피. N7151-B을 생육가능한 배지(Tryptone 1%, Yeast extract 0.5%, NaCl 1%)에서 배양하고, 그 배양액으로부터 알긴산 분해 효소를 수거하는 것을 포함한다. 이때 본 발명에 따른 균주 를 배양배지(Alginate-Na 0.5%, Yeast extract 0.2%, NaCl 0.2%, K2HPO4 0.2%, MgSO4?7H2O 0.1%, KCl 0.1%, CaCl2 0.005%)에서 30℃, 2일간 1차 배양하고 배양액으로부터 원심분리를 이용해 상등액을 회수한 후, 0.45 um로 여과 후, 암모늄 설페이트를 이용하여 농축 후 이용할 수 있다. 배양시 본 발명에 따른 균주의 원활한 생장과 알긴산 분해 효소의 대량 생산을 위하여 상기 배지에 알긴산을 첨가하는 것이 바람직하다. 또한, 배양액으로부터 알긴산 분해 효소의 수거는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, FPLC(Fast performance liquid chromatography) 등의 당업계에 공지된 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.
실시예 1. 샘플 채취, 미생물 분리, 배양 및 유지
우리나라 동해안에서 미역을 채취하여 미역표면을 긁어 채취한 샘플을 배양배지(Alginate-Na 0.5%, Yeast extract 0.2%, NaCl 0.2%, K2HPO4 0.2%, MgSO4 7H2O 0.1%, KCl 0.1%, CaCl2 0.005%)에 도말하여, 30℃에서 2일간 배양하여 미생물을 분 리하였다. 분리된 미생물을 'N7151-B 균주'라 명명하였다.
실시예 2. 표현형적 특성(phenotypic characteristics) 조사
본 발명에 따른 N7151-6 균주의 형태학적 및 생리학적 특성을 조사하기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다.
2-1. 생리학적 특성
(1) 온도 범위
본 발명에 따른 N7151-B 균주를 영양 배지(Difco)에서 각 온도별(4, 16, 25, 30, 37, 42 및 48℃)로 2일간 배양하여 생장 온도 범위를 조사하였다. 그 결과, N7151-B 균주는 16 내지 37℃에서 생장하는 것으로 나타났으며, 최적 생장 온도는 16℃로 나타났다(도 2 참조).
(2) 염(NaCl) 내성
본 발명에 따른 N7151-B 균주를 0-10%(w/v)의 NaCl을 포함하는 트립티카제 소이 배지(trypticase soy broth)배지에서 30℃로 3일간 배양하였다. 그 결과, 생장을 위한 최적 NaCl의 농도는 2%인 것으로 나타났으며, 8%에서는 생장이 느려졌다(도 4 참조).
(3) pH 범위
본 발명에 따른 N7151-B 균주를 각 pH(3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0)의 배양 배지에서 2일간 배양하여 생장 pH 범위를 조사하였다. 그 결과, pH 3.0 이상에서 생장 가능함을 알 수 있었으며, 최적 생장 pH는 6인 것으로 나타났다. (도 6 참조).
(4) 탄소원의 이용능력 테스트
탄소원의 이용능력 테스트는 하기 [표 1]에 기재된 총 20개의 기질을 포함하는 마이크로 플레이트를 이용하여 수행하였다. 각 기질을 최종농도 1%(salicin 0.5%)가 되도록 하여 당 기초 배지인 퍼플 브로쓰 베이스(puple broth base, Difro)에 여과 또는 습열 멸균하여 가하였다. 이후, 상기 배지에 본 발명의 균주를 접종하여 30℃에서 3일간 배양하였다. 이후, 양성반응은 노란색으로, 음성반응은 원래 배지색인 보라색으로 하여 결과를 확인하였다.
[표 1]. 탄소원 이용능력 테스트에 사용된 기질 및 이용능력
상기 [표 1]에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 N7151-B균주는 본 실험에 사용된 20개 기질 중 D-글루코스, D-플루토스, 글리세롤, 트레할로스, 리보스, 살리신, 셀로바이오즈를 이용하는 것으로 확인되었다.
실시예 3. 16S rDNA 서열 결정
라이네이 등의 방법(Rainey et al., Syst. Appl. Microbiol., 15: 197-202, 1992)에 따라 본 발명에 따른 N7151-B 균주로부터 게노믹 DNA를 추출한 후, 서열번호 1과 서열번호 2로 기재되는 프라이머를 이용하여 16S rDNA를 증폭하였다. PCR 반응조건은 게노믹 DNA 10 ng, Taq 중합효소 1 unit, 10× 완충용액(with MgCl2) 및 각 프라이머 20 pmol을 총 반응용액으로 하여 94℃에서 5분 동안 주형 DNA를 전변성화시킨 후, 94℃에서 1분; 56℃에서 30초; 및 72℃에서 1분 30초를 한 싸이클(cycle)로 하여 총 25회 반복수행한 후, 마지막으로 72℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이후, PCR 산물을 pGEM-T 벡터(Promega)에 클로닝한 후, 분리된 DNA 클론을 ABI PRISMTM 염색 시약(Perkin Elmer, USA)과 반응시켰다. ABI 377 제네틱 분석기(ABI 377 genetic analyzer, Perkin Elmer, USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다.
그 결과, 본 발명에 따른 N7151-B 균주의 16S rDNA의 크기는 1545 bp이었으며, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 가졌다. 또한, 본 발명에 따른 N7151-B 균주의 16S rDNA의 염기서열을 NCBI GenBank 데이터베이스의 BLASTN과 BLASTX를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 N7151-B 균주의 16S rDNA의 염기서열은 다양한 바실러스 속 미생물 중에서도 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 튜린겐시스 (Bacillus thuringiensis)와 99%의 높은 상동성을 나타내었다.
상기 결과들로부터 본 발명에 따른 N7151-B 균주가 바실러스 속에 속하는 미생물임을 확인하였다. 본 발명자들은 상기 N7151-B 균주를 '바실러스 에스피. N7151-B(Bacillus sp. N7151-B)'라 명명하고 2008년 12월 23일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터 미생물자원센터에 기탁하였다(기탁번호: KACC91428P).
실시예 4. 본 발명에 따른 균주로부터 알긴산 분해 효소의 생산 조건
본 발명 N7151-B 균주의 알긴산 분해능을 확인하기 위한 고체배지(Alginate-Na 0.5%, Yeast extract 0.2%, K2HPO4 0.2%, MgSO4 7H2O 0.1%, KCl 0.1%, CaCl2 0.005%, Agar 1.5%)에서 대조군으로 E. coli로 CPC(cetylpyridinium chloride) 10%로 알긴산 분해능을 확인하였다(도 5 참조). 세포성장은 흡광도가 0.5 이하가 되도록 배양액을 희석한 후 분광광도계를 이용하여 660nm에서 흡광도를 측정하였다. 알긴산 분해효소 활성은 기질로써 0.25% Na-알긴산(sodium alginate) 0.9 ml에 배양 상등액 0.1 ml를 첨가하여, 37℃에서 1시간 반응시킨 후 DNS법에 의해 흡광도(550nm)를 측정하여 우론산으로 D-글루코론산 생성량을 측정하였다.
그 결과 본 발명에 따른 균주의 배양시 온도가 16℃일 때 성장이 가장 좋으나, 온도가 30℃일 때 가장 높은 알긴산 분해효소의 활성을 보이므로, 알긴산 분해효소의 최적 발현 온도는 30℃ 로 조사되었다(표 2).
[표 2]. 배양 배지의 온도에 따른 균주의 성장과 알긴산 분해효소 활성도
또한 본 발명에 따른 균주의 배양시 염화나트륨(NaCl)의 농도가 2%일 때 성장이 가장 좋으나, 염화나트륨의 농도가 4%일 때 가장 높은 알긴산 분해효소의 활성을 보이므로, 알긴산 분해효소의 최적 발현 염화나트륨의 농도는 4%로 조사되었다(표 3).
[표 3]. 배양 배지의 NaCl 농도에 따른 균주 성장과 알긴산 분해효소 활성도
그리고 본 발명에 따른 균주의 배양시 pH 6일 때 성장이 가장 좋으나, pH 8일 때 가장 높은 알긴산 분해효소의 활성을 보이므로, 알긴산 분해효소의 최적 발현 pH의 값은 8로 조사되었다(표 4).
[표 4]. 배양 배지의 pH 에 따른 균주의 성장과 알긴산 분해효소 활성도
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의해 분리?동정된 신규 미생물 바실러스 에스피. N7151-B를 배양한 배양액으로부터 원심분리하여 알긴산 분해효소를 효과적으로 생산할 수 있었고, 본 발명의 신규 미생물 바실러스 에스피. N7151-B을 이용하면 해조류에 포함된 다당류인 알긴산을 효소적으로 가수분해함으로써 알긴산 저분자화물을 경제적으로 대량생산할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 신규 미생물 및 이를 이용하여 생산한 알긴산 분해효소는, 식품학적, 약학적 및 미용학적 등의 용도로 사용되고 있는 만뉴론산과 글루론산 제조에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 알긴산의 구조식을 나타낸 것이다.
도 2는 온도에 따른 본 발명의 균주의 생장 곡선을 나타낸 것이다.
도 3은 온도에 따른 본 발명의 균주의 알긴산 분해 활성도를 나타낸 것이다.
도 4은 염화나트륨의 농도에 따른 본 발명의 균주의 생장 곡선을 나타낸 것이다.
도 5는 염화나트륨의 농도에 따른 본 발명의 균주의 알긴산 분해 활성도를 나타낸 것이다.
도 6는 pH에 따른 본 발명의 균주의 생장 곡선을 나타낸 것이다.
도 7은 pH에 따른 본 발명의 균주의 알긴산 분해 활성도를 나타낸 것이다.
<110> Gijang Co. Ltd.
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cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca 1140
tcattaagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 1200
cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacggtacga 1260
agagctgcaa gaccgcgagg tggagctaat ctcataaaac cgttctcagt tcggattgta 1320
ggctgcaact cgcctacatg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg 1380
tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc 1440
gaagtcggtg gggtaacctt tttggagcca gccgcctaag gtgggacaga tgattggggt 1500
gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaac ctgcggctgg atcac 1545
Claims (4)
- 한국농업미생물자원센터에 기탁번호 KACC91428P로 기탁된 신규 미생물, 바실러스 에스피. N7151-B(Bacillus sp. N7151-B).
- 제1항에 있어서, 상기 바실러스 에스피. N7151-B는 알긴산 분해 효소를 생산하는 미생물인 것을 특징으로 하는 신규 미생물, 바실러스 에스피. N7151-B.
- 제1항에 있어서, 상기 바실러스 에스피. N7151-B는 서열번호 3의 16S rDNA를 갖는 것을 특징으로 하는 신규 미생물, 바실러스 에스피. N7151-B.
- 삭제
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Applications Claiming Priority (1)
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KR1020090007045A KR101153871B1 (ko) | 2009-01-29 | 2009-01-29 | 알긴산 분해 효소를 생산하는 신규 미생물, 바실러스 에스피 n7151-b |
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Family Applications (1)
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-
2009
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