KR20010085689A - 3-하이드록시티에닐알칸산을 모노머유닛으로서 함유하는폴리하이드록시알카노에이트 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

티에닐알칸산을 함유하는 배지에서, 원료로서 티에닐알칸산을 이용해서, 3-하이드록시티에닐알칸산을 모노머유닛으로 지닌 신규의 폴리하이드록시알카노에이트를 합성가능한 미생물을 배양하고, 이 배양균체내에 생산된 폴리하이드록시알카노에이트를 추출해서 회수한다.

Description

3-하이드록시티에닐알칸산을 모노머유닛으로서 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 및 그 제조방법{POLYHYDROXYALKANOATE CONTAINING 3-HYDROXYTHIENYLALKANOIC ACID AS MONOMER UNIT AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME}
본 발명은, 신규의 폴리하이드록시알카노에이트(이하, "PHA"라 약칭함)에 관한 것이다. 또, 본 발명은, PHA를 생산해서 균체내에 축적할 수 있는 미생물을 이용한 이러한 PHA의 매우 효율적인 제조방법에 관한 것이다.
이제까지, 많은 미생물이 폴리-3-하이드록시부티르산(이하, "PHB"라 약칭함) 혹은 기타 PHA를 생산하여 균체내에 축적하는 것이 보고되어 있다("생분해성 플라스틱 핸드북", 생분해성 플라스틱연구회편, (주) 엔티에스(NTS Co., Ltd.)발행, p178-197). 종래의 플라스틱의 경우와 마찬가지로, 이들 폴리머는, 용융처리 등을 통해서 각종 제품을 제조하는 데 사용될 수 있다. 또한, 이들은, 생분해성이므로, 자연계에 있어서 미생물에 의해 완전히 분해되어, 많은 종래의 합성폴리머와는 달리 자연환경에 잔류해서 오염시키는 일은 없다. 또, 양호한 생체적합성을 지녀, 의료용 연질재료로서의 응용도 기대되고 있다.
또, 이들 PHA는 그 생산시에 이용되는 미생물의 종류나 배지조성, 배양조건 등에 따라 각종 조성이나 구조를 지니는 것으로 알려져 있고, 또, PHA물성의 개량이라고 하는 관점에서, 이들의 조성이나 구조의 제어에 관한 많은 연구가 행해져 왔다.
예를 들면, 알칼리젠스 유트로퍼스(Alcaligenes eutropus) H16(ATCC No.17699) 및 그 변이체는, 그 배양시의 탄소원을 변화시킴으로써, 3-하이드록시부티르산(이하, "3HB"라 약칭함) 및 3-하이드록시발레르산(이하, "3HV"라 약칭함)의 공중합체를 다양한 조성비로 생산하는 것이 보고되어 있다(일본국 공개특허 평 6-15604호 공보, 일본국 공개특허 평 7-14352호 공보, 일본국 공개특허 평 8-19227호 공보 등).
일본국 공개특허 평 5-74492호 공보에는, 메틸로박테리움속(Methylobacteriumsp.), 파라코커스속(Paracoccussp.), 알칼리제네스속(Alcaligenessp.) 또는 슈도모나스속(Pseudomonassp.)의 미생물을, 탄소수 3 내지 7개의 1급알콜에 접촉시킴으로써, 3HB와 3HV와의 공중합체를 생산시키는 방법이 개시되어 있다.
일본국 공개특허 평 5-93049호 공보 및 일본국 공개특허 평 7-265065호 공보에는, 아에로모나스 카비에(Aeromonas caviae)를, 올레산이나 올리브유를 탄소원으로 해서 배양함으로써, 3HB와 3-하이드록시헥산산(이하, "3HHx"라 칭함)의 2성분 공중합체를 생산하는 것이 개시되어 있다.
일본국 공개특허 평 9-191893호 공보에는, 코마모나스 아시도보란스(Comamonas acidovorans) IFO 13852는, 탄소원으로서 글루콘산 및 1,4-부탄디올을 이용해서 배양하면, 3HB와 4-하이드록시부티르산을 모노머유닛으로서 지니는 폴리에스테르를 생산하는 것이 개시되어 있다.
또, 현재, 탄소수를 대략 12개까지 지닌 중간사슬길이(이하, "mcl"이라 칭함)의 3-하이드록시알카노에이트(이하, "3HA"라 약칭함)로 이루어진 PHA에 대해서 예의 연구를 행하고 있다. PHA의 합성경로는 크게 2가지 형태로 분류될 수 있고, 그 구체적인 예로서 이하의 (1)항 및 (2)항 기재를 들 수 있다.
(1) β-산화를 이용한 합성
일본국 특허공보 제 2642937호에서는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonasoleovorans) ATCC 29347에, 탄소원으로서 비고리식 지방족 탄화수소를 부여할 경우, 탄소수 6 내지 12의 3-하이드록시알카노에이트의 모노머유닛을 지닌 PHA가 생산되는 것이 개시되어 있다. 또, Appl. Environ. Microbiol, 58(2), 746(1992)에는, 슈도모나스 레시노보란스(Pseudomonas resinovorans)가 옥탄산을 단일 탄소원으로 해서, 3-하이드록시부티르산, 3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시옥탄산 및 3-하이드록시데칸산(양비: 1:15:75:9)을 모노머유닛으로서 지닌 폴리에스테르를 생산하고, 또, 헥산산을 단일 탄소원으로 해서, 3-하이드록시부티르산, 3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시옥탄산 및 3-하이드록시데칸산(양비: 8:62:23:7)을 모노머유닛으로서 지닌 폴리에스테르를 생산하는 것이 보고되어 있다. 여기서, 원료 지방산보다도 사슬길이가 긴 3HA모노머유닛은 (2)항에 기재된 지방산 합성경로에 의한 것으로 추정된다.
(2) 지방산 합성경로를 이용한 합성
Int. J. Biol. Macromol., 16(3), 119(1994)에는, 슈도모나스속 61-3 균주가 글루콘산나트륨을 단일 탄소원으로 해서, 3-하이드록시부티르산, 3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시옥탄산, 3-하이드록시데칸산, 3-하이드록시도데칸산 등의 3-하이드록시알칸산과, 3-하이드록시-5-시스-데센산 등의 3-하이드록시알켄산을 모노머유닛으로 지닌 폴리에스테르를 생산하는 것이 보고되어 있다.
그런데, PHA의 생합성은, 통상, 균체내에서 각종 대사경로의 중간체로서 형성된 "D-3-하이드록시아실-CoA"를 매트릭스, 즉, 기질로서 사용하는 PHA신타제(synthase: 합성효소)에 의해 수행된다.
여기서, "CoA"란 "보조효소(coenzyme) A"를 의미한다. 그리고, 상기 (1)항의 종래기술에서 설명한 바와 같이, 탄소원으로서 옥탄산, 노난산 등의 지방산을 사용할 경우, PHA의 생합성은, 출발물질로서 "β-산화사이클"에서 형성된 "D-3-하이드록시아실-CoA"에 의해 행해진다.
"β-산화사이클"에 의해 PHA가 생합성되는 반응을 표시하면, 다음과 같다.
한편, 상기 (2)항의 종래기술에 있어서 기재한 바와 같이, 글루코스 등의 당류를 이용해서 PHA를 생합성할 경우, 출발물질로서 "지방산 합성경로"에서 형성된 "D-3-하이드록시아실-ACP"로부터 변환된 "D-3-하이드록시아실-CoA"를 이용해서 생합성을 행한다.
여기서, "ACP"란 "아실 담지 단백질(acyl carrier protein)"을 의미한다.
그런데, 전술한 바와 같이, 상기 (1)항 및 (2)항에 있어서 합성되는 PHA는 모두, "통상의(usual) PHA"인 곁사슬에 알킬기를 지닌 모노머유닛으로 이루어진 PHA이다. 그러나, 이와 같은 미생물생산 PHA의 보다 광범위한 응용, 예를 들면, 기능성 폴리머로서의 응용을 고려하면, 곁사슬에 도입되는 알킬기이외의 다른 치환기(예를 들면, 페닐기)를 지닌 PHA는 극히 유용한 것으로 기대된다. 다른 치환기의 예로서는, 불포화 탄화수소, 에스테르기, 알킬기, 시아노기, 할로겐화 탄화수소, 에폭사이드 등을 들 수 있다.
이러한 치환기가 도입된 PHA(이하, 필요에 따라 "특이한(unusual) PHA"라 칭함)의 합성에 대해서는, 예를 들면, Macromolecules, 24, p5256-5260(1991)에 있어서 β-산화를 이용한 합성의 점에서 아릴기 등을 지닌 PHA로서 보고되어 있다. 구체적으로는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가, 5-페닐발레르산(이하, "PVA"라 약칭함) 및 노난산(몰비 2:1, 총농도 10mmol/ℓ)을 이용해서, 3HV, 3-하이드록시헵탄산, 3-하이드록시노난산, 3-하이드록시운데칸산 및 3-하이드록시-5-페닐발레르산(이하, "3HPV"라 약칭함)을 모노머유닛으로서 0.6:16.0:41.1:1.7:40.6의 양비로 함유하는 PHA를 배지 1ℓ당 160㎎(균체에 대한 건조중량비가 31.6%임) 생산하고, 또, PVA 및 옥탄산(몰비 1:1, 총농도 10mmol/ℓ)을 이용해서, 3HHx, 3-하이드록시옥탄산, 3-하이드록시데칸산 및 3HPV를 모노머유닛으로서 7.3:64.5:3.9:24.3의 양비로 함유하는 PHA를 배지 1ℓ당 200㎎(균체질량에 대한 건조중량비가 39.2%임) 생산하는 것이 보고되어 있다. 이 보고서에 있어서의 PHA는, 노난산과 옥탄산을 사용하는 사실로부터 주로 β-산화에 의해 합성되는 것으로 여겨진다.
상기와 관련된 기재는, Macromol. Chem., 191, 1957-1965(1990) 및 Chirality, 3, 492-494(1991)에서도 발견되며, 아마도 함유된 3HPV에 의해 폴리머물성이 변화하는 것으로 인식되고 있다.
이상과 같이, 미생물생산 PHA에 대해서는, 그 생산에 이용되는 미생물의 종류나 배지조성, 배양조건 등을 변화시킴으로써 각종 조성 및 구성의 것을 얻을 수 있으나, 플라스틱으로서의 응용을 고려할 때 그들의 물성의 점에서 아직 충분하지 않다. 또, 미생물생산 PHA의 응용분야를 보다 확대하기 위해서는, 물성개량을 보다 폭넓게 검토하는 것이 중요하므로, 보다 다양한 구조의 모노머유닛을 함유하는 PHA와, 그 제조방법, 나아가서는 소망의 PHA를 효율적으로 생산할 수 있는 미생물의 개발과 탐색이 필수이다.
한편, 전술한 바와 같이 곁사슬에 치환기를 도입한 PHA(특이한 PHA)는, 도입하는 치환기를 소망의 특성 등에 따라서 선택함으로써, 매우 유용한 기능이나 특성을 갖춘 "기능성 폴리머"로서의 전개도 기대될 수 있고, 또한, 기능성과 생분해성의 양자를 만족시키는 우수한 PHA와, 그 제조방법, 나아가서는 소망의 PHA를 효율적으로 생산할 수 있는 미생물의 개발과 탐색도 중요하다.
이러한 치환기를 곁사슬에 도입한 PHA의 다른 예로서는, 페닐기나 페녹시기를 곁사슬에 지닌 PHA를 들 수 있다.
페닐기의 다른 예로서는, Macromolecules, 29, 1762-1766(1996)에, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 5-(4-톨릴)발레르산(5-(4-메틸페닐)발레르산)을 함유하는 배지에서의 배양을 통해 모노머유닛으로서 3-하이드록시-5-(4-톨릴)발레르산을 함유하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다.
또, Macromolecules, 32, 2889-2895(1999)에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 5-(2,4-디니트로페닐)발레르산과 노난산을 함유하는 배지에서의 배양을 통해 모노머로서 3-하이드록시-5-(2,4-디니트로페닐)발레르산 및 3-하이드록시-5-(4-니트로페닐)발레르산을 함유하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다.
또한, Macromol. Chem. Phys., 195, 1665-1672(1994)에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 11-페녹시운데칸산으로부터 3-하이드록시-5-페녹시발레르산과 3-하이드록시-9-페녹시노난산의 유닛을 함유하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다.
또, Macromolecules, 29, 3432-3435(1996)에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)를 이용해서, 6-페녹시헥산산으로부터 3-하이드록시-4-페녹시부티르산과 3-하이드록시-6-페녹시헥산산유닛을 함유하는 PHA, 8-페녹시옥탄산으로부터 3-하이드록시-4-페녹시부티르산과 3-하이드록시-6-페녹시헥산산과 3-하이드록시-8-페녹시옥탄산유닛을 함유하는 PHA 및 11-페녹시운데칸산으로부터 3-하이드록시-5-페녹시발레르산과 3-하이드록시-7-페녹시헵탄산유닛을 함유하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다. 이 보고서에 있어서의 폴리머의 수율은 다음 표와 같다.
탄소원(알카노에이트) 균체의 건조중량(㎎/ℓ) 폴리머의 건조중량(㎎/ℓ) 수율(%)
6-페녹시헥산산 950 100 10.5
8-페녹시옥탄산 820 90 11
11-페녹시운데칸산 150 15 10
또한, Can. J. Microbiol., 41, 32-43(1995)에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans) ATCC 29347 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) KT 2442를 이용해서, 옥탄산과 p-시아노페녹시헥산산 또는 p-니트로페녹시헥산산을 원료로 해서, 3-하이드록시-p-시아노페녹시헥산산 또는 3-하이드록시-p-니트로페녹시헥산산의 모노머유닛을 함유하는 PHA를 성공적으로 생산할 수 있는 것이 보고되어 있다.
일본국 특허 제 2989175호 공보에는, 3-하이드록시-5-(모노플루오로페녹시)펜타노에이트(이하, "3H5(MFP)P"라 약칭함)유닛 혹은 3-하이드록시-5-(디플루오로페녹시)펜타노에이트(이하, "3H5(DFP)P"라 약칭함)유닛으로 이루어진 호모폴리머; 적어도 3H5(MFP)P유닛 또는 3H5(DFP)P유닛을 함유하는 코폴리머; 이들 폴리머를 합성할 수 있는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida); 및 슈도모나스 속(Pseudomonassp.)을 이용한 상기의 폴리머의 제조방법이 기재되어 있다.
이들 생산은 이하와 같은 "2단계 배양"에 의해 행해지고 있다.
배양기간: 1단계-24시간; 2단계-96시간.
각 단계에 있어서의 탄소원과 얻어지는 폴리머는 다음과 같다.
(1) 얻어진 폴리머: 3H5(MFP)P 호모폴리머
1단계째의 탄소원: 시트르산, 효모엑스(추출물)
2단계째의 탄소원: 모노플루오로페녹시운데칸산
(2) 얻어진 폴리머: 3H5(DFP)P 호모폴리머
1단계째의 탄소원: 시트르산, 효모엑스
2단계째의 탄소원: 디플루오로페녹시운데칸산
(3) 얻어진 폴리머: 3H5(MFP)P 코폴리머
1단계째의 탄소원: 옥탄산 또는 노난산, 효모엑스
2단계째의 탄소원: 모노플루오로페녹시운데칸산
(4) 얻어진 폴리머: 3H5(DFP)P 호모폴리머
1단계째의 탄소원: 옥탄산 또는 노난산, 효모엑스
2단계째의 탄소원: 디플루오로페녹시운데칸산
치환기를 지닌 중간사슬길이의 지방산은, 사슬말단에 1 내지 2개의 불소원자가 치환된 페녹시기를 지닌 폴리머의 합성을 실현할 수 있고, 이러한 폴리머는, 높은 융점과 양호한 가공성을 유지하면서 입체규칙성과 발수성을 부여할 수 있는 효과를 지닌다.
또, 시클로헥실기를 모노머유닛중에 함유하는 PHA는, 통상의 지방족 하이드록시알칸산을 유닛으로서 함유하는 PHA와는 다른 고분자물성을 표시할 것으로 기대되고 있고, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)에 의한 생산예가 보고되어 있다(Macromolecules, 30, 1611-1615(1997)).
이 보고에 의하면, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)를, 노난산(이하, "NA"라 약칭함)과 시클로헥실부티르산(이하, "CHBA"라 약칭함) 혹은 시클로헥실발레르산(이하, "CHVA"라 약칭함)을 함유하는 배지중에서 배양하면, 시클로헥실기 유닛과, 노난산으로부터 유래된 유닛을 함유하는 PHA가 얻어지고 있다(각 비율은 알려져 있지 않음).
총농도를 20mmol/ℓ로 해서 CHBA와 NA의 양의 비를 변화시켜, 이하의 표에 표시한 결과를 얻었다.
NA:CHBA CDW PDW 수율 유닛
5:5 756.0 89.1 11.8 NA, CHBA
1:9 132.8 19.3 14.5 NA, CHBA
CDW: 균체의 건조중량(㎎/ℓ)
PDW: 폴리머의 건조중량(㎎/ℓ)
수율: PDW/CDW(%)
그러나, 이 경우에는, 배지당의 폴리머수율은 충분한 것은 아니었고, 또 얻어진 PHA 자체에도 모노머유닛중에 노난산유래의 지방족 하이드록시알칸산이 공존하고 있었다.
이상 설명한 바와 같이, 각종 치환기를 곁사슬에 도입한 PHA를 미생물을 이용해서 생산하고자 할 경우에는, 상기 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)의 보고예에서 알 수 있듯이, 도입하고자 하는 치환기를 지닌 알카노에이트를, 폴리머원료로서 뿐만 아니라 증식용 탄소원으로서도 이용하고 있다.
그러나, 도입하고자 하는 치환기를 지닌 알카노에이트를, 폴리머의 원료로서 뿐만 아니라 증식용 탄소원으로서도 이용하는 방법은, 알카노에이트의 β-산화를 통한 아세틸-CoA의 생성에 의거한 에너지원의 공급이 기대되고 있으나, 이러한 방법에 있어서는, 어느 정도의 사슬길이를 지닌 출발물질을 사용하지 않는 한 β-산화에 의해 아세틸-CoA를 생성할 수 없고, 이 때문에, PHA의 원료로서 이용될 수 있는 알카노에이트가 한정되어 버리는 점이 심각한 문제이다. 또, β-산화에 의해 사슬길이가 2개의 메틸렌사슬만큼 짧아진 기질이 새로이 생성되고, 이들이 PHA의 모노머유닛으로서 도입되므로, 합성된 PHA는 사슬길이가 메틸렌사슬 2개만큼 다른 모노머유닛으로 이루어진 공중합체로 되는 일이 많다. 전술한 보고예에서는, 8-페녹시옥탄산으로부터 유래된 3-하이드록시-8-페녹시옥탄산과, 대사산물로부터 유래된 부산물인 3-하이드록시-6-페녹시헥산산 및 3-하이드록시-4-페녹시부티르산의 3종류의 모노머유닛으로 이루어진 공중합체가 생산된다. 이 점에 있어서, 단일의 모노머유닛으로 이루어진 PHA를 이 방법으로 생산하는 것은 곤란하다. 또, β-산화에 의해 생성된 아세틸-CoA에 의거해서 에너지원을 공급하는 방법에서는, 미생물의 증식률이 느리기 때문에, PHA의 합성에 시간이 걸려, 합성된 PHA의 수율이 낮아지는 것도 심각한 문제이다.
이 때문에, 도입하고자 하는 치환기를 지닌 알카노에이트에 부가해서, 증식용 탄소원으로서 옥탄산, 노난산 등의 중간사슬길이의 지방산을 함유하는 배지에서 미생물을 배양한 후, PHA를 추출하는 방법이, 유효한 것으로 간주되어, 일반적으로 이용되고 있다.
그러나, 본 발명자들에 의한 고찰에 의하면, 증식용 탄소원으로서 옥탄산, 노난산 등의 중간사슬길이의 지방산을 사용하는 β-산화경로에 의해 합성된 PHA는 순도가 낮아, 얻어진 폴리머의 50%이상이, 증식용 탄소원으로부터 유래된 모노머유닛(예를 들면, 3-하이드록시옥탄산 및 3-하이드록시노난산)인 mcl-3HA모노머유닛,즉 "통상의 PHA"의 유닛이다. 이들 mcl-3HA유닛의 폴리머는, 단일 조성물인 경우 실온에서 점착성이 있고, 이들이 본 발명에서 의도하는 PHA중에 다량 공존할 경우, 해당 폴리머의 유리전이점(Tg)이 상당히 낮아진다. 따라서, 상온에서 경질인 폴리머를 얻고자 할 경우, mcl-3HA모노머유닛의 혼재는 바람직하지 않다. 또, 이와 같은 이종의 곁사슬구조의 존재는, 분자내 또는 분자간 곁사슬구조로부터 유래된 상호작용을 저해하여, 결정성 혹은 배향성에 큰 영향을 미친다. 폴리머의 물성의 향상, 새로운 기능의 부여를 달성하는 데, 이들 mcl-3HA모노머유닛의 혼재는 심각한 문제이다. 이 문제의 해결수단의 하나로서, 특정의 치환기를 지닌 모노머유닛만으로 이루어진 PHA를 얻기 위해, 증식용 탄소원으로부터 유래된 이러한 mcl-3HA모노머유닛과 같은 "목적외" 모노머유닛을 분리하여 제거하기 위한 정제공정을 부가하는 것을 들고 있으나, 이것은, 조작이 번잡해지는 외에, 수율의 상당한 저하도 피할 수 없다. 더 큰 문제점은, 목적으로 하는 모노머유닛과 목적외의 모노머유닛이 공중합체를 형성할 경우, 목적외의 모노머유닛만을 제거하는 것은 극히 곤란하다는 점이다. 특히, 불포화 탄화수소로부터 유래되는 기, 에스테르기, 알릴기, 시아노기, 니트로기, 할로겐화 탄화수소로부터 유래되는 기 또는 에폭사이드를 지닌 기와 같은 기를 곁사슬에 도입한 모노머유닛을 함유하는 PHA를 합성하고자 할 경우, mcl-3HA모노머유닛은 목적으로 하는 모노머유닛과 공중합체를 형성할 경우가 많아, PHA합성후의 mcl-3HA모노머유닛의 제거는 극히 곤란하다.
따라서, 본 발명자들은, 기능성 폴리머에의 적용을 고려할 때 "특이한 PHA"를 고순도로 얻을 수 있는 생합성법의 개발이 절실히 요구되는 것을 인식해서, 기능성과 생분해성의 양 특성을 지닌 우수한 폴리머 및 전술한 바와 같이 이러한 폴리머를 생산해서 그 균체내에 축적할 수 있는 미생물과, 그리고, 이러한 PHA를 고순도를 효율적으로 생합성하는 방법의 개발이 상당히 유용하고 중요하다고 여기게 되었다.
본 발명의 목적은, 상기 문제를 해결하여, 디바이스재료 및 의료용 재료로서 유용한 치환기를 곁사슬에 지닌 다양한 구조의 모노머유닛을 함유하는 PHA(특이한 PHA)와, 이러한 "특이한 PHA"를 미생물을 이용해서 생산할 수 있는 방법을 제공하는 데 있고, 특히, 혼재하는 목적외의 모노머유닛이 저감되어 소망의 "특이한 PHA"를 고순도로 얻을 수 있는 동시에 넓은 적용분야를 지닐 수 있는 제조방법을 제공하는 데 있다.
즉, 본 발명자들은, 디바이스재료 및 의료용 재료로서 유용한 작용기를 곁사슬에 지닌 PHA의 개발을 목적으로 해서, 각종 PHA를 생산해서 균체내에 축적가능한 미생물의 탐색 및 이들 미생물을 이용해서 소망의 PHA를 생산하는 방법에 대해 예의 연구를 행한 결과, 하기 화학식[9]:
(식중, n은 1 내지 8의 정수의 어느 하나임)로 표시되는 티에닐알칸산을 원료로서사용해서 하기 화학식[2]:
(식중, n은 1 내지 8의 정수의 어느 하나임)로 표시되는 3-하이드록시티에닐알칸산을 모노머유닛으로서 함유하는 신규의 PHA를 생산해서 균체내에 축적가능한 미생물을 발견하였고, 또한, 상기 화학식[9]로 표시되는 티에닐알칸산과, 당류, 효모엑스 또는 폴리펩톤의 공존하에 이들 미생물을 배양함으로써 이러한 PHA를 생합성 할 수 있는 것을 발견함과 동시에, 이와 같이 해서 얻어진 PHA가 고순도인 것을 발견하였다.
특히, 본 발명자들은, 하기 화학식[11]:
로 표시되는 5-(2-티에닐)발레르산(이하, "TVA"라 약칭함), 하기 화학식[12]:
로 표시되는 6-(2-티에닐)헥산산(이하, "THxA"라 약칭함) 및 하기 화학식[13]:
으로 표시되는 7-(2-티에닐)헵탄산(이하, "THpA"라 약칭함)의 적어도 어느 한 종을 원료로서 사용해서, 하기 화학식[5]:
로 표시되는 3-하이드록시-4-(2-티에닐)부티르산(이하, "3HTB"라 약칭함), 하기 화학식[6]:
으로 표시되는 3-하이드록시-5-(2-티에닐)발레르산(이하, "3HTV"라 약칭함), 하기화학식[7]:
로 표시되는 3-하이드록시-6-(2-티에닐)헥산산(이하, "3HTHx"라 약칭함) 및 하기 화학식[8]:
로 표시되는 3-하이드록시-7-(2-티에닐)헵탄산(이하, "3HTHp"라 약칭함)을 모노머유닛으로서 함유하는 신규의 PHA를 생산해서, 그 균체내에 축적가능한 미생물을 발견하였고, 또한, 이들 미생물을 TVA, THxA 또는 THpA와, 당류, 효모엑스 또는 폴리펩톤의 공존하에 배양시켜 이러한 PHA를 생합성할 수 있으며, 이와 같이 해서 얻어진 PHA가 고순도인 것을 발견하여, 본 발명에 이르게 되었다.
즉, 본 발명은, 하기 화학식[2]:
(식중, n은 1 내지 8의 정수의 어느 하나임)로 표시되는 모노머유닛을 지닌 폴리하이드록시알카노에이트에 관한 것이다.
또, 본 발명은, 하기 화학식[9]:
(식중, n은 1 내지 8의 정수의 어느 하나임)로 표시되는 티에닐알칸산을 함유하는 배지에서 미생물을 배양함으로써 이러한 미생물이 하기 화학식[10]:
(식중, m은 n, n-2, n-4 및 n-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개이상인 동시에 1이상의 정수임)으로 표시되는 대응하는 모노머유닛을 지닌 PHA를 생산하는 것을 특징으로 하는 PHA의 제조방법에 관한 것이다.
즉, 본 발명에 의한 PHA의 제조방법은, TVA, THxA 또는 THpA와, 당류, 효모엑스 또는 폴리펩톤의 공존하에 모노머유닛으로서 3HTB, 3HTV, 3HTHx 또는 3HTHp를 함유하는 PHA를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 지닌 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의하면, 청구항 제 1항에 기재된 화학식[1]로 표시되는 모노머유닛을 지닌 신규의 폴리하이드록시알카노에이트가 제공된다. 이것에 의해, 기능성 폴리머로서 유용한 폴리하이드록시알카노에이트를 효율적으로 생산할 수 있고, 디바이스재료, 의료용 재료 등의 각종 분야에의 적용을 기대할 수 있다.
본 발명에 의하면, 디바이스재료, 의료용 재료 등으로서 유용한 곁사슬에 치환기를 지닌 다양한 구조의 모노머유닛을 함유하는 PHA(특이한 PHA)를 제공하는 것이 가능하고, 또, 미생물을 이용해서 상기 "특이한 PHA"를 생산하는 방법을 제공하는 것이 가능하다. 특히, 목적외의 모노머유닛을 감소시켜, 소망의 "특이한 PHA"를 고순도 및 고수율로 얻을 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 실시예 1에 있어서 원료로서 TVA를 사용한 폴리머의1H-NMR스펙트럼도
도 2는 실시예 1에 있어서 원료로서 TVA를 사용한 폴리머의13C-NMR스펙트럼도
도 3은 실시예 5에 있어서 원료로서 THxA를 사용한 폴리머의1H-NMR스펙트럼도
도 4는 실시예 11에 있어서 원료로서 THpA를 사용한 폴리머의1H-NMR스펙트럼도
이하, 본 발명의 바람직한 실시형태예에 대해 구체적으로 설명한다.
본 발명의 PHA란, 디바이스재료, 의료용 재료 등에 유용한 곁사슬에 치환체를 지닌 다양한 구조의 모노머유닛을 함유하는 PHA, 보다 구체적으로는, 곁사슬에 티에닐기를 지닌 PHA이다. 또, 본 발명에 의한 PHA의 제조방법에 의하면, 미생물을 이용해서 소망의 PHA를 고순도 및 고수율로 제조하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 PHA는 통상 R-체만으로 이루어진 아이소택틱(즉, 입체규칙성) 중합체이다.
<종래기술과의 당류의 차이점>
본 발명에 의한 PHA를 생산하는 방법의 하나는, 미생물을 배양할 때, 소망의 모노머유닛을 도입하기 위한 알칸산뿐만 아니라 알칸산이외의 탄소원으로서 당류만을 배지에 첨가함으로써, 해당 미생물이 생산해서 축적하는PHA에 있어서 목적으로 하는 모노머유닛의 함유율을 현저하게 높은 것으로 하거나, 혹은 목적으로 하는 모노머유닛만으로 PHA를 구성하는 점을 특징으로 하고 있다. 이 특정의 모노머유닛의 우선화를 촉진하는 효과는, 배지중에, PHA의 원료로서 사용되는 알칸산 이외의 탄소원으로서 당류만을 첨가함으로써 실현되고 있다.
즉, 본 발명자들은, 목적으로 하는 모노머유닛을 도입하기 위한 알칸산과 함께 공존하는 탄소원으로서 당류를 사용해서 배양을 행하였고, 그 결과, 공존하는 탄소원으로서 노난산, 옥탄산 등의 mcl-알칸산을 이용하는 종래의 방법에 비해서, 목적으로 하는 PHA가 고수율 및 고순도로 얻어지는 것을 발견하였으며, 이 효과는, β-산화를 이용하지 않는 프로세스에 의해 미생물용의 탄소원 및 에너지원인 아세틸-CoA를 생성가능한 배양법에 의해 실현되며, 이것에 의해 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명의 방법에 있어서는, 미생물의 증식탄소원으로서 글루코스, 프럭토스, 만노스 등의 당류를 사용하고, 생산되는 PHA는, 당류와 공존하는 목적으로 하는 모노머유닛을 도입하기 위한 알카노에이트로 이루어져, 글루코스 등의 당류로부터 유래된 모노머유닛은 전혀 또는 거의 함유하지 않는다. 이 점에 있어서, 본 발명의 방법은, PHA에 도입되는 모노머유닛용의 출발물질로서 글루코스 등의 당류자체를 사용하는 종래의 PHA미생물생산법과는 구성과 효과가 기본적으로 다르다.
<종래기술과의 효모엑스의 차이점>
본 발명에 의한 PHA의 생산방법의 하나는, 미생물을 배양할 때, 배지에 목적으로 하는 모노머유닛을 도입하기 위한 알칸산뿐만 아니라 알칸산이외의 탄소원으로서 효모엑스만을 첨가함으로써, 미생물이 생산해서 축적하는 PHA에 있어서 목적으로 하는 모노머유닛의 함유율을 현저하게 높은 것으로 하거나, 혹은 목적으로 하는 모노머유닛만으로 PHA를 구성하는 점을 특징으로 하고 있다. 이 특정의 모노머유닛의 우선화를 촉진하는 효과는, 배지중에, 알칸산 이외의 탄소원으로서, 효모엑스만을 첨가함으로써 실현되고 있다.
미생물에 의한 PHA의 생산시에, 배지에 효모엑스를 이용하는 예로서, 일본국 공개특허 평 5-49487호 공보에 기재된 바와 같이, 로도박터(Rhodobacter)속에 속하는 미생물을 이용하는 방법을 들 수 있다. 그러나, 이 종래의 방법은, 치환기를 지니지 않은 하이드록시알칸산을 모노머유닛으로 하는, 일반적인 PHB 및 PHV를 생산하는 방법이다. 본 발명의 목적으로 하는 생합성경로는, PHB 및 PHV를 생산하는 생합성경로와는 독립된 경로인 것이 알려져 있고, 상기 일본국 공개특허 평 5-49487호 공보에 있어서는, 본 발명의 목적으로 하는 PHA의 합성경로에 있어서의 효모엑스의 효과에 대해서도 하등 언급이 없다. 또, 효모엑스의 효과도, 미생물이 일반적으로 생산하는 PHA 및 PHV에 관해서, 효모엑스를 첨가하면, 단지 균체내의 PHA축적량의 증대가 도모되는 효과가 있는 것을 표시하고 있을 뿐이며, 증식을 위해 효모엑스가 첨가되어 있지 않은 것이 명백히 기재되어 있다. 본 발명은 티에닐알칸산과 효모엑스를 공존시킴으로써 증식과 동시에 PHA의 생산과 축적을 행하는 것으로, 효모엑스가 발휘하는 효과가 전혀 다르다. 또, 본 발명의 효과인, 특정의 모노머유닛의 우선화에 대해서도 하등 언급되어 있지 않고, 본 발명과는 달리, 미생물이 생산하는 PHA조성에 있어서의 티에닐기를 치환기로서 지닌 특정의 모노머유닛의 우선화라고 하는 효과는 표시되어 있지 않다.
또한, 미생물에 의한 PHA의 생산에 효모엑스를 이용하는 예로서는, 전술한 일본국 특허 제 2989175호 공보에 기재된, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)를 이용하는 방법을 들 수 있다. 이 특허공보에 개시되어 있는 PHA의 생산방법은, 2단계 배양을 사용하는 것으로, PHA의 축적은 2단계째의 배양에 있어서만, 탄소원 이외의 영양원의 제한하에 행하는 것이 개시되어 있다. 이 점에서, 이 방법은, 티에닐알칸산과 효모엑스를 함유하는 배지에서의 1단계 배양만으로, 소망의 PHA의 합성과 축적을 행하는 본 발명의 방법과는 구성과 효과가 전혀 다르다. 또, 상기 일본국 특허 제 2989175호에 있어서의 효모엑스의 효과는, 2단계 배양을 이용할 때, 1단계째의 배양에 있어서, 단순히 2단계째의 배양에 이용되는 미생물의 증식만을 목적으로 한 것이며, 1단계째는 영양원이 풍부한 조건하에 배양되는 것으로 명확히 기재되어 있다. 여기서, PHA의 원료는, 1단계째의 배양에는 공존하고 있지 않다. 본 발명에 있어서의 효모엑스의 효과는, 티에닐알칸산과 효모엑스를 공존시킴으로써 증식과 함께 PHA의 생산과 축적을 행하는 것이므로, 효모엑스가 발휘하는 효과가 전혀 다르다. 또, 상기 일본국 특허 제 2989175호에서는 1단계째의 배양에 탄소원으로서 시트르산, 옥탄산 및 노난산의 어느 것이 공존하고 있으므로, 티에닐알칸산과 효모엑스만을 공존시키는 본 방법과는 구성에 있어서도 다른 것이다.
<종래기술과의 폴리펩톤의 차이점>
본 발명에 의한 PHA생산방법의 하나는, 미생물을 배양할 때, 배지에 목적으로 하는 모노머유닛을 도입하기 위한 알칸산뿐만 아니라 알칸산이외의 탄소원으로서 폴리펩톤만을 첨가함으로써, 미생물이 생산해서 축적하는 PHA에 있어서 목적으로 하는 모노머유닛의 함유율을 현저하게 높은 것으로 하거나, 혹은 목적으로 하는 모노머유닛만으로 PHA를 구성하는 점을 특징으로 하고 있다. 이 특정의 모노머유닛의 우선화를 촉진하는 효과는, 배지중에, 알칸산 이외의 탄소원으로서, 폴리펩톤만을 첨가함으로써 실현되고 있다.
또, 미생물에 의해 PHA를 생산하기 위해 폴리펩톤을 사용하는 예로서는, 일본국 공개특허 평 5-49487호 공보, 일본국 공개특허 평 5-64591호 공보, 일본국 공개특허 평 5-214081호 공보, 일본국 공개특허 평 6-145311호 공보, 일본국 공개특허 평 6-284892호 공보, 일본국 공개특허 평 7-48438호 공보, 일본국 공개특허 평 8-89264호 공보, 일본국 공개특허 평 9-191893호 공보 및 일본국 공개특허 평 11-32789호 공보에 있어서, 미생물을 이용해서 PHA를 생산할 때 배지에 폴리펩티드를 함유시키는 것이 개시되어 있으나, 어느 경우에 있어서도, 폴리펩티드를 예비배양단계, 즉, 단순히 균체를 증식시키는 단계에서 사용하고, 모노머유닛인 원료를 예비배양중에 함유시키지 않는다. 또, 폴리펩톤을 PHA를 생산하는 균체를 작성하는 과정에서 사용하는 예는 없다. 이에 대해서, 본 발명은, 목적으로 하는 모노머유닛을 도입하기 위한 알칸산과 이러한 알칸산이외의 탄소원으로서 폴리펩티드만을 공존시킴으로써 증식과 동시에 PHA의 생산과 축적을 행하는 것으로, 폴리펩티드를 이용하는 종래의 예와는 그 구성 및 효과가 전혀 다르다. 또, 본 발명의 효과인, 특정의 모노머유닛의 우선화에 대해서도 하등 언급되어 있지 않고, 본 발명과는 달리, 미생물이 생산하는 PHA조성에 있어서의 티에닐기를 치환기로서 지닌 특정의 모노머유닛의 우선화라고 하는 효과는 표시되어 있지 않다.
이하, 본 발명의 미생물, 배양방법 등에 대해 설명한다.
<PHA모노머유닛의 공급방식>
먼저, 소망의 PHA에 공존하게 될 mcl-3HA의 공급방식의 하나인 "지방산 합성경로"에 대해 상세히 설명한다.
글루코스 등의 당류를 탄소원으로서 사용한 경우, 세포성분으로서 필요한 알칸산은, 당류로부터 "해당계(glycolysis system)"를 통해서 생성되는 아세틸-CoA를 출발물질로 한 "지방산 합성경로"로부터 생합성된다. 또, 지방산합성에는, 신규(de novo) 합성경로와 탄소사슬연장경로가 있으며, 이하에 이들에 대해 설명한다.
(1) 신규(de novo) 합성경로
아세틸-CoA카르복실라제(EC 6.4.1.2)와 지방산 합성효소(EC 2.3.1.85)의 2개의 효소에 의해 촉매된다. 또, 아세틸-CoA카르복실라제는, 비오틴을 개재해서, 최종적으로 이하의 반응을 촉매하여 아세틸-CoA로부터 말로닐-CoA를 생성하는 효소이며, 반응은 하기 식:
아세틸-CoA + ATP + HCO3 -↔말로닐-CoA + ADP + Pi
으로 표시된다.
또, 지방산 합성효소는, 전이-축합-환원-탈수-환원의 반응사이클을 촉매하는 효소이며, 전체 반응은 다음 식:
아세틸-CoA + n말로닐-CoA + 2nNADPH + 2nH+
↔CH3(CH2)2nCOOH + nCO2+ 2nNADP++ (n-1)CoA
으로 표시된다.
또한, 효소의 종류에 따라, 반응생성물이 유리산, CoA유도체 또는 ACP유도체인 경우가 있다.
여기서, 아세틸-CoA는 하기 화학식:
으로 표시되고, 말로닐-CoA는 하기 화학식:
으로 표시된다.
또, CoA는 "보조효소 A"의 약칭이며, 하기 화학식:
으로 표시된다.
"D-3-하이드록시아실-ACP"는, 이들 경로중에서 이하의 경로를 통해 PHA의 생합성용의 모노머기질인 중간체로서 공급된다. 또, 이하의 반응식에 표시한 바와 같이, 경로는 탄소를 2개씩 부가하고, 최종적으로는 팔미트산으로 연장된다. 따라서, PHA생합성용의 모노머기질로서는, "D-3-하이드록시부틸-ACP"로부터 탄소수가 7개인 "D-3-하이드록시팔미틸-ACP"의 7종류의 "D-3-하이드록시아실-ACP"가 공급되는 것으로 된다.
2) 탄소사슬연장경로
이 경로는, 크게 2개의 경로로 분류되고, 그 중 하나는, 아실-ACP에 말로닐-ACP가 부가되어, 최종적으로 탄소사슬이 2개 연장된 아실-ACP(및 CO2)를 형성하는 경로(이하, "경로 A"라 칭함)이고, 다른 하나는, 아세틸-CoA에 아세틸-CoA가 부가되어, 최종적으로 탄소사슬이 2개 연장된 아실-CoA를 형성하는 경로(이하, "경로 B"라 칭함)이다. 각 경로에 대해 이하 설명한다.
·경로 A
R-CO-ACP + 말로닐-ACP →
R-CO-CH2-CO-ACP + CO2
R-CO-CH2-CO-ACP →
R-CHOH-CH2-CO-ACP →
R-CH=CH-CO-ACP →
R-CH2-CH2-CO-ACP
·경로 B
R-CO-CoA + 아세틸-CoA → R-CO-CH2-CO-CoA
R-CO-CH2-CO-CoA → R-CHOH-CH2-CO-CoA →
R-CH=CH-CO-CoA →R-CH2-CH2-CO-CoA
상기 A 및 B의 어느 경로도, 중간체로서 "D-3-하이드록시아실-CoA" 또는 "D-3-하이드록시아실-ACP"가 생성되어, "D-3-하이드록시아실-CoA"가 PHA합성용의 모노머기질로서 직접 사용되고, "D-3-하이드록시아실-ACP"는 ACP-CoA트랜스퍼라제(transferase: 전이효소)에 의해 "D-3-하이드록시아실-CoA"로 전환된 후 PHA합성용의 모노머기질로서 사용되는 것으로 생각할 수 있다.
또, 글루코스 등의 당류를 탄소원으로서 사용한 경우, 미생물세포중에는 "해당계"와 "지방산 합성경로"에 의해 mcl-3HA모노머유닛을 생성하는 것을 고려할 수 있다.
여기서, 예를 들면, 옥탄산이나 노난산 등의 mcl-알칸산 혹은 5-페닐발레르산, 4-페녹시부티르산, 4-시클로헥실부티르산 및 5-(2-티에닐)발레르산 등의 말단에 직선사슬의 지방족 알킬이외의 작용기가 부가된 알칸산은, CoA리가제(EC 6.2.1.3 등)에 의해 CoA유도체로 변환되어, β-산화계를 담당하는 효소군에 의해 PHA의 생합성의 모노머기질인 "D-3-하이드록시아실-CoA"로 직접 변화된다.
즉, 당류로부터 생성되는 mcl-3HA모노머유닛은 극히 다단계 효소반응을 통해(즉, 간접적으로) 생성되는 한편, mcl-3HA모노머유닛은 mcl-알칸산으로부터 극히 직접 생성된다.
이제, 미생물의 증식을 담당하는 아세틸-CoA의 생성에 대해 설명한다. 목적으로 하는 모노머유닛을 도입하기 위한 알칸산이외에, mcl-알칸산을 공존시키는 방법에 있어서, 이들 알칸산은, β-산화방식을 통함으로써, 아세틸-CoA가 생성된다. 일반적으로, mcl-알칸산은, 거대한 치환기를 지닌 알칸산(페닐기, 페녹시기, 시클로헥실기, 티에닐기 등을 지닌 알칸산)에 비해서 β-산화방식의 효소군에 대한 친화도가 높아, 아세틸-CoA는, mcl-알칸산의 공존에 의해 효율적으로 생성되는 것으로 고려할 수 있다. 따라서, 에너지원 및 탄소원으로서 아세틸-CoA를 이용하는 미생물의 증식에 유리하다.
그러나, β-산화방식을 통한 mcl-알칸산이 직접 PHA의 모노머유닛으로 변환되므로, 생산된 PHA는, 목적으로 하는 모노머유닛이외에 다량의 mcl-3HA모노머유닛을 함유하는 것이 심각한 문제이다.
이 문제를 해결하기 위해서, 아세틸-CoA 또는 에너지원 및 탄소원을 효율적으로 공급할 수 있는 mcl-알칸산이외의 물질을 선택해서 목적으로 하는 알칸산에 공존시키는 방법이 바람직하다. 이미 설명한 바와 같이, 아세틸-CoA는, 지방산합성경로를 통해 PHA의 모노머유닛으로 될 수 있으나, 이것은, 아세틸-CoA가 mcl-알칸산에 비해서 많은 다단계반응을 경유할 필요가 있는 간접법이고, 아세틸-CoA를 생성가능한 물질의 농도 등의 배양조건을 적절하게 선택함으로써, 실질적으로 전혀 또는 거의 mcl-3HA가 공존하지 않는 제조법을 얻는 것이 가능하다.
또한, 1단계째에 있어서 미생물의 증식만을 목적으로 하는 배양을 행하고, 2단계째에 있어서 탄소원으로서 배지에 목적으로 하는 알칸산만을 첨가하는 제조방법이 통상 이용된다. 이 때, 본 발명자들에 의하면, 알칸산이 아실-CoA로 되는 β-산화방식의 개시발효효소인 아실-CoA리가제가 ATP를 필요로 한다는 사실에 의거해서, 2단계째에 있어서도 에너지원으로서 미생물이 사용할 수 있는 물질이 보다 효과적인 방법이라는 결론에 도달해, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명에 있어서, 아세틸-CoA 또는 에너지원 및 탄소원을 효율적으로 공급할 수 있는 물질로서는, 글리세르알데하이드, 에리트롤, 아라비노스, 크실로스, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스 등의 알도스류, 글리세롤, 에리트리톨, 자일리톨 등의 알디톨류, 글루콘산 등의 알돈산류, 글루크론산, 갈락투론산 등의 우론산류, 말토스, 슈크로즈, 락토스 등의 이당류 등의 당류이외에, β-산화방식을 통하지 않고 아세틸-CoA 또는 에너지원 및 탄소원을 효율적으로 공급할 수 있는 화합물인 한, 효모엑스, 폴리펩톤, 고기엑스 및 카사민산 등의 천연물질로부터 유래된 배지성분을 포함하는 어느 화합물도 사용할 수 있고, 이들은 사용되는 균주용의 물질로서의 유용성에 의거해서 적절하게 선택하면 된다. 또한, 조합물이 공존하는 mcl-3HA의 환원을 가능하게 하는 한, 복수종의 화합물을 선택해서 사용할 수 있다.
<미생물>
본 발명에서 사용되는 미생물에 대해서는, TVA, THxA 또는 THpA를 원료로 해서, 상기 3HTB, 3HTV, 3HTHx 또는 3HTHp를 모노머유닛으로서 함유하는 PHA를 생산할 수 있는 것인 한, 어느 미생물이라도 사용가능하며, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 범위내에서, 필요에 따라 복수종의 미생물을 혼합해서 사용해도 된다.
본 발명자들은, TVA, THxA 또는 THpA를 원료로 해서, 상기 3HTB, 3HTV, 3HTHx 또는 3HTHp를 모노머유닛으로서 함유하는 PHA를 생산가능한 미생물의 탐색을 행한 결과, 본 발명자들이 토양으로부터 분리한 미생물인, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) P91, 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45, 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2 및 슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161가 소망의 능력을 지니는 PHA를 생산가능한 것을 발견하였다. 또, P91균주, H45균주, YN2균주 및 P161균주는 각각, 일본국 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 특허미생물기탁센터에 기탁되어 있고, 또, 이들 미생물은, 부타페스트조약에 의거한 국제 기탁소에 수탁되어 있다. 국제 기탁번호는 다음과 같다.
P91균주: "FERM BP-7373"
H45균주: "FERM BP-7374"
YN2균주: "FERM BP-7375"
P161균주: "FERM BP-7376"
이하, P91균주, H45균주, YN2균주 및 P161균주에 대해 상세히 설명한다.또, P161균주에 대해서는, 16S rRNA의 염기서열이 서열번호 1로 표시되어 있다.
<P91균주의 균학적 성질>
(1) 형태학적 성질
세포의 형상과 크기: 간상균, 0.6㎛×1.5㎛
세포의 다형성: 없음
운동성: 있음
포자형성: 없음
그램염색: 음성
콜로니형상: 원형, 전체 가장자리가 매끄러움, 저볼록형상, 표면이 원활, 광 택있음, 크림색
(2) 생리학적 성질
카탈라제: 양성
옥시다제: 양성
O/F시험: 산화형
질산환원: 음성
인돌생산: 음성
글루코스 산성화: 음성
아르기닌디하이드롤라제: 양성
우레아제: 음성
에스쿨린가수분해: 음성
젤라틴가수분해: 음성
β-갈락토시다제: 음성
King's B 한천에서의 형광색생산: 양성
(3) 기질동화능
글루코스: 양성
L-아라비노스: 음성
D-만노스: 음성
D-만니톨: 음성
N-아세틸-D-글루코사민: 음성
말토스: 음성
글루콘산 칼륨: 양성
n-카프르산: 양성
아디프산: 음성
dl-말산: 양성
시트르산 나트륨: 양성
아세트산 페닐: 양성
<H45균주의 균학적 성질>
(1) 형태학적 성질
세포의 형상과 크기: 간상균, 0.8㎛×(1.0 내지 1.2)㎛
세포의 다형성: 없음
운동성: 있음
포자형성: 없음
그램염색: 음성
콜로니형상: 원형, 전체 가장자리가 매끄러움, 저볼록형상, 표면이 원활, 광 택있음, 크림색
(2) 생리학적 성질
카탈라제: 양성
옥시다제: 양성
O/F시험: 산화형
질산환원: 음성
인돌생산: 음성
글루코스 산성화: 음성
아르기닌디하이드롤라제: 음성
우레아제: 음성
에스쿨린가수분해: 음성
젤라틴가수분해: 음성
β-갈락토시다제: 음성
King's B 한천에서의 형광색생산: 양성
4%NaCl에서의 생육: 음성
폴리-β-하이드록시부티르산의 축적: 음성
(3) 기질동화능
글루코스: 양성
L-아라비노스: 음성
D-만노스: 양성
D-만니톨: 양성
N-아세틸-D-글루코사민: 양성
말토스: 음성
글루콘산 칼륨: 양성
n-카프르산: 양성
아디프산: 음성
dl-말산: 양성
시트르산 나트륨: 양성
아세트산 페닐: 양성
<YN2균주의 균학적 성질>
(1) 형태학적 성질
세포의 형상과 크기: 간상균, 0.8㎛×(1.5 내지 2.0)㎛
세포의 다형성: 없음
운동성: 양성
포자형성: 없음
그램염색: 음성
콜로니형상: 원형, 전체 가장자리가 매끄러움, 저볼록형상, 표면이 원활, 광택있음, 투명함
(2) 생리학적 성질
카탈라제: 양성
옥시다제: 양성
O/F시험: 산화형
질산환원: 음성
인돌생산: 양성
글루코스 산성화: 음성
아르기닌디하이드롤라제: 음성
우레아제: 음성
에스쿨린가수분해: 음성
젤라틴가수분해: 음성
β-갈락토시다제: 음성
King's B 한천에서의 형광색생산: 양성
4%NaCl에서의 생육: 양성(약)
폴리-β-하이드록시부티르산의 축적: 양성
Tween 80의 가수분해: 양성
(3) 기질동화능
글루코스: 양성
L-아라비노스: 양성
D-만노스: 음성
D-만니톨: 음성
N-아세틸-D-글루코사민: 음성
말토스: 음성
글루콘산 칼륨: 양성
n-카프르산: 양성
아디프산: 음성
dl-말산: 양성
시트르산 나트륨: 양성
아세트산 페닐: 양성
<P161균주의 균학적 성질>
(1) 형태학적 성질
세포의 형상과 크기: 구형상, 직경 Φ0.6㎛ 또는 간상 0.6㎛×(1.5 내지 2.0)㎛
세포의 다형성: 있음(신장형)
운동성: 있음
포자형성: 없음
그램염색: 음성
콜로니형상: 원형, 전체 가장자리가 매끄러움, 저볼록형상, 표면이 원활, 광택있음, 담황색
(2)생리학적 성질
카탈라제: 양성
옥시다제: 양성
O/F시험: 산화형
질산환원: 양성
인돌생산: 음성
글루코스 산성화: 음성
아르기닌디하이드롤라제: 양성
우레아제: 음성
에스쿨린가수분해: 음성
젤라틴가수분해: 음성
β-갈락토시다제: 음성
King's B 한천에서의 형광색생산: 양성
(3) 기질동화능
글루코스: 양성
L-아라비노스: 양성
D-만노스: 양성
D-만니톨: 양성
N-아세틸-D-글루코사민: 양성
말토스: 음성
글루콘산 칼륨: 양성
n-카프르산: 양성
아디프산: 음성
dl-말산: 양성
시트르산 나트륨: 양성
아세트산 페닐: 양성
<배양>
본 발명의 증식용 탄소원 및 소망의 모노머유닛을 도입하기 위한 알카노에이트를 함유하는 배지에 이들 미생물을 배양함으로써 소망의 PHA를 생산하는 것이 가능하다. 이 PHA는 R-체만으로 이루어진, 아이소택틱 폴리머이다.
본 발명에 관한 PHA의 제조방법에 이용되는 미생물의 통상의 배양, 예를 들면, 보존균주의 작성, 균체의 수나 활성상태를 확보하기 위한 증식 등에는, 이용하는 미생물의 증식에 필요한 성분을 함유하는 배지를 적절하게 선택해서 이용한다. 예를 들면, 미생물의 생육이나 생존에 악영향을 미치지 않는 것인 한, 일반적인 천연배지(육즙, 효모엑스 등)나 영양원을 첨가한 합성배지 등의 소정 종류의 배지를 이용하는 것이 가능하다.
배양에는, 미생물이 증식되어 PHA를 생산하는 배양프로세스인 한 액체배양이나 고체배양 등의 어떠한 배양프로세스를 이용해도 된다. 또, 배양의 종류로서는, 배치(batch)식 배양, 유동배치식 배양, 반연속배양, 연속배양 등을 들 수 있고, 특히 제한은 없다. 액체배치식 배양의 형태로서는, 진탕플라스크에 의한 진탕을 통해 산소를 공급하는 방법, 자(jar)발효기를 이용하는 교반통기방식의 산소공급방법 등을 들 수 있다. 이들 프로세스를 2가지 이상 접속한 다단방식을 채용해도 된다.
상기 PHA생산 미생물을 이용해서 3HTB, 3HTV, 3HTHx 또는 3HTHp를 모노머유닛으로서 함유하는 PHA를 생산할 경우, 적어도 PHA생산용 원료로서 각각 대응하는 TVA, THxA 또는 THpA와, 증식용 탄소원을 함유하는 무기배지 등을 사용해도 된다. 증식용 탄소원으로서는, 효모엑스, 폴리펩톤, 고기엑스 등의 영양분을 사용할 수 있고, 또한, β-산화방식을 통하지 않고 아세틸-CoA를 생산하는 화합물인 한, 글리세르알데하이드, 에리트롤, 아라비노스, 크실로스, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스 등의 알도스류, 글리세롤, 에리트리톨, 자일리톨 등의 알디톨류, 글루콘산 등의 알돈산류, 글루크론산, 갈락투론산 등의 우론산류, 말토스, 슈크로즈, 락토스 등의 이당류 등의 당류를 사용할 수 있으며, 이들은, 사용되는 균주의 탄소원으로서의 유용성에 의거해서 적절하게 선택해도 된다. 또, 조합물이 공존하는 mcl-3HA의 환원을 가능하게 하는 한, 복수종의 화합물을 선택해서 사용할 수 있다. 이들중, 당류가 특히 바람직하게 사용되며, 보다 바람직하게는, 글루코스, 프럭토스 및 만노스로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다. 미생물에 의해 PHA를 생산해서 축적시키는 방법에 대해서는, 미생물을 충분히 증식시킨 후, 그 균체를, 염화암모늄 등의 질소원이 제한된 배지로 옮기고, 목적으로 하는 유닛의 원료가 첨가된 화합물에 의해 배양을 행함으로써 생산성을 향상시킬 수 있다. 구체적으로는, 상기 소망의 프로세스를 2종 이상 접속시킨 다단 방식을 채용한다. 예를 들면, D-글루코스 0.05% 내지 5.0%정도, 및 TVA 0.01% 내지 1.0%정도를 함유하는 무기배지 등에서 대수증식상 또는 정상기의 시점까지 배양하고, 균체를 원심분리기 등에 의해 회수한 후, TVA, THxA 또는 THpA를 0.01%에서 1.0%정도 함유한, 질소원을 제한한 혹은 질소원이 제한된 또는 거의 존재하지 않는 무기배지에서 더욱 배양하는 방법이 있다.
상기의 배양방법에 이용되는 무기배지로서는, 인원(예를 들면, 인산염 등), 질소원(예를 들면, 암모늄염, 질산염 등) 등 미생물의 증식을 허용하는 성분을 함유하고 있는 것이면 어느 것이라도 되며, 예를 들면, 무기염의 배지로서는, MSB배지, E배지(J. Biol. Chem., 218: 97-106(1956)), M9배지 등을 들 수 있다.
또, 본 발명의 실시예에서 사용된 M9배지의 조성은 다음과 같다.
Na2HPO4: 6.2g
KH2PO4: 3.0g
NaCl: 0.5g
NH4Cl: 1.0g
(배지 1ℓ중, pH 7.0)
또, PHA의 바람직한 증식 및 생산을 위해서는, 상기 무기배지에 하기 미량성분용액을 약 0.3%(v/v) 첨가하는 것이 바람직하다.
미량성분용액
니트릴로 트리아세트산: 1.5g
MgSO4: 3.0g
MnSO4: 0.5g
NaCl: 1.0g
FeSO4: 0.1g
CaCl2: 0.1g
CoCl2:0.1g
ZnSO4: 0.1g
CuSO4: 0.1g
AlK(SO4)2: 0.1g
H3BO3: 0.1g
Na2MoO4: 0.1g
NiCl2: 0.1g
(1리터당)
배양온도는, 상기 균주가 바람직하게 증식될 수 있는 온도이면 되고, 예를 들면, 14℃ 내지 40℃, 바람직하게는 20℃ 내지 35℃정도이다.
구체적인 예로서는, D-글루코스 0.05% 내지 5.0%정도 및 TVA 0.01% 내지1.0%정도를 함유하는 무기배지 등에서 대수증식상 또는 정상기의 시점까지 배양함으로써, 목적외의 모노머유닛이 거의 또는 전혀 공존하지 않는 소망의 PHA를 추출할 수 있다. 이 PHA는 통상 R-체만으로 이루어진, 아이소택틱 폴리머이다.
D-글루코스 대신에 효모엑스 또는 폴리펩톤을 동일량 부여해도 되고, 그 조합물을 이용해도 된다.
<PHA의 회수>
본 발명의 방법에 있어서의 배양액으로부터의 PHA의 회수는, 통상 행해지고 있는 방법을 적용할 수 있다. PHA가 배양액중에 분비될 경우에는, 배양액으로부터의 추출정제방법이 사용되고, 또, PHA가 균체에 축적되는 경우에는, 균체로부터의 추출정제방법이 이용된다. 예를 들면, 미생물의 배양균체로부터의 PHA의 회수에는, 통상 행해지고 있는 클로로포름 등의 유기용매를 이용한 추출이 가장 간편하나, 클로로포름대신에 아세톤을 사용하는 경우도 있다. 또, 유기용매가 사용되기 어려운 환경중에 있어서는, SDS 등의 계면활성제를 이용한 처리, 리소자임 등의 효소를 이용한 처리, EDTA, 차아염소산 나트륨, 암모니아 등의 약제를 이용한 처리에 의해서 PHA이외의 균체성분을 제거해서, PHA를 회수하는 방법을 이용하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명의 미생물의 배양, 본 발명의 미생물에 의한 PHA의 생산과 균체내로의 축적, 그리고, 본 발명에 있어서의 균체로부터의 PHA의 회수는, 상기 방법으로 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 표시한다. 또, 이하의 설명중, "%"는 특별한 언급이 없는한 중량에 의거한 것이다.
(실시예)
실시예 1
효모엑스(디프코(Difco)사 제품) 0.5% 및 TVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 푸티다 P91균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조하였다.
이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전식 증발기에서 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.
얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정(同定)을 행하였다. 그 결과, 하기 표 1에 표시한 바와 같이, 이러한 PHA는, 3HTV만을 모노머유닛으로서 지닌 PHA로 확인되었다.
슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) P91에 의한 PHA의 생산
균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 590mg/ℓ7mg/ℓ1%
모노머유닛의 조성(GC-MS, TIC피크면적비)3-하이드록시-5-(2-티에닐)발레르산 100%
이 PHA에 대해서, 핵자기공명장치(FT-NMR: 브루커(Bruker) DPX 400)를 이용해서, 이하의 측정조건하에서 분석을 행하였다.
<측정조건>
측정핵종:1H,13C
사용용매: CDCl3(기준으로서 모세관에 봉입된 TMS/CDCl3를 사용하였음)
공명주파수:1H = 400MHz,13C = 100MHz
그의1H-NMR스펙트럼과,13C-NMR스펙트럼 및 귀속결과(하기 화학식[14] 참조)를 도 1과 도 2 및 하기 표 2에 각각 표시한다.
1H- 및13C-NMR스펙트럼의 귀속결과
1H 13C
위치 화학적 이동/ppm 적분치 타입 화학적 이동/ppm
a - - - 169.1
b 2.52 2 m 35.5
c 5.23 1 m 70.0
d 1.97 2 m 35.5
e 2.82 2 m 25.5
f - - - 143.4
g 6.76 1 dd 124.4
h 6.87 1 dd 126.8
i 7.07 1 d 123.2
d: 2중선, dd: 더블2중선, t: 3중선, m: 다중선
또, 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔-MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의한 이 PHA의 분자량의 측정결과, Mn=72,000, Mw=260,000이었다.
실시예 2
D-글루코스 0.5% 및 TVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 TVA 0.1%를 함유하지만, 질산염원(NH4Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 42시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조하였다.
이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전식 증발기에서 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.
얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 3에 표시한 바와 같이, 이러한 PHA는, 상기 화학식[6]으로 표시되는 모노머유닛을 지닌 PHA로 확인되었다.
슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2에 의한 PHA의 생산
균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 1300mg/ℓ820mg/ℓ63%
모노머유닛의 조성(GC-MS, TIC피크면적비)3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시-5-(2-티에닐)발레르산 1%1%1%97%
실시예 3
D-글루코스 0.5% 및 TVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 H45균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 TVA 0.1%를 함유하지만, 질산염원(NH4Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 42시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조하였다.
이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전식 증발기에서 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.
얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 4에 표시한 바와 같이, 이러한PHA는, 상기 화학식[6]으로 표시되는 모노머유닛을 지닌 PHA로 확인되었다.
슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45에 의한 PHA의 생산
균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 660mg/ℓ270mg/ℓ41%
모노머유닛의 조성(GC-MS, TIC피크면적비)3-하이드록시옥탄산3-하이드록시-5-(2-티에닐)발레르산 1%99%
실시예 4
D-글루코스 0.5% 및 TVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 젯세니이 P161균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 46시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 TVA 0.1%를 함유하지만, 질산염원(NH4Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 41시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조하였다.
이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전식 증발기에서 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.
얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 5에 표시한 바와 같이, 이러한PHA는, 상기 화학식[6]으로 표시되는 모노머유닛을 지닌 PHA로 확인되었다.
슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161에 의한 PHA의 생산
균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 820mg/ℓ480mg/ℓ59%
모노머유닛의 조성(GC-MS, TIC피크면적비)3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시-5-(2-티에닐)발레르산 1%1%98%
실시예 5
폴리펩톤(니혼세이야쿠사 제품) 0.5% 및 THxA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조하였다.
이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전식 증발기에서 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에서 냉메탄올중에서 침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.
얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 6에 표시한 바와 같이, 이러한 PHA는, 상기 화학식[8]로 표시되는 모노머유닛을 지닌 PHA로 확인되었다.
슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2에 의한 PHA의 생산
균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 620mg/ℓ300mg/ℓ48%
모노머유닛의 조성(GC-MS, TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시-4-(2-티에닐)부티르산3-하이드록시-6-(2-티에닐)헥산산 16%4%80%
이 PHA에 대해서, 핵자기공명장치(FT-NMR: 브루커 DPX 400)를 이용해서, 이하의 측정조건하에서 분석을 행하였다.
<측정조건>
측정핵종:1H
사용용매: CDCl3(기준으로서 모세관에 봉입된 TMS/CDCl3를 사용하였음)
공명주파수:1H = 400MHz
그의1H-NMR스펙트럼 및 귀속결과(하기 화학식: 3-하이드록시-4-(2-티에닐)부티르산[15], 3-하이드록시-6-(2-티에닐)헥산산[16] 및 3-하이드록시부티르산[17] 참조)를 도 3 및 하기 표 7에 각각 표시한다.
화학적 이동(ppm) 적분치 타입 귀속결과
1.27 0.41 d d3
1.63 3.95 m d2, e2
2.40-2.63 2.43 m b1, b2, b3
2.79 1.99 m f2
3.12 0.06 m d1
5.17-5.27 1.15 m c2, c3
5.33 0.04 m c1
6.74 0.82 dd h2
6.80 0.04 m f2
6.86 0.86 quart g1, i2
7.05 0.82 dd j2
7.10 0.04 dd h1
d: 2중선, dd: 더블2중선, t: 3중선, quart: 4중선, m: 다중선
또, 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔-MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의한 이 PHA의 분자량의 측정결과, Mn=180,000, Mw=411,000이었다.
실시예 6
폴리펩톤(니혼세이야쿠사 제품) 0.5% 및 THxA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 젯세니이 P161균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조하였다.
이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전식 증발기에서 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.
얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 8에 표시한 바와 같이, 이러한 PHA는, 상기 화학식[8]로 표시되는 모노머유닛을 지닌 PHA로 확인되었다.
슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161에 의한 PHA의 생산
균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 390mg/ℓ170mg/ℓ44%
모노머유닛의 조성(GC-MS, TIC피크면적비)3-하이드록시-4-(2-티에닐)부티르산3-하이드록시-6-(2-티에닐)헥산산 4%96%
실시예 7
폴리펩톤(니혼세이야쿠사 제품) 0.5% 및 THxA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 H45균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조하였다.
이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전식 증발기에서 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.
얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 9에 표시한 바와 같이, 이러한 PHA는, 상기 화학식[8]로 표시되는 모노머유닛을 지닌 PHA로 확인되었다.
슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45에 의한 PHA의 생산
균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 350mg/ℓ140mg/ℓ40%
모노머유닛의 조성(GC-MS, TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시-4-(2-티에닐)부티르산3-하이드록시-6-(2-티에닐)헥산산 1%5%94%
실시예 8
D-글루코스 0.5% 및 THxA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 THxA 0.1%를 함유하지만, 질산염원(NH4Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 42시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조하였다.
이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전식 증발기에서 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.
얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 10에 표시한 바와 같이, 이러한 PHA는, 상기 화학식[8]로 표시되는 모노머유닛을 지닌 PHA로 확인되었다.
슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2에 의한 PHA의 생산
균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 1280mg/ℓ660mg/ℓ52%
모노머유닛의 조성(GC-MS, TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시테트라데칸산3-하이드록시-4-(2-티에닐)부티르산3-하이드록시-6-(2-티에닐)헥산산 2%1%7%14%5%8%2%61%
실시예 9
D-글루코스 0.5% 및 THxA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 젯세니이 P161균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 THxA 0.1%를 함유하지만, 질산염원(NH4Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 42시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조하였다.
이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전식 증발기에서 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.
얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 11에 표시한 바와 같이, 이러한 PHA는, 상기 화학식[8]로 표시되는 모노머유닛을 지닌 PHA로 확인되었다.
슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161에 의한 PHA의 생산
균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 1080mg/ℓ534mg/ℓ49%
모노머유닛의 조성(GC-MS, TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시테트라데칸산3-하이드록시-4-(2-티에닐)부티르산3-하이드록시-6-(2-티에닐)헥산산 1%1%5%6%2%3%3%79%
실시예 10
D-글루코스 0.5% 및 THxA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 H45균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 THxA 0.1%를 함유하지만, 질산염원(NH4Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 42시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조하였다.
이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전식 증발기에서 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.
얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 12에 표시한 바와 같이, 이러한 PHA는, 상기 화학식[8]로 표시되는 모노머유닛을 지닌 PHA로 확인되었다.
슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45에 의한 PHA의 생산
균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 1150mg/ℓ620mg/ℓ54%
모노머유닛의 조성(GC-MS, TIC피크면적비)3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시테트라데칸산3-하이드록시-4-(2-티에닐)부티르산3-하이드록시-6-(2-티에닐)헥산산 4%6%2%3%3%82%
실시예 11
폴리펩톤(니혼세이야쿠사 제품) 0.5% 및 THpA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조하였다.
이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전식 증발기에서 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.
얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 13에 표시한 바와 같이, 이러한 PHA는, 상기 화학식[9]로 표시되는 모노머유닛을 지닌 PHA로 확인되었다.
슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2에 의한 PHA의 생산
균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 590mg/ℓ220mg/ℓ37%
모노머유닛의 조성(GC-MS, TIC피크면적비)3-하이드록시-5-(2-티에닐)발레르산3-하이드록시-7-(2-티에닐)헵탄산 82%18%
이 PHA에 대해서, 핵자기공명장치(FT-NMR: 브루커 DPX 400)를 이용해서, 이하의 측정조건하에서 분석을 행하였다.
<측정조건>
측정핵종:1H
사용용매: CDCl3(기준으로서 모세관에 봉입된 TMS/CDCl3를 사용하였음)
공명주파수:1H = 400MHz
그의1H-NMR스펙트럼 및 귀속결과(하기 화학식: 3-하이드록시-5-(2-티에닐)발레르산[18] 및 3-하이드록시-7-(2-티에닐)헵탄산[19] 참조)를 도 4 및 하기 표 14에 각각 표시한다.
화학적 이동(ppm) 적분치 타입 귀속결과
1.33 0.40 m e2
1.64 0.80 m d2, f2
1.96 1.60 m d1
2.45-2.59 2.02 m b1, b1
2.77-2.82 1.99 m e1, g2
5.15-5.24 1.00 m c1, c2
6.74 0.97 d g1, i2
6.86 1.00 t h1, j2
7.06 0.97 d i1, k2
d: 2중선, t: 3중선, m: 다중선
또, 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔-MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의한 이 PHA의 분자량의 측정결과, Mn=49,000, Mw=88,000이었다.
실시예 12
폴리펩톤(니혼세이야쿠사 제품) 0.5% 및 THpA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 젯세니이 P161균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조하였다.
이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전식 증발기에서 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.
얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 15에 표시한 바와 같이, 이러한 PHA는, 상기 화학식[9]로 표시되는 모노머유닛을 지닌 PHA로 확인되었다.
슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161에 의한 PHA의 생산
균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 970mg/ℓ550mg/ℓ56%
모노머유닛의 조성(GC-MS, TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시-5-(2-티에닐)발레르산3-하이드록시-7-(2-티에닐)헵탄산 4%61%36%
실시예 13
폴리펩톤(니혼세이야쿠사 제품) 0.5% 및 THpA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 H45균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조하였다.
이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전식 증발기에서 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.
얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 16에 표시한 바와 같이, 이러한 PHA는, 상기 화학식[9]로 표시되는 모노머유닛을 지닌 PHA로 확인되었다.
슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45에 의한 PHA의 생산
균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 450mg/ℓ200mg/ℓ44%
모노머유닛의 조성(GC-MS, TIC피크면적비)3-하이드록시-5-(2-티에닐)발레르산3-하이드록시-7-(2-티에닐)헵탄산 68%32%
실시예 14
D-글루코스 0.5% 및 THpA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 THpA 0.1%를 함유하지만, 질산염원(NH4Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 43시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조하였다.
이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전식 증발기에서 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.
얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 17에 표시한 바와 같이, 이러한 PHA는, 상기 화학식[9]로 표시되는 모노머유닛을 지닌 PHA로 확인되었다.
슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2에 의한 PHA의 생산
균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 1540mg/ℓ1090mg/ℓ71%
모노머유닛의 조성(GC-MS, TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시테트라데칸산3-하이드록시-5-(2-티에닐)발레르산3-하이드록시-7-(2-티에닐)헵탄산 1%1%3%6%3%5%58%23%
실시예 15
D-글루코스 0.5% 및 THpA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 젯세니이 P161균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 THpA 0.1%를 함유하지만, 질산염원(NH4Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 42시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조하였다.
이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전식 증발기에서 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.
얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 18에 표시한 바와 같이, 이러한 PHA는, 상기 화학식[9]로 표시되는 모노머유닛을 지닌 PHA로 확인되었다.
슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161에 의한 PHA의 생산
균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 1180mg/ℓ736mg/ℓ62%
모노머유닛의 조성(GC-MS, TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시테트라데칸산3-하이드록시-5-(2-티에닐)발레르산3-하이드록시-7-(2-티에닐)헵탄산 1%2%2%1%2%62%30%
실시예 16
D-글루코스 0.5% 및 THpA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 H45균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 THpA 0.1%를 함유하지만, 질산염원(NH4Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 43시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조하였다.
이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전식 증발기에서 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.
얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 19에 표시한 바와 같이, 이러한 PHA는, 상기 화학식[9]로 표시되는 모노머유닛을 지닌 PHA로 확인되었다.
슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45에 의한 PHA의 생산
균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 1240mg/ℓ851mg/ℓ69%
모노머유닛의 조성(GC-MS, TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시테트라데칸산3-하이드록시-5-(2-티에닐)발레르산3-하이드록시-7-(2-티에닐)헵탄산 1%2%2%1%1%63%30%
이상, 본 발명에 의하면, 하기 청구항 제 1항에 기재된 화학식[1]로 표시되는 모노머유닛을 지닌 신규의 폴리하이드록시알카노에이트를 제공할 수 있다. 이것에 의해, 기능성 폴리머로서 유용한 폴리하이드록시알카노에이트를 효율적으로 제조할 수 있고, 디바이스재료, 의료용 재료 등의 각종 분야에의 응용을 기대할 수 있다.
또, 본 발명에 의하면, 디바이스재료, 의료용 재료 등으로서 유용한 곁사슬에 치환기를 지닌 다양한 구조의 모노머유닛을 함유하는 PHA(특이한 PHA)를 제공하는 것이 가능하고, 또, 미생물을 이용해서 상기 "특이한 PHA"를 생산하는 방법을 제공하는 것이 가능하다. 특히, 목적외의 모노머유닛을 감소시켜, 소망의 "특이한 PHA"를 고순도 및 고수율로 얻을 수 있는 방법을 제공할 수 있다.

Claims (28)

  1. 하기 화학식[1]:
    AxB(1-x)[1]
    [식중, A는 하기 화학식[2]:
    (식중, n은 1 내지 8중 어느 하나의 정수임)로 표시되는 적어도 1종이고;
    B는 하기 화학식[3]:
    (식중, p는 0 내지 10중 어느 하나의 정수임) 또는 하기 화학식[4]:
    (식중, q는 3 또는 5임)로 표시되는 모노머유닛으로부터 선택된 적어도 1종이고;
    x는 0.01 내지 1사이의 수임]로 표시되는 모노머유닛조성을 지닌 폴리하이드록시알카노에이트.
  2. 제 1항에 있어서, 하기 화학식[5]:
    로 표시되는 모노머유닛을 함유해서 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트.
  3. 제 1항에 있어서, 하기 화학식[6]:
    으로 표시되는 모노머유닛을 함유해서 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트.
  4. 제 1항에 있어서, 하기 화학식[7]:
    로 표시되는 모노머유닛을 함유해서 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트.
  5. 제 1항에 있어서, 하기 화학식[8]:
    로 표시되는 모노머유닛을 함유해서 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트.
  6. 제 1항에 있어서, 하기 화학식[5]:
    로 표시되는 모노머유닛을 함유하고, 또, 하기 화학식[7]:
    로 표시되는 모노머유닛을 함유해서 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트.
  7. 제 1항에 있어서, 하기 화학식[6]:
    으로 표시되는 모노머유닛을 함유하고, 또, 하기 화학식[8]:
    로 표시되는 모노머유닛을 함유해서 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트.
  8. 제 1항에 있어서, 하기 화학식[5]:
    로 표시되는 모노머유닛을 함유해서 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트.
  9. 제 1항에 있어서, 하기 화학식[6]:
    으로 표시되는 모노머유닛만으로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트.
  10. 제 1항에 있어서, 하기 화학식[7]:
    로 표시되는 모노머유닛만으로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트.
  11. 제 1항에 있어서, 하기 화학식[8]:
    로 표시되는 모노머유닛만으로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트.
  12. 제 1항에 있어서, 수평균분자량이 10,000 내지 300,000의 범위내인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트.
  13. 티에닐알칸산을 함유하는 배지에서, 티에닐알칸산을 이용해서 티에닐알칸산으로부터, 하기 화학식[1]:
    AxB(1-x)[1]
    [식중, A는 하기 화학식[2]:
    (식중, n은 1 내지 8중 어느 하나의 정수임)로 표시되는 적어도 1종이고;
    B는 하기 화학식[3]:
    (식중, p는 0 내지 10중 어느 하나의 정수임) 또는 하기 화학식[4]:
    (식중, q는 3 또는 5임)로 표시되는 모노머유닛으로부터 선택된 적어도 1종이고;
    x는 0.01 내지 1사이의 수임]로 표시되는 모노머유닛조성을 지닌 폴리하이드록시알카노에이트를 합성가능한 미생물을 배양하는 공정으로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 티에닐알칸산이 하기 화학식[9]:
    (n은 1 내지 8중 어느 하나의 정수임)로 표시되는 티에닐알칸산이고,
    상기 폴리하이드록시알카노에이트가 하기 화학식[10]:
    (식중, m은 n, n-2, n-4 및 n-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개이상인 동시에 1이상의 정수임)으로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  15. 제 13항에 있어서, 티에닐알칸산과 당류를 함유하는 배지에서, 티에닐알칸산을 이용해서, 상기 화학식[1]로 표시되는 모노머유닛조성을 지닌 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하기 위한 미생물을 배양하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 미생물의 배양은, 티에닐알칸산과 당류를 함유하는 배지를 이용해서 1단계로 행하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 미생물의 배양은, 티에닐알칸산과 당류를 함유하는 배지를 사용한 배양과, 그 후, 티에닐알칸산과 당류를 함유하는 동시에 질소원을저감한 배지를 사용한 배양의 적어도 2단계로 행하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  18. 제 15항에 있어서, 상기 당류는, 글루코스, 프럭토스 및 만노스로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  19. 제 13항에 있어서, 티에닐알칸산과 효모엑스를 함유하는 배지에서, 티에닐알칸산을 이용해서, 상기 화학식[1]로 표시되는 모노머유닛조성을 지닌 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하기 위한 미생물을 배양하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  20. 제 13항에 있어서, 티에닐알칸산과 폴리펩톤을 함유하는 배지에서, 티에닐알칸산을 이용해서, 상기 화학식[1]로 표시되는 모노머유닛조성을 지닌 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하기 위한 미생물을 배양하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  21. 제 13항에 있어서, 상기 미생물이 생산한 폴리하이드록시알카노에이트를 단리하는 공정을 또 구비한 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  22. 제 13항에 있어서, 상기 미생물이 슈도모나스속(Pseudomonassp.)의 미생물인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 미생물이 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) P91(FERM BP-7373), 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45(FERM BP-7374), 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2(FERM BP-7375) 및 슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161(FERM BP-7376)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  24. 제 14항에 있어서, 하기 화학식[11]:
    로 표시되는 5-(2-티에닐)발레르산을 함유하는 배지에서, 5-(2-티에닐)발레르산을 이용해서, 하기 화학식[6]:
    으로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하기 위한 미생물을 배양하는 공정을 구비하고,
    생산된 폴리하이드록시알카노에이트가 상기 화학식[6]으로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  25. 제 14항에 있어서, 하기 화학식[12]:
    로 표시되는 6-(2-티에닐)헥산산을 함유하는 배지에서, 6-(2-티에닐)헥산산을 이용해서, 하기 화학식[7]:
    로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 구비하고,
    생산된 폴리하이드록시알카노에이트가 상기 화학식[7]로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  26. 제 14항에 있어서, 하기 화학식[13]:
    으로 표시되는 7-(2-티에닐)헵탄산을 함유하는 배지에서, 7-(2-티에닐)헵탄산을 이용해서, 하기 화학식[8]:
    로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하기 위한 미생물을 배양하는 공정을 구비하고,
    생산된 폴리하이드록시알카노에이트가 상기 화학식[8]로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  27. 제 14항에 있어서, 하기 화학식[12]:
    로 표시되는 6-(2-티에닐)헥산산을 함유하는 배지에서, 6-(2-티에닐)헥산산을 이용해서, 하기 화학식[5]:
    로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 동시에 하기 화학식[7]:
    로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하기 위한 미생물을 배양하는 공정을 구비하고,
    생산된 폴리하이드록시알카노에이트가 상기 화학식[5]로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 동시에 상기 화학식[7]로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  28. 제 14항에 있어서, 하기 화학식[13]:
    으로 표시되는 7-(2-티에닐)헵탄산을 함유하는 배지에서, 7-(2-티에닐)헵탄산을 이용해서, 하기 화학식[6]:
    으로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 동시에 하기 화학식[8]:
    로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하기 위한 미생물을 배양하는 공정을 구비하고,
    생산된 폴리하이드록시알카노에이트가 상기 화학식[6]으로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 동시에 상기 화학식[8]로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
KR10-2001-0010202A 2000-02-29 2001-02-28 3-하이드록시티에닐알칸산을 모노머유닛으로서 함유하는폴리하이드록시알카노에이트 및 그 제조방법 KR100447966B1 (ko)

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