CN102093969A - 葛根素磷酯化的微生物转化方法 - Google Patents
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Abstract
葛根素磷酯化的微生物转化方法：将具有葛根素磷酯化酶活力的BacilluscereusNT-02微生物菌种接种到培养基中，进行发酵培养。发酵结束后，将发酵液与菌体分离。所获菌体作为静息细胞，加入到含有葛根素的转化液中，使葛根素转化为磷酯化葛根素。转化结束后，去除菌体，转化液用有机溶剂萃取处理，或用药学上可接受的方法处理，得到葛根素及磷酯化葛根素总异黄酮，经色谱分离或药学上可接受的分离方法，可得到含量>90％的磷酯化葛根素粉末。
Description
技术领域
本发明涉及一种葛根素磷酯化的微生物转化方法。
技术背景
葛根素（Puerarin）化学名为：4’,7-二羟基-8-β-D-葡萄糖异黄酮。其毒副作用小，有较广泛的生理功能：如具有抗心律失常及降血压；扩张冠状动脉，保护心肌超微结构，减少心肌梗死范围；扩张脑血管，增加脑血流量，改善大脑供氧；改善耳、视网膜等器官微循环；抑制血小板聚集，改善血液流变，降低血液黏滞度的作用和低密度脂蛋白被氧化损伤的程度；能清除自由基和抗氧化作用；保护动脉血管内皮细胞，阻止动脉粥样硬化，防止血栓形成；有较缓和的降低血糖的作用。
发明内容
本发明目的在于提供一种葛根素磷酯化的微生物转化方法：筛选获得可催化Puerarin为葛根素-6″-O-磷酸酯（puerarin-6″-O-phosphate ester）微生物菌株，以便采用微生物转化的方法，获得puerarin-6″-O-phosphate ester产品。Puerarin转化为puerarin-6″-O-phosphate ester的代谢途径见图1。
本发明采用分离及保藏的具有葛根素磷酸酯化酶活力的微生物菌种，接种到培养液中，进行发酵培养。发酵结束后，将发酵液与菌体分离。所获菌体作为静息细胞，加入到含有葛根素的转化液中，使葛根素转化为葛根素-6″-O-磷酸酯。转化结束后，去除菌体，上清液经浓缩、低温干燥处理后，可得到含葛根素-6″-O-磷酸酯的固体（纯度≥50%）。或将转化液的上清液用有机溶剂萃取，再用水从有机相中反萃取，获得的水相萃取液经浓缩、硅胶层析，可得到含葛根素-6″-O-磷酸酯的溶液，再将含葛根素-6″-O-磷酸酯的溶液经浓缩、或低温处理后，可得到葛根素-6″-O-磷酸酯粉末或晶体（纯度≥90%）。
上述具有葛根素磷酸酯化酶活力的微生物菌种，是蜡状芽孢杆菌；具体可以是Bacillus cereus NT-02、Bacillus cereus ATCC14579、Bacillus cereus ATCC10987、Bacillus cereus ATCC10876、Bacillus cereus ATCC 1778、Bacillus cereus ATCC14679、Bacillus cereus ATCC4342、Bacillus cereus ATCC13061、Bacillus cereus ATCC17802、Bacillus cereus ATCC 3018、Bacillus cereus ATCC33019、Bacillus cereus ATCC9139、Bacillus cereus ATCC 55812中的一种或几种。其中Bacillus cereus NT-02是发明人筛选的一株菌株，用于本发明有更好的效果，该菌株已于2010年11月12日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存号CGMCC No. 4326，分类命名为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
上述用于发酵培养的培养液的营养物质没有特别的限制，可以是任何一种适合于微生物生长的营养介质，如牛肉膏蛋白胨培养基，LB培养基，或由含质量比0.1%-10%的一种或几种氮源混合组成的培养液，pH6-10，如以植物蛋白胨、鱼胨、玉米浆等为氮源的培养基。
上述葛根素磷酸酯化微生物发酵培养条件是：30～40℃，10～400rrpm摇瓶振荡通气、或搅拌通气或管道通气供氧，反应时间9～36小时。
上述的发酵液与菌体分离，可采用离心分离方法获得菌体。
上述的葛根素磷酸酯化静息细胞转化反应可在水相、有机相或水相-有机双相中进行。水相转化条件为：底物质量比浓度大于0.01％(质量比)至饱和浓度，在任意一种pH6～10的偏碱性的缓冲溶液中；有机相为乙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺，或其他对细胞毒性较小的有机溶剂；水相-有机相为上述水相与有机相的任意比例混合物。转化温度范围在30～40℃，10～400rpm摇瓶振荡通气、或搅拌通气或管道通气供氧，反应时间9～36小时，转化结束后，将转化液与菌体通过离心或过滤分开，可获得含有葛根素-6″-O-磷酸酯的转化液。
上述含有葛根素-6″-O-磷酸酯溶液加入正丁醇、乙酸乙酯等有机溶剂，振荡、萃取，静置或离心分层后，有机相部分再用水萃取，萃取液经浓缩、硅胶层析分离，可得到含葛根素-6″-O-磷酸酯的溶液，再经浓缩、或低温处理后，可得到葛根素-6″-O-磷酸酯粉末（纯度≥90%）。其在DMSO中的1H-NMR和13C-NMR的化学位移的解析结果如下表1：
表1 葛根素-6″-O-磷酸酯的 13C- NMR和1H-NMR的解析结果
| No. | 13C -NMR | 1H -NMR | JH-H |
| 2 | 153.0 | 8.3 | S |
| 3 | 123.4 | — | |
| 4 | 175.4 | — | |
| 5 | 126.6 | 7.9 | d,J=8.8Hz |
| 6 | 115.2 | 7.0 | d,J=8.8Hz |
| 7 | 162.0 | — | |
| 8 | 112.9 | — | |
| 9 | 156.7 | — | |
| 10 | 117.1 | — | |
| 1′ | 123.0 | — | |
| 2′,6′ | 130.4 | 7.36 | d,J=8.1Hz |
| 3′,5′ | 115.4 | 6.78 | d,J=8.2Hz |
| 4′ | 157.6 | — | |
| 1″ | 74.1 | 4.81 | d,J=9.6Hz |
| 2″ | 71.1 | 3.2-4.78 | |
| 3″ | 78.8 | 3.2-4.78 | |
| 4″ | 70.4 | 3.2-4.78 | |
| 5″ | 81.1 | 3.2-4.78 | |
| 6″ | 64.9 | 3.2-4.78 |
MS分析葛根素-6″-O-磷酸酯的分子量为495.1。
本发明用微生物转化方法获得的葛根素-6″-O-磷酸酯，其抗氧化活性比葛根素强30倍，且水溶性是底物的18倍以上，其他的药理活性都有不同程度的改善。
附图说明
图1 是Puerarin转化为puerarin-6″-O-phosphate的代谢途径。
具体实施方式
实施例1.将100ml 牛肉膏蛋白胨培养基放入500ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌后，接入Bacillus cereus CGMCC4326菌种，35℃，200rpm振荡发酵培养18小时后，停止发酵，离心分离菌体和发酵液，取62.5ml菌液的菌体加入到含有0.5％葛根素，25ml磷酸盐缓冲液（pH7.5）的250ml三角瓶中，35℃，200rpm振荡通气进行葛根素-6″-O-磷酸酯化静息细胞转化反应，24小时后，停止转化反应，过滤去除菌体，上清液中含有38%的葛根素-6″-O-磷酸酯。上清液用5ml正丁醇萃取两次后，葛根素-6″- O -磷酸酯 含量可达到80%。浓缩液经硅胶柱层析分离浓缩后，可得到纯度达95%的葛根素-6″-O-磷酸酯粉末。
实施例2. 将7L牛肉膏蛋白胨培养基放入15L全自动发酵罐，121℃高压蒸汽灭菌后，接入Bacillus cereus CGMCC4326菌种，37℃，400rpm通气发酵，12小时后，停止发酵，过滤使菌体和发酵液分离，取62.5ml菌液的菌体加入到含有0.5％葛根素，25ml磷酸盐缓冲液（pH7. 5）的250ml三角瓶中，35℃，200rpm振荡通气进行葛根素磷酸酯化静息细胞转化反应，24小时后，停止转化反应，过滤去除菌体，上清液中含有45%的葛根素-6″-O-磷酸酯。上清液用15ml正丁醇萃取两次后，葛根素-6″-O-磷酸酯含量可达到80%。浓缩色谱分离后，可得到（纯度90%）葛根素-6″-O-磷酸酯粉末。
实施例3.将50ml 牛肉膏蛋白胨培养基放入250ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌后，接入Bacillus cereus ATCC14579菌种，37℃，150rpm振荡发酵培养，96小时后，停止发酵，过滤使菌体和发酵液分离，取62.5ml菌液的菌体加入到含有0.5％葛根素，25ml磷酸盐缓冲液（pH7.5）的250ml三角瓶中，37℃，150rpm振荡通气进行葛根素磷酸酯化静息细胞转化反应，12小时后，停止转化反应，过滤去除菌体，上清液中含32%的葛根素-6″-O-磷酸酯。上清液用10ml正丁醇萃取两次后，葛根素-6″-O-磷酸酯纯度可达到80%。浓缩色谱分离后，可得到（纯度90%）葛根素-6″-O-磷酸酯粉末。
实施例4.将100ml 含（1%）葡萄糖，（2%）植物蛋白胨培养基放入500ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌后，接入Bacillus cereus ATCC10987菌种，35℃，250rpm振荡发酵培养，36小时后，停止发酵，过滤使菌体和发酵液分离，取62.5ml菌液的菌体加入到含有0.5％葛根素，25ml磷酸盐缓冲液（pH7.0）的250ml三角瓶中，38℃，250rpm振荡通气进行葛根素-6″-O-磷酸酯化静息细胞转化反应。48小时后，停止转化反应，过滤去除菌体，上清液直接浓缩、干燥后，可得到葛根素-6″-O-磷酸酯粉末（纯度为50%）。
实施例5.将100ml 含（1%）葡萄糖，（3%）鱼胨培养基放入500ml三角瓶共15瓶， 121℃高压蒸汽灭菌后，接入Bacillus cereus ATCC10876菌株的孢子，35℃，220rpm通气发酵，16小时后，停止发酵，过滤使菌体和发酵液分离，取1500ml菌液的菌体加入到475ml磷酸盐缓冲液（pH7. 5），再加入25ml含40g/L葛根素的二甲基亚砜溶液(混合相中含葛根素2g/L)分装入5个500ml三角瓶中。上述混合相于35℃，200rpm振荡通气进行葛根素-6″-O-磷酸酯静息细胞转化反应，36小时后，停止转化反应，过滤去除菌体，上清液用250ml正丁醇萃取两次后，经HPLC制备色谱分离，浓缩结晶后，可得到0.6g纯度为98%的葛根素-6″-O -磷酸酯粉末。
实施例6：与实施例1基本相同，但菌种采用Bacillus cereus ATCC 1778。
实施例7：与实施例1基本相同，但菌种采用Bacillus cereus ATCC14679。
实施例8：与实施例1基本相同，但菌种采用Bacillus cereus ATCC4342。
实施例9：与实施例1基本相同，但菌种采用Bacillus cereus ATCC13061。
实施例10：与实施例1基本相同，但菌种采用Bacillus cereus ATCC17802。
实施例11：与实施例1基本相同，但菌种采用Bacillus cereus ATCC 3018。
实施例12：与实施例1基本相同，但菌种采用Bacillus cereus ATCC33019。
实施例13：与实施例1基本相同，但菌种采用Bacillus cereus ATCC9139。
实施例14：与实施例1基本相同，但菌种采用Bacillus cereus ATCC 55812。
本发明不限于这些公开的实施方案，本发明将覆盖在专利书中所描述的范围，以及权利要求范围的各种变型和等效变化。
Claims (6)
1. 一种葛根素磷酯化的微生物转化方法，所述的方法是：
将具有葛根素磷酯化酶活力的微生物接种到培养液中，30～40℃，10～400rrpm摇瓶振荡或通气、或搅拌通气或管道通气供氧，发酵9～36小时；发酵结束后，将发酵液与菌体分离，所获菌体作为静息细胞，加入到含有葛根素的转化液中，使葛根素转化为磷酯化葛根素;其中所说的具有葛根素磷酯化活力的微生物菌种是蜡状芽孢杆菌；
转化结束后，去除菌体，上清液经浓缩、低温干燥处理后，可得葛根素-6″-O-磷酸酯固体；或者将转化液离心所得的上清液用有机溶剂萃取处理，有机溶剂萃取液再用水反萃取后，经浓缩、硅胶层析分离，得到含葛根素-6″-O-磷酸酯的溶液，再将含葛根素-6″-O-磷酸酯的溶液经浓缩、或低温处理后，得到葛根素-6″-O-磷酸酯粉末或晶体。
2.根据权利要求1所述的葛根素磷酸酯化的微生物转化方法，其特征在于，所述的蜡状芽孢杆菌是Bacillus cereus CGMCC4326、Bacillus cereus ATCC14579、Bacillus cereus ATCC10987、Bacillus cereus ATCC10876、Bacillus cereus ATCC 1778、Bacillus cereus ATCC14679、Bacillus cereus ATCC4342、Bacillus cereus ATCC13061、Bacillus cereus ATCC17802、Bacillus cereus ATCC 3018、Bacillus cereus ATCC33019、Bacillus cereus ATCC9139、Bacillus cereus ATCC55812中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的葛根素磷酸酯化的微生物转化方法，其特征在于所述的用于菌体发酵培养的培养液，是牛肉膏蛋白胨培养液或LB培养基或由含0.1%-10%(质量比)的一种或几种氮源混合组成的培养液，pH6-10。
4.根据权利要求1或2所述的葛根素磷酸酯化的微生物转化方法，其特征在于发酵培养液与菌体分离，采用离心分离方法。
5.根据权利要求4所述的葛根素磷酸酯化的微生物转化方法，其特征在于所述发酵培养后获得的菌体，作为静息细胞用于葛根素磷酸酯化，转化反应在水相、有机相或水相-有机双相中进行：
水相转化条件为：底物浓度大于0.01％(质量比)至饱和浓度，在任意一种pH6～10的偏碱性的缓冲溶液中；
有机相为乙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺，或其他对细胞毒性较小的有机溶剂；
水相-有机相为上述水相与有机相的任意比例混合物；
转化温度范围在30～40℃，10～400rpm摇瓶振荡通气、或搅拌通气或管道通气供氧，反应时间9～36小时，转化结束后，将转化液与菌体离心分开，获得含有葛根素磷酸酯化的转化液。
6.根据权利要求5所述的葛根素磷酸酯化的微生物转化方法，其特征在于所述的萃取转化液的有机溶剂为正丁醇或乙酸乙酯。
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| 《食品科学》 20081231 李军红灯 磷脂酶产生菌株的筛选及其性质研究 全文 1-6 第29卷, 第11期 2 * |
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