JPH07500615A - ポリ−β−ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）共重合体およびその製造方法、これを生産する微生物とＰＨＡ共重合体の高分子ブレンド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリ−β−ヒドロキシアルカノエート（Ｐ　ＨＡ　）共重合体およびその製造方 法、これを生産する微生物とＰ　ＨＡ共重合体の高分子ブレンド。

発明の詳細な説明 本発明は栄養成分の制限による微生物の生体内でのポリーβ−ｔＦｏ＋ノア／ｌ ｚカッエート（ｐｏｌｙ−β−ｈｙｄｒｏｘｙ　ａｌｋａｎｏａｔｅ）共重合体 （以下Ｐ　ＨＡと略す）の好気的（ａｅｒｏｂｉｃ）生産方法に関するものであ る。

本発明で使用した微生物により生産されるポリエステルＰＨＡは多様な炭素原子 数をもつモノマー（β−ヒドロキノカルボン酸β−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｃａｒｂｏ ｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　）からなる共重合体であり、生分解性をもつから農業用 フィルムおよび各種のフィルム、各種の容器なとの成形物、手術用縫合糸、人工 皮膚組織、光学活性充填物なとに利用できる。

ヨーロッパ特許第０．０４６，３４４号には葡萄糖を利用したポリ−β−ヒドロ キノブチレート（ｐｏｌｙ−β−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕ４ｙｒａｔｅ　：　Ｐ　Ｈ Ｂ　）の生産にたいする技術が公開されている。

これはアルカリノネス　ユートロブス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐ ｕｓ）Ｉ（１６の突然変異菌株であるＡ、ユートロブス　ＮＣＩＢ　１１５９９ を利用して窒素源を枯渇させることにより細胞内にＰｌ（Ｂを蓄積、生産する技 術である。

ヨーロッパ特許第０．０６９．４９７号ではＡ、ユートロブスＮＣｌ３　１１５ ９９の炭素源を葡萄糖とプロピオン酸などのような有機酸を利用してＰ　ＨＢホ モポリマーの主成分である３ＨＢ　（３−ヒドロキノブチレート３−ｈｙｄｒｏ ｘｙ　ｂｕｔｙｒａｔｅ）と３ＨＶ（３−ヒドロキシバレレート　３−　ｈｙｄ ｒｏｘｙ　ｖａｌｅｒａｔｅ）の共重合体を生産した。この共重合体はＰＨＢホ モポリマーの分子チェーン内に３ＨＶ成分を挿入することによってＰＨＢの結晶 化度を低め各種の物性および加工性を変形したものである。

そして、特開昭６４−２６９９８９、特開昭６４−４８８２１、特開平１−１５ ６３２０ではＰＨＢの物性を改良するためＡ、ユートロブスを利用して５ＨＶ（ ５−ヒドロキシバレレート５−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｖａｌｅｒａｔｅ　）　、３　 ＨＶ　（３−ヒドロキシバレレート　５−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｖａｌｅｒａｔｅ　 ）と４ＨＢ（４−ヒドロキシブチレート　４−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｂｕｔｙｒａｔ ｅ）などを結合した数種の新しい共重合体を生産した。

これらの改良された共重合体はその生産のために葡萄糖と有機酸を同時に使用せ ねばならず、共重合体の成分の含量を増大させるためには細胞に有毒な有機酸の 濃度を高めねばならないので共重合体の生産性が著しく低下し、主原料である葡 萄糖の価格が高くて生産の経済性が落ちるという欠点があった。

また、ヨーロッパ特許第０．０５２，４６０号ではＰＨＢの物性を改良するため にＰ　ＨＢと非生分解性合成高分子をブレンドして改良Ｐ　［（Ｂブレンドを生 産したがこれは非生分解性の合成高分子を含むのでＰＨＢの最大長所である生分 解性を低下させる欠点があり、日本特許公開公報昭６３−２２６２９１では飽和 および不飽和炭水化物（パラフィン、オレフィン）を炭素源としてＰｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖｏｒａｎを利用したポリエステル共重合体を生産した。

この共重合体は炭素数６から１２までの３−ヒドロキノカルボン酸たちのポリエ ステル結合の高分子で、栄養成分の制限により細胞内に蓄積生産されたポリエス テルの含１が低く、ためにその生産性が極めて低い。

以上の諸技術から推してＰＨＨの物性が改良でき結晶化度の低い生分解性ポリエ ステルの開発必要性が台頭しており、同時にこの低い結晶化度の生分解性ポリエ ステルの生産性を高めることのできる製造工程の開発が要求される。

オヤイツ（Ｏｙａｉｚ）などのＪ、Ｇｅｎ、　Ａｐｐｉ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、 　ｖｏｌ、　２９、ｐｐ、１７−４０　（＋９８３）によれば、Ｐｓｅｕｄｏｍ ｏｎａｓ属の諸種の微生物は細胞内の脂肪酸および３−ヒドロキシ脂肪酸の造成 に特異性を有することが明かされた。またフルコ（Ｆｕｌｃ。

）のＰｒｏｇ、　ＬｉｐｉｄＲｅｓ、、　ｖｏｌ、２２．　ｐｐ、ｌ　３３−１ ６０　（１９８３）によると大部分のグラム陰性バクテリアに３−ヒドロキシ脂 肪酸が広く分布しているといい、ウィソルトｆｌＬＬｈｏＨ）などのＡｐｐｌ、 　Ｅｎｖｉｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　ｖｏｌ、　５４．　Ｎａｌ　 ２．　Ｉ）　ｐ、２９２４−２９３２　（＋９８８）で提案しているＰ、　ｏｌ ｅｏｖ。

ｒａｎ種でのＰＨＡ共重合体生合成経路によると３−ヒドロキシ脂肪酸はａｃｙ ｌ−ＣｏＡ　５ｙｎｔｈｅｔａｓｅとＰ　ＨＡ　５ｙｎｔｈｅｔａｓｅの作用に より重合され、以上の発表に基づけばこれは多様な大きさの炭素数０４〜ＣＩ６ の３−ヒドロキシカルボン酸が重合したＰＨＡ共重合体が微生物によって生産で きることを意味する。

その例として、ダウニス（Ｄａｗｅｓ）などのＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１ ｅｔｔｅｒｓ、　ｖａｔ、　１１．　ｋ７．　ｐｐ、　４７１−４７６　（１９ ８９）ではＰｓｅｕｄｏ＋ｎｏｎａｓ属のＰ、　ｐｕｔｉｄａ、　Ｐ、　ｏｌｅ ｏｖｏｒａｎ　、　Ｐ、　ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ、　Ｐ、　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｎｃｅなどの種はアルカン（ａｌｋａｎｅ）　、アルカノール（ａｌｋａｎｏｌ 　）　、アルカン酸（ａｌｋａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）を利用してＣ６〜ＣＩＯの ３−ヒドロキシ酸ＰＨＡ共重合体ポリエステルを生産している。しかしこれらの 菌はその炭素源として葡萄糖、果糖、砂糖のように同化速度の高い炭水化物を利 用してＰＨＡを生産しないからその生産性が極めて低いという問題がある。

本発明はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属ｃｅｐａｃｉａ種の微生物を好気的（ａｅｒ ｏｂｉｃ）細胞培養のあと窒素源などの栄養成分を制限して細胞内で広範囲の炭 素数０４〜Ｃ１４の３−ヒドロキノカルボン酸のＰＨＡ共重合体ポリエステルを 生産するためのものである。

従来の諸技術をみるとＰＨＨの物性、加工性を改良するために共重合体の生産に 力を注いだ結果、共重合体を生産するとき細胞に有毒な有機酸を利用することに よってＰＨＢのホモポリマー生産と比べてその生産性が著しく減少するが、日本 特許公開公報昭６３−２２６２９１の場合と同じく炭素源として飽和、不飽和炭 化水素を使用するから細胞の成長およびＰＨＡの生産性が低かった反面、本発明 では広範囲の炭素数を有する３−ヒドロキシカルボン酸の共重合体を砂糖、葡萄 糖、果糖、グリセリンなどのような同化性の極めて高い炭水化物を炭素源とし・ 　て使用するからその生産性が極めて高い製造方法を開発し、ここで開発したＰ ＨＡ共重合体は結晶化度が低いため既存のＰＨＢを代替するとか高分子ブレンデ ィング技術を利用してＰＨＢの物性を改良するのに有益に利用できるものである 。

（１）共重合体のモノマー構成 本発明では砂糖、葡萄糖、果糖、グリセリンなどの炭水化物と糖蜜などの複合炭 水化物を細胞の成長とＰＨＡ共重合体の生産の同一炭素源として利用する生産性 の高い方法でありここで生産された共重合体の構成は次のとおりである。

本発明で生産の共重合体は炭素数がＣ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃｔ０１２、Ｃ１４であ る３−ヒドロキシカルボン酸たちとその側鎖のω２位置に二重結合を含んだＣ６ 、Ｃ８、Ｃｌ０１ＣＩ２、ＣＩ４の３−ヒドロキシカルボン酸たちをモノマーと するポリエステル結合の高分子である。

（２）使用菌株 本発明で使用した菌株はｏｅｒｇｙのＭａｎｕａｌ　ｏｒ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａ ｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　（Ｎ、　Ｒ，Ｋｒｉｅｇ、Ｊ、　Ｇ、　Ｈ ｏ１ｅ著）第８版によるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属のｃｅｐａｃｉａ種に属する 。しかし、Ｐｓｅｕｄｏ＋ｎｏｎａｓ属各種の細胞内部の脂肪酸（ｌａｔｔｙ　 ａｃｉｄ）および３−ヒドロキシ脂肪酸の構成によって分類したオヤイツ（Ｏｙ ａｉｚ）などのＪ、Ｇｅｎ、　Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　ｖｏｌ、２ ９．　ｐｐ　１　？−４０でみると３−ヒドロキシテトラゾカッエート（３−ｈ ｙｄｒｏｘｙ　ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏａｔｅ）をつくる点にあってはｃｅｐａ ｃｉａ種と一致するが、３−ヒドロキシカルボン酸３−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｄｅｃ ａｎｏａｔｅ　）と３−ヒドロキシウンデカノエート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｕ ｎｄｅｃａｎｏａｔｅ　）を等しく生産するという点にあってはＣｅｐａｃｉａ 種と異なる。

本発明で使用した菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ　Ｋ　Ｙ　Ｇ　 −５０５は１９９０年＋１月２９日に韓国微生物センターと延世大学校工科大学 食品工学課（ソウル市西大門区１２０−７４９）に委託された。委託番号はＫＣ ＣＭＩ　ＯＯ０４である。

菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａは織物工場の排水からサンプルを 得て、これを０．８５％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣ１溶液により１０’〜１０’倍量に希 釈し得られるが、次の国学的性質を有する。

〈細胞分離源〉 廃水 く細胞の顕微鏡上の形態〉 １、細胞の様子：竿状 （直径０．７〜１．１μｍ、長さ１．　５〜４．　０μｍ）２、鞭毛：多軸性鞭 毛 ３、単細胞、双細胞で存在 ４、運動性　揚性 ５．胞子形成：陰性 ６、ダラム染色・陰性 ７、ＰＨＢ生成・陽性 く各種培地上での生育状態〉 １、酵母エキス寒天培地での表面培養 ３５℃、２４時間培養 隆起度：中間 表面　偏平または低い半球形 細胞群集の大きさ　１〜３龍 細胞群集の色　白 透明度　低い Ｐ　ＨＡを生成 ２、酵母エキス液体培養 ３５℃、２４時間培養 生育速度　極めて早い、単細胞のみ存在細胞培養液の色、培養初期には白、末期 には褐色に変色ＰＨＡを生成 ３、砂糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）含有の寒天培地で表面培養３５℃、２４時間培養 隆起度、低い 表面：偏平または低い半球形 細胞群集の大きさ　０．５〜ｌ、５− 細胞群集の色　白 透明度：低い Ｐ　ＨＡを生成 ４、砂糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）含有の液体合成培地で培養３５℃、２４時間培養 生育速度；早い、単細胞および双細胞で存在細胞培養液の色・培養初期には白、 末期には褐色に変色ＰＨＡを生成 〈生理学的性質ン ｌ、カタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）　：陽性２、酸化酵素（Ｏｘｉｄａｓｅ） 　陽性３、ウレアーゼ（Ｕｒｅａｓｅ）　：陽性４、硝酸塩還元、陰性 ５、砂糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）からのＬｅｖａｎ形成、陰性６、ゼラチン加水分解 ：陽性 ７、澱粉加水分解・陰性 ８、細胞外部ＰＨＢ加水分解・陰性 ９、脱窒素化、陰性 １０、色素の生成：培養初期には黄白色培養後期には褐色 比窒素源の利用　アンモニューム塩および尿素を利用、生育する ＋２．酸素にたいする性質　好気性 ＋３．生育ＰＨ：ＰＨ４〜９で生育 ＰＨ６，５〜７．０で最適生育 ＋４．生育温度　１０〜４０℃ ３０〜３５℃が最適 １５、Ｇ＋Ｃ成分含量：　６７．　０〜６７．　５　ｍｏ１％Ｉ６　炭素源の同 化性およびＰ　ＨＡ生成（３）ＰＨＡの分析 ＧＣ及びＧＣ−マススペクトルの分析のためにＰＨＡをＢｒａｕｎｅｇｇなとの Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　、　Ｖｏｌ 、　６．　ＰＰ２９−３７（１９８７）の方法により処理してサンプルを準備し た。定量分析のためにはＰＨＢを標準材料として使用したが、ＰＨＢ量とに対す るＧＣスペクトル上の［標準定量直線Ｊは第１図のとおりである。

第２図はＰＨＡのＧＣスペクトル分析結果であり、ピーク１．２．４．６．８． １０は炭素数４．６．１Ｏ２１２，１４の３−ヒドロキノカルボン酸たちで、次 の一般構造を有するモノマーである。

またビーク７．３．５．９、ｉｔは炭素数６．８、ｌ０１１２．１４の３−ヒド ロキノカルボン酸たちで、側鎖のω２位置に二重結合を有する次の一般構造を持 つモノマーである。

各ピークの構造及び成分名は下記表１のとおりである。

各ピークのＧＣ上の保持時間のｌｏｇ値と炭素数の相関関係第３図のとおりであ り、炭素数による保持時間の周期性のあごとを知ることができる。ＧＣスペクト ル上の他のピーク４１　Ｐ　Ｈへの末端のＯＨ基を封鎖する有機酸またはその誘 導体推定され（３）ＰＨＡ共重合体の構造分析 第４図は化学イオン（ｃｈｅｍｉｃａｌ　１ｏｎｉｚａｔｉｏｎ）によるマスス ペクトルで３ＵＡと３ＵＥの資料である。

第４図の（ａ）をみると分子量が２３０であり、（ｂ）をみると分子量が２２８ であることを知ることができる。また第５）、（ｂ）ともに分子量の差が２にな るピーク（ｍ／ｅ＝１３８、＋３６、ｍ／ｅ＝１８０．１７８、ｍ／ｅ＝２１２ ．２１Ｏ）があることをみることができ、これは二重結合による分子量２の減少 を意味する。

第５図（ｂ）のｍ／ｅ＝１２６のピークは３ＵＥの二重結合を有する側鎖であり ＰＨＡのすべての構成成分のマススペクトルでは共通的にＩ　Ｏ３（ＨＯＣＨＣ Ｈ２ＣＯＯＣＨ，）　、／、４３　（ＯＨＣＨＣＨ２）ピークをもっている。

ＮＭＲスペクトルは第６図でＰＨＢのスペクトルと比較した。ＰＨＢと比較する とき側鎖の水素原子ピークが６＝０．９１、ｌ、２７．１．５９ｐｐｍの三つに 分離して現れており特に側鎖の二重結合のビニル基の水素原子ピークが６＝２． ０５と現れている。

ＩＲスペクトルは第７図で（ａ）はＰ　ＨＢ、（ｂ）はＰＨＡのものである。二 つの場合とも１７２５ｃｍ’にエステルカルボニルバンド チレンのバンドが（ｂ）の場合３０８０ｃｍ’で側鎖の炭素二重結合のバンドが 現れている。

（４）細胞成長および生産条件 すべての実験はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ　Ｋ　Ｙ　Ｇ　−　５ 　０　５　（Ｋ　ＣＣＭＩ０００４）を使用した。細胞の成長には炭素源、窒素 源およびＰ．Ｍｇ，に、Ｎａなどの塩類が必要であり微量元素のＦｅ−　Ｍｎ． Ｃｏ、Ｃａ，Ｃｕ，Ｚｎなど力（必要である。

このような栄養のほかに好気成長のための酸素の供給を要し生育のための最適の 酸性度はｐ）（＝６．５〜７、０てあり、最適の成長温度は３０〜３５℃である 。使用可能な炭素源としては砂糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）　、果糖（ｆｒｕｃｔｏｓ ｅ）、葡萄糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）　、マルトース（ｆｆｌａ■ＯＳＣ）ナトノ炭 水化物とエタノール（ｅｔｈａｎｏｌ　）、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ） 　、ｎ−プロパツール（　ｎ　−　ｐｒｏｐａｎｏｌ）、ｎ−ブタノール（ｎ　 −ｂｕｔａｎｏｌ　）　、プロピレンゲ盲ノコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　ｇｌ ｙｃｏｌ）のような７　／ｌ／　コ−　／ｌ／類、７セーｒ−ト（ａｃｅｔａｔ ｅ　）　、プロピオネート（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）　、ブチラード（ｂｕｔｙ ｒａｔｅ）　、バレレート（ｖａｌｅｒａｔｅ）　、ラクテート（　Ｉａｃｔａ ｔｅ）、ントレート（ｃｉｔｒａｔｅ　）などのような有機酸とグルタメイト（ ｇｌｕｔａｍａｔｅ　）　、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ　）　、アスノ（ ラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）などのようなアミノ酸が可能である。複合炭素 源としては魚油（ｆｉｓｈ　ｏｉｌ）、糖蜜（ｍｏｌａｓｓｅｓ）　、酵母エキ ス（ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ）などが利用可能である。

窒素源としてはアンモニュームイオン塩である硫酸アンモニューム、塩化アンモ ニューム、水酸化アンモニューム産アンモニア水などと尿素を使用することがで きる。

ＰＨＡ共重合体の細胞内蓄積、生産は培地内の栄養源１種またはそれ以上の枯渇 によってはじまり一般的に窒素源の枯渇によって最も高い蓄積をみせる。また蓄 積されたＰＨＡはエネルギーおよび炭素源の貯蔵物質であるから培地内の炭素源 の枯渇によって代謝過程で再使用されその蓄積率が減少するので培地内の炭素源 の十分な状態で窒素源を制限してその生産・蓄積を誘導せねばならない。

細胞の継代培養および保存のためには下の構成をもったＹＭ培地を３５℃で培養 した。

ＹＭ培地：酵母エキス　３　ｇ／Ｌ 麦芽エキス　３ｇ／Ｌ ｔｒｙｐｔｏｎ　５　ｇ　／　Ｌ ｓｕｃｒｏｓｅ　５　ｇ　／　Ｌ 細胞の培養はＩＬフラスコで下の構成をもった２００ｔｄの成長培地を培養温度 ３５℃、１５０〜２　０　０　ｒｐｍの振盪培養器で１２〜２４時間おこなった 。

Ｋ１４１　Ｐ　Ｏ，Ｉ　ｇ／　Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ．ｌ　２Ｈ２０　３．Ｏｇ／ＬＭｇＳ０．　０．４ｇ／Ｌ （ＮＨＩ）２　ＳＯ，　０．５　ｇ／Ｌ微量元素溶液　４−／Ｌ 炭素源は０．　５％（Ｗ／　Ｖ　）を使用し微量元素溶液の構成は次のとおりで ある。

Ｆ　ｅ　Ｓｏ．７　Ｈｉｏ　３．　Ｏ　ｇ／　ＬＣａＣｌｚ　２Ｈｇ　Ｏ　２， ５ｇ／ＬＺｎＳ０．７Ｈｔ　０　２　０　０■／ＬＨ３ＢＯ，　ａｏｏ■／Ｌ ＭｎＣＬ　４８．０　６０ｍｇ／Ｌ ＣｏＣ］。６　＋４２０　４０　ｍｇ／　ＬＣｕ　Ｓ　０．５　Ｈ２０２０ＩＩ ｇ／　ＬＮｉＣｌ、６Ｈ２０４０＊／Ｌ 細胞のＰ　Ｉ−（Ａ蓄積・生産実験では他の培養条件はすべて成長培地と同一に し硫酸アンモニュームの濃度だけを０．２５ｇ／Ｌに低めて培養することによっ て初期１２時間は菌体成長をおこしたあと制限されるようにすることによってＰ 　ＨＡの蓄積を誘導した。細胞内で蓄積速度を高めるためには硫酸アンモニュー ムの濃度がＯ，Ｉｇ／Ｌ以下に制限されねばならず、炭素源は十分に維持せねば ならない。また蓄積速度を高めるためにはｐＨ＝６．５〜７．０に維持せねばな らず燐酸カリューム塩と燐酸ナトリューム水化物をそれぞれ１．０〜２．０ｇ／ Ｌ、３、ｏ＝６．０ｇ／Ｌ、Ｍｇ５Ｏ，の濃度を０．２〜０．４ｇ／し、微量元 素の濃度を０．５〜４Ｊ／Ｌにする。

（５）ＰＩ−ＩＡの分離精製 細胞内に蓄積のＰ　ＨＡを分離精製するには公知の方法が幾種もあって、アメリ カ特許第３，０３６，９５９号、３，０４４．９４２号、３，２７５，６１０号 などからみれば培養液から菌体を分離収去のあと、アセトンで洗浄して細胞膜の 脂質を一部除去してクロロフォルム、メチレンクロライド、ピリジンなどの溶剤 でＰ　ＨＡを抽出してから各種の後処理をおこなう。

本研究でも菌体内に蓄積されたＰＨＡの分離精製には類似の方法を使用した。培 養液５００ｇを１０分間遠心分離して菌体を分離収去し、アセトンで洗浄、乾燥 のあとクロロフォルムで菌体をよく解いて懸濁させてから８０〜１００℃で４〜 ８時間静置のあとＰ　ｌ（Ａを抽出した。

抽出したクロロフォルム溶液を濾過して残存菌体を除去したあとクロロフォルム 溶液に対し５〜１０倍のボリュウームの沈澱剤を添加して非結晶質のＰ　ＨＡ共 重合体を得た。沈澱剤としては水、メタノール、エタノール、アセトン、エーテ ル、ヘキサンを使用したがメタノールとエタノールだけに非結晶質沈澱がみられ た。このあとはすべての分離精製過程で沈澱剤としてメチルアルコールを使用し た。

（６）ＰＨＢとＰ　ＨＡの溶液ブレンディングヨーロソバ特許第０．０５２．４ ６０号ではＰ　ＨＢに合成高分子をブレンディングすることによってＰ　）（Ｂ の物性を改良した。しかし添加剤として使用した合成高分子はＰ　ＨＢとは異な り生分解ができない成分なので生産された高分子ブレンドはＰｌ−（Ｂのもっと も大きな長所である生分解性に問題をおこす。

本研究で開発したＰ　ＨＡ結晶化度がすこぶる高いＰＨＢとは反対に結晶化度が すこぶる低い非結晶質の高分子であって生分解の可能な高分子であるがらＰ　Ｉ Ｉ　Ｂとブレンディングしてその相対含量を任意に調節して多様な物性の生分解 性高分子を得ることができる。

本発明では菌体からＩ）　ＨＡを抽出したクロロフォルム溶液に適量のＰ　ＨＢ を添加して溶かしたあと２０〜ＩＯθ℃で１０〜６０分間攪拌してからクロロフ ォルムを蒸発させるが５〜１０倍！（クロロフォルム溶液にたいして）の沈澱剤 を添加してＰＨＡブレンド高分子の沈澱を生成させ濾過して１００℃で真空状態 で乾燥させ１月４Ａブレンドを得た。

（７）ＰＨＡの物性および生分解性 生産されたＰＨＡは非結晶質の高分子であり融点（Ｔｍ）は存在しない。分子量 の分布は第８図のとおりである。

ブランドル（Ｂｒａｎｄｌｅ）なとのＡｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、、　ｖｏｆ、５４．ＮＱ８．、ｐｐ１９７７−１９８２　（＋９８ ９）てみると長い側鎖を有するＰＩＣＡの生分解速度はＰ　Ｉ−Ｉ　Ｂと比べて より遅いだろうと主張している。

本研究で開発したＰＨＡは側鎖の長さの長いＰ　ＨＡてあり生分解速度がＰ　Ｈ Ｂより遅いことと予測されるがＰＨＢとブレンディングすることによってその生 分解速度が調節可能である。

（８）産業上の打用性 本発明によって獲得したＰ　ＨＡ共重合体はポリエステル重合体であり既存のＰ ＨＢと類似の高分子である。

熱可塑性の生分解性高分子であるＰＨＢは農業用および各種フィルム、容器など の成形物、手術用の縫合糸、人工皮膚組織、骨移植組織、光学活性充填物、医薬 伝達体系などの分野に応用性があるがその物性が加工に適しないという欠点があ る。

本発明で獲得したＰ　ＨＡはＰＨＢとブレンディングすることによって既存のＰ 　ＨＢの物性を改良してその応用性をはるかに拡大する長所を有し、同時に生分 解性をそのまま保有する高分子ブレンドをこしらえるのに使用できる。

すなわち、本発明のＰ　ＨＡはＰ　ＨＢの産業的用途がすべて代替できる高分子 であり、また一部モノマーの側鎖のω２位置に二重結合を保有しているから各種 有機化学的変形を通しての機能性が付与できるので多様な機能をもった生分解性 高分子を得ることができる。

本発明は下記の実施例を通して一層詳細に説明するが、これらに局限されるもの ではない。

実施例１ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ　ＫＹＧ　−５０５（ＫＣＣＭ　Ｉ　 ＯＯ０４）を利用して炭素源５　ｇ／Ｌ、窒素源０．２５ｇ／Ｌをもった次の合 成培地２００−をＩＬ振盪フラスコで２４時間培養した。

ＫＨ２ＰＯ，ｌ　ｇ／Ｌ Ｎａ２　ＨＰＯ，Ｉ　２１−１２０　３　ｇ／Ｌ（ＮＨ，）　２　Ｓｏ、　０． ２５　ｇ／ＬＭｇＳ０．　０．　４ｇ／Ｌ 微量元素溶液　４−／Ｌ ここて微量元素溶液の構成は次のとおりである。

Ｆ　ｅ　Ｓ　０．７　Ｈ２０３ｇ　／　ＬＣａＣ１２２Ｈ＋　０　２．５ｇ／Ｌ ＺｎＳ０．７Ｈ，０２００ｘ／Ｌ Ｈ３ＢＯ１６００■／Ｌ ＭｎＣＩ２４Ｈ２０６０ｗ／Ｌ ＣｏＣＩ□６Ｈ□０　４００ｍｇ／Ｌ ＣｕＳ０，５Ｈ＋　０　２０ｍｇ／Ｌ ＮｉＣ１゜６　Ｈ＋　０　４０ｍｇ／　Ｌ実験した炭素源は砂糖（ｓｕｃｒｏｓ ｅ）　、果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、葡萄糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）　、マルトース （ｍａｌｔａｓｅ）　、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、糖蜜（ｍｏｌａｓ ｓｅｓ）　、魚油（ｆｉｓｈ　ｏｉｌ）　、これらで培養した１００Ｔｎｌの培 養液を遠心分離してアセトンで洗浄のあと２０■の乾燥細胞からＰ　Ｉ（Ａを抽 出・分析した。

それぞれの炭素原料にした細胞濃度およびＰ　ＨＡ含有量は次の表２に示すとお りである。

表２．炭素源別にした細胞濃度およびＰＨＡ蓄積率実施例　２．ＰＨの細胞成長 およびＰＨＡ蓄積に及ぼす影響Ｐｓｅｕｄｏｆｆｉｏｎａｓ　ｄｅｐａｃｉａ　 ＫＹＧ−５０５（ＫＣＣＭ　１０００４）を実施例１の合成培地にて５　ｇ／Ｌ の砂糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）　、０．２５ｇ／Ｌの（ＮＨ，）２　ＳＯ，を添加し てそれぞれｐＨ４，５，６，７，８で２４時間培養した。各ｐＨでの培養液を１ ００−遠心分離し、アセトンで洗浄のあと２ｏ■の乾燥細胞がらＰＨＡを抽出、 分析した。

各ｐＨによる細胞の濃度およびＰＨＡは表３に示し、表４ではＰＨＡの各モノマ ーの含量を示した。

表５ではｐＨの変化による二重結合含有成分の相対的含量を示した。

表３．ｐＨ変化による細胞濃度および蓄積重要４．ｐＨの変化によるＰＨＡの各 モノマーの含量表５．ｐＨによる二重結合の相対的含量（ｗｔ％）実施例３．Ｐ Ｏ，”−の細胞成長およびＰＨＡ蓄積に及ぼす影響Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃ ｅｐａｃｉａ　ＫＹＧ　−５０５（ＫＣＣＭ　Ｉ　ＯＯＯ４）を、実施例１（７ ）合成培地でＫＨｚ　ＰＯｔ　１．０ｇ／Ｌ、Ｎａ２　ＨＰＯｌ−１２Ｈ２０３ ，Ｏｇ／Ｌの００ＯＳ０．２，０．５．１．Ｏ１２，０，３，０，５，０倍濃度 にしてそれぞれＩＬ振盪フラスコに入れて２４時間培養した。

各濃度の培養で１００−を遠心分離しアセトンで洗浄のあと２０■の乾燥細胞か らＰＨＡを抽出、分析した。

それぞれの燐酸塩の濃度による最終細胞濃度およびＰＨＡ蓄積率は表６に示し、 ＰＨＡ各成分の含量は表７に示した。

表６　燐酸塩の１度による最終細胞濃度およびＰＨＡ蓄積蓄積率表情酸塩の１度 にょるＰＨＡ各単量体の含量（ｗｔ％）実施例４−　Ｍｇ　Ｓ　ｏ　＋の細胞成 長およびＰＨＡの蓄積に及ぼす影響 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ　ＫＹＧ　−５０５（ＫＣＣＭ　１０ ００４）を実施例Ｉの合成培地からＭｇ５Ｏ＋だけを除いて５．　０ｇ／Ｌの砂 糖、０．２５ｇ／ＬＯ）（ＮＨ，）２３ｏｔを添加してＭｇ５ＯＩの濃度を各お （７）Ｏ，０，０，２，０，４，１，０，３，０ｇ／Ｌの濃度にしてＩＬ振盪フ ラスコで２４時間培養した。各濃度の培養液から１００４を遠心分離してアセト ンで洗浄のあと２ｏ■の乾燥細胞がらＰＨＡを抽出、分析した。

Ｍｇ５Ｏ＋の各濃度による最終細胞濃度およびＰＨＡ蓄積率は表８に示し、ＰＨ Ａ各成分の含量は表９に示した。

表ｓ　、　Ｍ　ｇ　Ｓ　ｏ　＊の濃度による最適の細胞濃度およびＰＨＡ蓄積率 表９．Ｍｇ５Ｏ，濃度にょるＰＨＡ各モノマーの含量実施ｆＩＩＩ５．微量元素 が細胞の成長とＰＨＡの蓄積に及ぼす影響Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃ ｉａ　ＫＹＧ　−５０５（ＫＣＣＭ　１０００４）を、実施例１の合成培地から 微量元素だけを除外して５゜０ｇ／Ｌの砂糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）　、０．　２５ 　ｇ／Ｌの（ＮＨ４）ｓ　ＳＯ，を添加し、微量元素溶液をそれぞれ０．０．０ ．５、■。

５．４，０．８．０，１５．０Ｊ／Ｌの濃度にして、ＩＬ振盪フラスコで２４時 間培養した。各濃度の培養液から１００−を遠心分離してアセトンで洗浄の上２ ０■の乾燥細胞からＰＨＡを抽出、分析した。

それぞれの微量元素溶液濃度による最終細胞濃度、Ｐ　ＨＡ蓄積率を表ＩＯに示 し、ＰＨＡ各成分の含量は表１．１に示した。

表ＩＯ微量元素溶液別の最終細胞濃度およびＰＨＡ蓄積率表重要、微量元素溶液 濃度別の各モノマー含量（ｗｔ％）実施例６．ＰＨＢとＰＨＡ溶液のブレンディ ングＰｓｅｕｄｏｉｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ　ＫＹＧ　−５０５（ＫＣＣＭ　 １０００４）を利用、実施例１の合成培地から砂糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）と（ＮＨ 、＞　、ＳＯ，を利用して細胞培養した７５％ＰＨＡ蓄積率の乾燥細胞２２ｇを ５００−のクロロフォルムで抽出した。抽出したクロロ７ｔルム溶液０．０．５ ．１０，２０．５ｏ、８０ｉを２ｇのＰＨＢを溶かしたｌｏｍＬのクロロフォル ム溶液とそれぞれ混ぜて２５℃で１時間攪拌のあとクロロフォルム溶液にだいし ５倍量のメチルアルコールを加えて沈殿させてから濾過して１００℃、真空状態 で乾燥させてＰ　ＨＡ高分子ブレンドを得た。添加したＰＨＡ抽出溶液の量によ る沈殿量は第９図に示すとおりで、第１０図は溶液ブレンディングのとき沈殿前 の溶液状態でのＰ　ＨＡの相対含量と沈殿のあと生成の高分子ブレンド内での相 対含量を分析して表示したものであり、沈殿前後Ｐ　Ｉ−（Ａの相対含量には変 化がなくこれはＰＨＡとＰＨＢが同時に沈殿することを意味する。

図面の簡単な説明 第１図はＰ　ＨＡ共重合体の定量のためのＰＨＢ標準定量直線である。ＰＨＡの 定量のためにＰ　ＨＢを標準試料として、ＧＣスペクトルを分析、面積を比較、 計算することによってＰＨＡの量を計算する。

第２図はＰ　ＨＡ共重合体のＧＣスペクトルである。ＰＨＡをメチルエステル化 してＧＣを分析した結果、各ピークはＰＨＡを構成するモノマーたちのメチルエ ステル分子であることが判明した。

第３図はＧＣスペクトル上でＰ　ＨＡ共重合高分子の各モノマーの保持時間（Ｒ Ｔ　：　Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ）のｌｏｇ値と炭素数との関係を表す。

炭素数に比例してＲＴのｌｏｇ値が増加することを表す。

第４　（ａ）図は３−ヒドロキシウンデカノエートメチルエステル（３−ｈｙｄ ｒｏｘｙ　ｕｎｄｅｃａｎｏａｔｅ　ｍｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ　：　３　ＵＡ ）のＣＩ　（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）質量スペクトルである 。分子量＝２３１−１．＝２３０であることが分かり２１３番ピークは３ＵＡメ チルエステル分子からＨ２Ｏが脱落して生じたピークである第４　（ｂ）図は３ −ヒドロキシ−１Ｏ−ウンデセノエートメチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙ　 −１０−ｕｎｄｅｃｅｎｏａｔｅ　ｍｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ　：　３ＵＡ）の ＣＩ質量スペクトルである。（＊分子量＝２２９−１＝２２８であることが分か り、２１１ビークは３ＵＡのメチルエステル分子からＨ＋Ｏが脱落して生じたピ ークである。

第５（ａ）図は３−ヒドロキシウンデカノエートメチルエステル（３−ｈｙｄｒ ｏｘｙ　ｕｎｄｅｃｅｎｏａｔｅ　ｏ＋ｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ　：　３　ＵＡ ）のＥ　Ｔ　（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）質量スペクトル である。

第５　（ｂ）図は３−ヒドロキシ−１０−ウンデセノエートメチルエステル（３ −ｈｙｄｒｏｘｙ　−１０−ｕｎｄｅｃｅｎｏａｔｅ　ｍｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅ ｒ　：３ＵＥ）のＥＩ７ｉ量スペクトルである。

第６図はＰＨＡ共重合高分子の’ｌ−ｌ−１−Ｎスペクトルである。

第７　（ａ）図はＰ　ＨＢのＩＲスペクトルである。

第７　（ｂ）図はＰＨＡ共重合体のＩＲスペクトルである。

第８図はＰ　ＨＡ共重合体の分子量分布曲線である。

第９図はＰＨＡ共重合体とＰＨＨの溶液ブレンディング中ＰＨＡ共重合体の量（ クロロホルム抽出液により生成した沈澱の量）である。

第１Ｏ図はＰＨＡ共重合体とＰ　ＨＢの溶液ブレンディング後共沈を起こす前の ＰＨＡの相対含量と共沈後に生成の沈澱でのＰＨＡの相対含量の比較を示す。

ＦＩＧ、Ｉ ＰＨＢ　（ｍｇ）／２ｍＬクロロフォルムＦＩＧ、２ ＦＩｏ、３ ＦＩＧ、Ｌ、（ｂ） 質量／１１荷 ＦＩｏ、５（ａ） 質量／電荷 ＦＩＧ、５（ｂ） 質量／電荷 ＦＩＧ、７にａＪ Ｆｌｏ、８ 分子量 ＦＩＧ、９ クロロフォルム抽出液量（ｍＬ） クロロフォルム抽出液量［ｍＬ） 国際調査報告 一一一−＾−ｍｋ、ＰＣ？／にＲ９１１０００１９フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｎ　１／２０ Ｃ１２Ｒ１：３８） Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記構造式（１）のモノマーと構造式（２）のモノマーで構成される平均分 子量１０．０００以上のポり−β−ヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙ−β− ｈｙｒｏｘｙａｌｋａｏａｔｅ；ＰＨＡ）の共重合体。 （１）▲数式、化学式、表等があります▼（２）▲数式、化学式、表等がありま す▼（ｎ＝２、４、６、８ａｎｄ　ｍ＝０、２、４、６、８）２．下記のような モノマー及び重量含量範囲の構造を有することを特徴とする請求項１記載のＰＨ Ａ共重合体。 ３−ヒドロキシブチレート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｂｕｔｙｒａｔｅ）；０．０ −０．５Ｗｔ％ ３−ヒドロキシヘキサノエート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｈｅｘａｎａｔｅ）１． ０−５．０ｗｔ％ ３−ヒドロキシ−４−ヒキサノエート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｈｅｘｅｎｏ ａｔｅ）；０．０−１．０ｗｔ％３−ヒドロキシオクタノエート（３−ｈｙｄｒ ｏｘｙ　ｏｃｔａｎｏａｔｅ）５．０−１５．０ｗｔ％ ３−ヒドロキシ−６−オクタノエート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｏｃｔｅｎｏ ａｔｅ）；０．０−５．０ｗｔ％３−ヒドロキシデカノエート（３−ｈｙｄｒｏ ｘｙ　ｄｅｃａｏａｔｅ）；４０．０−６０．０ｗｔ％ ３−ヒドロキシ−８−デカノェート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｄｅｃｅｎｏａ ｔｅ）；０．０−１０．０ｗｔ％３−ヒドロキシウンデカノエート（３−ｈｙｄ ｒｏｘｙ　ｕｎｄｅｃａｎｏａｔｅ）；１０．０−２０．０ｗｔ％ ３−ヒドロキシ−１０−ウンデセノエート（３−ｙｄｒｏｘｙ−１０−ｕｎｄｅ ｃｅａｏａｔｅ）；０．０−２０．０ｗｔ％３−ヒドロキシテトラデカノエート （３−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏａｔｅ）；０．０−５．０ｗｔ ％３−ヒドロキシ−１２−デセノエート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｔｅｔｒ ａｄｅｃｅｎｏａｔｅ）；０．０−５．０ｗｔ％３．請求項１記載のＰＨＡ共重 合体を生産するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａ（ＫＣＣＭ　１０００４ ）およびその変種。 ４．炭素源、窒素源、その他を栄養源として含む培養液からＰｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ　ｃｅｐａｃｉａ（ＫＣＣＭ　１０００４）およびその変種を培養した後、 窒素源およびその他の栄養源を制限して菌体からＰＨＡ共重合体を生産する方法 。 ５．炭素源が葡萄糖、果糖、マルトース、糖蜜、魚油であることを特徴とする請 求項４記載の方法。 ６．炭素源としてアセテート（ａｃｅｔａｔｅ）、プロピオネート（ｐｒｏｐｉ ｏｎａｔｅ）、ブチレート（ｂｕｔｙｒａｔｅ）、バレレート（ｖａｌｅｒａｔ ｅ）、ラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）、シトレート（ｃｉｔｒａｔｅ）などの有 機酸を使用することを特徴とする請求項４記載の方法。 ７．炭素源としてエタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）、グリセロール（ｇｌｙｓｅｒ ｏｌ）、ｎ−プロパノール（ｎ−ｐｒｏｐａｎｏＩ）、ｎ−ブタノール（ｎ−ｂ ｕｔａｎｏｌ）、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ） などのアコールを使用することを特徴とする請求項４記載の方法。 ８．窒素源としてアンモニュームイオン塩または尿素を使用して菌体を増殖させ たあと培養液中のアンモニュームイオンの濃度を０．０３ｇ／Ｌ以下に制限して ＰＨＡ共重合体を生産することを特徴とする請求項４記載の方法。 ９．硫酸マグネシュームの濃度が０．２−０．４ｇ／しであることを特徴とする 請求項４記載の方法。 １０．微量元素溶液の濃度が０．５−４ｍｅ／しであることを特徴とする請求項 ４記載の方法。 １１．請求項１記載のＰＨＡ共重合体０．５−９９．５ｗｔ％とＰＨＢ　９９． ５−０．５ＷＴ％とで構成される分子量１万以上の高分子ブレンド。 １２．請求項２記載のＰＨＡ共重合体０．５−９９．５ｗｔ％とＰＨＢ９９．５ −０．５ｗｔ％とで構成される分子量１万以上の高分子ブレンド。