KR20020070643A - 곁사슬에 비닐페닐구조를 지닌폴리하이드록시알카노에이트 폴리에스테르 및 그 생산방법 - Google Patents

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Abstract

3-하이드록시-ω-(4-비닐페닐)알칸산유닛을 1유닛%이상 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트형 폴리에스테르 및 미생물에 의한 그의 생산방법을 제공한다.

Description

곁사슬에 비닐페닐구조를 지닌 폴리하이드록시알카노에이트 폴리에스테르 및 그 생산방법{POLYHYDROXYALKANOATE POLYESTER HAVING VINYL PHENYL STRUCTURE IN THE SIDE CHAIN AND ITS PRODUCTION METHOD}
발명의 분야
본 발명은 신규한 유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)형 폴리에스테르 및 미생물을 이용한 그의 생산방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 3-하이드록시-ω-(4-비닐페닐)알칸산유닛을 함유하는 PHA폴리에스테르 및 원료로서 ω-(4-비닐페닐)알칸산을 이용해서 PHA를 생산할 수 있는 미생물을 이용한 이러한 PHA의 생산방법에 관한 것이다.
배경기술
지금까지, 많은 미생물이 폴리-3-하이드록시부티르산(PHB) 혹은 기타 PHA를 생산하여 그 균체내에 축적하는 것이 보고되어 있다("생분해성 플라스틱 핸드북",생분해성 플라스틱연구회편, (주) 엔티에스(N.T.S.)발행, p178-197(1995)). 종래의 플라스틱의 경우와 마찬가지로, 이들 폴리머는, 용융처리 등을 통해서 각종 제품을 제조하는 데 사용될 수 있다. 또한, PHA와 같은 미생물에 의해 생산된 폴리머(이하, "미생물생산 폴리머"라 칭함)는, 생분해성이므로, 자연계에 있어서 미생물에 의해 완전히 분해되는 이점이 있다. 따라서, 예를 들면, 종래의 합성폴리머화합물과는 달리, 폐기된 미생물생산 폴리머는, 자연환경에 잔류해서 오염시키는 일은 없다. 또, 미생물생산 PHA는, 일반적으로 생체적합성이 우수하므로, 의료용 연질부재에의 응용도 기대되고 있다.
또, 이러한 미생물생산 PHA는, 생산에 사용되는 미생물의 종류나 배지조성, 배양조건 등에 따라 각종 조성이나 구조를 지니는 것으로 알려져 있고, 또, 이제까지, 주로 PHA물성의 개량이라고 하는 관점에서, 이들 미생물생산 PHA의 조성이나 구조의 제어에 관한 많은 연구가 행해져 왔다.
미생물생산 PHA의 조성이나 구조의 제어를 목적으로 하는 연구의 일부로서, 최근, 유닛중에 방향고리를 지닌 PHA를 미생물이 생산시키도록 하는 각종 연구가 행해져 왔다.
5-페닐발레르산을 기질로서 이용해서 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛을 함유하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다(Makromol. Chem., 191, 1957-1965(1990) 및 Macromolecules, 24, 5256-5260(1991)).
또, Macromolecules, 29, 1762-1766(1996)에, 슈도모나스올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 5-(p-톨릴)발레르산을 기질로서 이용해서 3-하이드록시-5-(p-톨릴)발레르산유닛을 함유하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다.
또한, Macromolecules, 32, 2889-2895(1999)에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 5-(2,4-디니트로페닐)발레르산을 기질로서 이용해서 3-하이드록시-5-(2,4-디니트로페닐)발레르산유닛 및 3-하이드록시-5-(p-니트로페닐)발레르산유닛을 함유하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다.
Macromol. Chem. Phys., 195, 1665-1672(1994)에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 11-페녹시운데칸산을 기질로서 이용해서 3-하이드록시-5-페녹시발레르산유닛과 3-하이드록시-9-페녹시노난산유닛을 함유하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다.
또, 일본국 공고특허 제 2989175호 공보에는, 3-하이드록시-5-(모노플루오로페녹시)펜타노에이트(3H5(MFP)P)유닛 혹은 3-하이드록시-5-(디플루오로페녹시)펜타노에이트(3H5(DFP)P)유닛으로 이루어진 호모폴리머; 적어도 3H5(MFP)P유닛 또는 3H5(DFP)P유닛을 함유하는 코폴리머; 이들 폴리머를 생산하는 능력을 지닌 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida); 및 슈도모나스속을 이용한 이들의 제조방법이 개시되어 있다. 또한, 상기 미생물은, 이러한 치환된 페녹시기를 지닌 긴 사슬지방산을 자화해서 곁사슬말단에 1 내지 2개의 불소원자가 치환된 페녹시기를 지닌 폴리머를 생산할 수 있는 것도 개시되어 있고, 그 발명의 이점으로서, 이러한 폴리머는 융점이 높은 데다가, 가공성이 양호하고, 또한, 입체규칙성과 발수성을 부여하는 것이 기재되어 있다.
또한, 상기 유닛중의 방향고리상에 불소원자를 지닌 불소치환 PHA이외에, 유닛중의 방향고리상에 시아노 및/또는 니트로기가 치환된 PHA도 연구되고 있다.
Can. J. Microbiol., 41, 32-43(1995) 및 Polymer International, 39, 205-213(1996)에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans) ATCC 29347균주 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) KT 2442균주가, 옥탄산과 6-(p-시아노페녹시)헥산산 또는 6-(p-니트로페녹시)헥산산을 기질로 사용해서, 3-하이드록시-6-(p-시아노페녹시)헥산산 또는 3-하이드록시-6-(p-니트로페녹시)헥산산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA를 생산할 수 있는 것이 보고되어 있다.
이러한 치환된 방향고리를 지닌 유닛을 함유하는 PHA는, 융점이 높고 가공성도 양호하다고 하는 방향고리에 유래하는 폴리머특성을 지니면서, 방향고리상에 존재하는 치환기에 유래하는 기능도 지니므로 다기능의 PHA로 된다.
한편, 유닛중에 비닐기를 지닌 PHA폴리머의 곁사슬에, 비닐기를 이용한 화학변환을 통해 소망의 작용기를 도입함으로써, 다기능의 PHA를 얻는 것을 목적으로 한 연구도 활발히 진행되고 있다.
Polymer, 41, 1703-1709(2000)에는, 슈도모나스에 의해 곁사슬에 비닐기를 지닌 폴리에스테르를 생산한 후, 비닐기를 산화시켜, 곁사슬에 수산기를 지닌 폴리에스테르를 생산한 것이 보고되어 있다.
마찬가지로, Macromolecules, 31, 1480-1486(1998)에는, 슈도모나스 올레오보란스에 의해, 곁사슬에 비닐기를 지닌 폴리에스테르를 생산한 후, 해당 비닐기를에폭시화함으로써, 상기 곁사슬상에 에폭시기를 함유하는 폴리에스테르를 생산한 것이 보고되어 있다.
또, Polymer, 40, 3787-3793(1999)에는, 마찬가지의 방법에 의해 얻어진 에폭시기를 곁사슬에 지닌 폴리머를, 헥사메틸렌디아민과 함께 가열한 경우, 그 가교반응과 생성물에 대한 해석이 보고되어 있다.
또한, Polymer, 3, 2090-2097(1994)에는, 폴리에스테르곁사슬상의 비닐기를 이용해서, 폴리에스테르분자내의 가교반응을 행하여 폴리에스테르의 물성을 개량한 것이 보고되어 있다.
상기 연구들로부터 알 수 있는 바와 같이, 불포화 탄화수소기인 비닐기는, 부가반응 등에 있어서의 반응성이 높아, 다양한 작용기를 도입하여 화학적 변환을 실시하는 것이 가능하다. 또, 비닐기는 폴리머의 가교반응의 발판 혹은 가교점으로 될 수 있으므로, PHA를 구성하는 유닛내에 비닐기를 지니는 것은, 기능재료로서의 PHA의 응용을 고려해서, 매우 유용하다고 말할 수 있다.
종래 알려진 비닐기를 지닌 폴리에스테르폴리머는, 폴리에스테르골격구조에 직접 결합된 알킬곁사슬의 선단에 비닐기가 치환된 구조를 지니고 있다. 그러나, 알킬 곁사슬을 지닌 폴리에스테르는, 일반적으로, 유리전이온도 및 융점은 그다지 높지 않아, 용융가공의 점에서는 열적 성질은 반드시 양호한 것은 아니고, 필름이나 가공상품으로서 우수한 성상을 지니고 있는 재료는 많지 않다. 한편, 곁사슬에 방향고리를 지닌 폴리에스테르는, 이미 설명한 바와 같이, 일반적으로 융점은 높고, 가공성이 양호하고 하는 특색을 지니고 있다.
따라서, 우수한 가공성을 지닌 새로운 기능성 폴리머를 개발하기 위해서는, 방향고리와 비닐기를 곁사슬에 모두 지니는 폴리에스테르의 이용이 요망된다. 지금까지는, 폴리에스테르의 곁사슬에 방향고리와 비닐기 등의 작용기를 모두 도입한 보고는 없었다.
본 발명은, 상기 과제를 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은, 곁사슬에 방향고리와 비닐기를 지닌 폴리에스테르, 특히, 생분해성을 지닌 PHA폴리에스테르와, 그 생산방법을 제공하는 데 있다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, 곁사슬에 그 고리상에 비닐기가 치환된 방향고리를 지니고 있는 PHA폴리에스테르와 그것을 미생물을 이용해서 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 실시예 1에서 얻어진 PHA폴리머의1H-NMR스펙트럼도
본 발명자들은, 상기 목적을 달성하기 위해, 예의 연구를 행한 결과, 하기에 기재한 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 일양상에 의하면, 하기 화학식(1):
(식중, n은 0 내지 7에서 임의로 선택된 1개이상의 정수)로 표시되는 3-하이드록시-ω-(4-비닐페닐)알칸산유닛을 1유닛%이상 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트형 폴리에스테르가 제공된다.
본 발명의 폴리에스테르는, 경우에 따라서는, 상기 3-하이드록시-ω-(4-비닐페닐)알칸산유닛이외에, 하기 화학식(2):
(식중, m은 0 내지 8에서 임의로 선택된 1개이상의 정수)로 표시되는 3-하이드록시알칸산유닛을 함유해도 된다.
이러한 폴리에스테르의 일례로서는, 분자중에 하기 화학식(3):
으로 표시되는 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛을 1유닛%이상 함유하는 폴리에스테르를 들 수 있다.
본 발명의 다른 양상에 의하면,
(1) 하기 화학식(4):
(식중, p는 0 내지 7에서 임의로 선택된 1개이상의 정수)로 표시되는 ω-(4-비닐페닐)알칸산을 원료로서 준비하는 공정과;
(2) 상기 ω-(4-비닐페닐)알칸산으로부터 하기 화학식(1):
(식중, n은 0 내지 7에서 임의로 선택된 1개이상의 정수)로 표시되는 3-하이드록시-ω-(4-비닐페닐)알칸산유닛을 1유닛%이상 함유하는 폴리에스테르를 생산할 수 있는 미생물을 이용해서 해당 폴리에스테르를 생산하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 폴리에스테르의 생산방법이 제공된다.
이하, 본 발명에 대해 보다 상세히 설명한다.
본 발명은, 곁사슬에 비닐기가 치환되어 있는 방향고리를 지닌 신규의 PHA폴리에스테르로서, 하기 화학식(1):
(식중, n은 0 내지 7에서 임의로 선택된 1개이상의 정수)로 표시되는 3-하이드록시-ω-(4-비닐페닐)알칸산유닛을 함유하는 폴리에스테르(이하, "본 발명의 PHA폴리에스테르"라 칭함)를 제공하고 있다. 본 발명의 PHA폴리에스테르는 후술하는 미생물을 이용해서 생산될 수 있다.
이 3-하이드록시-ω-(4-비닐페닐)알칸산유닛은 방향족 페닐기의 p위치에 비닐기를 지니고 있다. 비닐기는 부가반응 등의 반응성이 높고, 다양한 작용기의 도입이나 화학적 변환을 실시하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 PHA폴리머는, 페닐기의 존재에 의해서 융점이 높고 가공성도 양호하다고 하는 가공특성을 지닐 뿐만 아니라, 상기 비닐기를 이용해서, 다양한 작용기의 도입이나 화학적 변환을 실시함으로써 신규의 기능을 부여하는 점에서도 유용한 것이다.
또, 본 발명의 PHA폴리에스테르는, 다른 유닛, 통상, 몇몇 3-하이드록시알칸산유닛을 함유해도 된다. 바람직하게는 화학식(1)로 표시되는 유닛은, 페닐기의존재비율에 의존하는 고융점 및 양호한 가공성을 고려해서, 통상 주성분으로서 적어도 1유닛%이상, 즉, 적어도 50유닛%이상, 보다 바람직하게는 70유닛%이상 함유시킨다.
구체적으로는, 화학식(1)의 유닛은, 본 발명의 PHA폴리에스테르중의 다른 유닛 모두가 화학식(2):
(식중, m은 0 내지 8에서 임의로 선택된 1개이상의 정수)로 표시되는 3-하이드록시알칸산인 경우, 바람직하게는 70유닛%이상 함유시킨다.
그러나, 본 발명의 PHA가 상기 화학식(1)로 표시되는 유닛이외에도 곁사슬에 페닐기를 지닌 유닛을 함유할 경우, 마찬가지 유닛의 총합은, 바람직하게는 70유닛%이상이다. 본 발명의 PHA의 용도나 화학식(1)로 표시되는 유닛의 이용목적에 따라서는, 그러한 높은 함유량이 반드시 필요한 것은 아니다. 그러나, 화학식(1)로 표시된 유닛의 함유량이 1유닛%미만인 경우에는, 해당 폴리머내의 유닛의 존재로 인한 특성이 전체로서 발휘되지 않게 된다.
바람직하게는 다른 구성성분으로서 함유되는 3-하이드록시알칸산유닛은, 곁사슬에 탄소수 1 내지 9의 직쇄형 알킬기를 지닌 상기 화학식(2)로 표시되는ㅌ 3-하이드록시알칸산유닛이다. 이런 유형의 3-하이드록시알칸산유닛은 비닐기로서높은 반응성을 지니지 않기 때문에, 각종 작용기를 도입할 때나 화학적 변환을 행할 때 불필요한 반응을 일으키지 않아 비닐기의 선택적인 반응을 허용하게 된다. 또, 본 발명의 PHA는, 용융성형해서 각종의 최종제품으로 가공하나, 그 분자량이 과도하게 큰 것으로 되면, 페닐기에 의한 융점의 상승작용이 필요이상으로 작용해서, 적절한 용융온도범위를 초과해 버리게 된다. 그 점도 고려하면, 본 발명의 PHA의 수평균분자량은 3000 내지 200000의 범위가 바람직하다.
이하, 본 발명의 PHA폴리에스테르의 생산방법을 상세히 설명한다. 본 발명의 PHA폴리에스테르는, 미생물에 의해 생분해가능한 PHA폴리에스테르로서 생산될 수 있다. 구체적으로는, 하기 화학식(4):
(식중, p는 0 또는 8미만의 정수임)로 표시되는 ω-(4-비닐페닐)알칸산을, PHA생산 미생물에 의해 상기 화학식(1)로 표시되는 대응하는 3-하이드록시-ω-(4-비닐페닐)알칸산유닛으로 변환시킨다. 다음에, 상기 미생물은 변환된 유닛을 함유하는 PHA폴리에스테르를 생산해서 축적시킨다.
예를 들면, 하기 화학식(5):
로 표시되는 5-(4-비닐페닐)발레르산을 원료로서 사용할 경우, 하기 화학식(3)
으로 표시되는 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산을 함유하는 PHA폴리에스테르가 생산되어 축적된다.
또, 하기 화학식(6):
으로 표시되는 8-(4-비닐페닐)옥탄산을 원료로서 사용할 경우에는, 하기화학식(7):
로 표시되는 3-하이드록시-8-(4-비닐페닐)옥탄산유닛과 하기 화학식(8):
로 표시되는 3-하이드록시-6-(4-비닐페닐)헥산산유닛을 함유하는 PHA폴리에스테르가 생산되어 축적된다.
또, 하기 화학식(9):
로 표시되는 10-(4-비닐페닐)데칸산을 원료로서 사용할 경우, 하기 화학식(10):
으로 표시되는 3-하이드록시-10-(4-비닐페닐)데칸산유닛과 하기 화학식(7):
로 표시되는 3-하이드록시-8-(4-비닐페닐)옥탄산유닛과 하기 화학식(8):
로 표시되는 3-하이드록시-6-(4-비닐페닐)헥산산유닛을 함유하는 PHA폴리에스테르가 생산되어 축적된다.
또, 하기 화학식(11):
로 표시되는 11-(4-비닐페닐)운데칸산을 원료로서 사용한 경우, 하기 화학식(12):
로 표시되는 3-하이드록시-9-(4-비닐페닐)노난산유닛과 하기 화학식(13):
으로 표시되는 3-하이드록시-7-(4-비닐페닐)헵탄산유닛과 하기 화학식(3):
으로 표시되는 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛을 함유하는 PHA폴리에스테르가 생산되어 축적된다.
일반적으로는, 생산된 PHA폴리에스테르는, 3-하이드록시-ω-(4-비닐페닐)알칸산유닛의 곁사슬상에 4-비닐페닐기 등의 소수성 원자기를 지니므로, PHA폴리에스테르는, 물용해성이 나빠, 균체내에 축적된다. 따라서, 해당 폴리에스테르는, 미생물을 배양해서 PHA폴리에스테르를 축적하고 있는 균체를 집균함으로써 배지로부터 용이하게 분리된다. 집균된 균체를 세정·건조한 후, 목적으로 하는 PHA폴리에스테르를 회수할 수 있다.
미생물의 배양균체로부터의 PHA폴리에스테르를 회수하기 위해서는, 통상의 방법이면 어느 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들면, 클로로포름, 디클로로메탄, 아세톤 등의 유기용매에 의한 추출이 가장 간편하나, 디옥산, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴도 이용가능하다. 또, 유기용매가 사용되기 어려운 조건에 있어서는, 다른 균체성분을 제거하는 이하의 방법중 하나를 이용해서 분쇄된 균체로부터PHA를 회수할 수 있다. 그 방법으로서는, SDS 등의 계면활성제처리, 리소자임 등의 효소처리, 차아염소산염, 암모니아, EDTA 등의 약제처리, 초음파분쇄법, 균질화법, 가압분쇄법, 비드충격법, 분쇄법, 분말화법, 동결-해빙법 등을 들 수 있다.
본 발명의 PHA폴리에스테르의 생산에 사용되는 미생물로서는, PHA를 생산할 수 있는 미생물, 특히, ω-(4-비닐페닐)알칸산(화학식(4))을 함유하는 배지에서 배양할 때 화학식(1)로 표시되는 3-하이드록시-ω-(4-비닐페닐)알칸산유닛을 함유하는 PHA폴리에스테르를 생산할 수 있는 미생물이면 어떠한 것이라도 된다. 이러한 미생물의 예로서는, 슈도모나스(Pseudomonas)속에 속하는 것을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, PHA를 생산할 수 있으나, 페닐기상의 비닐치환기를 산화하거나 에폭시화하는 효소활성을 나타내지 않는 균주가 보다 바람직하다. 보다 바람직한 균주로서는, 예를 들면, 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2(FERM BP-7375), 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45(FERM BP-7374), 슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161(FERM BP-7376), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) P91(FERM BP-7373) 등을 들 수 있다.
이들 4종의 미생물은, AIST(Institute of Advanced Industrial Science and Technology)(이전의 통산성 공업기술원)의 IPOD(International Patent Organism Depositary)에 기탁되어 있고, 일본국 공개특허 제 2001-288256호 공보에 기재되어 있다.
또, 본 발명의 PHA폴리에스테르의 성분, 즉, 화학식(1)로 표시되는 3-하이드록시-ω-(4-비닐페닐)알칸산유닛과 화학식(2)로 표시되는 3-하이드록시-알칸산유닛은 모두, 그들의 3위치에 비대칭탄소원자를 지니고 있으므로, 이들 비대칭중심에 기인한 절대배치가 다른 PHA의 입체이성질체가 존재한다. 생분해성의 관점에서는, 함유되는 모든 유닛이 R-입체이성질체인 PHA가 가장 바람직하다.
본 발명에 의하면, 대응하는 알칸산은, 미생물에 의해 3-하이드록시알칸산으로 변환되므로, 본 발명의 생산방법에 의해 얻어진 PHA폴리에스테르는, 모든 유닛이 R-입체이성질체인 특성을 지닌다.
기질을 함유하는 배지에서 PHA생산 미생물을 배양하는 본 발명의 생산방법에 있어서, 배양조건은 다음과 같이 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명의 목적으로 하는 PHA폴리에스테르를 생산하기 위한 기질, 즉, 화학식(4)로 표시되는 ω-(4-비닐페닐)알칸산의 배지중의 농도는, 0.01 내지 1%(w/v), 보다 바람직하게는 0.02 내지 0.2%(w/v)의 범위이다. 또, PHA폴리에스테르에 상기 3-하이드록시-ω-(4-비닐페닐)알칸산유닛이외에 다른 종류의 3-하이드록시알칸산유닛을 함유시키고자 할 경우에는, 배지에 대응하는 3-하이드록시알칸산을 첨가한다.
배지에는, 미생물의 증식을 촉진하는 효모엑스, 폴리펩톤 및 고기엑스 등의 영양소를 함유시켜도 된다. 즉, 효모엑스, 폴리펩톤 또는 고기엑스의 형태로, 펩티드류를 에너지원 및 탄소원으로서 첨가시키는 것이 가능하다.
또는, 배지에는, 미생물의 증식에 의해 소비되는 에너지원 및 탄소원으로서 탄수화물을 첨가시킬 수 있다. 예를 들면, 글리세르알데하이드, 에리트로즈, 아라비노스, 크실로스, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스 등의 알도스; 글리세롤, 에리트리톨, 크실리톨 등의 알디톨; 글루콘산 등의 알돈산류; 글루쿠론산, 갈락투론산 등의 우론산류; 말토스, 수크로스, 락토스 등의 이당류 등을 사용할 수 있다.
또, 상기 당류대신에, 유기산, 보다 구체적으로는, TCA사이클에 관여하는 카르복시산류 또는 TCA사이클로부터 수개의 생화학적 단계에 의해 유도되는 것 등을 들 수 있다. 예를 들면, 피루브산, 옥살아세트산, 시트르산, 이소시트르산, 케토글루타르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 락트산 등의 하이드록시카르복시산류나 옥소카르복시산류 또는 그들의 수용성 염을 들 수 있다. 혹은, 아미노산, 예를 들면, 아스파라긴산, 글루탐산 또는 그들의 염 등의 아미노산을 사용할 수도 있다. 유기산 또는 그들의 염을 배지에 첨가할 때에는, 피루브산, 옥살아세트산, 시트르산, 이소시트르산, 케토글루타르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 락트산 및 그들의 염의 1종이상을 선택하는 것이 바람직하다. 아미노산 또는 그들의 염을 배지에 첨가할 때에는, 아스파라긴산, 글루탐산 또는 그들의 염의 1종이상을 선택하는 것이 바람직하다. 이 경우, 필요에 따라서, 전부 혹은 일부을 수용성 염의 형태로 첨가하여, 배지의 pH에 영향을 미치지 않고, 배지에 균일하게 용해시키는 것도 가능하다.
미생물의 증식을 향상시키는 영양원으로서, 배지에 첨가하는 상기 펩티드류, 탄수화물류, 유기산류 및 그들의 염류, 아미노산 및 그들의 염류는 단독으로 혹은 조합해서 첨가해도 된다. 그 경우, 배지에 대한 첨가량은, 통상 0.1 내지 5%(w/v), 보다 바람직하게는 0.2 내지 2%(w/v)의 범위이다. 유기산의 염을 사용할 때에는, 첨가량은 대응하는 유기산으로 환산한 첨가량을 의미한다. 2종이상을함께 사용할 때에는, 그 첨가량의 합계를 상기 범위내로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 염기성 염배지로서는, 인산을 함유하는 무기배지나 암모늄염이나 질산염 등의 질소원을 사용할 수 있다. 또, PHA의 생산성은, 배지중에 함유된 질소원의 농도를 조절함으로써 향상시킬 수 있다.
배양온도는, 이용하는 균체가 그 온도에서 양호하게 증식될 수 있는 한 어떠한 온도라도 사용할 수 있으나, 15 내지 30℃의 범위로 선택하는 것이 적당하다. 또, 기질과 영양원을 유지할 수 있고, 또 사용되는 미생물의 증식이 가능하며, PHA생산에 적합한 형태인 한, 액체 또는 고체의 어떠한 배양방법도 사용할 수 있다. 또한, 배치(즉, 회분식) 배양, 패드배치배양, 반연속배양 또는 연속배양의 어느 것도 가능하다. 적절한 액체배치배양 방법으로서는, 진탕플라스크내에서 진탕에 의해 산소를 공급하는 배양방법이나, 교반통기방식에 의해 산소를 공급하는 쟈(jar)발효방법 등을 들 수 있다.
PHA의 미생물생산 수법으로서는, 상기 설명한 소정량의 기질을 함유시킨, 인산염 및 암모늄염 혹은 질산염 등의 질소원을 함유하는 무기염배지에서 미생물을 배양하는 1단계배양법외에, 2단계배양법도 있다. 이 2단계배양에 있어서는, 먼저, 상기 1단계배양용의 배지에서 미생물을 충분히 증식시킨 후, 기질은 소정농도로 함유하나 염화암모늄 등의 질소원이 제한된 제 2의 배지에 이식해서 배양하여, PHA를 생산·축적시킨다. 이 2단계 배양법을 채용하면, 목적으로 하는 PHA의 생산성이 향상될 경우가 있다.
이하의 실시예에서 사용된 무기염배지인 M9배지의 조성은 다음과 같다. 이것은, 본 발명의 생산법에 사용할 수 있는 무기염배지의 일례이다.
M9배지의 조성(g/ℓ)
Na2HPO4: 6.3
KH2PO4: 3.0
NH4Cl: 1.0
NaCl: 0.5
pH = 7.0
또한, 양호한 균체의 증식 및 높은 PHA생산성을 얻기 위해서, M9배지 등의 무기염배지에 하기 조성의 미량원소의 성분용액을 0.3%(v/v)정도 첨가할 필요가 있다. 이러한 미량성분용액의 첨가는, 미생물의 증식시에 사용되는 미량금속원소를 공급하는 것이다.
미량성분용액의 조성(g/ℓ)
니트릴로트리아세트산: 1.5;
MgSO4: 3.0; MnSO4: 0.5; NaCl: 1.0; FeSO4: 0.1;
CaCl2: 0.1; CoCl2: 0.1; ZnSO4: 0.1;
CuSO4: 0.1; AlK(SO4)2: 0.1;
H3BO3: 0.1; Na2MoO4: 0.1; NiCl2: 0.1.
[실시예]
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 최량의 형태이지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
5-(4-비닐페닐)발레르산과 펩티드원(영양원)으로서 폴리펩톤을 함유하는 M9배지를 이용해서, 1단계배양에 의해 균주 YN2를 배양해서 PHA의 생산을 행하였다.
폴리펩톤 0.5% 및 5-(4-비닐페닐)발레르산 0.05%를 함유하는 M9배지 200㎖를 담고있는 500㎖ 진탕플라스크에, 한천판상에서 증식한 균주 YN2의 콜로니를 접종하여 30℃에서 48시간 배양을 행하였다. 그 후, 원심분리에 의해 배양균체를 집균하여, 메탄올로 세정하고 동결한 후, 건조균체의 중량을 칭량하였다.
상기 건조균체에, 클로로포름을 첨가하고, 40℃에서 24시간 폴리머를 추출하였다. 클로로포름추출액을 여과해서 파쇄균체를 제거하고, 해당 폴리머가 용해되어 있는 클로로포름층을 증발기에 의해 농축한 후, 냉메탄올로 잔류물을 재회수하였다. 재회수된 침전물을 감압하 건조해서, 목적으로 하는 폴리머를 얻었다. 건조균체의 중량은 139㎎, 얻어진(재회수된) 폴리머의 중량은 22㎎이었다.
얻어진 폴리머의 평균분자량은, 겔투과크로마토그래피(HLC-8220GPC; 토소사 제품, 컬럼: TSK-GEL Super HM-H; 토소사 제품, 용매: 클로로포름, 폴리스티렌표준)에 의해 측정하였다. 그 결과, 얻어진 폴리머는, 수평균분자량 Mn=3700, 중량평균분자량 Mw=8900이었다.
얻어진 폴리머의 구조는,1H-NMR(FT-NMR: 브루커 DPX400; 공명주파수: 400㎒; 측정핵종:1H; 사용된 용매: CDCl3; 기준: 모세관봉입 TMS/CDCl3; 측정온도: 실온)에 의해 결정하였다.1H-NMR의 스펙트럼차트는 도 1에 표시되어 있다. 또, 도 1에 표시한1H-NMR스펙트럼의 각각의 공명신호를 부여하는 수소원자의 귀속을 표 1(1H-NMR)에 표시한다.
1H-NMR의 귀속결과
ppm 적분치 분열 귀속
1.82∼1.186 2H m c
2.40∼2.64 4H m a, d
5.14∼5.28 2H m b, h1
5.62∼5.67 1H d h2
6.58∼6.66 1H t g
7.03∼7.05 2H d e
7.24∼7.26 2H d f
1H-NMR의 귀속결과, 도면에 표시한 각 시그널은, 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛으로부터 유래하는 것으로 확인되었다. 또, 얻어진 PHA는, 주구성유닛으로서 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산을 함유하고, 그 함유율은, 적어도 73유닛%이상인 것이 표시되었다. 또, 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛이외의 함유되는 유닛은, 방향고리(벤젠고리)를 지니지 않고, 화학식(2)로 표시되는 3-하이드록시알칸산유닛인 것으로 여겨진다.
실시예 2
5-(4-비닐페닐)발레르산과 탄소원으로서 글루코스를 함유하는 M9배지를 이용해서, 2단계배양에 의해 균주 YN2를 배양해서 PHA의 생산을 행하였다.
글루코스 0.5% 및 5-(4-비닐페닐)발레르산 0.05%를 함유하는 M9배지 200㎖를담고있는 500㎖ 진탕플라스크에, 한천판상에서 증식한 균주 YN2의 콜로니를 접종하여 30℃에서 48시간 배양을 행하였다. 그 후, 원심분리에 의해 배양균체를 집균하였다.
다음에, 글루코스 0.5% 및 5-(4-비닐페닐)발레르산 0.05%를 함유하나, NH4Cl은 함유하지 않는 M9배지 200㎖를 담고있는 500㎖ 진탕플라스크에, 상기에서 집균한 균체를 이식하고 30℃에서 48시간 배양을 행하였다. 그 후, 원심분리에 의해 배양균체를 집균하여, 메탄올로 세정하고 동결한 후, 건조균체물의 중량을 칭량하였다.
상기 건조균체에, 클로로포름을 첨가하고, 40℃에서 24시간 폴리머를 추출하였다. 클로로포름추출액을 여과해서 파쇄균체를 제거하고, 해당 폴리머가 용해되어 있는 클로로포름층을 증발기에 의해 농축한 후, 냉메탄올로 잔류물을 재회수하였다. 재회수된 침전물을 감압하 건조해서, 목적으로 하는 폴리머를 얻었다. 건조균체의 중량은 203㎎, 얻어진(재회수된) 폴리머의 중량은 17㎎이었다.
얻어진 폴리머의 평균분자량은, 겔투과크로마토그래피(HLC-8220GPC; 토소사 제품, 컬럼: TSK-GEL Super HM-H; 토소사 제품, 용매: 클로로포름, 폴리스티렌표준)에 의해 측정하였다. 그 결과, 얻어진 폴리머는, 수평균분자량 Mn=8100, 중량평균분자량 Mw=17000이었다.
얻어진 폴리머의 구조는,1H-NMR(FT-NMR: 브루커 DPX400; 공명주파수: 400㎒; 측정핵종:1H; 사용된 용매: CDCl3; 기준: 모세관봉입 TMS/CDCl3; 측정온도: 실온)에 의해 결정하였다. 그 결과, 실시예 1에 있어서의1H-NMR시그널에 상당하는 스펙트럼이 관측되어, 그 스펙트럼의 강도로부터 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛을 주구성유닛으로서 97유닛%이상 함유하는 PHA인 것으로 판명되었다.
실시예 3
5-(4-비닐페닐)발레르산과 유기산으로서 피루브산 나트륨을 함유하는 M9배지를 이용해서, 2단계배양에 의해 균주 YN2를 배양해서 PHA의 생산을 행하였다.
실시예 2에 있어서 글루코스대신에, 해당(당분해)경로 혹은 당생성경로에 있어서 알파옥소카르복시산인 피루브산나트륨을 사용한 이외에는, 실시예 2와 마찬가지 방법으로 균체배양 및 PHA생산을 행하였다. 건조균체를 칭량하고, 마찬가지 절차 및 조건에 의해 폴리머를 회수하였다. 건조균체의 중량은 145㎎, 얻어진 폴리머의 중량(재회수된 양)은 29㎎이었다.
얻어진 폴리머의 평균분자량은, 겔투과크로마토그래피(HLC-8220GPC; 토소사 제품, 컬럼: TSK-GEL Super HM-H; 토소사 제품, 용매: 클로로포름, 폴리스티렌표준)에 의해 측정하였다. 그 결과, 얻어진 폴리머는, 수평균분자량 Mn=7300, 중량평균분자량 Mw=16000이었다.
얻어진 폴리머의 구조는,1H-NMR(FT-NMR: 브루커 DPX400; 공명주파수: 400㎒; 측정핵종:1H; 사용된 용매: CDCl3; 기준: 모세관봉입 TMS/CDCl3; 측정온도: 실온)에 의해 결정하였다. 그 결과, 실시예 1에 있어서의1H-NMR시그널에 상당하는 스펙트럼이 관측되어, 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛을 주구성유닛으로서 함유하는 PHA인 것으로 판명되었고, 그 스펙트럼의 강도로부터, 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛의 함유량은 적어도 99유닛%이상이었다.
실시예 4
5-(4-비닐페닐)발레르산과 펩티드원으로서 폴리펩톤을 함유하는 M9배지를 이용해서, 1단계배양에 의해 균주 YN2를 배양해서 PHA의 생산을 행하였다. PHA의 추출은 클로로포름과 아세톤에 의해 행하였다.
폴리펩톤 0.5% 및 5-(4-비닐페닐)발레르산 0.05%를 함유하는 M9배지 200㎖를 담고있는 500㎖ 진탕플라스크에, 한천판상에서 증식한 균주 YN2의 콜로니를 접종하여 30℃에서 72시간 배양을 행하였다. 그 후, 원심분리에 의해 배양균체를 집균하여, 메탄올로 세정하고 동결한 후, 건조균체물의 중량을 칭량하였다.
상기 건조균체에, 클로로포름을 첨가하고, 25℃에서 72시간 폴리머를 추출하였다. 클로로포름추출액을 여과해서 파쇄균체를 제거하고, 해당 폴리머가 용해되어 있는 클로로포름층을 증발기에 의해 농축한 후, 아세톤에 해당 잔류물을 용해시키고, 불용물을 여과에 의해 제거하였다. 아세톤추출물을 증발기에 의해 농축한 후, 냉메탄올로 침전시켰다. 재회수된 침전물을 감압하 건조해서, 목적으로 하는 폴리머를 얻었다. 건조균체의 중량은 155㎎, 얻어진(재회수된) 폴리머의 중량은 20㎎이었다.
얻어진 폴리머의 평균분자량은, 겔투과크로마토그래피(HLC-8220GPC; 토소사 제품, 컬럼: TSK-GEL Super HM-H; 토소사 제품, 용매: 클로로포름, 폴리스티렌표준)에 의해 측정하였다. 그 결과, 얻어진 폴리머는, 수평균분자량 Mn=9900, 중량평균분자량 Mw=39000이었다.
얻어진 폴리머의 구조는,1H-NMR(FT-NMR: 브루커 DPX400; 공명주파수: 400㎒; 측정핵종:1H; 사용된 용매: CDCl3; 기준: 모세관봉입 TMS/CDCl3; 측정온도: 실온)에 의해 결정하였다. 그 결과, 실시예 1에 있어서의1H-NMR시그널에 상당하는 스펙트럼이 관측되어, 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛을 주구성유닛으로서 함유하는 PHA인 것으로 판명되었고, 그 스펙트럼의 강도로부터, 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛의 함유량은 적어도 99유닛%이상이었다.
실시예 5
5-(4-비닐페닐)발레르산과 효모엑스를 함유하는 M9배지를 이용해서, 1단계배양에 의해 균주 P161을 배양해서 PHA의 생산을 행하였다. PHA의 추출은 클로로포름과 아세톤에 의해 행하였다.
효모엑스 0.5% 및 5-(4-비닐페닐)발레르산 0.05%를 함유하는 M9배지 200㎖를 담고있는 500㎖ 진탕플라스크에, 한천판상에서 증식한 균주 P161의 콜로니를 접종하여 30℃에서 72시간 배양을 행하였다. 그 후, 원심분리에 의해 배양균체를 집균하여, 메탄올로 세정하고 동결한 후, 건조균체물의 중량을 칭량하였다.
상기 건조균체에, 클로로포름을 첨가하고, 25℃에서 72시간 폴리머를 추출하였다. 클로로포름추출액을 여과해서 파쇄균체를 제거하고, 해당 폴리머가 용해되어 있는 클로로포름층을 증발기에 의해 농축한 후, 아세톤에 해당 잔류물을 용해시키고, 불용물을 여과에 의해 제거하였다. 아세톤추출물을 증발기에 의해 농축한 후, 냉메탄올로 침전시켰다. 재회수된 침전물을 감압하 건조해서, 목적으로 하는 폴리머를 얻었다. 건조균체의 중량은 135㎎, 얻어진(재회수된) 폴리머의 중량은 16㎎이었다.
얻어진 폴리머의 평균분자량은, 겔투과크로마토그래피(HLC-8220GPC; 토소사 제품, 컬럼: TSK-GEL Super HM-H; 토소사 제품, 용매: 클로로포름, 폴리스티렌표준)에 의해 측정하였다. 그 결과, 얻어진 폴리머는, 수평균분자량 Mn=8900, 중량평균분자량 Mw=32000이었다.
얻어진 폴리머의 구조는,1H-NMR(FT-NMR: 브루커 DPX400; 공명주파수: 400㎒; 측정핵종:1H; 사용된 용매: CDCl3; 기준: 모세관봉입 TMS/CDCl3; 측정온도: 실온)에 의해 결정하였다. 그 결과, 실시예 1에 있어서의1H-NMR시그널에 상당하는 스펙트럼이 관측되어, 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛을 주구성유닛으로서 함유하는 PHA인 것으로 판명되었고, 그 스펙트럼의 강도로부터, 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛의 함유량은 적어도 99유닛%이상이었다.
실시예 6
5-(4-비닐페닐)발레르산과 효모엑스를 함유하는 M9배지를 이용해서, 1단계배양에 의해 균주 H45를 배양해서 PHA의 생산을 행하였다. PHA의 추출은 클로로포름과 아세톤에 의해 행하였다.
효모엑스 0.5% 및 5-(4-비닐페닐)발레르산 0.05%를 함유하는 M9배지 200㎖를 담고있는 500㎖ 진탕플라스크에, 한천판상에서 증식한 균주 H45의 콜로니를 접종하여 30℃에서 72시간 배양을 행하였다. 그 후, 원심분리에 의해 배양균체를 집균하여, 메탄올로 세정하고 동결한 후, 건조균체물의 중량을 칭량하였다.
상기 건조균체에, 클로로포름을 첨가하고, 25℃에서 72시간 폴리머를 추출하였다. 클로로포름추출액을 여과해서 파쇄균체를 제거하고, 해당 폴리머가 용해되어 있는 클로로포름층을 증발기에 의해 농축한 후, 아세톤에 해당 잔류물을 용해시키고, 불용물을 여과에 의해 제거하였다. 아세톤추출물을 증발기에 의해 농축한 후, 냉메탄올로 침전시켰다. 재회수된 침전물을 감압하 건조해서, 목적으로 하는 폴리머를 얻었다. 건조균체의 중량은 135㎎, 얻어진(재회수된) 폴리머의 중량은 16㎎이었다.
얻어진 폴리머의 평균분자량은, 겔투과크로마토그래피(HLC-8220GPC; 토소사 제품, 컬럼: TSK-GEL Super HM-H; 토소사 제품, 용매: 클로로포름, 폴리스티렌표준)에 의해 측정하였다. 그 결과, 얻어진 폴리머는, 수평균분자량 Mn=8900, 중량평균분자량 Mw=32000이었다.
얻어진 폴리머의 구조는,1H-NMR(FT-NMR: 브루커 DPX400; 공명주파수: 400㎒; 측정핵종:1H; 사용된 용매: CDCl3; 기준: 모세관봉입 TMS/CDCl3; 측정온도: 실온)에 의해 결정하였다. 그 결과, 실시예 1에 있어서의1H-NMR시그널에 상당하는 스펙트럼이 관측되어, 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛을 주구성유닛으로서 함유하는 PHA인 것으로 판명되었고, 그 스펙트럼의 강도로부터, 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛의 함유량은 적어도 99유닛%이상이었다.
실시예 7
5-(4-비닐페닐)발레르산과 효모엑스를 함유하는 M9배지를 이용해서, 1단계배양에 의해 균주 P91을 배양해서 PHA의 생산을 행하였다. PHA의 추출은 클로로포름과 아세톤에 의해 행하였다.
효모엑스 0.5% 및 5-(4-비닐페닐)발레르산 0.05%를 함유하는 M9배지 200㎖를 담고있는 500㎖ 진탕플라스크에, 한천판상에서 증식한 균주 P91의 콜로니를 접종하여 30℃에서 96시간 배양을 행하였다. 그 후, 원심분리에 의해 배양균체를 집균하여, 메탄올로 세정하고 동결한 후, 건조균체물의 중량을 칭량하였다.
상기 건조균체에, 클로로포름을 첨가하고, 25℃에서 72시간 폴리머를 추출하였다. 클로로포름추출액을 여과해서 파쇄균체를 제거하고, 해당 폴리머가 용해되어 있는 클로로포름층을 증발기에 의해 농축한 후, 아세톤에 해당 잔류물을 용해시키고, 불용물을 여과에 의해 제거하였다. 아세톤추출물을 증발기에 의해 농축한 후, 냉메탄올로 침전시켰다. 재회수된 침전물을 감압하 건조해서, 목적으로 하는 폴리머를 얻었다. 건조균체의 중량은 105㎎, 얻어진(재회수된) 폴리머의 중량은11㎎이었다.
얻어진 폴리머의 평균분자량은, 겔투과크로마토그래피(HLC-8220GPC; 토소사 제품, 컬럼: TSK-GEL Super HM-H; 토소사 제품, 용매: 클로로포름, 폴리스티렌표준)에 의해 측정하였다. 그 결과, 얻어진 폴리머는, 수평균분자량 Mn=9200, 중량평균분자량 Mw=31000이었다.
얻어진 폴리머의 구조는,1H-NMR(FT-NMR: 브루커 DPX400; 공명주파수: 400㎒; 측정핵종:1H; 사용된 용매: CDCl3; 기준: 모세관봉입 TMS/CDCl3; 측정온도: 실온)에 의해 결정하였다. 그 결과, 실시예 1에 있어서의1H-NMR시그널에 상당하는 스펙트럼이 관측되어, 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛을 주구성유닛으로서 함유하는 PHA인 것으로 판명되었고, 그 스펙트럼의 강도로부터, 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛의 함유량은 적어도 99유닛%이상이었다.
실시예 8
8-(4-비닐페닐)옥탄산과 폴리펩톤을 함유하는 M9배지를 이용해서, 1단계배양에 의해 균주 YN2를 배양해서 PHA의 생산을 행하였다. PHA의 추출은 클로로포름과 아세톤에 의해 행하였다.
폴리펩톤 0.5% 및 8-(4-비닐페닐)옥탄산 0.05%를 함유하는 M9배지 200㎖를 담고있는 500㎖ 진탕플라스크에, 한천판상에서 증식한 균주 YN2의 콜로니를 접종하여 30℃에서 96시간 배양을 행하였다. 그 후, 원심분리에 의해 배양균체를 집균하여, 메탄올로 세정하고 동결한 후, 건조균체물의 중량을 칭량하였다.
상기 건조균체에, 클로로포름을 첨가하고, 25℃에서 72시간 폴리머를 추출하였다. 클로로포름추출액을 여과해서 파쇄균체를 제거하고, 해당 폴리머가 용해되어 있는 클로로포름층을 증발기에 의해 농축한 후, 아세톤에 해당 잔류물을 용해시키고, 불용물을 여과에 의해 제거하였다. 아세톤추출물을 증발기에 의해 농축한 후, 냉메탄올로 침전시켰다. 재회수된 침전물을 감압하 건조해서, 목적으로 하는 폴리머를 얻었다. 건조균체의 중량은 170㎎, 얻어진(재회수된) 폴리머의 중량은 26㎎이었다.
얻어진 폴리머의 평균분자량은, 겔투과크로마토그래피(HLC-8220GPC; 토소사 제품, 컬럼: TSK-GEL Super HM-H; 토소사 제품, 용매: 클로로포름, 폴리스티렌표준)에 의해 측정하였다. 그 결과, 얻어진 폴리머는, 수평균분자량 Mn=12000, 중량평균분자량 Mw=38000이었다.
얻어진 폴리머의 구조는,1H-NMR(FT-NMR: 브루커 DPX400; 공명주파수: 400㎒; 측정핵종:1H; 사용된 용매: CDCl3; 기준: 모세관봉입 TMS/CDCl3; 측정온도: 실온)에 의해 결정하였다. 그 결과, 하기 화학식(7):
로 표시되는 3-하이드록시-8-(4-비닐페닐)옥탄산유닛과 하기 화학식(8):
로 표시되는 3-하이드록시-6-(4-비닐페닐)헥산산유닛을 30:70의 비율로 함유하는 PHA인 것으로 판명되었다.
실시예 9
10-(4-비닐페닐)데칸산과 폴리펩톤을 함유하는 M9배지를 이용해서, 1단계배양에 의해 균주 YN2를 배양해서 PHA의 생산을 행하였다. PHA의 추출은 클로로포름과 아세톤에 의해 행하였다.
폴리펩톤 0.5% 및 10-(4-비닐페닐)데칸산 0.05%를 함유하는 M9배지 200㎖를 담고있는 500㎖ 진탕플라스크에, 한천판상에서 증식한 균주 YN2의 콜로니를 접종하여 30℃에서 96시간 배양을 행하였다. 그 후, 원심분리에 의해 배양균체를 집균하여, 메탄올로 세정하고 동결한 후, 건조균체물의 중량을 칭량하였다.
상기 건조균체에, 클로로포름을 첨가하고, 25℃에서 72시간 폴리머를 추출하였다. 클로로포름추출액을 여과해서 파쇄균체를 제거하고, 해당 폴리머가 용해되어 있는 클로로포름층을 증발기에 의해 농축한 후, 아세톤에 해당 잔류물을 용해시키고, 불용물을 여과에 의해 제거하였다. 아세톤추출물을 증발기에 의해 농축한 후, 냉메탄올로 침전시켰다. 재회수된 침전물을 감압하 건조해서, 목적으로 하는 폴리머를 얻었다. 건조균체의 중량은 160㎎, 얻어진(재회수된) 폴리머의 중량은 23㎎이었다.
얻어진 폴리머의 평균분자량은, 겔투과크로마토그래피(HLC-8220GPC; 토소사 제품, 컬럼: TSK-GEL Super HM-H; 토소사 제품, 용매: 클로로포름, 폴리스티렌표준)에 의해 측정하였다. 그 결과, 얻어진 폴리머는, 수평균분자량 Mn=10000, 중량평균분자량 Mw=36000이었다.
얻어진 폴리머의 구조는,1H-NMR(FT-NMR: 브루커 DPX400; 공명주파수: 400㎒; 측정핵종:1H; 사용된 용매: CDCl3; 기준: 모세관봉입 TMS/CDCl3; 측정온도: 실온)에 의해 결정하였다. 그 결과, 하기 화학식(10):
으로 표시되는 3-하이드록시-10-(4-비닐페닐)데칸산유닛과 하기 화학식(7):
로 표시되는 3-하이드록시-8-(4-비닐페닐)옥탄산유닛과 하기 화학식(8):
로 표시되는 3-하이드록시-6-(4-비닐페닐)헥산산유닛을 20:30:50의 비율로 함유하는 PHA인 것으로 판명되었다.
실시예 10
11-(4-비닐페닐)운데칸산과 폴리펩톤을 함유하는 M9배지를 이용해서, 1단계배양에 의해 균주 YN2를 배양해서 PHA의 생산을 행하였다. PHA의 추출은 클로로포름과 아세톤에 의해 행하였다.
폴리펩톤 0.5% 및 11-(4-비닐페닐)운데칸산 0.05%를 함유하는 M9배지 200㎖를 담고있는 500㎖ 진탕플라스크에, 한천판상에서 증식한 균주 YN2의 콜로니를 접종하여 30℃에서 120시간 배양을 행하였다. 그 후, 원심분리에 의해 배양균체를 집균하여, 메탄올로 세정하고 동결한 후, 건조균체물의 중량을 칭량하였다.
상기 건조균체에, 클로로포름을 첨가하고, 25℃에서 72시간 폴리머를 추출하였다. 클로로포름추출액을 여과해서 파쇄균체를 제거하고, 해당 폴리머가 용해되어 있는 클로로포름층을 증발기에 의해 농축한 후, 아세톤에 해당 잔류물을 용해시키고, 불용물을 여과에 의해 제거하였다. 아세톤추출물을 증발기에 의해 농축한 후, 냉메탄올로 침전시켰다. 재회수된 침전물을 감압하 건조해서, 목적으로 하는 폴리머를 얻었다. 건조균체의 중량은 170㎎, 얻어진(재회수된) 폴리머의 중량은 26㎎이었다.
얻어진 폴리머의 평균분자량은, 겔투과크로마토그래피(HLC-8220GPC; 토소사 제품, 컬럼: TSK-GEL Super HM-H; 토소사 제품, 용매: 클로로포름, 폴리스티렌표준)에 의해 측정하였다. 그 결과, 얻어진 폴리머는, 수평균분자량 Mn=11000, 중량평균분자량 Mw=37000이었다.
얻어진 폴리머의 구조는,1H-NMR(FT-NMR: 브루커 DPX400; 공명주파수: 400㎒; 측정핵종:1H; 사용된 용매: CDCl3; 기준: 모세관봉입 TMS/CDCl3; 측정온도: 실온)에 의해 결정하였다. 그 결과, 하기 화학식(12):
로 표시되는 3-하이드록시-9-(4-비닐페닐)노난산유닛과 하기 화학식(13):
으로 표시되는 3-하이드록시-7-(4-비닐페닐)헵탄산유닛과 하기 화학식(3):
으로 표시되는 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛을 10:20:70의 비율로 함유하는 PHA인 것으로 판명되었다.
이상, 본 발명에 의하면, 곁사슬에 방향고리와 비닐기를 지닌 폴리에스테르, 특히, 3-하이드록시-ω-(4-비닐페닐)알칸산유닛을 1유닛%이상 함유하는 생분해성폴리하이드록시알카노에이트형 폴리에스테르 및 미생물에 의한 그의 생산방법을 제공하는 것이 가능하다.

Claims (20)

  1. 하기 화학식(1):
    (식중, n은 0 내지 7에서 임의로 선택된 1개이상의 정수)로 표시되는 3-하이드록시-ω-(4-비닐페닐)알칸산유닛을 1유닛%이상 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트형 폴리에스테르.
  2. 제 1항에 있어서, 하기 화학식(2):
    (식중, m은 0 내지 8에서 임의로 선택된 1개이상의 정수)로 표시되는 3-하이드록시-알칸산유닛을 또 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트형 폴리에스테르.
  3. 제 1항에 있어서, 분자중에 하기 화학식(3):
    으로 표시되는 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛을 1유닛%이상 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트형 폴리에스테르.
  4. 제 1항에 있어서, 수평균분자량이 3000 내지 200000의 범위에 있는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트형 폴리에스테르.
  5. (1) 하기 화학식(4):
    (식중, p는 0 내지 7에서 임의로 선택된 1개이상의 정수)로 표시되는 ω-(4-비닐페닐)알칸산을 원료로서 준비하는 공정과;
    (2) 상기 ω-(4-비닐페닐)알칸산으로부터 하기 화학식(1):
    (식중, n은 0 내지 7에서 임의로 선택된 1개이상의 정수)로 표시되는 3-하이드록시-ω-(4-비닐페닐)알칸산유닛을 1유닛%이상 함유하는 폴리에스테르를 생산할 수 있는 미생물을 이용해서 해당 폴리에스테르를 생산하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 폴리에스테르의 생산방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 (2)공정은, ω-(4-비닐페닐)알칸산을 함유하는 배지중에서 상기 미생물을 배양하는 공정(3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리에스테르의 생산방법.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 ω-(4-비닐페닐)알칸산이, 하기 화학식(5):
    로 표시되는 5-(4-비닐페닐)발레르산이고,
    상기 폴리에스테르는, 분자중에 하기 화학식(3):
    으로 표시되는 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛을 1유닛%이상 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리에스테르의 생산방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 배지는, 상기 ω-(4-비닐페닐)알칸산에 부가해서, 펩티드원을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리에스테르의 생산방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 펩티드원이 폴리펩톤인 것을 특징으로 하는 폴리에스테르의 생산방법.
  10. 제 6항에 있어서, 상기 배지는, 상기 ω-(4-비닐페닐)알칸산에 부가해서, 효모엑스를 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리에스테르의 생산방법.
  11. 제 6항에 있어서, 상기 배지는, 상기 ω-(4-비닐페닐)알칸산에 부가해서, 유기산 또는 그의 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리에스테르의 생산방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 유기산 또는 그의 염이, 피루브산, 옥살아세트산, 시트르산, 이소시트르산, 케토글루타르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 락트산 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 폴리에스테르의 생산방법.
  13. 제 6항에 있어서, 상기 배지는, 상기 ω-(4-비닐페닐)알칸산에 부가해서, 아미노산 또는 그의 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리에스테르의 생산방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 아미노산 또는 그의 염이, 글루탐산, 아스파라긴산 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 폴리에스테르의 생산방법.
  15. 제 6항에 있어서, 상기 배지는, 상기 ω-(4-비닐페닐)알칸산에 부가해서, 탄수화물을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리에스테르의 생산방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 탄수화물이, 글리세르알데하이드, 에리트로즈, 아라비노스, 크실로스, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스, 글리세롤, 에리트리톨, 크실리톨, 글루콘산, 글루쿠론산, 갈락투론산, 말토스, 수크로스 및 락토스로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 폴리에스테르의 생산방법.
  17. 제 6항에 있어서, 상기 배지는. 상기 ω-(4-비닐페닐)알칸산에 부가해서, 탄소수 4 내지 12의 직쇄형 알칸산 또는 그의 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리에스테르의 생산방법.
  18. 제 6항에 있어서, 상기 (2)공정은, 상기 미생물에 의해 생산된 폴리에스테를 해당 미생물로부터 회수하는 공정(4)를 또 구비한 것을 특징으로 하는 폴리에스테르의 생산방법.
  19. 제 5항에 있어서, 상기 미생물이 슈도모나스(Pseudomonas)속에 속하는 것을 특징으로 하는 폴리에스테르의 생산방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 미생물이, 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2(FERM BP-7375), 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii)H45(FERM BP-7374), 슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161(FERM BP-7376) 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) P91(FERM BP-7373)로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 폴리에스테르의 생산방법.
KR10-2002-0010799A 2001-02-28 2002-02-28 곁사슬에 비닐페닐구조를 지닌폴리하이드록시알카노에이트 폴리에스테르 및 그 생산방법 KR100484719B1 (ko)

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