KR100392711B1

KR100392711B1 - 생체고분자의분해에의한알킬(d)-3-히드록시부티레이트의제조방법

Info

Publication number: KR100392711B1
Application number: KR1019980004455A
Authority: KR
Inventors: 임인택; 한규범; 이영; 이상엽
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 1998-02-14
Filing date: 1998-02-14
Publication date: 2003-10-22
Also published as: KR19990069913A

Abstract

본 발명은 생체 고분자 물질을 분해시켜 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트(alkyl (D)-3-hydroxybutyrate)를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 미생물에서 생합성된 생체 고분자 물질인 폴리 3-히드록시부티레이트(poly 3-hydroxybutyrate; PHB)를 가알콜 분해반응시키는 과정을 포함하는 본 발명의 제조방법은 광학적으로 순수한 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트를 경제적으로 생산할 수 있는 우수한 제조방법이다.

Description

생체 고분자의 분해에 의한 알킬 (Ｄ)-3-히드록시부티레이트의 제조방법

본 발명은 생체 고분자 물질을 분해시켜 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트[alkyl (D)-3-hydroxybutyrate]를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 생체 고분자 물질인 폴리 3-히드록시부티레이트(poly 3-hydroxybutyrate, 이하, "PHB"라 약칭한다)를 미생물로부터 얻은 후 이를 분해하는 과정을 포함하는 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트의 제조방법에 관한 것이다.

알킬 (D)-3-히드록시부티레이트는 키랄성 전구체(chiral building block)로서 정밀화학 분야에서 매우 유용하게 사용되는 물질이다.

이제까지 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트는 대개 1) 미생물을 이용하여 1,3-부탄디올(1,3-butanediol)을 산화시켜 3-히드록시부티릭산(3-hydroxybutyric acid)을 얻는 방법 (Hadara, T., and Hirabayashi, T., Agric. Biol. Chem., 1968,vol. 32,1175); 2) 부티릭산을 미생물로 히드록시화하여 3-히드록시부티릭산을 얻는 방법 (Hasegawa, J., Ogura, M., Kanama, H., Noda, N., Kawaharada, H. and Watanabe, K.,J. Ferment. Technol., 1982,vol. 60, 501); 및 3) 알킬 3-케토부티레이트(alkyl 3-ketobutyrate)를 미생물 또는 효소로 환원시켜 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트를 제조하는 방법 (Deol, B. S., Ridley, D. D., and Simpson, G. W.,Aust. J. Chem.,1976,vol. 29, 2459; Mochizuki, N., Sugai, T. and Ohta, H.,Biosci. Biotech. Biochem.,1994, vol. 58, 1966; Kaeai, Y., Tsujimoto, M., Kendo, S., Takanabe, K., Nakamura, K. and Ohno, A.,Bull. Chem. Soc. Jpn.,1994,vol. 67, 524) 등에 의해 제조되었다. 그러나, 상기한 방법들은 생산성이 낮아 상업적으로 유용하지 못하다는 단점이 있다.

또한, 알킬 3-케토부티레이트를 키랄 촉매(chiral catalyst)로 수소화 반응시켜 화학적으로 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트를 제조하는 방법도 연구되었다. 즉, 키랄성 루테늄(Ru) 촉매를 사용하여 케토기를 비대칭 환원시켜 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트를 제조하였으며 (Noyori, R., Ohkuma, T., Kitamura, M., Takaya, H., Sayo, N., Kumobayashi, H. and Akutagawa, S.,J. Am. Chem. Soc.,1987,vol. 109, 5856), 키랄성 백금(Pt) 촉매를 제올라이트에 담지시켜 비대칭 수소화 반응에 이용함으로써 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트를 제조하였다 (Van Brussel, W.; Renard, M.; Tas, D.; Rane, V. H.; Parton, R.; and Jacobs, P. A., WO 9714500 A1). 그러나, 상기한 화학적 촉매에 의한 환원방법은 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트를 공업적으로 대량생산할 수 있다는 유리한 점이 있으나, 고가의 촉매가 사용되어 비경제적이며, 제조된 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트의 광학순도(optical purity)가 비교적 낮다는 단점이 있다.

한편, 발효를 통하여 폴리 3-히드록시부티레이트를 얻고, 이를 산 분해시켜원하는 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트를 제조하는 방법들이 시도되었다. 즉, 용매추출법을 이용하여 PHB를 정제한 뒤 황산을 촉매로 하여 가알콜 분해반응(alcoholysis)시켜 메틸 (D)-3-히드록시부티레이트[methyl (D)-3 -hydroxybutyrate]를 제조하였다 (Seebach, D., Beck, A. K., Breitschuh, R. and Job, K.,Org. Synth.,1992,vol. 71, 39). 이 방법에서는 용매추출법에 의해 PHB를 정제하기 때문에 고순도의 메틸 (D)-3-히드록시부티레이트를 얻을 수 있지만, 정제 비용이 많이 소요된다는 단점이 있다.

또한, 발효과정을 통하여 PHB가 함유된 균주를 얻고, 이를 건조시킨 뒤 정제과정 없이 고온 및 고압의 조건에서 황산 촉매를 사용하고, 메탄올을 가하여 직접 균주를 분해시켜 메틸 (D)-3-히드록시부티레이트를 제조하였다 (Hasegawa, M. and Honda, H., JP 02086786 A2). 이 방법은 PHB를 정제하는 과정이 생략되기 때문에 정제에 소요되는 비용이 절감될 수 있어 경제적이지만, 산 분해를 통하여 생성되는 메틸 (D)-3-히드록시부티레이트의 순도가 저하된다는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 상기한 문제점들을 해결하여 PHB를 이용한 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트의 제조방법을 연구하여 오던 중, 미생물 내에 축적된 PHB를 세포용해법에 의해 분리·정제한 뒤 분해시켜 광학적으로 순수한 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트를 경제적이면서 높은 수득률로 제조할 수 있는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 PHB를 이용하여 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트를 경제적이면서 높은 수득률로 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 PHB를 생합성하는 미생물에서 PHB를 분리·정제한 뒤 산성 가알콜 분해반응시켜 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트를 얻는 과정을 포함하는 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 제조방법은 PHB를 생합성하는 미생물의 세포내에 축적된 PHB를 분리·정제한 뒤 PHB를 산성 조건에서 가알콜 분해반응시켜 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트을 얻는 과정으로 구성된다.

먼저, PHB를 생합성하는 미생물의 세포내에 축적된 PHB를 분리·정제한다.

일반적으로 PHB는 상당수의 원핵생물(prokaryotic organism)에서 에너지 및 탄소 저장원으로서 생산된다(Brandle, H.; Gross, R. A.; Lenz, R. W; and Fuller, R.C.,Adv. Biochem. Eng. Biotechnol.,1990,vol. 41, 78). 본 발명에서는 알카리제니스 유트로푸스 균주(Alcaligenes eutrophus, 수탁번호: NCIMB 11599)와 재조합 대장균[Escherichia coli, 대한민국 특허출원 제 95-17591호; "필라멘테이션 억제에 의한 재조합 대장균으로부터 고농도 PHB(poly 3-hydroxybutyrate)를 제조하는 방법"]을 사용하여 본 발명의 원료로 사용된 PHB를 생산한다. 발효를 통하여 배양된 상기 미생물은 그 세포내에 건조질량비로 약 30∼80% 정도의 PHB가 축적되는데, 세포를 파괴하고 PHB를 회수하는 과정을 통하여 분리·정제된다. 세포내의 PHB를분리·정제하는 방법은 크게 세포내의 PHB를 녹여서 추출하는 용매추출법과 효소(enzyme), 수산화 알칼리염(hydroxy alkali salts), 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 또는 계면활성제(surfactants) 등으로 세포물질들을 분해·제거한 뒤 남은 폴리 3-히드록시부티레이트을 회수하는 세포용해법(한세광, 장용근, 이상엽,생물공학 NEWS,1994,vol. 1, 45)으로 대별되는데, 용매추출법은 유기용매를 사용하기 때문에 폴리 3-히드록시부티레이트를 고순도로 얻을 수 있지만, 정제비용이 많이 소요된다는 단점이 있으며, 세포용해법은 용매추출법에 비해 저순도의 PHB가 얻어지지만 정제가 간편하고, 비용이 적게드는 장점이 있다.

즉, 용매추출법으로 정제한 98% 이상의 순도인 폴리 3-히드록시부티레이트를 촉매(진한 염산)하에서 n-프로판올, 에탄올 및 메탄올과 반응시켜 n-프로필 (D)-3-히드록시부티레이트, 에틸 (D)-3-히드록시부티레이트 및 메틸 (D)-3-히드록시부티레이트를 얻은 뒤 이들을 각각 1%의 클로로포름 용액에서 광회전값을 측정하여 문헌값과 비교하면 광학적으로 순수힌 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트가 제조됨을 알 수 있다.

한편, 상기에서 용매추출법을 통하여 얻은 폴리 3-히드록시부티레이트를 가알콜 분해반응시킬 때 사용되는 촉매를 진한 황산에서 진한 염산으로 변화시키면 반응속도가 증가하게 되는데, 진한 염산 대신 무수 염산을 사용하였을 때의 가알콜 분해반응 속도가 더욱 증가하게 된다.

또한, 소듐 도데실 설페이트로 세포용해법에 의해 분리·정제한, 순도가 약 85%인 폴리 3-히드록시부티레이트를 황산 촉매하에서 가알콜 분해반응시키면 소듐도데실 설페이트가 반응을 저해하기 때문에 반응속도가 감소되고, 수득률도 저하된다는 단점이 있다. 이때 진한 황산 대신 무수 염산을 촉매로 사용하면 상기와 같은 반응성 및 수득률의 저하를 해결할 수 있다.

본 발명에서는 세포용해법을 이용하여 세포내의 폴리 3-히드록시부티레이트를 분리·정제한다. 이때 상기한 효소, 수산화 알칼리염, 차아염소산나트륨 또는 계면활성제 등을 각각 단독으로 사용하거나 이들을 조합하여 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 용액을 이용하여 세포내에서 PHB를 70∼99%의 순도로 정제하는 것이 바람직하며, 80∼98%의 순도로 정제하는 것이 더욱 바람직하다.

정제된 PHB를 산 촉매하에서 알콜과 반응시켜 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트를 얻는다. 이때 산 촉매로는 전술한 바와 같이 염산을 사용하는데, 진한 염산을 사용하는 것이 바람직하며, 무수 염산(anhydrous HCl)을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 산 촉매는 0.05∼50 당량의 산을 사용하는 것이 바람직하며, 0.1∼10 당량의 산을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

그리고, 알콜로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올 등의 지방족 알콜(aliphatic alcohol)이 사용되는 것이 바람직하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 제조방법을 상세히 설명하기로 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

먼저, 실시예에 앞서 비교실시예를 먼저 기술함으로써 본 발명의 제조방법을 더욱 상세히 설명하기로 한다.

〈비교실시예 1〉 용매추출법을 통해 제조된 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트

용매추출법으로 얻어진 순도가 약 99%인 PHB 1g/20㎖를 20㎖의 1,2-디클로로에탄과 20㎖의 무수 메탄올, 에탄올 및 n-프로판올과 2㎖의 진한 염산이 각각 함유된 혼합용액에 각각 첨가한 뒤 12시간 동안 환류하였다. 그런 다음 20㎖의 염화나트륨 수용액(50% 포화), 20㎖의 중탄산나트륨 수용액(포화) 및 10㎖에 해당하는 염화나트륨 수용액(포화)으로 반응용액을 세척한 뒤 수용액 층을 20㎖의 디클로로메탄으로 두 번 추출한 다음 수집된 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 그런 다음 건조된 유기층을 회전 증발시켜서 목적 화합물들을 얻고(n-프로필(D)-3-히드록시부티레이트의 경우 1.59g), 목적 화합물들을 진공증류하여 메틸 (D)-3-히드록시부티레이트, 에틸 (D)-3-히드록시부티레이트 및 n-프로필 (D)-3-히드록시부티레이트를 얻었다. 제조된 메틸 (D)-3-히드록시부티레이트, 에틸 (D)-3-히드록시부티레이트 및 n-프로필 (D)-3-히드록시부티레이트는 클로로포름 용액(1%)을 이용하여 각각의 광회전 값을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

〈비교실시예 2〉 메틸 (D)-3-히드록시부티레이트의 가알콜 분해반응(alcoholysis) 속도 측정

용매추출법을 통하여 얻은 PHB 10㎎을 클로로포름(2㎖)과 메탄올(2㎖)의 혼합용액에 넣고, 여기에 진한 황산 또는 진한 염산을 각각 가하였다. 여기에 내부 표준물질로서 알킬 벤조에이트(alkyl benzoate)를 첨가하고, 이 용액을 80℃로 가온·환류시켜 가알콜 분해반응을 수행하여 1시간 및 2시간 경과되었을 때 반응용액을 취하여 1,2-디클로로에탄과 절반이 포화된 소금물의 혼합용액(1:1)에 희석시켜 반응을 중지시키고 모세관 가스 크로마토그래피(capillary GC)로 생성된 메틸 (D)-3-히드록시부티레이트의 농도를 측정하여 반응속도를 알아내어, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

상기 표 2에서 볼 수 있듯이, 진한 염산 보다 무수 염산을 사용하였을 때 폴리 3-히드록시부티레이트가 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트로 분해되는 반응의 속도가 증가되었음을 알 수 있다.

〈실시예 1〉 폴리 3-히드록시부티레이트(PHB)의 분리·정제

약 70∼80%의 PHB가 함유된 알카리제니스 유트로푸스 균주(수탁번호: NCIMB 11599) 10g을 5%(중량/부피)의 소듐 도데실설페이트(sodium dodecylsulfate), 수산화 칼륨 및 수산화 나트륨 수용액 100㎖에 각각 넣고, 110℃로 가온한 뒤 각각의 용액을 원심분리(2500×g, 25℃, 20분)하여 PHB를 세포 조각(cell debris)이 포함된 상등액과 분리하였다. 그런 다음 상등액을 증류수로 씻은 뒤 다시 원심분리하여 공기중에서 건조시켜 폴리 3-히드록시부티레이트를 얻었다.

또한, 약 70∼80%의 PHB가 함유된 재조합 대장균 10g을 5%(중량/부피)의 소듐 도데실설페이트, 수산화칼륨 및 수산화나트륨 수용액 100㎖에 각각 넣고, 35℃로 가열하여 1시간 동안 방치하였다. 그런 다음 각각의 용액을 원심분리(2500×g, 25℃, 20분)하여 PHB를 세포 조각이 포함된 상등액과 분리하였다. 상등액을 증류수로 씻은 뒤 다시 원심분리하여 공기중에서 건조시켜 폴리 3-히드록시부티레이트를 얻었다.

〈실시예 2〉폴리 3-히드록시부티레이트(PHB)의 가알콜 분해반응(alcoholysis) 속도 측정

세포용해법에 사용되는 물질(소듐 도데실설포네이트, 수산화 칼륨 및 수산화 나트륨)을 다르게 하여 상기 실시예 1에서 얻은 각각의 PHB 10㎎을 1,2-디클로로에탄, 클로로포름(2㎖)과 메탄올(2㎖)의 혼합용액에 넣고, 여기에 진한 황산 또는 진한 염산을 각각 100㎕씩 가하였다. 여기에 내부 표준물질로서 알킬 벤조에이트(alkyl benzoate)를 첨가하고, 이 용액을 80℃에서 가온·환류시켜 가알콜 분해반응시켜 반응이 1시간 및 2시간 경과되었을 때 반응용액을 취하여 1,2-디클로로에탄과 절반이 포화된 소금물의 혼합용액(1:1)에 희석시켜 반응을 중지시키고 모세관 가스 크로마토그래피(capillary GC)로 생성된 메틸 (D)-3-히드록시부티레이트의 농도를 측정하여 반응속도를 알아보았다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

상기 표 3에서 볼 수 있듯이, 진한 황산 보다 진한 염산을 사용하였을 때 폴리 3-히드록시부티레이트가 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트로 분해되는 반응의 속도가 증가되었음을 알 수 있다.

〈실시예 3〉 메틸 (D)-3-히드록시부티레이트의 제조

소듐 도데실술포네이트를 이용하고, 세포 용해법으로 분리·정제한 85% 순도의 PHB 1g/10㎖를 같은 부피비의 1,2-디클로로에탄과 염산 가스(7.8%)를 함유한 무수 메탄올의 혼합용액에 첨가한 뒤 24시간 동안 환류하였다. 그런 다음 반응용액 부피의 1/4에 해당하는 염화나트륨 수용액(50% 포화), 반응용액 부피의 1/8에 해당하는 중탄산나트륨 수용액(포화) 및 반응용액 부피의 1/8에 해당하는 염화나트륨 수용액(포화)으로 반응용액을 세척한 뒤 수용액 층을 반응용액 부피의 1/4에 해당하는 디클로로메탄으로 두 번 추출한 다음 수집된 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 그런 다음 건조된 유기층을 회전 증발시켜서 0.931g/10㎖의 목적 화합물을 얻고, 목적 화합물을 진공증류 또는 칼럼 크로마토그래피하여 메틸 (D)-3-히드록시부티레이트를 고순도로 얻었다.

또한, 상기와 같은 조건에서 PHB의 농도를 2g/10㎖로 반응시켜 1.549g/10㎖의 메틸 (D)-3-히드록시부티레이트를 얻었다.

한편, 수산화나트륨 수용액(0.2%)을 이용하여 세포용해법으로 분리·정제된 폴리 3-히드록시부티레이트(순도: 80%)를 상기와 같은 조건에서 반응시켜 0.659g/10㎖의 메틸 (D)-3-히드록시부티레이트를 얻었다.

제조된 메틸 (D)-3-히드록시부티레이트는 클로로포름 용액(1%)을 이용하여 광회전값을 측정하였다.

〈실시예 4〉 기타 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트의 제조

메탄올 대신 n-프로판올 및 에탄올을 사용하고, 상기 실시예 3과 같은 조건에서 반응시켜 n-프로필 (D)-3-히드록시부티레이트과 에틸 (D)-3-히드록시부티레이트를 얻었다. 제조된 n-프로필 (D)-3-히드록시부티레이트과 에틸 (D)-3-히드록시부티레이트는 클로로포름 용액(1%)을 이용하여 각각의 광회전 값을 측정하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 제조방법은 세포용해법을 사용하기 때문에 미생물의 세포 내에 축적된 폴리 3-히드록시부티레이트를 경제적으로 분리·정제할 수 있으며, 가알콜 분해반응(alcoholysis)에 의해 폴리 3-히드록시부티레이트를 분해시키는 반응에서 진한염산 또는 무수염산을 산 촉매로 사용하기 때문에 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트를 높은 수율로 얻을 수 있는 우수한 제조방법이다.

Claims

폴리 3-히드록시부티레이트(PHB)를 생합성하는 미생물의 세포내에 축적된 폴리 3-히드록시부티레이트를 세포용해법에 의해 분리·정제하는 단계 및 2) 산 촉매하에서 가알콜 분해반응시키는 단계로 구성되는 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트의 제조방법
제 1항에 있어서, 폴리 3-히드록시부티레이트(PHB)를 생합성하는 미생물은 알카리제니스 유트로푸스(Alkaligenes eutrophus) 또는 재조합 대장균(Escherichia coli)을 사용하는 것을 특징으로 하는 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트의 제조방법.
제 1항에 있어서, 세포용해법에 의해 폴리 3-히드록시부티레이트를 분리·정제하는 과정에 있어서, 효소(enzyme), 수산화 알칼리염(hydroxy alkali salts), 차아염소산 나트륨(sodium hypochlorite) 및 계면활성제(surfactants)를 단독 또는 조합하여 사용함으로써 폴리 3-히드록시부티레이트를 70∼99%의 순도로 분리·정제하는 것을 특징으로 하는 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트의 제조방법
제 1항에 있어서, 산 촉매는 0.05∼50 당량의 무수염산을 사용하는 것을 특징으로 하는 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트의 제조방법
제 1항에 있어서, 가알콜 분해반응에 사용되는 알콜은 탄소수가 C₁∼C₄인 지방족 알콜(aliphatic alcohol)인 것을 특징으로 하는 알킬 (D)-3-히드록시부티레이트의 제조방법