JP2001078753A - 新規微生物ｏｋ３株およびその微生物を用いたポリヒドロキシアルカノエートの生物的生産方法 - Google Patents

新規微生物ｏｋ３株およびその微生物を用いたポリヒドロキシアルカノエートの生物的生産方法

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JP2001078753A
JP2001078753A JP25413299A JP25413299A JP2001078753A JP 2001078753 A JP2001078753 A JP 2001078753A JP 25413299 A JP25413299 A JP 25413299A JP 25413299 A JP25413299 A JP 25413299A JP 2001078753 A JP2001078753 A JP 2001078753A
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剛士 今村
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ３−ヒドロキシ酪酸と、３−ヒドロキシ−５
−(４−置換フェニル)吉草酸類をモノマーユニットとし
て含むポリヒドロキシアルカノエートを同時に生産・蓄
積する新規微生物の提供。 【解決手段】 ３−ヒドロキシ酪酸と、下記一般式
（１）： 【化１】 （式中、ＲはＨまたはＣＨ３を表す）で示される３−ヒ
ドロキシ−５−(４−置換フェニル)吉草酸をモノマーユ
ニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートを同時
に生産する新規微生物バークホルデリア・スピーシズ
（Burkholderia sp.）ＯＫ３株（FERM P-17370）。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生分解性ポリエス
テルの生産能を有する新規微生物、ならびに前記微生物
を用いる生分解性ポリエステルの生物的生産方法に関す
る。具体的には、生分解性ポリエステルとして、３−ヒ
ドロキシ酪酸と、３−ヒドロキシ−５−(４−置換フェ
ニル)吉草酸類をモノマーユニットとして含むポリヒド
ロキシアルカノエートを同時に生産・蓄積する新規微生
物、およびその微生物を用いて、前記３−ヒドロキシ酪
酸と３−ヒドロキシ−５−(４−置換フェニル)吉草酸類
をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノ
エートの同時生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】長年にわたって、石油由来の合成高分子
を、プラスチック等として利用してきたが、生活廃棄物
に含まれるこれらプラスチック等の処理が大きな社会問
題となっている。石油由来の合成高分子材料は、分解さ
れにくい利点から、過去において、金属材料、ガラス等
の代替えを果たしてきたが、大量に消費され、また大量
に廃棄される昨今では、その分解されにくいという性質
が逆に災いし、廃棄物処理場に蓄積されることとなっ
た。また、焼却処理を行うと、ＣＯ2 排出量の増加とな
り、ある場合には、ダイオキシンや環境ホルモン等の有
害物質の発生原因ともなる。このような環境への影響を
配慮して、従来の石油由来の合成高分子材料に代えて、
一定の強度・耐久性は維持するものの、最終的には、自
然に存在する各種微生物等により分解が可能な生分解性
高分子材料の利用が検討され、一部実用化が進みつつあ
る。
【０００３】例えば、ポリ３−ヒドロキシブチレート
（ＰＨＢ）に代表される微生物産生ポリエステル（ポリ
ヒドロキシアルカノエート；ＰＨＡ）は、生物により分
解されうるという特性を有しており、前記の生分解性高
分子材料としての応用が検討されている。すなわち、微
生物産生ポリエステルは、再び微生物等により生分解さ
れるので、最終的には、自然の物質循環に取り込まれ
る。つまり、環境保全を可能とするプラスチックとして
利用することができる。また、医療用軟質部材として
も、今後一層有用視される可能性を有している（特開平
５−１５９号公報、特開平６−１６９９８０号公報、特
開平６−１６９９８８号公報、特開平６−２２５９２１
号公報などを参照)。
【０００４】これまで、多くの細菌が、ポリ３−ヒドロ
キシブチレート（ＰＨＢ）、あるいは３−ヒドロキシブ
チレートとその他のヒドロキシアルカノエートとのコポ
リマーを菌体内に生成・蓄積することが報告されている
（「生分解性プラスチックハンドブック」 (生分解性プ
ラスチック研究会編；(株)エヌ・ティー・エス)、p.178
-197などを参照)。例えば、アルカリゲネス・ユウトロ
ファスＨ１６株（Alcaligenes eutropus H16； ATCC N
o. 17699）ならびにその変異株は、これらポリマーの生
産に関し詳細に研究されている。すなわち、基質となる
炭素源を変化させることによって、３−ヒドロキシブチ
レート（３ＨＢ：３−ヒドロキシブタン酸）と３−ヒド
ロキシバレレート（３ＨＶ：３−ヒドロキシペンタン
酸）の共重合体または両者の各単位を共に含有成分とす
る共重合体を様々な割合で生成することが公表されてい
る（特表平６−１５６０４号公報、特表平７−１４３５
２号公報、特公平８−１９２２７号公報などを参照)。
【０００５】また、特許公報第２６４２９３７号には、
シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovo
rans）ATCC 29347株に、炭素源として非環状脂肪族炭化
水素を与えることにより、炭素数が６から１２までの３
−ヒドロキシアルカノエート（３ＨＡ：３−ヒドロキシ
アルカン酸）をモノマーユニットとするポリエステルを
生産することが開示されている。
【０００６】特開平５−７４４９２号公報には、メチロ
バクテリウム（Methylobacterium)属、パラコッカス(Pa
racoccus)属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、シュ
ードモナス（Pseudomonas）属のバクテリアを、炭素数
３から７の第一級アルコールに接触させることにより、
３ＨＢと３ＨＶの共重合ポリエステルを生産せしめる方
法が開示されている。
【０００７】特開平５−９３０４９号公報、および特開
平７−２６５０６５号公報には、アエロモナス・キャビ
エ（Aeromonas caviae）を、不飽和脂肪酸のオレイン酸
（(Z)-9-オクタデセン酸）やオレイン酸等の不飽和脂肪
酸を多く含むオリーブオイルを炭素源として培養するこ
とにより、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサノエート（３
ＨＨｘ：３−ヒドロキシヘキサン酸）の２成分共重合ポ
リエステルを生産することが開示されている。
【０００８】特開平９−１９１８９３号公報には、コマ
モナス・アシドボランス(Comamonasacidovorans) IFO 1
3852株を、炭素源としてD-グルコン酸及び1,4-ブタンジ
オール含む培地を用いて培養することにより、３ＨＢと
４−ヒドロキシブチレート（４ＨＢ：４−ヒドロキシブ
タン酸）をモノマーユニットに持つポリエステルを生産
することが開示されている。
【０００９】更に、これら微生物が産生するポリエステ
ルに、種々の機能性を付与するため、様々な置換基の導
入がなされてきている。これら置換基導入等に関して
は、例えば、FEMS Microbiology Letters, 128 (1995)
p.219-228などに詳細に記載されている。導入される置
換基（官能基）には、例えば、不飽和炭化水素基、エス
テル基（ラクトン構造など）、アリール基（芳香環）、
シアノ基、ハロゲン化炭化水素基、エポキシ基（エポキ
シ化）等が挙げられる。
【００１０】このように、微生物生産ポリエステルであ
るポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、モノマ
ーユニットに様々な置換基を導入することより様々な機
能を示すものが得られているが、その利用範囲をより広
げる上では、更に広範囲なモノマーユニットを含んだＰ
ＨＡを生産する方法が望まれる。また、前記のＰＨＡを
生産しうる微生物の探索・開発が必要となる。
【００１１】例えば、アリール基をモノマーユニット分
子内に含むＰＨＡを生産する微生物としては、これま
で、３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリアン酸（３Ｈ
ＰＶ：３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、上記
一般式（１）でＲ＝Ｈの化合物）をモノマーユニットと
してＰＨＡ中に導入する菌株として、シュードモナスオ
レオボランス(Pseudomonas oleovorans)の一株が報告さ
れているのみである（Macromolecules, 24, p.5256-526
0 (1991)を参照)。前記報告、ならびにInternational J
ournal of Biological Macromolecules, 19, p.29-34
(1996)を参照すると、前記菌株はノナン酸あるいはオク
タン酸を増殖基質とし、培地に添加する５−フェニルバ
レリアン酸(ＰＶＡ：５−フェニルペンタン酸)から、３
ＨＰＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産す
る。また、この時同時に生産される他のＰＨＡのモノマ
ーユニットは、３−ヒドロキシ吉草酸(３ＨＶ：３−ヒ
ドロキシペンタン酸)、３−ヒドロキシヘキサン酸(３Ｈ
Ｈｘ)、３−ヒドロキシヘプタン酸(３ＨＨｐ)、３−ヒ
ドロキシオクタン酸(３ＨＯ)、３−ヒドロキシノナン酸
(３ＨＮ)、３−ヒドロキシデカン酸(３ＨＤ)、３−ヒド
ロキシドデカン酸(３ＨＤＯ)であり、一般的なＰＨＡの
主成分である３−ヒドロキシ酪酸(３ＨＢ：３−ヒドロ
キシブタン酸)ユニットは含まれていない。さらに、Mac
romolecules, 29, p.1762-1766 (1996)には、５−（ｐ
−トリル）バレリアン酸（５−（ｐ−トリル）ペンタン
酸）、５−（４−エチルフェニル）バレリアン酸（５−
（４−エチルフェニル）ペンタン酸）、５−（４−ビフ
ェニリル）バレリアン酸（５−（４−ビフェニリル）ペ
ンタン酸）、８−（ｐ−トリル）オクタン酸を基質とし
て、それぞれの基質化合物に対応する芳香環を含んだＰ
ＨＡを生産することが記載されている。また、Macromole
cules, 29, p.3432-3435 (1996)には、６−フェノキシ
ヘキサン酸、８−フェノキシオクタン酸、１１−フェノ
キシウンデカン酸を基質として、それぞれの基質化合物
に対応する芳香環を含んだＰＨＡを生産することが記載
されている。しかしながら、モノマーユニットに３ＨＢ
は含まれていない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】一方、様々なニーズに
対応して、多様な物性のＰＨＡが望まれており、例え
ば、これまで報告のない、３ＨＢとフェニル基などのア
リール基を置換基として含む３−ヒドロキシアルカン酸
（３ＨＡ）を同時に含むコポリマーの生産方法が強く望
まれている。また、前記のコポリマーを生産する微生物
の探索・開発にも、大きな期待が掛けられている。
【００１３】本発明は、上記の課題を解決するものであ
り、本発明の目的は、３ＨＢと、下記一般式（１）で示
される３−ヒドロキシ−５−(４−置換フェニル)吉草酸
をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノ
エートを同時に生産する新規な微生物を提供することに
ある。また、本発明の目的は、前記の微生物を利用し
て、３ＨＢと、下記一般式（１）で示される３−ヒドロ
キシ−５−(４−置換フェニル)吉草酸をモノマーユニッ
トとして含むポリヒドロキシアルカノエートの生物的生
産方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題
を解決するため、新規に各地から採取した土壌から多数
の菌株を単離し、５−フェニルバレリアン酸(ＰＶＡ：
５−フェニルペンタン酸)を単一炭素源とする選択培地
において生育するＰＶＡ資化増殖微生物を選別した。更
に、選別されたＰＶＡ資化増殖微生物の複数菌株につい
て、その属の同定、ならびに、ポリヒドロキシアルカノ
エート（ＰＨＡ）の生産能を調べたところ、ノナン酸と
５−フェニルバレリアン酸を基質（炭素源）として培養
する際、３−ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）ならびに３
−ヒドロキシ−５−フェニルバレリアン酸（３ＨＰＶ
Ａ）をモノマーユニニットとして含むＰＨＡを同時に生
産する能力を示す菌株の存在を見出した。このうち、前
記のＰＨＡ生産能を有し、バークホルデリア・スピーシ
ズ（Burkholderia sp.）と同定できる菌株は、新規な菌
株と判断され、そのうち、一つの菌株をバークホルデリ
ア・スピーシズ（Burkholderia sp.）ＯＫ３株として、
通産省 工業技術院 生命工学工業技術研究所（生命研
（NIBH））に寄託した(寄託番号：FERM P-17370）。ま
た、このＯＫ３株は、更に、下記一般式（２）で示され
る５−（４−置換フェニル）バレリアン酸を含む培地で
培養すると、３−ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）ならび
に対応する３−ヒドロキシ−５−（４−置換フェニル）
バレリアン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生
産能を示すことを見出した。かかる知見に基づき、本発
明を完成するに至った。
【００１５】すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカ
ノエート生産能を有する微生物は、３−ヒドロキシ酪酸
と、下記一般式（１）：
【００１６】
【化３】 （式中、ＲはＨまたはＣＨ3 を表す）で示される３−ヒ
ドロキシ−５−(４−置換フェニル)吉草酸をモノマーユ
ニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートを同時
に生産する新規微生物バークホルデリア・スピーシズ
（Burkholderia sp.）ＯＫ３株（FERM P-17370）であ
る。
【００１７】また、本発明のポリヒドロキシアルカノエ
ートの生物的生産方法は、前記バークホルデリア・スピ
ーシズ（Burkholderia sp.）ＯＫ３株（FERM P-17370）
を、下記一般式（２）：
【００１８】
【化４】 （式中、ＲはＨまたはＣＨ3 を表す）で示される５−
(４−置換フェニル)吉草酸を含む培地中で培養した後、
３-ヒドロキシ酪酸と、前記一般式（１）で示され、前
記一般式（２）とＲを共通とするる３−ヒドロキシ−５
−(４−置換フェニル)吉草酸をモノマーユニットとして
含むポリヒドロキシアルカノエートを前記培養物から抽
出することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート
の生物的生産方法である。
【００１９】なお、上記のポリヒドロキシアルカノエー
トの生物的生産方法において、前記ポリヒドロキシアル
カノエートの抽出に、クロロホルムを用いると好まし
い。同じく、前記ポリヒドロキシアルカノエートの抽出
に、次亜塩素酸塩を用いることも好ましい。加えて、前
記培地は、上記一般式（２）で示される５−(４−置換
フェニル)吉草酸に加えて、ノナン酸またはラウリン酸
（ドデカン酸）のいずれかを含む培地とすることが好ま
しい。
【００２０】
【発明の実施の形態】本発明の微生物であるＯＫ３株
は、岡山県の土壌からＰＶＡを単一炭素源とする選択培
地によりＰＶＡ資化増殖微生物として取得された。
【００２１】このＯＫ３株は、次の表１〜３に纏める特
徴を有する微生物である。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【表２】
【００２４】
【表３】
【００２５】（3）キノン組成分析 以上の性質を有することから、本菌株、ＯＫ３株は、バ
ークホルデリア スピーシズ（Burkholderia sp.）と同
定するのが、適当であることが認められた。
【００２６】更に、このＯＫ３株は、後述の実施例にお
いて詳細に記載するように、ノナン酸（ＮＡ）と上記一
般式（２）で示される５−(４−置換フェニル)バレリア
ン酸を基質（炭素源）とした培養によって、これまで報
告の無い、３ＨＢならびに一般式（１）に示される３−
ヒドロキシ−５−(４−置換フェニル)バレリアン酸をモ
ノマーユニットとして含むＰＨＡを同時に生産する能力
があることが判明した。以上の特徴的な性質を示すこと
から、ＯＫ３株は、バークホルデリア属に属する新きな
菌株であると結論し、バークホルデリア スピーシズ（B
urkholderia sp.）ＯＫ３株として、通産省 工業技術
院 生命工学工業技術研究所に寄託した(寄託番号：FER
M P-17370）。
【００２７】本発明のＯＫ３株は、通常増殖させる場合
には、一般増殖用の天然培地（ＬＢ培地等）や、Ｍ９培
地のような無機塩培地に酵母エキスやペプトン等を０．
２％〜０．５％程度添加した培地を用いることができ
る。
【００２８】一方、ＰＨＡを蓄積させる場合は、Ｍ９培
地のような無機塩培地に、増殖用炭素源として、炭素数
７〜１２程度の脂肪酸、例えば、ノナン酸（ＮＡ）やオ
クタン酸（ＯＡ）、デカン酸、ラウリン酸（ドデカン
酸）等の中鎖の脂肪酸を０．１％〜０．２％程度、及び
一般式（２）に示される５−(４−置換フェニル)バレリ
アン酸を０．１％〜０．２％程度添加した培地用いて、
対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、菌体を遠心
分離等で収穫する。次いで、この菌体を、窒素源が存在
しない無機塩培地に、中鎖の脂肪酸を０．１％〜０．２
％程度、及び一般式（２）に示す5-(4-置換フェニル)バ
レリアン酸を０．１％〜０．２％程度添加した培地で更
に培養するという方法を採ることができる。
【００２９】あるいは、始めから無機塩培地中の窒素源
濃度を１／１０程度に制限し、上記中鎖の脂肪酸を０．
１％〜０．２％程度、及び一般式（２）に示される５−
(４−置換フェニル)バレリアン酸を０．１％〜０．２％
程度添加した培地で培養し、対数増殖後期から定常期の
時点で菌体を収穫して、所望のＰＨＡを抽出する方法を
採用することもできる。
【００３０】この様な培養には、バッチ式、流動バッチ
式、連続培養式、リアクター形式等、通常微生物を培養
する種々の方法を用いることができる。
【００３１】先に述べた、ＰＨＡを蓄積させる際に利用
される無機塩培地は、リン源(通常はリン酸塩)、窒素源
(通常はアンモニウム塩、或いは硝酸塩)等、微生物が増
殖しうる成分を含んでいるものならいかなるものでもよ
く、例えば、ＭＳＢ培地、Ｍ９培地等を挙げることがで
きる。本発明における実施例で用いるＭ９培地の組成を
表４に示す。
【００３２】
【表４】
【００３３】本発明のポリヒドロキシアルカノエートの
生物的生産方法においては、培養後、集菌される菌体か
ら、目的のＰＨＡを回収する手段には、通常行われてい
るクロロホルム抽出が最も簡便である。例えば、有機溶
媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活
性剤処理、リゾチーム等の酵素処理、ＥＤＴＡ、次亜塩
素酸ナトリウム、アンモニア等の薬剤処理によって、目
的のＰＨＡ以外の菌体内成分を除去することによって、
ＰＨＡを回収する方法を採ることもできる。なかでも、
次亜塩素酸ナトリウムを利用する手段は、好適に利用さ
れる。
【００３４】
【実施例】以下に、具体例を示し、本発明をより詳しく
説明する。ただし、本発明は、これらの実施例により、
なんら限定されるものではない。
【００３５】（実施例１） ３ＨＢおよび３ＨＰＶ含有ＰＨＡの生産−１ ノナン酸０．１％を含むＭ９寒天培地上で生育させたＯ
Ｋ３株のコロニーを、ノナン酸０．１％、ＰＶＡ（５−
フェニルペンタン酸）０．１％を含むＭ９液体培地（２
００ ｍＬ）に植菌し、３０℃で培養した。３６時間
後、菌体を遠心分離によって収穫し、ノナン酸０．１
％、ＰＶＡ ０．２％を含む、窒素源（ＮＨ4 Ｃｌ）を含
まないＭ９液体培地（２００ ｍＬ）に再懸濁して、更
に、３０℃で３６時間振とう培養した。この菌体を、再
び遠心分離によって収穫し、冷メタノールで一度洗浄し
て凍結乾燥した。
【００３６】この凍結乾燥ペレットを秤量した後、１０
０ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌
してＰＨＡを抽出した。抽出液を０．４５μｍのフィル
ターでろ過した後、エバポレーターで濃縮し、濃縮液を
冷メタノール中で再沈殿させ、ポリマーを得た。このポ
リマーを室温で減圧乾燥し、秤量した。
【００３７】得られたＰＨＡの組成は以下のようにして
分析した。すなわち、約１０ｍｇＰＨＡを２５ｍＬ容ナ
ス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍＬに溶解させ、
３％硫酸を含むメタノール溶液２ｍＬを加えて、１００
℃で還流しながら３．５時間反応させた。反応終了後、
脱イオン水１０ｍＬを加えて、激しく１０分間振とうし
た後に、２層に分離した下層のクロロホルム層を取り出
し、硫酸マグネシウムで脱水した。このクロロホルム層
をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−Ｍ
Ｓ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）にかけて、含まれて
いるＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同
定を行った。表５に、同定されたモノマーユニットとそ
の含有率を示す。
【００３８】
【表５】
【００３９】ＣＤＷ：ｃｅｌｌ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ
(乾燥菌体重量) ＰＤＷ：Ｐｏｌｙｍｅｒ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ(ポリマ
ー乾燥重量) Ｃ／Ｐ：ポリマー乾燥重量／乾燥菌体重量 ３ＨＢ：３−ヒドロキシ酪酸 ３ＨＶ：３−ヒドロキシ吉草酸 ３ＨＨｐ：３−ヒドロキシヘプタン酸 ３ＨＮ：３−ヒドロキシノナン酸 ３ＨＰＶ：３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸
【００４０】（実施例２） ３ＨＢおよび３ＨＰＶ含有ＰＨＡの生産−２ ラウリン酸０．１％を含むＭ９寒天培地上で生育させた
ＯＫ３株のコロニーを、ラウリン酸０．１％、ＰＶＡ
（５−フェニルペンタン酸）０．１％を含むＭ９液体培
地（２００ ｍＬ）に植菌し、３０℃で培養した。３６
時間後、菌体を遠心分離によって収穫し、ノナン酸０．
１％、ＰＶＡ ０．２％を含む、窒素源（ＮＨ4 Ｃｌ）
を含まないＭ９液体培地（２００ ｍＬ）に再懸濁し
て、更に、３０℃で３６時間振とう培養した。この菌体
を、再び遠心分離によって収穫し、冷メタノールで一度
洗浄して凍結乾燥した。
【００４１】この凍結乾燥ペレットを秤量した後、１０
０ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌
してＰＨＡを抽出した。抽出液を０．４５μｍのフィル
ターでろ過した後、エバポレーターで濃縮し、濃縮液を
冷メタノール中で再沈殿させ、ポリマーを得た。このポ
リマーを室温で減圧乾燥し、秤量した。
【００４２】得られたＰＨＡの組成は以下のようにして
分析した。すなわち、約１０ｍｇＰＨＡを２５ｍＬ容ナ
ス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍＬに溶解させ、
３％硫酸を含むメタノール溶液２ｍＬを加えて、１００
℃で還流しながら３．５時間反応させた。反応終了後、
脱イオン水１０ｍＬを加えて、激しく１０分間振とうし
た後に、２層に分離した下層のクロロホルム層を取り出
し、硫酸マグネシウムで脱水した。このクロロホルム層
をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−Ｍ
Ｓ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）にかけて、含まれて
いるＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同
定を行った。表６に、同定されたモノマーユニットとそ
の含有率を示す。
【００４３】
【表６】
【００４４】ＣＤＷ：ｃｅｌｌ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ
(乾燥菌体重量) ＰＤＷ：Ｐｏｌｙｍｅｒ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ(ポリマ
ー乾燥重量) Ｃ／Ｐ：ポリマー乾燥重量／乾燥菌体重量 ３ＨＢ：３−ヒドロキシ酪酸 ３ＨＨｘ：３−ヒドロキシヘキサン酸 ３ＨＯ：３−ヒドロキシオクタン酸 ３ＨＤ：３−ヒドロキシデカン酸 ３ＨＤＤ：３−ヒドロキシドデカン酸 ３ＨＰＶ：３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸
【００４５】（実施例３） ３ＨＢ及び３ＨＴＶＡ（３−ヒドロキシ−５−(ｐ−ト
リル）吉草酸）含有ＰＨＡの生産 まず、Macromolecules, 29, p.1762-1766 (1996)とMacr
omolecules, 27, p.45-49 (1994)に記載される方法に従
って、グリニャール反応により基質であるＴＶＡ（５−
(ｐ−トリル）吉草酸：５−(ｐ−トリル）ペンタン酸）
を合成した。即ち、５−ブロモ吉草酸を無水ＴＨＦ（テ
トラヒドロフラン）に溶解させ、−２０℃、アルゴン雰
囲気下で３Ｍ メチルマグネシウムクロリドＴＨＦ溶液
を滴下しながら加えた。約１５分間攪拌した後、ｐ−ブ
ロモトルエンとマグネシウムのＴＨＦ溶液を更に滴下
し、次いで、０．１Ｍ Ｌｉ2 ＣｕＣｌ4 のＴＨＦ溶液を
加えた（温度は−２０℃に保持）。この反応液を、室温
まで戻し、更に一晩攪拌した。その後、この溶液を氷冷
した２０％硫酸水溶液に注加し、攪拌して、水層を採取
した。得られる水層を食塩で飽和し、エーテルで抽出し
た。更に、エーテル抽出液から、５０ｇの水酸化カリウ
ムを加えた１００ｍＬの脱イオン水で抽出した後、水層
を２０％硫酸水溶液で酸性化して、油状部分を回収し
た。
【００４６】この油状部分を、硫酸マグネシウムで脱水
した後、減圧乾燥した。得られた生成物を、重アセトン
に溶解して1Ｈ−ＮＭＲを測定したところ、合成法を開
示する原論文のMacromolecules, 29, p.1762-1766 (199
6)に示されるＴＶＡのデータと一致した。この生成物を
ＴＶＡ基質として以下の実験に用いた。
【００４７】ノナン酸０．１％を含むＭ９寒天培地上で
生育させたＯＫ３株のコロニーを、ノナン酸０．１％、
ＴＶＡ ０．１％を含むＭ９液体培地（２００ ｍＬ）に
植菌し、３０℃で培養した。３６時間後、菌体を遠心分
離によって収穫し、ノナン酸０．１％、ＴＶＡ ０．２
％を含む、窒素源（ＮＨ4 Ｃｌ）を含まないＭ９液体培
地（２００ ｍＬ）に再懸濁して、更に、３０℃で３６
時間振とう培養した。この菌体を、再び遠心分離によっ
て収穫し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【００４８】この凍結乾燥ペレットを秤量した後、１０
０ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌
してＰＨＡを抽出した。抽出液を０．４５μｍのフィル
ターでろ過した後、エバポレーターで濃縮し、濃縮液を
冷メタノール中で再沈殿させ、ポリマーを得た。このポ
リマーを室温で減圧乾燥し、秤量した。
【００４９】得られたＰＨＡの組成は以下のようにして
分析した。すなわち、約１０ｍｇＰＨＡを２５ｍＬ容ナ
ス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍＬに溶解させ、
３％硫酸を含むメタノール溶液２ｍＬを加えて、１００
℃で還流しながら３．５時間反応させた。反応終了後、
脱イオン水１０ｍＬを加えて、激しく１０分間振とうし
た後に、２層に分離した下層のクロロホルム層を取り出
し、硫酸マグネシウムで脱水した。このクロロホルム層
をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−Ｍ
Ｓ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）にかけて、含まれて
いるＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同
定を行った。表７に、同定されたモノマーユニットとそ
の含有率を示す。
【００５０】
【表７】
【００５１】ＣＤＷ：ｃｅｌｌ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ
(乾燥菌体重量) ＰＤＷ：Ｐｏｌｙｍｅｒ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ(ポリマ
ー乾燥重量) Ｃ／Ｐ：ポリマー乾燥重量／乾燥菌体重量 ３ＨＢ：３−ヒドロキシ酪酸 ３ＨＶ：３−ヒドロキシ吉草酸 ３ＨＨｐ：３−ヒドロキシヘプタン酸 ３ＨＮ：３−ヒドロキシノナン酸 ３ＨＴＶＡ：３−ヒドロキシ−５−（ｐ−トリル）吉草
酸
【００５２】
【発明の効果】本発明は、３ＨＢと３−ヒドロキシ−５
−(４−置換フェニル)吉草酸をモノマーユニットとする
ＰＨＡを同時に生産するという特異な性質を有する新規
な菌株として、バークホルデリア スピーシズ ＯＫ３株
（FERM P-17370）を提供するとともに、このＯＫ３株を
基質として、５−(４−置換フェニル)吉草酸を含む培地
で適当な条件下で培養することで、３ＨＢならびに３−
ヒドロキシ−５−(４−置換フェニル)吉草酸をモノマー
ユニットとするＰＨＡを同時に生産することを可能とし
た。本発明の方法では、３−ヒドロキシ−５−(４−置
換フェニル)吉草酸をモノマーユニットとするＰＨＡに
加えて、同時に３ＨＢをモノマーユニットとするＰＨＡ
も高い収率で、簡便に生産することができる利点があ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ３−ヒドロキシ酪酸と、下記一般式
    （１）： 【化１】 （式中、ＲはＨまたはＣＨ3 を表す）で示される３−ヒ
    ドロキシ−５−(４−置換フェニル)吉草酸をモノマーユ
    ニットとして含むポリヒドロキシアルカノエートを同時
    に生産する新規微生物バークホルデリア・スピーシズ
    （Burkholderia sp.）ＯＫ３株（FERM P-17370）。
  2. 【請求項２】 前記請求項１記載のバークホルデリア・
    スピーシズ（Burkholderia sp.）ＯＫ３株（FERM P-173
    70）を、下記一般式（２）： 【化２】 （式中、ＲはＨまたはＣＨ3 を表す）で示される５−
    (４−置換フェニル)吉草酸を含む培地中で培養した後、
    ３-ヒドロキシ酪酸と、前記一般式（１）で示され、前
    記一般式（２）とＲを共通とするる３−ヒドロキシ−５
    −(４−置換フェニル)吉草酸をモノマーユニットとして
    含むポリヒドロキシアルカノエートを前記培養物から抽
    出することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート
    の生物的生産方法。
  3. 【請求項３】 前記ポリヒドロキシアルカノエートの抽
    出に、クロロホルムを用いることを特徴とする請求項２
    に記載のポリヒドロキシアルカノエートの生物的生産方
    法。
  4. 【請求項４】 前記ポリヒドロキシアルカノエートの抽
    出に、次亜塩素酸塩を用いることを特徴とする請求項２
    に記載のポリヒドロキシアルカノエートの生物的生産方
    法。
  5. 【請求項５】 前記培地は、ノナン酸またはラウリン酸
    のいずれかを含むことを特徴とする請求項２〜４のいず
    れかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの生物的生
    産方法。
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