CN104726345B - 一组高产巴卡亭ⅲ组合菌株及生产巴卡亭ⅲ的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组高产巴卡亭Ⅲ组合菌株及生产巴卡亭Ⅲ的方法，属于生物技术领域。高产巴卡亭Ⅲ组合菌株为产巴卡亭Ⅲ菌株与产紫杉醇菌株的组合菌株，产巴卡亭Ⅲ菌株为南方红豆杉内生真菌no.79，产紫杉醇菌株为曼地亚红豆杉内生真菌Z58或印度紫杉内生Gliocladium sp.。通过将产巴卡亭Ⅲ菌株与产紫杉醇菌株单独培养后再混合培养，大幅提高了发酵物中巴卡亭Ⅲ的产量。本发明利用代谢途径互补和反馈抑制原理大大提高了巴卡亭Ⅲ的产量，远高于单独培养的产量。本发明使利用内生真菌进行工业发酵培养生产巴卡亭Ⅲ成为可能，为半合成法生产紫杉醇提供更为廉价的原料，降低了生产成本；减弱对红豆杉资源的依赖，减小对环境的破坏。

Description

一组高产巴卡亭Ⅲ组合菌株及生产巴卡亭Ⅲ的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，公开了一组高产巴卡亭Ⅲ组合菌株及生产巴卡亭Ⅲ的方法。
背景技术
癌症是严重影响人类健康的重大疾病之一，1979年美国癌症中心(NationalCancer Institute)证实紫杉醇具有独特的抗癌机理。紫杉醇对卵巢癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、黑色素瘤、头颈部癌具有很好的疗效。但是，天然紫杉醇主要来源于红豆杉属(Taxus)植株，含量很低，制备一例病人所需药物要用3-4棵百年红豆杉大树，而从大约2000棵红豆杉大树树皮中只能提取1kg紫杉醇。而红豆杉属(Taxus)植物为我国珍稀濒危物种，属国家一级保护植物。
紫杉醇细胞培养、真菌发酵、全合成与半合成等研究报道很多。其中细胞培养生产紫杉醇不失为一种较理想的方法，但是其产率较低。
自从1991年Stierle与Stroble筛选出第一株产紫杉醇的内生真菌以来，国内外学者相继开展了筛选产紫杉醇内生真菌的研究。例如，马天有等分离得到一株能产紫杉醇的内生真菌，产量为141.20μg/L(马天有，董兆麟.从植物分离产紫杉醇的内生真菌的研究.西北大学学报:自然科学版,1999.2(91):47-49)；胡凯等分离到三株紫杉醇产生菌，最高一株产量为276.75μg/L(胡凯，谈峰，唐克轩，等.南方红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分离和筛选.西南师范大学学报.自然科学版,2006.31(1):134-137)。孟丽等从根部不仅分离到产紫杉醇的多个内生真菌菌株，而且其中一株镰刀菌(Fusarium sp.)菌株产量高达515.20μg/L(竺俊鑫；李勇超；孟丽；红豆杉中产紫杉醇内生真菌分离部位的比较研究[J]；生物技术通报；2008年04期)，为迄今报道的产紫杉醇内生真菌产量最高的野生菌株。综观以往研究，产紫杉醇菌株的产率总体较低，仍达不到真菌发酵工业化生产紫杉醇的盈亏平衡点(1mg/L)。
1988年，法国Denis等首次报道了以10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-deacetylbaccatinⅢ，10-DAB)为原料半合成紫杉醇。1994年美国施贵宝公司(BMS)采用Holton教授半合成方法的专利生产半合成紫杉醇。1997年，半合成紫杉醇通过美国FDA批准上市。半合成紫杉醇是当前生产紫杉醇的主要途径，其是以红豆杉树皮中含量相对较丰富的10-DAB为起始母核，首先用硅烷基团保护7位羟基，再乙酰化10位羟基，形成TES-baccatinⅢ，其再与C13侧链前体缩合，然后水解除去7位和2位上的保护基团即成为紫杉醇。但是紫杉醇转化的前体物——10-DAB主要是从红豆杉树皮或枝叶中获得，因此，紫杉醇的生产还脱离不了红豆杉资源。
巴卡亭Ⅲ(BaccatinⅢ)是红豆杉中生物合成紫杉醇的中间产物，其结构比10-DAB在10位上多了一个乙酰基，更接近紫杉醇。故而巴卡亭Ⅲ比10-DAB更具市场前景。
发明内容
本方法的目的在于提供一组高产巴卡亭Ⅲ组合菌株及该组合菌株生产巴卡亭Ⅲ的方法，通过培养该组合菌株发酵液中的巴卡亭Ⅲ含量大幅提高，为半合成法生产紫杉醇提供优质价廉的前体物质。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一组高产巴卡亭Ⅲ组合菌株为产巴卡亭Ⅲ菌株与产紫杉醇菌株的组合菌株。
优选的，所述的产巴卡亭Ⅲ菌株为南方红豆杉内生真菌no.79；所述的产紫杉醇菌株为曼地亚红豆杉内生真菌Z58或印度紫杉内生Gliocladium sp.。其中，南方红豆杉内生真菌no.79在文献1中公开，曼地亚红豆杉内生真菌Z58在文献2中公开，印度紫杉内生Gliocladium sp.在文献3中公开。
文献1：Jian Zaiyou,Meng Li,Xu Guifang,Zhou Xiuren.Isolation of anendophytic fungus producing baccatin III from Taxus wallichiana var.mairei.JInd Microbiol Biotechnol,2013.40:1297-1302.该文献记载了从南方红豆杉中分离到一株产巴卡亭Ⅲ的内生菌菌株no.79(Diaporthe sp.)，其巴卡亭Ⅲ产量是0.219mg/L。
文献2：苗莉云，张鹏，刘博，徐曼，等.产紫杉醇内生真菌Z58的分离和鉴定.中国生物化学与分子生物学报,2012.28(12):1141-1146。该文献记载了从曼地亚红豆杉中分离得到一株产紫杉醇内生真菌菌株Z58(Hypocrea sp.)，其紫杉醇产量为2.5-3.0μg/g。
文献3：D.Sreekanth,A.Syed,S.Sarkar,D.Sarkar,et al.Production,purification,and characterization of taxol and 10-DABIII from a newendophytic fungus Gliocladium sp.isolated from the Indian yew tree,Taxusbaccata.J Microbiol Biotechnol,2009.19(11),1342-1347.该文献记载了从印度紫衫中提取了一株产紫杉醇和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的内生菌新菌株(Gliocladium sp.)，其紫杉醇和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ产量分别为10μg/L和65μg/L。
真菌no.79、Z58和Gliocladium sp.菌株的分类如下：
no.79为真菌界，子囊菌纲，球壳目，腐皮壳科，间座壳属。
Z58为真菌界，粪壳菌纲，肉座菌目，肉座菌科，肉坐菌属。
Gliocladium sp.为真菌界，粪壳菌纲，肉座菌目，肉座菌科，粘帚霉属。
no.79、Z58和Gliocladium sp.的特征见下表。
Figure BDA0000669600490000031
上述组合菌株在生产巴卡亭Ⅲ中的应用。
上述组合菌株生产巴卡亭Ⅲ的方法，为产巴卡亭Ⅲ菌株与产紫杉醇菌株混合培养。
优选的，所述的组合菌株生产巴卡亭Ⅲ的方法包括如下步骤：
(1)将产巴卡亭Ⅲ菌株，产紫杉醇菌株分别接种于PDA培养基中培养得到种子发酵液。
(2)将产巴卡亭Ⅲ菌株的种子发酵液，产紫杉醇菌株的种子发酵液分别接种于发酵培养基中扩大培养。所述的发酵培养基为：马铃薯200g、麸皮10g、酵母膏1g/L、蔗糖20g、苯甲酸钠250mg/L、硫酸镁0.4g/L、磷酸二氢钾2g/L、水1000mL；或马铃薯200g，麸皮5g，酵母膏1g/L，蔗糖20g，硫酸镁2g/L，苯甲酸钠250mg/L，硫酸锌0.05g/L，钼酸铵0.15g/L，水1000mL；自然pH。
(3)将扩大培养的产巴卡亭Ⅲ菌株菌液与产紫杉醇菌株菌液混合，再补加发酵培养基培养。
(4)巴卡亭Ⅲ的提取：将(3)培养得到的发酵液离心，上清液用二氯甲烷萃取，菌丝破碎后也用二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷萃取液，通过干燥、蒸干得到巴卡亭Ⅲ。
更优选的，所述的组合菌株生产巴卡亭Ⅲ的方法包括如下步骤：
(1)将产巴卡亭Ⅲ菌株，产紫杉醇菌株分别接种于60mL PDA培养基中培养得到种子发酵液。
(2)菌体生长培养：将产巴卡亭Ⅲ菌株的种子发酵液，产紫杉醇菌株的种子发酵液分别接种于含500mL发酵培养基的摇瓶中培养得到含菌体和培养液的菌液。
(3)将产巴卡亭Ⅲ菌株菌液与产紫杉醇菌株菌液按体积比1:1混合，再补加总体积1倍的发酵培养基培养。
(4)巴卡亭Ⅲ的提取：将(3)培养得到的发酵液4000rpm离心15min，上清液部分用等体积的二氯甲烷萃取，取水相部分再用等体积的二氯甲烷萃取1次；菌丝部分经液氮研碎，超声30min，静置过夜后用等体积的二氯甲烷萃取，重复处理1次；将所有的二氯甲烷萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35℃下减压蒸馏至干得到巴卡亭Ⅲ。
上述组合菌株生产巴卡亭Ⅲ的方法还包括含量检测步骤，将通过上述方法得到的巴卡亭Ⅲ用甲醇溶解，滤膜过滤后上高效液相色谱柱，色谱条件为：VP-ODS C18柱(150mm×46mm)；流动相为甲醇∶水∶乙腈＝20∶45∶35(体积比)；流速0.7mL/min，检测波长227nm。
本发明是利用这两种同类真菌代谢途径互补及反馈抑制，一方面使产紫杉醇内生真菌为产巴卡亭Ⅲ内生真菌的生物转化提供在巴卡亭Ⅲ合成过程当中所需的多种酶类和一些诱导因子，加速了最初前体如乙酰CoA和苯丙氨酸等物质的利用，从而提高了巴卡亭Ⅲ的含量。另一方面产紫杉醇内生真菌为产巴卡亭Ⅲ的内生真菌提供了一定量的紫杉醇，而紫杉醇作为代谢终产物反馈抑制了代谢历程，致使中间代谢产物巴卡亭Ⅲ的积累。
本发明的优点在于：利用产巴卡亭Ⅲ内生真菌培养物与产紫杉醇内生真菌培养物进行混合培养，大幅度提高发酵物中巴卡亭Ⅲ含量。通过将no.79与Z58或Gliocladium sp.单独培养后再混合培养，采用二段发酵法发酵，最终发酵液中巴卡亭Ⅲ的产量分别达到11.734和9.36mg/L，使发酵物种的巴卡亭Ⅲ含量提高42-53倍，达到10mg/L，大大高于产巴卡亭Ⅲ内生真菌单独培养的产量水平。本发明使利用内生真菌进行工业发酵培养生产巴卡亭Ⅲ成为可能，为半合成法生产紫杉醇提供更为廉价的原料，降低了生产成本；进而减弱对红豆杉资源的依赖，减小对环境的破坏。
附图说明
图1是HPLC测定no.79与Z58混合培养产巴卡亭Ⅲ的谱图。
图2是HPLC测定no.79与Gliocladium sp.混合培养产巴卡亭Ⅲ的谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。应理解，下面的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本技术的范围。
实施例1no.79与Z58组合生产巴卡亭Ⅲ
以下是no.79与Z58菌株混合培养提取巴卡亭Ⅲ的具体步骤：
(1)培养基的制备：
1)PDA培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，水1000mL，自然pH。
2)发酵培养基：马铃薯200g，麸皮10g，酵母膏1g/L，蔗糖20g，苯甲酸钠250mg/L，硫酸镁0.4g/L，磷酸二氢钾2g/L，水1000mL，自然pH。马铃薯去皮切条，水煮30min，4层纱布过滤；麸皮水煮30分钟，4层纱布过滤。
(2)菌体预培养：挑取产巴卡亭Ⅲ的内生真菌no.79和产紫杉醇的内生真菌Z58分别接种于60mL PDA培养基中，25℃、100rpm/min培养1天形成种子发酵液。
(3)菌体生长培养：分别将上述两种真菌的种子发酵液接种于含500mL发酵培养基的摇瓶中，25℃、100rpm/min培养2天得到含菌体和培养液的真菌菌液。
(4)将上述发酵物(即真菌菌液)进行混合培养生产巴卡亭Ⅲ：将no.79菌液与Z58菌液按体积比1:1混合，补加总体积1倍的发酵培养基于25℃、100rpm/min培养3天，并将no.79菌液和Z58菌液单独培养作对照。
(5)巴卡亭Ⅲ的提取：将发酵物4000rpm离心15min，将上清液部分用等体积的二氯甲烷萃取，取水相部分再用等体积的二氯甲烷萃取1次。菌丝部分经液氮研碎，超声30min，静置过夜后用上清液等体积的二氯甲烷萃取，重复处理1次，将所有的二氯甲烷萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35℃下减压蒸馏至干，溶解于3mL甲醇中，用0.45μm滤膜过滤，定容至10mL，避光冷藏，备用。
(6)含量检测：将滤后的巴卡亭Ⅲ样品上高效液相色谱柱，色谱条件为：VP-ODSC18柱(150mm×46mm)；流动相为甲醇(v):水(v):乙腈(v)＝20∶45∶35；流速0.7mL/min，检测波长227nm，柱温35℃。
分别测定混合培养与单独培养的两个菌株所得的巴卡亭Ⅲ的产量，混合培养的产量为11.734mg/L(HPLC谱图见图1)、单独培养no.79的产量为0.219mg/L，混合发酵后巴卡亭Ⅲ产量比单独培养no.79菌株提高了53.5倍。
实施例2no.79和Gliocladium sp.组合生产巴卡亭Ⅲ
实施方案与实施例1一致，所用的产巴卡亭Ⅲ的菌株为no.79，产紫杉醇菌株为Gliocladium sp.。所用的发酵培养基：马铃薯200g，麸皮5g，酵母膏1g/L，蔗糖20g，硫酸镁2g/L，苯甲酸钠250mg/L，硫酸锌0.05g/L，钼酸铵0.15g/L，水1000mL，自然pH。发酵条件不变，进行混合发酵和单独发酵。发酵产物进行高效液相色谱检测，混合发酵巴卡亭Ⅲ的含量为9.36mg/L(见图2)，混合发酵后巴卡亭Ⅲ的产量比单独培养no.79提高了42.7倍。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.产巴卡亭Ⅲ组合菌株在生产巴卡亭Ⅲ中的应用，其特征在于：所述产巴卡亭Ⅲ组合菌株为产巴卡亭Ⅲ菌株与产紫杉醇菌株的组合菌株；所述的产巴卡亭Ⅲ菌株为南方红豆杉内生真菌no.79；所述的产紫杉醇菌株为曼地亚红豆杉内生真菌Z58。
2.产巴卡亭Ⅲ组合菌株生产巴卡亭Ⅲ的方法，其特征在于：为产巴卡亭Ⅲ菌株与产紫杉醇菌株混合培养，包括如下步骤：
(1)将产巴卡亭Ⅲ菌株，产紫杉醇菌株分别接种于PDA培养基中培养得到种子发酵液；
(2)将产巴卡亭Ⅲ菌株的种子发酵液，产紫杉醇菌株的种子发酵液分别接种于发酵培养 基中扩大培养；
(3)将扩大培养的产巴卡亭Ⅲ菌株菌液与产紫杉醇菌株菌液混合，再补加发酵培养基培 养；
(4)巴卡亭Ⅲ的提取：将(3)培养得到的发酵液离心，上清液用二氯甲烷萃取，菌丝 破碎后也用二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷萃取液，通过干燥、蒸干得到巴卡亭Ⅲ；
所述的产巴卡亭Ⅲ菌株为南方红豆杉内生真菌no.79；所述的产紫杉醇菌株为曼地亚红豆杉内生真菌Z58。
3.根据权利要求2所述的生产巴卡亭Ⅲ的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的发酵 培养基为：马铃薯200g、麸皮10g、酵母膏1g/L、蔗糖20g、苯甲酸钠250mg/L、硫酸镁0.4g/L、 磷酸二氢钾2g/L、水1000mL；或马铃薯200g，麸皮5g，酵母膏1g/L，蔗糖20g，硫酸镁2g/L，苯甲酸钠250mg/L，硫酸锌0.05g/L，钼酸铵0.15g/L，水1000mL；自然pH。
4.根据权利要求2所述的生产巴卡亭Ⅲ的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将产巴卡亭Ⅲ菌株，产紫杉醇菌株分别接种于60mL PDA培养基中培养得到种子发酵液；
(2)菌体生长培养：将产巴卡亭Ⅲ菌株的种子发酵液，产紫杉醇菌株的种子发酵液分别接种于含500mL发酵培养基的摇瓶中培养得到含菌体和培养液的菌液；
(3)将产巴卡亭Ⅲ菌株菌液与产紫杉醇菌株菌液按体积比1:1混合，再补加总体积1倍的发酵培养基培养；
(4)巴卡亭Ⅲ的提取：将(3)培养得到的发酵液4000rpm离心15min，上清液部分用 等体积的二氯甲烷萃取，取水相部分再用等体积的二氯甲烷萃取1次；菌丝部分经液氮研碎， 超声30min，静置过夜后用等体积的二氯甲烷萃取，重复处理1次；将所有的二氯甲烷萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35℃下减压蒸馏至干得到巴卡亭Ⅲ。
5.根据权利要求2-4任一项所述的生产巴卡亭Ⅲ的方法，其特征在于还包括含量检测步骤：将得到的巴卡亭Ⅲ用甲醇溶解，滤膜过滤后上高效液相色谱柱，色谱条件为：VP-ODSC18 柱；流动相为甲醇∶水∶乙腈＝20∶45∶35；流速0.7mL/min，检测波长227nm。
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