CN105602994B - 一种海洋真菌哈茨木霉dlen2008005的发酵提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种海洋真菌哈茨木霉dlen2008005的发酵提取物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株海洋真菌哈茨木霉（Trichoderma harzianum）DLEN2008005及其应用。所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005于2016年1月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.12105；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。同时，本发明对海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的静置发酵液进行了活性物质的提取纯化，该菌株及其培养物，以及发酵液提取物具有很好的抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶的活性，在制备抗老年痴呆药物方面，以及在制备抗氧化药物和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面具有很好的应用前景。

Description

一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物及其制备方法和应用。
背景技术
随着世界人口老龄化的加剧和老年痴呆（Alzheimer’s Disease, AD）发病率的不断增加，寻找抗老年痴呆的新药已迫在眉睫。
目前，被广泛接受的老年痴呆病理理论是胆碱能神经损伤假说。在该理论的指导下，乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）抑制剂是目前应用最广的抗老年痴呆症药物。同时不少研究发现，需氧细胞代谢过程中产生的超氧自由基会对脑组织造成损害，促进脑细胞的衰老和死亡，而且自由基还能损害细胞染色体，使第21号染色体畸变，从而发生AD。而抗氧化剂不仅能够稳定细胞膜，消除活性氧，同时还能抑制和清除脑内β淀粉样蛋白沉积，从而来预防和保护神经细胞免受损伤，从而延缓 AD的发展进程。
因为乙酰胆碱酯酶抑制剂和抗氧化剂均有治疗或延缓AD的作用，因此筛选具有抑制 AChE 活性和抗氧化双重功能的药物具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有老年痴呆治疗药物的不足，提供一种海洋真菌哈茨木霉（Trichoderma harzianum）DLEN2008005的发酵液活性提取物及其制备方法和应用，该菌株发酵液的活性提取物具有很好的抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶活性，在制备抗老年痴呆药物方面具有很好的应用前景。
本发明的目的是提供一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物。
本发明另一目的是提供上述发酵提取物及其制备方法和应用。
本发明的再一目的是提供海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵活性物质及其提取纯化方法和应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物，是由海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵液经过提取得到，所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005于2016年1月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（其简称为CGMCC），保藏编号为：CGMCC No.12105；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
该菌株通过静置发酵后，将其发酵液的乙酸乙酯提取物与菌丝体甲醇提取物合并得到具有抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶活性的总粗提物，该提取物经硅胶柱层析及制备液相色谱分离，得到两个有效部分的组分1和组分2，具有抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶的显著活性，有作为抗老年痴呆药物的潜在用途。
所述海洋真菌哈茨木霉（Trichoderma harzianum）DLEN2008005是从中国大连海域的潮间带海藻龙须菜藻体组织内分离获得，具有抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶作用，依据《真菌鉴定手册》（魏景超，1979）鉴定为Trichoderma harzianum菌株。
该菌株的ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
该菌株具有下述性质：接种到海水马铃薯蔗糖培养基（海水PSA）平板上，28 ℃培养，菌落开始为白絮状，圆形，向四周扩展，后从菌落中央向边缘产生灰绿色孢子，菌落边缘颜色略浅，整个菌落呈松散絮状；显微镜下菌丝纤细无色，具分隔，多分枝；分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，对生或互生，一般有2～3次分枝，着生分生孢子的小梗瓶形或锥形；分生孢子多为球形，孢壁具小疣突，蓝绿色；最佳生长温度范围26～30℃，最佳生长pH为6.0～7.0，可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖等碳源；该菌株在海水马铃薯蔗糖液体培养基中静置发酵可产生抗氧化和乙酰胆碱酯酶抑制剂活性物质。
该菌株的生长盐浓度范围为2.0%～5.0%。
另外，在上述制备发酵提取物的工艺中，具体地，所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵液的获得方法如下：将海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005接种于灭菌的液体培养基中，自然光照28℃培养21～24天；
其中，所述液体培养基的制备方法为：每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖和20.0g海盐，自然pH值；所述马铃薯煮汁为：取新鲜马铃薯去皮切成1cm3大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500mL煮沸20min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。
更具体优选地，上述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵液的获得方法如下：
（1）种子培养：将菌种从斜面上接种到无菌的种子固体培养基平板上，将培养皿平板置于恒温培养箱中28℃下倒置培养，培养时间为4～5天；
（2）扩大培养：将1L液体培养基灌装到3L三角瓶中，用透气封口膜封口后于高压灭菌锅中121℃、0.1 Mpa灭菌20min；冷却后按照每1000mL液体培养基接种上述步骤（1）培养后的种子平板带菌培养基块40～80cm2的比例接种，封口，置于恒温培养箱中培养，自然光照，培养时间为21～24天，得到发酵液；
其中，所用到的培养基如下：
种子固体培养基为：每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖、20.0g海盐和15.0g琼脂，自然pH值；
液体培养基为：每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖和20.0g海盐，自然pH值；
其中，马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm3大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500 mL煮沸20 min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。
另外，在上述制备发酵提取物的工艺中，所述提取的方法如下：
（1）提取：培养结束后得到的发酵液，用500mL乙酸乙酯过夜杀菌，然后超声处理30min，加入硅藻土抽滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯提取物；滤饼用200mL甲醇浸泡12～24h后，超声30min，抽滤，得到甲醇提取物；如此重复2次；
将乙酸乙酯提取物和甲醇提取物分别用旋转蒸发仪于45℃减压浓缩，最后合并提取物并离心后，继续用旋转蒸发仪于45℃减压蒸干，得到一份干固体，为总活性粗提物，即得到所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物。
上述发酵提取物在制备抗老年痴呆药物方面的应用，以及在制备抗氧化药物和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面的应用，都在本发明的保护范围之内。
一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵活性物质（组分1），是由上述发酵提取物再经过提纯所得，所述提纯的方法为：将发酵提取物溶于少量（优选5～20mL）甲醇，加入到与其干重相等的100～200目硅胶，混合并研磨均匀至干燥，上样于20～50倍样品干重的200～300目硅胶层析柱上，用洗脱剂逐步梯度洗脱，所用洗脱剂为氯仿：丙酮=25：1～0：1（v/v），采用薄层色谱生物活性自显影法追踪活性组分；将有活性组分的组份样品采用反相液相色谱的方法进行进一步纯化得到；反相液相色谱的条件为：色谱柱SinoChrom ODS-AP，粒径15µm，尺寸为20.0 mm×250 mm，流动相为甲醇：水=8：2，流速为2 mL/min，峰的保留时间在4～9 min。
一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵活性物质（组分2），是由上述发酵提取物再经过提纯所得，所述提纯的方法为：将发酵提取物溶于少量（优选5～20mL）甲醇，加入到与其干重相等的100～200目硅胶，混合并研磨均匀至干燥，上样于20～50倍样品干重的200～300目硅胶层析柱上，用洗脱剂逐步梯度洗脱，所用洗脱剂为氯仿：丙酮=25：1～0：1（v/v），采用薄层色谱生物活性自显影法追踪活性组分；将有活性组分的组份样品采用正相液相色谱的方法进行进一步纯化得到；正相液相色谱的条件为：SepaFlash®标准型快速分离硅胶柱-12 g，粒径40～63 µm，尺寸为17 mm×85 mm，氯仿：甲醇=5:1，流速为4 mL/min，峰的保留时间在10～15 min。
而且，上述发酵活性物质（组分1和组分2）在制备抗老年痴呆药物方面的应用，以及在制备抗氧化药物和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面的应用，也都在本发明的保护范围之内。
本发明经过大量的研究和探索，筛选分离到海洋真菌菌株哈茨木霉（Trichoderma harzianum）DLEN2008005，该菌株可以利用常规的静置方法培养，培养基中可含有用于微生物培养的碳源、氮源及其它营养源，对光照无严格限制，以适宜于该菌株生长为准。
以制备抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶活性产物为目的时，发酵培养应选择使培养物的活性提取物的收率最高的条件为好。由以上所得的培养物出发，通过一些适当的方法就能提取其中的活性组分，这些方法是常用于提取代谢物的方法，例如可利用活性提取物与其它杂质在溶解度、离子结合力、吸附亲和力及分子量等方面的差别进行提取，这些方法可以单独使用，也可以适当配合或反复使用。
其中，以如下培养基、培养方法和提取方法来培养海洋真菌菌株哈茨木霉DLEN2008005产生活性产物最佳：
（1）培养基：
种子固体培养基为：蔗糖20.0g，马铃薯煮汁500mL，海盐20.0g，琼脂15.0g，自然pH值。
液体培养基为：蔗糖20.0g，马铃薯煮汁500mL，海盐20.0g，自然pH值。
其中，马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm3大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500mL煮沸20min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。
（2）培养和提取方法：
A．种子培养：将菌种从斜面上接种到无菌的种子固体培养基平板上，将培养皿平板置于恒温培养箱中28℃下倒置培养，培养时间为4～5天；
B．扩大培养：将1L液体培养基灌装到3L三角瓶中，用透气封口膜封口后于高压灭菌锅中121℃、0.1 Mpa灭菌20min；冷却后按照每1000mL液体培养基接种上述步骤A培养后的种子平板带菌培养基块40～80cm2的比例接种，封口，置于恒温培养箱中培养，自然光照，培养时间为20～25天，得到发酵液；
C．提取：培养结束后得到的发酵液，用500mL乙酸乙酯过夜杀菌，然后超声处理30min，加入硅藻土抽滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯提取物；滤饼用200mL甲醇浸泡12～24h后，超声30min，抽滤，得到甲醇提取物；如此重复2次；
将乙酸乙酯提取物和甲醇提取物分别用旋转蒸发仪于45℃减压浓缩，最后合并提取物并离心后，继续用旋转蒸发仪于45℃减压蒸干，得到一份干固体，为总活性粗提物；
D．提纯：将上述总活性粗提物溶于5～20mL甲醇，加入到与其干重相等的100～200目硅胶，混合并研磨均匀至干燥，上样于20～50倍样品干重的200～300目硅胶层析柱上，用洗脱剂逐步梯度洗脱，所用洗脱剂为氯仿：丙酮=25：1～0：1（v/v），采用薄层色谱生物活性自显影法追踪活性组分。将有活性组分的组份样品采用液相制备的方法进行进一步纯化，得到白色粉末组分1和2。
其中，液相制备使用正相柱与反相柱，检测254nm下紫外吸收，正相柱使用的流动相为氯仿-甲醇，反相柱使用的流动相为甲醇-水。组分1通过反相液相色谱制备得到（条件：色谱柱SinoChrom ODS-AP，粒径15µm，尺寸为20.0mm×250mm，流动相为甲醇：水=8：2，流速为2mL/min），峰的保留时间在4～9min；组分2通过正相液相色谱制备得到（条件：SepaFlash®标准型快速分离硅胶柱-12g，粒径40～63µm，尺寸为17mm×85mm，氯仿：甲醇=5：1，流速为4 mL/min），峰的保留时间在10～15min。
另外，薄层分析显示：层析展开剂为二氯甲烷：甲醇=5：1时，组分1在GF254薄层硅胶板上Rf值为0.85，254nm紫外灯下具蓝紫色吸收，茴香醛硫酸显色为棕红色；组分2在GF254薄层硅胶板上Rf值为0.42，254 nm紫外灯下吸收较弱，茴香醛硫酸显色为浅灰色。
还对这两个组分进行了HPLC分析，液相型号为Agilent 1260，色谱分析条件如下：色谱柱为Luna 5u C18(2) 100A，尺寸为150 mm×4.6 mm，粒径5 µm，系统为甲醇-水，0～15min 15～100%甲醇线性洗脱，15.01～30min 100%甲醇等度洗脱，流速1 ml/min。结果表明：组分1含有的抗氧化与抑制乙酰胆碱酯酶活性特征成分的主要色谱峰保留时间为19.7～21.4 min；组分2具有抑制乙酰胆碱酯酶活性特征成分的主要色谱峰保留时间11.9～12.6 min。
本发明通过薄层色谱生物活性自显影显示组分1具有抗氧化与抑制乙酰胆碱酯酶双重活性，组分2具有抑制乙酰胆碱酯酶活性。通过酶标比色法测定这两个组分的活性，组分1同时具有抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶的活性，其清除DPPH自由基的EC50和抑制乙酰胆碱酯酶的IC50分别为1.76mg/mL、2.43mg/mL，组分2具有抑制乙酰胆碱酯酶活性，其IC50值为1.87mg/mL。
本发明的海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005发酵液及其活性提取物，以及其中的有效组分，可以用于制备抗老年痴呆的药物。
本发明具有以下有益效果：
本发明筛选分离得到一株海洋真菌哈茨木霉（Trichoderma harzianum）DLEN2008005，已于2016年1月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.12105；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株及其培养物具有抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶的活性，在制备抗老年痴呆药物方面，以及在制备抗氧化药物和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面具有很好的应用前景。
同时，本发明还对海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵液进行了活性物质的提取纯化，得到的总提取物具有很好的抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶的活性，在制备抗老年痴呆药物方面，以及在制备抗氧化药物和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面具有很好的应用前景。
进一步地，本发明获得了海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵液提取物的组分1和组分2，具有显著的抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶的活性，在制备抗老年痴呆药物方面，以及在制备抗氧化药物和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面具有很好的应用前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的分离与鉴定
1、分离方法
（1）样品：中国大连海域的潮间带海藻龙须菜藻体。
（2）分离方法
将上述新鲜海藻样品用121℃下20 min高压灭菌后的海水冲洗两遍，转移进200mL三角烧瓶中加入用121℃下20 min高压灭菌后的玻璃珠及无菌海水50 mL，在60 rpm转速下振荡10 min，弃去上清液，再用无菌海水藻体冲洗2遍。
将经过上述处理的海藻用50mL 70%乙醇的水溶液浸泡10秒后取出，用50 mL无菌海水冲洗去表面残余乙醇，用无菌吸水纸吸干残余海水，用火焰灼烧灭菌后的刀片将海藻斜切为小段，并移植到平板固体培养基上28℃下培养3天。
再将初始呈白絮状扩展生长而后显灰绿色的菌落用无菌刀片切取菌丝尖端，转移到新的平板固体培养基上，继续在28℃下培养3天，如此重复三次，得到纯菌株。
另外，分离过程中所使用的平板固体培养基为海水马铃薯蔗糖培养基（海水PSA），其成分为：每升中含500 mL马铃薯煮汁，20g蔗糖，0.2g氯霉素，20g粗海盐，121℃下20 min高压灭菌后可用。
其中，马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm3大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500 mL煮沸20 min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。
2、鉴定方法：
（1）形态学鉴定：将得到的纯菌株接种到海水PSA平板上，28℃培养，观察菌落形体特征，包括菌落中心及边缘部分的质地与颜色；并在菌落边缘斜插入无菌盖玻片，待菌丝生长延伸到盖玻片上时，用镊子取出带菌丝的盖玻片贴到载玻片上，于光学显微镜下观察菌丝、分生孢子梗、分生孢子的形态特征。参照魏景超编著的《真菌鉴定手册》对其进行形态学鉴定。
（2）鉴定到一株属于木霉属的菌株，进一步对其进行分子生物学鉴定：
将菌株接种到海水PSA平板上28℃下培养7天后，用无菌刀片刮下菌丝，转移进无菌的研钵中，加入液氮研磨，然后使用北京Tiangen生物技术公司的植物基因组提取试剂盒DP305根据说明书步骤提取DNA，所得DNA样本溶解于50μL TE缓冲液中。
以该DNA样本为模板，使用真菌通用引物ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) 和ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)通过PCR反应扩增其核糖体基因内转录间隔区序列ITS1-5.8S-ITS2，PCR反应条件为：1）起始94℃变性5 min；2）94℃变性0.5 min；3）55℃退火0.5 min；4）72℃延伸1 min；5）最终72℃延伸5 min。其中，步骤2）至步骤4）循环30次。
PCR反应产物使用琼脂糖电泳纯化，纯化产物用基因测序仪直接测序，测序结果与Genbank数据库中的序列进行BLAST比对，根据序列相似性，将该菌株鉴定为哈茨木霉。
3、经过上述分离鉴定，结果显示，筛选得到一株海洋真菌哈茨木霉，具有很好的抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶活性。
该菌株接种到海水马铃薯蔗糖培养基（海水PSA）平板上，28℃培养，菌落开始为白絮状，圆形，向四周扩展，后从菌落中央向边缘产生灰绿色孢子，菌落边缘颜色略浅，整个菌落呈松散絮状。
显微镜下，菌丝纤细无色，具分隔，多分枝。分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，对生或互生，一般有2～3次分枝，着生分生孢子的小梗瓶形或锥形。分生孢子多为球形，孢壁具小疣突，蓝绿色。最佳生长温度范围26～30℃，最佳生长pH为6.0～7.0，可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖等碳源。
该菌株在海水马铃薯蔗糖液体培养基中静置发酵可产生抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶活性的物质。
将该菌株命名为海洋真菌哈茨木霉（Trichoderma harzianum）DLEN2008005，并已于2016年1月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（其简称为CGMCC），保藏编号为：CGMCC No.12105；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
实施例2 海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005发酵液活性测试
1、哈茨木霉DLEN2008005发酵液获得
（1）种子培养：将菌种从斜面上接种到无菌的种子固体培养基平板上，将培养皿平板置于恒温培养箱中28℃下倒置培养，培养时间为4～5天；
（2）扩大培养：将1L液体培养基灌装到3L三角瓶中，用透气封口膜封口后于高压灭菌锅中121℃、0.1 Mpa灭菌20min；冷却后按照每1000mL液体培养基接种上述步骤（1）培养后的种子平板带菌培养基块40～80cm2的比例接种，封口，置于恒温培养箱中培养，自然光照，培养时间为21～24天，得到发酵液。
其中，所用到的培养基：
种子固体培养基为：蔗糖20.0g，马铃薯煮汁500mL，海盐20.0g，琼脂15.0g，自然pH值。
液体培养基为：蔗糖20.0g，马铃薯煮汁500mL，海盐20.0g，自然pH值。
其中，马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm3大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500 mL煮沸20 min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。
2、经过测试，海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵液具有抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶活性。
实施例3 海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005发酵液活性物质的提取
1、培养基
（1）种子固体培养基为：蔗糖20.0g，马铃薯煮汁500mL，海盐20.0g，琼脂15.0g，自然pH值。
（2）液体培养基为：蔗糖20.0g，马铃薯煮汁500mL，海盐20.0g，自然pH值。
其中，马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm3大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500 mL煮沸20 min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。
2、提取方法
（1）种子培养：将菌种从斜面上接种到无菌的种子固体培养基平板上，将培养皿平板置于恒温培养箱中28℃下倒置培养，培养时间为4～5天；
（2）扩大培养：将1L液体培养基灌装到3L三角瓶中，用透气封口膜封口后于高压灭菌锅中121℃、0.1 Mpa灭菌20min；冷却后按照每1000mL液体培养基接种上述步骤（1）培养后的种子平板带菌培养基块40～80cm2的比例接种，封口，置于恒温培养箱中培养，自然光照，培养时间为20～25天，得到发酵液；
（3）提取：步骤（2）得到的发酵液用500mL乙酸乙酯过夜杀菌，然后超声处理30min，加入硅藻土抽滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯提取物；滤饼用200mL甲醇浸泡12‐24 h后，超声30min，抽滤，得到甲醇提取物；如此重复2次；
将乙酸乙酯提取物和甲醇提取物分别用旋转蒸发仪于45℃减压浓缩，最后合并提取物并离心后，继续用旋转蒸发仪于45℃减压蒸干，得到一份干固体，为总活性粗提物；
（4）提纯：将上述总活性粗提物溶于5～20mL甲醇，加入到与其干重相等的100～200目硅胶，混合并研磨均匀至干燥，上样于20～50倍样品干重的200～300目硅胶层析柱上，用洗脱剂逐步梯度洗脱，所用洗脱剂为氯仿：丙酮=25：1～0：1（v/v），采用薄层色谱生物活性自显影法追踪活性组分；将有活性组分的组份样品采用液相制备的方法进行进一步纯化，得到白色粉末组分1和2。
其中，液相制备使用正相柱与反相柱，检测254 nm下紫外吸收，正相柱使用流动相为氯仿-甲醇，反相柱使用流动相为甲醇-水。
组分1通过反相液相色谱制备得到（条件：色谱柱SinoChrom ODS-AP，粒径15µm，尺寸为20.0 mm×250 mm，流动相为甲醇：水=8:2，流速为2 mL/min），峰的保留时间在4～9min。
组分2通过正相液相色谱制备得到（条件：SepaFlash®标准型快速分离硅胶柱-12g，粒径40～63µm，尺寸为17mm×85mm，氯仿：甲醇=5：1，流速为4 mL/min），峰的保留时间在10～15min。
3、薄层分析显示：层析展开剂为二氯甲烷：甲醇=5：1时，组分1在GF254薄层硅胶板上Rf值为0.85，254nm紫外灯下具蓝紫色吸收，茴香醛硫酸显色为棕红色；组分2在GF254薄层硅胶板上Rf值为0.42，254 nm紫外灯下吸收较弱，茴香醛硫酸显色为浅灰色。
4、另外，对这两个组分进行了HPLC分析，液相型号为Agilent 1260，色谱分析条件如下：色谱柱为Luna 5u C18(2) 100A，尺寸为150 mm×4.6 mm，粒径5 µm，系统为甲醇-水，0～15min 15～100%甲醇线性洗脱，15.01～30min 100%甲醇等度洗脱，流速1 ml/min。
5、结果表明：组分1含有的抗氧化与抑制乙酰胆碱酯酶活性特征成分的主要色谱峰保留时间为19.7～21.4 min；组分2具有抑制乙酰胆碱酯酶活性特征成分的主要色谱峰保留时间11.9～12.6 min。
实施例4 海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005发酵液活性物质的活性测定
1、薄层色谱生物活性自显影实验：
（1）取两块相同的GF254硅胶板，用干净的甲醇将其预展干净后晾干，分别用毛细管取10µL组分1和组分2各点样于层析板上，用二氯甲烷：甲醇=25：1展开。
抗乙酰胆碱酯酶活性实验是均匀喷上0.5U/mL AChE，晾干，使酶液固定，然后在37℃的恒温培养箱中保湿孵育20min，孵育结束后，将DTNB与ATCh以1：1混合，喷雾到板子上，再37℃孵育10min，观察实验现象。
抗氧化实验是在薄层板上喷1.28mmol/L的DPPH甲醇溶液，暗处放置5～8min后，观察实验现象。
（2）实验结果
薄层色谱生物活性自显影显示组分1具有抗氧化与抑制乙酰胆碱酯酶双重活性，组分2具有抑制乙酰胆碱酯酶活性。
2、酶标比色法实验：
（1）抑制乙酰胆碱酯酶活性实验方法：在96孔板中依次加入200µL、100µL、40µL、20µL、10µL质量浓度为5 mg/mL样品溶液，晾干后依次加入10µL 10%DMSO，40µL 0.1 M的PBS（pH 7.4），10µL终浓度为0.02 U/mL AChE，20µL 5 mM DTNB，37 ℃孵育10 min，加入20µL10 mM ATCh，再37℃孵育10 min后加入30µL 1%SDS，用酶标仪在405 nm处检测OD值，其值为OD样品。同时每个样品都设一对应的样品本底，同上检测，设为 OD样品本底。阴性对照用 10%DMSO代替样品，同上检测，设为 OD阴性；阴性本底为用BSA代替酶液，其他反应条件同 OD阴性，其它同上检测，设为OD阴性本底。所有试验重复2次并计算平均值和标准差，阳性对照为他克林。设AChE 抑制率为 I(%)，如下公式计算[13]：I%=[(OD阴性-OD阴性本底)-(OD样品-OD样品本底)]/(OD阴性-OD阴性本底)×100%。
以抑制率—浓度做图，取对数趋势线，计算IC50。
（2）抗氧化实验方法：在96孔板中依次加入200µL、100µL、50µL、25µL、12.5µL质量浓度为5 mg/mL样品溶液，晾干后加入100µL DMSO，再加入100µL 0.16 mmol/L DPPH甲醇溶液，混匀，对照用甲醇代替DPPH溶液；空白组是在100µL DPPH中加入100µL DMSO混合，对照组用100µL甲醇溶液代替DPPH。室温暗处放置30 min，于540 nm处测定吸光度，分别记为A1、A2、A3、A4。
清除率%=100-(A1-A2)×100/(A3-A4)
式中，A1为实验组的吸光值；A2为实验对照组的吸光值；A3为空白组的吸光值；A4为空白对照组的吸光值。
平行测定2次，计算平均值，并以Vc作阳性对照(即用Vc代替样品液的测量）。
以自由基清除率—浓度做图，取对数趋势线，计算EC50。
（3）实验结果
通过酶标比色法测定这两个组分的活性，组分1同时具有抗氧化和抗乙酰胆碱酯酶的活性，其清除DPPH自由基的EC50和抗乙酰胆碱酯酶的IC50分别为1.76 mg/mL、2.43 mg/mL；组分2具有抗乙酰胆碱酯酶活性，其IC50值为1.87 mg/mL。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东海洋大学
<120> 一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物及其制备方法和应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 612
<212> DNA
<213> 哈茨木霉DLEN2008005的ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列
<400> 1
ttttgatatg cttaagttca gcgggtattc ctacctgatc cgaggtcaac atttcagaag 60
ttgggtgttt aacggctgtg gacgcgccgc gctcccgatg cgagtgtgca aactactgcg 120
caggagaggc tgcggcgaga ccgccactgt atttcggaga cggccaccgc caaggcaggg 180
ccgatcccca acgccgaccc cccggagggg ttcgagggtt gaaatgacgc tcggacaggc 240
atgcccgcca gaatactggc gggcgcaatg tgcgttcaaa gattcgatga ttcactgaat 300
tctgcaattc acattactta tcgcatttcg ctgcgttctt catcgatgcc agaaccaaga 360
gatccgttgt tgaaagtttt gattcatttt cgaaacgcct acgagaggcg ccgagaaggc 420
tcagattata aaaaaaaccc gcgagggggt atacaataag agttttggtt ggtcctccgg 480
cgggcgcctt ggtccggggc tgcgacgcac ccggggcaga gatcccgccg aggcaacagt 540
ttggtaacgt tcacattggg tttgggagtt gtaaactcgg taatgatccc tccgcaggtc 600
acccctacag aa 612

Claims (10)

1.一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物，其特征在于，是由海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵液经过提取得到，所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005于2016年1月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.12105；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；所述发酵提取物具有抗老年痴呆、抗氧化和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性；所述发酵提取物提取的方法如下：
（1）提取：培养结束后得到的发酵液，用500mL乙酸乙酯过夜杀菌，然后超声处理30min，加入硅藻土抽滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯提取物；滤饼用200mL甲醇浸泡12～24h后，超声30min，抽滤，得到甲醇提取物；如此重复2次；
（2）将乙酸乙酯提取物和甲醇提取物分别用旋转蒸发仪于45℃减压浓缩，最后合并提取物并离心后，继续用旋转蒸发仪于45℃减压蒸干，得到一份干固体，为总活性粗提物，即得到所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物。
2.根据权利要求1所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物，其特征在于，所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵液的获得方法如下：将海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005接种于灭菌的液体培养基中，自然光照28℃培养21～24天；其中，所述液体培养基的制备方法为：每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖和20.0g海盐，自然pH值；所述马铃薯煮汁为：取新鲜马铃薯去皮切成1cm3大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500mL煮沸20min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。
3.根据权利要求2所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物，其特征在于，所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵液的获得方法如下：
（1）种子培养：将菌种从斜面上接种到无菌的种子固体培养基平板上，将培养皿平板置于恒温培养箱中28℃下倒置培养，培养时间为4～5天；
（2）扩大培养：将1L液体培养基灌装到3L三角瓶中，用透气封口膜封口后于高压灭菌锅中121℃、0.1 Mpa灭菌20min；冷却后按照每1000mL液体培养基接种上述步骤（1）培养后的种子平板带菌培养基块40～80cm2的比例接种，封口，置于恒温培养箱中培养，自然光照，培养时间为21～24天，得到发酵液；
其中，所用到的培养基如下：
种子固体培养基为：每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖、20.0g海盐和15.0g琼脂，自然pH值；
液体培养基为：每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖和20.0g海盐，自然pH值；
其中，马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm3大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500mL煮沸20 min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。
4.权利要求1～3任一所述发酵提取物在制备抗老年痴呆药物方面的应用。
5.权利要求1～3任一所述发酵提取物在制备抗氧化药物和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面的应用。
6.一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵活性物质，其特征在于，是由权利要求1～3任一所述发酵提取物再经过提纯所得，所述提纯的方法为：将发酵提取物溶于5～20mL甲醇，加入到与其干重相等的100～200目硅胶，混合并研磨均匀至干燥，上样于20～50倍样品干重的200～300目硅胶层析柱上，用洗脱剂逐步梯度洗脱，所用洗脱剂为氯仿：丙酮=25：1～0：1（v/v），采用薄层色谱生物活性自显影法追踪活性组分；
将有活性组分的组份样品采用反相液相色谱的方法进行进一步纯化得到；反相液相色谱的条件为：色谱柱SinoChrom ODS-AP，粒径15µm，尺寸为20.0 mm×250 mm，流动相为甲醇：水=8：2，流速为2 mL/min，峰的保留时间在4～9 min；所述发酵活性物质具有抗老年痴呆、抗氧化和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性。
7.一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵活性物质，其特征在于，是由权利要求1～3任一所述发酵提取物再经过提纯所得，所述提纯的方法为：将发酵提取物溶于5～20mL甲醇，加入到与其干重相等的100～200目硅胶，混合并研磨均匀至干燥，上样于20～50倍样品干重的200～300目硅胶层析柱上，用洗脱剂逐步梯度洗脱，所用洗脱剂为氯仿：丙酮=25：1～0：1（v/v），采用薄层色谱生物活性自显影法追踪活性组分；
将有活性组分的组份样品采用正相液相色谱的方法进行进一步纯化得到；正相液相色谱的条件为：SepaFlash®标准型快速分离硅胶柱-12 g，粒径40～63 µm，尺寸为17 mm×85mm，氯仿：甲醇=5:1，流速为4 mL/min，峰的保留时间在10～15 min；所述发酵活性物质具有抗老年痴呆和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性。
8.权利要求6或7所述发酵活性物质在制备抗老年痴呆药物方面的应用。
9.权利要求6所述发酵活性物质在制备抗氧化药物和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面的应用。
10.权利要求7所述发酵活性物质在制备抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面的应用。
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