DE60304620T2

DE60304620T2 - Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten aus Alkanen mit aromatischen Ringen im Molekül

Info

Publication number: DE60304620T2
Application number: DE60304620T
Authority: DE
Inventors: c/o Canon Kabushiki Kaisha Takashi Kenmoku; c/o Canon Kabushiki Kaisha Etsuko Sugawa; c/o Canon Kabushiki Kaisha Tetsuya Yano; c/o Canon Kabushiki Kaisha Takeshi Imamura; c/o Canon Kabushiki Kaisha Tsutomu Honma
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2002-04-26
Filing date: 2003-04-07
Publication date: 2007-05-03
Also published as: CN1495215A; EP1367078A3; JP2003310292A; KR20030084731A; EP1367078A2; DE60304620T8; KR100548943B1; US7056708B2; EP1367078B1; US20030207412A1; CN1252119C; DE60304620D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat (das hier nachstehend als "PHA" abgekürzt werden kann), als einen Polyester, wobei als Ausgangsmaterial ein substituiertes Alkanderivat verwendet wird. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von PHA unter Verwendung von Mikroorganismen, die PHA produzieren und in den Zellen speichern können, wobei als Ausgangsmaterial in substituiertes Alkanderivat verwendet wird.
Beschreibung des einschlägigen Standes der Technik
Es ist berichtet worden, daß viele Mikroorganismen Poly-3-hydroxybuttersäure (die hier nachstehend als "PHB" abgekürzt werden kann) oder andere PHA produzieren und diese Polymere in den Zellen speichern ("Biodegradable Plastic Handbook", herausgegeben von der Society of Biodegradable Plastic Research, N·T·S Co., Ltd., S. 178-197 (1995)). Diese Polymere können wie herkömmliche Kunststoffe für die Herstellung verschiedener Arten von Produkten durch Verarbeiten aus der Schmelze und dergleichen verwendet werden. Die Polymere sind zudem biologisch abbaubar und werden somit von Mikroorganismen in der Natur vorteilhafterweise zersetzt. Im Gegensatz zu synthetischen Polymeren verschmutzen diese Polymere somit die Umwelt nicht. Die vorstehend genannten Polymere haben auch eine hervorragende Biokompatibilität. Somit läßt sich erwarten, daß sie weiche medizinische Materialien und dergleichen bilden.
Es ist bekannt, daß von Mikroorganismen produzierbare PHA in Abhängigkeit von den Arten der für die Produktion verwendeten Mikroorganismen, den Zusammensetzungen der Züchtungsmedien, den Kulturbedingungen usw. verschiedene Zusammensetzungen und Strukturen aufweisen. Folglich sind Untersuchungen zur Regelung der Zusammensetzungen und Strukturen von PHA hauptsächlich durchgeführt worden, um deren physikalische Eigenschaften zu verbessern.
Es wird zum Beispiel berichtet, daß ein Stamm von Alcaligenes eutropus H16 (ATCC Nr. 17699) oder dessen Mutanten Copolymere von 3-Hydroxybuttersäure ("3HB") und 3-Hydroxyvaleriansäure ("3HV") mit verschiedenen Zusammensetzungsverhältnissen produziert, wenn für die Züchtung verschiedene Kohlenstoffquellen verwendet werden (japanische Patentveröffentlichungen Nr. 6-15604, 7-14352 und 8-19227).
Die japanische Patentveröffentlichung Nr. 2642937 offenbart, daß dem Stamm Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 ein nichtcyclischer aliphatischer Kohlenwasserstoff als Kohlenstoffquelle zugesetzt wird, wodurch PHA mit einem 3-Hydroxyalkanoat mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen als Monomereinheit erzeugt wird.
JP-A-5-7492 offenbart ein Verfahren, bei dem Mikroorganismen von Methylobacterium sp., Paracoccus sp., Alcaligenes sp. und Pseudomonas sp. mit einem primären Alkohol mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen in Kontakt gebracht werden, wodurch ein Copolymer von 3HB und 3HV erzeugt wird.
JP-A-5-93049 und 7-265065 offenbaren, daß ein Stamm von Aeromonas caviae mit Oleinsäure und Olivenöl als Kohlenstoffquellen gezüchtet wird, wodurch ein binäres Copolymer von 3HB und 3-Hydroxyhexansäure ("3HHx") erzeugt wird.
JP-A-9-191893 offenbart, daß ein Stamm von Comamonas acidovorans IFO 13852 mit Gluconsäure und 1,4-Butandiol als Kohlenstoffquellen gezüchtet wird, wodurch ein Polyester mit 3HB und 4-Hydroxybuttersäure als Monomereinheiten erzeugt wird.
Die vorstehend beschriebenen PHA weisen Alkylgruppen in den Seitenketten auf, das heißt sie sind "übliches PHA". Angesichts der umfangreichen Verwendung der von einem Mikroorganismus produzierbaren PHA wird jedoch erwartet, daß PHA mit von Alkylgruppen verschiedenen Substituenten, zum Beispiel einer Phenylgruppe und dergleichen, die in die Seitenketten eingeführt wurden, vorteilhafte Polyester darstellen. Zu Beispielen anderer Substituenten gehören ein ungesättigter Kohlenwasserstoff, ein Esterrest, eine Allylgruppe, eine Cyanogruppe, ein Halogenkohlenwasserstoff, ein Epoxid und dergleichen. Insbesondere wurde PHA mit einem aromatischen Ring extensiv untersucht.
(a) PHA mit einer Phenylgruppe oder einer teilweise substituierten Phenylgruppe:
In Macromolecules, 24, 5256-5260 (1991) wird berichtet, daß Pseudomonas oleovorans PHA mit 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure als Einheit produziert, wenn 5-Phenylvaleriansäure als Substrat verwendet wird.
Insbesondere wird berichtet, daß Pseudomonas oleovorans PHA, das 3HV, 3-Hydroxyheptansäure, 3-Hydroxynonansäure, 3-Hydroxyundecansäure und 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure (hier nachstehend als "3HPV" abgekürzt) als Monomereinheiten in einem Verhältnis von 0,6:16,0:41,1:1,7:40,6 enthält, in einer Menge von 160 mg pro Liter Kulturmedium (Trockengewichtsanteil 31,6 %, auf die Zellen bezogen) produziert, wenn als Substrate 5-Phenylvaleriansäure (hier nachstehend als "PVA" abgekürzt) und Nonansäure verwendet werden (Molverhältnis 2:1, Gesamtkonzentration 10 mMol/l). Es wird auch berichtet, daß Pseudomonas oleovorans PHA, das 3HHx, 3-Hydroxyoctansäure, 3-Hydroxydecansäure und 3HPV als Monomereinheiten in einem Verhältnis von 7,3 64,5:3,9:24,3 enthält, in einer Menge von 200 mg pro Liter Kulturmedium (Trockengewichtsanteil 39,2 %, auf die Zellen bezogen) produziert, wenn PVA und Octansäure als Substrate verwendet werden (Molverhältnis 1:1, Gesamtkonzentration 10 mMol/l).
Neben den vorstehend aufgeführten Berichten findet man damit in Zusammenhang stehende Beschreibungen auch in Makromol. Chem., 191, 1957-1965 (1990) und Chirality, 3, 492-494 (1991), worin eine Änderung der physikalischen Eigenschaften des Polymers aufgrund des Vorhandenseins einer 3HPV-Einheit festgestellt wird.
In Macromolecules, 29, 1762-1766 (1996) wird berichtet, daß Pseudomonas oleovorans PHA produziert, das 3-Hydroxy-5-(4'-tolyl)valeriansäure als eine Einheit aufweist, wenn 5-(4'-Tolyl)valeriansäure als Substrat verwendet wird.
In Macromolecules, 32, 2889-2895 (1999) wird berichtet, daß Pseudomonas oleovorans PHA produziert, das 3-Hydroxy-5-(2',4'-dinitrophenyl)valeriansäure und 3-Hydroxy-5-(4'-nitrophenyl)valeriansäure als Einheiten aufweist, wenn 5-(2',4'-Dinitrophenyl)valeriansäure als Substrat verwendet wird.
(b) PHA, das eine Phenoxygruppe oder eine teilweise substituierte Phenoxygruppe enthält:
In Macromol. Chem. Phys., 195, 1665-1672 (1994) wird berichtet, daß Pseudomonas oleovorans ein PHA-Copolymer von 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure und 3-Hydroxy-9-phenoxynonansäure produziert, wenn 11-Phenoxyundecansäure als Substrat verwendet wird.
In Macromolecules, 29, 3432-3435 (1996) wird berichtet, daß Pseudomonas oleovorans PHA, das 3-Hydroxy-4-phenoxy-n-buttersäure und 3-Hydroxy-6-phenoxy-n-hexansäure als Einheiten enthält, aus 6-Phenoxyhexansäure, PHA, das 3-Hydroxy-4-phenoxy-n-buttersäure, 3-Hydroxy-6-phenoxy-n-hexansäure und 3-Hydroxy-8-phenoxy-n-octansäure als Einheiten enthält, aus 8-Phenoxyoctansäure und PHA, das 3-Hydroxy-5-phenoxy-n-valeriansäure und 3-Hydroxy-7-phenoxy-n-heptansäure als Einheiten enthält, aus 11-Phenoxyundecansäure produziert. Die Ausbeuten der Polymere sind diesem Bericht entnommen und in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1
Die japanische Patentveröffentlichung Nr. 2989175 offenbart eine Erfindung, die ein Homopolymer, das aus einer 3-Hydroxy-5-(monofluorphenoxy)pentanoat-Einheit (3H5(MFP)P-Einheit) oder einer 3-Hydroxy-5-(difluorphenoxy)pentanoat-Einheit (3H5(DFP)P-Einheit) besteht, ein Copolymer, das zumindest die 3H5(MFP)P-Einheit oder die 3H5(DFP)P-Einheit umfaßt, und ein Verfahren zur Herstellung dieser Polymere unter Verwendung von Pseudomonas putida, Pseudomonas sp. für die Synthese der Polymere betrifft.
Diese Polymere werden durch das folgende zweistufige Züchtungsverfahren hergestellt.

Züchtungszeit: erste Stufe 24 Stunden, zweite Stufe 96 Stunden.

Das in jeder Stufe verwendete Substrat und das entstandene Polymer sind nachfolgend aufgeführt.

(1) Entstandenes Polymer: 3-Hydroxy-5-(monofluorphenoxy)pentanoat-Homopolymer Substrate in der ersten Stufe: Citronensäure, Hefeextrakt Substrat in der zweiten Stufe: Monofluorphenoxyundecansäure
(2) Entstandenes Polymer: 3-Hydroxy-5-(difluorphenoxy)pentanoat-Homopolymer Substrate in der ersten Stufe: Citronensäure, Hefeextrakt Substrat in der zweiten Stufe: Difluorphenoxyundecansäure
(3) Entstandenes Polymer: 3-Hydroxy-5-(monofluorphenoxy)pentanoat-Copolymer Substrate in der ersten Stufe: Octansäure oder Nonansäure, Hefeextrakt Substrat in der zweiten Stufe: Monofluorphenoxyundecansäure
(4) Entstandenes Polymer: 3-Hydroxy-5-(difluorphenoxy)pentanoat-Copolymer Substrate in der ersten Stufe: Octansäure oder Nonansäure, Hefeextrakt Substrat in der zweiten Stufe: Difluorphenoxyundecansäure.

Für diesen Effekt kann ein Polymer mit Phenoxygruppen deren Enden der Seitenketten mit 1 bis 2 Fluoratomen substituiert sind, durch Assimilation einer Fettsäure mit mittlerer Kettenlänge mit Substituenten synthetisiert werden, und dem Polymer kann Stereoregularität und Hydrophobie verliehen werden, wobei ein hoher Schmelzpunkt und eine gute Verarbeitbarkeit erhalten bleiben.
Außerdem wurde auch ein mit Fluor substituiertes Polymer, mit Cyano oder Nitro substituierte Polymere untersucht.
Can. J. Microbiol., 41, 32-43 (1995) und Polymer International, 39, 205-213 (1996) offenbaren, daß PHA, das 3-Hydroxy-p-cyanophenoxyhexansäure oder 3-Hydroxy-p-nitrophenoxyhexansäure als Monomereinheit enthält, unter Verwendung eines Stamms von Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 und eines Stamms von Pseudomonas putida KT 2442 und Octansäure und p-Cyanophenoxyhexansäure oder p-Nitrophenoxyhexansäure als Substrate produziert wird.
Im Gegensatz zu allgemeinem PHA mit Alkylgruppen in den Seitenketten hat das in diesem Bericht offenbarte PHA aromatische Gruppen in den Seitenketten und ist somit von Vorteil, um ein Polymer zu erhalten, dessen physikalische Eigenschaften sich von diesen aromatischen Ringen ableiten.
(c) Es wird erwartet, daß PHA mit einer Monomereinheit, die eine Cyclohexylgruppe enthält, physikalische Eigenschaften des Polymers aufweist, die sich von denen eines PHA unterscheiden, das eine Monomereinheit aufweist, die eine übliche aliphatische Hydroxyalkansäure enthält. Beispiele der Erzeugung mit Pseudomonas oleovorans sind in Macromolecules, 30, 1611-1615 (1997) aufgeführt.
In diesem Bericht wird ein Stamm von Pseudomonas oleovorans in einem Kulturmedium gezüchtet, das Nonansäure und Cyclohexylbuttersäure oder Cyclohexylvaleriansäure enthält, wodurch ein PHA erhalten wird, das eine Einheit, die eine Cyclohexylgruppe enthält, und eine von Nonansäure stammende Einheit enthält (das Verhältnis ist nicht bekannt).
Bezüglich der Ausbeute wird berichtet, daß das Verhältnis zwischen Nonansäure und Cyclohexylbuttersäure bei den Bedingungen einer Gesamtkonzentration des Substrats von 20 mMol/l geändert wurde, wodurch die in Tabelle 2 aufgeführten Ergebnisse erhalten wurden. Tabelle 2
CDW: Trockengewicht der Zellen (mg/l), PDW: Trockengewicht des Polymers (mg/l), Ausbeute: PDW/CDW (%)
In diesem Beispiel ist jedoch die Ausbeute des Polymers pro Liter Kulturmedium unzureichend und das entstandene PHA selbst enthält in der Monomereinheit aliphatische Hydroxyalkansäure, die von Nonansäure stammt.
Es wurde auch eine neue Kategorie untersucht, bei der PHA mit geeigneten funktionellen Gruppen in den Seitenketten nicht nur produziert worden ist, um einfach die physikalischen Eigenschaften zu verändern, sondern um auch unter Ausnutzung dieser funktionellen Gruppen eine neue Funktion zu schaffen.
In Macromolecules, 31, 1480-1486 (1996) und Journal of Polymer Science: Part A; Polymer Chemistry, 36, 2381-22387 (1998) wird zum Beispiel berichtet, daß PHA mit einer Einheit mit einer Vinylgruppe am Ende der Seitenkette synthetisiert und dann mit einem Oxidationsmittel epoxidiert wird, wodurch ein PHA synthetisiert wird, das an den Enden der Seitenketten sehr reaktive Epoxygruppen aufweist.
Ein Synthesebeispiel von PHA mit einer Einheit, die eine von einer Vinylgruppe verschiedene Sulfidgruppe enthält, von der erwartet wird, daß sie eine hohe Reaktivität hervorruft, ist das PHA, von dem in Macromolecules, 32, 8315-8318 (1999) berichtet wird, wobei ein Stamm von Pseudomonas putida 27N01 ein PHA-Copolymer von 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure und 3-Hydroxy-7-(phenylsulfanyl)heptansäure produziert, wobei 11-Phenylsulfanylvaleriansäur als Substrat verwendet wird.
Wie vorstehend beschrieben können von Mikroorganismen produzierbare PHA mit unterschiedlichen Zusammensetzungen und Strukturen erhalten werden, wenn die Arten der für die Produktion verwendeten Mikroorganismen, die Zusammensetzungen der Medien und die Züchtungsbedingungen geändert werden. Die vorstehend beschriebenen PHA wurden jedoch nur erzeugt, um die physikalischen Eigenschaften als Kunststoff zu verbessern.
Andererseits läßt sich erwarten, daß das vorstehend beschriebene "unübliche PHA", bei dem Substituenten in die Seitenkette eingeführt worden sind, ein "funktionelles Polymer" sein kann, das aufgrund der Eigenschaften der eingeführten Substituenten nützliche Funktionen und Eigenschaften hat. Folglich wird es als sehr nützlich und wichtig gesehen, ein hervorragendes Polymer mit der vorstehend angegebenen Funktion und biologischen Abbaubarkeit, Mikroorganismen, die dieses Polymer produzieren können und das Polymer in den Zellen speichern können, und ein Biosyntheseverfahren zur wirksamen Produktion des Polymers mit hoher Reinheit zu entwickeln.
Ein allgemeines Verfahren zur Herstellung von "unüblichem PHA", bei dem in die Seitenketten irgendwelche der zahlreichen Gruppen eingeführt worden sind, das heißt ein PHA mit einer Monomereinheit der Formel (7), mit Mikroorganismen umfaßt: eine substituierte Fettsäure der Formel (8), die einen einzuführenden Substituenten aufweist, wird chemisch synthetisiert, die Fettsäure wird Mikroorganismen für die Züchtung zugeführt, und das erzeugte PHA wird dann herausgelöst, wie es im vorstehenden Bericht bei Beispielen von Pseudomonas oleovorans offenbart ist.
worin bedeuten
R zumindest einen Rest aus der Gruppe von Resten, die jeweils einen aromatischen Ring aufweisen, und
r irgendeine ganze Zahl von 1 bis 8.
worin bedeuten
R zumindest einen Rest aus der Gruppe von Resten, die jeweils einen aromatischen Ring aufweisen, und
s irgendeine ganze Zahl von 1 bis 8.
Beim vorstehend beschriebenen allgemeinen Verfahren zur Herstellung von PHA, bei dem die substituierte Fettsäure als Substrat synthetisiert und die substituierte Fettsäure den Mikroorganismen zugeführt wird, ist eine Carboxylgruppe der substituierten Fettsäure die aktive Gruppe in der chemischen Reaktion und somit ist die chemische Synthese der Fettsäure durch die Art, Anzahl und Position der eingeführten Substituenten deutlich eingeschränkt. Folglich ist häufig ein kompliziertes Verfahren zum Schützen der aktiven Carboxylgruppe beim Reaktionsschritt der chemischen Synthese und zum Entfernen der Schutzgruppe der Carboxylgruppe erforderlich, wodurch eine chemische Reaktion mit einigen Schritten erforderlich ist. Die Synthese auf industriellem Produktionsniveau ist folglich schwierig oder die Synthese erfordert viel Zeit, Arbeit und Kosten.
Wenn jedoch "unübliches PHA" erzeugt werden kann, indem als Ausgangsmaterial in substituiertes Alkan verwendet wird, das im Vergleich mit der substituierten Fettsäure leicht chemisch synthetisiert werden kann, läßt sich das vorstehend angegebene Problem möglicherweise lösen.
Herkömmliche Beispiele der Erzeugung von PHA aus Alkanderivaten schließen Beispiele der Biosynthese von PHA mit Mikroorganismen ein, wobei als Ausgangsmaterialien geradkettige Alkane und Alkene (Doppelbindungen enthaltende Alkane) (Appl. Environ. Microbiol., 54, 2924-2932 (1988)), chlorierte Alkane (Macromolecules, 23, 3705-3707 (1990)), fluorierte Alkane (Biotechnol. Lett., 16, 501-506 (1994)) und Alkane, die Acetoxyreste enthalten, verwendet werden (Macromolecules, 33, 8571-8575 (2000)). Über Synthesebeispiele von PHA unter Verwendung eines Alkans, das einen Rest aufweist, der einen aromatischen Ring als Substituenten enthält, gibt es keinen Bericht.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Als Ergebnis intensiver Untersuchungen zur Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung von "unüblichem PHA" unter Verwendung eines Ausgangsmaterials, das im Vergleich mit substituierten Fettsäuren leicht synthetisiert werden kann oder verfügbar ist, haben die Erfinder festgestellt, daß "unübliches PHA" hergestellt werden kann, wenn als Ausgangsmaterial ein substituiertes Alkan verwendet wird, das im Vergleich mit substituierten Fettsäuren chemisch leicht synthetisiert werden kann. Diese Erkenntnis führte zu dem neuen Verfahren zur Herstellung von PHA unter Verwendung eines substituierten Alkans.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat unter Verwendung von Mikroorganismen umfaßt das Züchten von Mikroorganismen, die Polyhydroxyalkanoat produzieren können, in einem Medium, das zumindest eine Ausgangsverbindung enthält, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus substituierten Alkanen der Formel (1) besteht, wodurch ein Polyhydroxyalkanoat erzeugt wird, das in seinem Molekül zumindest eine Einheit aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 3-Hydroxy-substituierten Alkanoat-Einheiten der Formel (2) besteht:
worin bedeuten:
R einen Rest, der einen substituierten aromatischen Ring enthält, und
n eine ganze Zahl von 1 bis 8;
worin bedeuten:
R einen Rest, der einen substituierten aromatischen Ring enthält, und
m eine ganze Zahl von 1 bis 8.
In den Formeln (1) und (2) ist der Rest R, der einen substituierten aromatischen Ring enthält, zumindest ein Rest, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus substituierten Phenylsulfanylresten der Formel (3), und der Gruppe, bestehend aus (substituierten Phenylmethyl)sulfanyl-Resten der Formel (4):
worin R1 für einen Substituenten am aromatischen Ring steht und ausgewählt ist aus einem H-Atom, einem Halogenatom, einer CN-Gruppe, einer NO₂-Gruppe, einer CH₃-Gruppe, einer C₂H₅-Gruppe, einer CH₃CH₂CH₂-Gruppe, einer (CH₃)₂CH-Gruppe und einer (CH₃)₃C-Gruppe;
worin R2 für einen Substituenten am aromatischen Ring steht und ausgewählt ist aus einem H-Atom, einem Halogenatom, einer CN-Gruppe, einer NO₂-Gruppe, einer CH₃-Gruppe, einer C₂H₅-Gruppe, einer CH₃CH₂CH₂-Gruppe, einer (CH₃)₂CH-Gruppe und einer (CH₃)₃C-Gruppe.
Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen deutlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Darstellung des ¹H-NMR-Spektrums des in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung erzeugten Polyhydroxyalkanoats.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Als erstes Beispiel einer Verbindung, die in der vorliegenden Erfindung als Ausgangsverbindung verwendet wird, wird zumindest eine Verbindung aus 1-[(substituierten Phenyl)sulfanyl]alkanen der Formel (9) ausgewählt. In diesem Fall wird ein Polyhydroxyalkanoat erzeugt, das in seinem Molekül zumindest eine Einheit aufweist, die aus 3-Hydroxy-ω-[(substituierten phenyl)sulfanyl]alkanoat-Einheiten der Formel (10) ausgewählt ist.
worin R1 für zumindest einen Substituenten eines aromatischen Rings steht und ausgewählt ist aus einem H-Atom, einem Halogenatom, einer CN-Gruppe, einer NO₂-Gruppe, einer CH₃-Gruppe, einer C₂H₅-Gruppe, einer CH₃CH₂CH₂-Gruppe, einer (CH₃)₂CH-Gruppe und einer (CH₃)₃C-Gruppe, und n für eine ganze Zahl von 1 bis 8 steht.
worin R1 für zumindest einen Substituenten eines aromatischen Rings steht und ausgewählt ist aus einem H-Atom, einem Halogenatom, einer CN-Gruppe, einer NO₂-Gruppe, einer CH₃-Gruppe, einer C₂H₅-Gruppe, einer CH₃CH₂CH₂-Gruppe, einer (CH₃)₂CH-Gruppe und einer (CH₃)₃C-Gruppe, und m für eine ganze Zahl von 1 bis 8 steht.
Als zweites Beispiel einer Verbindung, die in der vorliegenden Erfindung als Ausgangsverbindung verwendet wird, wird zumindest eine Verbindung aus 1-{[(substituierten Phenyl)methyl]sulfanyl}alkanen der Formel (11) ausgewählt. In diesem Fall wird ein Polyhydroxyalkanoat erzeugt, das in seinem Molekül zumindest eine Einheit aufweist, die aus 3-Hydroxy-ω-{[(substituierten phenyl)methyl]sulfanyl}alkanoat-Einheiten der Formel (12) ausgewählt ist.
worin R2 für zumindest einen Substituenten eines aromatischen Rings steht und ausgewählt ist aus einem H-Atom, einem Halogenatom, einer CN-Gruppe, einer NO₂-Gruppe, einer CH₃-Gruppe, einer C₂H₅-Gruppe, einer CH₃CH₂CH₂-Gruppe, einer (CH₃)₂CH-Gruppe und einer (CH₃)₃C-Gruppe, und n für eine ganze Zahl von 1 bis 8 steht.
worin R2 für zumindest einen Substituenten eines aromatischen Rings steht und ausgewählt ist aus einem H-Atom, einem Halogenatom, einer CN-Gruppe, einer NO₂-Gruppe, einer CH₃-Gruppe, einer C₂H₅-Gruppe, einer CH₃CH₂CH₂-Gruppe, einer (CH₃)₂CH-Gruppe und einer (CH₃)₃C-Gruppe, und m für eine ganze Zahl von 1 bis 8 steht.
Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren ausführlich beschrieben. Das Herstellungsverfahren umfaßt einen Schritt, bei dem Mikroorganismen in einem Medium gezüchtet werden, das zumindest eine der Verbindungen der Formel (9) und (11) enthält, wodurch ein Polyhydroxyalkanoat erzeugt wird, das in seinem Molekül zumindest eine der 3-Hydroxyalkansäure-Einheiten der Formeln (10) und (12) aufweist.
Beim vorstehend beschriebenen Herstellungsverfahren, das den Schritt des Züchtens von Mikroorganismen, das heißt den Schritt der Erzeugung von Polyhydroxyalkanoat mit Mikroorganismen, umfaßt, stehen die Länge "n" der Methylenkette des Ausgangsmaterials der Formel (9) oder (11) und die Länge "m" der Methylen-Seitenkette der Einheit der Formel (10) oder (12), die im Molekül des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Polyhydroxyalkanoats vorliegt, in folgendem Zusammenhang (1): m = n – 2I (1)worin I eine ganze Zahl von 0 ≤ 1 < (1/2)n ist.
Wenn als Ausgangsmaterial zum Beispiel 7-(Phenylsulfanyl)heptan der Formel (13) verwendet wird, weist das erzeugte Polyhydroxyalkanoat eine 3-Hydroxy-7-(phenylsulfanyl)heptansäure-Einheit der Formel (14) und eine 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit der Formel (15) auf.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte PHA kann in seinem
Polymermolekül zumindest eine Einheit aus 3-Hydroxyalkansäure-Einheiten der Formel (5):
worin p für eine ganze Zahl von 0 bis 8 steht und im Polymer einen oder mehrere Werte haben kann; oder 3-Hydroxyalk-5-ensäure-Einheiten der Formel (6) enthalten:
worin q eine ganze Zahl von 3 bis 5 ist und im Polymer einen oder mehrere Werte haben kann.
Das Zahlenmittel des Molekulargewichts des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten PHA beträgt etwa 5.000 bis 1.000.000.
Es folgt eine Beschreibung der Mikroorganismen, des Züchtungsschritts und des Gewinnungsschritts in der vorliegenden Erfindung.
Mikroorganismen
Als im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Mikroorganismen können irgendwelche Mikroorganismen eingesetzt werden, sofern Polyhydroxyalkanoat, das in seinem Molekül eine 3-Hydroxy-substituierte Alkanoat-Einheit der Formel (2) aufweist, deren Seitenketten einen Rest mit einem substituierten aromatischen Ring der Formel (3) oder (4) aufweist, erzeugt werden kann, wenn als Ausgangsmaterial, das heißt als Substratausgangsmaterial, ein substituiertes Alkan der Formel (1) verwendet wird, das einen Rest aufweist, der einen substituierten aromatischen Ring der Formel (3) oder (4) enthält. Je nach Bedarf können viele Arten von Mikroorganismen in einem Bereich verwendet werden, in dem die Aufgabe der vorliegenden Erfindung gelöst werden kann.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mikroorganismen müssen zumindest die Fähigkeit aufweisen, Alkan in Alkansäure zu überführen, und haben ferner die Fähigkeit, aus Alkansäure PHA zu produzieren. Die Fähigkeit, ein Alkan in eine Alkansäure zu überführen, tritt im allgemeinen bei einer Gruppe von Enzymsystemen auf, die Alkan-Monooxygenase als Startenzym verwenden.
Die bekannten Mikroorganismen von Pseudomonas sp. waren die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismen. Insbesondere gehören zu Beispielen der Mikroorganismen aus dem Boden abgetrennte Mikroorganismen, wie Mikroorganismen des Stamms Pseudomonas cichorii YN2, der im offengelegten japanischen Patent Nr. 2002-178484 offenbart ist, und Mikroorganismen des Stamms Pseudomonas oleovorans ATCC 29347, der im offengelegten japanischen Patent Nr. 63-226291 offenbart ist. Der Stamm YN ist als FERM BP-7375 beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, National Institute of Bioscience and Human-Technology hinterlegt.
Züchtungsschritt
Beim Züchtungsschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat (PHA) wird Polyhydroxyalkanoat, das in seinem Molekül zumindest eine Einheit aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 3-Hydroxy-substituierten Alkanoat-Einheiten der Formel (2) besteht, aus zumindest einem substituierten Alkan erzeugt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus substituierten Alkanen der Formel (1) besteht, wobei die Mikroorganismen verwendet werden, die die Fähigkeit aufweisen, Polyhydroxyalkanoat zu produzieren.
Für eine normale Züchtung der Mikroorganismen, die in diesem Züchtungsschritt verwendet werden, zum Beispiel für die Herstellung eines Vorratsstamms und das Wachstum der Mikroorganismen, um die Anzahl der Mikroorganismen zu sichern, die für die Produktion von PHA erforderlich ist, und deren aktiven Zustand zu sichern, wird ein Kulturmedium geeignet ausgewählt, das die für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlichen Komponenten enthält. Es kann zum Beispiel irgendein Kulturmedium, wie ein allgemeines natürliches Medium (Nährbouillonmedium, Hefeextrakt oder dergleichen), ein synthetisches Medium, das eine Nährstoffquelle enthält, oder dergleichen verwendet werden, sofern das Kulturmedium keinen nachteiligen Einfluß auf das Wachstum und Überleben der Mikroorganismen hat. Die Züchtungsbedingungen in Form von Temperatur, Bewegen, Rühren und dergleichen, werden entsprechend der verwendeten Mikroorganismen geeignet ausgewählt.
Andererseits kann beim Züchtungsschritt für die Erzeugung des zu erzielenden PHA, das in seinem Molekül zumindest eine Einheit aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 3-Hydroxy-substituierten Alkanoat-Einheiten der Formel (1) besteht, unter Verwendung der vorstehend beschriebenen, PHA produzierenden Mikroorganismen ein anorganisches Kulturmedium verwendet werden, wobei das Kulturmedium als Ausgangsmaterialien für die Erzeugung des PHA zumindest ein substituiertes Alkan, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus substituierten Alkanen der Formel (1) besteht, das der Monomereinheit entspricht, und eine Kohlenstoffquelle für das Wachstum der Mikroorganismen enthält. Der ursprüngliche Gehalt des zumindest einen substituierten Alkans, das mit der Formel (1) angegeben wird und als Ausgangsmaterial verwendet wird, wird vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 1 % (V./V.) und stärker bevorzugt von 0,02 bis 0,2 % (V./V.) pro Liter Kulturmedium ausgewählt.
Als Züchtungsschritt kann das Herstellungsverfahren einen Schritt umfassen, bei dem die Mikroorganismen in Gegenwart von Dicyclopropylketon gezüchtet werden, das eine das Alkanoxidationssystem einleitende Substanz ist. Es ist allgemein bekannt, daß das Alkanoxidationssystem von einem geradkettigen Alkan, das als Substrat des Stoffwechselwegs verwendet wird, zum Beispiel Octan, Nonan oder dergleichen, wirksam eingeleitet wird. Wenn das vorstehend angegebene geradkettige Alkan jedoch als Startsubstanz verwendet wird, muß das Phänomen berücksichtigt werden, daß der Anteil der PHA-Einheit aus einer Fettsäure mit mittlerer Kettenlänge im erzeugten PHA zunimmt. Der Grund ist, daß das geradkettige Alkan durch das Alkanoxidationssystem in geradkettige Alkansäure überführt wird und durch das β-Oxidationssystem zu einem PHA-Monomersubstrat wird.
Das in der vorliegenden Erfindung als Monomersubstrat verwendete substituierte Alkan kann auch das Alkanoxidationssystem einleiten und wie das geradkettige Alkan als PHA-Monomereinheit eingeführt werden. Das Alkanoxidationssystem hat sich als Stoffwechselsystem von geradkettigem Alkan herausgebildet, das in der vorliegenden Erfindung verwendete substituierte Alkan leitet jedoch in einigen Fällen das Alkanoxidationssystem nicht ausreichend ein.
Obwohl Dicyclopropylketon beim Alkanoxidationssystem als induzierende Substanz wirkt, wird es nicht zum Substrat des Oxidationssystems (es wird nicht mit Alkan-Monooxygenase oxidiert). Dicyclopropylketon ist als nicht-metabolisierbare induzierende Substanz bekannt (Journal of Bacteriology, 123, 546-556 (1975)). Wenn das Alkanoxidationssystem unzureichend eingeleitet wird, wenn es erwünscht ist, die Aktivierung weiter zu verbessern, oder wenn ein geringer Anteil der PHA-Einheit aus einer Fettsäure mit mittlerer Kettenlänge im zu erzielenden PHA erwünscht ist, kann folglich beim erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren, Dicyclopropylketon als bevorzugte einleitende Substanz für das Alkanoxidationssystem verwendet werden. In diesem Fall wird das Alkanoxidationssystem durch Dicyclopropylketon wirksam eingeleitet, und der Stoffwechsel des Substrats wird vollständig ausgenutzt, um das in der vorliegenden Erfindung verwendete substituierte Alkan zu überführen. Als Ergebnis kann effektiv eine vom substituierten Alkan stammende Monomereinheit erzeugt werden, wodurch Verbesserungen bei der Ausbeute von PHA und dem Anteil der vom substituierten Alkan stammenden Monomereinheit erreicht werden.
Dem Kulturmedium kann Dicyclopropylketon zusammen mit dem in der vorliegenden Erfindung verwendeten substituierten Alkan zugesetzt werden oder dem Kulturmedium allein zugesetzt werden. In diesem Fall kann der Gehalt von Dicyclopropylketon entsprechend der Bedingungen, wie Art des Wachstumssubstrats im Kulturmedium, Vorhandensein des substituierten Alkans, Konzentration des substituierten Alkans, Kulturart (einstufige Kultur oder mehrstufige Kultur), Stufenzahl der mehrstufigen Kultur usw., geeignet ausgewählt werden. Der Gehalt wird jedoch vorzugsweise im Bereich von 0,001 bis 1 % (V./V.) und stärker bevorzugt von 0,01 bis 0,1 % (V./V.) pro Liter Kulturmedium ausgewählt.
Das substituierte Alkan, das mit der Formel (1) angegeben und als Ausgangsmaterial verwendet wird, ist im allgemeinen hydrophob und weist somit nicht unbedingt eine sehr gute Wasserlöslichkeit auf. Die vorstehend beschriebenen Mikroorganismen haben jedoch die Fähigkeit, daß das substituierte Alkan als Substrat verwendet werden kann, und selbst wenn in der ersten Stufe der Kultur die Menge des substituierten Alkans dessen Löslichkeit übersteigt, wodurch ein teilweise suspendierter Teil erzeugt wird, wird das substituierte Alkan folglich während der kontinuierlichen Züchtung von den Mikroorganismen allmählich aufgenommen und somit allmählich im Kulturmedium gelöst, wodurch keine Probleme hervorgerufen werden. Die Mikroorganismen scheiden auch eine einem oberflächenaktiven Mittel ähnliche Substanz aus, um das substituierte Alkan wirksam aufzunehmen, wodurch die Aufnahme des als Substrat verwendeten substituierten Alkans erleichtert wird.
Um das Dispersionsvermögen zu verbessern, kann das substituierte Alkan, das mit der Formel (1) angegeben und als Substrat verwendet wird, entsprechend der Umstände in einem Lösungsmittel, wie 1-Hexadecen oder n-Hexadecen, gelöst werden oder dem Kulturmedium als feine Suspension zugesetzt werden. In diesem Fall muß die Konzentration des Lösungsmittels, wie 1-Hexadecen oder n-Hexadecen, auf das Kulturmedium bezogen 3 % (V./V.) oder weniger betragen.
Das Wachstumssubstrat, das von den Mikroorganismen für das Wachstum benötigt wird, wird dem Medium zudem getrennt zugesetzt. Als Wachstumssubstrat kann ein Nährstoff, wie Hefeextrakt, Polypepton oder Fleischextrakt, verwendet werden. Angesichts der Nützlichkeit als Kohlenstoffquelle kann das Wachstumssubstrat entsprechend des verwendeten Stamms auch geeignet aus Sacchariden, organischen Säuren, die als Zwischenprodukte beim TCC-Zyklus erzeugt werden, organischen Säuren oder Salzen davon, die beim TCC-Zyklus durch eine einstufige oder zweistufige biochemische Reaktion erzeugt werden, Aminosäuren oder Salzen davon, geradkettigen Alkanen mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen oder Salzen davon und dergleichen ausgewählt werden.
Von diesen Wachstumssubstraten wird als ein Saccharid vorzugsweise zumindest eine Verbindung aus Aldosen, wie Glycerinaldehyd, Erythrose, Arabinose, Xylose, Glucose, Galactose, Mannose, Fructose und dergleichen; Alditolen, wie Glycerol, Erythritol, Xylitol und dergleichen; Aldonsäuren, wie Gluconsäure und dergleichen; Uronsäuren, wie Glucuronsäure, Galacturonsäure und dergleichen; Disacchariden, wie Maltose, Saccharose, Lactose und dergleichen, ausgewählt.
Als organische Säure oder deren Salz wird vorzugsweise zumindest eine Verbindung aus der Gruppe ausgewählt, die aus Pyruvinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Citronensäure, Succinsäure und Salzen davon besteht. Als Aminosäure oder deren Salz wird vorzugsweise zumindest eine Verbindung aus der Gruppe ausgewählt, die aus Glutaminsäure, Asparaginsäure und Salzen davon besteht.
Von den zahlreichen Wachstumssubstraten wird vorzugsweise Polypepton oder ein Saccharid verwendet, und vorzugsweise wird insbesondere zumindest eine Verbindung aus der Gruppe ausgewählt, die aus Glucose, Fructose und Mannose besteht, und als Saccharid verwendet. Der Gehalt des Wachstumssubstrats wird vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 5 % (Gew./Vol.) und stärker bevorzugt im Bereich von 0,2 bis 2 % (Gew.-/Vol.) pro Liter Kulturmedium ausgewählt.
Ein weiteres Verfahren, das beim Züchtungsschritt für die Produktion und zum Speichern von PHA in den Mikroorganismen durchgeführt wird, umfaßt das ausreichende Wachstum der Mikroorganismen, das Übertragen der Zellen in ein Medium, in dem eine Stickstoffquelle, wie Ammoniumchlorid, eingeschränkt ist, und anschließend das weitere Züchten der Zellen in einem Medium, das eine Verbindung enthält, die als Substrat für die zu erzielende Einheit zugesetzt wurde. Bei diesem Verfahren kann die Produktivität verbessert werden. Es kann zum Beispiel ein System mit mehreren Schritten verwendet werden, das mehrere, bei unterschiedlichen Züchtungsbedingungen durchgeführte Schritte umfaßt.
Insbesondere umfaßt das bevorzugte Züchtungsverfahren in zwei Schritten einen Schritt 1-1, bei dem die Mikroorganismen in einem Kulturmedium, das das substituierte Alkan der Formel (1) und ein Polypepton als Kohlenstoffquelle enthält, bis zu einer späteren Stufe des exponentiellen Wachstums oder der stationären Phase gezüchtet werden und die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen werden, und danach einen Schritt 1-2, bei dem die Zellen der Mikroorganismen, die im vorhergehenden Schritt 1-1 gezüchtet wurden und gewachsen sind, in einem Kulturmedium weiter gezüchtet werden, das das substituierte Alkan der Formel (1) und eine organische Säure oder deren Salz als Kohlenstoffquelle und keine Stickstoffquelle enthält. Ein weiteres bevorzugtes Züchtungsverfahren in zwei Schritten umfaßt einen Schritt 1-3, bei dem die Mikroorganismen in einem Kulturmedium, das das substituierte Alkan der Formel (1) und Glucose als Kohlenstoffquelle enthält, bis zu einer späteren Stufe des exponentiellen Wachstums oder der stationären Phase gezüchtet werden und die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen werden, und danach einen Schritt 1-4, bei dem die Zellen der Mikroorganismen, die im vorhergehenden Schritt 1-3 gezüchtet wurden und gewachsen sind, in einem Kulturmedium weiter gezüchtet werden, das das substituierte Alkan der Formel (1) und Glucose als Kohlenstoffquelle und keine Stickstoffquelle enthält. Ein weiteres bevorzugtes Züchtungsverfahren in zwei Schritten umfaßt einen Schritt 1-5, bei dem die Mikroorganismen in einem Kulturmedium, das das substituierte Alkan der Formel (1) und ein Polypepton als Kohlenstoffquelle enthält, bis zu einer späteren Stufe des exponentiellen Wachstums oder der stationären Phase gezüchtet werden und die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen werden, und danach einen Schritt 1-6, bei dem die Zellen der Mikroorganismen, die im vorhergehenden Schritt 1-5 gezüchtet wurden und gewachsen sind, in einem Kulturmedium weiter gezüchtet werden, das das substituierte Alkan der Formel (1) und ein Saccharid als Kohlenstoffquelle und keine Stickstoffquelle enthält.
Bei jedem dieser Züchtungsverfahren in zwei Schritten wird das PHA, das in seinem Molekül zumindest eine Einheit enthält, die aus der Gruppe von 3-Hydroxysubstituierten Alkanoat-Einheiten der Formel (2) ausgewählt ist, aus dem entsprechenden substituierten Alkan der Formel (1) erzeugt und beim Wachstum der Zellen im ersten Schritt als Ausgangsmaterial verwendet. Dann werden die gezüchteten Zellen in einen Züchtungszustand gebracht, hauptsächlich in den für die Produktion des PHA im zweiten Schritt in dem Medium, das keine Stickstoffquelle enthält, wodurch die Menge des in den Zellen gespeicherten PHA weiter erhöht wird.
Dicyclopropylketon, das eine wirksame einleitende Substanz für den Alkanoxidationsweg darstellt, der Alkan-Monooxygenase als Startenzym umfaßt, kann ebenfalls zumindest einem der Schritte 1-1 und 1-2, der Schritte 1-3 und 1-4 oder der Schritte 1-5 und 1-6 zugesetzt werden, um den Stoffwechsel des substituierten Alkans wirksam zu fördern, womit die entsprechende substituierte Alkansäure erzeugt wird, wodurch die Ausbeute von PHA und der Anteil der zu erzielenden PHA-Monomereinheit erhöht werden.
Beim ersten Züchtungsschritt, mit dem hauptsächlich das Alkanoxidationssystem eingeleitet werden soll, das heißt der Schritt 1-1, der Schritt 1-3 oder der Schritt 1-5, kann zudem anstelle des substituierten Alkans Dicyclopropylketon allein verwendet werden.
Beim Züchtungsschritt kann die Temperatur so eingestellt werden, daß der Stamm ausreichend wächst. Die Züchtungstemperatur wird zum Beispiel geeignet im Bereich von 15 bis 40°C, stärker bevorzugt im Bereich von 20 bis 35°C und besonders bevorzugt im Bereich von 20 bis 30°C ausgewählt.
Es kann irgendein Verfahren aus einem Flüssigkulturverfahren, einem Festkulturverfahren und dergleichen angewendet werden, sofern die verwendeten Mikroorganismen wachsen können, um aus zumindest einem substituierten Alkan als im Medium enthaltenem Ausgangsmaterial, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus substituierten Alkanen der Formel (1) besteht, ein PHA zu produzieren, das in seinem Molekül zumindest eine Einheit enthält, die aus 3-Hydroxy-substituierten Alkanoat-Einheiten der Formel (2) ausgewählt ist. Außerdem kann irgendeine Kultur aus Batch-Kultur, Fed-batch-Kultur, halbkontinuierlicher Kultur, kontinuierlicher Kultur und dergleichen, verwendet werden, sofern das Ausgangsmaterial, die Kohlenstoffquelle und Sauerstoff geeignet zugeführt werden.
Beispiele eines Batch-Flüssigkulturverfahrens schließen ein Verfahren, bei dem Sauerstoff durch Schütteln eines Schüttelkolbens zugeführt wird, und ein Verfahren ein, bei dem Sauerstoff in einem gerührten Belüftungssystem unter Verwendung eines Fermentors zugeführt wird.
Als anorganisches Kulturmedium, das für dieses Züchtungsverfahren verwendet wird, kann irgendein Kulturmedium verwendet werden, sofern es die für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlichen Komponenten, wie eine Phosphorquelle (zum Beispiel ein Phosphat oder dergleichen), eine Stickstoffquelle (zum Beispiel ein Ammoniumsalz, ein Nitrat oder dergleichen) und dergleichen enthält. Es kann zum Beispiel das Medium MSB oder das Medium M9 verwendet werden.
Die Zusammensetzung des im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mediums M9 ist nachfolgend aufgeführt.

Na₂HPO₄ 6,2 g

KH₂PO₄ 3,0 g

NaCl 0,5 g

NH₄Cl 1,0 g

(pro 1 Liter Kulturmedium, pH = 7,0).

Um das Wachstum und die Erzeugung von PHA weiter zu verbessern, muß zum Beispiel etwa 0,3 % (V./V.) Lösungen der nachfolgenden Mikrokomponenten zugesetzt werden, um die erforderlichen Mikronährstoffelemente zu kompensieren. (Lösung von Mikrokomponenten)

Nitrilotriessigsäure:	1,5 g
MgSO₄:	3,0 g
MnSO₄:	0,5 g
NaCl:	1,0 g
FeSO₄:	0,1 g
CaCl₂:	0,1 g
CoCl₂:	0,1 g
ZnSO₄:	0,1 g
CuSO₄:	0,1 g
AlK(SO₄)₂:	0,1 g
H₃BO₃:	0,1 g
Na₂MoO₄:	0,1 g
NiCl₂:	0,1 g

(pro 1 Liter Lösung der Mikrokomponenten, pH = 7,0).

Wie beim vorstehend beschriebenen Züchtungsverfahren kann irgendeines der herkömmlichen Verfahren, die für die Züchtung von Mikroorganismen angewendet werden, wie eine Batch-Kultur, eine Batch-Fließkultur, eine halbkontinuierliche Kultur, eine kontinuierliche Kultur, eine Kultur in einem Reaktorsystem, eine Festkultur und dergleichen, angewendet werden.
Schritt zum Extrahieren/Reinigen
Es kann ein herkömmliches Verfahren angewendet werden, um das PHA aus den Zellen der Mikroorganismen zu erhalten, die es gemäß der vorliegenden Erfindung produzieren und speichern. Die Gewinnung von PHA aus den gezüchteten Zellen der Mikroorganismen durch Herauslösen mit einem organischen Lösungsmittel stellt das einfachste Verfahren dar. Zu Beispielen des organischen Lösungsmittels gehören Chloroform, Dichlormethan, Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, Acetonitril und dergleichen.
In einer Umgebung, in der die Verwendung eines organischen Lösungsmittels schwierig ist, kann ein chemisches Behandlungsverfahren angewendet werden.
In diesem Fall kann PHA gewonnen werden, indem die vom PHA verschiedenen Zellkomponenten durch Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie SDS, oder dergleichen, durch Behandlung mit einem Enzym, wie Lysozym, oder dergleichen oder durch Behandlung mit einer Chemikalie wie EDTA, Ammoniak oder dergleichen, entfernt werden. Das PHA kann auch gewonnen werden, indem die vom PHA verschiedenen Zellkomponenten mit Natriumhypochlorit entfernt werden, es kann jedoch die Struktur verändert werden. Das PHA kann ferner gewonnen werden, indem die von PHA verschiedenen Zellkomponenten durch physikalisches Zerkleinern der Zellen der Mikroorganismen entfernt werden. In diesem Fall kann irgendeines der Verfahren, wie ein Zerkleinerungsverfahren mit Ultraschall, ein Verfahren mit einem Homogenisierapparat, ein Zerkleinerungsverfahren mittels Druck, ein Kugelschlagverfahren, ein Pulverisierverfahren, ein Mahlverfahren und ein Verfahren aus Gefrieren-Auftauen, angewendet werden.
In der vorliegenden Erfindung sind die Züchtung der Mikroorganismen, die Erzeugung von PHA unter Verwendung der Mikroorganismen, das Speichern von PHA in den Zellen und die Gewinnung des PHA aus den Zellen nicht auf die vorstehend beschriebenen Verfahren begrenzt.
Beispiele
Nachfolgend werden Beispiele der vorliegenden Erfindung beschrieben. In der nachfolgenden Beschreibung bezieht sich "%" auf das Gewicht, wenn es nicht anders angegeben ist.
Beispiel 1
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde 0,1 % (V./V.) mit einem Filter sterilisiertes 1-(Phenylsulfanyl)pentan in das Medium gegeben, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. 48 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und danach gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde erneut in kaltem Methanol gefällt. Ferner wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 96 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch Gel-Permeationschromatographie gemessen (GPC; Toso HLC-8220, Säule: Toso TSK-GEL Super HM-H, Lösungsmittel: Chloroform, Umrechnung auf Polystyrol). Ergebnis Mn = 125.000 und Mw = 278.000. Das PHA wurde bei folgenden Meßbedingungen mit einer Vorrichtung für die magnetische Kernresonanz analysiert:
<Meßvorrichtung> FT-NMR: Bruker DPX400
Resonanzfrequenz: 1 H = 400 MHz
<Meßvorrichtung> Gemessene Kernspezies: 1H
verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃
Bezug: kapillar verschlossenes TMS/CDCl₃
Meßtemperatur: Raumtemperatur.
1 ist eine Darstellung des ¹H-NMR-Spektrums und Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der Identifizierung (sehe Formel (16)).
Tabelle 3
Wie in Tabelle 3 angegeben, wurde das PHA als ein PHA bestätigt, das 97 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheiten und andere Einheiten, die aus gesättigten oder ungesättigten 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen bestehen, enthält.
Beispiel 2
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Polypepton enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde 0,1 % (V./V.) mit einem Filter sterilisiertes 1-(Phenylsulfanyl)pentan in das Medium gegeben, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. 48 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und danach gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Dann wurde die konzentrierte Lösung erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 52 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 135.000 und Mw = 324.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 63 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 3
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Natriumglutamat enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde 0,1 % (V./V.) mit einem Filter sterilisiertes 1-(Phenylsulfanyl)pentan in das Medium gegeben, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. 48 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und danach gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Dann wurde die konzentrierte Lösung erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 200 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 122.000 und Mw = 278.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 10 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 4
200 ml Medium M9, das 0,1 % (Vol./Vol.) Nonansäure enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde 0,1 % (V./V.) mit einem Filter sterilisiertes 1-(Phenylsulfanyl)pentan in das Medium gegeben, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. 48 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und danach gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Dann wurde die konzentrierte Lösung erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 70 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 135.000 und Mw = 324.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 8 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 5
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Hefeextrakt enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde 0,1 % (V./V.) mit einem Filter sterilisiertes 1-(Phenylsulfanyl)pentan in das Medium gegeben, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. 48 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und danach gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Dann wurde die konzentrierte Lösung erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 45 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 138.000 und Mw = 331.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 61 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte/ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 6
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde 0,1 % (V./V.) mit einem Filter sterilisiertes 1-(Phenylsulfanyl)pentan in das Medium gegeben, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. Wenn die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm 0,1 betrug, wurde dem Kulturmedium dann ferner 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Nachdem die Züchtung unter Schütteln 90 Stunden fortgesetzt worden war, wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und danach gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Dann wurde die konzentrierte Lösung erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 65 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 121.000 und Mw = 281.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 92 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 7
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Polypepton enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde 0,1 % (V./V.) mit einem Filter sterilisiertes 1-(Phenylsulfanyl)pentan in das Medium gegeben, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. Wenn die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm 0,1 betrug, wurde dem Kulturmedium dann ferner 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Nach einer 48-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und danach gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert, mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 58 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 108.000 und Mw = 245.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 70 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 8
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde 0,1 % (V./V.) mit einem Filter sterilisiertes 1-(Phenylsulfanyl)pentan in das Medium gegeben, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose und kein NH₄Cl als Stickstoffquelle enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, und die Schüttelkultur erfolgte bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Dann wurde die konzentrierte Lösung erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 125 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde.
Ergebnis Mn = 125.000 und Mw = 272.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 87 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 9
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde 0,1 % (V./V.) mit einem Filter sterilisiertes 1-(Phenylsulfanyl)pentan in das Medium gegeben, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, so daß die Konzentration 0,1 % (V./V.) betrug, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Dann wurde die konzentrierte Lösung erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 147 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 129.000 und Mw = 286.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 89 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 10
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde 0,1 % (V./V.) mit einem Filter sterilisiertes 1-(Phenylsulfanyl)pentan in das Medium gegeben, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das kein NH₄Cl als Stickstoffquelle enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert und die Schüttelkultur erfolgte bei 30°C und 125 Ausschlägen/min. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Dann wurde die konzentrierte Lösung erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 70 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 138.000 und Mw = 298.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 96 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 11
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde 0,1 % (V./V.) mit einem Filter sterilisiertes 1-(Phenylsulfanyl)pentan in das Medium gegeben, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. Wenn die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm 0,1 betrug, wurde dem Kulturmedium ferner 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Nachdem die Schüttelkultur 14 Stunden fortgesetzt worden war, wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (V./V.) Glucose und kein NH₄Cl als Stickstoffquelle enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurden dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und 0,05 (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Dann wurde die konzentrierte Lösung erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 8 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 128.000 und Mw = 278.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 94 % einer -Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 12
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde 0,1 % (V./V.) mit einem Filter sterilisiertes 1-(Phenylsulfanyl)pentan in das Medium gegeben, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. Wenn die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm 0,1 betrug, wurde dem Kulturmedium ferner 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Nach einer 14-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose und kein NH₄Cl als Stickstoffquelle enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Dann wurde die konzentrierte Lösung erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 14 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde.
Ergebnis Mn = 125.000 und Mw = 282.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 88 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 13
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde 0,1 % (V./V.) mit einem Filter sterilisiertes 1-(Phenylsulfanyl)pentan in das Medium gegeben, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. Wenn die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm 0,1 betrug, wurde dem Kulturmedium ferner 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Nach einer 14-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Dann wurde die konzentrierte Lösung erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 90 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 138.000 und Mw = 298.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 90 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 14
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. Wenn die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm 0,1 betrug, wurde dem Kulturmedium 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Nachdem die Schüttelkultur 14 Stunden fortgesetzt worden war, wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurden dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Dann wurde die konzentrierte Lösung erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 51 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 121.000 und Mw = 283.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 80 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 15
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. Wenn die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm 0,1 betrug, wurde dem Kulturmedium 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Nach einer 14-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose und kein NH₄Cl als Stickstoffquelle enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, und die Schüttelkultur erfolgte bei 30°C und 125 Ausschlägen/min 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 14 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 119.000 und Mw = 245.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 89 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 16
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. Wenn die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm 0,1 betrug, wurde dem Kulturmedium 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Nach einer 14-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Dann wurde die konzentrierte Lösung erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 65 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde.
Ergebnis Mn = 137.000 und Mw = 299.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 72 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 17
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) mit einem Filter sterilisiertes 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. Wenn die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm 0,1 betrug, wurde dem Kulturmedium ferner 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Nach einer 14-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose und kein NH₄Cl als Stickstoffquelle enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurden dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und 0,05 (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert Dann wurde die konzentrierte Lösung erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 5 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 118.000 und Mw = 262.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 89 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 18
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) mit einem Filter sterilisiertes 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. Wenn die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm 0,1 betrug, wurde dem Kulturmedium ferner 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Nach einer 14-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurden dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Dann wurde die konzentrierte Lösung erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 60 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 110.000 und Mw = 262.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 78 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 19
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. Wenn die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm 0,1 betrug, wurde dem Kulturmedium 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Nach einer 14-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose und kein NH₄Cl als Stickstoffquelle enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurden dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert und die Schüttelkultur erfolgte bei 30°C und 125 Ausschlägen/min. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Dann wurde die konzentrierte Lösung erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 8 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 121.000 und Mw = 278.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 89 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 20
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. Wenn die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm 0,1 betrug, wurde dem Kulturmedium 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Nach einer 14-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurden dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Dann wurde die konzentrierte Lösung erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 30 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde.
Ergebnis Mn = 122.000 und Mw = 269.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 72 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 21
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Polypepton enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Kulturmedium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Kulturmedium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. Nachdem die Schüttelkultur 48 Stunden fortgesetzt worden war, wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose und kein NH₄Cl als Stickstoffquelle enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 121 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 121.000 und Mw = 278.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 94 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 22
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Polypepton enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Kulturmedium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Kulturmedium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. Nach einer 48-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 115 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 121.000 und Mw = 282.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 93 % einer -Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 23
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Polypepton enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Kulturmedium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. Nachdem die Schüttelkultur 48 Stunden fortgesetzt worden war, wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das kein NH₄Cl als Stickstoffquelle enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert, mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 51 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 119.000 und Mw = 278.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 96 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Nydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 24
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Polypepton enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Kulturmedium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. Wenn die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm 0,1 betrug, wurde dem Medium ferner 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde ausreichend gerührt. Nach einer 14-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose und kein NH₄Cl als Stickstoffquelle enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 160 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 140.000 und Mw = 308.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 85 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 25
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Polypepton enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Kulturmedium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann bei 30°C unter Schütteln mit 125 Ausschlägen/min gezüchtet wurde. Wenn die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm 0,1 betrug, wurde dem Medium ferner 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde ausreichend gerührt. Nach einer 14-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 118 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 138.000 und Mw = 312.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 93 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 26
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Polypepton enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägenlmin unterzogen wurde. Wenn die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm 0,1 betrug, wurde dem Medium 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde ausreichend gerührt. Nach einer 14-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose und kein NH₄Cl als Stickstoffquelle enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 160 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 139.000 und Mw = 309.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 86 % einer -Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 27
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Polypepton enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. Wenn die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm 0,1 betrug, wurde dem Medium ferner 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde ausreichend gerührt. Nach einer 14-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 121 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 141.000 und Mw = 302.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 85 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 28
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Polypepton enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. Nach einer 48-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Natriumpyruvat und kein NH₄Cl als Stickstoffquelle enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 48 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 145 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde.
Ergebnis Mn = 135.000 und Mw = 288.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 72 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 29
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Polypepton enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. Wenn die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm 0,1 betrug, wurde dem Medium ferner 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Nach einer 14-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Natriumpyruvat und kein NH₄Cl als Stickstoffquelle enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 48 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 80 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 129.000 und Mw = 288.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 81 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 30
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Polypepton enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. Wenn die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm 0,1 betrug, wurde dem Medium 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt. Nach einer 14-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Natriumpyruvat und kein NH₄Cl als Stickstoffquelle enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurden dem Medium 0,1 % (V./V.) mit einem Filter sterilisiertes 1-(Phenylsulfanyl)pentan und 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 48 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 80 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 131.000 und Mw = 289.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 80 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 31
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Polypepton enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. Wenn die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm 0,1 betrug, wurde dem Medium 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt. Nach einer 14-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Natriumpyruvat und kein NH₄Cl als Stickstoffquelle enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurden dem Medium 0,1 % (V./V.) mit einem Filter sterilisiertes 1-(Phenylsulfanyl)pentan und 0,05 % (V./V.) Dicyclopropylketon zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 48 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 75 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 131.000 und Mw = 292.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 78 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 32
Kolonien des Stamms YN2 auf einem Agarmedium M9, das 0,1 % (Gew./Vol.) Nonansäure enthielt, wurden in sterilisierter physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, und die Trübung bei 600 nm wurde bei 1,0 geregelt. Die entstandene Suspension wurde auf 40 Platten Agarmedium M9 ausgestrichen, das keine Kohlenstoffquelle enthielt und das vorher hergestellt worden war, und es erfolgte eine ruhende Kultur bei 30°C in einer Nonanatmosphäre. Nachdem die ruhende Kultur 48 Stunden fortgesetzt worden war, wurden die Zellen gewonnen und danach in 2 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose und kein NH₄Cl als Stickstoffquelle enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) mit einem Filter sterilisiertes 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 10 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde.
Ergebnis Mn = 128.000 und Mw = 282.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 46 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 33
Kolonien des Stamms YN2 auf einem Agarmedium M9, das 0,1 % (Gew./Vol.) Nonansäure enthielt, wurden in sterilisierter physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, und die Trübung bei 600 nm wurde bei 1,0 geregelt. Die entstandene Suspension wurde auf 40 Platten Agarmedium M9 ausgestrichen, das keine Kohlenstoffquelle enthielt und das vorher hergestellt worden war, und es erfolgte eine ruhende Kultur bei 30°C in einer Nonanatmosphäre. Nachdem die Kultur 48 Stunden fortgesetzt worden war, wurden die Zellen gewonnen und danach in 2 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) mit einem Filter sterilisiertes 1-(Phenylsulfanyl)pentan zugesetzt, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 81 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 131.000 und Mw = 301.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 15 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 34
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-[(4-Methylphenyl)sulfanyl]pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. Nach einer 90-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose und kein NH₄Cl als Stickstoffquelle enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-[(4-Methylphenyl)sulfanyl]pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 74 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 72.800 und Mw = 143.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 40 % einer 3-Hydroxy-5-[(4-methylphenyl)sulfanyl]valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 35
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-(Phenylsulfanyl)heptan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. Nach einer 48-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und danach gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 84 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 128.000 und Mw = 294.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 40 % einer 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure-Einheit, 17 % einer 3-Hydroxy-7-(phenylsulfanyl)heptansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 36
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-[(4-Fluorphenyl)sulfanyl]pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. Nach einer 48-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und danach gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 80 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 118.000 und Mw = 252.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 76 % einer 3-Hydroxy-5-[(4-fluorphenyl)sulfanyl]valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 37
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Polypepton enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-[(4-Cyanophenyl)sulfanyl]pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. Nach einer 48-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-[(4-Cyanophenyl)sulfanyl]pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert und die Schüttelkultur erfolgte bei 30°C und 125 Ausschlägen/min. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 45 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 68.000 und Mw = 137.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 12 % einer 3-Hydroxy-5-[(4-cyanophenyl)sulfanyl]valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 38
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-[(4-Nitrophenyl)sulfanyl]pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägenlmin unterzogen wurde. Nach einer 90-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-[(4-Nitrophenyl)sulfanyl]pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 20 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 68.000 und Mw = 137.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 5 % einer 3-Hydroxy-5-[(4-nitrophenyl)sulfanyl]valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 39
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Polypepton enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-[(Phenylmethyl)sulfanyl]pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. Nach einer 48-stündigen Kultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und danach gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 61 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 38.000 und Mw = 75.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 72 % einer 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 40
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-[(Phenylmethyl)sulfanyl]pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. Nach einer 48-stündigen Kultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und danach gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 58 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 29.000 und Mw = 57.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 81 % einer 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)sulfanyl]valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 41
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-{[(4-Fluorphenyl)methyl]sulfanyl}pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. Nach einer 48-stündigen Kultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und danach gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 80 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 28.000 und Mw = 55.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 73 % einer 3-Hydroxy-5-{[(4-fluorphenyl)methyl]sulfanyl}valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 42
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Polypepton enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-{[(4-Cyanophenyl)methyl]sulfanyl}pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. Nach einer 48-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-{[(4-Cyanophenyl)methyl]sulfanyl}pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 26 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde.
Ergebnis Mn = 32.000 und Mw = 66.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 12 % einer 3-Hydroxy-5-{[(4-cyanophenyl)methyl]sulfanyl}valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Beispiel 43
200 ml Medium M9, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, wurden hergestellt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und dann mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-{[(4-Nitrophenyl)methyl]sulfanyl}pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Dann wurde der Stamm Pseudomonas cichorii YN2 in das Medium geimpft, das dann einer Schüttelkultur bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min unterzogen wurde. Nach einer 90-stündigen Schüttelkultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.
Dann wurden 200 ml Medium M9 hergestellt, das 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und danach mit einem Autoklaven sterilisiert. Nachdem der Kolben wieder Raumtemperatur erreicht hatte, wurde dem Medium 0,1 % (V./V.) 1-{[(4-Nitrophenyl)methyl]sulfanyl}pentan zugesetzt, das mit einem Filter sterilisiert worden war, und es wurde gut gerührt. Die gewonnenen Zellen wurden dann erneut im Medium suspendiert und die Schüttelkultur erfolgte bei 30°C mit 125 Ausschlägen/min. 90 Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pellets wurden in 20 ml Chloroform suspendiert und 20 Stunden bei 60°C gerührt, um das PHA herauszulösen. Der entstandene Extrakt wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde dann erneut in kaltem Methanol gefällt. Außerdem wurde nur der Niederschlag gewonnen und danach vakuumgetrocknet, wodurch 10 mg PHA erhalten wurden.
Das Molekulargewicht des so erhaltenen PHA wurde durch GPC-Analyse gemessen, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde. Ergebnis Mn = 26.000 und Mw = 53.000. Als Ergebnis der ¹H-NMR-Analyse des PHA, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde bestätigt, daß das PHA 5 % einer 3-Hydroxy-5-{[(4-nitrophenyl)methyl]sulfanyl}valeriansäure-Einheit und andere Einheiten, die gesättigte oder ungesättigte 3-Hydroxyalkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen umfassen, enthält.
Obwohl die vorliegende Erfindung anhand dessen beschrieben worden ist, was gegenwärtig als bevorzugte Ausführungsformen angesehen wird, ist es selbstverständlich, daß die Erfindung nicht auf die offenbarten Ausführungsformen begrenzt ist.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat unter Verwendung von Mikroorganismen, umfassend das Züchten von Mikroorganismen, die Polyhydroxyalkanoat produzieren können, in einem Medium, enthaltend zumindest eine Ausgangsverbindung, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus substituierten Alkanen der Formel (1) besteht, wodurch ein Polyhydroxyalkanoat erzeugt wird, das in seinem Molekül zumindest eine Einheit aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 3-Hydroxy-substituierten Alkanoat-Einheiten der Formel (2) besteht:
worin bedeuten: R einen Rest, der einen substituierten aromatischen Ring enthält, und n eine ganze Zahl von 1 bis 8;
worin bedeuten: R einen Rest, der einen substituierten aromatischen Ring enthält, und m eine ganze Zahl von 1 bis 8; wobei in den Formeln (1) und (2) der Rest R, der einen substituierten aromatischen Ring enthält, zumindest ein Rest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus substituierten Phenylsulfanylresten der Formel (3):
worin R1 für einen Substituenten am aromatischen Ring steht und ausgewählt ist aus einem H-Atom, einem Halogenatom, einer CN-Gruppe, einer NO₂-Gruppe, einer CH₃-Gruppe, einer C₂H₅-Gruppe, einer CH₂CH₂CH₂-Gruppe, einer (CH₃)₂CH-Gruppe und einer (CH₃)₃C-Gruppe, und der Gruppe, bestehend aus (substituierten Phenylmethyl)sulfanyl-Resten der Formel (4):
worin R2 für einen Substituenten am aromatischen Ring steht und ausgewählt ist aus einem H-Atom, einem Halogenatom, einer CN-Gruppe, einer NO₂-Gruppe, einer CH₃-Gruppe, einer C₂H₅-Gruppe, einer CH₃CH₂CH₂-Gruppe, einer (CH₃)₂CH-Gruppe und einer (CH₃)₃C-Gruppe.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei n in der Formel (1) und m in der Formel (2) in folgendem Zusammenhang (1) stehen: m = n – 2 I (1)worin I für eine ganze Zahl von 0 ≤ 1 < (1/2)n steht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polyhydroxyalkanoat in seinem Polymermolekül eine Einheit der Formel (2) und mindestens eine 3-Hydroxyalkansäure-Einheit der Formel (5) und eine 3-Hydroxyalk-5-ensäure-Einheit der Formel (6) aufweist:
worin p für eine ganze Zahl von 0 bis 8 steht und einen oder mehrere Werte haben kann;
worin q eine ganze Zahl von 3 bis 5 ist und einen oder mehrere Werte haben kann.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zahlenmittel des Molekulargewichts des Polyhydroxyalkanoats im Bereich von 5.000 bis 1.000.000 liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner einen Schritt aufweist, bei dem die Mikroorganismen in einem Kulturmedium, das Dicyclopropylketon enthält, gezüchtet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Kulturmedium Polypepton enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Kulturmedium einen Hefeextrakt enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Kulturmedium ein Saccharid enthält.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Saccharid zumindest eine Verbindung ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Glycerinaldehyd, Erythrose, Arabinose, Xylose, Glucose, Galactose, Mannose, Fructose, Glycerol, Erythritol, Xylitol, Gluconsäure, Glucuronsäure, Galacturonsäure, Maltose, Saccharose und Lactose.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Kulturmedium eine organische Säure oder deren Salz enthält.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die organische Säure oder deren Salz, die bzw. das im Kulturmedium enthalten ist, zumindest eine Verbindung ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Pyruvinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Citronensäure, Succinsäure und Salzen davon.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Kulturmedium eine Aminosäure oder deren Salz enthält.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Aminosäure oder deren Salz, die bzw. das im Kulturmedium enthalten ist, zumindest eine Verbindung ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Glutaminsäure, Asparaginsäure und Salzen davon.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Kulturmedium eine geradkettige Alkansäure mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen oder deren Salz enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Züchtungsschritt, bei dem die Mikroorganismen gezüchtet werden, die beiden Schritte umfaßt: (1) Züchten der Mikroorganismen in einem Kulturmedium, enthaltend zumindest ein substituiertes Alkan, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus substituierten Alkanen der Formel (1), und ein Polypepton; und (2) weiteres Züchten der Mikroorganismen, die im Schritt (1) gezüchtet worden sind, in einem Kulturmedium, enthaltend zumindest ein substituiertes Alkan, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus substituierten Alkanan der Formel (1), und eine organische Säure oder deren Salz.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Züchtungsschritt, bei dem die Mikroorganismen gezüchtet werden, die beiden Schritte umfaßt: (3) Züchten der Mikroorganismen in einem Kulturmedium, enthaltend zumindest ein substituiertes Alkan, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus substituierten Alkanen der Formel (1), und ein Saccharid; und (4) weiteres Züchten der Mikroorganismen, die im Schritt (3) gezüchtet worden sind, in einem Kulturmedium, enthaltend zumindest ein substituiertes Alkan, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus substituierten Alkanen der Formel (1), und ein Saccharid.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Züchtungsschritt, bei dem die Mikroorganismen gezüchtet werden, die beiden Schritte umfaßt: (5) Züchten der Mikroorganismen in einem Kulturmedium, enthaltend zumindest ein substituiertes Alkan, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus substituierten Alkanen der Formel (1), und Polypepton; und (6) weiteres Züchten der Mikroorganismen, die im Schritt (5) gezüchtet worden sind, in einem Kulturmedium, enthaltend zumindest ein substituiertes Alkan, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus substituierten Alkanen der Formel (1), und ein Saccharid.
Verfahren nach Anspruch 15, ferner umfassend einen Schritt, bei dem die Mikroorganismen in einem Medium, das Dicyclopropylketon enthält, gezüchtet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mikroorganismen Alkan-Monooxygenase aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Mikroorganismen Pseudomonas cichorii YN2, FERM BP-7375 sind.