DE60116810T2

DE60116810T2 - Polyhydroxyalkanoat enthaltend 3-Hydroxythienyl-Alkansäure als Monomer und ein Verfahren zur Herstellung desselben

Info

Publication number: DE60116810T2
Application number: DE60116810T
Authority: DE
Inventors: Tsutomu Ohta-ku Honma; Tetsuya Ohta-ku Yano; Shin Ohta-ku Kobayashi; Takeshi Ohta-ku Imamura; Takashi Ohta-ku Kenmoku; Shinya Ohta-ku Kozaki
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2000-02-29
Filing date: 2001-02-28
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2021-03-01
Also published as: KR20010085689A; EP1130043A3; DE60116810D1; KR100447966B1; EP1130043A2; US6479621B2; EP1130043B1; US20020065389A1

Description

ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Polyhydroxyalkanaot (das hier nachstehend als PHA abgekürzt werden kann). Sie betrifft auch ein sehr effektives Verfahren zur Herstellung eines solchen PHA, wobei Mikroorganismen verwendet werden, die PHA produzieren und in der Zelle speichern können.
Bisher wurde von vielen Mikroorganismen berichtet, daß sie Poly-3-hydroxybuttersäure (die als PHB abgekürzt werden kann) oder andere PHA produzieren und diese in der Zelle speichern ("Biodegradation Plastic Handbook", Biodegradable Plastic Research Association, NTS, Co. Ltd., S. 178–197). Wie im Falle herkömmlicher Kunststoffe können diese Polymere für die Herstellung verschiedener Arten von Produkten durch Verarbeiten aus der Schmelze und dergleichen verwendet werden. Da sie zudem biologisch abbaubar sind, werden sie im Gegensatz zu vielen herkömmlichen synthetischen Polymeren in der Natur vorteilhafterweise durch Mikroorganismen vollständig abgebaut und bleiben nicht in der Umwelt zurück, um eine Verschmutzung hervorzurufen. Sie weisen auch eine gute Biokompatibilität auf, und es lassen sich Anwendungen, wie als weiche medizinische Materialien und dergleichen, erwarten.
Es ist bekannt, daß diese PHA in Abhängigkeit von der Art der Mikroorganismen, die bei deren Produktion verwendet wurden, und der Zusammensetzung des Kulturmediums, den Kulturbedingungen und dergleichen verschiedene Zusammensetzungen und Strukturen aufweisen können, und bis jetzt wurden Untersuchungen zur Kontrolle dieser Zusammensetzungen und Strukturen grundsätzlich durchgeführt, um die Eigenschaften des PHA zu verbessern.
Es wurde zum Beispiel berichtet, daß Alcaligenes eutropus H 16, ATCC Nr. 17639 und dessen Mutanten Copolymere von 3-Hydroxybuttersäure (die hier nachstehend als 3HB abgekürzt werden kann) und 3-Hydroxyvaleriansäure (die hier nachstehend als 3HV abgekürzt werden kann) in verschiedenen Zusammensetzungsverhältnissen produzieren können, indem während deren Züchtung die Kohlenstoffquellen geändert werden (japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 6-15604, japanische Patenveröffentlichung (Kokoku) Nr. 7-14352, japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 8-19227).
In der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 5-74492 wird ein Verfahren offenbart, bei dem ein Copolymer von 3HB und 3HV erzeugt wird, indem Methylobacterium sp., Paracoccus sp., Alcaligenes sp. und Pseudomonas sp. mit einem primären Alkohol mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen in Kontakt gebracht werden.
In der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 5-93049 und der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 7-265065 wird offenbart, daß binäre Copolymere von 3HB und 3-Hydroxyhexansäure (die hier nachstehend als 3HHx abgekürzt werden kann) erzeugt werden, wenn Aeromonas caviae mit Oleinsäure oder Olivenöl als Kohlenstoffquellen gezüchtet wird.
In der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 9-191893 wird offenbart, daß Comamonas acidovoranas IFO 13852 durch Züchtung unter Verwendung von Gluconsäure und 1,4-Butandiol als Kohlenstoffquellen Polyester mit 3HB und 4-Hydroxybuttersäure als Monomereinheit produziert.
Gegenwärtig werden auch bei PHA intensive Untersuchungen durchgeführt, das aus 3-Hydroxyalkanoat (das hier nachstehend als 3HA abgekürzt werden kann) mit einer mittleren Kettenlänge (als mcl bezeichnet) mit bis zu etwa 12 Kohlenstoffatomen besteht. Die Synthesewege des PHA können allgemein in zwei Arten unterteilt werden, und bestimmte Beispiele davon sind nachfolgend in den Punkten (1) und (2) dargestellt.
(1) Synthese unter Anwendung der β-Oxidation
Im japanischen Patent Nr. 2642937 wird offenbart, daß PHA mit einer Monomereinheit aus 3-Hydroxyalkanoat mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen erzeugt wird, wenn Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 acyclische aliphatische Kohlenwasserstoff als Kohlenstoffquellen zugesetzt werden. In Appl. Environ. Microbiol, 58 (2), 746 (1992) wird auch berichtet, daß Pseudomonas resinovorans mit Octansäure als einziger Kohlenstoffquelle Polyester mit 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyhexansäure, 3-Hydroxyoctansäure und 3-Hydroxydecansäure (Mengenverhältnis 1 : 15 : 75 : 9) als Monomereinheit erzeugt und mit Hexansäure als einziger Kohlenstoffquelle Polyester mit 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyhexansäure, 3-Hydroxyoctansäure und 3-Hydroxydecansäure (Mengenverhältnis 8 : 62 : 23 : 7) als Monomereinheit erzeugt. Hier wird angenommen, daß die 3HA-Monomereinheit, die eine größere Kettenlänge als die Stammfettsäure hat, über den Fettsäuresyntheseweg erzeugt wird, der unter (2) beschrieben ist.
(2) Synthese auf dem Fettsäuresyntheseweg
In Int. J. Biol. Macrobiol., 16 (3), 119 (1994) wird berichtet, daß der Stamm Pseudomonas sp. 61-3 mit Natriumgluconat als einziger Kohlenstoffquelle Polyester mit 3-Hydroxyalkansäuren, wie 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyhexansäure, 3-Hydroxyoctansäure, 3-Hydroxydecansäure und 3-Hydroxydodecansäure, und 3-Hydroxyalkensäuren, wie 3-Hydroxy-5-cis-decensäure und 3-Hydroxy-5-cis-dodecensäure, als Monomereinheit produziert.
Die Biosynthese von PHA erfolgt übrigens gewöhnlich durch PHA-Synthase, wobei als Matrix "D-3-Hydroxyacyl-CoA" verwendet wird, das in Zellen als Zwischenprodukte verschiedener Stoffwechselwege produziert wird.
"CoA" steht hier für "Coenzym A". Wie im vorstehend aufgeführten Stand der Technik unter (1) beschrieben, wird die Biosynthese von PHA, wenn Fettsäuren, wie Octansäure und Nonansäure als Kohlenstoffquellen verwendet werden, mit "D-3-Hydroxyacyl-CoA" durchgeführt, das im "β-Oxidationszyklus" als Ausgangssubstanz produziert wird.
Nachfolgend sind Reaktionen aufgeführt, durch die PHA über den "β-Oxidationszyklus" biosynthetisiert wird.
Wie im vorstehend aufgeführten Stand der Technik unter (2) beschrieben, wird die Biosynthese andererseits, wenn PHA unter Verwendung von Sacchariden, wie Glucose, biosynthetisiert wird, mit "D-3-Hydroxyacyl-CoA" durchgeführt, das durch Umwandlung aus "D-3-Hydroxyacyl-ACP" erzeugt wurde, das im "Fettsäuresyntheseweg" als Ausgangssubstanz erzeugt wird.
"ACP" steht hier für "Acyl-Trägerprotein".
Wie bereits beschrieben, ist übrigens jedes PHA, das vorstehend unter (1) und (2) synthetisiert worden ist, ein PHA, das aus einer Monomereinheit mit Alkylgruppen an der Seitenkette besteht, das heißt ein "übliches PHA". In Anbetracht einer umfangreichen Verwendung eines Mikroorganismus, der ein PHA wie dieses produzieren kann, zum Beispiel bei der Verwendung als funktionelle Polymere, wird jedoch erwartet, daß ein PHA sehr vorteilhaft ist, bei dem in die Seitenkette von Alkylgruppen verschiedene Substituenten (zum Beispiel Phenylgruppen) eingeführt worden sind. Zu Beispielen anderer Substituenten gehören ungesättigte Kohlenwasserstoffe, Estergruppen, Allylgruppen, Cyanogruppen, Halogenkohlenwasserstoffe und Epoxid.
Zur Synthese von PHA, in das solche Substituenten eingeführt sind (hier nachstehend falls erforderlich als "unübliches PHA" bezeichnet) findet man zum Beispiel in bezug auf die Synthese unter Anwendung der β-Oxidation in Macromolecules, 24, S. 5256–5260 (1991) einen Bericht zu PHA mit Arylgruppen und dergleichen. Insbesondere wird berichtet, daß Pseudomonas oleovorans 160 mg PHA pro Liter Kulturmedium produziert (der auf die Zelle bezogene Anteil des Trockengewichts beträgt 31,6 %), das als Monomereinheit 3HV, 3-Hydroxyheptansäure, 3-Hydroxynonansäure, 3-Hydroxyundecansäure und 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure (die hier nachstehend als 3HPV abgekürzt werden kann) in einem Mengenverhältnis von 0,6 : 16,0 : 41,1 : 1,7 : 40,6 enthält, wobei 5-Phenylvaleriansäure (die als PVA abgekürzt werden kann) und Nonansäure verwendet werden (Molverhältnis 2 : 1 und Gesamtkonzentration 10 mMol/l), und 200 mg PHA pro Liter Kulturmedium produziert (der auf die Zellmasse bezogene Anteil des Trockengewichts beträgt 39,2 %), das als Monomereinheit 3HHx, 3-Hydroxyoctansäure, 3-Hydroxydecansäure und 3HPV in einem Mengenverhältnis von 7,3 : 64,5 : 3,9 : 24,3 enthält, wobei PVA und Octansäure verwendet werden (Molverhältnis 1 : 1 und Gesamtkonzentration 10 mMol/l). Anhand der Tatsache, daß in diesem Bericht Nonansäure und Octansäure verwendet werden, wird angenommen, daß das PHA grundsätzlich über die β-Oxidation synthetisiert wird.
Damit in Zusammenhang stehende Beschreibungen findet man auch in Macromol. Chem., 191, 1957–1965 (1990) und Chirality, 3, 492–494 (1991), und es wird festgestellt, daß die Änderung der Eigenschaften des Polymers wahrscheinlich durch das enthaltene 3HPV hervorgerufen wird.
Wie vorstehend beschrieben, wurden bei Mikroorganismen, die PHA produzieren können, jene mit unterschiedlichen Zusammensetzungen und Strukturen erhalten, indem die Arten der für deren Produktion verwendeten Mikroorganismen, die Zusammensetzungen der Kultur, die Kulturbedingungen und dergleichen geändert wurden, sie können jedoch in Hinblick auf die Eigenschaften noch immer nicht angemessen sein, wenn deren Verwendung als Kunststoffe in Betracht gezogen wird. Um den Anwendungsbereich eines Mikroorganismus, der PHA produzieren kann, noch mehr zu erweitern, ist es wichtig, die Verbesserung der Eigenschaften noch stärker in Betracht zu ziehen, und für diesen Zweck sind die Erforschung und Entwicklung einer PHA enthaltenden Monomereinheit mit mannigfaltigeren Strukturen, von Verfahren zu deren Herstellung und von Mikroorganismen, die das gewünschte PHA wirksam produzieren können, wesentlich.
Bei PHA, bei dem Substituenten in die Seitenkette eingeführt sind (unübliches PHA), wie es vorstehend beschrieben ist, werden die eingeführten Substituenten andererseits entsprechend der gewünschten Eigenschaften und dergleichen ausgewählt, wodurch auch die Entwicklung als "funktionelle Polymere" erwartet werden kann, die sehr nützliche Funktionen und Eigenschaften haben, die sich durch die Eigenschaften der eingeführten Substituenten und dergleichen ergeben, und die Erforschung und Entwicklung eines hervorragenden PHA, das eine solche Funktionalität und biologische Abbaubarkeit ermöglicht, so daß sie untereinander kompatibel sind, von Verfahren zu deren Herstellung und von Mikroorganismen, die das gewünschte PHA wirksam produzieren können, stellen ebenfalls wichtige Herausforderungen dar.
Zu anderen Beispielen von PHA, bei dem diese Substituenten in die Seitenkette eingeführt sind, gehören PHA mit Phenylgruppen oder Phenoxygruppen an der Seitenkette.
Als weiteres Beispiel von Phenylgruppen wird in Macromolecules, 29, 1762–1766 (1996) berichtet, daß Pseudomonas oleovorans durch Züchtung auf einem Medium, das 5-(4-Tril)valeriansäure (5-(4-Methylphenyl)valeriansäure) enthält, PHA produziert, das 3-Hydroxy-5-(4-tril)valeriansäure als Monomer aufweist.
Außerdem wird in Macromolecules, 32, 2889–2895 (1999) berichtet, daß Pseudomonas oleovorans durch Züchtung auf einem Medium, das 5-(2,4-Dinitrophenyl)valeriansäure und Nonansäure enthält, PHA produziert, das 3-Hydroxy-5-(2,4-dinitrophenyl)valeriansäure und 3-Hydroxy-5-(4-nitrophenyl)valeriansäure als Monomereinheit aufweist.
Als ein Beispiel für Phenoxygruppen wird in Macromol. Chem. Phys., 195, 1665–1672 (1994) auch berichtet, daß Pseudomonas oleovorans aus 11-Phenoxyundecansäure PHA produziert, das 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure und 3-Hydroxy-9-phenoxynonansäure als Einheiten enthält.
In Macromolecules, 29, 3432–3435 (1996) wird auch berichtet, daß Pseudomonas oleovorans aus 6-Phenoxyhexansäure PHA produziert, das 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure und 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure als Einheiten enthält, aus 8-Phenoxyoctansäure PHA produziert, das 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure, 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure und 3-Hydroxy-8-phenoxyoctansäure als Einheiten enthält, und aus 11-Phenoxyundecansäure PHA produziert, das 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure und 3-Hydroxy-7-phenoxyheptansäure als Einheiten enthält. Die Ausbeuten der Polymere sind diesem Bericht entnommen und nachfolgend aufgeführt.
In Can. J. Microbiol., 41, 32–43 (1995) wird zudem berichtet, daß PHA, das 3-Hydroxy-p-cyanophenoxyhexansäure oder 3-Hydroxy-p-nitrophenoxyhexansäure als Monomereinheit enthält, erfolgreich mit Octansäure und p-Cyanophenoxyhexansäure oder p-Nitrophenoxyhexansäure als Ausgangsmaterial erzeugt wird, wenn Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 und Pseudomonas putida KT 2442 verwendet werden.
Im japanischen Patent Nr. 2989175 sind Verfahren zur Erzeugung eines Homopolymers, das aus Einheiten von 3-Hydroxy-5-(monofluorphenoxy)pentanoat (das hier nachstehend als 3H5(MFP)P abgekürzt werden kann) oder Einheiten aus 3-Hydroxy-5-(difluorphenoxy)pentanoat (das hier nachstehend als 3H5(DFP)P abgekürzt werden kann) besteht, und eines Copolymers, das zumindest 3H5(MFP)P-Einheiten oder 3H5(DFP)P-Einheiten enthält, Pseudomonas putida für die Synthese dieser Polymere und die vorstehend beschriebenen Polymere unter Verwendung von Pseudomonas sp. beschrieben.
Diese Produktionen erfolgen über eine "Zweistufenkultur", wie es nachstehend beschrieben ist.
Kulturzeit: erste Stufe 24 Stunden; zweite Stufe 96 Stunden.
Die Kohlenstoffquellen und die in den entsprechenden Stufen erhaltenen Polymere sind nachstehend aufgeführt.
(1) Erhaltenes Polymer: 3H5(MFP)P-Homopolymer

Kohlenstoffquellen in der ersten Stufe: Citronensäure, Hefeextrakt
Kohlenstoffquelle in der zweiten Stufe: Monofluorphenoxyundecansäure

(2) Erhaltenes Polymer: 3H5(DFP)P-Homopolymer

Kohlenstoffquellen in der ersten Stufe: Citronensäure, Hefeextrakt
Kohlenstoffquelle in der zweiten Stufe: Difluorphenoxyundecansäure

(3) Erhaltenes Polymer: 3H5(MFP)P-Copolymer

Kohlenstoffquellen in der ersten Stufe: Octansäure oder Nonansäure und Hefeextrakt
Kohlenstoffquelle in der zweiten Stufe: Monofluorphenoxyundecansäure

(4) Erhaltenes Polymer: 3H5(DFP)P-Copolymer

Kohlenstoffquellen in der ersten Stufe: Octansäure oder Nonansäure und Hefeextrakt
Kohlenstoffquelle in der zweiten Stufe: Difluorphenoxyundecansäure

Für diesen Effekt kann eine Fettsäure mit mittlerer Kettenlänge in Erscheinung treten, die Substituenten aufweist, so daß ein Polymer erhalten wird, das Phenoxygruppen mit Kettenenden aufweist, die mit 1 bis 2 Fluoratomen substituiert sind, und es kann Stereoregularität und Wasserabweisungsvermögen verliehen werden, wobei hohe Schmelzpunkte und eine gute Verarbeitbarkeit erhalten bleiben.
Es wird auch erwartet, daß PHA, das in der Monomereinheit Cyclohexylgruppen enthält, Eigenschaften des Polymers zeigt, die sich von denen eines PHA unterscheiden, das übliche aliphatische Hydroxyalkansäure als Einheiten enthält, und von einem Beispiel zu dessen Herstellung mittels Pseudomonas oleovorans ist berichtet worden (Macromolecules, 30, 1611–1615 (1997)).
Laut diesem Bericht wurde, wenn Pseudomonas oleovorans in einem Medium gezüchtet wurde, in dem Nonansäure (die hier nachstehend als NA abgekürzt werden kann) und Cyclohexylbuttersäure (die hier nachstehend als CHBA abgekürzt werden kann) oder Cyclohexylvaleriansäure (die hier nachstehend als CHVA abgekürzt werden kann) gleichzeitig vorhanden sind, PHA erhalten, das Einheiten, die Cyclohexylgruppen enthalten, und von Nonansäure stammende Einheiten enthält (das jeweilige Verhältnis ist nicht bekannt).
In bezug auf dessen Ausbeute und dergleichen wurde berichtet, daß das Mengenverhältnis zwischen CHBA und NA bei einer Gesamtkonzentration von 20 mMol/l geändert wurde, wodurch Ergebnisse erhalten wurden, wie sie nachstehend aufgeführt sind.

CDW: Trockengewicht der Zellen (mg/l)
PDW: Trockengewicht der Polymere (mg/l)
Ausbeute: PDW/CDW (%)

In diesem Beispiel reicht jedoch die Ausbeute der Polymere für das Kulturmedium nicht, und das erhaltene PHA selbst weist auch eine von Nonansäure stammende aliphatische Hydroxyalkansäureeinheit auf, die gleichzeitig in dessen Monomereinheit vorhanden ist.
Wenn PHA mit verschiedenen, in die Seitenkette eingeführten Substituenten auf diese Weise unter Verwendung von Mikroorganismen erzeugt werden soll, werden Verfahren angewendet, bei denen Alkanoat mit einzuführenden Substituenten nicht nur als Polymermaterial sondern auch als Kohlenstoffquelle für die Züchtung verwendet wird, so wie es in den aufgeführten Beispielen von Pseudomonas oleovorans vorkommt, die bereits beschrieben worden sind.
Bei dem Verfahren, bei dem Alkanoat mit einzuführenden Substituenten nicht nur als Polymermaterial sondern auch als Kohlenstoffquelle für die Züchtung verwendet wird, ist jedoch die Bereitstellung einer Energiequelle auf der Basis der Produktion von Acetyl-CoA über die β-Oxidation aus dem Alkanoat zu erwarten, und bei diesem Verfahren kann Acetyl-CoA nicht über die β-Oxidation produziert werden, wenn nicht eine Ausgangssubstanz mit einer bestimmten Kettenlänge verwendet wird, und das Alkanoat, das als Ausgangsmaterial für das PHA verwendet werden kann, ist somit begrenzt, was ein wesentliches Problem darstellt. Da kürzlich Matrizes mit einer um zwei Methylenketten verkürzten Kettenlänge über die β-Oxidation produziert worden sind und diese als Monomereinheit des PHA eingeführt werden, ist das synthetisierte PHA auch oft ein Copolymer, das aus einer Monomereinheit mit Kettenlängen besteht, die sich durch zwei Methylenketten unterscheiden. Im vorstehend aufgeführten Beispiel wird ein Copolymer produziert, das aus drei Arten von Monomereinheiten, 3-Hydroxy-8-phenoxyoctansäure, die von 8-Phenoxyoctansäure abgeleitet ist, und 3-Hydroxy-6-phenoxyhexansäure und 3-Hydroxy-4-phenoxybuttersäure, besteht, die Nebenprodukte sind, die von Stoffwechselprodukten stammen. In diesem Zusammenhang ist die Anwendung dieses Verfahrens im Falle der Herstellung eines PHA, das aus einer einzigen Monomereinheit besteht, äußerst problematisch. Bei Verfahren, die auf der Bereitstellung von Energiequellen auf der Basis der Produktion von Acetyl-CoA über die β-Oxidation basieren, ist zudem das Wachstum der Mikroorganismen langsam, und somit ist für die Synthese des PHA viel Zeit erforderlich, und die Ausbeuten des synthetisierten PHA nehmen ab, was ebenfalls ein wesentliches Problem darstellt.
Folglich werden Verfahren als wirksam angesehen und im allgemeinen angewendet, bei denen Mikroorganismen auf einem Medium gezüchtet werden, in dem zusätzlich zum Alkanoat mit einzuführenden Substituenten Fettsäuren mit mittlerer Kettenlänge, wie Octansäure und Nonansäure usw., als Kohlenstoffquelle für die Züchtung vorliegen und das PHA dann herausgelöst wird.
Nach Ansicht der hier genannten Erfinder hat jedoch das über den β-Oxidationsweg synthetisierte PHA, bei dem Fettsäuren mit mittlerer Kettenlänge, wie Octansäure und Nonansäure usw. als Kohlenstoffquelle für die Züchtung verwendet werden, eine geringere Reinheit, und 50 % oder mehr der erhaltenen Polymere sind eine mcl-3HA-Monomereinheit, die Monomereinheiten, die von der Kohlenstoffquelle für die Züchtung (zum Beispiel 3-Hydroxyoctansäure und 3-Hydroxynonansäure) stammen, das heißt Einheiten des "üblichen PHA" sind. Diese mcl-3HA-Einheiten sind im Falle einer einfachen Zusammensetzung bei Raumtemperatur klebrige Polymere, und wenn sie im durch die vorliegende Erfindung bezweckten PHA gleichzeitig in großer Menge vorliegen, wird der Umwandlungspunkt zweiter Ordnung (Tg) des Polymers deutlich verringert. Wenn die Eigenschaften eines harten Polymers bei Raumtemperatur erzielt werden sollen, ist folglich das gleichzeitige Vorhandensein der mcl-3HA-Monomereinheit unerwünscht. Bei einer Heteroseitenkettenstruktur wie dieser ist auch bekannt, daß sie die Wechselwirkung behindert, die sich von der intramolekularen oder intermolekularen Seitenkettenstruktur ableitet und einen deutlichen Einfluß auf die Kristallinität und Orientierung hat. Für eine Verbesserung der Polymereigenschaften und zusätzliche neue Funktionen stellt das gleichzeitige Vorhandensein dieser mcl-3HA-Monomereinheit ein wesentliches Problem dar. Als Maßnahme zur Lösung dieses Problems wird ein Reinigungsprozeß zum Abtrennen und Entfernen der "unerwünschten" Monomereinheit, wie der mcl-3HA-Monomereinheit, die von der Kohlenstoffquelle für die Züchtung stammt, vorgesehen, wodurch ein PHA erhalten wird, das nur aus einer Monomereinheit mit bestimmten Substituenten besteht. Das Problem besteht jedoch darin, daß die Verfahren kompliziert werden und eine deutliche Verringerung der Ausbeuten nicht vermieden werden kann. Das ernsthaftere Problem besteht darin, daß es äußerst schwierig ist, nur die unerwünschte Monomereinheit zu entfernen, wenn die erwünschte Monomereinheit und die unerwünschte Monomereinheit ein Copolymer bildet. Wenn die Aufgabe insbesondere darin besteht, ein PHA zu synthetisieren, das eine Monomereinheit enthält, die Gruppen, die von ungesättigten Kohlenwasserstoffen, Estergruppen, Allylgruppen, Cyanogruppen, Nitrogruppen erhalten wurden, Gruppen, die von Halogenkohlenwasserstoffen erhalten wurden, und Gruppen mit Epoxid usw. enthält, die darin als Seitenkette eingeführt sind, existieren viele Fälle, bei denen die mcl-3HA-Monomereinheit mit der erwünschten Monomereinheit ein Copolymer bildet, und das Entfernen dieser mcl-3HA-Monomereinheit ist nach der Synthese des PHA somit äußerst problematisch.
Die hier genannten Erfinder haben somit erkannt, daß die Entwicklung eines Biosyntheseverfahrens, durch das "unübliches PHA" mit hoher Reinheit erhalten werden kann, absolut notwendig ist, wenn man die Anwendung bei funktionellen Polymeren in Betracht zieht. Deshalb wurde überlegt, daß die Entwicklung von hervorragenden Polymeren, die sowohl Funktionalität aufweisen als auch biologisch abbaubar sind, und von Mikroorganismen, die diese Polymere produzieren und in der Zelle speichern können, wie es vorstehend beschrieben ist, und eines Verfahrens zur wirksamen Biosynthese eines solchen PHA mit hoher Reinheit sehr nützlich und wichtig ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung löst die vorstehend beschriebenen Probleme und soll ein PHA, das eine Monomereinheit mit mannigfaltigen Strukturen mit Substituenten in der Seitenkette enthält, das als Material für Vorrichtungen und als medizinisches Material vorteilhaft ist (unübliches PHA) und ein Verfahren zur Erzeugung eines solchen "unüblichen PHA" unter Verwendung von Mikroorganismen und insbesondere ein Herstellungsverfahren bereitstellen, bei dem die gleichzeitig vorhandene unerwünschte Monomereinheit verringert ist und somit das gewünschte "unübliche PHA" mit hoher Reinheit erhalten werden kann und außerdem hohe Ausbeuten erzielt werden.
Die hier genannten Erfinder haben folglich weiterhin enthusiastische Untersuchungen zur Prüfung von Mikroorganismen, die verschiedene Arten von PHA produzieren und in der Zelle speichern können, und eines Verfahrens zur Produktion des gewünschten PHA unter Verwendung dieser Mikroorganismen mit dem Ziel durchgeführt, PHA mit funktionellen Gruppen in der Seitenkette zu entwickeln, das als Material für Vorrichtungen und als medizinisches Material nützlich ist. Als Ergebnis haben wir Mikroorganismen gefunden, die ein neues PHA produzieren können, das als Monomereinheit 3-Hydroxythienylalkansäure der chemischen Formel [2] enthält
(wobei n irgendeine ganze Zahl von 1 bis 8 ist),
wobei als Ausgangsmaterial Thienylalkansäure der chemischen Formel [9] verwendet wird
(wobei n irgendeine ganze Zahl von 1 bis 8 ist),
und die dieses in der Zelle speichern können, und außerdem haben wir festgestellt, daß ein solches PHA biosynthetisiert werden kann, wenn diese Mikroorganismen gezüchtet werden, während gleichzeitig Thienylalkansäure mit der vorstehend angegebenen chemischen Formel [9] und Saccharide, Hefeextrakt oder Polypepton vorhanden sind, und daß das dadurch erhaltene PHA eine höhere Reinheit hat.
Insbesondere haben wir Mikroorganismen gefunden, die ein neues PHA produzieren können, das als Monomereinheit enthält:
3-Hydroxy-4-(2-thienyl)buttersäure (die hier nachstehend als 3HTB abgekürzt wird) mit der chemischen Formel [5],
3-Hydroxy-5-(2-thienyl)valeriansäure (die hier nachstehend als 3HTV abgekürzt wird) mit der chemischen Formel [6],
3-Hydroxy-6-(2-thienyl)hexansäure (die hier nachstehend als 3HTHx abgekürzt wird) mit der chemischen Formel [7],
und 3-Hydroxy-7-(2-thienyl)heptansäure (die hier nachstehend als 3HTHp abgekürzt wird) mit der chemischen Formel [8],
wobei als Ausgangsmaterialien zumindest eine der Verbindungen verwendet wird:
5-(2-Thienyl)valeriansäure (die hier nachstehend als TVA abgekürzt wird) mit der chemischen Formel [11],
6-(2-Thienyl)hexansäure (die hier nachstehend als THxA abgekürzt wird) mit der chemischen Formel [12],
7-(2-Thienyl)heptansäure (die hier nachstehend als THpA abgekürzt wird) mit der chemischen Formel [13],
und diese in der Zelle speichern können, und außerdem haben wir festgestellt, daß ein solches PHA biosynthetisiert werden kann, wenn diese Mikroorganismen gezüchtet werden, während gleichzeitig TVA, THxA oder THpA und Saccharide, Hefeextrakt oder Polypepton vorhanden sind, und daß das dadurch erhaltene PHA eine höhere Reinheit aufweist, und gelangten damit zur vorliegenden Erfindung.
Das heißt, daß die vorliegende Erfindung ein Polyhydroxyalkanoat betrifft, das eine Monomereinheit der chemischen Formel [2] aufweist
(wobei n irgendeine ganze Zahl von 1 bis 8 ist).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung dieses PHA, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen Prozeß aufweist, bei dem Mikroorganismen auf einem Kulturmedium gezüchtet werden, das Thienylalkansäure der chemischen Formel [9] enthält,
(wobei n irgendeine ganze Zahl von 1 bis 8 ist),
wodurch veranlaßt wird, daß diese Mikroorganismen PHA produzieren, das eine entsprechende Monomereinheit aufweist, die mit der nachfolgenden chemischen Formel [10] angegeben wird,
(wobei m in der vorstehenden Formel einen oder mehrere Werte aus der Gruppe von n, n-2, n-4 und n-6 hat und auch eine ganze Zahl größer als oder gleich 1 ist).
Das heißt, daß das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von PHA dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen Prozeß aufweist, bei dem Mikroorganismen gezüchtet werden, die PHA produzieren, das 3HTB, 3HTV, 3HTHx oder 3HTHp als Monomereinheit enthält, wobei gleichzeitig NA, THxA oder THpA und Saccharide, Hefeextrakt oder Polypepton vorhanden sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden ein neues Polyhydroxyalkanoat mit einer Monomereinheit mit der vorstehend angegebenen chemischen Formel [1] und ein Verfahren zur Herstellung dieses Polyhydroxyalkanoats unter Verwendung von Mikroorganismen bereitgestellt. Dadurch kann das Polyhydroxyalkanoat wirksam erzeugt werden, das als funktionelles Polymer vorteilhaft ist, und man kann dessen Verwendung auf verschiedenen Gebieten, wie als Material für Vorrichtungen und medizinisches Material, erwarten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird es möglich, PHA (unübliches PHA), das eine Monomereinheit mit mannigfaltigen Strukturen mit Substituenten an der Seitenkette enthält, das als Material für Vorrichtungen, medizinisches Material und dergleichen vorteilhaft ist, und ein Verfahren zur Herstellung dieses "unüblichen PHA" bereitzustellen, bei dem Mikroorganismen verwendet werden. Insbesondere kann ein Verfahren angegeben werden, bei dem die unerwünschte Monomereinheit vermindert ist und somit das gewünschte "unübliche PHA" mit hoher Reinheit erhalten werden kann und hohe Ausbeuten erzielt werden.
Zusammenfassend betrifft die vorliegende Erfindung ein Polyhydroxyalkanoat und das Verfahren zur Herstellung eines Polyhydroxyalkanoats, wie es in den Ansprüchen angegeben ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt das ¹H NMR-Spektrum eines Polymers von Beispiel 1, wobei TVA als Ausgangsmaterial verwendet wurde;
2 zeigt das ¹³C NMR-Spektrum eines Polymers von Beispiel 1, wobei TVA als Ausgangsmaterial verwendet wurde;
3 zeigt das ¹H NMR-Spektrum eines Polymers von Beispiel 5, wobei THxA als Ausgangsmaterial verwendet wurde;
4 zeigt das ¹H NMR-Spektrum eines Polymers von Beispiel 11, wobei THpA als Ausgangsmaterial verwendet wurde.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Das erfindungsgemäße PHA ist ein PHA, das eine Monomereinheit mit mannigfaltigen Strukturen mit Substituenten an der Seitenkette enthält, das für ein Material für Vorrichtungen, ein medizinisches Material oder dergleichen vorteilhaft ist, insbesondere ein PHA, das an der Seitenkette Thienylgruppen aufweist. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des PHA ermöglicht es auch, das gewünschte PHA mit hoher Reinheit und hohen Ausbeuten herzustellen, wobei Mikroorganismen verwendet werden. Außerdem sind die erfindungsgemäßen PHA isotaktische Polymere, die im allgemeinen nur aus R-Hauptteilen bestehen.
<Saccharide, Unterschiede zum Stand der Technik>
Eines der erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von PHA ist dadurch gekennzeichnet, daß einem Kulturmedium nicht nur Alkansäure zum Einführen der gewünschten Monomereinheit sondern auch nur Saccharide als von Alkansäure verschiedene Kohlenstoffquelle zugesetzt werden, wenn die Mikroorganismen gezüchtet werden, wodurch im erzeugten und von den Mikroorganismen gespeicherten PHA der Gehalt der gewünschten Monomereinheit deutlich zunimmt oder nur die gewünschte Monomereinheit erhalten wird. Der Effekt, daß einer bestimmten Monomereinheit hohe Priorität beigemessen wird, wird dadurch erreicht, daß in das Kulturmedium nur Saccharide als von Alkansäure verschiedene Kohlenstoffquelle gegeben werden.
Das heißt, daß die hier genannten Erfinder die Züchtung durchgeführt haben, indem Saccharide als gleichzeitig vorhandene Kohlenstoffquellen zusammen mit Alkansäure verwendet wurden, um die gewünschte Monomereinheit einzuführen, und sie folglich zu der Erkenntnis gelangten, daß das gewünschte PHA mit viel höheren Ausbeuten und viel höherer Reinheit erhalten wird – verglichen mit herkömmlichen Verfahren, die mcl-Alkansäure, wie Nonansäure und Octansäure, als gleichzeitig vorhandene Kohlenstoffquellen verwenden – und dieser Effekt wird durch das Züchtungsverfahren erreicht, das durch einen Prozeß, der keine β-Oxidation anwendet, Acetyl-CoA produzieren kann, das eine Kohlenstoffquelle und eine Energiequelle für Mikroorganismen darstellt, woraus die vorliegende Erfindung resultiert.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden Saccharidverbindungen, wie Glucose, Fructose und Mannose, als Kohlenstoffquelle für die Züchtung der Mikroorganismen verwendet, und das produzierte PHA besteht aus Alkanoat für die Einführung der gewünschten Monomereinheit, das gleichzeitig mit Sacchariden vorliegt, und enthält keine oder sehr wenig Monomereinheiten, die von Sacchariden, wie Glucose, stammen. In diesem Zusammenhang sind die Konfiguration und die Wirkung des erfindungsgemäßen Verfahrens grundsätzlich von herkömmlichen Verfahren zur Erzeugung von PHA durch Mikroorganismen verschieden, die Saccharide selbst, wie Glucose, als Ausgangsmaterialien für die Monomereinheit verwenden, die in PHA eingeführt wird.
<Hefeextrakt, Unterschiede zum Stand der Technik>
Eines der erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung von PHA ist dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium bei der Züchtung der Mikroorganismen nicht nur Alkansäure, um die gewünschte Monomereinheit einzuführen, sondern auch Hefeextrakt allein als von Alkansäure verschiedene Kohlenstoffquelle zugesetzt wird, wodurch in dem PHA, das von den Mikroorganismen produziert und gespeichert wird, der Gehalt der gewünschten Monomereinheit deutlich erhöht oder nur die gewünschte Monomereinheit erhalten wird. Der Effekt, daß einer bestimmten Monomereinheit hohe Priorität beigemessen wird, wird dadurch erzielt, daß dem Kulturmedium als von Alkansäure verschiedene Kohlenstoffquelle nur Hefeextrakt zugesetzt wird.
Ein Beispiel der Verwendung von Hefeextrakt im Kulturmedium zum Zeitpunkt der Produktion von PHA durch Mikroorganismen ist ein Verfahren, bei dem Mikroorganismen verwendet werden, die als Rhodobacter sp. klassifiziert werden, wie es in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 5-49487 beschrieben ist. Dieses herkömmliche Verfahren ist jedoch ein Verfahren, bei dem allgemeines PHB und PHV erzeugt werden, die als Monomereinheit ein Hydroxyalkanoat ohne Substituenten aufweisen. Ein Syntheseweg, wie er durch die vorliegende Erfindung vorgesehen ist, ist bekanntlich ein Weg, der von Synthesewegen unabhängig ist, über die PHB und PHV produziert werden, und in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 5-49487 gibt es keine Beschreibung der Wirkung von Hefeextrakt im Syntheseweg von PHA, wie er bei der vorliegenden Erfindung beabsichtigt ist. Für den Effekt von Hefeextrakt wird auch nur in bezug auf PHA und PHV, die allgemein von Mikroorganismen produziert werden, angegeben, daß der Zusatz von Hefeextrakt die Menge des in der Zelle gespeicherten PHA einfach erhöht, und es wird ausdrücklich festgestellt, daß Hefeextrakt nicht zum Zwecke der Züchtung zugesetzt wird. Die vorliegende Erfindung soll die Produktion und Speicherung sowie auch das Wachstum bewirken, indem Thienylalkansäure und Hefeextrakt gleichzeitig vorliegen, und daß ist davon völlig verschieden. Außerdem gibt es keine Beschreibung, daß der bestimmten Monomereinheit hohe Priorität beigemessen wird, was einen Effekt der vorliegenden Erfindung darstellt, und im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung wird der Effekt, daß einer bestimmten Monomereinheit mit Thienylgruppen als Substituenten in der Zusammensetzung des von Mikroorganismen produzierten PHA hohe Priorität beigemessen wird, nicht aufgeführt.
Ferner stellt ein Verfahren, das Pseudomonas putida verwendet, wie es im japanischen Patent Nr. 2989175 beschrieben ist, ein Beispiel der Verwendung von Hefeextrakt für die Produktion von PHA durch Mikroorganismen dar. Das dort beschriebene Verfahren zur Erzeugung von PHA ist nur ein Verfahren, bei dem eine zweistufige Kultur angewendet wird, und es wird offenbart, daß das Speichern von PHA nur in der Kultur der zweiten Stufe bei einer Einschränkung der von der Kohlenstoffquelle verschiedenen Nährstoffquellen erfolgt. In diesem Zusammenhang ist es in bezug auf die Konfiguration und die Effekt von dem Verfahren der vorliegenden Erfindung vollkommen verschieden, bei dem das gewünschte PHA nur durch eine einstufige Kultur in einem Kulturmedium synthetisiert und gespeichert wird, das Thienylalkansäure und Hefeextrakt enthält. Im japanischen Patent Nr. 2989175 zielt die Wirkung von Hefeextrakt im Falle der Verwendung der Kultur der zweiten Stufe auch einfach nur darauf, in der ersten Stufe der Kultur Mikroorganismen für die Verwendung in der zweiten Stufe der Kultur zu züchten, und darin wird ausdrücklich festgestellt, daß die Züchtung in der ersten Stufe bei Bedingungen mit reichlich vorhandenen Nährstoffquellen durchgeführt wird. Das Ausgangsmaterial des PHA liegt hier in der ersten Stufe nicht gleichzeitig vor. Für die Wirkung des Hefeextrakts in der vorliegenden Erfindung werden die Produktion und Speicherung von PHA sowie auch die Züchtung so durchgeführt, daß Thienylalkansäure und Hefeextrakt gleichzeitig vorliegen, was in bezug auf die von Hefeextrakt hervorgerufenen Effekte völlig anders ist. Im japanischen Patent Nr. 2989175 existiert in der ersten Stufe der Kultur auch gleichzeitig irgendeine Säure aus Citronensäure, Octansäure und Nonansäure als Kohlenstoffquelle, was sich von der erfindungsgemäßen Konfiguration völlig unterscheidet, bei der nur Thienylalkansäure und Hefeextrakt gleichzeitig vorhanden sind.
<Polypepton, Unterschiede zum Stand der Technik>
Eines der erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung von PHA ist dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium bei der Züchtung der Mikroorganismen nicht nur Alkansäure für die Einführung der gewünschten Monomereinheit sondern auch nur Polypepton als von Alkansäure verschiedene Kohlenstoffquelle zugesetzt werden, wodurch im PHA, das von den Mikroorganismen produziert und gespeichert wird, der Gehalt der gewünschten Monomereinheit deutlich erhöht oder nur die gewünschte Monomereinheit erhalten wird. Der Effekt, daß der bestimmten Monomereinheit hohe Priorität beigemessen wird, wird dadurch erzielt, daß dem Kulturmedium als von Alkansäure verschiedene Kohlenstoffquelle nur Polypepton zugesetzt wird.
Als Beispiele der Verwendung von Polypepton für die Produktion von PHA durch Mikroorganismen wird zudem in der
offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 5-49487,
offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 5-64591,
offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 5-214081,
offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 6-145311,
offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 6-284892,
offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 7-48438,
offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 8-89264,
offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 9-191893 und
offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 11-32789 offenbart,
daß Polypepton im Kulturmedium enthalten ist, wenn Mikroorganismen dazu gebracht werden, PHA zu produzieren, in jedem Fall wird jedoch Polypepton in einer Vorkulturstufe, das heißt in einer Stufe verwendet, in der einfach die Zellen gezüchtet werden, und Ausgangsmaterialien, die eine Monomereinheit sind, sind in dieser Vorkultur nicht eingeschlossen. Es gibt auch keine Beispiele, bei denen Polypepton bei dem Prozeß verwendet wird, bei dem die Zelle dazu gebracht wird, PHA zu produzieren. Im Gegensatz dazu soll die vorliegende Erfindung die Produktion und Speicherung von PHA als auch das Wachstum bewirken, indem Alkansäure für die Einführung der gewünschten Monomereinheit und nur Polypepton als von dieser Alkansäure verschiedene Kohlenstoffquelle gleichzeitig vorhanden sind, und sie ist in bezug auf die Konfiguration und den Effekt von herkömmlichen Beispielen der Verwendung von Polypepton vollkommen verschieden. Außerdem gibt es keine Beschreibung darüber, daß der bestimmten Monomereinheit hohe Priorität beigemessen wird, was einen Effekt der vorliegenden Erfindung darstellt, und im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung ist der Effekt, daß der bestimmten Monomereinheit mit Thienylgruppen als Substituenten in der Zusammensetzung des von Mikroorganismen produzierten PHA hohe Priorität beigemessen wird, nicht dargelegt.
Nachfolgend werden Mikroorganismen, Züchtungsverfahren und dergleichen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung beschrieben.
<Systeme für die Zuführung der PHA-Monomereinheit>
Zuerst wird der "Fettsäuresyntheseweg" detailliert beschrieben, der eines der Zuführungssysteme darstellt, durch das es dazu kommt, daß die mcl-3HA-Monomereinheit im gewünschten PHA gleichzeitig vorliegt.
Im Falle der Verwendung von Sacchariden, wie Glucose, als Kohlenstoffquelle wird die Alkansäure, die als Zellkomponente erforderlich ist, durch den "Fettsäuresyntheseweg" biosynthetisiert, für den Acetyl-CoA, das durch das "Glycolysesystem" aus Sacchariden erzeugt wird, eine Ausgangssubstanz darstellt. Die Fettsäuresynthese beinhaltet zudem einen neuen (de novo) Syntheseweg und einen Weg zur Verlängerung der Kohlenstoffkette, und diese werden nachstehend beschrieben.
(1) Neuer (de novo) Syntheseweg
Er wird von zwei Enzymen, einer Acetyl-CoA-Carboxylase (EC 6.4.1.2) und einem Enzym für die Fettsäuresynthese (EC 2.3.1.85) katalysiert. Außerdem ist Acetyl-CoA-Carboxylase ein Enzym, das Biotin beinhaltet und schließlich die folgende Reaktion katalysiert, wodurch aus Acetyl-CoA Malonyl-CoA erzeugt wird, und diese Reaktion wird mit der folgenden Gleichung angegeben: Acetyl-CoA + ATP + HCO₃ ⟺ Malonyl-CoA + ADP + P_i
Das Enzym für die Fettsäuresynthese ist auch ein Enzym, das den reaktiven Zyklus aus Übertragung – Kondensation – Reduktion – Dehydratation – Reduktion katalysiert, und die gesamte Reaktion wird mit der folgenden Gleichung angegeben Acetyl-CoA + n Malonyl-CoA + 2n NADPH + 2n H⁺ ⟺ CH₃(CH₂)_2nCOOH + n CO₂ + 2n NADP⁺ + (n – 1) CoA
In Abhängigkeit von den Arten der Enzyme kann das Reaktionsprodukt zudem eine freie Säure, ein CoA-Derivat oder ein ACP-Derivat sein.
Das Acetyl-CoA wird hier mit der folgenden chemischen Formel angegeben
und das Malonyl-CoA wird mit der folgenden chemischen Formel angegeben
CoA ist zudem eine Abkürzung für Coenzym A, und dieses wird mit der folgenden chemischen Formel angegeben.
"D-3-Hydroxyacyl-ACP" wird als Zwischenprodukt geliefert, das bei diesen Synthesewegen ein Monomersubstrat für die Biosynthese von PHA auf dem folgenden Syntheseweg darstellt. Wie in der folgenden Reaktionsgleichung gezeigt, geht der Syntheseweg weiter, so daß Kohlenstoffatome auf doppelter Basis angefügt werden, und das geht schließlich bis zur Palmitinsäure. Deshalb werden für das Monomersubstrat für die Biosynthese von PHA sieben Arten von "D-3-Hydroxyacyl-ACP", von "D-3-Hydroxybutyryl-ACP" bis "D-3-Hydroxypalmityl-ACP", mit der gleichen Anzahl von Kohlenstoffatomen geliefert.
(2) Syntheseweg zur Verlängerung der Kohlenstoffkette
Dieser Syntheseweg wird allgemein in zwei Wege klassifiziert, einen, der einen Syntheseweg darstellt, bei dem dem Acyl-ACP Malonyl-ACP zugesetzt wird, wodurch schließlich Acyl-ACP mit einer um 2 verlängerten Kohlenstoffkette (und CO₂) erzeugt wird (als Weg A bezeichnet), und den anderen, der einen Syntheseweg darstellt, bei dem dem Acyl-CoA Acetyl-CoA zugesetzt wird, wodurch schließlich Acyl-CoA mit einer um 2 verlängerten Kohlenstoffkette erzeugt wird (als Weg B bezeichnet). Jeder dieser Synthesewege wird nachstehend beschrieben. Syntheseweg A

Syntheseweg B
Es kann angenommen werden, daß sowohl im System A als auch B "D-3-Hydroxyacyl-CoA" oder "D-3-Hydroxyacyl-ACP" als Zwischenprodukt erzeugt wird und daß das "D-3-Hydroxyacyl-CoA" direkt als Monomersubstrat für die Synthese des PHA verwendet wird und daß das "D-3-Hydroxyacyl-ACP" durch ACP-CoA-Transferase in "D-3-Hydroxyacyl-CoA" überführt und dann als Monomersubstrat für die Synthese des PHA verwendet wird.
Es kann angenommen werden, daß die mcl-3HA-Monomereinheit im Falle der Verwendung von Sacchariden, wie Glucose, als Kohlenstoffquelle, über das "Glycolysesystem" und den "Fettsäuresyntheseweg" in den Zellen der Mikroorganismen produziert wird.
Hier kann angenommen werden, daß mcl-Alkansäuren, wie zum Beispiel Octansäure und Nonansäure, oder Alkansäuren mit funktionellen Gruppen, die von einer geradkettigen aliphatischen Alkylgruppe verschieden sind, die im Übermaß zugesetzt werden, wie 5-Phenylvaleriansäure, 4-Phenoxybuttersäure, 4-Cyclohexylbuttersäure und 5-(2-Thienyl)valeriansäure, durch CoA-Ligase (EC 6.2.1.3 usw.) zu CoA-Derivaten verändert werden, und durch eine Enzymgruppe, die für β-Oxidationssysteme verantwortlich ist, direkt zu "D-3-Hydroxyacyl-CoA" verändert werden, das ein Monomersubstrat für die Biosynthese von PHA darstellt.
Das heißt, während die mcl-3HA-Monomereinheit, die von Sacchariden erzeugt wird, über extrem mehrstufige Enzymreaktionen (das heißt indirekt) erzeugt wird, wird die mcl-3HA-Monomereinheit ganz direkt aus mcl-Alkansäure produziert.
Nunmehr wird die Produktion des Acetyl-CoA beschrieben, das für das Wachstum der Mikroorganismen verantwortlich ist. Bei dem Verfahren, bei dem mcl-Alkansäure gleichzeitig neben der Alkansäure für die Einführung der gewünschten Monomereinheit vorliegt, durchlaufen die Alkansäuren das β-Oxidationssystem, wodurch Acetyl-CoA produziert wird. Allgemein kann angenommen werden, daß mcl-Alkansäure im Vergleich mit Alkansäuren mit voluminösen Substituenten (Alkansäuren mit Substituenten, wie Phenylgruppen, Phenoxygruppen, Cyclohexylgruppen und Thienylgruppen) eine hohe Affinität gegenüber einer Enzymgruppe des β-Oxidationssystems aufweist und Acetyl-CoA durch die gleichzeitig vorhandene mcl-Alkansäure wirksam produziert wird. Deshalb ist sie für das Wachstum der Mikroorganismen unter Verwendung des Acetyl-CoA als Energiequellen und Kohlenstoffquellen von Vorteil.
Das wesentliche Problem besteht jedoch darin, daß das erzeugte PHA eine größere Menge der mcl-3HA-Monomereinheit aufweist, die gleichzeitig neben der gewünschten Monomereinheit existiert, da mcl-Alkansäure, die das β-Oxidationssystem durchläuft, direkt zur Monomereinheit des PHA geändert wird.
Um dieses Problem zu lösen, ist ein Verfahren erwünscht, bei dem eine von mcl-Alkansäure verschiedene Substanz, die Acetyl-CoA oder Energiequellen und Kohlenstoffquellen wirksam liefern kann, ausgewählt wird und diese gleichzeitig mit der gewünschten Alkansäure vorliegt. Wie bereits beschrieben, kann das Acetyl-CoA die Monomereinheit des PHA werden, indem es den Fettsäuresyntheseweg durchläuft, das ist jedoch ein indirekter Weg, bei dem das Acetyl-CoA im Vergleich mit der mcl-Alkansäure mehrstufige Reaktionen durchlaufen muß, und es werden die Züchtungsbedingungen, wie die Konzentration der Substanz, die die Produktion des Acetly-CoA ermöglicht, geeignet ausgewählt, wodurch ein Herstellungsverfahren erreicht werden kann, bei dem im wesentlichen kein oder wenig mcl-3HA gleichzeitig vorliegt.
Es werden gewöhnlich auch Herstellungsverfahren angewendet, bei denen in der ersten Stufe die Züchtung nur zum Zwecke des Wachstums der Mikroorganismen durchgeführt wird und in der zweiten Stufe nur die gewünschte Alkansäure als Kohlenstoffquellen in das Kulturmedium gegeben wird. Gemäß der Erfinder und aufgrund der Tatsache, daß Acyl-CoA-Ligase, die ein erstes Fermentationsenzym des β-Oxidationssystems ist, durch das Alkansäure zu Acyl-CoA wird, ATP erfordert, wurde die Schlußfolgerung gezogen, daß gegenwärtig ein Verfahren zur vorliegenden Erfindung führt, bei dem eine Substanz wirksamer ist, die auch in der zweiten Stufe von Mikroorganismen als Energiequelle verwendet werden kann.
Als Substanzen, die in der vorliegenden Erfindung wirksam Acetyl-CoA oder Energiequellen und Kohlenstoffquellen liefern können, können neben Sacchariden, einschließlich Aldosen, wie Glycerinaldehyd, Erythrol, Arabinose, Xylose, Glucose, Galactose, Mannose und Fructose, Algitol, wie Glycerol, Erythritol und Xylitol, Aldonsäure, wie Gluconsäure, Uronsäure, wie Glucuronsäure und Galacturonsäure, und Disacchariden, wie Maltose, Saccharose und Lactose, irgendwelche Verbindungen, einschließlich Komponenten eines Kulturmediums, die von natürlichen Substanzen abgeleite sind, wie Hefeextrakt, Polypepton, Fleischextrakt, Casaminosäure, verwendet werden, sofern sie Verbindungen sind, die Acetyl-CoA oder Energiequellen und Kohlenstoffquellen liefern können, ohne daß sie das β-Oxidationssystem durchlaufen, und diese können auf der Basis geeignet ausgewählt werden, ob sie als Substanzen für die zu verwendenden Stämme nützlich sind. Es kann auch eine Vielzahl von Verbindungen ausgewählt und verwendet werden, sofern diese Kombination eine Verringerung des gleichzeitig vorhandenen mcl-3HA erlaubt.
<Mikroorganismen>
Als Mikroorganismen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung können irgendwelche Mikroorganismen eingesetzt werden, sofern sie mit den vorstehend beschriebenen TVA, THxA oder THpA als Ausgangsmaterialien PHA produzieren können, das als Monomer die vorstehend beschriebenen 3HTB, 3HTV, 3HTHx oder 3HTHp enthält. Falls erforderlich kann auch eine Mehrzahl von Mikroorganismen innerhalb des Bereichs gemischt und verwendet werden, in dem die Aufgabe der vorliegenden Erfindung gelöst werden kann.
Die hier genannten Erfinder haben eine Prüfung von Mikroorganismen durchgeführt, die unter Verwendung von TVA, THxA oder THpA als Ausgangsmaterial PHA produzieren können, das als Monomereinheit die vorstehend beschriebenen 3HTB, 3HTV und 3HTHx oder 3HTHp enthält. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß Pseudomonas putida P91, Pseudomonas cichorii H45, Pseudomonas cichorii YN2 und Pseudomonas jessenii P161, die Mikroorganismen sind, die von den hier genannten Erfindern aus dem Boden abgetrennt worden sind und PHA produzieren können, die gewünschte Fähigkeit aufweisen. Außerdem sind der Stamm P91, der Stamm H45, der Stamm YN2 und der Stamm P161 beim Patent Microorganism Deposition Center, Institute of Life Engineering Technology, Economic and Industrial Ministry als "FERM BP-7373", "FERM BP-7374", "FERM BP-7375" bzw. "FERM BP-7376" hinterlegt. Diese Mikroorganismen wurden auf der Grundlage des Budapester Vertrags auch in eine internationale Hinterlegung überführt. Die internationalen Zugangsnummern sind wie folgt.
Stamm P91: "FERM BP-7373"
Stamm H45: "FERM BP-7374"
Stamm YN2: "FERM BP-7375"
Stamm P161: "FERM BP-7376".
Die bakteriologischen Eigenschaften der vorstehend beschriebenen Stämme P91, H45, YN2 und P161 sind nachfolgend aufgeführt. Für den Stamm P161 ist auch die Basensequenz aus 16S rRNA in der Aufstellung Nr. I aufgeführt.
<Bakteriologische Eigenschaften des Stamms P91>
(1) Morphologische Eigenschaften

Form und Größe der Zelle: Stäbchen, 0,6 μm × 1,5 μm
Polymorphie der Zelle: keine Polymorphie
Motilität: beweglich
Sporulation: keine Sporulation
Gramfärbung: negativ
Koloniemorphologie: rund, vollständig glatt, geringe Vertiefung, glatte Oberfläche, glänzend, cremig

(2) Physiologische Eigenschaften:

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: Oxidationstyp
Reduktion von Nitraten: negativ
Produktion von Indol: negativ
Glucoseansäuerung: negativ
Arginin-Dihydrolase: positiv
Urease: negativ
Esculin-Hydrolyse: negativ
Gelatine-Hydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Erzeugung eines fluoreszierenden Pigmentes auf King-B-Agar: positiv

(3) Substratassimilierbarkeit

Glucose: positiv
L-Arabinose: negativ
D-Mannose: negativ
D-Manitol: negativ
N-Acetyl-D-glucosamin: negativ
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprinsäure: positiv
Adipinsäure: negativ
dl-Äpfelsäure: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv

<Bakteriologische Eigenschaften des Stamms H45>
(1) Morphologische Eigenschaften

Form und Größe der Zelle: Stäbchen, 0,8 μm × 1,0 bis 1,2 μm
Polymorphie der Zelle: keine Polymorphie
Motilität: beweglich
Sporulation: keine Sporulation
Gramfärbung: negativ
Koloniemorphologie: rund, vollständig glatt, geringe Vertiefung, glatte
Oberfläche, glänzend, cremig

(2) Physiologische Eigenschaften:

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: Oxidationstyp
Reduktion von Nitraten: negativ
Produktion von Indol: negativ
Glucoseansäuerung: negativ
Arginin-Dihydrolase: negativ
Unease: negativ
Esculin-Hydrolase: negativ
Gelatine-Hydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Erzeugung eines fluoreszierenden Pigmentes auf King-B-Agar: positiv
Wachstum in Gegenwart von 4 % NaCl: negativ
Speicherung von Poly-β-hydroxybuttersäure: negativ

(3) Substratassimilierbarkeit

Glucose: positiv
L-Arabinose: negativ
D-Mannose: positiv
D-Manitol: positiv
N-Acetyl-D-glucosamin: positiv
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprinsäure: positiv
Adipinsäure: negativ
dl-Äpfelsäure: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv

<Bakteriologische Eigenschaften des Stamms YN2>
(1) Morphologische Eigenschaften

Form und Größe der Zelle: Stäbchen, 0,8 μm × 1,5 bis 2,0 μm
Polymorphie der Zelle: keine Polymorphie
Motilität: beweglich
Sporulation: keine Sporulation
Gramfärbung: negativ
Koloniemorphologie: rund, vollständig glatt, geringe Vertiefung, glatte Oberfläche, glänzend, durchscheinend

(2) Physiologische Eigenschaften:

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: Oxidationstyp
Reduktion von Nitraten: negativ
Produktion von Indol: negativ
Glucoseansäuerung: negativ
Arginin-Dihydrolase: negativ
Unease: negativ
Esculin-Hydrolase: negativ
Gelatine-Hydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Erzeugung eines fluoreszierenden Pigmentes auf King-B-Agar: positiv
Wachstum in Gegenwart von 4 % NaCl: positiv (geringes Wachstum)
Speicherung von Poly-β-hydroxybuttersäure: negativ
Hydrolyse von Tween 80: positiv

(3) Substratassimilierbarkeit

Glucose: positiv
L-Arabinose: positiv
D-Mannose: negativ
D-Manitol: negativ
N-Acetyl-D-glucosamin: negativ
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprinsäure: positiv
Adipinsäure: negativ
dl-Äpfelsäure: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv
<Bakteriologische Eigenschaften des Stamms P161 >

(1) Morphologische Eigenschaften

Form und Größe der Zelle: Sphäre, φ 0,6 μ
Stäbchen, 0,6 μm × 1,5 bis 2,0 μm
Polymorphie der Zelle: tritt auf (Expansionstyp)
Motilität: beweglich
Sporulation: keine
Gramfärbung: negativ
Koloniemorphologie: rund, vollständig glatt, geringe Vertiefung, glatte Oberfäche, hellgelb

(2) Physiologische Eigenschaften:

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: Oxidationstyp
Reduktion von Nitraten: positiv
Produktion von Indol: negativ
Glucoseansäuerung: negativ
Arginin-Dihydrolase: positiv
Urease: negativ
Esculin-Hydrolyse: negativ
Gelatine-Hydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Erzeugung eines fluoreszierenden Pigmentes auf King-B-Agar: positiv

(3) Substratassimilierbarkeit

Glucose: positiv
L-Arabinose: positiv
D-Mannose: positiv
D-Manitol: positiv
N-Acetyl-D-glucosamin: positiv
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprinsäure: positiv
Adipinsäure: negativ
dl-Äpfelsäure: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv

<Kultur>
Das gewünschte PHA kann produziert werden, wenn diese Mikroorganismen auf einem Kulturmedium gezüchtet werden, das Alkanoat zum Einführen der gewünschten Monomereinheit und Kohlenstoffquellen für die erfindungsgemäße Züchtung enthält. Dieses PHA besteht nur aus R-Hauptteilen und ist ein isotaktisches Polymer.
Für die normale Züchtung von Mikroorganismen für die Verwendung bei dem PHA-Verfahren, auf das sich die die vorliegende Erfindung bezieht, zum Beispiel für die Herstellung von Vorratsstämmen und die Züchtung, um die Anzahl der Stämme und die wirksamen Bedingungen zu sichern, die für die Produktion des PHA erforderlich sind, wird passend ein Kulturmedium ausgewählt und verwendet, das die Komponenten enthält, die für die Züchtung der zu verwendenden Mikroorganismen erforderlich sind. Es können zum Beispiel irgendwelche Arten von Kulturmedien verwendet werden, wie allgemeine natürliche Kulturmedien (Nährbouillon, Hefeextrakt usw.) und synthetische Kulturmedien, denen Nährstoffquellen zugesetzt wurden, sofern sie keinen nachteiligen Einfluß auf das Wachstum und Überleben der Mikroorganismen haben.
Für die Züchtung können irgendwelche Züchtungsverfahren, wie eine Flüssigkultur und eine Festkultur, angewendet werden, sofern sie Züchtungsverfahren darstellen, durch die Mikroorganismen wachsen und PHA erzeugt wird. Außerdem sind auch die Arten der Kultur nicht eingeschränkt, dazu gehören eine Batch-Kultur, eine Fed-batch-Kultur, eine halbkontinuierliche Kultur und eine kontinuierliche Kultur. Formen der Flüssig-Batch-Kultur schließen Verfahren, bei denen Sauerstoff durch Schütteln mit einem Schüttelkolben zugeführt wird, und Verfahren zur Sauerstoffzufuhr mittels Rühr- und Belüftungssystemen unter Verwendung von Fermentoren ein. Es können mehrstufige Systeme gewählt werden, die zwei oder mehrere dieser Verfahren verbinden.
Wenn PHA, das 3HTB, 3HTV, 3HTHx oder 3HTHp als Monomereinheit enthält, unter Verwendung von PHA produzierenden Mikroorganismen erzeugt wird, wie es vorstehend beschrieben ist, können anorganische Kulturmedien und dergleichen verwendet werden, die zumindest jedes entsprechende TVA, THxA und THpA als Ausgangsmaterialien für die Produktion von PHA und Kohlenstoffquellen für das Wachstum enthalten. Als Kohlenstoffquellen für das Wachstum können Nährstoffe, wie Hefeextrakt, Polypepton und Fleischextrakt verwendet werden, und außerdem können irgendwelche Verbindungen, einschließlich Saccharide, zum Beispiel Aldosen, wie Glycerinaldehyd, Erythrol, Arabinose, Xylose, Glucose, Galactose, Mannose und Fructose, Algitol, wie Glycerol, Erythritol und Xylitol, Aldonsäure, wie Gluconsäure, Uronsäure, wie Glucuronsäure und Galacturonsäure, und Disaccharide, wie Maltose, Saccharose und Lactose, verwendet werden, sofern sie Verbindungen sind, die Acetyl-CoA produzieren, ohne daß der β-Oxidationszyklus durchlaufen wird, und diese können auf der Basis der Nützlichkeit als Kohlenstoffquelle für die zu verwendenden Stämme geeignet ausgewählt werden. Es kann auch eine Mehrzahl von Verbindungen ausgewählt und verwendet werden, sofern die Kombination eine Verringerung des gleichzeitig vorhandenen mcl-3HA ermöglicht. Davon werden besonders bevorzugt Saccharide verwendet, und stärker bevorzugt wird eine Substanz aus der Gruppe ausgewählt, die aus Glucose, Fructose und Mannose besteht. Für Verfahren, durch die Mikroorganismen PHA produzieren und speichern, nachdem die Mikroorganismen ausreichend gewachsen sind, wird die Zelle in das Kulturmedium übertragen, in dem Stickstoffquellen, wie Ammoniumchlorid, begrenzt sind, und die Züchtung wird ferner mit Verbindungen durchgeführt, die Ausgangsmaterialien für die gewünschten Einheiten darstellen, die zugesetzt werden, wodurch die Produktivität verbessert werden kann. Insbesondere wird ein mehrstufiges System gewählt, das zwei oder mehr der vorstehend beschriebenen Prozesse verbindet. Es gibt zum Beispiel ein Verfahren, bei dem die Kultur auf einem anorganischen Kulturmedium usw., das etwa 0,05 bis 5,0 % D-Glucose und etwa 0,01 bis 1,0 % TVA, THxA oder THpA enthält, bis zum Zeitpunkt der logarithmischen Wachstumsphase oder der stationären Phase durchgeführt wird und die Zelle durch Zentrifugieren und dergleichen aufgefangen wird, darauf folgt die Durchführung der Kultur auf dem anorganischen Kulturmedium, das etwa 0,01 bis 1,0 % TVA, THxA oder THpA enthält, wobei die Stickstoffquellen begrenzt sind oder im wesentlichen keine Stickstoffquellen existieren.
Anorganische Kulturmedien für die Verwendung bei den vorstehend genannten Züchtungsverfahren können irgendwelche Medien sein, sofern sie Komponenten enthalten, die das Wachstum von Mikroorganismen erlauben, wie Phosphorquellen (zum Beispiel Phosphat) und Stickstoffquellen (zum Beispiel Ammoniumsalze und Nitrat), und zu Kulturmedien anorganischer Salze können zum Beispiel die Kulturmedien MSB, die Kulturmedien E (J. Biol. Chem. 218, 97– 106 (1956)), die Kulturmedien M9 und dergleichen gehören.
Die Zusammensetzung des Kulturmediums M9, das zum Beispiel in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist wie folgt:

Na₂HPO₄: 6,2 g

KH₂PO₄: 3,0 g

NaCl: 0,5 g

NH₄Cl: 1,0 g

(pro Liter Kulturmedium, pH = 7,0).
Außerdem ist es für eine vorteilhafte Züchtung und Produktion von PHA bevorzugt, daß den vorstehend beschriebenen anorganischen Kulturmedien etwa 0,3 % (V./V.) Mikrokomponentenlösungen zugesetzt werden. Mikrokomponentenlösungen

Nitrilotriessigsäure: 1,5 g

MgSO₄: 3,0 g

MnSO₄: 0,5 g

NaCl: 1,0 g

FeSO₄: 0,1 g

CaCl₂: 0,1 g

CoCl₂: 0,1 g

ZnSO₄: 0,1 g

CuSO₄: 0,1 g

AlK(SO₄)₂: 0,1 g

H₃BO₃: 0,1 g

Na₂MoO₄: 0,1 g

NiCl₂: 0,1 g

(pro Liter)
Die Züchtungstemperatur kann eine Temperatur sein, die es erlaubt, daß die vorstehend beschriebenen Stämme vorteilhaft wachsen, und es sind zum Beispiel 14 bis 40°C, vorzugsweise etwa 20 bis 35°C geeignet.
Als bestimmtes Beispiel wird die Züchtung auf einem anorganischen Kulturmedium usw. durchgeführt, das etwa 0,05 bis 5,0 % D-Glucose und etwa 0,01 bis 1,0 % TVA, THxA oder THpA enthält, und die Zelle wird zum Zeitpunkt der logarithmischen Wachstumsphase oder der stationären Phase aufgefangen, wodurch das gewünschte PHA herausgelöst werden kann, bei dem wenig oder keine unerwünschte Monomereinheit gleichzeitig vorliegt. Dieses PHA besteht im allgemeinen nur aus R-Hauptteilen und ist ein isotaktisches Polymer.
Anstelle von D-Glucose kann auch die gleiche Menge Hefeextrakt oder Polypepton zugegeben werden. Es können auch Kombinationen davon verwendet werden.
<Auffangen des PHA>
Zum Auffangen des PHA aus der Kulturlösung, worauf sich die vorliegende Erfindung bezieht, können gewöhnlich durchgeführte Verfahren angewendet werden. Ein herauslösendes Reinigungsverfahren aus der Kulturlösung kann in dem Fall angewendet werden, wenn das PHA in die Kulturlösung ausgeschieden wird, und ein herauslösendes Reinigungsverfahren aus der Zelle in dem Fall, wenn PHA in der Zelle gespeichert wird. Zum Auffangen des PHA aus der gezüchteten Zelle von Mikroorganismen ist es zum Beispiel am einfachsten, das Herauslösen mit organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform, wie üblich durchzuführen, es kann jedoch Fälle geben, bei denen anstelle von Chloroform Aceton verwendet wird. In Umgebungen, in denen die Verwendung organischer Lösungsmittel problematisch ist, können auch Verfahren angewendet werden, bei denen die von PHA verschiedenen Zellkomponenten durch Verfahren unter Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln, wie SDS, durch Verfahren unter Verwendung von Enzymen, wie Lysozym, und durch Verfahren entfernt werden, die Chemikalien, wie EDTA, Natriumhypochlorit und Ammoniak verwenden, um das PHA aufzufangen.
Außerdem sollten die erfindungsgemäße Züchtung der Mikroorganismen, die Produktion des PHA durch Mikroorganismen und das Speichern in der Zelle gemäß dieser Erfindung und das Auffangen des PHA aus der Zelle in der vorliegenden Erfindung nicht auf die vorstehend beschriebenen Verfahren begrenzt sein.
Nachfolgend sind Beispiele aufgeführt. Ferner bezieht sich "%" nachfolgend auf das Gewicht, wenn es nicht anders angegeben ist.
(Beispiele)
Beispiel 1
200 ml Kulturmedium M9, das 0,5 % Hefeextrakt (von Difco hergestellt) und 0,1 TVA enthielt, wurden mit Pseudomonas putida P91 geimpft und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Nachdem die extrahierte Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert worden war, wurde sie mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, die eingeengte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde.
Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem herkömmlichen Verfahren unterzogen und dann durch Gaschromatographie – Massenspektrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Modus) analysiert, um eine Identifizierung der mit Methyl veresterten Substanzen der PHA-Monomereinheit vorzunehmen. Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurde ein solches PHA folglich als PHA identifiziert, das nur 3HTV als Monomereinheit aufweist.
Tabelle 1
Bei diesem PHA wurde eine Analyse bei folgenden Meßbedingungen durchgeführt, wobei eine Vorrichtung für die magnetische Kernresonanz (FT-NMR: Bruker DPX-400) verwendet wurde.
<Meßbedingung>

Gemessenes Nuclid: ¹H, ¹³C
verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃ (als Bezug wurde in einer Kapillare enthaltenes TMS/CDCl₃ verwendet)
Resonanzfrequenzen: ¹H = 400 MHz, ¹³C = 100 MHz

Die ¹H- und ¹³C NMR-Spektren und die Ergebnisse ihrer Zuordnung (siehe chemische Formel [14]) sind nachfolgend in den 1 und 2 bzw. Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2 Ergebnisse der Zuordnung der ¹H- und ¹³C NMR-Spektren

d: Dublett, dd: doppeltes Dublett, t: Triplett, m: Multiplett

Außerdem lautete das Ergebnis der Auswertung des Molekulargewichts dieses PHA durch Gelpermeationschromatographie Mn = 72.000, Mw = 260.000 (GPC; Säule Tosoh HL C-8020; Polymer Laboratory PL Gel MIXED-C (5 μm); Lösungsmittel Chloroform; Polystyrol-Umrechnung).
Beispiel 2
200 ml Kulturmedium M9, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % TVA enthielt, wurden mit Pseudomonas cichorii YN2 geimpft und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 48 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und erneut in 200 ml Kulturmedium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % TVA und keine Nitratquelle (NH₄Cl) enthielt, und außerdem bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 42 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Nachdem die extrahierte Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert worden war, wurde sie mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, die eingeengte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde.
Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem herkömmlichen Verfahren unterzogen und dann durch Gaschromatographie – Massenspektrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Modus) analysiert, um eine Identifizierung der mit Methyl veresterten Substanzen der PHA-Monomereinheit vorzunehmen. Wie in Tabelle 3 gezeigt, wurde ein solches PHA folglich als PHA identifiziert, das eine Monomereinheit mit der vorstehend angegebenen chemischen Formel [6] aufweist.
Tabelle 3
Beispiel 3
200 ml Kulturmedium M9, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % TVA enthielt, wurden mit Pseudomonas cichorii H45 geimpft und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 48 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und erneut in 200 ml Kulturmedium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % TVA und keine Nitratquelle (NH₄Cl) enthielt, und außerdem bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 42 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Nachdem die extrahierte Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert worden war, wurde sie mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, die eingeengte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde.
Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem herkömmlichen Verfahren unterzogen und dann durch Gaschromatographie – Massenspektrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Modus) analysiert, um eine Identifizierung der mit Methyl veresterten Substanzen der PHA-Monomereinheit vorzunehmen. Wie in Tabelle 4 gezeigt, wurde ein solches PHA folglich als PHA identifiziert, das eine Monomereinheit mit der vorstehend angegebenen chemischen Formel [6] aufweist.
Tabelle 4
Beispiel 4
200 ml Kulturmedium M9, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % TVA enthielt, wurden mit Pseudomonas jessenii P161 geimpft und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 46 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und erneut in 200 ml Kulturmedium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % TVA und keine Nitratquelle (NN₄Cl) enthielt, und außerdem bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 41 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Nachdem die extrahierte Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert worden war, wurde sie mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, die eingeengte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde.
Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem herkömmlichen Verfahren unterzogen und dann durch Gaschromatographie – Massenspektrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Modus) analysiert, um eine Identifizierung der mit Methyl veresterten Substanzen der PHA-Monomereinheit vorzunehmen. Wie in Tabelle 5 gezeigt, wurde ein solches PHA folglich als PHA identifiziert, das eine Monomereinheit mit der vorstehend angegebenen chemischen Formel [6) aufweist.
Tabelle 5
Beispiel 5
200 ml Kulturmedium M9, das 0,5 % Polypepton (von Nihon Seiyaku hergestellt) und 0,1 % THxA enthielt, wurden mit Pseudomonas cichorii YN2 geimpft und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 48 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Nachdem die extrahierte Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert worden war, wurde sie mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, die eingeengte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde.
Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem herkömmlichen Verfahren unterzogen und dann durch Gaschromatographie – Massenspektrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Modus) analysiert, um eine Identifizierung der mit Methyl veresterten Substanzen der PHA-Monomereinheit vorzunehmen. Wie in Tabelle 6 gezeigt, wurde ein solches PHA folglich als PHA identifiziert, das eine Monomereinheit mit der vorstehend angegebenen chemischen Formel [8] aufweist.
Tabelle 6
Bei diesem PHA wurde eine Analyse bei folgenden Meßbedingungen durchgeführt, wobei eine Vorrichtung für die magnetische Kernresonanz (FT-NMR: Bruker DPX-400) verwendet wurde.
<Meßbedingung>

Gemessenes Nuclid: ¹H
verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃ (als Bezug wurde in einer Kapillare enthaltenes TMS/CDCl₃ verwendet)
Resonanzfrequenzen: ¹H = 400 MHz

Das ¹H NMR-Spektrum und die Ergebnisse seiner Zuordnung sind in 3 bzw. Tabelle 7 aufgeführt (siehe chemische Formeln: 3-Hydroxy-4-(2-thienyl)buttersäure [15], 3-Hydroxy-6-(2-thienyl)hexansäure [16] und 3-Hydroxybuttersäure [17]).
Tabelle 7

d: Dublett, dd: doppeltes Dublett, t: Triplett, quart: Quartett, m: Multiplett

Außerdem lautete das Ergebnis der Auswertung des Molekulargewichts dieses PHA durch Gelpermeationschromatographie Mn = 180.000, Mw = 411.000 (GPC; Säule Tosoh HL C-8020; Polymer Laboratory PL Gel MIXED-C (5 μm); Lösungsmittel Chloroform; Polystyrol-Umrechnung).
Beispiel 6
200 ml Kulturmedium M9, das 0,5 % Polypepton (von Nihon Seiyaku hergestellt) und 0,1 % THxA enthielt, wurden mit Pseudomonas jessenii P161 geimpft und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 48 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Nachdem die extrahierte Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert worden war, wurde sie mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, die eingeengte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde.
Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem herkömmlichen Verfahren unterzogen und dann durch Gaschromatographie – Massenspektrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Modus) analysiert, um eine Identifizierung der mit Methyl veresterten Substanzen der PHA-Monomereinheit vorzunehmen. Wie in Tabelle 8 gezeigt, wurde ein solches PHA folglich als PHA identifiziert, das eine Monomereinheit mit der vorstehend angegebenen chemischen Formel [8] aufweist.
Tabelle 8
Beispiel 7
200 ml Kulturmedium M9, das 0,5 % Polypepton (von Nihon Seiyaku hergestellt) und 0,1 % THxA enthielt, wurden mit Pseudomonas cichorii H45 geimpft und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 48 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Nachdem die extrahierte Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert worden war, wurde sie mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, die eingeengte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde.
Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem herkömmlichen Verfahren unterzogen und dann durch Gaschromatographie – Massenspektrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Modus) analysiert, um eine Identifizierung der mit Methyl veresterten Substanzen der PHA-Monomereinheit vorzunehmen. Wie in Tabelle 9 gezeigt, wurde ein solches PHA folglich als PHA identifiziert, das eine Monomereinheit mit der vorstehend angegebenen chemischen Formel [8] aufweist.
Tabelle 9
Beispiel 8
200 ml Kulturmedium M9, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % THxA enthielt, wurden mit Pseudomonas cichorii YN2 geimpft und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 48 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und erneut in 200 ml Kulturmedium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % THxA und keine Nitratquelle (NN₄Cl) enthielt, und außerdem bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 42 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Nachdem die extrahierte Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert worden war, wurde sie mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, die eingeengte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde.
Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem herkömmlichen Verfahren unterzogen und dann durch Gaschromatographie – Massenspektrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Modus) analysiert, um eine Identifizierung der mit Methyl veresterten Substanzen der PHA-Monomereinheit vorzunehmen. Wie in Tabelle 10 gezeigt, wurde ein solches PHA folglich als PHA identifiziert, das eine Monomereinheit mit der vorstehend angegebenen chemischen Formel [8] aufweist.
Tabelle 10
Beispiel 9
200 ml Kulturmedium M9, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % THxA enthielt, wurden mit Pseudomonas jessenii P161 geimpft und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 48 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und erneut in 200 ml Kulturmedium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % THxA und keine Nitratquelle (NH₄Cl) enthielt, und außerdem bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 42 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Nachdem die extrahierte Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert worden war, wurde sie mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, die eingeengte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde.
Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem herkömmlichen Verfahren unterzogen und dann durch Gaschromatographie – Massenspektrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Modus) analysiert, um eine Identifizierung der mit Methyl veresterten Substanzen der PHA-Monomereinheit vorzunehmen. Wie in Tabelle 11 gezeigt, wurde ein solches PHA folglich als PHA identifiziert, das eine Monomereinheit mit der vorstehend angegebenen chemischen Formel [8] aufweist.
Tabelle 11
Beispiel 10
200 ml Kulturmedium M9, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % THxA enthielt, wurden mit Pseudomonas cichorii H45 geimpft und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 48 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und erneut in 200 ml Kulturmedium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % THxA und keine Nitratquelle (NH₄Cl) enthielt, und außerdem bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 42 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Nachdem die extrahierte Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 um filtriert worden war, wurde sie mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, die eingeengte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde.
Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem herkömmlichen Verfahren unterzogen und dann durch Gaschromatographie – Massenspektrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Modus) analysiert, um eine Identifizierung der mit Methyl veresterten Substanzen der PHA-Monomereinheit vorzunehmen. Wie in Tabelle 12 gezeigt, wurde ein solches PHA folglich als PHA identifiziert, das eine Monomereinheit mit der vorstehend angegebenen chemischen Formel [8] aufweist.
Tabelle 12
Beispiel 11
200 ml Kulturmedium M9, das 0,5 % Polypepton (von Nihon Seiyaku hergestellt) und 0,1 % THpA enthielt, wurden mit Pseudomonas cichorii YN2 geimpft und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 48 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Nachdem die extrahierte Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert worden war, wurde sie mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, die eingeengte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde.
Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem herkömmlichen Verfahren unterzogen und dann durch Gaschromatographie – Massenspektrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Modus) analysiert, um eine Identifizierung der mit Methyl veresterten Substanzen der PHA-Monomereinheit vorzunehmen. Wie in Tabelle 13 gezeigt, wurde ein solches PHA folglich als PHA identifiziert, das eine Monomereinheit mit der vorstehend angegebenen chemischen Formel [9] aufweist.
Tabelle 13
Bei diesem PHA wurde eine Analyse bei folgenden Meßbedingungen durchgeführt, wobei eine Vorrichtung für die magnetische Kernresonanz (FT-NMR: Bruker DPX-400) verwendet wurde.
<Meßbedingung>

Das ¹H NMR-Spektrum und die Ergebnisse seiner Zuordnung sind in 4 bzw. Tabelle 14 aufgeführt (siehe chemische Formeln: 3-Hydroxy-5-(2-thienyl)valeriansäure [18] und 3-Hydroxy-7-(2-thienyl)heptansäure [19]).
Tabelle 14

d: Dublett, t: Triplett, m: Multiplett

Außerdem lautete das Ergebnis der Auswertung des Molekulargewichts dieses PHA durch Gelpermeationschromatographie Mn = 49.000, Mw = 88.000 (GPC; Säule Tosoh HL C-8020; Polymer Laboratory PL Gel MIXED-C (5 μm); Lösungsmittel Chloroform; Polystyrol-Umrechnung).
Beispiel 12
200 ml Kulturmedium M9, das 0,5 % Polypepton (von Nihon Seiyaku hergestellt) und 0,1 % THpA enthielt, wurden mit Pseudomonas jessenii P161 geimpft und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 48 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Nachdem die extrahierte Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert worden war, wurde sie mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, die eingeengte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde.
Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem herkömmlichen Verfahren unterzogen und dann durch Gaschromatographie – Massenspektrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Modus) analysiert, um eine Identifizierung der mit Methyl veresterten Substanzen der PHA-Monomereinheit vorzunehmen. Wie in Tabelle 15 gezeigt, wurde ein solches PHA folglich als PHA identifiziert, das eine Monomereinheit mit der vorstehend angegebenen chemischen Formel [9] aufweist.
Tabelle 15
Beispiel 13
200 ml Kulturmedium M9, das 0,5 % Polypepton (von Nihon Seiyaku hergestellt) und 0,1 % THpA enthielt, wurden mit Pseudomonas cichorii H45 geimpft und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 48 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Nachdem die extrahierte Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert worden war, wurde sie mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, die eingeengte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde.
Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem herkömmlichen Verfahren unterzogen und dann durch Gaschromatographie – Massenspektrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Modus) analysiert, um eine Identifizierung der mit Methyl veresterten Substanzen der PHA-Monomereinheit vorzunehmen. Wie in Tabelle 16 gezeigt, wurde ein solches PHA folglich als PHA identifiziert, das eine Monomereinheit mit der vorstehend angegebenen chemischen Formel [9] aufweist.
Tabelle 16
Beispiel 14
200 ml Kulturmedium M9, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % THpA enthielt, wurden mit Pseudomonas cichorii YN2 geimpft und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 48 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und erneut in 200 ml Kulturmedium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % THpA und keine Nitratquelle (NH₄Cl) enthielt, und außerdem bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 43 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Nachdem die extrahierte Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert worden war, wurde sie mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, die eingeengte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde.
Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem herkömmlichen Verfahren unterzogen und dann durch Gaschromatographie – Massenspektrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Modus) analysiert, um eine Identifizierung der mit Methyl veresterten Substanzen der PHA-Monomereinheit vorzunehmen. Wie in Tabelle 17 gezeigt, wurde ein solches PHA folglich als PHA identifiziert, das eine Monomereinheit mit der vorstehend angegebenen chemischen Formel [9] aufweist.
Tabelle 17
Beispiel 15
200 ml Kulturmedium M9, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % THpA enthielt, wurden mit Pseudomonas jessenii P161 geimpft und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 48 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und erneut in 200 ml Kulturmedium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % THpA und keine Nitratquelle (NH₄Cl) enthielt, und außerdem bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 42 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Nachdem die extrahierte Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert worden war, wurde sie mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, die eingeengte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde.
Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem herkömmlichen Verfahren unterzogen und dann durch Gaschromatographie – Massenspektrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Modus) analysiert, um eine Identifizierung der mit Methyl veresterten Substanzen der PHA-Monomereinheit vorzunehmen. Wie in Tabelle 18 gezeigt, wurde ein solches PHA folglich als PHA identifiziert, das eine Monomereinheit mit der vorstehend angegebenen chemischen Formel [9] aufweist.
Tabelle 18
Beispiel 16
200 ml Kulturmedium M9, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % THpA enthielt, wurden mit Pseudomonas cichorii H45 geimpft und bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 48 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und erneut in 200 ml Kulturmedium M9 suspendiert, das 0,5 % D-Glucose und 0,1 % THpA und keine Nitratquelle (NH₄Cl) enthielt, und außerdem bei 30°C einer Schüttelkultur mit 125 Ausschlägen/Minute unterzogen. Nach 43 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Dieses gefriergetrocknete Pellet wurde in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Nachdem die extrahierte Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert worden war, wurde sie mit einem Rotationsverdampfer eingeengt, die eingeengte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt, und es wurde nur der Niederschlag aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch das PHA erhalten wurde.
Das erhaltene PHA wurde der Methanolyse nach einem herkömmlichen Verfahren unterzogen und dann durch Gaschromatographie – Massenspektrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Modus) analysiert, um eine Identifizierung der mit Methyl veresterten Substanzen der PHA-Monomereinheit vorzunehmen. Wie in Tabelle 19 gezeigt, wurde ein solches PHA folglich als PHA identifiziert, das eine Monomereinheit mit der vorstehend angegebenen chemischen Formel [9] aufweist.
Tabelle 19
SEQUENZAUFSTELLUNG

Claims

Polyhydroxyalkanoat, das eine Monomereinheit mit der Zusammensetzung mit der folgenden chemischen Formel [1] aufweist: A_xB_{(1 – x)} [1](wobei in der vorstehenden Formel A zumindest eine Einheit mit der folgenden chemischen Formel [2] ist:
(wobei n für eine ganze Zahl von 1 bis 8 steht); und B zumindest eine Monomereinheit ist, die aus Monomereinheiten der folgenden chemischen Formel [3]:
(wobei p für eine ganze Zahl von 0 bis 10 steht) oder der chemischen Formel [4] ausgewählt ist:
(wobei q gleich 3 oder 5 ist); und x eine Zahl zwischen oder gleich 0,01 und 1 ist).
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, das eine Monomereinheit der chemischen Formel [5] umfaßt:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, das eine Monomereinheit der chemischen Formel [6] umfaßt:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, das eine Monomereinheit der chemischen Formel [7] umfaßt:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, das eine Monomereinheit der chemischen Formel [8] umfaßt:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, umfassend eine Monomereinheit der chemischen Formel [5]:
und auch eine Monomereinheit der chemischen Formel [7]:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, umfassend eine Monomereinheit der chemischen Formel [6]:
und auch eine Monomereinheit der chemischen Formel [8]:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, das nur eine Monomereinheit der chemischen Formel [5] umfaßt:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, das nur eine Monomereinheit der chemischen Formel [6] umfaßt:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, das nur eine Monomereinheit der chemischen Formel [7] umfaßt:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, das nur eine Monomereinheit der chemischen Formel [8] umfaßt:
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, wobei das Zahlenmittel des Molekulargewichts im Bereich von 10.000 bis 300.000 liegt.
Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat, umfassend das Züchten von Mikroorganismen, die Polyhydroxyalkanoat mit einer Monomereinheit mit der Zusammensetzung mit der folgenden chemischen Formel [1]: A_xB_{(1 – x)} [1](wobei in der vorstehenden Formel A zumindest eine Einheit mit der folgenden chemischen Formel [2] ist:
(wobei n eine ganze Zahl größer als oder gleich 1 ist); und B zumindest eine Monomereinheit ist, die aus Monomereinheiten der folgenden chemischen Formel [3]:
(wobei p für eine ganze Zahl von 0 bis 10 steht) oder der chemischen Formel [4] ausgewählt ist:
(wobei q gleich 3 oder 5 ist); und x eine Zahl zwischen oder gleich 0,01 und 1 ist) aus Thienylalkansäure synthetisieren können, wobei diese Thienylalkansäure verwendet wird, auf einem Kulturmedium, das diese Thienylalkansäure einschließt.
Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 13, wobei die Thienylalkansäure Thienylalkansäure mit der folgenden chemischen Formel [9] ist:
(wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist); und das Polyhydroxyalkanoat ein Polyhydroxyalkanoat ist, das eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [10] einschließt:
(wobei m in der vorstehenden Formel zumindest einen Wert aus der Gruppe von n, n-2, n-4 und n-6 hat und eine ganze Zahl größer als oder gleich 1 ist).
Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 13, umfassend einen Schritt des Züchtens von Mikroorganismen für die Produktion von Polyhydroxyalkanoat mit einer Monomereinheit mit der Zusammensetzung mit der chemischen Formel [1] unter Verwendung von Thienylalkansäure auf einem Kulturmedium, das die Thienylalkansäure und Saccharide einschließt.
Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 15, wobei das Züchten der Mikroorganismen in einer Stufe unter Verwendung eines Kulturmediums erfolgt, das Thienylalkansäure und Saccharide einschließt.
Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 15, wobei das Züchten der Mikroorganismen in zumindest zwei Stufen mit einer Kultur unter Verwendung eines Kulturmediums, das Thienylalkansäure und Saccharide einschließt, und einer Folgekultur unter Verwendung eines Kulturmediums durchgeführt wird, das Thienylalkansäure und Saccharide einschließt und weniger Stickstoffquellen aufweist.
Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 15, wobei die Saccharide zumindest ein Saccharid aus der Gruppe von Glucose, Fructose und Mannose sind.
Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 13, umfassend einen Schritt des Züchtens von Mikroorganismen für die Produktion von Polyhydroxyalkanoat mit einer Monomereinheit mit der Zusammensetzung mit der chemischen Formel [1] unter Verwendung von Thienylalkansäure auf einem Kulturmedium, das die Thienylalkansäure und Hefeextrakt einschließt.
Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 13, umfassend das Züchten von Mikroorganismen für die Produktion von Polyhydroxyalkanoat mit der Monomereinheit mit der Zusammensetzung mit der chemischen Formel [1] unter Verwendung von Thienylalkansäure auf einem Kulturmedium, das Thienylalkansäure und Polypepton einschließt.
Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 13, das ferner das Abtrennen des von den Mikroorganismen produzierten Polyhydroxyalkanoats umfaßt.
Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 13, wobei die Mikroorganismen Mikroorganismen von Pseudomonas sp. sind.
Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 22, wobei die Mikroorganismen zumindest ein Mikroorganismus sind, der aus der Gruppe von Pseudomonas putida P91 (FERM BP-7373), Pseudomonas cichorii H45 (FERM BP-7374), Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375) und Pseudomonas jessenii P161 (FERM BP-7376) ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 14, umfassend das Züchten von Mikroorganismen für die Produktion von Polyhydroxyalkanoat, das eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [6] einschließt:
unter Verwendung von 5-(2-Thienyl)valeriansäure auf einem Kulturmedium, das 5-(2-Thienyl)valeriansäure mit der folgenden chemischen Formel [11] einschließt
wobei das produzierte Polyhydroxyalkanoat eine Monomereinheit mit der chemischen Formel [6] einschließt.
Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 14, umfassend das Züchten von Mikroorganismen für die Produktion von Polyhydroxyalkanoat, das eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [7] einschließt:
unter Verwendung von 6-(2-Thienyl)hexansäure auf einem Kulturmedium, das 6-(2-Thienyl)hexansäure mit der folgenden chemischen Formel [12] einschließt:
wobei das produzierte Polyhydroxyalkanoat eine Monomereinheit mit der chemischen Formel [7] einschließt.
Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 14, umfassend das Züchten von Mikroorganismen für die Produktion von Polyhydroxyalkanoat, das eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [8] einschließt:
unter Verwendung von 7-(2-Thienyl)heptansäure auf einem Kulturmedium, das 7-(2-Thienyl)heptansäure mit der folgenden chemischen Formel [13] einschließt:
wobei das produzierte Polyhydroxyalkanoat eine Monomereinheit mit der chemischen Formel [8] einschließt.
Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 14, umfassend das Züchten von Mikroorganismen für die Produktion von Polyhydroxyalkanoat, das eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [5]:
und eine Monomereinheit mit der folgenden chemischen Formel (7] einschließt:
unter Verwendung von 6-(2-Thienyl)hexansäure auf einem Kulturmedium, das 6-(2-Thienyl)hexansäure mit der folgenden chemischen Formel [12] einschließt:
wobei das produzierte Polyhydroxyalkanoat eine Monomereinheit mit der chemischen Formel [5] und eine Monomereinheit mit der chemischen Formel (7] einschließt.
Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 14, umfassend das Züchten von Mikroorganismen für die Produktion von Polyhydroxyalkanoat, das eine Monomereinheit der folgenden chemischen Formel [6]:
und eine Monomereinheit mit der folgenden chemischen Formel [8] einschließt:
unter Verwendung von 7-(2-Thienyl)heptansäure auf einem Kulturmedium, das 7-(2-Thienyl)heptansäure mit der folgenden chemischen Formel [13] einschließt:
wobei das produzierte Polyhydroxyalkanoat eine Monomereinheit mit der chemischen Formel [6] und eine Monomereinheit mit der chemischen Formel [8] einschließt.