CN102517369B - 高密度微生物混合发酵在氮限制下合成含苯聚羟基烷酸酯的方法 - Google Patents

高密度微生物混合发酵在氮限制下合成含苯聚羟基烷酸酯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种高密度微生物混合发酵在氮限制下合成含苯聚羟基烷酸酯的方法，第一阶段：在发酵培养基中加入≤0.5g/L的含苯有机物和5～20g/L的糖作为碳源，接入两种或两种以上的微生物种子液，利用在线信号判断碳源消耗量，流加碳源保证微生物生长所需；第二阶段：当微生物细胞吸光密度30，用不含氮碱性溶液调pH值并停止补氨水和其它含氮物质，使发酵液中的氮含量降低至0.001mol/L实现氮限制；监控溶解氧和pH值的变化，当二者同时迅速上升加碳源转化为含苯聚羟基烷酸酯。本发明利用微生物混合发酵、多种碳源分段补给合成既含短链单体又含有中长链单体的含苯聚羟基烷酸酯，并能有效地大范围调控其产物组成的优点。

Description

高密度微生物混合发酵在氮限制下合成含苯聚羟基烷酸酯的方法
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种高密度微生物混合发酵在氮限制下合成含苯聚羟基烷酸酯的方法。
背景技术
伴随石油化工的发展，合成塑料已成为人们生活和生产密不可分的工业产品。但是大量不可降解塑料的废弃已造成愈来愈严重的“白色污染”，日益威胁着人类赖以生存的环境，因此开发可生物降解的塑料已成为当务之急。目前采用生物技术生产的生物可完全降解的塑料中，研究得比较多的有两类：聚乳酸和聚羟基烷酸酯。尤其后者的物化性能与聚丙烯相近，还具有生物相容性、光学活性、压电效应、低透氧性、抗紫外线和抗凝血性等许多独特的优点，在医用产品领域也有广泛的用途。
临床医学研究表明：含苯基功能团的有机物苯乙酸和苯丁酸等具有抗肿瘤、镇痛和化学预防治疗等功能。如果将苯基功能团引入生物高分子聚合材料----聚羟基烷酸酯中，合成出具有优良物理化学和机械性能的含苯聚羟基烷酸酯(PHPhA)，利用它在降解过程中缓慢释放出含苯基功能团的有机酸如苯乙酸、苯丁酸等的特点，从而使生物可降解医用材料聚羟基烷酸酯在使用过程中具有抗肿瘤、镇痛等新的医学作用，可为扩大该类生物高分子材料在医学方面的应用奠定良好的基础。
不含苯基功能团的聚羟基烷酸酯的生物合成技术已经基本成熟，如利用发酵法合成聚羟基丁酸酯(PHB)的浓度可达到每升140克，合成的羟基丁酸和羟基戊酸共聚物的浓度能达到每升50～90克左右，这使它们的生产成本大幅度降低，具备了工业化规模生产的条件。但是利用微生物以含苯有机物(如苯戊酸、苯乳酸等)为碳源合成含有苯基功能团的聚羟基烷酸酯时，由于通常微生物代谢含苯有机物的速率较低，而且有机物碳源对细胞生长有明显抑制作用等原因，使得最终得到的细胞浓度和产物浓度都较低。近期报道的两段流加式高密度发酵合成聚羟基苯烷酸酯的方法，可有效地降低有机物碳源对细胞生长抑制作用，从而使得发酵果汁最终得到的细胞浓度可以达到35.3克/升，产物聚羟基苯烷酸酯的浓度达到12.3克/升。但此发酵过程仅仅利用单一菌种Pseudomonas putida发酵合成含苯羟基烷酸酯共聚物，其中的单体绝大部分都是中长链(六个碳或以上)烷酸酯单体，短链(4个碳或以下，或5个碳)烷酸酯单体含量低，导致其材料难于加工成型，应用范围受到很大限制。
此外，利用单一菌种微生物发酵合成含苯聚羟基烷酸酯时，因微生物特性所定，其代谢产物含苯聚羟基烷酸酯往往主要由短链单体组成，或者主要由中长链单体组成，很难调节和控制含苯聚羟基烷酸酯产物中短链单体和中长链单体的比例，以使其产物的物理化学性能难以调控，大大地限制了它的使用范围。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足，提供一种利用微生物混合发酵、多种碳源分段补给来合成既含有短链单体又含有中长链单体的含苯聚羟基烷酸酯，并能有效地大范围调控其产物组成的高密度微生物混合发酵在氮限制下合成含苯聚羟基烷酸酯的方法。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：高密度微生物混合发酵在氮限制下合成含苯聚羟基烷酸酯的方法，主要将两种或两种以上的微生物接种到同一发酵罐内进行混合培养，为了实现高密度发酵，整个发酵分两个阶段完成：
(1)第一阶段：首先在发酵培养基中加入不大于0.5g/L的含苯有机物和5～20g/L的糖作为碳源，然后接入两种或两种以上的微生物种子液于发酵培养基中，并在发酵罐中进行发酵培养，以1vvm的流量将无菌空气或富氧气体(如工业级的氧气)连续通入搅拌釜式发酵罐内，控制发酵罐的搅拌转速为150～800转/分钟，发酵温度为微生物生长的适宜温度，发酵液中溶解氧浓度高于微生物生长代谢的需求值；并利用氨水调节pH为微生物生长的适宜pH值(如果不用氨水而用氢氧化钠溶液来调节pH值时，在发酵过程中需要补给一定量的氮源如硫酸铵，以保证发酵过程中微生物对氮的需求量)；发酵过程中利用在线信号(如溶氧浓度、pH、在线糖浓度分析仪等)判断发酵过程中碳源(糖和含苯有机物等)的消耗量，适时流加碳源以保证微生物的生长所需碳源；
(2)第二阶段：当微生物细胞吸光密度达到30(600nm波长下的测量值)后，利用不含氮的碱性溶液来调节pH值，并停止补加氨水和其它含氮物质，使发酵液中的氮含量逐渐降低至0.001mol/L，造成发酵液中氮源供给不足实现氮限制；并随时监控溶解氧浓度和pH值的变化，当二者的值同时迅速上升时，流加碳源，微生物就会将发酵液中的碳源通过微生物代谢合成转化为含苯聚羟基烷酸酯。
本发明上述的两种或两种以上的微生物为有能力将碳源转化为含苯聚羟基烷酸酯的微生物，如Pseudomonas oleovorans(食油假单胞菌)，Pseudomonas putida(恶臭假单胞菌)，Pseudomonas hydrogenovora，Caldimonas taiwanensi，Ralstonia eutropha(真养产碱杆菌)等中的两种或两种以上。
本发明上述第一阶段中所述的“微生物生长的适宜温度”和“微生物生长的适宜pH值”，因为适宜温度和pH与菌种种类有关，根据具体采用的菌种种类可以给出适宜的温和pH值，如本发明采用的适宜温度可以为28～38℃，如以恶臭假单胞菌Pseudomonasputida KT2442和真养产碱杆菌Ralstonia eutropha混合培养为例，适宜pH值为7.0±2。
上述所述的含苯有机物为苯乙酸、苯己酸、苯戊酸、苯乳酸中的一种或一种以上混合物。
上述所述的糖为葡萄糖、蔗糖、木糖等中的一种或一种以上的混合。本发明的优点和有益效果如下：
1.不同的微生物可将碳源转化为不同的聚羟基烷酸酯，如Ralstonia eutropha可将葡萄糖转化为聚羟基丁酸酯(属于短链聚羟基烷酸酯，比较脆、硬)，而Pseudomonasputida可将葡萄糖转化为聚羟基癸酸-月桂酸酯共聚物(属于中长链聚羟基烷酸酯，比较柔、有弹性)；本发明利用不同微生物的混合发酵，可以合成出既含有短链也含有中长链的聚羟基烷酸酯；同时通过混合碳源补给，利用不同微生物在不同碳源环境下生长代谢的差异性，可实现大范围调控产物中短链和中长链单体的比例，达到调控产物组成的目的，从而改善产物的物理化学性能，扩大产物的应用范围。
2.本发明通过两阶段碳源补给策略，可有效地克服含苯有机物对细胞代谢生长的抑制作用，实现高密度发酵，通过增加细胞密度，提高了含苯有机物的消耗速率，从而提高了含苯聚羟基烷酸酯的生产率。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明不仅仅局限于以下实施例：
恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2442和真养产碱杆菌Ralstonia eutropha都具有将碳源(糖类)转化为含苯聚羟基烷酸酯的能力，在此以恶臭假单胞菌Pseudomonasputida KT2442和真养产碱杆菌Ralstonia eutropha的高密度微生物混合发酵在氮限制条件下高效合成含苯聚羟基烷酸为例，说明本发明的具体实施方式。
上述的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2442来源于韩国科学技术院生物化学工程实验室，真养产碱杆菌Ralstonia eutropha购于英国菌种保藏中心。
实施例1
以表3中所述的分批流加补料发酵方案中的补料方案1实施，具体过程如下：
(1)第一阶段：在5L发酵罐(发酵罐Model：KF-5，KOBIOTECH CO.，LTD韩国生物技术有限公司，型号KF-5)中，配制1.8L基本发酵培养基(其组成见表1)，灭菌后分别接入100mL恶臭假单胞菌的种子液和100mL真养产碱杆菌的种子液(液体种子发酵培养基中蔗糖浓度为5g/L，其它成分的浓度与基本发酵培养基的相同，见表1，种子液按照常规技术制备)。在30℃、初始搅拌转速220转/分钟下开始发酵培养，再以1vvm的流量通入无菌空气或富氧气体，保持发酵液中溶氧浓度高于20％(通过调节搅拌转速或气体中氧气的浓度使溶解氧浓度高于20％，以同温同压下空气中的氧在发酵液中的饱和溶解度值为100％为参照)；用36％氨水调节pH为7.0，氨水可以同时当做氮源使用，在线监测发酵罐中pH和溶解氧浓度的变化，当二者同时迅速上升时(行业常规技术判断)，说明培养基中碳源耗尽，需要流加碳源即加入补料I(其组成见表2即蔗糖)，使发酵罐中蔗糖浓度保持在15g/L之下。
(2)定期从发酵罐内取出发酵液，用分光光度计测量细胞吸光密度值(OD)，当细胞吸光密度值到达30后，发酵进入第二阶段，此时采用2M NaOH调控pH为7.0，开始实施氮限制；同样通过在线监测发酵罐中pH和溶解氧浓度的变化，当二者的值同时迅速上升时，流加碳源即加入补料I和补料II适量，以保持罐体内蔗糖浓度低于15g/L，苯戊酸浓度低于1.0g/L；每隔一定时间取发酵液，离心后测上清液中铵盐离子浓度，由测量值判断，适时加入一定量的补料III(其组成见表2即(NH4)2SO4，MgSO4·7H2O，KH2PO4)，以保持发酵液中(NH4)2SO4浓度低于0.05g/L。培养48小时发酵结束。
实施例2
以表3中所述的两步分批补料发酵方案中的补料方案2实施，即第一阶段流加补料IV，第二阶段流加补料IV+II+III，培养时间50h，其他过程同例1。
实施例3
以表3中所述的两步分批补料发酵方案中的补料方案3实施，即第一阶段流加补料V，第二阶段流加补料V+II+III，培养时间47h，其他过程同例1。
实施例4
以表3中所述的两步分批补料发酵方案中的补料方案4实施，即第一阶段流加补料VI，第二阶段流加补料VI+II+III，培养时间50h，其他过程同例1。
利用上述发酵方法，采取如表3所示的补料策略，发酵终了时细胞浓度、产物聚羟基苯烷酸酯的浓度及其组成(通过气相色谱分析确定其组成)的变化见表4。
表1发酵培养基及微量元素溶液的组成
Figure BDA0000121012970000041
Figure BDA0000121012970000051
表2流加发酵过程中补给料液的组成
表3分批补料方案
Figure BDA0000121012970000053
表4混合发酵中采用氮限制在不同补料策略下含苯聚羟基烷酸酯合成情况
Figure BDA0000121012970000054
Figure BDA0000121012970000061
上述表4中各个组分含义：PHPhA：聚羟基苯烷酸酯(即产物)；HB：羟基丁酸；HHx：羟基己酸；HO：羟基辛酸；HD：羟基癸酸；HM：羟基豆蔻酸；HPV：羟基苯戊酸；DCW：干细胞浓度；％DCW＝PHPhA浓度/DCW。
从表4可以看出，最终细胞浓度在35～39g/L之间，产物浓度在11.7～14.3g/L之间变化。产物聚羟基苯烷酸酯共聚物主要含有C4(即HB)、C6(即HHx)、C8(即HO)、C10(即HD)、C14(即HM)和苯戊酸单体，其中C4和C10的含量比较高。作为短链单体代表的C4和中长链单体代表的C10在产物中的比例变化范围分别为11～47％和39～72％。说明恶臭假单胞菌和真养产碱杆菌混合发酵不但可以合成既含有短链单体又含有中长链单体的含苯聚羟基烷酸酯，而且通过混合补料调控方法可以有效的大范围调节含苯聚羟基烷酸酯中短链单体和中中长链单体的比例，从而达到大范围调控产物组成的目的。同时发酵过程中含苯聚羟基烷酸酯浓度与细胞浓度有相关性，在细胞内含苯聚羟基烷酸酯含量一定时，当细胞密度增高，单位体积发酵液中含苯聚羟基烷酸酯浓度也会随之增加。由于方案1得到的细胞浓度值为本实验中最大，即使方案2得到的每克细胞中含苯聚羟基烷酸酯含量高于方案1，最终方案1得到的含苯聚羟基苯烷酸酯浓度(14.3克/升)仍然为最高，这就是高密度发酵的优势。

Claims (1)

1.一种高密度微生物混合发酵在氮限制下合成含苯聚羟基烷酸酯的方法，其特征在于：合成方法具体过程如下：
(1)第一阶段：在5L发酵罐中，配制1.8L基本发酵培养基，灭菌后分别接入100mL恶臭假单胞菌Pseudomonas putidaKT2442的种子液和100mL真养产碱杆菌Ralstonia eutropha的种子液，其中种子液按照常规技术制备，且液体种子发酵培养基中蔗糖浓度为5g/L，其它成分的浓度与基本发酵培养基的相同；在30℃、初始搅拌转速220转/分钟下开始发酵培养，再以1vvm的流量通入无菌空气或富氧气体，通过调节搅拌转速或气体中氧气的浓度保持发酵液中溶氧浓度高于20％，其中以同温同压下空气中的氧在发酵液中的饱和溶解度值为100％为参照；用36％氨水调节pH为7.0，氨水同时当做氮源使用，在线监测发酵罐中pH和溶解氧浓度的变化，当以行业常规技术判断二者同时迅速上升时，说明培养基中碳源耗尽，需要流加碳源即加入600g/L的蔗糖溶液，使发酵罐中蔗糖浓度保持在15g/L之下；
(2)定期从发酵罐内取出发酵液，用分光光度计测量细胞吸光密度值(OD)，当细胞吸光密度值到达30后，发酵进入第二阶段，此时采用2MNaOH调控pH为7.0，开始实施氮限制；同样通过在线监测发酵罐中pH和溶解氧浓度的变化，当二者的值同时迅速上升时，流加碳源即加入600g/L的蔗糖溶液和200g/L的苯戊酸溶液，以保持罐体内蔗糖浓度低于15g/L，苯戊酸浓度低于1.0g/L；每隔一定时间取发酵液，离心后测上清液中铵盐离子浓度，由测量值判断，适时加入一定量的5.92g/L的(NH4)2SO4溶液，75g/L的MgSO4·7H2O溶液，75g/L的KH2PO4溶液，以保持发酵液中(NH4)2SO4浓度低于0.05g/L，培养48小时发酵结束；
所述的基本发酵培养基为组成如下的培养基：蔗糖15g/L，KH2PO43g/L，(NH4)2SO41g/L，MgSO4·7H2O1.2g/L，柠檬酸1.7g/L，苯戊酸0.1g/L，微量元素溶液10ml/L；其中所述的微量元素溶液，其组成如下：FeSO4·7H2O10g/L，CaCl22g/L，ZnSO4·7H2O2.25g/L，MnSO4·4H2O0.35g/L，CuSO4·5H2O1.2g/L，H3BO30.25g/L，Na2MoO4·2H2O0.12g/L，35%HCL10ml/L；
所述发酵罐为韩国生物技术有限公司生产的Model：KF-5发酵罐。
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