DE60123500T2

DE60123500T2 - Polyhydroxyalkanoate die 3-Hydroxybenzoylalkancarbonsäure als Monomer enthalten, und Verfahren zu ihren Herstellung

Info

Publication number: DE60123500T2
Application number: DE60123500T
Authority: DE
Inventors: Tsutomu Ohta-ku Honma; Etsuko Ohta-ku Sugawa; Tetsuya Ohta-ku Yano; Shin Ohta-ku Kobayashi; Takeshi Ohta-ku Imamura; Takashi Ohta-ku Kenmoku
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2000-02-29
Filing date: 2001-02-28
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2021-03-01
Also published as: KR100487877B1; DE60123500D1; EP1130042B1; KR20010085690A; ATE341573T1; US6861550B2; EP1130042A3; US20030100084A1; EP1130042A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Polyhydroxyalkanoat (hier gelegentlich als "PHA" abgekürzt, auch wenn manchmal in Mehrzahl gemeint). Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur hocheffizienten Erzeugung von PHA unter Verwendung von Mikroorganismen, die PHA produzieren und in ihren Zellen speichern können.
Einschlägiger Stand der Technik
Bisher ist von einer Vielzahl von Mikroorganismen berichtet worden, daß sie in ihren Zellen Poly-3-hydroxybuttersäure (hier nachstehend gelegentlich als "PHB" abgekürzt) oder andere PHA erzeugen und speichern ("Biodegradable Plastics Handbook", herausgegeben von Biodegradable Plastics Society, veröffentlicht von NTS Co., Ltd., P178-197). Diese Polymere können wie herkömmliche Kunststoffe für die Erzeugung verschiedener Arten von Produkten durch Schmelzverfahren usw. verwendet werden. Da diese Polymere den Vorteil haben, daß sie aufgrund ihrer biologischen Abbaubarkeit von Mikroorganismen in der Natur vollständig zersetzt werden, bleiben sie im Gegensatz zu vielen herkömmlichen synthetischen Polymerverbindungen nicht in der Umwelt zurück, um eine Verschmutzung hervorzurufen. Außerdem haben sie auch eine hervorragende biologische Kompatibilität, und es läßt sich deren Verwendung bei weichen medizinischen Teilen und dergleichen erwarten.
Es ist bekannt, daß solche mikrobiellen PHA in Abhängigkeit von den Arten der Mikroorganismen, der Zusammensetzungen der Kulturmedien, den Kulturbedingungen usw., die für deren Erzeugung verwendet werden, vielfältige Zusammensetzungen und Strukturen haben, und bis jetzt sind Untersuchungen bezüglich der Regelung dieser Zusammensetzungen und Strukturen in Hinblick auf eine Verbesserung der Eigenschaften der PHA durchgeführt worden.
Es ist zum Beispiel berichtet worden, daß der Stamm Alcaligenes eutropus H16 (ATCC Nr. 17699) und dessen mutante Stämme Copolymere von 3-Hydroxybuttersäure (hier nachstehend gelegentlich als "3HB" abgekürzt) und 3-Hydroxyvaleriansäure (hier nachstehend gelegentlich als "3HV" abgekürzt) mit vielfältigen Zusammensetzungsverhältnissen erzeugen, wenn die Kohlenstoffquellen in deren Kultur verändert werden (japanische Patentveröffentlichungen Nr. 6-15604, 7-14352, 8-19227 und dergleichen).
Die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 5-74492 offenbart ein Verfahren, bei dem das Copolymer von 3HB und 3HV erzeugt wird, wenn Methylobacterium sp., Paracoccus sp., Alcaligenes sp. oder Pseudomonas sp. mit einem primären Alkohol mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen in Kontakt gebracht wird.
Die offengelegten japanischen Patentanmeldungen Nr. 5-93049 und 7-265065 offenbaren, daß Zweikomponenten-Copolymere von 3HB und 3-Hydroxyhexansäure (hier nachstehend gelegentlich als "3HHx" abgekürzt) erzeugt werden, wenn Aeromonas caviae unter Verwendung von Oleinsäure oder Olivenöl als Kohlenstoffquelle gezüchtet wird.
Die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 9-191893 offenbart, daß Comamonas acidovorans IFO 13852 in einer Kultur mit Gluconsäure und 1,4-Butandiol als Kohlenstoffquelle einen Polyester produziert, der 3HB und 4-Hydroxybuttersäure als Monomereinheiten aufweist.
In den letzten Jahren wurden auch intensive Untersuchungen zu einem PHA durchgeführt, das aus einem 3-Hydroxyalkanoat (hier nachstehend gelegentlich als "3HA" abgekürzt) mit mittlerer Kettenlänge (als "mcl" abgekürzt) mit bis zu etwa 12 Kohlenstoffatomen besteht. Synthesewege für solche PHA können allgemein in zwei Arten unterteilt werden, und bestimmte Beispiele dafür sind nachfolgend unter (1) und (2) angegeben.
(1) Synthese unter Anwendung der β-Oxidation
Das japanische Patent Nr. 2642937 offenbart, daß ein PHA mit Monomereinheiten aus 3-Hydroxyalkanoat mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen erzeugt wird, wenn Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 ein nichtcyclischer aliphatischer Kohlenwasserstoff als Kohlenstoffquelle zugeführt wird.
Außerdem ist in Appl. Environ. Microbiol, 58 (2), 746 (1992) berichtet worden, daß Pseudomonas resinovorans einen Polyester mit 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyhexansäure, 3-Hydroxyoctansäure und 3-Hydroxydecansäure (in einem quantitativen Verhältnis von 1:15:75:9) als Monomereinheiten produziert, wenn als einzige Kohlenstoffquelle Octansäure verwendet wird, und auch einen Polyester mit 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyhexansäure, 3-Hydroxyoctansäure und 3-Hydroxydecansäure (in einem quantitativen Verhältnis von 8:62:23:7) als Einheiten produziert, wenn als einzige Kohlenstoffquelle Hexansäure verwendet wird. Hier wird angenommen, daß 3HA-Monomereinheiten, die eine größere Kettenlänge als die von Fettsäuren haben, als Ausgangsmaterial auf dem Fettsäuresyntheseweg erzeugt werden, der unter (2) beschrieben ist.
(2) Synthese unter Anwendung des Fettsäuresyntheseweges
In Int. J. Biol. Macromol., 16 (3), 119 (1994) ist berichtet worden, daß der Stamm Pseudomonas sp. 61-3 einen Polyester produziert, der aus 3-Hydroxyalkansäuren, wie 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyhexansäure, 3-Hydroxyoctansäure, 3-Hydroxydecansäure und 3-Hydroxydodecansäure, und 3-Hydroxyalkensäuren, wie 3-Hydroxy-5-cis-decensäure und 3-Hydroxy-5-cis-dodecensäure, als Einheiten besteht, wenn als einzige Kohlenstoffquelle Natriumgluconat verwendet wird.
Die Biosynthese von PHA erfolgt übrigens gewöhnlich durch eine PHA-Synthase, wobei "D-3-Hydroxyacyl-CoA" als Substrat verwendet wird, das in der Zelle als Zwischenprodukt von vielen Stoffwechselwegen erzeugt wird.
"CoA" steht hier für ein "Coenzym A". Wie vorstehend im Stand der Technik unter (1) beschrieben, erfolgt die Biosynthese von PHA unter Verwendung von "D-3-Hydroxyacyl-CoA" als zugrundeliegende Substanz, das im "β-Oxidationszyklus" gebildet wird, falls als Kohlenstoffquellen Fettsäuren, wie Octansäure und Nonansäure, verwendet werden.
Nachfolgend sind Reaktionen angegeben, über die PHA durch den "β-Oxidationszyklus" biosynthetisiert wird.
Wie im Stand der Technik vorstehend unter (2) beschrieben, wird andererseits in dem Fall, bei dem PHA unter Verwendung von Sacchariden, wie Glucose, biosynthetisiert wird, dies unter Verwendung von "D-3-Hydroxyacyl-CoA" als zugrundeliegende Substanz durchgeführt, das aus dem im "Fettsäuresyntheseweg" gebildeten "D-3-Hydroxyacyl-ACP" umgewandelt wird.
"ACP" steht hier für ein "Acyl-Trägerprotein".
Wie bereits beschrieben, ist übrigens jedes PHA, das sowohl gemäß der vorstehend angegebenen Synthesen (1) als auch (2) synthetisiert worden ist, ein PHA, das aus Monomereinheiten besteht, die Alkylgruppen in den Seitenketten aufweisen, das heißt ein "übliches PHA". Wenn jedoch ein größerer Anwendungsbereich eines mikrobiellen PHA wie diesem, zum Beispiel die Verwendung als funktionelles Polymer, in Betracht gezogen wird, wird erwartet, daß PHA mit Substituenten, die von Alkylgruppen verschieden sind (zum Beispiel Phenylgruppen), die in die Seitenketten eingeführt sind, sehr nützlich sind. Zu solchen anderen Substituenten gehören ein ungesättigter Kohlenwasserstoff, eine Estergruppe, ein Allylgruppe, eine Cyanogruppe, ein Halogenkohlenwasserstoff, Epoxid oder dergleichen.
In bezug auf die Synthese von PHA mit einem solchen Substituenten (das heißt von Alkylgruppen verschieden), der in die Seitenkette eingeführt worden ist (hier nachstehend falls erforderlich als "unübliches PHA" bezeichnet), ist von der Synthese unter Anwendung der β-Oxidation berichtet worden, einen Bericht bezüglich PHA mit einer Arylgruppe und dergleichen, die in die Seitenkette eingeführt worden ist, kann man zum Beispiel in Macromolecules, 24, S. 5256-5260 (1991) finden. Insbesondere ist berichtet worden, daß Pseudomonas oleovorans ein PHA, das 3HV, 3-Hydroxyheptansäure, 3-Hydroxynonansäure, 3-Hydroxyundecansäure und 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure (hier nachstehend gelegentlich als 3HPV abgekürzt) in einem quantitativen Verhältnis von 0,6 16,0 : 41,1 : 1,7 : 40,6 als Monomereinheiten enthält, in einer Menge von 160 mg pro Liter (l) Kulturlösung (der Trockengewichtsanteil in bezug auf die Zellmasse beträgt 31,6 %) produziert, wenn 5-Phenylvaleriansäure (hier nachstehend gelegentlich als PVA abgekürzt) und Nonansäure (Molverhältnis 2 1, Gesamtkonzentration 10 mMol/l) als Substrate verwendet werden, und auch ein PHA, das 3HHx, 3-Hydroxyoctansäure, 3-Hydroxydecansäure und 3HPV in einem quantitativen Verhältnis von 7,3 : 64,5 : 3,9 : 24,3 als Monomereinheiten enthält, in einer Menge von 200 mg/l Kulturlösung produziert (der Trockengewichtsanteil in bezug auf die Zellmasse beträgt 39,2%), wenn PVH und Octansäure als Substrate verwendet werden (Molverhältnis 1:1, Gesamtkonzentration 10 mMol/l). In diesem Bericht wird angenommen, daß das PHA hauptsächlich über den β-Oxidationsweg synthetisiert wird, da Nonansäure und Octansäure verwendet werden.
Eine zugehörige Beschreibung findet man auch in Macromol. Chem., 191, 1957-1965 (1990) und Chirality, 3, 492-494 (1991), worin Änderungen der Eigenschaften des Polymers festgestellt werden, die vermutlich durch das enthaltene 3HPV hervorgerufen werden.
Wie vorstehend bei mikrobiellen PHA beschrieben, können unterschiedliche Zusammensetzungen und Strukturen erhalten werden, wenn die Arten der Mikroorganismen, die Zusammensetzungen des Kulturmediums, die Kulturbedingungen und dergleichen, die für deren Herstellung angewendet werden, geändert werden, in Hinblick auf ihre Verwendung bei Kunststoffen kann jedoch festgestellt werden, daß deren Eigenschaften noch nicht befriedigend sind. Um den Anwendungsbereich von mikrobiellen PHA stärker zu erweitern, ist es von Bedeutung, eine weitere Verbesserung der Eigenschaften zu untersuchen, und es ist folglich wesentlich, PHA, die Monomereinheiten mit vielfältigen Strukturen umfassen, Verfahren zu deren Herstellung und Mikroorganismen, die die gewünschten PHA wirksam produzieren können, zu entwickeln und zu untersuchen.
Wie bereits beschrieben kann bei PHA (übliches PHA) mit in die Seitenkette eingeführten Substituenten andererseits auch erwartet werden, sie als "funktionelles Polymer" zu entwickeln, das aufgrund der Eigenschaften usw. der eingeführten Substituenten mit sehr nützlichen Funktionen und Eigenschaften ausgestattet ist, wenn die einzuführenden Substituenten entsprechen der gewünschten Eigenschaften ausgewählt werden, folglich stellt es ein wichtiges Problem dar, hervorragende PHA, die sowohl eine solche Funktionalität als auch biologische Abbaubarkeit aufweisen, die miteinander kompatibel sind, Verfahren zu deren Herstellung und Mikroorganismen, die die gewünschten PHA wirksam produzieren können, zu entwickeln und zu erforschen.
Weitere Beispiele von PHA mit solchen in die Seitenkette eingeführten Substituenten schließen PHA ein, die in der Seitenkette die vorstehend angegebene Phenylgruppe und außerdem eine Phenoxygruppe aufweisen.
Als weitere Beispiele der Phenylgruppe ist in Macromolecules, 29, 1762-1766 (1996) berichtet worden, daß Pseudomonas oleovorans ein PHA produziert, das 3-Hydroxy-5-(4-tolyl)valeriansäure als Monomereinheiten enthält, wenn die Züchtung in einem Kulturmedium erfolgt, das 5-(4-Tolyl)valeriansäure (5-(4-Methylphenyl)valeriansäure) als Substrat enthält).
Außerdem wird in Macromolecules, 32, 2889-2895 (1999) berichtet, daß Pseudomonas oleovorans ein PHA produziert, das 3-Hydroxy-5-(2,4-dinitrophenyl)valeriansäure und 3-Hydroxy-5-(4-nitrophenyl)valeriansäure als Monomereinheiten enthält, wenn die Züchtung in einem Kulturmedium erfolgt, das 5-(2,4-Dinitrophenyl)valeriansäure und Nonansäure als Substrate enthält.
Als ein Beispiel der Phenoxygruppe ist ferner in Macromol. Chem. Phys., 195, 1665-1672 (1994) berichtet worden, daß Pseudomonas oleovorans aus 11-Phenoxyundecansäure ein PHA produziert, das 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure und 3-Hydroxy-9-phenoxynonansäure als Einheiten enthält.
Außerdem ist in Macromolecules, 29, 3432-3435 (1996) von der Verwendung von Pseudomonas oleovorans für die Produktion von PHA, die 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure und 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure als Einheiten umfassen, aus 6-Phenoxyhexansäure; von PHA, die 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure, 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure und 3-Hydroxy-8-phenoxyoctansäure als Einheiten umfassen, aus 8-Phenoxyocansäure; bzw. von PHA, die 3-Hydroxy-5-phenoxybuttersäure und 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure als Einheiten enthalten, aus 11-Phenoxyundecansäure berichtet worden. Die Ausbeuten der in diesem Bericht genannten Polymere sind wie folgt.
Außerdem wird in Can. J. Microbiol., 41, 32-43 (1995) erfolgreich ein PHA erzeugt, das 3-Hydroxy-p-cyanophenoxyhexansäure oder 3-Hydroxy-p-nitrophenoxyhexansäure als Monomereinheiten enthält, wobei Octansäure und p-Cyanophenoxyhexansäure oder p-Nitrophenoxyhexansäure als Substrate und der Stamm Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 und der Stamm Pseudomonas putida KT 2442 verwendet werden.
Im japanischen Patent Nr. 2989175 sind Homopolymere, die aus einer 3-Hydroxy-5-(monofluorphenoxy)pentanoat-Einheit (3H5(MFP)P-Einheit) oder einer 3-Hydroxy-5-(difluorphenoxy)pentanoat-Einheit (3H5(DFP)P-Einheit) bestehen und Copolymere, die die 3H5(MFP)P-Einheit und/oder die 3H5(DFP)P-Einheit umfassen; Pseudomonas putida für die Synthese dieser Polymere; und Verfahren zur Herstellung der vorstehend genannten Polymere unter Verwendung der Gattung Pseudomonas offenbart.
Diese Herstellungen werden in der folgenden "Kultur mit zwei Schritten" vorgenommen.

Züchtungszeit: 24 Stunden für den ersten Schritt, 96 Stunden für den zweiten Schritt.

Die Substrate für jeden Schritt und die erhaltenen Polymere sind nachfolgend aufgeführt.

(1) Erhaltenes Polymer: 3H5(MFP)P-Homopolymer Substrat für den ersten Schritt: Citronensäure, Hefeextrakt Substrat für den zweiten Schritt: Monofluorphenoxyundecansäure
(2) Erhaltenes Polymer: 3H5(DFP)P-Homopolymer Substrat für den ersten Schritt: Citronensäure, Hefeextrakt Substrat für den zweiten Schritt: Difluorphenoxyundecansäure
(3) Erhaltenes Polymer: 3H5(MFP)P-Copolymer Substrat für den ersten Schritt: Octansäure oder Nonansäure, Hefeextrakt Substrat für den zweiten Schritt: Monofluorphenoxyundecansäure
(4) Erhaltenes Polymer: 3H5(DFP)P-Copolymer Substrat für den ersten Schritt: Octansäure oder Nonansäure, Hefeextrakt Substrat für den zweiten Schritt: Difluorphenoxyundecansäure

Als Effekt wird beschrieben, daß Polymere mit Phenoxygruppen, die mit 1 bis 2 Fluoratomen substituiert sind, am Ende der Seitenkette synthetisiert werden können, indem Fettsäuren mit mittlerer Kettenlänge, die Substituenten aufweisen, assimilieren, und daß diesen Stereoregularität und Wasserabweisungsvermögen verliehen werden kann, wobei ein hoher Schmelzpunkt und eine gute Verarbeitbarkeit erhalten bleiben.
Außerdem wird bei PHA, die eine Cyclohexylgruppe in den Monomereinheiten enthalten, erwartet, daß sie Polymereigenschaften aufweisen, die sich von denen von PHA unterscheiden, die gewöhnliche aliphatische Hydroxyalkansäuren als Einheiten enthalten, und es wird ein Beispiel zu ihrer Herstellung durch Pseudomonas oleovorans aufgeführt (Macromolecules, 30, 1611-1615 (1997)).
Laut diesem Bericht werden, wenn Pseudomonas oleovorans im Medium gezüchtet wird, in dem Nonansäure (hier nachstehend als "NA" abgekürzt) zusammen mit Crylohexylbuttersäure (hier nachstehend als "CHBA" abgekürzt) oder Cyclohexylvaleriansäure (hier nachstehend als "CHVA" abgekürzt) gleichzeitig vorliegt, PHA erhalten, die Einheiten der Cyclohexylgruppe und von Nonansäure stammende Einheiten enthalten (das jeweilige Verhältnis ist nicht bekannt).
Zur Ausbeute usw. ist berichtet worden, daß die quantitativen Verhältnisse von CHBA und NA in die Bedingung 20 mMol/l der Gesamtkonzentration des Substrats in bezug auf CHBA geändert wurden, wodurch die in Tabelle 2 aufgeführten Ergebnisse erhalten wurden.
Tabelle 2

CDW: Zellen (Trockengewicht) (mg/l)
PDW: Polymer (Trockengewicht) (mg/l)
Ausbeute: PDW/CDW (%)

Die Polymerausbeute pro Kulturlösung ist jedoch in diesem Fall unzureichend, und von Nonansäue stammende aliphatische Hydroxyalkansäuren sind auch mit den Monomereinheiten des erhaltenen PHA selbst gemischt.
Wenn PHA mit unterschiedlichen in die Seitenkette eingeführten Substituenten unter Verwendung von Mikroorganismen produziert werden, wie es in den Beispielen des vorstehend genannten Berichts mit Pseudomonas oleovorans ersichtlich ist, wird ein Verfahren angewendet, bei dem Alkanoate mit einzuführenden Substituenten zusätzlich zur Verwendung als Polymerbestandteile als Kohlenstoffquellen für das Wachstum verwendet werden.
Bei dem Verfahren, bei dem Alkanoate mit einzuführenden Substituenten zusätzlich zur Verwendung als Polymerbestandteile als Kohlenstoffquellen für das Wachstum verwendet werden, wird jedoch erwartet, daß eine Energiequelle geliefert wird, die auf der Erzeugung von Acetyl-CoA über die β-Oxidation aus den vorstehend beschriebenen Alkanoaten basiert. Bei solchen Verfahren kann das Acetyl-CoA nicht durch die β-Oxidation erzeugt werden, wenn das Substrat nicht eine bestimmte Kettenlänge hat, folglich stellt es ein signifikantes Problem dar, daß die als Substrate von PHA verwendbaren Alkanoate begrenzt sind.
Kürzlich wurden im allgemeinen ferner Substrate, die durch die β-Oxidation jeweils um zwei Methylenketten kürzere Kettenlängen aufweisen, gebildet und als Monomereinheiten von PHA eingeführt, folglich wurden die synthetisierten PHA oft Copolymere, die Monomereinheiten umfassen, die jeweils eine um zwei Methylenketten verschiedene Kettenlänge aufweisen. Im vorstehend angegebenen Bericht werden Copolymere erzeugt, die aus drei Arten von Monomereinheiten bestehen: 3-Hydroxy-8-phenoxyoctansäure, die von 8-Phenoxyoctansäure als Substrat stammt, 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure und 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure, die Nebenprodukte sind, die von Stoffwechselprodukten abgeleitet sind.
Wenn ein PHA erhalten werden soll, das aus einer einzigen Monomereinheit besteht, ist die Anwendung dieses Verfahrens angesichts dessen äußerst problematisch. Bei dem Verfahren, das voraussetzt, daß die Lieferung einer Energiequelle auf der Erzeugung von Acetyl-CoA über die β-Oxidation basiert, stellt es ferner ein deutliches Problem dar, daß das Wachstum der Mikroorganismen langsam ist und die Synthese der PHA lange dauert und daß die Ausbeute der synthetisierten PHA wahrscheinlich abnimmt.
Zusätzlich zu Alkanoaten, die Substituenten aufweisen, deren Einführung vorgesehen ist, wird folglich im allgemeinen das Verfahren angewendet, das wahrscheinlich beim Herauslösen der PHA nach der Züchtung der Mikroorganismen in dem Medium effektiv ist, das gleichzeitig mit Fettsäuren mit mittlerer Kettenlänge, wie Octansäure und Nonansäure, als Kohlenstoffquellen für das Wachstum vorliegt.
Nach Ansicht der hier genannten Erfinder haben die PHA, die über den β- Oxidationsweg synthetisiert wurden, wobei Fettsäuren mit mittlerer Kettenlänge, wie Octansäure und Nonansäure, wie sie vorstehend beschrieben sind, als Kohlenstoffquellen für das Wachstum verwendet werden, eine geringe Reinheit, und 50 % oder mehr der erhaltenen Polymere sind mcl-3HA-Monomereinheiten, das heißt "gewöhnliche PHA"-Einheiten, die Monomereinheiten darstellen (zum Beispiel 3-Hydroxyoctansäure, 3-Hydroxynonansäure usw.), die von den Kohlenstoffquellen für das Wachstum stammen. Diese mcl-3HA-Einheiten sind bei üblicher Temperatur klebrige Polymere mit einer einzigen Zusammensetzung, und wenn mcl-3HA-Einheiten in großen Mengen mit den gewünschten erfindungsgemäßen PHA gemischt werden, verringern sie den Umwandlungspunkt zweiter Ordnung (Tg) der Polymere deutlich.
Wenn die Eigenschaft erreicht werden soll, daß das Polymer bei üblicher Temperatur hart ist, ist ein Gemisch der mcl-3HA-Monomereinheiten unerwünscht. Es ist auch bekannt, daß eine solche heterogene Struktur der Seitenkette die Wechselwirkung stört, die sich von den intramolekularen oder intermolekularen Strukturen der Seitenketten ableitet, so daß sie die Kristallinität und Orientierung deutlich beeinflußt. Wenn eine Verbesserung der Polymereigenschaften und eine zusätzliche Funktionalität erreicht werden sollen, ist ein Gemisch der mcl-3HA-Monomereinheiten sehr problematisch.
Eine Lösung dieses Problems besteht darin, einen Reinigungsschritt zum Abtrennen/Entfernen von "unerwünschten" Monomereinheiten, wie mcl-3HA-Monomereinheiten, die sich von der Kohlenstoffquelle für das Wachstum ableiten, vorzunehmen, um PHA zu erhalten, die nur aus einer Monomereinheit mit einem bestimmten Substituenten bestehen. Dabei bestehen jedoch die Probleme, daß das Verfahren kompliziert wird und eine deutlich Verringerung der Ausbeute nicht vermieden werden kann.
Es gibt auch das signifikante Problem, daß es äußerst schwierig ist, nur unerwünschte Monomere zu entfernen, wenn Copolymere aus den gewünschten und unerwünschten Monomereinheiten gebildet werden. Wenn das Ziel insbesondere in der Synthese von PHA besteht, die Monomereinheiten mit einer Seitenkette, wie einer Gruppe, die von einem ungesättigten Kohlenwasserstoff erhalten wird, einer Estergruppe, einer Allylgruppe, einer Cyanogruppe, einer Nitrogruppe oder einer Gruppe, die von einem Halogenkohlenwasserstoff erhalten wurde, einer Gruppe, die mit Epoxid eingeführt worden ist, oder dergleichen, als Seitenkettenstruktur enthalten, bilden die mcl-3HA-Monomereinheiten mit der gewünschten Monomereinheit oft ein Copolymer, so daß es äußerst problematisch ist, nach der Synthese der PHA die mcl-3HA-Monomereinheiten zu entfernen.
EP-A-1 188 782, die am 20/03/02 veröffentlicht worden ist und die Prioritäten vom 14/09/00, 13/12/00, 31/05/01 und 11/09/01 beansprucht, offenbart ein Beispiel von biosynthetischen Polyhydroxyalkanoaten, die Zusammensetzungen der Monomereinheit aufweisen, die den nachfolgend angegebenen Tabellen A, B, C, D, E und F entsprechen. Diese Polyhydroxyalkanoate werden hier nicht beansprucht. [Tabelle A]
[Tabelle B]
[Tabelle C]
[Tabelle D]
[Tabelle E]
[Tabelle F]
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die hier genannten Erfinder sind folglich zu der Erkenntnis gelangt, daß die Entwicklung eines Biosyntheseverfahrens für die Gewinnung von "unüblichen PHA" mit hoher Reinheit wesentlich ist, falls die Verwendung bei funktionellen Polymeren in Betracht gezogen wird. Folglich war es vermutlich sehr nützlich und wichtig, hervorragende Polymere, die sowohl mit Funktionalität als auch biologischer Abbaubarkeit versehen sind, wie es vorstehend beschrieben ist, Mikroorganismen, die die erfindungsgemäßen Polymere produzieren und diese in den Zellen speichern können, und ein Verfahren zur wirksamen Biosynthese der erfindungsgemäßen Polymere mit hoher Reinheit zu entwickeln.
Die vorliegende Erfindung löst die vorstehend beschriebenen Probleme und stellt PHA (unübliche PHA) bereit, die umfassen: Monomereinheiten unterschiedlicher Strukturen mit Substituenten in den Seitenketten, die als Materialien für Vorrichtungen, medizinische Materialien und dergleichen nützlich sind, und gibt ein Verfahren an zur Herstellung der vorliegenden "unüblichen PHA" unter Verwendung von Mikroorganismen, insbesondere ein Herstellungsverfahren, bei dem das Gemisch aus unerwünschten Monomereinheiten verringert wird und das gewünschte "unübliche PHA" mit hoher Reinheit und hoher Ausbeute erhalten werden kann.
Da das Ziel der hier genannten Erfinder in der Entwicklung von PHA mit Substituenten in der Seitenkette bestand, die als Materialien für Vorrichtungen, medizinische Materialien und dergleichen nützlich sind, haben sie folglich Mikroorganismen erforscht, die unterschiedliche Arten von PHA produzieren und diese in den Zellen speichern können, und sie haben beharrlich wiederholte Untersuchungen zu einem Verfahren für die Herstellung der gewünschten PHA unter Verwendung solcher Mikroorganismen durchgeführt.
Als Ergebnis haben die hier genannten Erfinder festgestellt, daß Mikroorganismen neue PHA, die 3-Hydroxybenzoylalkansäure der folgenden chemischen Formel [2] als Monomereinheit umfassen, produzieren und diese in den Zellen speichern können, daß ferner diese PHA biosynthetisiert werden können, wenn diese Mikroorganismen bei gleichzeitig vorhandenen Benzoylalkansäuren der folgenden chemischen Formel [10] mit Sacchariden gezüchtet werden können und daß die dadurch erhaltenen PHA eine relativ hohe Reinheit aufweisen.
worin n eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist.
worin n eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist.
Insbesondere haben die hier genannten Erfinder Mikroorganismen gefunden, die als Ausgangsmaterial verwenden können:
4-Benzoylbuttersäure (hier nachstehend gelegentlich als "BzBA" abgekürzt) der chemischen Formel [12]:
5-Benzoylvaleriansäure (hier nachstehend gelegentlich als "BzVA" abgekürzt) der chemischen Formel [13]:
6-Benzoylhexansäure (hier gelegentlich als "BzHxA" abgekürzt) der chemischen Formel [14]:
7-Benzoylheptansäure (hier gelegentlich als "BzHpA" abgekürzt) der chemischen Formel [15]:
und 8-Benzoyloctansäure (hier gelegentlich als "BzOA" abgekürzt) der chemischen Formel [16]:
und die neue PHA produzieren und in den Zellen speichern können, die als Monomereinheiten enthalten:
3-Hydroxy-4-benzoylbuttersäure (hier nachstehend gelegentlich als "3HBzB" abgekürzt) der chemischen Formel [5]:
3-Hydroxy-5-benzoylvaleriansäure (hier nachstehend gelegentlich als "3HBzV" abgekürzt) der chemischen Formel [6]:
3-Hydroxy-6-benzoylhexansäure (hier nachstehend gelegentlich als "3HBzHx" abgekürzt) der chemischen Formel [7]:
3-Hydroxy-7-benzoylheptansäure (hier nachstehend gelegentlich als "3HBzHp" abgekürzt) der chemischen Formel [8]:
bzw. 3-Hydroxy-8-benzoyloctansäure (hier nachstehend gelegentlich als "3HBzO" abgekürzt) der chemischen Formel [9]:
Ferner wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen PHA biosynthetisiert werden können, wenn diese Mikroorganismen gezüchtet werden, wenn BzBA, BzVA, BzHxA, BzHpA oder BzOA gleichzeitig mit Sacchariden vorhanden ist, und daß die erhaltenen erfindungsgemäßen PHA eine relativ hohe Reinheit hatten, wodurch sie zur vorliegenden Erfindung gelangten.
Mit anderen Worten betrifft die vorliegende Erfindung Polyhydroxyalkanoate mit einer Zusammensetzung der Monomereinheiten der folgenden Formel [1]: AxB(1–x) [1]worin A zumindest eine oder mehrere Monomereinheiten der folgenden chemischen Formel [2] ist, B zumindest eine oder mehrere darstellt, die aus Monomereinheiten der folgenden chemischen Formel [3] oder [4] ausgewählt sind, und x nicht kleiner als 0,01 bis kleiner als 1 ist.
worin n eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist.
worin p eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist.
worin q gleich 3 oder 5 ist.
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polyhydroxyalkanoat gemäß der vorstehend angegebenen Formel [1], worin die eine oder mehreren Monomereinheiten der Formel [2] eine Monomereinheit der chemischen Formel [5] einschließen:
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polyhydroxyalkanoat der vorstehend angegebenen Formel [1], wobei die eine oder mehreren Monomereinheiten der Formel [2] eine Monomereinheit der chemischen Formel [6] einschließen:
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polyhydroxyalkanoat der vorstehend angegebenen Formel [1], wobei die eine oder mehreren Monomereinheiten der Formel [2] eine Monomereinheit der chemischen Formel [7] einschließen:
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polyhydroxyalkanoat der vorstehend angegebenen Formel [1], wobei die eine oder mehreren Monomereinheiten der Formel [2] eine Monomereinheit der chemischen Formel [8] einschließen:
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polyhydroxyalkanoat der vorstehend angegebenen Formel [1], wobei die eine oder mehreren Monomereinheiten der Formel [2] eine Monomereinheit der chemischen Formel [9] einschließen:
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polyhydroxyalkanoat der vorstehend angegebenen Formel [1], wobei die eine oder mehreren Monomereinheiten der Formel [2] eine Monomereinheit der chemischen Formel [6]:
und eine Monomereinheit der chemischen Formel [8] einschließen:
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polyhydroxyalkanoat der vorstehend angegebenen Formel [1], wobei die eine oder mehreren Monomereinheiten der Formel [2] eine Monomereinheit der chemischen Formel [7]:
und eine Monomereinheit der chemischen Formel [9] einschließen:
Nach einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung hat das erfindungsgemäße Polyhydroxyalkanoat ein Zahlenmittel des Molekulargewichts von 10.000 bis 1.000.000.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Polyhydroxyalkanoats, das einen Schritt umfaßt, bei dem in einem Benzoylalkansäure enthaltenden Medium ein Mikroorganismus gezüchtet wird, der unter Verwendung der Benzoylalkansäure ein Polyhydroxyalkanoat mit einer Zusammensetzung der Monomereinheit mit der folgenden Formel [1]: AxB(1–x) [1]aus der Benzoylalkansäure synthetisieren kann,
wobei A zumindest eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [2] ist:
worin n eine ganze Zahl von nicht weniger als 1 ist; und
B zumindest eine Einheit ist, die aus Monomereinheiten der folgenden chemischen Formel [3]:
worin p eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist, und
Monomereinheiten der folgenden chemischen Formel [4] ausgewählt ist:
worin q gleich 3 oder 5 ist; und
x nicht kleiner als 0,01 bis kleiner als 1 ist.
Nach einem weiteren Gesichtspunkt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Benzoylalkansäure eine Benzoylalkansäure der chemischen Formel [10]:
worin n eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist, und
das Polyhydroxyalkanoat ist ein Polyhydroxyalkanoat, das eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [11] umfaßt:
worin m zumindest einen oder mehrere Werte hat, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus n, n – 2, n – 4 und n – 6 besteht, und eine ganze Zahl von nicht weniger als 1 ist.
Nach einem weiteren Gesichtspunkt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Schritt des Züchtens des Mikroorganismus ein Schritt, bei dem der Mikroorganismus, der unter Verwendung der Benzoylalkansäure das Polyhydroxyalkanoat mit der Zusammensetzung der Monomereinheit produzieren kann, die mit der Formel [1] angegeben wird, in einem Medium gezüchtet wird, das Benzoylalkansäure und ein Saccharid enthält.
Bei diesem Verfahren kann die Züchtung des Mikroorganismus in einem Schritt durchgeführt werden, wobei ein Medium verwendet wird, das die Benzoylalkansäure und das Saccharid enthält.
Die Züchtung des Mikroorganismus kann auch in zumindest zwei Schritten erfolgen, indem eine Züchtung in einem Medium vorgenommen wird, das die Benzoylalkansäure und das Saccharid enthält, und danach in einem Medium gezüchtet wird, das die Benzoylalkansäure und das Saccharid enthält und in dem die Stickstoffquelle eingeschränkt ist.
Nach einem weiteren Gesichtspunkt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Saccharid zumindest eins, das aus der Gruppe von Glucose, Fructose und Mannose ausgewählt ist.
Bei jedem der vorstehend genannten Verfahren kann der Mikroorganismus ein Mikroorganismus sein, der zu Pseudomonas sp. gehört.
Insbesondere kann der Mikroorganismus zumindest ein Stamm sein, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Pseudomonas cichorii H45, FERM BP-7374; Pseudomonas cichorii YN2, FERM BP-7375; und Pseudomonas jessenii P161, FERM BP-7376 besteht.
Nach einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung ist der Schritt des Züchtens des Mikroorganismus ein Schritt, bei dem ein Mikroorganismus, der unter Verwendung von 4-Benzoylbuttersäure ein Polyhydroxyalkanoat produzieren kann, das eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [5] umfaßt:
in einem Medium gezüchtet wird, das 4-Benzoylbuttersäure der folgenden chemischen Formel [12] enthält:
und wobei das erzeugte Polyhydroxyalkanoat eine Monomereinheit der chemischen Formel [5] umfaßt.
Nach einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung ist der Schritt des Züchtens des Mikroorganismus ein Schritt, bei dem ein Mikroorganismus, der unter Verwendung von 5-Benzoylvaleriansäure ein Polyhydroxyalkanoat produzieren kann, das eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [6] umfaßt:
in einem Medium gezüchtet wird, das 5-Benzoylvaleriansäure der folgenden chemischen Formel [13] enthält:
und wobei das erzeugte Polyhydroxyalkanoat eine Monomereinheit der chemischen Formel [6] umfaßt.
Nach einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung ist der Schritt des Züchtens des Mikroorganismus ein Schritt, bei dem ein Mikroorganismus, der unter Verwendung von 6-Benzoylhexansäure ein Polyhydroxyalkanoat produzieren kann, das eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [7] umfaßt:
in einem Medium gezüchtet wird, das 6-Benzoylhexansäure der folgenden chemischen Formel [14] enthält:
und wobei das erzeugte Polyhydroxyalkanoat eine Monomereinheit der chemischen Formel [7] umfaßt.
Nach einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung ist der Schritt des Züchtens des Mikroorganismus ein Schritt, bei dem ein Mikroorganismus, der unter Verwendung von 7-Benzoylheptansäure ein Polyhydroxyalkanoat produzieren kann, das eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [8] umfaßt:
in einem Medium gezüchtet wird, das 7-Benzoylheptansäure der folgenden chemischen Formel [15] enthält:
und wobei das erzeugte Polyhydroxyalkanoat eine Monomereinheit der chemischen Formel [8] umfaßt.
Nach einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung ist der Schritt des Züchtens des Mikroorganismus ein Schritt, bei dem ein Mikroorganismus, der unter Verwendung von 8-Benzoyloctansäure ein Polyhydroxyalkanoat produzieren kann, das eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [9] umfaßt:
in einem Medium gezüchtet wird, das 8-Benzoyloctansäure der folgenden chemischen Formel [16] enthält:
und wobei das erzeugte Polyhydroxyalkanoat die Monomereinheit der chemischen Formel [9] umfaßt.
Nach einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist der Schritt des Züchtens des Mikroorganismus ein Schritt, bei dem ein Mikroorganismus, der unter Verwendung von 7-Benzoylheptansäure ein Polyhydroxyalkanoat produzieren kann, das Monomereinheiten der folgenden chemischen Formel [6]:
und der folgenden chemischen Formel [8] umfaßt:
in einem Medium gezüchtet wird, das 7-Benzoylheptansäure der folgenden chemischen Formel [15] enthält:
und wobei das erzeugte Polyhydroxyalkanoat Monomereinheiten der chemischen Formeln [6] und [8] umfaßt.
Nach einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung ist der Schritt des Züchtens des Mikroorganismus ein Schritt, bei dem ein Mikroorganismus, der unter Verwendung von 8-Benzoyloctansäure ein Polyhydroxyalkanoat produzieren kann, das Monomereinheiten der folgenden chemischen Formel [7]:
und der folgenden chemischen Formel [9] umfaßt:
in einem Medium gezüchtet wird, das 8-Benzoyloctansäure der folgenden chemischen Formel [16] enthält:
und wobei das erzeugte Polyhydroxyalkanoat Monomereinheiten der chemischen Formeln [7] und [9] umfaßt.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Polyalkanoaten, das den Schritt des Züchtens von Mikroorganismen im Medium, das Benzoylalkansäuren der chemischen Formel [10] umfaßt:
worin n eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist,
und des Produzierens der Polyhydroxyalkanoate mit den entsprechenden Monomereinheiten der chemischen Formel [11] durch die Mikroorganismen umfaßt:
worin m zumindest einen oder mehrere Werte hat, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus n, n – 2, n – 4 und n – 6 besteht, und eine ganze Zahl von nicht weniger als 1 ist.
Gemäß der erfindungsgemäßen Verfahren werden hier Saccharidverbindungen, zum Beispiel Glucose, Fructose, Mannose und dergleichen, als Substrate für die Züchtung der Mikroorganismen verwendet, so daß von Sacchariden, wie Glucose, stammende Monomereinheiten in den erzeugten PHA überhaupt nicht oder nur wenig enthalten sind. Angesichts dessen unterscheidet sich das erfindungsgemäße Verfahren grundsätzlich von herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von mikrobiellen PHA, die Saccharide, wie Glucose, verwenden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, wenn ferner ein Schritt vorliegt, bei dem die von den Mikroorganismen produzierten PHA abgetrennt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue Polyhydroxyalkanoate, die 3-Hydroxybenzoylalkansäuren als Monomereinheiten umfassen, und ein Verfahren zur Herstellung dieser Polyhydroxyalkanoate unter Verwendung von Mikroorganismen bereitgestellt. Die als funktionelle Polymere vorteilhaften Polyhydroxyalkanoate können wirksam erzeugt werden, wobei zu erwarten ist, daß sie auf jedem Gebiet, wie als Materialien für Geräte bzw. Vorrichtungen und medizinische Materialien, verwendet werden können.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine graphische Darstellung, die das ¹H-NMR-Spektrum eines Polymers unter Verwendung von BzBA als Ausgangsmaterial von Beispiel 1 zeigt;
2 ist eine graphische Darstellung, die das ¹H-NMR-Spektrum eines Polymers unter Verwendung von BzVA als Ausgangsmaterial von Beispiel 3 zeigt;
3 ist eine graphische Darstellung, die das ¹³C-NMR-Spektrum eines Polymers unter Verwendung von BzVA als Ausgangsmaterial von Beispiel 3 zeigt;
4 ist eine graphische Darstellung, die das ¹H-NMR-Spektrum eines Polymers unter Verwendung von BzHxA als Ausgangsmaterial von Beispiel 1 zeigt;
5 ist eine graphische Darstellung, die das ¹H-NMR-Spektrum eines Polymers unter Verwendung von BzHpA als Ausgangsmaterial von Beispiel 9 zeigt; und
6 ist eine graphische Darstellung, die das ¹H-NMR-Spektrum eines Polymers unter Verwendung von BzOA als Ausgangsmaterial von Beispiel 12 zeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die erfindungsgemäßen PHA sind isotaktische Polymere, die im allgemeinen nur aus der R-Form bestehen.
< Mit Sacchariden und dem TCC-Zyklus verbundene organische Säuren: Unterschied zum Stand der Technik >
Eines der Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen PHA ist dadurch gekennzeichnet, daß in den von den Mikroorganismen produzierten und gespeicherten PHA der Gehalt der gewünschten Monomereinheiten extrem erhöht ist oder nur die gewünschten Monomereinheiten erhalten werden, wenn bei der Züchtung der Mikroorganismen in das Medium zusätzlich zu Alkanoaten für die Einführung der gewünschten Monomereinheiten nur Saccharide oder mit dem TCC-Zyklus verbundene organische Säuren als von den Alkanoaten verschiedene Kohlenstoffquellen gegeben werden. Dieser beschleunigende Effekt der Bevorzugung dieser bestimmten Monomereinheiten wird dadurch erreicht, daß in das Medium als von den Alkanoaten verschiedene Kohlenstoffquellen nur Saccharide oder mit dem TCC-Zyklus verbundene organische Säuren gegeben werden.
Mit anderen Worten sind die Erfinder zur vorliegenden Erfindung gelangt, indem sie die Erkenntnis gewonnen haben, daß die gewünschten PHA mit viel besseren Ausbeuten und einer viel besseren Reinheit im Vergleich mit den herkömmlichen Verfahren erhalten werden, die mcl-Alkanoate, wie Nonansäure und Octansäure, als gleichzeitig vorhandene Substrate verwenden, wenn Saccharide oder mit dem TCC-Zyklus verbundene organische Säuren als gleichzeitig vorhandene Substrate zusammen mit Alkanoaten für die Einführung der gewünschten Monomereinheiten gezüchtet werden, und daß ein solcher Effekt durch ein Züchtungsverfahren erreicht wird, das Acetyl-CoA, das eine Kohlenstoffquelle und Energiequelle der Mikroorganismen darstellt, nach einem Verfahren erzeugen kann, das nicht von der β-Oxidation abhängt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Saccharidverbindungen, zum Beispiel Glucose, Fructose, Mannose und dergleichen, als Substrate für die Züchtung der Mikroorganismen verwendet, so daß die erzeugten PHA aus Alkanoaten für die Einführung der gewünschten Monomereinheiten bestehen, die gleichzeitig mit Sacchariden vorliegen, und die von den Sacchariden, wie Glucose, stammenden Monomereinheiten darin überhaupt nicht oder extrem wenig enthalten sind. Aus dieser Sicht unterscheiden sich die erfindungsgemäßen Verfahren sowohl im Aufbau als auch der Wirkung grundsätzlich von herkömmlichen Verfahren zur Erzeugung von mikrobiellen PHA, die Saccharide selbst, wie Glucose, als Ausgangssubstrate für die Einführung von Monomereinheiten in die PHA verwenden.
Die PHA, das Herstellungsverfahren und die Mikroorganismen gemäß dieser Erfindung werden nachfolgend ausführlich beschrieben.
< System für die Zuführung von PHA-Monomereinheiten >
Zuerst wird der "Fettsäuresyntheseweg" ausführlich beschrieben, der eines der Systeme darstellt, die mcl-3HA-Monomereinheiten zuführen, die in die gewünschten PHA eingemischt sind.
Wenn Saccharide, wie Glucose, Substrate darstellen, werden die für die Zellkomponenten erforderlichen Alkanoate über den "Fettsäuresyntheseweg" biosynthetisiert, bei dem das über den "glycolytischen Weg" aus Sacchariden erzeugte Acetyl-CoA eine Ausgangssubstanz darstellt. Die Fettsäuresynthese schließt den de novo Syntheseweg und den Kohlenstoffkettenverlängerungsweg ein, die nachfolgend beschrieben werden.
1) de novo Syntheseweg
Dieser Weg wird von zwei Enzymen katalysiert, die Acetyl-CoA-Carboxylase (EC 6.4.1.2) und Fettsäure-Synthase (EC 2.3.1.85) sind. Die Acetyl-CoA-Carboxylase ist ein Biotin einschiebendes Enzym, das schließlich die folgende Reaktion katalysiert, wodurch aus Acetyl-CoA Malonyl-CoA erzeugt wird. Diese Reaktion wird mit dem folgenden Schema [17] angegeben. Acetyl-CoA + ATP + HCO₃ ^– ⫾ Malonyl-CoA + ADP + Pi [17]
Fettsäure-Synthase ist ein Enzym, das den Reaktionszyklus der Transfer-Kondensation-Reduktion-Dehydratation-Reduktion katalysiert. Die gesamten Reaktionen werden mit dem folgenden Reaktionsschema [18] angegeben. Acetyl-CoA + n Malonyl-CoA + 2n NADPH + 2n H⁺ ⫾ CH₃(CH₂)_2nCOOH + n CO2 + 2n NADP⁺ + (n – 1) CoA [18]
Die Reaktionsprodukte können hier freie Säuren, CoA-Derivate oder ACP-Derivate sein, wobei dies von der Art der Enzyme abhängt.
Acetyl-CoA und Malonyl-CoA werden hier mit den folgenden chemischen Formeln [19] und [20] angegeben.
Außerdem ist CoA die Abkürzung von Coenzym A, das mit der folgenden chemischen Formel [21] angegeben wird.
Bei diesem Reaktionsweg wird "D-3-Hydroxyacyl-ACP", das das Monomersubstrat für die Biosynthese von PHA darstellen soll, über den nachstehend beschriebenen Weg als Zwischenprodukt zugeführt. Außerdem werden die in den folgenden Reaktionsschemata dargestellten Wege schließlich bei wiederholter Addition von zwei Kohlenstoffatomen bis Palmitinsäure ausgeweitet. Als Monomersubstrat für die Biosynthese von PHA werden folglich sieben "D-3-Hydroxyacyl-ACP" mit der gleichen Anzahl von Kohlenstoffatomen, von "D-3-Hydroxybutyryl-ACP" bis "D-3-Hydroxypalmityl-ACP", bereitgestellt.
2) Kohlenstoffkettenverlängerungsweg
Dieser Weg wird allgemein in zwei Wege unterteilt: bei einem davon wird Malonyl-ACP an Acyl-ACP angefügt, um dieses schließlich in Acyl-ACP zu überführen, bei dem die Kohlenstoffkette um zwei Kohlenstoffatome (und CO₂) verlängert ist (als "Weg A" bezeichnet), und bei einem anderen wird Acetyl-CoA an Acyl-CoA angefügt, um dieses schließlich in Acyl-CoA zu überführen, bei dem die Kohlenstoffkette um zwei Kohlenstoffatome verlängert ist (als "Weg B" bezeichnet). Jeder Weg wird nachfolgend beschrieben.
Weg A

R-CO-ACP + Malonyl-ACP → R-CO-CH₂-CO-ACP + CO₂ R-CO-CH₂-CCO-ACP → R-CHOH-CH₂-CO-ACP → R-CH=CH-CO-ACP → R-CH₂-CH₂-CO-ACP

Weg B

R-CO-CoA + Acetyl-CoA → R-CO-CH₂-CO-CoA R-CO-CH₂-CO-CoA → R-CHOH-CH₂-CO-CoA → R-CH=CH-CO-CoA → R-CH₂-CH₂-CO-CoA

Bei beiden Wegen A und B wird angenommen, daß als Zwischenprodukt "D-3-Hydroxyacyl-CoA" oder "D-3-Hydroxyacyl-ACP" erhalten wird, und "D-3-Hydroxyacyl-CoA" direkt als Monomersubstrat für die PHA-Synthese verwendet wird, wohingegen "D-3-Hydroxyacyl-ACP" als Monomersubstrat für die PHA-Synthese verwendet wird, nachdem es durch ACP-CoA-Transferase in "D-3-Hydroxyacyl-CoA" überführt worden ist.
Wenn Saccharide, wie Glucose und dergleichen, als Substrat verwendet werden, wird angenommen, daß über den "glycolytischen Weg" und den "Fettsäuresyntheseweg" innerhalb der mikrobiellen Zellen eine mcl-3HA- Monomereinheit gebildet wird, wie es vorstehend beschrieben ist. Wenn am TCC-Zyklus beteiligte organische Säuren als Substrat verwendet werden, wird das Acetyl-CoA durch Pyruvat-Dehydrogenase direkt aus Pyruvinsäure erhalten. Organische Säuren beim TCC-Zyklus, zum Beispiel ergibt Äpfelsäure durch Malat-Dehydrogenase Pyruvinsäure, ferner wird durch die vorstehend beschriebene Reaktion Acetyl-CoA erhalten. Oxalessigsäure ergibt durch Phosphoenolpyruvat-Kinase Phosphoenolpyruvinsäure, Phosphoenolpyruvinsäure ergibt von Pyruvat-Kinase katalysiert Pyruvinsäure, außerdem entsteht durch die vorstehend beschriebene Reaktion Acetyl-CoA. Es wird angenommen, daß das durch diese Reaktionen erzeugte Acetyl-CoA über den "Fettsäuresyntheseweg" die mcl-3HA-Monomereinheit ergibt.
Es wird angenommen, daß mcl-Alkanoate, zum Beispiel Octansäure oder Nonansäure, oder Alkanoate, an deren Ende eine von einer geradkettigen aliphatischen Alkylgruppe verschiedene funktionelle Gruppe angefügt ist, zum Beispiel 5-Phenylvaleriansäure, 5-(4-Fluorphenyl)valeriansäure, 6-Phenylhexansäure, 4-Phenoxybuttersäure oder 4-Cyclohexylbuttersäure, durch CoA-Ligase (EC 6.2.1.3 usw.) in CoA-Derivate überführt werden und durch die Enzymgruppe, die beim β-Oxidationssystem wirkt, in "D-3-Hydroxyacyl-CoA" umgewandelt werden, das direkt zu einem Monomersubstrat der PHA-Biosynthese wird.
Mit anderen Worten bedeutet dies, daß die mcl-3HA-Monomereinheit, die von Sacchariden oder mit dem TCC-Zyklus verbundenen organischen Säuren gebildet wird, durch eine äußerst vielstufige Enzymreaktion (das heißt indirekt) gebildet wird, wohingegen die mcl-3HA-Monomereinheiten ganz direkt aus den mcl-Alkanoaten erzeugt werden.
Hier wird die Entstehung von Acetyl-CoA beschrieben, das das Wachstum der Mikroorganismen vornimmt. Bei einem Verfahren, bei dem die mcl-Alkanoate zusätzlich zu den Alkanoaten für die Einführung der gewünschten Monomereinheiten gleichzeitig vorliegen, wird Acetyl-CoA über das β-Oxidationssystem dieser Alkanoate erzeugt. Im Vergleich mit Alkanoaten mit einem voluminösen Substituenten (Alkanoate mit Substituenten, wie einer Phenylgruppe, Phenoxygruppe oder Cyclohexylgruppe) haben die mcl-Alkanoate im allgemeinen vermutlich eine hervorragende Substrataffinität gegenüber der Enzymgruppe des β-Oxidationssystems, so daß das Acetyl-CoA durch das gleichzeitige Vorhandensein mit den mcl-Alkanoaten wirksam erzeugt wird. Folglich ist es für das Wachstum der Mikroorganismen vorteilhaft, Acetyl-CoA sowohl als Energiequelle als auch Kohlenstoffquelle zu verwenden.
Da die mcl-Alkanoate über das β-Oxidationssystem jedoch direkt in Monomereinheiten der PHA überführt werden, stellt es ein signifikantes Problem dar, daß eine große Menge der mcl-3HA-Monomereinheiten zusätzlich zu den gewünschten Monomereinheiten eingemischt ist.
Um dieses Problem zu lösen, ist es erwünscht, von den mcl-Alkanoaten verschiedene Substrate auszuwählen, die Acetyl-CoA oder eine Energiequelle und eine Kohlenstoffquelle wirksam zuführen können und das Verfahren anzuwenden, bei dem diese gleichzeitig mit den gewünschten Alkanoaten vorliegen. Wie bereits beschrieben ist es, obwohl Acetyl-CoA über den Fettsäuresyntheseweg in Monomereinheiten der PHA überführt werden kann, erforderlich, im Vergleich mit den mcl-Alkanoaten mehr mehrstufige Reaktionen zu durchlaufen, und es wird indirekt erzeugt. Durch geeignete Auswahl der Züchtungsbedingungen, wie Konzentration der Substrate, die Acetyl-CoA erzeugen können, ist es möglich, ein Herstellungsverfahren durchzuführen, bei dem die mcl-3HA im wesentlichen nicht oder nur wenig eingemischt sind.
Das Herstellungsverfahren, das in großem Umfang angewendet werden soll, umfaßt einen ersten Züchtungsschritt, bei dem nur das Wachstum der Mikroorganismen erfolgt, und einen zweiten Schritt, bei dem nur das gewünschte Alkanoat als Kohlenstoffquelle in das Medium gegeben wird. Da laut der Untersuchungen der Erfinder Acyl-CoA-Ligase, die ein Ausgangsenzym für die Überführung des erfindungsgemäßen Alkanoats in Acyl-CoA darstellt, ATP erfordert, wurden hierbei die Ergebnisse erzielt, daß das Herstellungsverfahren mit dem gleichzeitigen Vorhandensein mit Substraten, die auch im zweiten Schritt für die Mikroorganismen als Energiequelle nützlich sind, wirksamer war, womit sie zur vorliegenden Erfindung gelangten.
Nachfolgend werden Mikroorganismen, Züchtungsschritte und dergleichen beschrieben, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
(Mikroorganismen)
Als in der vorliegenden Erfindung verwendete Mikroorganismen können, wenn BzBA, BzVA, BzHxA, BzNpA oder BzOA als Ausgangsmaterial für die Herstellung der entsprechenden PHA verwendet werden können, die die vorstehend angegebenen 3HBzB, 3HBzV, 3HBzHx, 3HBzHp oder 3HBzO als Monomereinheit umfassen, irgendwelche Mikroorganismen verwendet werden. Innerhalb des Umfangs, der für die Zwecke der vorliegenden Erfindung erreicht werden kann, können ferner falls erforderlich mehrere Mikroorganismen gemischt und verwendet werden.
Die hier genannten Erfinder haben eine Prüfung von Mikroorganismen vorgenommen, die die entsprechenden PHA produzieren können, die die vorstehend beschriebenen 3HBzB, 3HBzV, 3HBzHx, 3HBzHp oder 3HBzO als Monomereinheit umfassen, wenn BzBA, BzVA, BzHxA, BzHpA oder BzOA als Substrat verwendet wird, und dieses in den Zellen speichern können. Als Ergebnis haben die hier genannten Erfinder festgestellt, daß aus dem Boden isolierte Mikroorganismen, die PHA produzieren können und die gewünschte Fähigkeit haben, der Stamm Pseudomonas cichorii H45, der Stamm Pseudomonas cichorii YN2, der Stamm Pseudomonas jessenii P161 und dergleichen sind. Der Stamm H45 wurde hier als Hinterlegungsnummer "FERM BP-7374", der Stamm YN2 als Hinterlegungsnummer "FERM BP-7375", und der Stamm P161 als Hinterlegungsnummer "FERM BP-7376" jeweils beim Deposition Center of Patent Microorganisms, Research Institute of Biotechnology and Industry, Agency of Industrial Science of Technology, Ministry of Economy and Industry hinterlegt, und diese sind Mikroorganismen, die in der japanischen Patentanmeldung Nr. 11-371863 beschrieben sind. Außerdem wurde eine internationale Hinterlegung dieser Mikroorganismen gemäß dem Budapester Vertrag vorgenommen. Die internationalen Zugangs- und Hinterlegungsnummern für diese Mikroorganismen sind wie folgt: Stamm H45: "FERM BP-7374", Stamm YN2: "FERM BP-7375" und Stamm P161: "FERM BP-7376".
Die bakteriologischen Eigenschaften der vorstehend angegebenen Stämme H45, YN2 und P161 werden wie folgt aufgeführt. Für den Stamm P161 ist die Basensequenz von 16SrRNA unter der Sequenznummer 1 aufgeführt.
< Bakteriologische Eigenschaften des Stamms H45 >
(1) Morphologische Eigenschaften

Form und Größe der Zelle: Stäbchen, 0,8 μm × 1,0 bis 1,2 μm
Polymorphie der Zelle: negativ
Beweglichkeit: beweglich
Sporulation: negativ
Gramfärbung: negativ
Kolonieform: kreisförmig; vollständiger glatter Rand; wenig konvex, glatte Oberfläche; glänzend, cremefarben

(2) Physiologische Eigenschaften:

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: oxidativ
Nitratreduktion: negativ
Indolproduktion: negativ
Säureproduktion aus Glucose: negativ
Arginin-Dihydrolase: negativ
Urease: negativ
Esculinhydrolyse: negativ
Gelatinehydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Erzeugung eines fluoreszierenden Pigmentes auf King-B-Agar: positiv
Wachstum unter 4 % NaCl: negativ
Akkumulation von Poly-β-hydroxybutyrat: negativ

(3) Substratassimilation

Glucose: positiv
L-Arabinose: negativ
D-Mannose: positiv
D-Manitol: positiv
N-Acetyl-D-glucosamin: positiv
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprinsäure: positiv
Adipinsäure: negativ
dl-Äpfelsäure: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv

< Bakteriologische Eigenschaften des Stamms YN2 >
(1) Morphologische Eigenschaften

Form und Größe der Zelle: Stäbchen, 0,8 μm × 1,5 bis 2,0 μm
Polymorphie der Zelle: negativ
Beweglichkeit: beweglich
Sporulation: negativ
Gramfärbung: negativ
Kolonieform: kreisförmig; vollständiger glatter Rand; wenig konvex, glatte Oberfläche; glänzend, durchscheinend

(2) Physiologische Eigenschaften:

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: oxidativ
Nitratreduktion: negativ
Indolproduktion: positiv
Säureproduktion aus Glucose: negativ
Arginin-Dihydrolase: negativ
Urease: negativ
Esculinhydrolyse: negativ
Gelatinehydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Erzeugung eines fluoreszierenden Pigmentes auf King-B-Agar: positiv
Wachstum unter 4 % NaCl: positiv (geringes Wachstum)
Akkumulation von Poly-β-hydroxybutyrat: negativ
Tween 80-Hydrolyse: positiv

(3) Substratassimilation

Glucose: positiv
L-Arabinose: positiv
D-Mannose: negativ
D-Manitol: negativ
N-Acetyl-D-glucosamin: negativ
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprinsäure: positiv
Adipinsäure: negativ
dl-Äpfelsäure: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv

< Bakteriologische Eigenschaften des Stamms P161 >
(1) Morphologische Eigenschaften

Form und Größe der Zelle: Sphären ∅ 0,6 μm Stäbchen 0,8 μm × 1,5 bis 2,0 μm
Polymorphie der Zelle: positiv (länglicher Typ)
Beweglichkeit: beweglich
Sporulation: negativ
Gramfärbung: negativ
Kolonieform: kreisförmig; vollständiger glatter Rand; wenig konvex, glatte Oberfläche; glänzend, schwach gelb

(2) Physiologische Eigenschaften:

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: oxidativ
Nitratreduktion: positiv
Indolproduktion: negativ
Säureproduktion aus Glucose: negativ
Arginin-Dihydrolase: positiv
Urease: negativ
Esculinhydrolyse: negativ
Gelatinehydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Erzeugung eines fluoreszierenden Pigmentes auf King-B-Agar: positiv

(3) Substratassimilation

Glucose: positiv
L-Arabinose: positiv
D-Mannose: positiv
D-Manitol: positiv
N-Acetyl-D-glucosamin: positiv
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprinsäure: positiv
Adipinsäure: negativ
dl-Äpfelsäure: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv

(Züchtungsschritt)
< Allgemeine Kultur >
Die gewünschten PHA können erzeugt werden, wenn diese Mikroorganismen in dem Medium gezüchtet werden, das Alkanoate für die Einführung der gewünschten Monomereinheit und Substrate für das Wachstum gemäß der vorliegenden Erfindung enthält. Solche PHA bestehen im allgemeinen nur aus der R-Form und sind isotaktische Polymere.
Bei der üblichen Züchtung von Mikroorganismen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von PHA verwendet werden, werden zum Beispiel die Herstellung von Stammzellstämmen, die Anzahl der Zellen, die für die Produktion der PHA und das Wachstum erforderlich ist, damit der aktive Zustand erhalten bleibt, und dergleichen, die Medien, die die erforderlichen Komponenten für das Wachstum der zu verwendenden Mikroorganismen enthalten, geeignet ausgewählt und verwendet. Es können zum Beispiel irgendwelche Arten von Medien, wie allgemeine natürliche Medien (Nährbouillon, Hefeextrakt usw.) und mit Nährstoffen ergänzte synthetische Medien verwendet werden, sofern sie keinen nachteiligen Einfluß auf das Wachstum und Überleben der Mikroorganismen haben.
Es können irgendwelche Züchtungsverfahren unter Verwendung einer Kultur, wie einer Flüssigkultur, einer Festkultur und dergleichen, angewendet werden, sofern die Mikroorganismen wachsen und die PHA produzieren können. Ferner können irgendwelche Arten verwendet werden: eine Batch-Kultur, eine Fedbatch-Kultur, eine halbkontinuierliche Kultur, eine kontinuierliche Kultur und dergleichen. Als Formen der Batch-Flüssigkultur schließen Verfahren für die Zuführung von Sauerstoff das Schütteln unter Verwendung eines Schüttelkolbens und das Belüften mit einer Schleudervorrichtung unter Verwendung eines Fermentors ein. Ein mehrstufiges Verfahren, bei dem diese Verfahren zu einer Vielzahl von Schritten verbunden sind, kann ebenfalls gewählt werden.
Wenn PHA, die 3HBzB, 3HBzV, 3HBzHx, 3HBzHp oder 3HBzO als Monomereinheit umfassen, unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Mikroorganismen erzeugt werden, können anorganische Medien und dergleichen verwendet werden, die zumindest das entsprechende BzBA, BzVA, BzHxA, BzHpA oder BzOA als Ausgangsmaterial für die Erzeugung von PHA und Kohlenstoffquellen für das Wachstum von Mikroorganismen enthalten. Als Kohlenstoffquellen für das Wachstum können Nährstoffe, wie Hefeextrakt, Polypepton und Fleischextrakt, verwendet werden, sie schließen ferner Saccharide, zum Beispiel Aldosen, wie Glycerinaldehyd, Erythrulose, Arabinose, Xylose, Glucose, Galactose, Mannose und Fructose, Alditole, wie Glycerol, Erythritol und Xylitol, Aldonsäure, wie Gluconsäure, Uronsäuren, wie Glucuronsäure und Galacturonsäure, Disaccharide, wie Maltose, Saccharose und Lactose, weitere organische Säuren oder deren Salze, wie Pyruvinsäure, Äpfelsäure, Citronensäure und Succinsäure, die als Zwischenprodukte beim TCC-Zyklus gebildet werden, Aminosäuren oder deren Salze, wie Glutaminsäure und dergleichen ein, und wenn die Verbindungen Acetyl-CoA ergeben können, ohne daß der β-Oxidationszyklus durchlaufen wird, können irgendwelche davon verwendet und geeignet als Substrate ausgewählt werden, die für die zu verwendenden Zellstämme nützlich sind. Wenn die Kombination wenig Gemisch von mcl-3HA aufweist, können mehrere Verbindungen ausgewählt und verwendet werden. Davon ist die Verwendung von bestimmten Sacchariden bevorzugt, stärker bevorzugt von mindestens einem, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Glucose, Fructose und Mannose besteht. Als Verfahren zur Produktion und Speicherung von PHA durch Mikroorganismen gibt es ein Verfahren, bei dem sie erst einmal ausreichend gezüchtet werden, danach werden die Zellen in das Medium übertragen, in dem eine Stickstoffquelle, wie Ammoniumchlorid, begrenzt ist, die Verbindungen, die Substrate der gewünschten Einheiten werden sollen, werden dem Medium zugesetzt, und die Zellen werden unter diesen Bedingungen weiter gezüchtet, wodurch die Produktivität in einigen Fällen verbessert wird. Insbesondere schließt es die Wahl eines mehrstufigen Verfahrens ein, bei dem die vorstehend beschriebenen Verfahren zu mehreren Schritten verbunden sind. Es gibt zum Beispiel ein Züchtungsverfahren, bei dem die Zellen, nachdem sie von der letzten Stufe des logarithmischen Wachstums in dem anorganischen Medium und dergleichen, das etwa 0,05 bis 5,0 % D-Glucose und etwa 0,01 bis 1,0 % BzBA, BzVA, BzHxA, BzHpA oder BzOA enthält, bis zum Zeitpunkt des stabilen Zustands gezüchtet werden, die Zellen durch Zentrifugentrennung und dergleichen gewonnen werden und diese ferner im anorganischen Medium gezüchtet werden, das etwa 0,01 bis 1,0 % BzBA, BzVA, BzHxA, BzHpA oder BzOA enthält, in dem die Stickstoffquellen eingeschränkt oder im wesentlichen nicht vorhanden sind. Als anorganische Medien, die für das vorstehend beschriebene Züchtungsverfahren verwendet werden sollen, kann irgendeines verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie die Komponenten, wie Phosphorquellen (zum Beispiel Phosphate usw.) und Stickstoffquellen (zum Beispiel Ammoniumsalze, Nitrat usw.) enthalten, durch die die Mikroorganismen wachsen können, wobei die Medien aus anorganischen Salzen zum Beispiel das Medium MSB, das Medium E (J. Biol. Chem., 218, 97-106 (1956)), das Medium M9 oder dergleichen einschließen können.
Die Zusammensetzung des Mediums M9, das hier in den erfindungsgemäßen Beispielen verwendet wurde, ist wie folgt:

Na₂HPO₄: 6,2 g

KH₂PO₄: 3,0 g

NaCl: 0,5 g

NH₄Cl: 1,0 g

(in 1 Liter Medium, pH = 7,0).
Für ein besseres Wachstum und eine bessere Produktion der PHA wird dem vorstehend beschriebenen Medium aus anorganischen Salzen vorzugsweise eine etwa 0,3 %-ige (V./V.) Lösung von Spurenkomponenten zugesetzt, wie sie nachstehend angegeben ist. [Lösung der Spurenkomponenten]

Nitrilotriessigsäure: 1,5

MgSO₄: 3,0

MnSO₄: 0,5

NaCl: 1,0

FeSO₄: 0,1

CaCl₂: 0,1

CoCl₂: 0,1

ZnSO₄: 0,1

CuSO₄: 0,1

AIK(SO₄)₂: 0,1

H₃BO₃: 0,1

Na₂MoO₄: 0,1

NiCl₂: 0,1

(in 1 Liter)
Die Züchtungstemperatur kann eine Temperatur sein, die ein gutes Wachstum der vorstehend angegebenen Zellstämme ermöglicht, es sind zum Beispiel 14 bis 40°C, vorzugsweise etwa 20 bis 35°C geeignet.
Als bestimmtes Beispiel können die gewünschten PHA nach der Züchtung im anorganischen Medium und dergleichen, das etwa 0,05 bis 5,0 % D-Glucose und etwa 0,01 bis 1,0 % BzBA, BzVA, BzHxA, BzHpA oder BzOA enthält, gefolgt von der Gewinnung der Zellen zum Zeitpunkt von der letzten Stufe des logarithmischen Wachstums bis zum stabilen Zustand herausgelöst werden, in dem die unerwünschten Monomereinheiten weniger eingemischt oder überhaupt nicht vorhanden sind. Solche PHA bestehen im allgemeinen nur aus der R-Form und sind isotaktische Polymere.
Es kann die gleiche Menge Hefeextrakt anstelle von D-Glucose zugegeben werden. Außerdem können Polypepton, organische Säuren (zum Beispiel Milchsäure, Pyruvinsäure, Citronensäure, Succinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure usw. und deren Salze), die mit dem TCC-Zyklus verbunden sind, und deren Kombination verwendet werden.
< Gewinnung der PHA >
Um die erfindungsgemäßen PHA aus den Kulturlösungen zu erhalten, können gewöhnlich durchgeführte Verfahren angewendet werden. Wenn die PHA in die Kulturlösung abgegeben werden, werden Verfahren zum Extrahieren aus der Kulturlösung und zur Reinigung angewendet, und wenn sie in den Zellen gespeichert werden, werden Verfahren zum Herauslösen aus den Zellen und zur Reinigung angewendet. Das einfachste Verfahren zur Gewinnung der PHA aus den gezüchteten Mikroorganismenzellen erfolgt durch Herauslösen mit organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform, was gewöhnlich durchgeführt wird, wohingegen gelegentlich Aceton statt Chloroform verwendet wird. In dem Fall, in dem die Verwendung von organischen Lösungsmitteln unwahrscheinlich ist, kann ein Verfahren angewendet werden, bei dem die PHA gewonnen werden, nachdem die von den PHA verschiedenen Zellkomponenten entfernt worden sind, indem mit oberflächenaktiven Mitteln, wie SDS, Enzymen, wie Lysozym, und chemischen Mitteln, wie EDTA, Natriumhypochlorit, Ammoniak und dergleichen behandelt wird.
Die erfindungsgemäße Züchtung der Mikroorganismen, die Produktion der PHA durch die erfindungsgemäßen Mikroorganismen und deren Speicherung in den Zellen und die Gewinnung der erfindungsgemäßen PHA aus den Zellen sind nicht auf die vorstehend beschriebenen Verfahren begrenzt.
Nachfolgend sind Beispiele aufgeführt. Darin basiert "%" auf dem Gewicht, wenn es nicht anders angegeben ist.
[Beispiel 1]
Der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzBA enthielt, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 48 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, danach erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzBA enthielt, ohne daß eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthalten war, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 42 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gereinigt und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 h bei 60°C gerührt, und das PHA wurde extrahiert. Nach dem Filtrieren der extrahierten Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm wurde es mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, und die konzentrierte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, ferner wurde nur der Niederschlag gewonnen, darauf folgte das Vakuumtrocknen, wodurch das PHA erhalten wurde.
Nach der Durchführung der Methanolyse des erhaltenen PHA nach einem herkömmlichen Verfahren wurde es unter Verwendung eines Gaschromatographie-Massenspektrometers (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode) analysiert, um die Methylesterverbindung der PHA-Monomereinheiten zu identifizieren. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das vorliegende PHA ein PHA ist, das 3HBzB als Monomereinheiten enthält, wie es in Tabelle 3 angegeben ist.
Tabelle 3
Erzeugung von PHA durch den Stamm Pseudomonas cichorii YN2
Dieses PHA wurde bei folgenden Meßbedingungen unter Verwendung eines NMR-Spektrometers (FT-NMR: Bruker DPX400) analysiert.
< Meßbedingungen >

Gemessenes Nuclid: ¹H
verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃ (in einer Kapillare verschlossenes TMS/CDCl₃ wurde als Bezug verwendet)
Resonanzfrequenz: ¹H = 400 MHz

Das ¹H-Spektrum ist in 1 gezeigt.
Anhand des in 1 dargestellten ¹H-NMR-Spektrums wurde festgestellt, daß ein PHA erhalten worden war, das Monomereinheiten der vorstehend angegebenen chemischen Formel [2] enthielt.
Außerdem wurde das Molekulargewicht des PHA durch Gel-Permeationschromatographie ausgewertet (GPC; Tosoh HLC-8020; Säule: Polymer Laboratory PL-Gel MIXED-C (5 μm); Lösungsmittel Chloroform; in Polystyrol umgerechnet), wodurch ein Mn = 18.000 und ein Mw = 42.000 erhalten wurden.
[Beispiel 2]
Der Stamm Pseudomonas jessenii P161 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzBA enthielt, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 48 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, danach erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzBA enthielt, ohne daß eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthalten war, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 42 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gereinigt und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 h bei 60°C gerührt, und das PHA wurde extrahiert. Nach dem Filtrieren der extrahierten Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm wurde es mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, und die konzentrierte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, ferner wurde nur der Niederschlag gewonnen, darauf folgte das Vakuumtrocknen, wodurch das PHA erhalten wurde.
Nach der Durchführung der Methanolyse des erhaltenen PHA nach einem herkömmlichen Verfahren wurde es unter Verwendung eines Gaschromatographie-Massenspektrometers (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode) analysiert, um die Methylesterverbindung der PHA-Monomereinheiten zu identifizieren. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das vorliegende PHA ein PHA ist, das 3HBzB als Monomereinheiten enthält, wie es in Tabelle 4 angegeben ist.
Tabelle 4
Erzeugung von PHA durch den Stamm Pseudomonas jessenii P161
[Beispiel 3]
Der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzVA enthielt, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 48 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, danach erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzVA enthielt, ohne daß eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthalten war, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 42 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gereinigt und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 h bei 60°C gerührt, und das PHA wurde extrahiert. Nach dem Filtrieren der extrahierten Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm wurde es mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, und die konzentrierte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, ferner wurde nur der Niederschlag gewonnen, darauf folgte das Vakuumtrocknen, wodurch das PHA erhalten wurde.
Nach der Durchführung der Methanolyse des erhaltenen PHA nach einem herkömmlichen Verfahren wurde es unter Verwendung eines Gaschromatographie-Massenspektrometers (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode) analysiert, um die Methylesterverbindung der PHA-Monomereinheiten zu identifizieren. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das vorliegende PHA ein PHA ist, das 3HBzV als Monomereinheiten enthält, wie es in Tabelle 5 angegeben ist.
Tabelle 5
Erzeugung von PHA durch den Stamm Pseudomonas cichorii YN2
Dieses PHA wurde bei folgenden Meßbedingungen unter Verwendung eines NMR-Spektrometers (FT-NMR: Bruker DPX400) analysiert.
< Meßbedingungen >

Gemessenes Nuclid: ¹H
verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃ (in einer Kapillare verschlossenes TMS/CDCl₃ wurde als Bezug verwendet)
Resonanzfrequenz: ¹H = 400 MHz, ¹³C = 100 MHz.

Die ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren sind in den 2 und 3 angegeben.
Anhand der in den 2 und 3 dargestellten ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren wurde festgestellt, daß ein PHA erhalten worden war, das Monomereinheiten der vorstehend angegebenen chemischen Formel [3] enthielt. Die Ergebnisse der Zuordnung (siehe chemische Formel [22]) sind in Tabelle 6 aufgeführt.
Tabelle 6
Zuordnung des ¹H- und ¹³C-NMR-Spektrums

d: Dublett, t: Triplett, m: Multiplett

Außerdem wurde das Molekulargewicht des PHA durch Gel-Permeationschromatographie ausgewertet (GPC; Tosoh HLC-8020; Säule: Polymer Laboratory PL-Gel MIXED-C (5 μm); Lösungsmittel Chloroform; in Polystyrol umgerechnet), wodurch ein Mn = 330.000 und ein Mw = 1.300.000 erhalten wurden.
[Beispiel 4]
Der Stamm Pseudomonas cichorii H45 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzVA enthielt, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 48 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, danach erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzVA enthielt, ohne daß eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthalten war, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 42 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gereinigt und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 h bei 60°C gerührt, und das PHA wurde extrahiert. Nach dem Filtrieren der extrahierten Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm wurde es mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, und die konzentrierte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, ferner wurde nur der Niederschlag gewonnen, darauf folgte das Vakuumtrocknen, wodurch das PHA erhalten wurde.
Nach der Durchführung der Methanolyse des erhaltenen PHA nach einem herkömmlichen Verfahren wurde es unter Verwendung eines Gaschromatographie-Massenspektrometers (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode) analysiert, um die Methylesterverbindung der PHA-Monomereinheiten zu identifizieren. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das vorliegende PHA ein PHA ist, das 3HBzV als Monomereinheiten enthält, wie es in Tabelle 7 angegeben ist.
Tabelle 7
Erzeugung von PHA durch den Stamm Pseudomonas cichorii H45
[Beispiel 5]
Der Stamm Pseudomonas jessenii P161 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzVA enthielt, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 46 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, danach erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzVA enthielt, ohne daß eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthalten war, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 41 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gereinigt und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 h bei 60°C gerührt, und das PHA wurde extrahiert. Nach dem Filtrieren der extrahierten Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm wurde es mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, und das Konzentrat wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, ferner wurde nur der Niederschlag gewonnen, darauf folgte das Vakuumtrocknen, wodurch das PHA erhalten wurde.
Nach der Durchführung der Methanolyse des erhaltenen PHA nach einem herkömmlichen Verfahren wurde es unter Verwendung eines Gaschromatographie-Massenspektrometers (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode) analysiert, um die Methylesterverbindung der PHA-Monomereinheiten zu identifizieren. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das vorliegende PHA ein PHA ist, das 3HBzV als Monomereinheiten enthält, wie es in Tabelle 8 angegeben ist.
Tabelle 8
Erzeugung von PHA durch den Stamm Pseudomonas jessenii P161
[Beispiel 6]
Der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzHxA enthielt, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 46 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, danach erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzHxA enthielt, ohne daß eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthalten war, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 47 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gereinigt und vakuumgetrocknet.
Dieses vakuumgetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 h bei 60°C gerührt, und das PHA wurde extrahiert. Nach dem Filtrieren der extrahierten Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm wurde es mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, und die konzentrierte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, ferner wurde nur der Niederschlag gewonnen, darauf folgte das Vakuumtrocknen, wodurch das PHA erhalten wurde.
Das erhaltene PHA wurde bei folgenden Meßbedingungen unter Verwendung eines NMR-Spektrometers (FT-NMR: Bruker DPX400) analysiert.
< Meßbedingungen >

Das ¹H-Spektrum ist in 4 gezeigt.
Anhand des in 4 dargestellten ¹H-NMR-Spektrums wurde festgestellt, daß ein PHA erhalten worden war, das Monomereinheiten der vorstehend angegebenen chemischen Formel [4] enthielt.
Nach der Durchführung der Methanolyse des erhaltenen PHA nach einem herkömmlichen Verfahren wurde es unter Verwendung eines Gaschromatographie-Massenspektrometers (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode) analysiert, um die Methylesterverbindung der PHA-Monomereinheiten zu identifizieren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 aufgeführt.
Tabelle 9
Erzeugung von Polyhydroxyalkanoaten durch den Stamm YN2
Anhand der vorstehenden Ergebnisse wurde bestätigt, daß das vorliegende PHA ein PHA ist, das 3HBzHx als Monomereinheiten enthält.
Außerdem wurde das Molekulargewicht des PHA durch Gel-Permeationschromatographie ausgewertet (GPC; Tosoh HLC-8020; Säule: Polymer Laboratory PL-Gel MIXED-C (5 μm); Lösungsmittel Chloroform; in Polystyrol umgerechnet), wodurch ein Mn = 24.000 und ein Mw = 62.000 erhalten wurden.
[Beispiel 7]
Der Stamm Pseudomonas cichorii H45 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzHxA enthielt, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 46 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, danach erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzHxA enthielt, ohne daß eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthalten war, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 47 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gereinigt und vakuumgetrocknet.
Dieses vakuumgetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 h bei 60°C gerührt, und die PHA wurden extrahiert. Nach dem Filtrieren der extrahierten Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm wurde es mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, und die konzentrierte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, ferner wurde nur der Niederschlag gewonnen, darauf folgte das Vakuumtrocknen, wodurch das PHA erhalten wurde.
Nach der Durchführung der Methanolyse des erhaltenen PHA nach einem herkömmlichen Verfahren wurde es unter Verwendung eines Gaschromatographie-Massenspektrometers (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode) analysiert, um die Methylesterverbindung der PHA-Monomereinheiten zu identifizieren. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das vorliegende PHA ein PHA ist, das 3HBzHx als Monomereinheiten enthält, wie es in Tabelle 10 angegeben ist.
Tabelle 10
Erzeugung von Polyhydroxyalkanoaten durch den Stamm H45
[Beispiel 8]
Der Stamm Pseudomonas jessenii P161 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzNxA enthielt, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 46 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, danach erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzNxA enthielt, ohne daß eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthalten war, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 47 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gereinigt und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 h bei 60 ° C gerührt, und das PHA wurde extrahiert. Nach dem Filtrieren der extrahierten Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm wurde es mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, und die konzentrierte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, ferner wurde nur der Niederschlag gewonnen, darauf folgte das Vakuumtrocknen, wodurch das PHA erhalten wurde.
Nach der Durchführung der Methanolyse des erhaltenen PHA nach einem herkömmlichen Verfahren wurde es unter Verwendung eines Gaschromatographie-Massenspektrometers (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode) analysiert, um die Methylesterverbindung der PHA-Monomereinheiten zu identifizieren. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das vorliegende PHA ein PHA ist, das 3HBzHx als Monomereinheiten enthält, wie es in Tabelle 11 angegeben ist.
Tabelle 11
Erzeugung von Polyhydroxyalkanoaten durch den Stamm P161
[Beispiel 9]
Der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzHpA enthielt, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 47 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, danach erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzHpA enthielt, ohne daß eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthalten war, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 43 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gereinigt und vakuumgetrocknet.
Dieses vakuumgetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 h bei 60°C gerührt, und das PHA wurde extrahiert. Nach dem Filtrieren der extrahierten Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm wurde es mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, und die konzentrierte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, ferner wurde nur der Niederschlag gewonnen, darauf folgte das Vakuumtrocknen, wodurch das PHA erhalten wurde.
Das erhaltene PHA wurde bei folgenden Meßbedingungen unter Verwendung eines NMR-Spektrometers (FT-NMR: Bruker DPX400) analysiert.
< Meßbedingungen >

Das ¹H-Spektrum ist in 5 gezeigt.
Anhand des in 5 dargestellten ¹H-NMR-Spektrums wurde festgestellt, daß ein PHA erhalten worden war, das Monomereinheiten der vorstehend angegebenen chemischen Formel [5] enthielt.
Nach der Durchführung der Methanolyse des erhaltenen PHA nach einem herkömmlichen Verfahren wurde es unter Verwendung eines Gaschromatographie-Massenspektrometers (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI- Methode) analysiert, um die Methylesterverbindung der PHA-Monomereinheiten zu identifizieren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 aufgeführt.
Tabelle 12
Erzeugung von Polyhydroxyalkanoaten durch den Stamm YN2
Anhand der vorstehenden Ergebnisse wurde bestätigt, daß das vorliegende PHA ein PHA ist, das 3HBzHp als Monomereinheiten enthält.
Außerdem wurde das Molekulargewicht der PHA durch Gel-Permeationschromatographie ausgewertet (GPC; Tosoh HLC-8020; Säule: Polymer Laboratory PL-Gel MIXED-C (5 μm); Lösungsmittel Chloroform; in Polystyrol umgerechnet), wodurch ein Mn = 23.000 und ein Mw = 53.000 erhalten wurden.
[Beispiel 10]
Der Stamm Pseudomonas cichorii H45 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzHpA enthielt, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 47 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, danach erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzHpA enthielt, ohne daß eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthalten war, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 43 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gereinigt und vakuumgetrocknet.
Dieses vakuumgetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 h bei 60°C gerührt, und das PHA wurde extrahiert. Nach dem Filtrieren der extrahierten Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm wurde es mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, und die konzentrierte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, ferner wurde nur der Niederschlag gewonnen, darauf folgte das Vakuumtrocknen, wodurch das PHA erhalten wurde.
Nach der Durchführung der Methanolyse des erhaltenen PHA nach einem herkömmlichen Verfahren wurde es unter Verwendung eines Gaschromatographie-Massenspektrometers (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode) analysiert, um die Methylesterverbindung der PHA-Monomereinheiten zu identifizieren. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das vorliegende PHA ein PHA ist, das 3HBzHp als Monomereinheiten enthält, wie es in Tabelle 13 angegeben ist.
Tabelle 13
Erzeugung von Polyhydroxyalkanoaten durch den Stamm H45
[Beispiel 11]
Der Stamm Pseudomonas jessenii P161 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzHpA enthielt, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 47 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, danach erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzHpA enthielt, ohne daß eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthalten war, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 43 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gereinigt und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 h bei 60°C gerührt, und das PHA wurde extrahiert. Nach dem Filtrieren der extrahierten Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm wurde es mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, und die konzentrierte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, ferner wurde nur der Niederschlag gewonnen, darauf folgte das Vakuumtrocknen, wodurch das PHA erhalten wurde.
Nach der Durchführung der Methanolyse des erhaltenen PHA nach einem herkömmlichen Verfahren wurde es unter Verwendung eines Gaschromatographie-Massenspektrometers (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode) analysiert, um die Methylesterverbindung der PHA-Monomereinheiten zu identifizieren. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das vorliegende PHA ein PHA ist, das 3HBzHp als Monomereinheiten enthält, wie es in Tabelle 14 angegeben ist.
Tabelle 14
Erzeugung von Polyhydroxyalkanoaten durch den Stamm P161
[Beispiel 12]
Der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzOA enthielt, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 47 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, danach erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzOA enthielt, ohne daß eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthalten war, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 43 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gereinigt und vakuumgetrocknet.
Dieses vakuumgetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 h bei 60°C gerührt, und das PHA wurde extrahiert. Nach dem Filtrieren der extrahierten Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm wurde es mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, und die konzentrierte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, ferner wurde nur der Niederschlag gewonnen, darauf folgte das Vakuumtrocknen, wodurch das PHA erhalten wurde.
Das erhaltene PHA wurde bei folgenden Meßbedingungen unter Verwendung eines NMR-Spektrometers (FT-NMR: Bruker DPX400) analysiert.
< Meßbedingungen >

Das ¹H-Spektrum ist in 6 gezeigt.
Anhand des in 6 dargestellten ¹H-NMR-Spektrums wurde festgestellt, daß ein PHA erhalten worden war, das Monomereinheiten der vorstehend angegebenen chemischen Formel [6] enthielt.
Nach der Durchführung der Methanolyse des erhaltenen PHA nach einem herkömmlichen Verfahren wurde es unter Verwendung eines Gaschromatographie-Massenspektrometers (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode) analysiert, um die Methylesterverbindung der PHA-Monomereinheiten zu identifizieren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 aufgeführt.
Tabelle 15
Erzeugung von Polyhydroxyalkanoaten durch den Stamm YN2
Anhand der vorstehenden Ergebnisse wurde bestätigt, daß das vorliegende PHA ein PHA ist, das 3HBzO als Monomereinheiten enthält.
Außerdem wurde das Molekulargewicht des PHA durch Gel-Permeationschromatographie ausgewertet (GPC; Tosoh HLC-8020; Säule: Polymer Laboratory PL-Gel MIXED-C (5 μm); Lösungsmittel Chloroform; in Polystyrol umgerechnet), wodurch ein Mn = 41.000 und ein Mw = 93.000 erhalten wurden.
[Beispiel 13]
Der Stamm Pseudomonas cichorii H45 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzOA enthielt, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 47 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, danach erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzOA enthielt, ohne daß eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthalten war, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 43 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gereinigt und vakuumgetrocknet.
Dieses vakuumgetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 h bei 60°C gerührt, und das PHA wurde extrahiert. Nach dem Filtrieren der extrahierten Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm wurde es mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, und die konzentrierte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, ferner wurde nur der Niederschlag gewonnen, darauf folgte das Vakuumtrocknen, wodurch das PHA erhalten wurde.
Nach der Durchführung der Methanolyse des erhaltenen PHA nach einem herkömmlichen Verfahren wurde es unter Verwendung eines Gaschromatographie-Massenspektrometers (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode) analysiert, um die Methylesterverbindung der PHA-Monomereinheiten zu identifizieren. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das vorliegende PHA ein PHA ist, das 3HBzO als Monomereinheiten enthält, wie es in Tabelle 16 angegeben ist.
Tabelle 16
Erzeugung von Polyhydroxyalkanoaten durch den Stamm H45
[Beispiel 14]
Der Stamm Pseudomonas jessenii P161 wurde in 200 ml des Mediums M9 geimpft, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzOA enthielt, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 47 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, danach erneut in 200 ml Medium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % BzOA enthielt, ohne daß eine Stickstoffquelle (NH₄Cl) enthalten war, darauf folgte eine Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/min bei 30°C. Nach 43 h wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gereinigt und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 h bei 60°C gerührt, und das PHA wurde extrahiert. Nach dem Filtrieren der Extraktlösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm wurde es mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, und die konzentrierte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, ferner wurde nur der Niederschlag gewonnen, darauf folgte das Vakuumtrocknen, wodurch das PHA erhalten wurde.
Nach der Durchführung der Methanolyse des erhaltenen PHA nach einem herkömmlichen Verfahren wurde es unter Verwendung eines Gaschromatographie-Massenspektrometers (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode) analysiert, um die Methylesterverbindung der PHA-Monomereinheiten zu identifizieren. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das vorliegende PHA ein PHA ist, das 3HBzO als Monomereinheiten enthält, wie es in Tabelle 17 angegeben ist.
Tabelle 17
Erzeugung von Polyhydroxyalkanoaten durch den Stamm P161
SEQUENZAUFSTELLUNG

Claims

Polyhydroxyalkanoat mit einer Zusammensetzung der Monomereinheit mit der folgenden Formel [1]: AxB(1–x) [1]wobei A zumindest eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [2] ist:
worin n eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist; und B zumindest eine Einheit ist, die aus Monomereinheiten der folgenden chemischen Formel [3]:
worin p eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist, und Monomereinheiten der folgenden chemischen Formel [4] ausgewählt ist:
worin q gleich 3 oder 5 ist; und x nicht kleiner als 0,01 und kleiner als 1 ist, mit der Maßgabe, daß die Zusammensetzung der Monomereinheit des Polyhydroxyalkanoats von denen gemäß Tabellen A, B, C, D, E und F verschieden ist: [Tabelle A]
[Tabelle B]
[Tabelle C]
[Tabelle D]
[Tabelle E]
[Tabelle F]
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, wobei die zumindest eine Monomereinheit der chemischen Formel [2] eine Monomereinheit einschließt, bei der n von 2 verschieden ist.
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die eine Monomereinheit oder die mehreren Monomereinheiten eine Monomereinheit der chemischen Formel [5] einschließt bzw. einschließen:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, wobei die eine Monomereinheit oder die mehreren Monomereinheiten eine Monomereinheit der chemischen Formel [6] einschließt bzw. einschließen:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die eine Monomereinheit oder die mehreren Monomereinheiten eine Monomereinheit der chemischen Formel [7] einschließt bzw. einschließen:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die eine Monomereinheit oder die mehreren Monomereinheiten eine Monomereinheit der chemischen Formel [8] einschließt bzw. einschließen:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die eine Monomereinheit oder die mehreren Monomereinheiten eine Monomereinheit der chemischen Formel [9] einschließt bzw. einschließen:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, wobei die Monomereinheiten eine Monomereinheit der chemischen Formel [6]:
und eine Monomereinheit der chemischen Formel [8] einschließen:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Monomereinheiten eine Monomereinheit der chemischen Formel (7]:
und eine Monomereinheit der chemischen Formel [9] einschließen:
Polyhydroxyalkanoat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Polyhydroxyalkanoat ein Zahlenmittel des Molekulargewichts von 10.000 bis 1.000.000 hat.
Verfahren zur Herstellung eines Polyhydroxyalkanoats, das einen Schritt umfaßt, bei dem in einem Benzoylalkansäure enthaltenden Medium ein zu Pseudomonas sp. gehörender Mikroorganismus gezüchtet wird, der unter Verwendung von Benzoylalkansäure ein Polyhydroxyalkanoat mit einer Zusammensetzung der Monomereinheit mit der folgenden Formel [1]: AxB(1–x) [1]aus der Benzoylalkansäure synthetisieren kann, wobei A zumindest eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [2] ist:
worin n eine ganze Zahl von nicht weniger als 1 ist; und B zumindest eine Einheit ist, die aus Monomereinheiten der folgenden chemischen Formel [3]:
worin p eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist, und Monomereinheiten der folgenden chemischen Formel [4] ausgewählt ist:
worin q gleich 3 oder 5 ist; und x nicht kleiner als 0,01 bis kleiner als 1 ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Benzoylalkansäure eine Benzoylalkansäure der folgenden chemischen Formel [10] ist:
worin n eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist, und das Polyhydroxyalkanoat ein Polyhydroxyalkanoat ist, das eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [11] umfaßt:
worin m zumindest einen oder mehrere Werte hat, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus n, n – 2, n – 4 und n – 6 besteht, und eine ganze Zahl von nicht weniger als 1 ist.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei der Schritt des Züchtens des Mikroorganismus ein Schritt ist, bei dem der Mikroorganismus, der unter Verwendung von Benzoylalkansäure das Polyhydroxyalkanoat mit der Zusammensetzung der Monomereinheit produzieren kann, die mit der Formel [1] angegeben wird, in einem Medium gezüchtet wird, das Benzoylalkansäure und ein Saccharid enthält.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Züchten des Mikroorganismus in einem Schritt unter Verwendung eines Mediums erfolgt, das die Benzoylalkansäure und das Saccharid enthält.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Züchten des Mikroorganismus in zumindest zwei Schritten erfolgt, indem eine Züchtung in einem Medium vorgenommen wird, das die Benzoylalkansäure und das Saccharid enthält, und danach in einem Medium gezüchtet wird, das die Benzoylalkansäure und das Saccharid enthält und in dem die Stickstoffquelle eingeschränkt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei das Saccharid zumindest eins ist, das aus der Gruppe von Glucose, Fructose und Mannose ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, wobei der Mikroorganismus zumindest ein Stamm ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Pseudomonas cichorii H45, FERM BP-7374; Pseudomonas cichorii YN2, FERM BP-7375; und Pseudomonas jessenii P161, FERM BP-7376 besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei der Schritt des Züchtens des Mikroorganismus ein Schritt ist, bei dem ein Mikroorganismus, der unter Verwendung von 4-Benzoylbuttersäure Polyhydroxyalkanoat produzieren kann, das eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [5] umfaßt:
in einem Medium gezüchtet wird, das 4-Benzoylbuttersäure der folgenden chemischen Formel [12] enthält:
und wobei das erzeugte Polyhydroxyalkanoat eine Monomereinheit der chemischen Formel [5] umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei der Schritt des Züchtens des Mikroorganismus ein Schritt ist, bei dem ein Mikroorganismus, der unter Verwendung von 5-Benzoylvaleriansäure Polyhydroxyalkanoat produzieren kann, das eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [6] umfaßt:
in einem Medium gezüchtet wird, das 5-Benzoylvaleriansäure der folgenden chemischen Formel [13] enthält:
und wobei das erzeugte Polyhydroxyalkanoat eine Monomereinheit der chemischen Formel [6] umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei der Schritt des Züchtens des Mikroorganismus ein Schritt ist, bei dem ein Mikroorganismus, der unter Verwendung von 6-Benzoylhexansäure Polyhydroxyalkanoat produzieren kann, das eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [7] umfaßt:
in einem Medium gezüchtet wird, das 6-Benzoylhexansäure der folgenden chemischen Formel [14] enthält:
und wobei das erzeugte Polyhydroxyalkanoat eine Monomereinheit der chemischen Formel [7] umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei der Schritt des Züchtens des Mikroorganismus ein Schritt ist, bei dem ein Mikroorganismus, der unter Verwendung von 7-Benzoylheptansäure Polyhydroxyalkanoat produzieren kann, das eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [8] umfaßt:
in einem Medium gezüchtet wird, das 7-Benzoylheptansäure der folgenden chemischen Formel [15] enthält:
und wobei das erzeugte Polyhydroxyalkanoat eine Monomereinheit der chemischen Formel [8] umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei der Schritt des Züchtens des Mikroorganismus ein Schritt ist, bei dem ein Mikroorganismus, der unter Verwendung von 8-Benzoyloctansäure Polyhydroxyalkanoat produzieren kann, das eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [9] umfaßt:
in einem Medium gezüchtet wird, das 8-Benzoyloctansäure der folgenden chemischen Formel [16] enthält:
und wobei das erzeugte Polyhydroxyalkanoat die Monomereinheit der chemischen Formel [9] umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei der Schritt des Züchtens des Mikroorganismus ein Schritt ist, bei dem ein Mikroorganismus, der unter Verwendung von 7-Benzoylheptansäure Polyhydroxyalkanoat produzieren kann, das Monomereinheiten der folgenden chemischen Formel [6]:
und der folgenden chemischen Formel [8] umfaßt:
in einem Medium gezüchtet wird, das 7-Benzoylheptansäure der folgenden chemischen Formel [15] enthält:
und wobei das erzeugte Polyhydroxyalkanoat Monomereinheiten der chemischen Formeln [6] und [8] umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei der Schritt des Züchtens des Mikroorganismus ein Schritt ist, bei dem ein Mikroorganismus, der unter Verwendung von 8-Benzoyloctansäure Polyhydroxyalkanoat produzieren kann, das Monomereinheiten der folgenden chemischen Formel [7]:
und der folgenden chemischen Formel [9] umfaßt:
in einem Medium gezüchtet wird, das 8-Benzoyloctansäure der folgenden chemischen Formel [16] enthält:
und wobei das erzeugte Polyhydroxyalkanoat Monomereinheiten der chemischen Formeln [7] und [9] umfaßt.