DE60017237T2

DE60017237T2 - Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Polyestern

Info

Publication number: DE60017237T2
Application number: DE60017237T
Authority: DE
Inventors: Takeshi Ohta-ku Imamura; Tetsuya Ohta-ku Yano; Shin Ohta-ku Kobayashi; Sakae Ohta-ku Suda; Tsutomu Ohta-ku Honma
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1999-12-27
Filing date: 2000-12-27
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2020-12-28
Also published as: DE60017237D1; EP1113076A3; US6492147B2; EP1113076A2; US20010031488A1; JP2001178487A; EP1113076B1

Description

ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polyesters unter Verwendung eines Mikroorganismus.
Einschlägiger Stand der Technik
Mikrobielle Polyester, zum Beispiel Poly-3-hydroxybutyrat (PHB), zeigen das bemerkenswerte Merkmal, daß sie biologisch abbaubar sind, womit sie sich von aus Erdöl hergestellten synthetischen Polymeren unterscheiden.
Synthetische Polymere werden schon lange als Kunststoffe usw. verwendet. Bei der Entsorgung bewirkt jedoch die Eigenschaft, daß sie sich schwer zersetzen, eine Anreicherung in Abfallentsorgungseinrichtungen, oder es entstehen, falls sie verbrannt werden, schädliche Substanzen, wie Dioxin und Endocrin-Zerstörer, wodurch es zu einer Umweltverschmutzung kommt.
Andererseits lassen sich jedoch von Mikroorganismen produzierte Polyester (hier nachstehend als „mikrobielle Polyester" bezeichnet) biologisch abbauen, um sie in ein natürliches Kreislaufsystem einzubringen, womit sie als die Umwelt erhaltende Kunststoffe verwendet werden können. Sie bieten auch die Möglichkeit weicher Materialien für medizinische Anwendungen (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 5-159).
Bisher wurde von verschiedenen Bakterien berichtet, daß sie PHB oder Copolymere von anderen Hydroxyalkansäuren in den Zellen produzieren und speichern (Handbook of Biodegradable Plastics, herausgegeben von Biodegradable Plastics Society, veröffentlicht von N.T.S., S. 178–197 (1995)).
Kürzlich wurden für die industrielle Verwendung solcher Polyhydroxyalkansäuren (PHA) verschiedene Versuche unternommen, damit die Mikroorganismen modifizierte PHA produzieren, die für weitreichende physikalisch-chemische Eigenschaften unübliche Monomereinheiten aufweisen.
Einer dieser Versuche, offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 5-30980, offenbart, daß Pseudomonas fluorescence FA-031 (FERM P-3433) Copolymere von Polyhydroxyfettsäureestern produzieren kann, die aus Monomereinheiten mit C₄ bis C₁₆ bestehen, wenn die Zellen im Stickstoff-Hungerzustand unter Verwendung von Oleinsäure, Triolein (Olivenöl) oder Triglycerid als Kohlenstoffquelle gezüchtet werden. In den C₁₄- und C₁₆-Einheiten wurde das Vorhandensein von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen bestätigt.
Außerdem offenbart sie, daß bei Verwendung von Linolsäure als Substrat der erzeugte Polyester C₄- bis C₁₆-Einheiten umfasst, und das Vorhandensein einer Doppelbindung wurde in den C₁₀-, C₁₂-, C₁₄- und C₁₆-Einheiten bestätigt, und wenn α-Linolensäure als Substrat verwendet wird, umfaßt der erzeugte Polyester C₄- bis C₁₆-Einheiten, und das Vorhandensein von Doppelbindungen wurde in den C₈-, C₁₀-, C₁₂-, C₁₄- und C₁₆-Einheiten bestätigt.
Ein Verfahren zur Herstellung von PHA, die 3-Hydroxyoctensäure- und 3-Hydroxyhexensäure-Einheiten enthält, ist in Int. J. Biol. Macromol. Bd. 12, S. 85-91 (1989) offenbart, wobei Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 unter Verwendung von 3-Hydroxy-6-octensäure oder 3-Hydroxy-7-octensäure als Substrat gezüchtet wird.
Ein Verfahren zur Herstellung von PHA, die 3-Hydroxydecensäure- und 3-Hydroxytetradecensäure-Einheiten enthält, ist in Appl. Environ. Microbiol. (1992) Bd. 58(2), S. 536–544 offenbart, wobei Pseudomonas putida KT2442 unter Verwendung von Glucose, Fructose und Glycerol als Substrate gezüchtet wird.
Ein Verfahren zur Herstellung von PHA, die 3-Hydroxyoctensäure- und 3-Hydroxyhexensäure-Einheiten enthält, ist in Polymer, Bd. 35(10) (1994), S. 2090-2097 offenbart, wobei Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 unter Verwendung von n-Octan und 1-Octan als Substrate gezüchtet wird.
Ein Verfahren zur Herstellung von PHA, die 3-Hydroxydecensäure- und 3-Hydroxytetradecensäure-Einheiten enthält, ist in Int. J. Biol. Macromol. 23 (1994), S. 61–72 offenbart, wobei Pseudomonas resinovorans NRRL B-2649 unter Verwendung von Talg als Substrat gezüchtet wird.
Obwohl wie vorstehend beschrieben verschiedene Verfahren untersucht worden sind, um unter Verwendung von Mikroorganismen PHA zu produzieren, die in ihren Seitenketten Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen aufweisen, gelangten die Erfinder zu der Erkenntnis, daß für praktische Zwecke eine größere Vielfalt von Züchtungsbedingungen und Substraten erforderlich ist. Gegenwärtig sind die Untersuchungen zur Verwendung von organischen Substratmaterialien, die von relativ kostengünstigen Mineralmaterialien, wie Erdöl, abgeleitet sind, nicht im mindesten ausreichend.
EP 0 274 151 A2 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Polyester-Biopolymeren durch Züchten der Bakterien Pseudomonas oleovorans auf Substraten, die bestimmte Nährstoffe aufweisen. Die Natur der Polyester kann geändert werden, indem die Natur der verwendeten Kohlenstoffquelle geändert wird. Auf diese Weise können Polyester mit ungesättigten Doppelbindungen erzeugt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines mikrobiellen Polyesters nach Anspruch 1 angegeben. Bevorzugte Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein ¹H-NMR-Diagramm von PHA.
2 ist ein ¹³C-NMR-Diagramm von PHA.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung gibt ein Verfahren zur Herstellung von PHA an, die eine Monomereinheit enthält, die in der Seitenkette eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung aufweist, indem ein Mikroorganismus in einem Medium gezüchtet wird, das als einzige Kohlenstoffquelle 1-Hexen enthält.
Vorzugsweise ist der Mikroorganismus ein Bakterium der Gattung Pseudomonas, stärker bevorzugt Pseudomonoas cichorii YN2 (FERM BP-7375).
Die systematischen Merkmale von Pseudomonas cichorii YN2 sind wie folgt:

Züchtungstemperatur: 30°C
Morphologie: Stäbchen (0,8 × 1,5 bis 2,0 μm)
Gramfärbung: gramnegativ
Sporenbildung: negativ
Motilität: positiv
Morphologie der Kolonien: kreisförmig, vollständig, konvex, glatt, glänzend, durchscheinend
Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: nicht-fermentierend
Salpetersäurereduktion: negativ
Indolproduktion: positiv
Glucoseansäuerung: negativ
Arginin-Dehydrolase: negativ
Urease: negativ
Esculin-Hydrolyse (β-Glucosidase): negativ
Gelatine-Hydrolyse (Protease): negativ
β-Galactosidase: negativ
Assimilation von Verbindungen: Glucose: positiv L-Arabinose: positiv D-Mannose: negativ D-Manitol: negativ N-Acetyl-D-glucosamin: negativ Maltose: negativ Kaliumgluconat: positiv n-Caprinsäure: positiv Adipinsäure: negativ dl-Malonsäure: positiv Natriumcitrat: positiv Phenylacetat: positiv
Erzeugung eines fluoreszierenden Pigmentes auf King's B-Agar: positiv
Züchtung in 4 % NaCl: positiv (schwach)
Ansammlung von Poly-β-hydroxybutyrat: negativ*
Tween 80-Abbau: positiv
(* Durch Färben der Kolonien auf dem Nähragar mit Sudanschwarz).

Anhand der vorstehend aufgeführten Merkmale wurde das Bakterium nach dem Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9. Auflage als ein Stamm von Pseudomonas cichorii bestimmt. Außerdem zeigt das Verhalten dieses Stammes bei der Produktion von PHA, daß er ein neuer Stamm ist, so daß er beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology als FERM BP-7375 hinterlegt worden ist.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Kulturmedium kann irgendein Mineralsalzmedium sein, das Phosphat und eine Stickstoffquelle, wie Ammoniumsalz oder Nitrat, enthält. Durch eine Regelung der Stickstoffkonzentration kann die PHA-Produktivität verbessert werden. Das dem Kulturmedium zuzusetzende 1-Hexen ist flüchtig und schlecht wasserlöslich, so daß das Züchtungsgefäß fest verschlossen werden muß, nachdem der erforderliche Sauerstoff gesichert ist.
Nachstehend ist ein Beispiel der Zusammensetzung eines Mineralsalzmediums aufgeführt. Medium M9

Na₂HPO₄ 6,3 g/l

KH₂PO₄ 3,0 g/l

NaCl 0,5 g/l

NH₄Cl 1,0 g/l

pH 7,0
Medium M9 1/10

Na₂HPO₄ 6,3 g/l

KH₂P_O4 3,0 g/l

NaCl 0,5 g/l

NH₄Cl 0,1 g/l

pH 7,0
Für eine bessere Züchtung und PHA-Produktion muß dem vorstehend aufgeführten Medium von anorganischen Salzen folgende Lösung von Spurenelementen bis auf 0,3 (V./V.) zugesetzt werden. Lösung der Spurenelemente (g/l)

Nitrilotriessigsäure 1,5

MgSO₄ 3,0

MnSO₄ 0,5

NaCl 1,0

FeSO₄ 0,1

CaCl₂ 0,1

ZnSO₄ 0,1

CuSO₄ 0,1

AIK(SO₄)₂ 0,1

H₃BO₃ 0,1

Na₂MoO₄ 0,1

NiCl₂ 0,1
Die Züchtungstemperatur kann irgendeine Temperatur sein, sofern der vorstehend genannte Stamm gut wachsen kann, zum Beispiel 15 bis 40°C, vorzugsweise etwa 20 bis 30°C.
In der vorliegenden Erfindung kann irgendein Züchtungsverfahren angewendet werden, sofern der vorstehend genannte Stamm wachsen und PHA produzieren kann, zum Beispiel eine Flüssigkultur, eine Festkultur, eine Batch-Kultur, eine Fed-batch-Kultur, eine halbkontinuierliche Kultur und eine kontinuierliche Kultur.
Um die PHA aus den Zellen zu gewinnen, ist in der vorliegenden Erfindung die übliche Extraktion mit Chloroform am bequemsten. Wenn sich jedoch das organische Lösungsmittel schwer verwenden läßt, kann die PHA gewonnen werden, indem die von PHA verschiedenen Zellkomponenten entfernt werden, indem mit oberflächenaktiven Mitteln, wie SDS, Enzymen, wie Lysozym, Mitteln, wie EDTA, Natriumhypochlorit und Ammoniak, behandelt wird.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend anhand des folgenden Beispiels beschrieben, es liegt jedoch in unserem Sinne, daß der Umfang der Erfindung nicht auf irgendwelche Einzelheiten der Beschreibung begrenzt ist.
BEISPIEL
Produktion von PHA durch Züchten des Stamms YN2 mit der Kohlenstoffquelle 1-Hexen Der Stamm YN2 wurde auf einem Agarmedium M9 gezüchtet, das 0,1 % Hefeextrakt enthielt, und eine Kolonie wurde genommen und in einer sterilisierten physiologischen Kochsalzlösung suspendiert, wodurch eine Zellsuspension mit OD₆₀₀ = 1,0 hergestellt wurde.
Diese Suspension wurde auf 20 Platten aus Agar 1/10N-M9 verteilt, der keine Kohlenstoffquelle enthielt, und die Platten wurden unter einer 1-Hexen-Atmosphäre bei 30°C inkubiert.
Nach einer viertägigen Inkubation wurden die Zellen aufgefangen, mit Methanol gewaschen, und die durch Zentrifugieren aufgefangenen Zellen wurden bei reduziertem Druck getrocknet. Das Trockengewicht der Zellen betrug 150 mg.
Den getrockneten Zellen wurden 50 ml Chloroform zugesetzt, und es wurde 24 Stunden bei 50°C gerührt, um die PHA herauszulösen. Die Chloroformschicht wurde filtriert und mit einem Verdampfungsapparat konzentriert. Es wurde kaltes Methanol zugesetzt, um den Niederschlag zu entfernen, der dann bei reduziertem Druck getrocknet wurde. Somit wurden 68 mg getrocknete PHA erhalten. Die PHA wurde auf etwa 45 % des Gewichts der getrockneten Zellen abgewogen.
Die Zusammensetzung des erhaltenen Polymers wurde wie folgt bestimmt: 10 mg des Polymers wurden in einen 25 ml Kolben vom Auberginen-Typ gegeben und durch Zugabe von 2 ml Chloroform gelöst, dazu wurden 2 ml einer Methanollösung gegeben, die 3 % Schwefelsäure enthielt, und das Ganze wurde 3,5 Stunden unter Rückfluß bei 100°C umgesetzt.
Nach Abschluß der Reaktion wurden dem Kolben 2 ml Wasser zugegeben, und der Kolben wurde 10 Minuten kräftig geschüttelt und für die Phasentrennung stehengelassen. Die untere Chloroformschicht wurde entfernt und über Magnesiumsulfat getrocknet. Diese wurde dann der Massen-Gaschromatographie unterzogen, um jeden Methylhydroxyalkanoat-Peak zu identifizieren, wobei ein Chromatograph-Massenspektrograph (GC-MS; Shimadzu QP-5050, DB-WAX-Kapillarsäule (J&W)) verwendet wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 gezeigt.
TABELLE 1
In Tabelle 1 gibt jeder Wert die Peakfläche (%) im TIC-Chromatogramm des GC-MS an.

C₄ : 3-Hydroxybuttersäure
C₆ : 3-Hydroxyhexansäure
C₆ : 3-Hydroxyhexensäure
C₈ : 3-Hydroxyoctansäure
C₈ : 3-Hydroxyoctensäure
C₁₀ : 3-Hydroxydecansäure
C₁₁ : 3-Hydroxyundecensäure
C_12' : 3-HA-Einheit mit einer Doppelbindung oder einer Verzweigung, nicht identifiziert
C₁₄ : 3-Hydroxytetradecansäure
C₁₄ : Vermutlich 3-Hydroxytetradecensäure, nicht identifiziert

Das erhaltene Polymer wurde ferner durch NMR analysiert (FT-NMR: Bruker DPX400, betreffende Nuklide: ¹H, ¹³C, Lösungsmittel: D-Chloroform mit TMS).
Die 1 und 2 zeigen die ¹H-NMR- und ¹³C-NMR-Diagramme. Tabelle 2 zeigt die Zuordnung der Peaks bei der ₁H-NMR.
TABELLE 2 Resonanzfrequenz: 400 MHz
Wie vorstehend dargestellt, wird PHA, die zumindest 3-Hydroxyhexensäure-Einheiten und 3-Hydroxyoctensäure-Einheiten enthält, in Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375) synthetisiert, wenn der Stamm in Gegenwart von 1-Hexen gezüchtet wird.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines mikrobiellen Polyesters, das einen Schritt umfaßt, bei dem ein Mikroorganismus in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das als einzige Kohlenstoffquelle 1-Hexen enthält, wobei der Mikroorganismus Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP7375) ist, der ein Polyhydroxyalkanoat produzieren kann.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der mikrobielle Polyester wenigstens eine Monomereinheit von Hydroxyfettsäure mit einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Hydroxyfettsäure-Einheit aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus 3-Hydroxyhexensäure und 3-Hydroxyoctensäure.